KR20220042367A - 신규한 항-트로포닌t 항체 - Google Patents

신규한 항-트로포닌t 항체 Download PDF

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원 발명은 심장 트로포닌 T에 결합하고 부모 단일클론 항체 11-7보다 더 나은 KD를 갖는 향상된 변이체 단일클론 항체에 관계한다.

Description

신규한 항-트로포닌T 항체
본원 발명은 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론 항체에 관계하고, 상기 항체는 CDR들이 하기 아미노산 서열들 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른 이들의 변이체를 포함하는 것으로 특징화된다: (i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고 (ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
본 명세서에서, 특허 출원 및 제조업체의 매뉴얼을 비롯한 다수의 문서가 인용된다. 이들 문서의 개시는 본원 발명의 특허성과 유관한 것으로 고려되지 않으며, 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다. 더 특정하게는, 모든 참조된 문서는 마치 각 개별 문서가 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 참조로서 편입된다.
심장 트로포닌은 심장 손상의 민감하고 특이적인 바이오마커이다. 특히, 심장 트로포닌 T (cTnT)은 고도로 심장 특이적이고, 그리고 이것은 비-심근 근육 또는 다른 조직 손상 이후에 혈청 내에 존재하지 않는다. 이에 더하여, cTnT는 심근 경색을 진단하는 데 이용되는 다른 바이오마커들보다 더 일관되고 민감한 바이오마커인 것으로 밝혀졌다. 따라서 심장 트로포닌은 일반적으로, 급성 심근 허혈을 진단하는 데 유용하고, 그리고 cTnT가 특히 유용하다.
심장 트로포닌 T는 심장 질환을 앓는 환자에서 폭넓게 이용되는 바이오마커이다. 심장 질환을 앓는 환자에서 이의 유용성이 최근에 Westermann et al. (Nature Reviews / Cardiology, vol 14 (2017) 473-483에 의해 검토되었다. cTnT의 이용이 급성 심근 경색 (AMI)이 의심되는 환자에서 충분히 확립되지만, 다른 급성 및 비급성 세팅에서도 트로포닌 계측이 이용된다. AMI가 의심되는 환자에서, 초기 의사 결정은 신속한 치료 및 추가 진단 평가를 가능하게 하는 데 결정적이다.
트로포닌에 대한 더 새로운, 높은-민감도 검정은 훨씬 낮은 농도의 검출을 가능하게 한다. 이들 검정 및 매우 낮은 컷오프 농도를 이용하여, 여러 신속한 진단 전략이 급성 심장 치료에서 진단을 향상시키는 것으로 보고되었다. 게다가, 트로포닌 검정의 비관상 및 비급성 적용 - 예를 들면 심부전, 폐색전증, 또는 안정적 관상 동맥 질환을 앓는 환자에서 바이오마커로서 -은 임박하고, 그리고 개체 위험 계층화를 향상시킬지도 모른다.
심장 트로포닌 T는 통상적으로, 샌드위치 유형 면역검정에서 계측되는데, 여기서 적어도 하나의 항체가 cTnT를 포획하는 데 이용되고 적어도 두 번째 (표지화된) 항체가 표본 내에서 cTnT를 검출하는 데 이용된다. 이것은 또한, Roche Diagnostics, Germany에 의해 판매된 cTnT에 대한 5세대 검정에서도 같은 경우이다. European Collection of Animal Cell Cultures, GB에 기탁된 바와 같은 하이브리도마 클론 7.1 A 12.2-22 (ECACC 89060901)에 의해 생산된 단일클론 항체 12.1A11.11-7이 거의 30년간 cTnT에 대한 검정에서 최고 검출 항체로서 이용되었다. 이 항체가 1989년에 산출된 그때 이래로, cTnT의 검출을 위한 더 나은 단일클론 항체는 나타나지 않았다.
지난 수년간, 다양한 트로포닌의 계측을 위한 훨씬 민감한 검정이, 예를 들면 이런 검정에서 이용된 검출 항체의 표지화를 위한 정교한 기술에 기초하여 개발되었다.
많은 연구에서, AMI가 의심되는 환자의 환자분류를 향상시키는 잠재력뿐만 아니라 임상 진단의 다른 분야에서 그들의 유용성 둘 모두에 대해 트로포닌의 다양한 높은-민감도 검정이 평가되었다.
가장 민감한 트로포닌 검정조차도 일정한 백분율의 건강한 개체에서 트로포닌을 계측하는 데 실패하는 것으로 보고되었다 (참조: 예를 들면 Westermann et al., 상기). 명백히, 검정 민감도는 예를 들면 cTnT의 검출에서 가장 중요하고, 그리고 그 목적을 달성하기 위한 향상이 매우 바람직할 것이다.
이러한 요구는 청구항에서 규정된 바와 같은 구체예를 제공함으로써 본원 발명에 의해 해소된다.
매우 놀랍게도, 일정한 돌연변이가 항체 12.1A11.11-7의 상보성 결정 영역 (CDRs) 내로 도입될 수 있는 것으로 이제 밝혀졌는데, 이들 돌연변이는 한편으로는 상기 항체의 cTnT와의 복합체 형성에 부정적으로 영향을 주지 않지만, cTnT 및 이런 돌연변이체 항체 사이에 형성된 복합체의 안정성에 대하여 유의미한 향상을 나타낸다. 이들 놀라운 특성을 통해, 우수한 민감도를 갖는 cTnT에 대한 검정이 실현가능하다.
따라서, 본원 발명은 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론 항체에 관계하고, 상기 항체는 CDR들이 하기 아미노산 서열들 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른 이들의 변이체를 포함하는 것으로 특징화된다:
(i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고
(ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
항체의 전체 구조는 당해 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 이황화 결합에 의해 연결된 2개 중쇄 및 2개 경쇄를 포함한다. 중쇄와 경쇄는 각각, 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다. 항원에 대한 결합 특이성은 항체를 형성하는 경쇄와 중쇄의 가변 도메인에 의해 제공된다. 더 특정하게는, 특이성을 결정하고 특정한 리간드와 접촉하는 항체의 부분은 상보성 결정 영역 (CDRs)으로서 지칭된다. 이들 CDR은 상기 분자의 가장 가변적인 부분이고 이들 분자의 다양성에 기여한다. 각 가변 도메인에는 4개의 프레임워크 영역 (FWs) 내로 임베드된 3개의 CDR 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3이 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, CDR-HC (또는 CDR(HC))는 가변 중쇄의 CDR 영역을 묘사하고, 그리고 CDR-LC (또는 CDR(LC))는 가변 경쇄의 CDR 영역에 관계한다. 유사하게, FW-HC (또는 FW(HC))는 가변 중쇄의 프레임워크 영역을 묘사하고, 그리고 FW-LC (또는 FW(LC))는 가변 경쇄의 프레임워크 영역에 관계한다.
본원 발명에 따라서 이용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 추가 서열/구성요소가 특정적으로 언급된 서열 및/또는 구성요소 이외에 포함될 수 있다는 것을 표시한다. 하지만, 이러한 용어는 또한, 청구된 요부가 정확하게, 언급된 서열 및/또는 구성요소로만 구성된다는 것을 포괄한다.
본원 발명의 항체가 언급된 아미노산 서열 이상을 포함하는 이들 구체예에서, 추가 아미노산은 N 말단 단부 또는 C 말단 단부 중 어느 한 곳에서, 또는 둘 모두에서 존재할 수 있다. 추가 서열은 예를 들면, 아래에서 상세하게 논의된 바와 같이, 예를 들면 정제 또는 검출을 위해 도입된 서열을 포함할 수 있다. 게다가, 개별 서열이 언급된 서열을 "포함하는" 경우에, 이들은 또한, N 말단 단부 또는 C 말단 단부 중 어느 한 곳에서, 또는 둘 모두에서 추가 아미노산을 포함할 수 있다.
본원 발명에 따라서, 항체는 서열 번호: 1의 인간 심장 트로포닌 T (cTnT)에 특이적으로 결합한다. 또한, 본원 발명의 항체가 상기 상술된 바와 같이 추가 아미노산을 포함하는 경우에, 상기 항체는 cTnT에 반드시 특이적으로 결합해야 하는 것으로 인지될 것이다.
본원 발명에 따라서, 용어 "특이적으로 결합한다" (본원에서 "특이적으로 상호작용한다"로서 또한 지칭됨)는 항체가 단지 cTnT에만 특이적으로 결합하며, 상이한 단백질, 특히 유사한 구조의 상이한 단백질 예컨대 예를 들면 트로포닌 I (서열 번호: 29)와는 교차반응하지 않거나 또는 본질적으로 교차반응하지 않는다는 것을 의미한다.
항체의 특이성을 분석하기 위한 상응하는 방법은 예를 들면 Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 및 Harlow & Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 설명된다. 적합한 연구의 무제한적 실례는 예를 들면 구조적으로 및/또는 기능적으로 밀접하게 관련된 분자를 이용한 결합 연구, 차단 연구 및 경쟁 연구이다. 이들 연구는 예컨대 FACS 분석, 유세포 계측 적정 분석 (FACS 적정), 표면 플라스몬 공명 (SPR, 예를 들면 BIAcore® 이용), 등온 적정 열량측정법 (ITC), 형광 적정과 같은 방법에 의해, 또는 방사성표지화된 리간드 결합 검정에 의해 실행될 수 있다. 추가 방법은 예를 들면 웨스턴 블롯, ELISA (경쟁 ELISA 포함), RIA-, ECL- 및 IRMA-검사를 포함한다.
본원 발명의 문맥에서, 용어 "항체"는 완전 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이들의 항원 결합 단편, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')2, Fv에 관계한다. 게다가, 상기 용어는 변형된 및/또는 변경된 항체 분자뿐만 아니라 재조합적으로 또는 합성적으로 산출된/합성된 항체에 관계한다. 용어 "항체"는 또한, 이중기능성 항체, 삼중기능성 항체, 완전 인간 항체, 키메라 항체, 그리고 항체 작제물, 예를 들면 단일 사슬 Fvs (scFv) 또는 항체-융합 단백질을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1과 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 VH 도메인과 CH1 도메인을 내포하는 하나의 중쇄의 부분을 내포하고, 그리고 사슬간 이황화 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자가 형성될 수 있도록, CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 또한 내포한다. "F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 그리고 사슬간 이황화 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되도록, CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 부분을 내포하는 2개의 중쇄를 내포한다. F(ab')2 단편은 따라서, 2개의 중쇄 사이의 이황화 결합에 의해 묶이는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
Fab/c 단편은 Fc와 Fab 결정인자 둘 모두를 내포하는데, 여기서 "Fc" 영역은 항체의 CH2와 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 내포한다. 이들 2개의 중쇄 단편은 2개 또는 그 이상의 이황화 결합에 의해, 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 묶인다.
"Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 둘 모두로부터 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역을 결여한다. "단일 사슬 Fvs" (또한 "scFv"로서 약칭됨)는 본원 발명의 맥락에서, 항체의 VH와 VL 도메인을 갖는 항체 단편인데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 이러한 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더욱 포함한다. 단일 사슬 항체의 생산에 대해 설명된 기술은 예를 들면, Pl
Figure pct00001
ckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y. 113 (1994), 269-315에서 설명된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "완전 인간 항체"는 단지 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 그럼에도 불구하고, 완전 인간 항체는 만약 생쥐에서, 생쥐 세포에서, 또는 생쥐 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되면 뮤린 탄수화물 사슬을 내포할 수 있거나, 또는 이것은 만약 쥐에서, 쥐 세포에서, 또는 쥐 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되면 쥐 탄수화물 사슬을 내포할 수 있다. 유사하게, 완전 인간 항체는 만약 햄스터에서, 햄스터 세포, 예컨대 예를 들면 CHO 세포에서, 또는 햄스터 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되면 햄스터 탄수화물 사슬을 내포할 수 있다. 다른 한편으로, "생쥐 항체" 또는 "뮤린 항체"는 단지 생쥐 (뮤린) 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체이고, 반면 "쥐 항체" 또는 "토끼 항체"는 단지 쥐 또는 토끼 면역글로불린 서열만을 각각 포함하는 항체이다. 완전 인간 항체의 경우에서와 같이, 이런 뮤린, 쥐 또는 토끼 항체는 만약 다른 종의 동물에서 또는 이런 동물의 세포에서 생산되면 다른 종으로부터 유래된 탄수화물 사슬을 내포할 수 있다. 예를 들면, 항체는 만약 햄스터 세포, 예컨대 예를 들면 CHO 세포에서, 또는 햄스터 세포로부터 유래된 하이브리도마에서 생산되면 햄스터 탄수화물 사슬을 내포할 수 있다. 완전 인간 항체는 예를 들면, 완전 인간 항체의 생산과 선별검사를 가능하게 하는 폭넓게 이용되는 선별검사 기술인 파지 전시에 의해 생산될 수 있다. 또한 파지 항체가 본원 발명의 맥락에서 이용될 수 있다. 파지 전시 방법은 예를 들면, US 5,403,484, US 5,969,108 및 US 5,885,793에서 설명된다. 완전 인간 항체의 개발을 가능하게 하는 다른 기술은 생쥐 하이브리도마 기법의 변형을 수반한다. 생쥐는 자체 생쥐 유전자 대신에 인간 면역글로불린 좌위를 내포하도록 유전자도입된다 (참조: 예를 들면, US 5,877,397).
용어 "키메라 항체"는 인간 또는 비인간 (예를 들면, 생쥐, 말, 토끼, 개, 소, 닭) 중 어느 한 가지인 다른 종으로부터 항체 영역 (예를 들면, 불변 영역)에 융합된 또는 키메라화된 인간 또는 비인간 종의 가변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.
앞서 언급된 바와 같이, 용어 "항체"는 또한 항체 작제물, 예컨대 항체-융합 단백질을 포괄하는데, 여기서 항체는 특정한 아미노산 서열에 의해 본원에서 규정된 도메인에 더하여, 예를 들면 재조합적으로 생산된 작제물의 단리 및/또는 제조를 위한 추가 도메인(들)을 포함한다.
본원 발명의 항체는 이것이, 본원 발명에서 개시되고 규정된 바와 같은 CDR들을 여전히 포함하는 재조합 항체, 예를 들면 재조합 인간 항체, 또는 헤테로-하이브리드 항체이도록 생산될 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 또는 단리되는 모든 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자가 유전자도입되는 동물 (예를 들면, 생쥐)로부터 단리된 항체, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 다른 DNA 서열에 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 창출되거나 또는 단리된 항체를 포함한다. 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변과 불변 영역 (존재하면)을 갖는다. 이런 항체는 하지만, 시험관내 돌연변이유발 (또는, 인간 Ig 서열이 유전자도입된 동물이 이용될 때, 생체내 체성 돌연변이유발)이 진행될 수 있고, 그리고 따라서 이들 재조합 항체의 VH와 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH와 VL 서열로부터 유래되고 이들 서열에 관련되지만, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "헤테로-하이브리드 항체"는 상이한 생물체로부터 유래하는 경쇄와 중쇄를 갖는 항체를 지칭하다. 예를 들면, 뮤린 경쇄와 연관된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로-하이브리드 항체이다. 헤테로-하이브리드 항체의 실례는 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함한다.
본원 발명에 따른 항체는 경쇄 CRD 및 중쇄 CRD의 언급된 조합을 포함한다. 이들 CDR이 통합되는 개별 가변 도메인의 주변 프레임워크 서열은 지체 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들면, 아래에 더욱 설명된 프레임워크 서열 또는 첨부된 실시예에서 이용된 특정한 프레임워크 서열이 이용될 수 있다.
본원 발명에 따라서, 이들 CDR은 특정적으로 언급된 서열을 포함할 수 있거나 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 그것으로부터 상이할 수 있다. 따라서, 각각의 CDR에서 하나의 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 대체될 수 있다. 아미노산 치환이 하나의 사슬 또는 하나의 항체의 전부는 아니지만 일부 CDR 내에 존재하는 것 또한 포괄되는 것으로 인지될 것이다.
본원 발명에 따라서, 용어 "치환"은 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 대체를 지칭한다. 따라서, 아미노산의 총수는 동일하게 남아있다. 일정한 위치에서 아미노산의 결실 및 상이한 위치에서 하나 (또는 그 이상의) 아미노산(들)의 도입은 용어 "치환"에 의해 명시적으로 포괄되지 않는다. 본원 발명에 따라서, 치환은 보존성 아미노산 치환 또는 비보존성 아미노산 치환일 수 있다. 용어 "보존성 아미노산 치환"은 당해 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 한 아미노산의 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 상이한 아미노산으로의 대체를 지칭한다. 이런 유사성은 예를 들면 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매적 성질에서 유사성을 포함한다. 아미노산 치환은 하기 군 중에서 한 가지의 하나의 아미노산이 동일한 군의 다른 아미노산에 의해 치환되는 사례에서 보존성 아미노산 치환이다: 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 그리고 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루타민산을 포함한다. 한 구체예에서, 임의의 (또는 모든) CDR에서 치환은 보존성 아미노산 치환이다. 또한 이들 CDR 중에서 하나 또는 그 이상에서 이런 치환된 아미노산을 갖는 항체는 반드시, 서열 번호: 1의 cTnT에 특이적으로 결합하는 항체이어야 하는 것으로 인지될 것이다.
한 구체예에서, 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 항체는 경쇄 가변 도메인이 서열 번호: 2의 아미노산 서열의 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열의 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열의 CDR3, 또는 CDR마다 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른, 이들 CDR 중에서 하나 또는 그 이상의 변이체를 포함하고, 그리고 중쇄 가변 도메인이 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 항체이다.
한 구체예에서 본원 발명은
인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 항체를 개시하고, 상기 항체는 CDR들이 하기 아미노산 서열들: (i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고 (ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것으로 특징화된다.
게다가, 본원 발명은 또한, 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 항체에 관계하고,
여기서 상기 항체는 화학식 I에서 표시된 바와 같은 프레임워크 영역 (FW)들 및 CDR들로 구성되는 경쇄 가변 도메인:
FW(LC)1 - CDR(LC)1 - FW(LC)2 - CDR(LC)2 - FW(LC)3 - CDR(LC)3 - FW(LC)4 (화학식 I)
및 화학식 II에서 표시된 바와 같은 FW들 및 CDR들로 구성되는 중쇄 가변 도메인:
FW(HC)1 - CDR(HC)1 - FW(HC)2 - CDR(HC)2 - FW(HC)3 - CDR(HC)3 - FW(HC)4 (화학식 II)를 포함하고,
여기서 상기 FW들은 하기 아미노산 서열들 또는 이들과 적어도 85% 동일한 이들의 변이체를 포함하고:
경쇄에서
FW(LC)1 서열 번호: 8의 아미노산 서열;
FW(LC)2 서열 번호: 9의 아미노산 서열;
FW(LC)3 서열 번호: 10의 아미노산 서열;
FW(LC)4 서열 번호: 11의 아미노산 서열;
및 중쇄에서
FW(HC)1 서열 번호: 12의 아미노산 서열;
FW(HC)2 서열 번호: 13의 아미노산 서열;
FW(HC)3 서열 번호: 14의 아미노산 서열;
FW(HC)4 서열 번호: 15의 아미노산 서열;
그리고 여기서 상기 CDR들은 각각, 하기 아미노산 서열들: (i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고 (ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 CDR마다 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른, 이들 CDR의 변이체를 포함한다.
게다가 본원 발명은 화학식 I에서 표시된 바와 같은 프레임워크 영역 (FW)들 및 CDR들로 구성되는 경쇄 가변 도메인:
FW(LC)1 - CDR(LC)1 - FW(LC)2 - CDR(LC)2 - FW(LC)3 - CDR(LC)3 - FW(LC)4 (화학식 I)
및 화학식 II에서 표시된 바와 같은 FW들 및 CDR들로 구성되는 중쇄 가변 도메인:
FW(HC)1 - CDR(HC)1 - FW(HC)2 - CDR(HC)2 - FW(HC)3 - CDR(HC)3 - FW(HC)4 (화학식 II)를 포함하는 항-cTnT 항체를 개시하고,
여기서 상기 FW들은 하기 아미노산 서열들 또는 이들과 적어도 85% 동일한 이들의 변이체를 포함하고:
경쇄에서
FW(LC)1 서열 번호: 8의 아미노산 서열;
FW(LC)2 서열 번호: 9의 아미노산 서열;
FW(LC)3 서열 번호: 10의 아미노산 서열;
FW(LC)4 서열 번호: 11의 아미노산 서열;
및 중쇄에서
FW(HC)1 서열 번호: 12의 아미노산 서열;
FW(HC)2 서열 번호: 13의 아미노산 서열;
FW(HC)3 서열 번호: 14의 아미노산 서열;
FW(HC)4 서열 번호: 15의 아미노산 서열;
그리고 여기서 상기 CDR들은 하기 아미노산 서열들: (i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고 (ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다.
화학식 I에 도시된 일차 구조는 N 말단으로부터 C 말단으로, 본원 발명의 항체의 경쇄 가변 도메인의 구성요소의 순서를 나타낸다. 화학식 II에 도시된 일차 구조는 N 말단으로부터 C 말단으로, 본원 발명의 항체의 중쇄 가변 도메인의 구성요소의 순서를 나타낸다. 각 경우에, 프레임워크 영역 (FW) 1은 개별 가변 사슬 도메인의 가장 N 말단 부분을 나타내고, 반면 FW 4는 개별 가변 사슬 도메인의 가장 C 말단 부분을 나타낸다.
앞서 규정된 바와 같이, 개별 FW와 CDR 서열은 언급된 아미노산 서열을 "포함한다". 한 구체예에서 개별 FW와 CDR 서열은 상기 아미노산 서열로 구성된다, 다시 말하면 본원 발명의 항-트로포닌 T 항체의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 각각, 화학식 I 및 화학식 II에서 표시된 바와 같은 FW들 및 CDR들로 구성되고, 여기서 개별 FW와 CDR 서열은 언급된 아미노산 서열로 구성된다.
이들 CDR 및 이들의 변이체에 대하여, 상기 제공된 정의 및 특정적으로 예시된 구체예는 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
프레임워크 영역에 대하여, 일정한 정도의 가변성이 또한 본원에서 구상된다, 다시 말하면 개별 FW는 특정적으로 언급된 아미노산 서열 또는 이것과 최소한 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이것으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 92.5%, 더 바람직하게는 적어도 95%이고, 훨씬 바람직하게는 동일성은 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%이고, 그리고 가장 바람직하게는 동일성은 적어도 99.5%이다. 상이한 FW에 대하여, 실제 서열 및 예를 들면 개별 FW 서열의 길이뿐만 아니라 개별 가변 사슬 도메인 내에서 이의 위치에 따라서, 상이한 정도의 서열 동일성이 허용 가능할 수 있는 것으로 인지될 것이다.
본원 발명에 따라서, 용어 "% 서열 동일성"은 아미노산 서열의 전체 길이 (또는 이들의 전체 비교된 부분)를 구성하는 아미노산 잔기의 숫자와 비교하여 2개 또는 그 이상의 정렬된 아미노산 서열의 동일한 아미노산의 정합 ("히트")의 숫자를 설명한다. 퍼센트 동일성은 동일한 잔기의 숫자를 잔기의 총수로 나누고, 그리고 결과물에 100을 곱함으로써 결정된다. 다른 용어에서, 2개 또는 그 이상의 (하위)서열이 당해 분야에서 공지된 바와 같은 서열 비교 알고리즘을 이용하여 계측된 대로 비교 윈도우에 비하여 또는 지정된 영역에 비하여 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬될 때, 또는 수동으로 정렬되고 시각적으로 검사될 때, 정렬을 이용하여, 동일한 아미노산 잔기의 백분율 (예를 들면, 85% 동일성)이 이들 서열 또는 하위서열에 대해 결정될 수 있다.
당업자는 예를 들면, 알고리즘 예컨대 NCBI BLAST 알고리즘 (Altschul, S.F. et al. [1997] Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), CLUSTALW 컴퓨터 프로그램 (Tompson, J.D. et al. [1994] Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) 또는 FASTA (Pearson, W.R. & Lipman, D.J. [1988] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448)에 기초된 것들을 이용하여 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성을 결정하는 방법을 알고 있다. 한 구체예에서, NCBI BLAST 알고리즘이 본원 발명에 따라서 이용된다. 아미노산 서열의 경우에, BLASTP 프로그램은 3의 단어 길이 (W) 및 10의 예상 (E)을 디폴트로서 이용한다. BLOSUM62 채점 매트릭스 (Henikoff, S. & Henikoff, J.G. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)는 50의 정렬 (B), 10의 예상 (E), M=5, N=4 및 양쪽 가닥의 비교를 이용한다. 따라서, % 서열 동일성이 표시되는 이들 구체예에서, NCBI BLAST 프로그램으로 결정된 대로 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 모든 아미노산 서열은 상기 구체예의 범위에 들어간다.
개별 특정적으로 언급된 아미노산 서열과 비교하여 프레임워크 영역에서 전술된 정도의 변동은 아미노산(들)의 치환, 삽입, 부가 또는 결실에 기인할 수 있다.
용어 "치환"은 앞서 규정되었다. 하나 이상의 아미노산이 치환되는 이들 사례에서, 각 아미노산은 다른 아미노산으로 독립적으로 대체된다, 다시 말하면 제거되는 각 아미노산에 대해 상이한 아미노산이 동일한 위치에서 도입된다.
본원 발명에 따라서, 용어 "삽입"은 특정적으로 언급된 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가를 지칭하는데, 여기서 상기 부가는 폴리펩티드의 N 또는 C 말단 단부에서 일어나지 않는다.
본원 발명에 따라서, 용어 "부가"는 특정적으로 언급된 아미노산 서열에, 상기 폴리펩티드의 N 또는 C 말단 단부 중 어느 한 곳에, 또는 둘 모두에 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가를 지칭한다.
본원 발명에 따라서 이용된 바와 같이, 용어 "결실"은 특정적으로 언급된 아미노산 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산의 상실을 지칭한다.
한 구체예에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열에서 변동은 아미노산(들)의 치환에 기인한다. 치환은 앞서 규정된 바와 같이, 보존성 아미노산 치환 또는 비보존성 아미노산 치환일 수 있다. 용어 "치환"에 대하여 앞서 제공된 정의 및 특정적으로 예시된 구체예는 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다. 한 구체예에서, 프레임워크 영역에서 치환은 보존성 아미노산 치환이다.
추가 구체예에서, 상기 CDR은 상기 언급된 특정한 서열로 구성되고 (다시 말하면 어떤 변동도 없이), 그리고 상기 언급된 프레임워크 영역 (FWs)은 상기 언급된 특정한 서열 내에 많으면 하기 양의 아미노산 변동을 포함한다:
FW(LC)1 많으면 3개의 아미노산 변동;
FW(LC)2 많으면 2개의 아미노산 변동;
FW(LC)3 많으면 4개의 아미노산 변동;
FW(LC)4 많으면 1개의 아미노산 변동; 및
FW(HC)1 많으면 3개의 아미노산 변동;
FW(HC)2 많으면 2개의 아미노산 변동;
FW(HC)3 많으면 4개의 아미노산 변동; 및
FW(HC)4 많으면 1개의 아미노산 변동.
추가 구체예에서, 이들 FW에서 아미노산 변동은 치환이다.
추가 구체예에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역 내에 존재하는 변동의 총량은 많으면 9개의 아미노산 치환, 예컨대 예를 들면 많으면 8개의 아미노산 치환, 예를 들면 많으면 6개의 아미노산 치환, 예컨대 많으면 4개의 아미노산 치환, 예를 들면 많으면 3개의 아미노산 치환, 예컨대 많으면 2개의 아미노산 치환이다. 추가 구체예에서, 합쳐진 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 1 내지 4 내에, 또는 합쳐진 중쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 1 내지 4 내에 단지 1개의 아미노산 치환만 존재한다.
본원에서 FW들로서 규정된 화학식 I 및 화학식 II의 부분이 가변 사슬 영역의 프레임 또는 골격의 부분을 형성하는 아미노산 서열이기 때문에, 특히 보존성 아미노산 치환의 형태에서 상기 서열 내에 치환은 많은 경우에, 항-cTnT 항체의 결합 능력에 영향을 주지 않을 것이다. 이것은 이들 아미노산이 전형적으로 cTnT에 결합에 직접적으로 관련되지 않기 때문이고, 그리고 적합한 대안 아미노산에 대한 이들의 치환은 단백질의 3차원 구조 및 접힘에서 어떤 변경도 발생하지 않도록 설계될 수 있다. 다른 한편으로, 이런 치환은 다양한 유익한 효과 예컨대 일정한 숙주에서 향상된 발현 또는 예를 들면 추가 이황화 다리의 도입에 의한 단백질의 안정화를 제공할 수 있다.
항체의 "결합 친화성"은 하기 방정식에 따라서, 표적 항원 상에서 에피토프 및 항체의 결합 부위 사이의 상호작용의 강도를 계측한다:
KD (또는 KD) = kd/ka
여기서:
KD = 해리 평형 상수 [M]
kd = 해리 속도 상수 [s-1]
ka = 연관 속도 상수 [M-1 s-1]
항체의 결합 친화성에 대한 추가의 유관한 파라미터는 아래와 같다:
t/2 = 해리 복합체 반감기 = ln2/kd/60 [분]
Rmax = 피분석물의 반응 최댓값 [RU]
MR: 몰 비율 = 피분석물의 반응 최댓값 (Rmax)의 비율
한 구체예에서 앞서 개시된 바와 같은 cTnT에 대한 단일클론 항체는 37 ℃에서 10 분 또는 그 이상의 t/2-diss로 cTnT에 결합한다.
본원 발명은 다음을 포함하는 항체에 더욱 관계하고:
(i) 서열 번호: 27의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인, 그리고
(ii) 서열 번호: 28의 중쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 도메인,
여기서 상기 항체는 인간 심장 트로포닌 T에 특이적으로 결합하고 37 ℃에서 10 분 또는 그 이상의 t/2-diss를 갖는다.
또한 다음을 포함하는 항체가 본원 발명에서 개시되고:
(i) 서열 번호: 27의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인, 그리고
(ii) 서열 번호: 28의 아미노산 서열의 중쇄 가변 도메인,
여기서 CDR들은 하기 아미노산 서열들: (i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고 (ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고,
그리고 여기서 상기 항체는 인간 심장 트로포닌 T에 특이적으로 결합하고 37 ℃에서 10 분 또는 그 이상의 t/2-diss를 갖는다.
한 구체예에서 본원 발명은 다음을 포함하는 항체에 관계한다:
(i) 서열 번호: 22의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인, 그리고
(ii) 서열 번호: 28의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 도메인.
본원 발명의 항-cTnT 항체, 특히 변동의 언급된 정도 및 유형에 대하여 앞서 제공된 모든 정의 및 특정적으로 예시된 구체예는 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
본원 발명에 따라서, cTnT에 대한 향상된 결합 특성 (더 나은 KD 값)을 갖고, 그리고 따라서 선행 검정과 비교하여 우수한 민감도에서 cTnT의 검출을 가능하게 하는 신규한 항-cTnT 항체가 제공된다.
용어 "KD"는 평형 해리 상수 (평형 결합 상수의 역수)를 지칭하고, 그리고 당해 분야에서 제공된 정의에 따라서 본원에서 이용된다. KD 값을 결정하기 위한 수단과 방법은 아래에서 짧게 제시되고 실시예에서 상세하게 설명된다.
항체, 예를 들면, 항-cTnT 항체의 결합 특성은 실시간 바이오센서-기반 분자 상호작용 계측, 예를 들면 표면 플라스몬 공명 분광법 (이것에 대해 Biacore 기술이 동의어처럼 되었다)을 통해 가장 잘 결정된다. 실험 상세는 실시예 5에서 제공되고, 그리고 동역학 데이터는 표 2에서 도시된다. 예를 들면, 표 2에서 A192W로서 표지화된 항체는 cTnT에 대한 향상된 결합 특성, 다시 말하면 1.1E+06< 0.01 1/Ms의 결합 상수 (ka); < 1E-05의 해리 상수 (kd) (>1155min의 해리에 대한 반감기 및 따라서 < 0.01nM의 전체 친화성 상수 (KD)로 번역됨)를 갖는다.
본원 발명에서 개시되고 청구된 바와 같은 돌연변이된 항체는 놀랍게도 한편으로는, 상기 항체의 cTnT와의 복합체 형성에 부정적으로 영향을 주지 않으며, 이들 모두에 대한 Ka가 부모 항체에서와 동일한 범위 안에 있다. 다른 한편으로는, 더 나은 KD 값으로 번역되는 cTnT 사이에 형성된 복합체의 안정성에 대하여 유의미한 향상이 달성될 수 있었다.
한 구체예에서 앞서 개시된 바와 같은 본원 발명에 따른 단일클론 항체는 37 ℃에서 10 분 또는 그 이상의 t/2-diss로 cTnT에 결합한다.
일반적으로, 더 낮은 KD 값은 당해 분야에서 널리 알려진 바와 같이 더 높은 또는 향상된 친화성에 상응한다. 한 구체예에서, 돌연변이체 항-cTnT 항체는 3nM의 KD를 갖는 부모 항체의 KD와 동등하거나 또는 이보다 낮은 결합 친화성을 갖는다.
가변 경쇄와 중쇄 영역에 대한 상기 언급된 서열은 첨부된 실시예에서 이용된 아미노산 서열이다.
본원 발명은 앞서 규정된 본원 발명의 항체 중에서 한 가지의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자에 더욱 관계한다. 이러한 핵산 분자는 본원에서 본원 발명의 첫 번째 핵산 분자로서 지칭된다. 게다가, 본원 발명은 또한, 앞서 규정된 본원 발명의 항체 중에서 한 가지의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자에 관계한다. 이러한 핵산 분자는 본원에서 본원 발명의 두 번째 핵산 분자로서 지칭된다.
본원 발명에 따라서, 본원에서 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드로서 또한 지칭되는 용어 "핵산 분자"는 DNA, 예컨대 cDNA 또는 유전체 DNA를 포함한다.
본원 발명의 핵산 분자는 예를 들면, 표준 화학적 합성 방법 및/또는 재조합 방법에 의해 합성되거나, 또는 예를 들면 화학적 합성 및 재조합 방법을 조합함으로써 반합성적으로 생산될 수 있다. 전사 조절 요소에 및/또는 다른 아미노산 인코딩 서열에 코딩 서열의 결찰은 확립된 방법, 예컨대 제한 절단, 결찰 및 분자 클로닝을 이용하여 실행될 수 있다.
본원 발명에 따라서, 본원 발명의 첫 번째 핵산 분자는
(i) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하거나;
(ii) 앞서 규정된 바와 같은 화학식 I의 아미노산 서열로 구성되거나; 또는
(iii) 서열 번호: 27의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 인코딩한다.
유사하게, 본원 발명의 두 번째 핵산 분자는
(i) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른 이의 변이체, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른 이의 변이체, 그리고 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른 이의 변이체를 포함하거나;
(ii) 앞서 규정된 바와 같은 화학식 II의 아미노산 서열로 구성되거나;
(Iii) 서열 번호: 28의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역을 인코딩한다.
본원 발명은 본원 발명의 첫 번째 핵산 분자, 다시 말하면 앞서 규정된 본원 발명의 항체 중에서 한 가지의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 더욱 관계한다. 본원 발명은 본원 발명의 두 번째 핵산 분자, 다시 말하면 앞서 규정된 본원 발명의 항체 중에서 한 가지의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 더욱 관계한다. 이런 벡터는 본원에서, "본원 발명의 개별 벡터(들)"로서 또한 지칭된다.
많은 적합한 벡터가 분자생물학의 당업자에게 알려져 있는데, 이것의 선택은 원하는 기능에 의존한다. 벡터의 무제한적 실례는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지, 그리고 예를 들면 유전공학에서 전통적으로 이용되는 다른 벡터를 포함한다. 당업자에게 널리 알려져 있는 방법이 다양한 플라스미드와 벡터를 작제하는 데 이용될 수 있다; 예를 들면, Sambrook et al. (loc cit.) 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)에서 설명된 기술을 참조한다.
한 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 본원 발명에 따른 발현 벡터는 숙주에서 본원 발명의 핵산 분자의 복제와 발현을 주도할 수 있고, 그리고 따라서, 선택된 숙주에서 그것에 의하여 인코딩된 본원 발명의 항-트로포닌 T 항체의 가변 사슬 도메인의 발현을 제공한다. 추가 구체예에서, 벡터(들)는 본원 발명의 상기 가변 사슬 도메인이 발현될 뿐만 아니라 본원 발명의 상기 가변 사슬 도메인을 포함하는 전장 IgG 항체가 발현되도록 담보하기 위한 추가 서열을 포함한다.
발현 벡터는 예를 들면, 클로닝 벡터, 이성분 벡터 또는 통합 벡터일 수 있다. 발현은 핵산 분자의 예를 들면 번역가능 mRNA로의 전사를 포함한다. 한 구체예에서, 벡터는 단일클론 토끼 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 일시적인 재조합 발현을 위한 진핵 발현 플라스미드이다. 이런 벡터는 항체 발현을 위해, 그러나 또한 예를 들면, 진핵 세포 예를 들면 HEK 293 또는 이들의 유도체 또는 CHO 세포의 일시적인 형질감염에 의한 항체 생산을 위해 특이적으로 개발되었다.
벡터의 무제한적 실례는 pQE-12, pUC-시리즈, pBluescript (Stratagene), 발현 벡터의 pET-시리즈 (Novagen) 또는 pCRTOPO (Invitrogen), 람다 gt11, pJOE, pBBR1-MCS 시리즈, pJB861, pBSMuL, pBC2, pUCPKS, pTACT1, pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT, E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a) 벡터 시스템, pREP (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pIZD35, Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pcDNA3.1, pSPORT1 (GIBCO BRL), pGEMHE (Promega), pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen) 및 pCINeo (Promega)를 포함한다. 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에 적합한 플라스미드 벡터에 대한 무제한적 실례는 예를 들면 플라스미드 pAO815, pPIC9K 및 pPIC3.5K (모두 Invitrogen)를 포함한다. 손톱개구리속 (Xenopus) 배아, 제브라피시 배아뿐만 아니라 매우 다양한 포유류 및 조류 세포에서 단백질을 발현하는 데 적합한 다른 벡터는 다목적 발현 벡터 pCS2+이다.
일반적으로, 벡터는 하나 또는 그 이상의 복제 기점 (ori) 및 클로닝 또는 발현을 위한 유전 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 또는 그 이상의 마커, 예를 들면, 항생제 내성, 그리고 하나 또는 그 이상의 발현 카세트를 내포할 수 있다. 이에 더하여, 벡터 내에 포함된 코딩 서열은 확립된 방법을 이용하여 전사 조절 요소에 및/또는 다른 아미노산 인코딩 서열에 결찰될 수 있다. 이런 조절 서열은 당업자에게 널리 알려져 있고, 그리고 제한 없이, 전사의 개시를 담보하는 조절 서열, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) (Owens, G.C. et al. [2001] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:1471-1476), 그리고 임의적으로, 전사체의 전사 종결 및 안정화를 담보하는 조절 요소를 포함한다. 전사의 개시를 담보하는 이런 조절 요소에 대한 무제한적 실례는 프로모터, 번역 개시 코돈, 인핸서, 인슐레이터 및/또는 본원 발명의 핵산 분자의 하류에 포함되는, 전사 종결을 담보하는 조절 요소를 포함한다. 추가 실례는 코자크 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 공여자와 수용자 부위와 측접된 개재성 서열, 분비 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이용된 발현 시스템에 따라서, 발현된 단백질을 세포 구획으로 또는 배양 배지로 지향시킬 수 있는 신호 서열을 포함한다. 벡터는 또한, 정확한 단백질 접힘을 용이하게 하기 위한 하나 또는 그 이상의 샤프롱을 코딩하는 추가의 발현가능 폴리뉴클레오티드를 내포할 수 있다.
적합한 복제 기점의 추가 실례는 예를 들면, 전장 ColE1, 절두된 ColEI, SV40 바이러스 및 M13 복제 기점을 포함하고, 반면 적합한 프로모터의 추가 실례는 제한 없이, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40-프로모터, RSV-프로모터 (Rous sarcome 바이러스), lacZ 프로모터, 테트라사이클린 프로모터/오퍼레이터 (tetp/o), 닭 β-액틴 프로모터, CAG-프로모터 (닭 β-액틴 프로모터 및 시토메갈로바이러스 극초기 인핸서의 조합), gai10 프로모터, 인간 연장 인자 1α-프로모터, AOX1 프로모터, GAL1 프로모터 CaM-키나아제 프로모터, lac, trp 또는 tac 프로모터, T7 또는 T5 프로모터, lacUV5 프로모터, 아우토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) 복수 핵 다면체형성 바이러스 (AcMNPV) 다면체 프로모터, 또는 포유류 및 다른 동물 세포에서 글로빈 인트론을 포함한다. 인핸서의 한 가지 실례는 예를 들면 SV40-인핸서이다. 전사 종결을 담보하는 조절 요소에 대한 무제한적 추가 실례는 SV40-폴리-A 부위, tk-폴리-A 부위, rho-독립된 lpp 종결자 또는 AcMNPV 다면체 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 선별가능 마커의 추가의 무제한적 실례는 메토트렉사트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149), 아미노글리코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 내성을 부여하는 npt (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995), 그리고 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485)를 포함한다. 추가의 선택가능 유전자, 다시 말하면 세포가 트립토판 대신에 인돌을 활용할 수 있게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 활용할 수 있게 하는 hisD (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); 세포가 만노오스를 활용할 수 있게 하는 만노오스-6-인산염 이성화효소 (WO 94/20627) 및 오르니틴 탈카르복실화효소 저해제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 탈카르복실화효소) (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.), 또는 블라스티시딘 S에 대한 내성을 부여하는, 아스페르길루스 테레우스 (Aspergillus terreus)로부터 유래된 탈아미노효소 (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338)가 설명되었다.
추가 구체예에서, 벡터는 5` CMV 프로모터 포함 인트론 A 및 3` BGH 폴리아데닐화 서열로 구성되는 발현 카세트를 내포하는 진핵 발현 플라스미드이다. 발현 카세트에 더하여, 플라스미드는 pUC18-유래된 복제 기점 및 대장균 (E. coli)에서 플라스미드 증폭을 위한 암피실린 내성을 부여하는 베타 락타마아제 유전자를 내포할 수 있다. 항체의 분비를 위해, 진핵 리더 서열이 항체 유전자의 5'에 클로닝될 수 있다.
적합한 세균 발현 숙주는 예를 들면 JM83, W3110, KS272, TG1, K12, BL21 (예컨대 BL21(DE3), BL21(DE3)PlysS, BL21(DE3)RIL, BL21(DE3)PRARE) 또는 Rosetta로부터 유래된 균주를 포함한다. 벡터 변형, PCR 증폭 및 결찰 기술에 대해, Sambrook & Russel [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY)을 참조한다.
본원 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터는 예를 들면 화학적 기초된 방법 (폴리에틸렌이민, 인산칼슘, 리포솜, DEAE-덱스트란, 뉴클레오펙션), 비화학적 방법 (전기천공, 초음파천공, 광학적 형질감염, 유전자 전자 전달, 수력학적 전달, 또는 세포를 본원 발명의 핵산 분자와 접촉 시에 자연 발생 형질전환), 입자-기반 방법 (유전자 총, 마그네토펙션, 임팔레펙션), 파지 벡터-기반 방법 및 바이러스 방법에 의해 세포 내로 도입되도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 예컨대 레트로바이러스, 우두 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 핵산 분자의 표적화된 세포 개체군 내로의 전달에 이용될 수 있다. 추가적으로, 바쿨로바이러스 시스템 또한, 본원 발명의 핵산 분자에 대한 진핵 발현 시스템에서 벡터로서 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 본원 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터는 인산칼슘에 의한 화학적 적격성 대장균 (E. coli)의 형질전환용으로 및/또는 폴리에틸렌이민- 또는 리포펙타민-형질감염에 의한 HEK293 및 CHO의 일시적인 형질감염용으로 설계된다.
본원 발명은 다음을 포함하는 벡터에 더욱 관계한다:
(i) 앞서 규정된 옵션 (i)에 따른 경쇄 가변 도메인 및 앞서 규정된 옵션 (i)에 따른 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자;
(ii) 앞서 규정된 옵션 (ii)에 따른 경쇄 가변 도메인 및 앞서 규정된 옵션 (ii)에 따른 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자; 또는
(iii) 앞서 규정된 옵션 (iii)에 따른 경쇄 가변 도메인 및 앞서 규정된 옵션 (iii)에 따른 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자.
한 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
본원 발명의 벡터, 특히 벡터 유형 또는 조절 서열에 대하여 앞서 제공된 모든 정의 및 특정적으로 예시된 구체예는 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다. 벡터의 이러한 두 번째 유형은 적어도 2개의 핵산 분자, 다시 말하면 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관계한다. 상기 조합으로부터 증거된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 본원 발명의 기능적 항-cTnT 항체의 발현이 가능해지도록 벡터 내에서 조합된다. 벡터의 이러한 두 번째 유형은 본원에서 "본원 발명의 조합 벡터"로서 또한 지칭된다.
본원 발명은 다음을 포함하는 숙주 세포 또는 비인간 숙주에 더욱 관계한다:
(i) 본원 발명의 조합 벡터; 또는
(ii) 본원 발명의 첫 번째 핵산 분자, 다시 말하면 본원 발명에 따른 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 본원 발명의 개별 벡터 및 본원 발명의 두 번째 핵산 분자, 다시 말하면 본원 발명의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 본원 발명의 개별 벡터, 여기서 이들 2개의 벡터는 상기 옵션 (i) 내지 (iii)에서 규정된 바와 같은 정합 경쇄와 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 용어 "원핵생물"은 본원 발명의 단백질의 발현을 위한 DNA, 또는 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환되거나, 형질도입되거나 또는 형질감염될 수 있는 모든 세균을 포함하는 것으로 의미된다. 원핵 숙주는 그람 음성균뿐만 아니라 그람 양성균 예컨대 예를 들면, 대장균 (E. coli), 살모넬라 티피뮤리움 (S. typhimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 코리네박테리움 (Corynebacterium) (글루타미쿰 (glutamicum)), 슈도모나스 (Pseudomonas) (플루오레센스 (fluorescens)), 락토바실루스 (Lactobacillus), 스트렙토미세스 (Streptomyces), 살모넬라 (Salmonella) 및 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다.
용어 "진핵"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함하는 것으로 의미된다. 전형적인 포유류 숙주 세포는 Hela, HEK293, H9, Per.C6 및 Jurkat 세포, 생쥐 NIH3T3, NS/0, SP2/0 및 C127 세포, COS 세포, 예를 들면 COS 1 또는 COS 7, CV1, 메추라기 QC1-3 세포, 생쥐 L 세포, 생쥐 육종 세포, 보우스 흑색종 세포 및 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다. 본원 발명에 따른 예시적인 포유류 숙주 세포는 CHO 세포이다. 다른 적합한 진핵 숙주 세포는 제한 없이, 닭 세포, 예컨대 예를 들면 DT40 세포, 또는 효모 예컨대 사카로미세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 및 클루이베로미세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)를 포함한다. 발현에 적합한 곤충 세포는 예를 들면 초파리 (Drosophila) S2, 초파리 (Drosophila) Kc, 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9 및 Sf21, 또는 트리코플루시아 (Trichoplusia) Hi5 세포이다. 적합한 제브라피시 세포주는 제한 없이, ZFL, SJD 또는 ZF4를 포함한다.
상기 설명된 벡터(들)는 숙주의 유전체 내로 통합될 수 있거나 또는 염색체외로 유지될 수 있다. 일단 벡터가 적합한 숙주 내로 통합되면, 상기 숙주는 핵산 분자의 높은 수준 발현에 적합한 조건하에 유지되고, 그리고 필요에 따라, 본원 발명의 항체의 수집과 정제가 뒤따를 수 있다. 전술된 숙주 세포에 대한 적합한 배양 배지와 조건은 당해 분야에서 공지된다.
한 구체예에서, 언급된 숙주는 포유류 세포, 예컨대 인간 세포 또는 인간 세포주이다. 추가 구체예에서, 본원 발명의 벡터(들)로 형질전환된 숙주 세포는 HEK293 또는 CHO이다. 또 다른 추가 구체예에서, 본원 발명의 벡터(들)로 형질전환된 숙주 세포는 CHO이다. 이들 숙주 세포뿐만 아니라 적합한 배지와 세포 배양 조건은 당해 분야에서 설명되었다, 예를 들면 Baldi L. et al., Biotechnol Prog. 2005 Jan-Feb;21(1):148-53, Girard P. et al., Cytotechnology. 2002 Jan;38(1-3):15-21 및 Stettler M. et al., Biotechnol Prog. 2007 Nov-Dec;23(6):1340-6을 참조한다.
본원 발명에 따라서, 용어 "포함하는 벡터"에 대하여, 숙주 세포가 본원 발명의 항-cTnT 항체를 생산하는 데 필요한 및/또는 충분한 추가 핵산 서열이 이들 벡터 내에 존재하는 것으로 이해된다. 이런 추가 핵산 서열은 예를 들면 경쇄의 나머지 부분을 인코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라 중쇄의 나머지 부분을 인코딩하는 핵산 서열이다.
본원 발명에 따라서, 숙주 세포 또는 비인간 숙주는 앞서 규정된 바와 같은 경쇄와 중쇄 가변 영역 둘 모두를 인코딩하는 하나의 벡터를 포함하거나, 또는 이것은 2개의 별개의 벡터를 포함하고, 여기서 하나의 벡터는 본원 발명에 따른 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 보유하고 두 번째 벡터는 본원 발명에 따른 정합 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 보유한다. 따라서, 첫 번째 벡터가 상기 옵션 (i)에 따른 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 보유하는 경우에, 두 번째 벡터는 또한 상기 옵션 (i)에 따른 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자를 보유한다. 옵션 (ii) 및 (iii)에도, 필요한 부분만 약간 수정하여 동일하게 적용된다.
따라서, 각 경우에, 전술된 결합 능력으로 구성되는 본원 발명의 항-cTnT 항체의 생산을 담보하기 위해 하나의 항체 분자 내에 존재해야 하는 이들 핵산 분자의 발현이 서로 연결된다.
이러한 구체예에 따른 숙주 세포는 예를 들면 본원 발명의 항-cTnT 항체를 대량으로 생산하는 데 이용될 수 있다. 상기 숙주 세포는 전술된 벡터(들)를 숙주 내로 도입함으로써 생산된다. 숙주 내에 상기 벡터(들)의 존재는 이후, 본원 발명의 항-cTnT 항체의 전술된 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 분자의 발현을 매개한다. 전술된 바와 같이, 본원 발명의 벡터(들)는 전장 IgG 항체의 발현을 가능하게 하는 추가 서열을 포함하고, 그것에 의하여 숙주 세포에 의한 전장 IgG 항체의 생산을 유발할 수 있는데, 여기서 상기 항체는 본원 발명에 따른 가변 경쇄 및/또는 중쇄 도메인의 존재에 의해 특징화된다.
본원 발명은 서열 번호: 1의 cTnT에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 위한 방법에 더욱 관계하고, 상기 방법은 적합한 조건하에 본원 발명의 숙주 세포를 배양하고, 그리고 생산된 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
이러한 구체예에 따라서, 본원 발명의 숙주 내에 존재하는 벡터(들)는 발현 벡터(들)이거나, 또는 상기 벡터(들)는 본원 발명의 핵산 분자(들)의 발현이 담보되도록 하는 방식으로, 이들 핵산 분자의 숙주 세포의 유전체 내로의 안정된 통합을 매개한다. 본원 발명의 항-cTnT 항체의 개별 경쇄와 중쇄 도메인을 인코딩하는 핵산 분자가, 상기 항체의 발현이 담보되도록 성공적으로 도입된 숙주 세포의 선택을 위한 수단과 방법은 당해 분야에서 널리 알려지고 설명되었다 (Browne, S.M. & Al-Rubeai, M. [2007] Trends Biotechnol. 25:425-432; Matasci, M et al. [2008] Drug Discov. Today: Technol. 5:e37-e42; Wurm, F.M. [2004] Nat. Biotechnol. 22:1393-1398).
원핵 또는 진핵 숙주 세포를 배양하기 위한 적합한 조건은 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들면, 세균 예컨대 예를 들면 대장균 (E. coli)은 루리아 베르타니 (Luria Bertani) (LB) 배지에서, 전형적으로 4 내지 약 37℃의 온도에서 환기 하에 배양될 수 있다. 발현 산물의 수율 및 용해도를 증가시키기 위해, 배지는 둘 모두를 증강하거나 또는 조장하는 것으로 알려진 적합한 첨가제로 완충되거나 또는 보충될 수 있다. 유도성 프로모터가 숙주 세포 내에 존재하는 벡터(들)에서 본원 발명의 핵산 분자를 제어하는 이들 사례에서, 폴리펩티드의 발현은 적합한 유도제, 예컨대 예를 들면 안히드로테트라사이클린의 첨가에 의해 유도될 수 있다. 적합한 발현 프로토콜과 전략은 당해 분야에서 설명되었고 (예를 들면 Dyson, M. R., et al. (2004). BMC Biotechnol. 4, 32-49에서 및 Baldi, L. et al. (2007). Biotechnol. Lett. 29, 677-684에서), 그리고 필요하면, 특정한 숙주 세포의 요구 및 발현되는 단백질의 요건에 맞춰 조정될 수 있다.
세포 유형 및 이의 특정한 요건에 따라서, 포유류 세포 배양은 예를 들면 10% (v/v) FCS, 2 mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 내포하는 RPMI, Williams' E 또는 DMEM 배지에서 실행될 수 있다. 세포는 예를 들면 5% CO2, 물-포화된 분위기에서 37 ℃에서 또는 DT40 닭 세포의 경우 41 ℃에서 유지될 수 있다.
곤충 세포 배양을 위한 적합한 배지는 예를 들면 TNM + 10% FCS, SF900 또는 HyClone SFX-곤충 배지이다. 곤충 세포는 통상적으로, 27℃에서 부착 또는 현탁 배양액으로서 성장된다.
진핵 또는 척추동물 세포에 대한 적합한 발현 프로토콜은 당업자에게 널리 알려져 있고, 그리고 예를 들면 Sambrook, J & Russel, D.W. [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY)로부터 검색될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법은 포유류 세포, 예컨대 예를 들면 CHO 또는 HEK293 세포를 이용하여 실행된다. 추가 구체예에서, 상기 방법은 CHO 세포를 이용하여 실행된다.
재조합 생산 절차에서 이용된 숙주에 따라서, 발현된 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비글리코실화될 수 있다. 한 구체예에서, 본원 발명의 항체의 코딩 서열을 내포하고 거기에 N 말단 FLAG-태그 및/또는 C 말단 His-태그가 유전적으로 융합된 플라스미드 또는 바이러스가 이용된다. 추가 구체예에서, 상기 FLAG-태그의 길이는 약 4 내지 8개의 아미노산, 예컨대 예를 들면 정확하게는 8개의 아미노산이다. 전술된 벡터는 당업자에게 통상적으로 공지된 임의의 기술을 이용하여 숙주를 형질전환하거나 또는 형질감염시키는 데 이용될 수 있다. 게다가, 융합된, 작동가능하게 연결된 유전자를 준비하고 이들을 예를 들면, 포유류 세포와 세균에서 발현하기 위한 방법은 당해 분야에서 널리 알려져 있다 (Sambrook, loc cit.).
형질전환된 숙주는 최적 세포 성장을 달성하는 당해 분야에서 공지된 기술에 따라서 생물반응기에서 성장되고 배양될 수 있다. 본원 발명의 항체는 이후, 성장 배지로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 미생물학적으로 발현된 항체의 단리와 정제는 임의의 전통적인 수단 예컨대 예를 들면, 친화성 크로마토그래피 (예를 들면 융합-태그 예컨대 Strep-태그 II 또는 His6 태그를 이용), 겔 여과 (크기 배제 크로마토그래피), 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 역상 HPLC 또는 면역침전에 의할 수 있다. 이들 방법은 당해 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 예를 들면 Sambrook, J & Russel, D.W. [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY)에서 전반적으로 설명되었다.
본원 발명에 따라서, 용어 "생산된 항체를 단리하는"은 본원 발명의 항-cTnT 항체의 단리를 지칭하는 것으로 인지될 것이다.
본원 발명은 다음 중에서 적어도 한 가지를 포함하는 조성물에 더욱 관계한다:
(i) 본원 발명의 항체,
(ii) 본원 발명의 핵산 분자,
(iii) 본원 발명의 벡터,
(iv) 본원 발명의 숙주 세포 및/또는
(v) 본원 발명의 방법에 의해 생산된 항체.
본원 발명에 따라서 이용된 바와 같이, 용어 "조성물"은 언급된 화합물 중에서 적어도 한 가지를 포함하는 조성물에 관계한다. 이것은 임의적으로, 본원 발명의 화합물의 특징을 변경하고, 그것에 의하여 예를 들면, 이들의 기능을 안정시키고, 조정하고 및/또는 증강할 수 있는 추가 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있고, 그리고 그 중에서도 특히, (a) 분말(들), (a) 정제(들) 또는 (a) 용액(들)의 형태일 수 있다.
조성물의 성분은 하나의 용기 또는 복수의 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 또는 바이알에서, 수성 용액으로서 또는 재구성을 위한 동결 건조된 제제로서 포장될 수 있다. 동결 건조된 제제의 한 가지 실례로서, 10-ml 바이알이 5 ml의 1% (w/v) 또는 10% (w/v) 수성 용액으로 채워지고, 그리고 결과의 혼합물이 동결 건조된다. 이용을 위한 용액은 예를 들면 치료적 용도를 위한 주사용수, 또는 진단 목적을 위한 다른 원하는 용매, 예를 들면 완충액 중 어느 한 가지를 이용하여, 동결 건조된 화합물(들)을 재구성함으로써 제조된다. 보존제 및 다른 첨가제 예컨대 예를 들면, 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 비활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
조성물의 다양한 성분은 사용법과 함께 키트로서 포장될 수 있다.
한 구체예에서, 본원 발명의 조성물은 당업자가 당해 분야에서 널리 알려진 시험관내 또는 탈체 방법, 예를 들면, 면역검정과 같은 방법을 실행할 수 있게 하는 조성물이다.
본원 발명의 항체를 활용할 수 있는 면역검정의 실례는 직접적인 또는 간접적인 형식 중 어느 한 가지에서 면역검정이다. 이런 면역검정의 실례는 효소 연결된 면역 흡착 검정 (ELISA), 효소 면역검정 (EIA), 방사면역검정 (RIA), 또는 발광, 형광, 화학발광 또는 전기화학발광의 검출에 기초된 면역검정이다.
심장 트로포닌 T (cTnT)는 예를 들면 US 6,333,397 및 US 6,376,206에서 각각 개시된 바와 같은 샌드위치 면역검정에 의해 가장 잘 검출되고, 그리고 cTnT의 계측을 위한 본질적으로 모든 차세대 검정에서 확증된다. Roche Diagnostics, Germany에 의해 판매된 5세대 cTnT-검정, cTnT에 대한 높은 민감도 검정 (hs-cTnT)에서, 샌드위치 면역검정 원리가 여전히 이용된다. 이러한 검정은 높은 민감도 검정인데, 그 이유는 이것이 5ng/ml의 검출 하한선 (LOD)에서 cTnT를 검출할 수 있기 때문이다. 검정 시간은 이용된 검정 프로토콜에 의존하고, 그리고 각각, 9 또는 18 분의 전반적으로 매우 짧은 인큐베이션 시간에도 불구하고 우수한 LOD가 도달된다. 이러한 검정에서 비오틴화된 포획 항체 및 루테닐화된 검출 항체를 포함하는 샌드위치가 형성된다. 이러한 복합체는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드에 결합되고, 그리고 결합되지 않은 물질은 배출된다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 만약 Kd가 뛰어나지 않으면, 이것은 상당히 결정적인데, 그 이유는 일부 해리가 발생하여 감소된 신호, 직접적으로는 감소된 LOD로의 번역을 야기할 것이기 때문이다.
당업자에게 명백한 바와 같이, cTnT의 검출을 위한 방법에서 본원 발명에 따른 항체를 이용하는 것이 유리할 것이다. 한 구체예에서 본원 발명은 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)을 결정하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 인간 심장 트로포닌 T에 대한 앞서 개시된 바와 같은 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서 본원 발명은 표본 내에서 cTnT를 검출하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 a) 항-cTnT 항체/cTnT 복합체의 형성에 충분한 시간 동안 및 조건하에, 표본을 본원 발명에 따른 항-cTnT 항체와 접촉시키는 단계; 및 b) 항-cTnT 항체/cTnT 복합체를 계측하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 복합체의 양은 표본 내에서 cTnT의 농도를 표시한다. 예를 들면, "항-cTnT 항체/cTnT 복합체"에서 용어 "/"는 비공유 복합체가 한편으로 항-cTnT 항체 및 다른 한편으로 cTnT 사이에 형성된다는 것을 표시하는 데 이용된다.
한 구체예에서 본원 발명은 표본 내에 cTnT를 검출하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 a) 첫 번째 항-cTnT 항체/cTnT/두 번째 항-cTnT 항체 복합체를 형성하는 데 충분한 시간 동안 및 조건하에, 표본을 cTnT에 대한 첫 번째 항체 및 cTnT에 대한 두 번째 항체와 접촉시키되, 두 번째 항체가 검출가능하게 표지화되는 단계; 및 b) (a)에서 형성된 복합체를 계측하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 복합체의 양은 표본 내에 cTnT의 농도를 표시하고, 그리고 여기서 첫 번째 또는 두 번째 항체 중 어느 하나는 본원 발명에 따른 항체이다.
당업자에게 명백한 바와 같이 표본은 첫 번째 항-cTnT 항체/cTnT/두 번째 항-cTnT 항체 복합체를 형성하는 데 충분한 시간 동안 및 조건하에, 첫 번째와 두 번째 항체와 임의의 원하는 순서로, 다시 말하면 첫 번째 항체 먼저, 두 번째 항체; 첫 번째 항체보다 두 번째 항체 먼저, 또는 동시에 접촉될 수 있다.
당업자가 쉽게 인지하는 바와 같이, 특정한 항 cTnT 항체 및 cTnT 항원/피분석물 사이의 복합체 (=항-cTnT 항체/cTnT 복합체)의 형성, 또는 cTnT에 대한 첫 번째 항체, cTnT (피분석물) 및 두 번째 항-cTnT 항체 복합체를 포함하는 이차 또는 샌드위치 복합체 (=첫 번째 항-cTnT 항체/cTnT/두 번째 항-cTnT 항체 복합체)의 형성에 적합하거나 또는 충분한 시간과 조건을 확립하는 것은 그저 일과적인 실험일 뿐이다.
항-cTnT 항체/cTnT 복합체, 또는 첫 번째 항-cTnT 항체/cTnT/두 번째 항-cTnT 항체 복합체의 검출은 각각, 임의의 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 이런 수단/방법에 절대적으로 익숙하다.
한 구체예에서 본원 발명은 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 항체의 용도에 관계하고, 상기 항체는 CDR들이 하기 아미노산 서열들 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른 이들의 변이체를 포함하는 것으로 특징화되고: (i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고 (ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 시험관내 진단 방법에서 앞서 개시된 임의의 다른 항체의 용도에 관계한다.
용어 "표본" 또는 "관심되는 표본" 또는 "검사 표본"은 본원에서 교체가능하게 이용된다. 표본은 시험관내 표본이고, 이것은 시험관내에서 분석되고 신체로 다시 이전되지 않을 것이다. 표본의 실례는 유체 표본 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 윤활액, 소변, 타액 및 림프액, 또는 고체 표본 예컨대 조직 추출물, 연골, 뼈, 윤활막 및 결합 조직을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 한 구체예에서 표본은 혈액, 혈청, 혈장, 윤활액 및 소변에서 선택된다. 한 구체예에서 표본은 혈액, 혈청 및 혈장에서 선택된다. 한 구체예에서 표본은 혈청 또는 혈장이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "참조 표본"은 관심되는 표본과 실제적으로 동일한 방식으로 분석되고 정보가 관심되는 표본의 것과 비교되는 표본을 지칭한다. 참조 표본은 따라서, 관심되는 표본으로부터 획득된 정보의 평가를 가능하게 하는 기준을 제공한다. 참조 표본은 건강한 또는 정상적인 조직, 장기 또는 개체로부터 유래될 수 있고, 그것에 의하여 조직, 장기 또는 개체의 건강한 상태의 기준을 제공할 수 있다. 정상적인 참조 표본의 상태 및 관심되는 표본의 상태 사이의 차이는 질환 진전의 위험, 또는 이런 질환 또는 장애의 존재 또는 추가 진행을 표시할 수 있다. 참조 표본은 비정상적인 또는 병든 조직, 장기 또는 개체로부터 유래될 수 있고, 그것에 의하여 조직, 장기 또는 개체의 병든 상태의 기준을 제공할 수 있다. 비정상적인 참조 표본의 상태 및 관심되는 표본의 상태 사이의 차이는 질환 진전의 낮아진 위험, 또는 이런 질환 또는 장애의 부재 또는 호전을 표시할 수 있다.
지표의 용어 "상승된" 또는 "증가된" 수준은 참조 또는 참조 표본 내에 이런 지표의 수준과 비교하여 더 높은, 표본 내에 이런 지표의 수준을 지칭한다. 예를 들면 소정의 질환을 앓지 않는 개체의 동일한 유체 표본에서보다, 상기 질환을 앓는 개체의 유체 표본에서 더 많은 양으로 검출 가능한 단백질은 상승된 수준을 갖는다.
일정한 구체예에서 cTnT에 대한 첫 번째 항체, cTnT (피분석물) 및 cTnT에 대한 두 번째 항체를 포함하는 샌드위치가 형성될 것인데, 여기서 두 번째 항체는 검출가능하게 표지화된다.
일반적으로 하기 범주로 군화될 수 있는 다양한 표지 (염료로서 또한 지칭됨)가 가용한데, 이들 모두 함께 및 이들 각각은 본원 발명에 따른 구체예를 나타낸다:
(a) 형광 염료
형광 염료는 예를 들면 Briggs et al "Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058)에 의해 설명된다.
형광 표지 또는 형광단은 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인을 비롯한 플루오레세인 유형 표지; TAMRA를 비롯한 로다민 유형 표지; 단실; 리사민; 시아닌; 피코에리트린; 텍사스 레드; 및 이들의 유사체를 포함한다. 형광 표지는 본원에서 개시된 기술을 이용하여, 표적 분자 내에 포함된 알데히드 기에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) 및 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.)로부터 상업적으로 가용한 것들을 포함한다.
(b) 발광 염료
발광 염료 또는 표지는 화학발광 염료 및 전기화학발광 염료로 더욱 하위범주화될 수 있다.
상이한 부류의 화학발광성 표지는 루미놀, 아크리디늄 화합물, 코엘린테라진 및 유사체, 디옥세탄, 퍼옥시옥살산에 기초된 시스템 및 이들의 유도체를 포함한다. 면역진단 절차를 위해 주로 아크리디늄 기초된 표지가 이용된다 (상세한 개요는 Dodeigne C. et al., Talanta 51 (2000) 415-439에서 제공된다).
전기화학발광 표지로서 이용된 주로 관련된 표지는 각각, 루테늄- 및 이리듐-기반 전기화학발광 복합체이다. 전기화학발광 (ECL)은 고도로 민감하고 선택적인 방법으로서 분석적 적용에서 매우 유용한 것으로 입증되었다. 이것은 전극 전위를 적용함으로써, 화학발광 분석의 분석적 이점 (배경 광학 신호의 부재)을 반응 제어의 용이함과 조합한다. 일반적으로, 액체상 또는 액체-고체 인터페이스에서 TPA (트리프로필아민)로 재생되는 루테늄 복합체, 특히 [Ru (Bpy)3]2+ (이것은 ~620 nm에서 광양자를 방출한다)가 ECL-표지로서 이용된다. 최근에 이리듐-기반 ECL-표지 또한 설명되었다 (WO2012107419(A1)).
(c) 방사성 표지는 방사성동위원소 (방사성 핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 131Bi를 이용한다.
(d) 영상화 및 치료 목적을 위한 표지로서 적합한 금속-킬레이트 복합체는 당해 분야에서 널리 알려져 있다 (US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).
한 구체예에서 cTnT에 대한 첫 번째 항체, cTnT (피분석물) 및 cTnT에 대한 두 번째 항체를 포함하는 샌드위치가 형성될 것인데, 여기서 두 번째 항체는 검출가능하게 표지화되고, 그리고 여기서 첫 번째 항-cTnT 항체는 고체상에 결합할 수 있거나 또는 고체상에 결합된다.
한 구체예에서 본원 발명에서 개시된 항-cTnT 항체는 cTnT를 계측하기 위한 면역검정에서 이용된다. 한 구체예에서 앞서 개시된 항-cTnT 항체는 샌드위치-유형 면역검정에서 이용된다. 한 구체예에서 본원 발명에서 개시된 항-cTnT 항체는 검출 항체로서 이용된다. 한 구체예에서 본원에서 개시된 바와 같은 항-cTnT 항체는 발광 염료, 특히 화학발광 염료 또는 전기화학발광 염료로 검출가능하게 표지화된다.
이런 저런 구체예가 본원 발명의 설명 및 실시예에 의해 개시되고 포괄된다. 본원 발명에 따라서 이용되는 방법, 용도 및 화합물 중에서 한 가지와 관련된 추가 문헌은 예를 들면 전자 장치를 이용하여, 공공 도서관 및 데이터베이스로부터 검색될 수 있다. 예를 들면, 인터넷에서 이용 가능한 공개 데이터베이스 "Medline"은 예를 들면, ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html 하에 월드와이드웹에서 활용될 수 있다. 추가 데이터베이스, 그리고 월드와이드웹에서 이용 가능한 주소, 예컨대 ncbi.nlm.nih.gov/, fmi.ch/biology/research_tools.html,tigr.org/, 또는 infobiogen.fr/는 당업자에게 알려져 있고, 그리고 또한, lycos.com 하에 월드와이드웹에서 주소를 이용하여 획득될 수 있다.
별도로 규정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본원 발명이 속하는 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 충돌하는 경우에는, 정의를 비롯한 특허 명세서가 우선할 것이다.
본원에서 제공된 모든 아미노산 서열은 당해 분야에서 관례적으로 행위되는 바와 같이, 가장 N 말단 잔기로 시작하여 가장 C 말단 잔기로 끝나도록 제시되고 (N→C), 그리고 본원 발명의 전역에서 아미노산을 식별하는 데 이용된 1 문자 또는 3 문자 코드 약어는 아미노산에 대해 통상적으로 이용되는 것들에 상응한다.
본 명세서에서, 특히 청구항에서 특징화된 구체예에 관하여, 종속항에서 언급된 각 구체예는 상기 종속항이 의존하는 각 청구항 (독립항 또는 종속항)의 각 구체예와 조합되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 3가지 대안 A, B 및 C를 나열하는 독립항 1, 3가지 대안 D, E 및 F을 나열하는 종속항 2, 그리고 청구항 제1항 및 제2항에 의존하고 3가지 대안 G, H 및 I를 나열하는 청구항 3의 경우에, 본 명세서는 별도로 구체적으로 언급되지 않으면, 조합 A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I에 상응하는 구체예를 명백하게 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
유사하게, 그리고 또한 독립항 및/또는 종속항이 대안을 나열하지 않는 이들 사례에서, 만약 종속항이 복수의 선행 청구항을 다시 인용하면, 그것에 의하여 커버된 요부의 임의의 조합이 명시적으로 개시된 것으로 고려되는 것으로 이해된다. 예를 들면, 독립항 1, 청구항 제1항을 다시 인용하는 종속항 2, 그리고 청구항 제2항 및 제1항 둘 모두를 다시 인용하는 종속항 3의 경우에, 청구항 제3항 및 제1항의 요부의 조합이 청구항 제3항, 제2항 및 제1항의 요부의 조합이 그러한 것처럼 명백하고 분명하게 개시된다는 결론이 나온다. 청구항 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항을 인용하는 추가 종속항 4가 존재하는 경우에, 청구항 제4항 및 제1항, 청구항 제4항, 제2항 및 제1항, 청구항 제4항, 제3항 및 제1항뿐만 아니라 청구항 제4항, 제3항, 제2항 및 제1항의 요부의 조합이 명백하고 분명하게 개시된다는 결론이 나온다.
상기 고려 사항은 모든 첨부된 청구항에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다. 무제한적 실례를 제공하기 위해, 청구항 제13항, 제12항 및 제1항 (i)의 조합이 청구항 구조에 비추어 명백하고 분명하게 구상된다. 청구항 제13항, 제11항 및 제4항 (ii)의 조합 등에도 동일하게 적용된다.
본원 발명의 일정한 양상은 또한, 첨부된 도면에 의하여 도해된다.
도면에 관한 설명:
도 1: 중쇄 CDR들 중 하나 또는 그 이상 내에서 아미노산 치환을 인코딩하는 DNA 라이브러리의 작제
도 1a: 돌연변이체 라이브러리의 작제에서 필요한 중쇄 단편의 생산 (단계1). 첫 번째 라운드 (PCR 1)에서 각각, 단편 1, 3 및 4에 상응하는 3개의 상이한 중쇄 단편이 상응하는 프라이머 세트의 도움으로 산출되었다. 담회색 스트레치는 CDR들을 표시한다. 중추 서열은 검은색으로 제시된다. 수평 화살표는 이용된 프라이머를 표시한다. 수직 화살표는 PCR의 결과를 표시한다. 상기 도면에서 가위표로 지워지는 짧은 42개 bp 올리고뉴클레오티드 (단편 2)는 PCR에 의해 획득되지 않고 화학적으로 별개로 합성되었다.
도 1b: CDR 단일 아미노산 무작위화에 의한 HC 라이브러리 합성. 두 번째 단계 PCR 2에서, 도 1a에서 설명된 바와 같이 획득된 4개의 단편이 주형 (검은색 선)으로서 역할을 하였다. X 표시가 있는 수평 화살표는 각 CDR 코돈 위치에 대한 변성된 NNK 코돈을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 표시한다. 이들 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 이에 더하여, 필요 및 표시에 따라, 단계 1의 단편 중에서 1개 또는 2개에 혼성화할 수 있는 서열 스트레치를 포함한다. 정방향과 역방향 프라이머가 각각, 개별 PCR을 수행하는 데 이용되었다 (작은 화살표).
도 1c: 라이브러리 합성의 최종 단계: 단계 1의 단편 중에서 1개 또는 2개에 혼성화할 수 있는 추가 서열 스트레치가 HC 라이브러리의 생산에서 최종 단계, 다시 말하면 PCR 2의 4가지 모든 산물을 이용한 중복 PCR을 수행하는 데 요구된다. 말단 프라이머 (F1A; R1A)가 이용되고, 그리고 이들 단편 자체가 이러한 중복 PCR에서 메가 프라이머로서 행동한다.
도 2: 주번세포질 Fab 발현에 대한 벡터 맵: 제공된 도면에서 설명은 자명한 것으로 고려되고, 그리고 모든 요소는 당업자에게 알려져 있다.
도 3: cTnT 결합 Fab 단편의 선별검사를 위한 ELISA 셋업: 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로역가 평판 (SA 평판)이 비오틴화된 심장 트로포닌 T (bi-cTnT)를 고체상에 결합시키는 데 이용된다. 재조합 항-cTnT 중쇄를 포함하는 Fab 단편 (<cTnT>-Fab)은 TnT에 결합하고 퍼옥시다아제 (POD)-표지화 항뮤린 Fab 항체 (항 muFab-POD)를 통해 검출된다.
도 4: Biacore 센서그램: Fab 단편 mAb<TnT>rM-11-7 내에 위치 A102에서 단일 아미노산 돌연변이의 영향이 37℃에서 활동적으로 분석되었다. 상대적 반응 단위 (RU, rel.resp.unit)는 초 (s) 단위로 모니터링된 실시간 SPR 계측의 신호 수준을 표시한다. mAb<TnT>rM-11-7 Fab A102 (야생형), A102W, A102F, A102Y, A102H, A102E, A102R, A102L, A102N, A102D, A102R 및 A102K에 대한 Biocore 계측이 도시된다.
도 5: 정규화된 Biacore 센서그램: Fab/트로포닌 T 복합체 해리 동역학의 오버레이. 돌연변이 A102W가 상기 복합체를 가장 잘 안정시키고, A102F가 그 뒤를 잇는다. A102Y는 야생형-유사 (A102) 해리 특성을 보여준다. 모든 다른 돌연변이는 부모 A102 Fab 단편과 비교할 때, 오히려 더 빠른 복합체 해리를 보여준다.
도 6: Elecsys® 샌드위치 검정: 검정 셋업을 보여주는 설정이 묘사된다. (돌연변이체) 비오틴화된 (bi) 포획 항체가 스트렙타비딘 (SA) 코팅된 비드에 부착된다. 항-cTnT 검출 항체는 루테닐화되었고 (Ru), 그리고 향상된 친화성의 효과가 ECL 분석에 의해 조사되었다.
도 7: cTnT의 계측을 위한 부모 및 돌연변이체 항체의 이용: 비 성숙된, 상업적인 표준 면역학적 시약 (왼쪽, 부모) 및 비오틴화된 표준 항체 접합체가 성숙된 비오틴화된 mAb<TnT>rM-11-7(A102W)-Fab에 의해 대체된 시약 (오른쪽, A102W)을 이용한 cTNT 결정에 대한 임의 발광 단위 (수치)가 도시된다. 흰색 칼럼: Diluent Universal 블랭크 값. 담회색 칼럼: 18 pg/ml 재조합 TnT (recTnT, Roche)를 내포하는 교정기 Cal1. 암회색 칼럼: 4200 pg/ml recTnT를 내포하는 교정기 Cal2.
하기 실시예는 본원 발명을 예시한다:
실시예 1: 재료 & 일반적인 방법
재조합 DNA 기술
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989에서 설명된 바와 같은 표준 방법이 DNA를 조작하는 데 이용되었다. 분자 생물학적 시약은 제조업체의 사용설명서에 따라서 이용되었다.
DNA 서열 결정
DNA 서열은 Microsynth AG (Balgach, Switzerland)에서 수행된 이중 가닥 염기서열분석에 의해 결정되었다.
DNA와 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
벡터 NT1 Advance 스위트 버전 11.5.0이 서열 창출, 매핑, 분석, 주해 및 도해에 이용되었다.
단백질 화학 및 표지화 기술
표준 단백질 화학 및 표지화 기술은 예를 들면 Hermanson, G. "Bioconjugate Techniques" 3rd Edition (2013) Academic Press에서 제공된다.
생물정보학
생물정보학 방법은 예를 들면 Keith J.M. (ed.) "Bioinformatics" Vol. I and Vol. II, Methods in Molecular Biology Vol. 1525 and Vol. 1526 (2017) Springer에서 및 Martin, A.C.R. & Allen, J. "Bioinformatics Tools for Analysis of Antibodies"in: D
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bel S. & Reichert J.M. (eds.) "Handbook of Therapeutic Antibodies" Wiley-VCH (2014)에서 제공된다.
전기화학발광 면역검정
면역검정 및 관련된 방법은 예를 들면 Wild D. (ed.) "The Immunoassay Handbook" 4th Edition (2013) Elsevier에서 제공된다. 전기화학발광 표지로서 루테늄 복합체는 예를 들면 Staffilani M. et al. Inorg. Chem. 42 (2003) 7789-7798에서 제공된다. 전형적으로, 전기화학발광 (ECL) 기초된 면역검정의 성과에 대해, Elecsys® 2010 분석기 또는 후임자 시스템, 예를 들면 Roche 분석기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Germany) 예컨대 E170, cobas e 601 모듈, cobas e 602 모듈, cobas e 801 모듈 및 cobas e 411, 그리고 이들 분석기용으로 설계된 Roche Elecsys® 검정이 이용되었는데, 이들은 각각 별도로 표시되지 않으면, 표준 조건하에 이용되었다.
실시예 2: 라이브러리 작제
부모 항체 가변 중쇄는 뮤린 기원 (서열 번호: 30)이다. 돌연변이된 HCCDR들을 포함하는 라이브러리가 HCCDR1, HCCDR2 및/또는 HCCDR3에서 각각, 단일 아미노산 무작위화의 목적으로 작제되었다. 첫 번째 단계에서, 4개의 상이한 부모 항체 프레임워크 영역 중에서 하나를 각각 인코딩하는 4개의 DNA 단편이 산출되었다. 프레임워크 영역 1, 3 및 4는 중합효소 연쇄 반응에 의해 인하우스 획득되었고, 프레임워크 영역 2를 나타내는 짧은 단편 2 (42개 bp = 서열 번호: 50)는 Metabion international AG에 주문되었다 (참조: 도 1a). 이들 단편은 겔 정제되고 정량되었다. 이들 DNA 단편 중에서 한 가지의 100 ng이 4개의 추가 PCR 반응 혼합물 각각에서 폴리뉴클레오티드 주형으로서 이용되었다. CDR 영역들이 부모 CDR과 동일한 숫자의 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리의 이용에 의해 부가되었는데, 여기서 상기 라이브러리의 구성원은 개별 HCCDR 내에 개별 코돈 위치 각각에 대해 하나의 NNK 코돈을 갖는 라이브러리 구성원을 포함하도록 설계되었다. CDR 라이브러리 내에 폴리뉴클레오티드는 개별 CDR에 인접한 프레임워크 영역에 혼성화할 수 있는 서열을 추가로 포함하였다. 말단 프라이머가 네스티드 PCR 증폭에 이용되었다. 그것에 의하여 (참조: 도 1b), 부분적으로 중첩되는 서열을 갖는 4개의 DNA 단편이 산출되었다. FW1 서열의 3' 단부 및 FW4 서열의 5' 단부에 혼성화하는 말단 프라이머를 이용한 중복 PCR이 이들 4개 단편을 선형 DNA 라이브러리 작제물에 연결하기 위해 수행되었다 (참조: 도 1c). 전형적인 PCR 반응물은 MgSO4, 200 μM dNTP 믹스, 0.5 μM 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 250 ng DNA 주형, 5 단위 Pwo DNA 중합효소를 포함하는 10 μl 10 x PCR 완충액을 내포하는 100 μl 반응 믹스에 PCR 등급 물로 채워졌다. 전형적인 PCR은 94 ℃에서 5 분 동안 초기 주형 변성으로 시작되고, 30회 주기 (94 ℃ 2 분, 60 ℃ 45 초, 72 ℃ 1 분)를 이용하고, 그리고 72 ℃에서 5 분 동안 최종 신장 단계를 내포하였다. 프라이머, 주형 및 단편 서열은 표 1에서 열거된다. 라이브러리 단편은 세포-없는 시스템에서 성공적인 전사와 번역을 위해 필요한 모든 조절 서열을 내포하였다. 당업자는 최신 방법을 따름으로써 이런 라이브러리를 산출할 수 있다, 예를 들면 Hanes, J. & Pluckthun, A. (1997), "In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display", Proc Natl Acad Sci U.S.A. 94, 4937-42를 참조한다.
표 1:
항-cTnT Fab 단편 라이브러리의 산출에 이용된 서열
PCR 1 서열 번호:
F1A CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCC 31
1-fr.1rv GGTAAAGGTATAGCCGCTCGCTTTGC 32
1-fr.3fw GCGGACGATTTTAAAGGCCGCTTTGC 33
1-fr.3rv GCGAACGCAAAAATAGGTCGCGG 34
1-fr.4fw GGGCCAGGGTACCAGCGTGACCG 35
R1A AACCCCCGCATAGGCTGGGGGTTGGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACG 36
PCR 2
단편 1
Frt GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT 37
2-H1 rv 믹스
2-H1 rv1 CCTGTTTCACCCAATGCATACTGAAMNNGGTAAAGGTATAGC 38
2-H1 rv2 CCTGTTTCACCCAATGCATACTMNNATCGGTAAAGGTATAGC 39
2-H1 rv3 CCTGTTTCACCCAATGCATMNNGAAATCGGTAAAGGTATAGC 40
2-H1 rv4 CCTGTTTCACCCAATGMNNACTGAAATCGGTAAAGGTATAGC 41
2-H1 rv5 CCTGTTTCACCCAMNNCATACTGAAATCGGTAAAGGTATAGC 42
2-fr.1 rv GCCTGTTTCACCCA 43
단편 2
2-fr.2 fw GCAAAGCGAGCGGCTATACCTTTACC 44
2-H1 fw 믹스
2-H1 fw1 GCTATACCTTTACCNNKTTCAGTATGCATTGGGTGAAACAGG 45
2-H1 fw2 GCTATACCTTTACCGATNNKAGTATGCATTGGGTGAAACAGG 46
2-H1 fw3 GCTATACCTTTACCGATTTCNNKATGCATTGGGTGAAACAGG 47
2-H1 fw4 GCTATACCTTTACCGATTTCAGTNNKCATTGGGTGAAACAGG 48
2-H1 fw5 GCTATACCTTTACCGATTTCAGTATGNNKTGGGTGAAACAGG 49
단편 2 (CDRH1 & CDRH2 사이의 프레임) TGGGTGAAACAGGCCCCGGGCAAAGGCCTGAAATGGATGGGC

 50
2-H2 rv 믹스
2-H2 rv1 CGTCCGCATAGGTCGGTTCGCCGGTTTCGGTGTTGATMNNGCCCATCCATTTCAGG 51
2-H2 rv2 CGTCCGCATAGGTCGGTTCGCCGGTTTCGGTGTTMNNCCAGCCCATCCATTTCAGG 52
2-H2 rv3 CGTCCGCATAGGTCGGTTCGCCGGTTTCGGTMNNGATCCAGCCCATCCATTTCAGG 53
2-H2 rv4 CGTCCGCATAGGTCGGTTCGCCGGTTTCMNNGTTGATCCAGCCCATCCATTTCAGG 54
2-H2 rv5 CGTCCGCATAGGTCGGTTCGCCGGTMNNGGTGTTGATCCAGCCCATCCATTTCAGG 55
2-H2 rv6 CGTCCGCATAGGTCGGTTCGCCMNNTTCGGTGTTGATCCAGCCCATCCATTTCAGG 56
2-H2 rv7 CGTCCGCATAGGTCGGTTCMNNGGTTTCGGTGTTGATCCAGCCCATCCATTTCAGG 57
2-H2 rv8 CGTCCGCATAGGTCGGMNNGCCGGTTTCGGTGTTGATCCAGCCCATCCATTTCAGG 58
2-H2 rv9 CGTCCGCATAGGTMNNTTCGCCGGTTTCGGTGTTGATCCAGCCCATCCATTTCAGG 59
2-H2 rv10 CGTCCGCATAMNNCGGTTCGCCGGTTTCGGTGTTGATCCAGCCCATCCATTTCAGG 60
2-fr.2 rv GCAAAGCGGCCTTTAAAATCGTCCGCATA 61
단편 3
2-fr.3 fw GGCAAAGGCCTGAAATGGATGGGC 62
2-H2 fw 믹스
2-H2 fw1 CCTGAAATGGATGGGCNNKATCAACACCGAAACCGGCGAACCGACCTATGCGGACG 63
2-H2 fw2 CCTGAAATGGATGGGCTGGNNKAACACCGAAACCGGCGAACCGACCTATGCGGACG 64
2-H2 fw3 CCTGAAATGGATGGGCTGGATCNNKACCGAAACCGGCGAACCGACCTATGCGGACG 65
2-H2 fw4 CCTGAAATGGATGGGCTGGATCAACNNKGAAACCGGCGAACCGACCTATGCGGACG 66
2-H2 fw5 CCTGAAATGGATGGGCTGGATCAACACCNNKACCGGCGAACCGACCTATGCGGACG 67
2-H2 fw6 CCTGAAATGGATGGGCTGGATCAACACCGAANNKGGCGAACCGACCTATGCGGACG 68
2-H2 fw7 CCTGAAATGGATGGGCTGGATCAACACCGAAACCNNKGAACCGACCTATGCGGACG 69
2-H2 fw8 CCTGAAATGGATGGGCTGGATCAACACCGAAACCGGCNNKCCGACCTATGCGGACG 70
2-H2 fw9 CCTGAAATGGATGGGCTGGATCAACACCGAAACCGGCGAANNKACCTATGCGGACG 71
2-H2 fw10 CCTGAAATGGATGGGCTGGATCAACACCGAAACCGGCGAACCGNNKTATGCGGACG 72
2-H3 rv 믹스
2-H3 rv1 GGTACCCTGGCCCCAATAATCCATCGCATGMNNGCGAACGCAAAAATAGG 73
2-H3 rv2 GGTACCCTGGCCCCAATAATCCATCGCMNNGCTGCGAACGCAAAAATAGG 74
2-H3 rv3 GGTACCCTGGCCCCAATAATCCATMNNATGGCTGCGAACGCAAAAATAGG 75
2-H3 rv4 GGTACCCTGGCCCCAATAATCMNNCGCATGGCTGCGAACGCAAAAATAGG 76
2-H3 rv5 GGTACCCTGGCCCCAATAMNNCATCGCATGGCTGCGAACGCAAAAATAGG 77
2-H3 rv6 GGTACCCTGGCCCCAMNNATCCATCGCATGGCTGCGAACGCAAAAATAGG 78
2-fr.3 rv CGGTCACGCTGGTACCCTGGCCCC 79
단편 4
2-fr.4 fw CCGCGACCTATTTTTGCGTTCGC 80
2-H3 fw 믹스
2-H3 fw1 CCTATTTTTGCGTTCGCNNKCATGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGTACC 81
2-H3 fw2 CCTATTTTTGCGTTCGCAGCNNKGCGATGGATTATTGGGGCCAGGGTACC 82
2-H3 fw3 CCTATTTTTGCGTTCGCAGCCATNNKATGGATTATTGGGGCCAGGGTACC 83
2-H3 fw4 CCTATTTTTGCGTTCGCAGCCATGCGNNKGATTATTGGGGCCAGGGTACC 84
2-H3 fw5 CCTATTTTTGCGTTCGCAGCCATGCGATGNNKTATTGGGGCCAGGGTACC 85
2-H3 fw6 CCTATTTTTGCGTTCGCAGCCATGCGATGGATNNKTGGGGCCAGGGTACC 86
Rrt GGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACGGATGCCCTGTGC 87
중복 PCR
F1A CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCC 88
R1A AACCCCCGCATAGGCTGGGGGTTGGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACG 89
PCR 단편 1 gggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcagattcagctggtgcagagcggcccggaactgaaaaaaccgggcgaaaccgtgaaaattagctgcaaagcgagcggctatacctttaccGATTTCAGTATGCATtgggtgaaacaggc 90
PCR 단편 2 gcaaagcgagcggctatacctttacc GATTTCAGTATGCAT tgggtgaaacaggccccgggcaaaggcctgaaatggatgggc TGGATCAACACCGAAACCGGCGAACCGACC tatgcggacgattttaaaggccgctttgc 91
PCR 단편 3 ggcaaaggcctgaaatggatgggc TGGATCAACACCGAAACCGGCGAACCGACC tatgcggacgattttaaaggccgctttgcgtttagcctggaaaccagcgcgaccaccgcgtatctgcagattaacaacctgaaaaacgaagataccgcgacctatttttgcgttcgc AGCCATGCGATGGATTAT tggggccagggtaccagcgtgaccg 92
PCR 단편 4 ccgcgacctatttttgcgttcgc AGCCATGCGATGGATTAT tggggccagggtaccagcgtgaccgtgagcagcgcgaaaaccaccccgccgagcgtgtatccgctggcgccgggcagcgcggcgcagaccaacagcatggtgaccctgggctgcctggtgaaaggctattttccggaaccggtgaccgtgacctggaacagcggcagcctgagcagcggcgtgcatacctttccggcggtgctgcagagcgatctgtataccctgagcagcagcgtgaccgtgccgagcagcacctggccgagcgaaaccgtgacctgcaacgtggcgcatccggcgagcagcaccaaagtggataaaaaaattggagctggtgcaggctctggtgctggcgcaggttctccagcagcggtgccggcagcagttcctgctgcggtgggcgaaggcgagggagagttcagtacgccagtttggatctcgcaggcacagggcatccgtgctggtcctcagaggctttcc 93
클로닝을 위한 정방향 프라이머 GCTACAAACGCGTACGCTATGCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCG 94
실시예 3: 시험관내 표시
Fab 표시를 위한 완충액이 제조되고 빙글빙글 회전하면서 4 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션되었다. 세척 완충액, WB, (60 mM 트리스; AcOH로 pH 7.5 조정됨, 180 mM NaCl, 60 mM 아세트산마그네슘, 5 % 차단제 BSA, 33 mM KCl, 200 μg t-RNA, 0,05 % Tween 20); 비드 세척 완충액 BWB (100 mM PBS, 0,1 % Tween 20); 중지 완충액 SB (AcOH로 조정된 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM 아세트산마그네슘, 5 % 차단제 BSA (Pierce), 33 mMKCl, 0,5 % Tween 20, 8.2 mM ox. 글루타티온); 용리 완충액 (AcOH로 조정된 55 mM 트리스 pH 7.5, 165 mM NaCl, 22 mM EDTA, 1 mg BSA, 5000 U rRNA (5000 U), 50 μg tRNA).
필요한 용적의 자성 비드 (스트렙타비딘 코팅된 비드)가 빙글빙글 회전하면서 4 ℃에서 하룻밤 동안 10 μL 초기 현탁액마다 100 μL 세척 완충액 (WB)으로 차단되었다. 프리패닝 (prepanning) 단계를 위해 25 μL의 비드가 이용되었고, 그리고 표적/배경 표본마다 패닝을 위해 20 μL가 이용되었다. 비드 보관 완충액의 아지드화나트륨을 제거하기 위해, 비드가 비드 세척 완충액 (BWB)으로 4회 및 WB로 3회 세척되었다. 이들 단계는 비드를 2 분 동안 수집하기 위해 자기장을 적용하고, 그리고 차후에 상층액을 폐기함으로서 수행되었다. 최종 세척 단계 후, 이들 비드는 WB에서 그들의 초기 용적으로 재현탁되었다.
세포-없는 시험관내 전사와 번역 시스템이 제조업체의 사용설명서 (PUREfrexTM DS 2.0)에 따라서 조립되었다. 표적 (T)에 대한 1.5 mL 반응 튜브 및 배경 (BG)에 대한 하나의 튜브가 제조되었다.
발현 주형 (LC) 및 표시 주형 (HC)의 DNA 입력이 2:1 분자 비율에서 적용되었다. 표시와 발현 주형을 코딩하는 DNA의 양은 모든 Fab 표시 주기에서 일정하게 유지되었다. 시험관내 전사/번역 반응 믹스가 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션되었다. 인큐베이션 후, 500 μL 중지 완충액을 첨가함으로써 반응이 중지되었고, 그 이후에 1 ℃에서 15 분 동안 14 000 rpm에서 원심분리 단계가 뒤따랐다. 별도로 명시되지 않으면, 후속 단계는 4 ℃에서 수행되었다. 번역 믹스의 중지된 상층액 (300 μL)이 준비된 비드 현탁액에 첨가되고, 그리고 좌우로 흔들리는 플랫폼 상에서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 그 후에, 불특정 결합 분자를 갖는 비드를 나머지 삼원 복합체를 갖는 상층액으로부터 분리하기 위해, 현탁액이 13 000 rpm 및 1 ℃에서 10 분 동안 원심분리되었다. 프리패닝된 상층액 (300 μL)이 새로운 2 mL 반응 튜브 내로 이전되고, WB로 사전 차단되고, 그리고 추가 이용 때까지 얼음 위에 유지되었다. 표적 (재조합 비오틴화된 cTnT)이 300 μL 프리패닝된 상층액에, 2 nM 내지 50 nM의 범위 안에 있는 최종 농도로 첨가되었다. 선택 압력을 끌어올리기 위해, 비오틴화된 cTnT 농도가 모든 주기에서 감소되었다. 현탁액이 좌우로 흔들리는 플랫폼 상에서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 용액 패닝 단계는 비오틴화된 cTnT 및 삼원 복합체 사이의 특이적 결합을 가능하게 하였다. 표적 cTnT에 결합한 삼원 복합체는 20 분 인큐베이션 단계에서 스트렙타비딘 비드로 포획되었다. 불특정 결합을 예방하기 위해, 주기 II에서 아비딘 비드가 스트렙타비딘 비드 대신에 이용되었다.
세척 단계는 자기장에서 결합 표적-삼원 복합체로 비드의 포획, 그 이후에 상층액의 제거를 포함한다. 비드는 500 μL 얼음같이 차가운 WB로 세척되었다. 세척 단계의 지속 기간을 5 분에서 1 시간으로 연장함으로써, 선택 압력이 후속 표시 주기에서 증가되었다. 비드를 새로운 차단된 2 mL 반응 튜브로 전달하는 데 최종 세척 단계가 이용되었다. 차후에 비드가 자기장으로 포획되었고, 그리고 상층액이 제거되었다. 후속 용리 단계가 100 μL의 1x EB 내포 EDTA를 첨가하고, 그리고 진탕하면서 10 분 동안 인큐베이션함으로써 수행되었다. mRNA가 삼원 복합체로부터 방출되었다. 그 후에 용리 믹스가 1 ℃에서 10 분 동안 14 000 rpm에서 원심분리되었다. 농축된 RNA를 단리하고 정제하기 위해, RNeasy MinElute 청소 키트 (Qiagen)가 제조업체의 사용설명서에 따라서 이용되었다. RNA가 16 μL RNA분해효소-없는 물로 용리되었다. 선택 단계로부터 임의의 남아있는 DNA를 절단하기 위해, Ambion DNA-free TM 키트가 제조업체의 사용설명서에 따라서 이용되었다. 남아있는 DNA는 후속 PCR 반응에서 증폭될 수 없다. DNA분해효소 불활성화 후, 현탁액이 13 000 rpm에서 및 실온에서 2 분 동안 원심분리되었다. 상층액 (50 μL)이 얼음 위에서 새로운 1.5 mL 반응 튜브로 이전되었다. 정제된 RNA는 역전사 (RT)에 즉시 이용되었다. 임의의 남아있는 상층액은 -80 ℃에서 보관되었다.
용리된 mRNA는 cDNA로 역전사되었다. 패닝 단계에서 표적을 내포하는, 표본 T에 대한 2개의 반응물이 설정되었다. 2개의 추가 반응물이 표본 BG 및 음성 대조 내포된 물에 대해 준비되었다. 표본 수에 따라서 마스터 믹스가 제조되었고, 그리고 예혼합물이 얼음 위에서 0.2 mL 반응 튜브에 배분되었다. 각 반응물은 12 μL의 용리된 RNA 및 0.5 μL의 역전사효소로 접종되었다. 음성 대조는 RNA 대신에 12 μL의 RNA분해효소-없는 물로 실행되었다. 역전사가 PCR 유전자증폭기에서 65 ℃에서 45 분 동안 수행되었다. 차후에 cDNA 표본이 얼음 위에서 5 분 동안 인큐베이션되고 하기 단계에서 증폭되었다. 남아있는 표본은 -20 ℃에서 보관되었다. 2번의 PCR 반응이 실행되었다: 첫 번째 PCR "RT에서 PCR"이 선택 풀의 cDNA를 증폭하기 위해 프라이머 Frt 및 Rrt로 수행되었다. 프라이머 F1A 및 R1A를 이용한 두 번째 PCR "RT-PCR에서 PCR"이 시험관내 전사/번역을 위한 조절 요소를 재부착하기 위해 적용되었다. 양쪽 반응은 Pwo DNA 중합효소로 수행되었다.
선택 풀의 충분한 DNA 농도를 제공하기 위해, 표본 T 및 BG 각각에 대한 4개의 반응물이 설정되었다.
추가적으로, 4개의 대조 표본이 설정되었다. 첫 2개의 표본은 표본 T 및 BG의 mRNA 단리 후, DNA 절단으로부터 유래되었고, 그리고 잠재적으로 남아있는 DNA를 증폭하기 위한 PCR에 의해 실증되었다. 세 번째와 네 번째는 RT의 음성 대조 및 PCR 등급 물을 이용한 "RT에서 PCR"에서 음성 대조이었다.
T의 PCR 산물은 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 예비 1 % 아가로오스 겔로부터 정제되고, 차후에 정량되고, "RT-PCR에서 PCR"을 위한 주형으로서 이용되었다. 선택 풀의 3개의 반응물 및 DNA 주형 대신에 PCR 등급 물을 이용한 하나의 음성 대조가 준비되었다. 각 반응물에 대해, 250 ng의 사전 정제된 "RT에서 PCR"이 이용되었다. PCR 산물은 QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 1 % 예비 아가로오스 겔로부터 정제되고, 그리고 후속 표시 주기에 이용되거나 또는 적합한 발현 시스템 내로 후속 하위클로닝을 위해 더욱 변형되었다.
실시예 4: 농축된 결합체의 주변세포질 발현
농축된 Fab 결합체를 단리하기 위해, 돌연변이된 뮤린 가변 HC들이 Fab의 뮤린 CH1 도메인, 뮤린 VL 도메인 및 뮤린 CL 도메인을 내포하는 p60rc_TnT M-11-7 발현 벡터 내로 클로닝되었다 (도 2 참조). 주형 DNA는 정방향 프라이머 5'-GCTACAAACGCGTACGCTATGCAGATTCAGCTGGTGCAGAGCG -3' (서열 번호: 94) 및 역방향 프라이머 Rrt 5'-GGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACGGATGCCCTGTGC-3' (서열 번호: 87)을 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 선택 풀이 BsiWI 및 KpnI 제한 부위를 통해, 발현 벡터 내로 클로닝되었다. 주변세포질 발현이 96 웰 딥웰 블록 (DWBs)에서 수행되었다. 전배양 ("마스터") DWB들이 Integra VIAFlo96을 이용함으로써 웰마다 1 mL LB (100 μg/mL 암피실린)로 채워졌고, 그리고 앞서 실행된 하위클로닝 및 형질전환의 단리된 클론으로 접종되었다. 선택 풀 (주기 III, IV, V)마다 약 200개의 집락이 선발되었다. 하나의 웰은 음성 대조로서, 접종 없이 남겨졌다; 다른 웰은 양성 대조로서, XL1 블루 변환된 TnT M-11-7 (야생형) Fab 발현 벡터로 접종되었다. 이들 DWB는 공기 투과성 막으로 밀봉되고 30 ℃에서 하룻밤 동안 궤도 진탕기 인큐베이터 (750 rpm)에서 인큐베이션되었다. 차후에, 마스터 DWB들의 각 웰로부터 50 μL가 Simmons, L. C., Reilly, D., Klimowski, L., Raju, T. S., Meng, G., Sims, P., Hong, K., Shields, R. L., Damico, L. A., Rancatore, P. & Yansura, D. G. (2002) "Expression of full-length immunoglobulins in Escherichia coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies", J Immunol Methods 263, 133-47에 의해 설명된 바와 같이, 웰마다 1150 mL C.R.A.P 배지 (100 μg/mL 암피실린)로 준비된 새로운 "발현" DWB로 이전되었다. 이들 DWB는 공기 투과성 막으로 밀봉되고 30 ℃에서 궤도 진탕기 인큐베이터에서 인큐베이션되었다. Fab 발현의 유도는 phoA 프로모터 및 인산염-제한 C.R.A.P 배지에 기초된다. 24 시간 후, 발현된 Fab를 포함하는 세포가 4000 rpm에서 10 분 동안 원심분리에 의해 수확되고 추가 이용 때까지 -20 ℃에서 보관되었다.
전배양 마스터 DWB들이 950 μL의 40 % 글리세롤을 첨가하고 -80 ℃에서 보관함으로써 "글리세롤 스톡"에 이용되었다. 세포 펠렛이 밀봉된 DWB의 5 분 동안 활발한 와동 및 실온에서 추가로 10 분 동안 진탕에 의해, 50 μL B-PERII 세균 단백질 추출 시약 (Thermo Fisher Scientific)에서 재현탁되었다. 세포 용해물이 950 μL 트리스 완충액 (20 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl)에서 희석되고 원심분리 (10 분, 4000 rpm) 전 10 분 동안 인큐베이션되었다. 미가공 세포 추출물을 내포하는 발현 블록이 ELISA 또는 SPR 동역학적 조사에서 추가 이용 때까지 4 ℃에서 유지되었다.
실시예 5: ELISA 스크린
상술된 Biacore 분석에 대한 최고 돌연변이체 Fab 결합체를 드러내기 위해, 사전 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)이 실행되었다. ELISA 셋업은 도 3에서 묘사된다. 궤도 진탕기에서 진탕함으로써, 비오틴화된 재조합 심장 트로포닌 T (100 nM)이 실온에서 1 시간 동안 스트렙타비딘 96 웰 평판에서 포획되었다. 항원 트로포닌 T가 100 μL IP 완충액 (PBS pH 7.3, 1 % BSA)에서 희석되었다. 차후에, 웰이 마이크로평판 세정기 BioTek ELx405 Select를 이용하여, 300 μL 1x 세척 완충액 (150 mM NaCl, 0.05 % Tween20, 0.2% 브로니독스)으로 3회 세척되었다. 세척한 후, 돌연변이된 항-cTnT Fab 결합체를 내포하는 미가공 대장균 (E. coli) 세포 추출물이 IP 완충액에서 1:4 희석되고 트로포닌 T 포획된 웰로 이전되었다. 다시 한 번, 웰이 300 μL 1x 세척 완충액으로 3회 세척되었다. 염소에서 생산된 항뮤린 IgG (Fab 특이적) - 퍼옥시다아제-표지화 항체 (검출 항체)가 트로포닌 T 결합된 돌연변이된 Fab 단편을 검출하기 위해 1:40 000 희석도 (IP 완충액에서)에서 이용되었다. 결합되지 않은 검출 항체를 제거하기 위해, 웰이 다시 한 번 300 μL 1x 세척 완충액으로 3회 세척되었다. 마이크로평판이 실온에서 30 분 동안 웰마다 100 μL ABTS와 함께 인큐베이션되었다. 흡광도가 405 nm에 세팅된 마이크로평판 판독기 BioTek Power 웨이브 XS로 계측되었다. 부모 항-cTnT 항체의 야생형 Fab가 양성 대조로서 이용되었다. 첫 번째 히트가 확인되었고, 그리고 이들의 미가공 세포 추출물이 동역학적 분석을 받았다.
실시예 6: SPR 기초된 기능적 분석
상세한 동역학적 조사가 GE Healthcare 8k 기기에서 37℃에서 수행되었다. Biacore CM-5 시리즈 S 센서가 상기 기기 내로 적제되고 제조업체의 사용설명서에 따라서 예조건화되었다. 시스템 완충액은 HBS-ET (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 % (w/v) Tween® 20)이었다. 표본 완충액은 1 mg/ml CMD (카르복시메틸덱스트란, Fluka)로 보충된 시스템 완충액이었다. 한 구체예에서 항뮤린 Fab 단편 포획 시스템이 CM5 바이오센서 상에 확립되었다. 토끼 다중클론 pAb 항 M-IgG, F(ab')2 단편 (카탈로그 번호 315-005-047, Jackson Immuno Research)이 제조업체의 사용설명서에 따라서 NHS/EDC 화학을 이용하여 고정되었다. 5 μl/분에서, 10 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)에서 30 μg/ml RAMF(ab')2가 각 흐름 셀에서 10.000 RU로 고정되었다. 센서가 차후에, 1 M 에탄올아민 pH 8.5로 포화되었다. 뮤린 항-TnT 항체 Fab' 단편이 설명된 바와 같이 대장균 (E. coli) 세포의 주번세포질에서 발현되고, 그리고 공지된 방법에 의해 용해되었다 (기술적인 상세를 위해, Andersen, D. C. & Reilly, D. E. (2004); Production technologies for monoclonal antibodies and their fragments. (Curr Opin Biotechnol 15, 456-62를 참조한다). 용해물이 표본 완충액에서 1:20 희석되었다. Fab' 단편이 2 분 동안 5 μl/분의 유동률에서 바이오센서 계측 셀 상에서 발현 용해물로부터 포획되고, 그 이후에 20 μl/분에서 10배 농축된 HBS-EP 완충액을 이용한 15 초 세척 단계가 뒤따랐다. 반응 단위 (RU)에서 Fab 단편 포획 수준 (CL)이 모니터링되었다. 재조합 인간 TnT (Roche, 37 kDa)가 표본 완충액에서 30 nM로 희석되었고, 그리고 농도 시리즈가 0 nM, 30 nM, 10 nM, 3.3 nM, 1.1 nM, 0.37 nM TnT 농도로 생산되었다. 피분석물 농도 시리즈가 3 분 연관 단계 동안 80 μl/분으로 주입되었고, 그리고 해리 단계가 5 분 동안 모니터링되었다. 피분석물 연관 단계의 종결 시점에서 반응 단위 (RU)에서 보고 포인트, "후기 결합 (binding late)" (BL)이 모니터링되었다. 동역학적 비율 결정의 각 주기 후, 포획 시스템이 10배 농축된 HBS-EP 완충액의 15 초 주입, 그 이후에 20 μl/분에서 100 mM HCl의 2회 1 분 주입에 의해 재생되었다. cTnT 피분석물의 동역학적 파라미터 ka [1/Ms], kd [1/s], t1/2 diss [분], KD [M] 및 결합 화학량론 (몰 비율) (상세를 위해, Schraeml, M. & Biehl, M. (2012); Kinetic screening in the antibody development process. Methods Mol Biol 901, 171-81을 참조한다)이 제조업체의 사용설명서에 따라서 Biaevaluation 소프트웨어 (GE healthcare)를 이용하여 각 Fab 단편 돌연변이체에 대해 결정되었다. 동역학적 파라미터는 HC CDR3 돌연변이와 상관되었다.
표 2:
작제되고 분석된 mAb<TnT>rM-11-7 Fab 위치 A102 유도체의 동역학 데이터.
Fab ka [1/Ms] kd[1/s] t1/2 [분] KD [nM] 서열 번호:
A102WT 1.1E+06 3.1E-03 4 3 16
A102D 1.9E+06 2.9E-02 0.4 15 17
A102E 1.1E+06 9.8E-03 1 9 18
A102F 9.0E+05 1.2E-03 10 1 19
A102H 8.3E+05 6.9E-03 2 8 20
A102I 1.7E+06 3.2E-02 0.4 18 21
A102K 5.1E+03 5.5E-02 0.2 11000 22
A102L 7.1E+05 9.0E-03 1 13 23
A102N 3.3E+06 5.6E-02 0.2 17 24
A102R 1.6E+04 4.2E-02 0.3 2500 25
A102W 1.1E+06 < 1E-05 >1155 < 0.01 7
A102Y 7.1E+05 3.3E-03 3 5 26
ctrl 결합 없음
표 2에서 약어: ka: 연관 속도 상수 [M-1 s-1], kd: 해리 속도 상수 [s-1], KD: 해리 평형 상수 KD [M], t/2-diss: 복합체 반감기, ln(2)/kd*60 [분], WT = 부모 (야생형), Fab = 소정의 아미노산 치환이 없거나 (WT) 또는 있는 HC CDR3을 포함하는 Fab 단편
Fab 단편 유도체 내에서, mAb<TnT>rM-11-7 Fab A102W는 가장 높은 피분석물 복합체 안정성 및 야생형 유사체 연관 속도 속력을 보여준다 (표 2 참조). 상기 표 2로부터 또한 알 수 있는 바와 같이, 놀랍게도, A102W (알라닌 (A)의 트립토판 (W)으로의 치환을 갖는 아미노산 위치 102)의 치환만 친화성에서 강한 증가를 야기한다. 이러한 돌연변이체 Fab 단편의 향상된 특성 - 야생형 또는 다른 돌연변이체와 비교하여 - 또한 각각, 도 4와 5로부터 쉽게 명백해진다.
실시예 7: HEK 세포에서 항체 Fab 단편의 발현
SPR 선별검사 후, 뮤린 Fab 단편 선도 후보 항체가 표준 세포 배양 절차에 따라서 생산되었다. 상응하는 벡터 및 클로닝 과정은 Norderhaug et al. J Immunol Methods. 1997 May 12;204(1):77-87에서 설명된다.
중쇄와 경쇄를 코딩하는 cDNA들이 인간 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 인핸서/프로모터 영역의 하류에 별개의 벡터 내로 클로닝되고, 그리고 BGH 폴리아데닐화 신호가 뒤따랐다.
현탁-적응된 인간 배아 신장 FreeStyle 293-F 세포주 (Thermo Fisher Scientific)가 상기 항체의 일시적인 유전자 발현 (TGE)에 이용되었다: 이들 세포는 제조업체의 지침에 따라서, PEIpro (Polyplus-형질감염 SA, Strasbourg) 형질감염 시약에 의해 복합화된 동등한 양의 양쪽 발현 플라스미드 (전체로서 0.7 mg/L 세포 배양액)를 이용하여 대략 2 x 10E6 생존 세포/ml로 형질감염되었다. 형질감염후 3 시간째에, 발현을 부양하기 위해, HDAC 저해제인 발프로산이 첨가되었다 (최종 농도: 4 mM). 매일, 배양액이 6 % (v/v)의 대두 펩톤 가수분해물-기반 피드로 보충되었다. 형질감염 후 7 일째에, 배양 상층액이 원심분리에 의해 수집되었고, 그리고 항체가 표준 절차에 따라서 그것으로부터 정제되었다. mAb<TnT>rM-11-7(A102W)-Fab(IgG1)-Qtag-Bi 단편이 공지된 방법에 의해 세포 배양 상층액으로부터 정제되었고, 그리고 설명된 바와 같이 쿠츠네리아 알비다 (Kutzneria albida) 트랜스글루타미나아제를 이용하여 비오틴에 부위 지향적으로 접합되었다 (Steffen et al. JBC, Sept.22, 292, 15622-15635, 2017).
실시예 8: ECL 계측
항체 Fab 단편 mAb<TnT>rM-11-7(A102W)-Fab(IgG1)-Qtag가 실시예 7에 따라서, 비오틴화된 Fab 단편, 다시 말하면, mAb<TnT>rM-11-7(A102W)-Fab(IgG1)-Qtag-Bi로서 생산되고 샌드위치 면역검정에서 검사되었다 (도 6 참조). Fab 단편 mAb<TnT>rM-11-7(A102W)-Fab(IgG1)-Qtag-Bi는 상업적으로 가용한 Roche Elecsys® 검정, 카탈로그 번호 05092744190 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 내에 포함된 바와 같은 MAB11-7의 비오틴화된 야생형 Fab-단편 (다시 말하면, 서열 번호: 16의 CDR3을 포함)과 비교되었다. 이들 비오틴화된 시약은 상응하는 검정 프로토콜에서 시약 1 (R1)로서 이용되었다. 루테닐화된 검출 항체는 Roche Elecsys® 검정, 카탈로그 번호 05092744190 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 내에 포함된 것이었다. 상기 루테닐화된 검출 항체는 Elecsys® R2 시약에 상응한다.
블랭크 대조가 있는 트로포닌 T hs 검정 프로토콜 (Diluent Universal, Id. 11732277122, Diluent Multi Assay, Id. 03609987170, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), 트로포닌 T hs 검정 규격을 이용한 트로포닌 T hs CalSet (Id. 05092752190, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로부터 Cal1 및 Cal2를 이용하여, Cobas E170 모듈에서 계측이 수행되었다.
상기 검정은 cobas e 분석기의 검정 프로토콜 2를 따르는데, 여기서 표본, R1 및 R2가 첫 번째 단계에서 9 분 인큐베이션 동안 혼합되고, 이후 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드가 두 번째 단계에서 다른 9 분 인큐베이션 동안 추가된다. 이것 이후에, 사전 세척 단계가 뒤따르는데; 여기서 부착된 면역-복합체를 갖는 비드가 자성에 의해 반응 큐벳의 바닥에 집중되고, 그리고 비드 상에서 만들어진 면역 복합체의 ECL-신호를 계측하기 위해 전체 혼합물이 계측 셀에 취해지기 전, 상층액이 Preclean 용액 (Roche 카탈로그 번호 03004899190)에 의해 2회 대체된다. 실행 (run)에서 이용된 R1 시약 (Bi-conjugate)은 각각, 본래 상업적으로 가용한 TNT-HS 검정의 시약, 또는 TNT R1 완충액에서 mAb<TnT>rM-11-7(A102W)-Fab(IgG1)-Qtag-Bi를 2.5 μg/ml로 포함하는 R1 시약 중 어느 한 가지이었다.
루테닐화된 (검출) 항체는 Roche Elecsys® 검정, 카탈로그 번호 05092744190 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 내에 포함된 것이었다. 상기 루테닐화된 검출 항체는 Elecsys® R2 시약에 상응한다.
Elecsys® 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드는 R1 및 R2 시약병 중에서 하나와 항상 조합으로 이용되었다. 계측된 표본은 표본 희석제 (Diluent Universal = 완충액 블랭크), 그리고 TnT Elecsys® 검정 상업적인 교정기 (Cal1 (~18 pg/ml recTnT) 및 Cal2 (~4200 pg/ml recTnT))를 포함하였다. 예시적인 결과는 도 7에서 제공된다. 도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 돌연변이체 항체 mAb<TnT>rM-11-7(A102W)을 이용하면, 블랭크 값이 954 수치 (부모)에서 777 수치 (A102W)로 감소하였다. Cal-1 신호 수준이 1432 수치 (부모)에서 2460 수치 (A102W)로 1.7배 증가하였다. Cal-2 수치 수준이 546602 (부모)에서 980432 (A102W) 수치로 1.8배 증가하였다. 신호 대 잡음 비율이 검정 동역학 및 민감도에서 증가를 판단하기 위한 가장 중요한 파라미터이기 때문에, 놀랍게도, 전반적으로 상기 새로운 (돌연변이체) 항체가 민감도에서 약 2배의 증가를 야기한다는 것이 밝혀질 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Novel anti-troponinT antibodies <130> P35678-EP <160> 94 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ser Asp Ile Glu Glu Val Val Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Gln 1 5 10 15 Glu Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Asp Trp Arg Glu Asp Glu Asp 20 25 30 Glu Gln Glu Glu Ala Ala Glu Glu Asp Ala Glu Ala Glu Ala Glu Thr 35 40 45 Glu Glu Thr Arg Ala Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ala Lys Glu 50 55 60 Ala Glu Asp Gly Pro Met Glu Glu Ser Lys Pro Lys Pro Arg Ser Phe 65 70 75 80 Met Pro Asn Leu Val Pro Pro Lys Ile Pro Asp Gly Glu Arg Val Asp 85 90 95 Phe Asp Asp Ile His Arg Lys Arg Met Glu Lys Asp Leu Asn Glu Leu 100 105 110 Gln Ala Leu Ile Glu Ala His Phe Glu Asn Arg Lys Lys Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Leu Val Ser Leu Lys Asp Arg Ile Glu Arg Arg Arg Ala Glu Arg 130 135 140 Ala Glu Gln Gln Arg Ile Arg Asn Glu Arg Glu Lys Glu Arg Gln Asn 145 150 155 160 Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ala Arg Arg Glu Glu Glu Glu Asn Arg Arg 165 170 175 Lys Ala Glu Asp Ala Arg Lys Lys Lys Ala Leu Ser Asn Met Met His 180 185 190 Phe Gly Gly Tyr Ile Gln Lys Gln Ala Gln Thr Glu Arg Lys Ser Gly 195 200 205 Lys Arg Gln Thr Glu Arg Glu Lys Lys Lys Lys Ile Leu Ala Glu Arg 210 215 220 Arg Lys Val Leu Ala Ile Asp His Leu Asn Glu Asp Gln Leu Arg Glu 225 230 235 240 Lys Ala Lys Glu Leu Trp Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Glu Ala Glu Lys 245 250 255 Phe Asp Leu Gln Glu Lys Phe Lys Gln Gln Lys Tyr Glu Ile Asn Val 260 265 270 Leu Arg Asn Arg Ile Asn Asp Asn Gln Lys Val Ser Lys Thr Arg Gly 275 280 285 Lys Ala Lys Val Thr Gly Arg Trp Lys 290 295 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> mus musculus <400> 2 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> mus musculus <400> 3 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> mus musculus <400> 4 Trp Gln Gly Thr His Leu Tyr Thr 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> mus musculus <400> 5 Asp Phe Ser Met His 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 7 Ser His Trp Met Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> mus musculus <400> 8 Met Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile 1 5 10 15 Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> mus musculus <400> 9 Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> mus musculus <400> 10 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 11 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> mus musculus <400> 12 Met Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> mus musculus <400> 13 Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 39 <212> PRT <213> mus musculus <400> 14 Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser 1 5 10 15 Ala Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr 20 25 30 Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg 35 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 15 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 16 Ser His Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 17 Ser His Asp Met Asp Tyr 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 18 Ser His Glu Met Asp Tyr 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 19 Ser His Phe Met Asp Tyr 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 20 Ser His His Met Asp Tyr 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 21 Ser His Ile Met Asp Tyr 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 22 Ser His Lys Met Asp Tyr 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 23 Ser His Leu Met Asp Tyr 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 24 Ser His Asn Met Asp Tyr 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 25 Ser His Arg Met Asp Tyr 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> mus musculus <400> 26 Ser His Tyr Met Asp Tyr 1 5 <210> 27 <211> 113 <212> PRT <213> mus musculus <400> 27 Met Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile 1 5 10 15 Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp 20 25 30 Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln 85 90 95 Gly Thr His Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 28 <211> 116 <212> PRT <213> mus musculus <400> 28 Met Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30 Phe Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp 35 40 45 Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Val Arg Ser His Trp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 210 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 29 Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu 20 25 30 Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln 35 40 45 Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu Leu Glu Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys 65 70 75 80 Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu 85 90 95 Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr 100 105 110 Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu 115 120 125 Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu 130 135 140 Arg Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly 145 150 155 160 Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val 165 170 175 Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg 180 185 190 Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe 195 200 205 Glu Ser 210 <210> 30 <211> 116 <212> PRT <213> mus musculus <400> 30 Met Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30 Phe Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp 35 40 45 Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp 50 55 60 Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95 Cys Val Arg Ser His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 31 cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccc 44 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 32 ggtaaaggta tagccgctcg ctttgc 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 33 gcggacgatt ttaaaggccg ctttgc 26 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 34 gcgaacgcaa aaataggtcg cgg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 35 gggccagggt accagcgtga ccg 23 <210> 36 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 36 aacccccgca taggctgggg gttggaaagc ctctgaggac cagcacg 47 <210> 37 <211> 63 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 37 gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60 cat 63 <210> 38 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 38 cctgtttcac ccaatgcata ctgaamnngg taaaggtata gc 42 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 39 cctgtttcac ccaatgcata ctmnnatcgg taaaggtata gc 42 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 40 cctgtttcac ccaatgcatm nngaaatcgg taaaggtata gc 42 <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 41 cctgtttcac ccaatgmnna ctgaaatcgg taaaggtata gc 42 <210> 42 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 cctgtttcac ccamnncata ctgaaatcgg taaaggtata gc 42 <210> 43 <211> 14 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 43 gcctgtttca ccca 14 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 44 gcaaagcgag cggctatacc tttacc 26 <210> 45 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> k is g or t <400> 45 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<222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> k is g or t <400> 49 gctatacctt taccgatttc agtatgnnkt gggtgaaaca gg 42 <210> 50 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 50 tgggtgaaac aggccccggg caaaggcctg aaatggatgg gc 42 <210> 51 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <400> 51 cgtccgcata ggtcggttcg ccggtttcgg tgttgatmnn gcccatccat ttcagg 56 <210> 52 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (36)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 cgtccgcata ggtcggttcg ccggtttcgg tgttmnncca gcccatccat ttcagg 56 <210> 53 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 cgtccgcata ggtcggttcg ccggtttcgg tmnngatcca gcccatccat ttcagg 56 <210> 54 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> n is a, c, g, or t <400> 54 cgtccgcata ggtcggttcg ccggtttcmn ngttgatcca gcccatccat ttcagg 56 <210> 55 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 55 cgtccgcata ggtcggttcg ccggtmnngg tgttgatcca gcccatccat ttcagg 56 <210> 56 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 cgtccgcata ggtcggttcg ccmnnttcgg tgttgatcca gcccatccat ttcagg 56 <210> 57 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 cgtccgcata ggtcggttcm nnggtttcgg tgttgatcca gcccatccat ttcagg 56 <210> 58 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 58 cgtccgcata ggtcggmnng ccggtttcgg tgttgatcca gcccatccat ttcagg 56 <210> 59 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 59 cgtccgcata ggtmnnttcg ccggtttcgg tgttgatcca gcccatccat ttcagg 56 <210> 60 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> m is a or c <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 60 cgtccgcata mnncggttcg ccggtttcgg tgttgatcca gcccatccat ttcagg 56 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 61 gcaaagcggc ctttaaaatc gtccgcata 29 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 62 ggcaaaggcc tgaaatggat gggc 24 <210> 63 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> k is g or t <400> 63 cctgaaatgg atgggcnnka tcaacaccga aaccggcgaa ccgacctatg cggacg 56 <210> 64 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> k is 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artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> k is g or t <400> 68 cctgaaatgg atgggctgga tcaacaccga annkggcgaa ccgacctatg cggacg 56 <210> 69 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> k is g or t <400> 69 cctgaaatgg atgggctgga tcaacaccga aaccnnkgaa ccgacctatg cggacg 56 <210> 70 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> k is g or t <400> 70 cctgaaatgg atgggctgga tcaacaccga aaccggcnnk ccgacctatg cggacg 56 <210> 71 <211> 56 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (41)..(42) <223> n is a, c, g, or t 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<220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 78 ggtaccctgg ccccamnnat ccatcgcatg gctgcgaacg caaaaatagg 50 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 79 cggtcacgct ggtaccctgg cccc 24 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 80 ccgcgaccta tttttgcgtt cgc 23 <210> 81 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> k is g or t <400> 81 cctatttttg cgttcgcnnk catgcgatgg attattgggg ccagggtacc 50 <210> 82 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> k is t or g <400> 82 cctatttttg cgttcgcagc nnkgcgatgg attattgggg ccagggtacc 50 <210> 83 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> k is t or g <400> 83 cctatttttg cgttcgcagc catnnkatgg attattgggg ccagggtacc 50 <210> 84 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> k is t or g <400> 84 cctatttttg cgttcgcagc catgcgnnkg attattgggg ccagggtacc 50 <210> 85 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> k is t or g <400> 85 cctatttttg cgttcgcagc catgcgatgn nktattgggg ccagggtacc 50 <210> 86 <211> 50 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> k is t or g <400> 86 cctatttttg cgttcgcagc catgcgatgg atnnktgggg ccagggtacc 50 <210> 87 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 87 ggaaagcctc tgaggaccag cacggatgcc ctgtgc 36 <210> 88 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 88 cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccc 44 <210> 89 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 89 aacccccgca taggctgggg gttggaaagc ctctgaggac cagcacg 47 <210> 90 <211> 185 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 90 gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60 catatgcaga ttcagctggt gcagagcggc ccggaactga aaaaaccggg cgaaaccgtg 120 aaaattagct gcaaagcgag cggctatacc tttaccgatt tcagtatgca ttgggtgaaa 180 caggc 185 <210> 91 <211> 142 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 91 gcaaagcgag cggctatacc tttaccgatt tcagtatgca ttgggtgaaa caggccccgg 60 gcaaaggcct gaaatggatg ggctggatca acaccgaaac cggcgaaccg acctatgcgg 120 acgattttaa aggccgcttt gc 142 <210> 92 <211> 170 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 92 cgaaccgacc tatgcggacg attttaaagg ccgctttgcg tttagcctgg aaaccagcgc 60 gaccaccgcg tatctgcaga ttaacaacct gaaaaacgaa gataccgcga cctatttttg 120 cgttcgcagc catgcgatgg attattgggg ccagggtacc agcgtgaccg 170 <210> 93 <211> 518 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 93 ccgcgaccta tttttgcgtt cgcagccatg cgatggatta ttggggccag ggtaccagcg 60 tgaccgtgag cagcgcgaaa accaccccgc cgagcgtgta tccgctggcg ccgggcagcg 120 cggcgcagac caacagcatg gtgaccctgg gctgcctggt gaaaggctat tttccggaac 180 cggtgaccgt gacctggaac agcggcagcc tgagcagcgg cgtgcatacc tttccggcgg 240 tgctgcagag cgatctgtat accctgagca gcagcgtgac cgtgccgagc agcacctggc 300 cgagcgaaac cgtgacctgc aacgtggcgc atccggcgag cagcaccaaa gtggataaaa 360 aaattggagc tggtgcaggc tctggtgctg gcgcaggttc tccagcagcg gtgccggcag 420 cagttcctgc tgcggtgggc gaaggcgagg gagagttcag tacgccagtt tggatctcgc 480 aggcacaggg catccgtgct ggtcctcaga ggctttcc 518 <210> 94 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 94 gctacaaacg cgtacgctat gcagattcag ctggtgcaga gcg 43

Claims (15)

  1. 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 항체로서, CDR들이 하기 아미노산 서열들 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른 이들의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체:
    (i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고
    (ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
  2. 청구항 제1항에 있어서, 경쇄 가변 도메인은 서열 번호: 2의 아미노산 서열의 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열의 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열의 CDR3, 또는 CDR마다 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른, 이들 CDR 중에서 하나 또는 그 이상의 변이체를 포함하고, 그리고 중쇄 가변 도메인은 청구항 제1항의 (ii) 하에서 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 항체.
  3. 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 항체로서, CDR들이 하기 아미노산 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체:
    (i) 경쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 그리고
    (ii) 중쇄 가변 도메인에서 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 및 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3.
  4. 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)에 특이적으로 결합하는 항체로서,
    여기서 상기 항체는 화학식 I에서 표시된 바와 같은 프레임워크 영역 (FW)들 및 CDR들로 구성되는 경쇄 가변 도메인:
    FW(LC)1 - CDR(LC)1 - FW(LC)2 - CDR(LC)2 - FW(LC)3 - CDR(LC)3 - FW(LC)4 (화학식 I)
    및 화학식 II에서 표시된 바와 같은 FW들 및 CDR들로 구성되는 중쇄 가변 도메인:
    FW(HC)1 - CDR(HC)1 - FW(HC)2 - CDR(HC)2 - FW(HC)3 - CDR(HC)3 - FW(HC)4 (화학식 II)를 포함하고,
    여기서 상기 FW들은 하기 아미노산 서열들 또는 이들과 적어도 85% 동일한 이들의 변이체를 포함하고, 그리고 여기서 상기 CDR들은 청구항 제1항에서 규정된 바와 같은 서열들 또는 많으면 하나의 아미노산 치환에서 서로 다른 이들의 변이체를 포함하는, 항체:
    경쇄에서
    FW(LC)1 서열 번호: 8의 아미노산 서열;
    FW(LC)2 서열 번호: 9의 아미노산 서열;
    FW(LC)3 서열 번호: 10의 아미노산 서열;
    FW(LC)4 서열 번호: 11의 아미노산 서열;
    및 중쇄에서
    FW(HC)1 서열 번호: 12의 아미노산 서열;
    FW(HC)2 서열 번호: 13의 아미노산 서열;
    FW(HC)3 서열 번호: 14의 아미노산 서열;
    FW(HC)4 서열 번호: 15의 아미노산 서열.
  5. 청구항 제4항에 있어서, 항체는 화학식 I에서 표시된 바와 같은 프레임워크 영역 (FW)들 및 CDR들로 구성되는 경쇄 가변 도메인:
    FW(LC)1 - CDR(LC)1 - FW(LC)2 - CDR(LC)2 - FW(LC)3 - CDR(LC)3 - FW(LC)4 (화학식 I)
    및 화학식 II에서 표시된 바와 같은 FW들 및 CDR들로 구성되는 중쇄 가변 도메인:
    FW(HC)1 - CDR(HC)1 - FW(HC)2 - CDR(HC)2 - FW(HC)3 - CDR(HC)3 - FW(HC)4 (화학식 II)를 포함하고,
    여기서 상기 CDR들은 청구항 제4항에서 규정된 바와 같은 서열을 포함하고, 그리고 여기서 상기 FW들은 하기 아미노산 서열들 또는 이들과 적어도 85% 동일한 이들의 변이체를 포함하는, 항체:
    경쇄에서
    FW(LC)1 서열 번호: 8의 아미노산 서열;
    FW(LC)2 서열 번호: 9의 아미노산 서열;
    FW(LC)3 서열 번호: 10의 아미노산 서열;
    FW(LC)4 서열 번호: 11의 아미노산 서열;
    및 중쇄에서
    FW(HC)1 서열 번호: 12의 아미노산 서열;
    FW(HC)2 서열 번호: 13의 아미노산 서열;
    FW(HC)3 서열 번호: 14의 아미노산 서열;
    FW(HC)4 서열 번호: 15의 아미노산 서열.
  6. 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 37 ℃에서 10 분 또는 그 이상의 t/2-diss를 갖는, 항체.
  7. 다음을 포함하는 항체로서:
    (i) 서열 번호: 27의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인, 그리고
    (ii) 서열 번호: 28의 중쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 도메인,
    여기서 상기 항체는 인간 심장 트로포닌 T에 특이적으로 결합하고 37 ℃에서 10 분 또는 그 이상의 t/2-diss를 갖는, 항체.
  8. 다음을 포함하는 항체로서:
    (i) 서열 번호: 27의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인, 그리고
    (ii) 서열 번호: 28의 중쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 도메인,
    여기서 상기 중쇄의 CDR들은 청구항 제1항에서 규정된 것들로 구성되고,
    그리고 여기서 상기 항체는 인간 심장 트로포닌 T에 특이적으로 결합하고 37 ℃에서 10 분 또는 그 이상의 t/2-diss를 갖는, 항체.
  9. 다음을 포함하는 항체로서:
    (i) 서열 번호: 27의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인, 그리고
    (ii) 서열 번호: 28의 아미노산 서열의 중쇄 가변 도메인,
    여기서 6개의 CDR들은 청구항 제1항에서 규정된 바와 같고,
    그리고 여기서 상기 항체는 인간 심장 트로포닌 T에 특이적으로 결합하고 37 ℃에서 10 분 또는 그 이상의 t/2-diss를 갖는, 항체.
  10. 다음을 포함하는 항체:
    (i) 서열 번호: 27의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 도메인, 그리고
    (ii) 서열 번호: 28의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 도메인.
  11. 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자.
  12. 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자.
  13. 다음을 포함하는 벡터:
    청구항 제11항에 따른 및/또는 청구항 제12항에 따른 핵산 분자.
  14. 다음 중에서 적어도 한 가지를 포함하는 조성물:
    (i) 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체,
    (ii) 청구항 제11항 또는 제12항의 핵산 분자 및/또는
    (iii) 청구항 제13항의 벡터.
  15. 인간 심장 트로포닌 T (서열 번호: 1)를 결정하는 방법에 있어서, 인간 심장 트로포닌 T에 대한 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
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