JP2015510767A - ヒスチジン操作された軽鎖抗体およびこれを作製するための遺伝子改変された非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年3月16日に出願された米国仮出願第61/611,950号および2012年12月13日に出願された米国仮出願第61/736,930号の米国特許法第119条(e)項の下での利益を主張する。これらの出願は、いずれも、その全体が本明細書に参考として援用される。
抗体は、各重鎖モノマーが同一の軽鎖と会合しているホモダイマー重鎖成分を一般的に含む。ヘテロダイマー重鎖成分を有する抗体(例えば、二重特異性抗体)は、治療抗体として望ましい。しかし、二重特異性抗体の重鎖の各々と十分に会合することができる好適な軽鎖成分を有する二重特異性抗体を作製することには、問題があることが判明した。
本発明は、pH依存性の抗原結合を示すヒト抗体分子をコードするヌクレオチド配列(複数可)、例えば、pH依存性の抗原結合を示す抗体をコードする、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列をそれらのゲノム内、例えば、それらの生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど);これと同じ免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を含む胚、細胞、および組織;これらを作製する方法;ならびにこれらを用いる方法を提供する。別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、反対が明らかに示されるか、その用語または語句が用いられる文脈から明らかに明白でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。
本発明者らは、pH依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する非ヒト動物を、軽鎖の配列に沿った1つまたは複数の位置において免疫グロブリン軽鎖可変領域の改変を施すことにより作製し得ることを発見した。動物が、抗体のCDR内でヒスチジンを発現するように、非ヒト動物の生殖細胞系列内に改変を施す方法が記載される。特に、マウスの生殖細胞系列内の免疫グロブリン軽鎖可変配列内に改変を施すための方法が記載される。例えば、軽鎖の可変領域配列は典型的に、可変領域配列に沿った体細胞超変異を示す。場合によって、このような変異は、ヒスチジン残基による置換(例えば、図1を参照されたい)を結果としてもたらし得る。このような変異は、抗原結合の一因となる可変ドメインの領域である相補性決定領域(CDR)内でもなお生じ得る。場合によって、このような変異は、pH依存性の抗原結合を示す、例えば、酸性pHにおける抗原結合の、中性pHにおける抗原結合と比較した低減を示す抗体を結果としてもたらし得る。このようなpH依存性の抗原結合が所望される。なぜなら、抗体が、細胞の外部の抗原に結合し、エンドソームへと内部移行すると、抗原を放出し、表面へと再度リサイクルされて、別の抗原に結合し、標的介在性クリアランスを回避することを可能とし得るからである。ランダムhisスキャニング変異生成を用いて、抗IL−6R抗体におけるpH依存性の結合特性を操作することにより、ヒスチジン残基を導入して、この効果を達成するための手法が報告されている(US2011/0111406A1)。しかし、抗体残基のランダム変異生成は、抗体の抗原への親和性の低下を結果としてもたらし得る。抗体配列内のヒスチジン置換を発現させるために遺伝子改変された非ヒト動物は、目的の抗原に応答する高親和性抗体であって、ヒスチジン改変(複数可)に起因して、pH依存性の抗原結合もまた提示する高親和性抗体の生成を可能とする。
一態様では、当技術分野で用いられる標準的な方法により、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物から、pH依存性の抗原結合を示すヒト抗原結合タンパク質、例えば、抗体を生成するための方法もまた本明細書において提供される。
本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、pH依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する様々な方法が提供される。pH依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をin vitroにおいて生成する方法もまた提供される。このような方法は、抗原結合タンパク質の様々な成分を、遺伝子改変された非ヒト動物において、in vivoで生成するステップと、次いで、それらを改変するステップと、生物体の外部において、in vitroで、哺乳動物細胞培養物中で発現させるタンパク質複合体としてそれらを再アセンブルするステップとを包含し得る。
(実施例1)
抗原特異的ヒト軽鎖内のヒスチジン残基の同定
ヒスチジン置換したヒトユニバーサル軽鎖抗体の操作および特徴付け
(実施例2.1)
ヒスチジン残基の生殖細胞系列ヒト再構成軽鎖への操作
操作したヒスチジン残基を、ヒトVκ1−39Jκ5軽鎖のQ105、Q106、Y108、およびP111位に導入するように特別にデザインされた部位指向変異生成プライマーを用いて、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトVκ1−39Jκ5軽鎖へと操作した。当技術分野で公知の分子技法(例えば、QuikChange II XL Site Directed Mutagenesis Kit、Agilent Technologies)を用いて、部位指向変異生成を実施した。CDR3内の操作された残基の位置を図2に示し、図2に示された、ヒスチジン置換したCDR3の核酸配列を、配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、および32に示す(対応するアミノ酸配列を、配列番号5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、および33に示す)。生殖細胞系列の、再構成されたVκ1−39Jκ5 CDR3の核酸配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号2および3に示す。
ヒスチジン操作した軽鎖の構築および発現
実施例2に従い作製された、生殖細胞系列の、操作したヒスチジン残基を含有するヒトVκ1−39に由来する軽鎖を構築し、ヒト細胞表面受容体に特異的である、様々なヒト重鎖(1〜5と表示される)と対合させて、CHO細胞における発現を解析した。ヒスチジン置換したVκ1−39に由来する軽鎖と対合させた、ヒト細胞表面受容体に特異的な5つのヒト重鎖は、単一の、再構成されたヒト軽鎖(ヒトVκ1−39/Jκ5の再構成された軽鎖;US2011/0195454A1を参照されたい)を有するマウスから得た。
ヒスチジン操作した軽鎖の結合親和性の決定
選択された抗体上清についての平衡解離定数(KD)、解離半減期(t1/2)、および他の動力学的パラメータは、BIACORETMT200装置(GE Healthcare)を用いるSPR(表面プラズモン共鳴)により決定した。キネティクスは、pH7.4およびpH5.75で測定した。結果を図5A〜5Eに示す。
ヒスチジン置換したVκ1−39Jκ5ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作および特徴付け
(実施例3.1)
再構成されたヒト軽鎖可変領域内のヒスチジン残基を操作するためのターゲッティングベクターの構築
当技術分野で公知の標準的な分子クローニング技法により作製されるターゲッティングベクターを用いて、ヒト軽鎖のCDR領域へと操作したヒスチジン残基を有する、再構成されたヒト軽鎖遺伝子を含有する遺伝子改変マウスを作製する。
ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を有するマウスにおける抗原への免疫応答の解析
細胞表面受容体(「抗原A」)を、CDR3内に4カ所のヒスチジン置換を有するVκ1−39およびJκ5を使用して既定の(pre−arranged)ヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス(以下では、「HULC 1927」とする)、もしくはCDR3内に3カ所のヒスチジン置換を有するVκ1−39およびJκ5を使用して既定のヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス(以下では、「HULC1930」とする)のいずれか、またはホモ接合性のWTマウスを免疫する免疫原として用いた。免疫を開始する前に、免疫前血清を、マウスから収集した。免疫原は、足蹠(f.p.)を介して、容量25μl中に、アジュバントとしてのCpGオリゴヌクレオチド(Invivogen)10μgと混合した、初回抗原刺激による免疫のためのタンパク質2.35μgを投与した。その後、3、6、11、13、17、20日目において、合計6回の追加免疫のために、マウスに、同じ経路を介して、2.35μgの抗原Aを、アジュバントとしての10μgのCpGおよび25μgのAdju−Phos(Brenntag)と共に追加免疫した。それぞれ、4および6回目の追加免疫の後の15および22日目において、マウスから採血した。それらの抗血清を、抗原Aに対する抗体力価についてアッセイした。
pH感受性モノクローナル抗体の生成
HULCマウス両方の系統でも、WTマウスでも、免疫原に対する所望の免疫応答が達成されたら、各マウス系統からの脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成し、96ウェルプレート内で成長させた。10日間成長後、各ハイブリドーマ細胞含有ウェルからの上清を、免疫原特異的ELISAを介してスクリーニングして、陽性の抗原結合試料を同定した。ELISAのために、96ウェルマイクロ滴定プレートを、1ug/mLの抗mycポリクローナル抗体(Novus Biologicals、番号NB600−34)により、4℃で一晩にわたりコーティングして、mycタグ付けされた抗原を固定し、これに続いて、PBS中の0.5%(w/v)のBSA溶液でブロッキングした。プレートを洗浄し、抗原溶液を、1μg/mLの濃度でプレートへと添加し、室温で1時間にわたり、コーティングしたプレートに結合させた。その後、ハイブリドーマ細胞からの上清を、1:50の希釈率でウェルへと添加し、室温で1時間にわたり結合させた。プレートに結合した抗体は、HRPとコンジュゲートさせた抗マウスIgGポリクローナル抗体(Jackson Immunoresearch、番号115−035−164)を用いて検出した。TMB基質を、プレート(BD Biosciences、番号51−2606KC/51−2607KC)へと添加し、製造元により推奨されるプロトコールに従い、比色シグナルを生じさせた。吸光度は、Victor Wallacプレートリーダーにおいて450nmで記録した。ODが0.5以上(ベースラインのODは約0.1)を有するとして定義される抗原陽性試料は、リアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー(Biacore 4000)を用いて、親和性スクリーニングにかけた。
Vκ1−39Jκ5に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスのCDR3領域における配列決定および体細胞超変異
HULCマウスおよびWTマウスによるモノクローナルハイブリドーマからの細胞ペレットを、軽鎖可変ドメインDNAの配列決定に用いた。26のクローンがモノクローナルとなり(上記の実施例3.3を参照されたい)、これらを配列決定にかけ、15のクローンを、HULCマウス軽鎖またはWTマウス軽鎖(MMおよびNN;表4を参照されたい)を用いて確認した。14のクローンは、HULCヘテロ接合性マウス(1927マウスまたは1930マウス)に由来し、1つのクローンは、WTマウスに由来した(OO;表4を参照されたい)。
Vκ1−39Jκ5に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスにおいて生成されるモノクローナル抗体のpH依存性結合
HULCマウスおよびWTマウスから単離されたモノクローナル抗体のpH依存性結合特徴をさらに評価するために、中性pHにおいて抗体/抗原間の会合相を観察し、中性または酸性pHにおいて抗体/抗原間の解離相を観察する、結合実験を実行した。
ヒスチジン置換したVκ3−20Jκ1ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作
例えば、米国特許出願第13/022,759号、同第13/093,156号、同第13/412,936号、および同第13/488,628号(それぞれ、特許公開第2011/0195454号、同第2012/0021409号、同第2012/0192300号、および同第2013/0045492号)、ならびに上記の実施例1において記載されている通りに、共通Vκ3−20Jκ1軽鎖を含むマウスを生成した。生殖細胞系列のユニバーサルVκ3−20Jκ1軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、配列番号59に示す。
ヒスチジン置換した単一の、再構成されたヒトユニバーサル軽鎖マウス(HULC)を含むマウスの交配
本実施例は、本明細書に記載されているHULCマウスのうちのいずれか1つと交配させて、多重の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を保有する、多重の遺伝子改変マウス系統を作製し得る、複数の他の遺伝子改変マウス系統について記載する。
操作された軽鎖遺伝子座の使用頻度を最適化するために、上記のHULC動物(例えば、Vκ1−39Jκ5またはVκ3−20Jκ1ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を含む)のうちの任意の1つを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと交配させ得る。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、上記の実施例3および4に記載されるとおりの再構成されたヒスチジン置換したヒト生殖細胞系列軽鎖領域を発現する。交配は、当技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁殖家(例えば、Jackson Laboratory)によって実施される。操作されたヒスチジン置換した軽鎖遺伝子座、および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、特有な軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。
操作されたヒト生殖細胞系列軽鎖遺伝子座を有するマウス(HULCマウス)は、ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマウスと交配させられる(US6,596,541を参照;VELOCIMMUNE(登録商標)マウス、Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)。VELOCIMMUNE(登録商標)マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変ドメインおよびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。
当業者は、日常的な程度の実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能である。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
ヒトVLセグメント配列およびヒトJLセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
遺伝子改変された非ヒト動物。
(項目2)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目1に記載の動物。
(項目3)
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目2に記載の動物。
(項目4)
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目3に記載の動物。
(項目5)
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトVHセグメント、ヒトDHセグメント、およびヒトJHセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、項目1に記載の動物。
(項目6)
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目5に記載の動物。
(項目7)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列である、項目6に記載の動物。
(項目8)
機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、項目1に記載の動物。
(項目9)
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、項目1に記載の動物。
(項目10)
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目5に記載の動物。
(項目11)
少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、相補性決定領域(CDR)3をコードするヌクレオチド配列内にある、項目1に記載の動物。
(項目12)
前記置換が、1つ、2つ、3つ、または4つのCDR3コドンの置換である、項目11に記載の動物。
(項目13)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントまたはヒトVκ3−20遺伝子セグメントに由来する、項目1に記載の動物。
(項目14)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ1−39/Jκ5遺伝子配列またはVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来する、項目13に記載の動物。
(項目15)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ1−39/Jκ5遺伝子配列に由来し、該Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列が、105、106、108、111位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目14に記載の動物。
(項目16)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来し、該Vκ3−20/Jκ1遺伝子配列が、105、106、107、109位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目14に記載の動物。
(項目17)
目的の抗原に応答するB細胞集団であって、中性pHと比較して、酸性pHにおける解離半減期(t1/2)が少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、または少なくとも約30倍の短縮を示す抗体が富化されたB細胞集団を含む、項目1に記載の動物。
(項目18)
中性pHと比較して、酸性pHにおける解離半減期(t1/2)の前記短縮が、約30倍以上の短縮である、項目17に記載の動物。
(項目19)
齧歯動物である、項目1に記載の動物。
(項目20)
ラットまたはマウスである、項目19に記載の齧歯動物。
(項目21)
マウスである、項目20に記載の齧歯動物。
(項目22)
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内で置換された前記少なくとも1つのコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも1つの非ヒスチジン残基のヒスチジンによる置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する、項目1に記載の動物。
(項目23)
ヒトVLセグメント配列およびヒトJLセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、
該マウスが、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、
遺伝子改変マウス。
(項目24)
前記単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目23に記載のマウス。
(項目25)
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される、項目24に記載のマウス。
(項目26)
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトVHセグメント、ヒトDHセグメント、およびヒトJHセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、項目23に記載のマウス。
(項目27)
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である、項目26に記載のマウス。
(項目28)
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、項目23に記載のマウス。
(項目29)
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、項目26に記載のマウス。
(項目30)
少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、相補性決定領域(CDR)3をコードするヌクレオチド配列内にある、項目23に記載のマウス。
(項目31)
前記置換が、1つ、2つ、3つ、または4つのCDR3コドンの置換である、項目30に記載のマウス。
(項目32)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントまたはヒトVκ3−20遺伝子セグメントに由来する、項目23に記載のマウス。
(項目33)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ1−39/Jκ5遺伝子配列またはVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来する、項目32に記載のマウス。
(項目34)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ1−39/Jκ5遺伝子配列に由来し、該Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列が、105、106、108、111位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目33に記載のマウス。
(項目35)
前記Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列が、105、106、108、および111位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目34に記載のマウス。
(項目36)
前記Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列が、106、108、および111位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目34に記載のマウス。
(項目37)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来し、該Vκ3−20/Jκ1遺伝子配列が、105、106、107、109位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、項目33に記載のマウス。
(項目38)
前記Vκ3−20/Jκ1遺伝子配列が、105、106、107、および109位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目37に記載のマウス。
(項目39)
前記Vκ3−20/Jκ1遺伝子配列が、105、106、および109位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目37に記載のマウス。
(項目40)
目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、全ての抗体が、
少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Vセグメント、ヒト重鎖Dセグメント、およびヒト重鎖Jセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と
を含む、項目23に記載のマウス。
(項目41)
目的の抗原へのpH依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
項目23に記載のマウスを生成するステップと、
該マウスを目的の抗原で免疫するステップと、
中性pHでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性pHでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップと
を含む方法。
(項目42)
前記抗体が、酸性pHおよび37℃で、約2分間以下の解離半減期(t1/2)を示す、項目41に記載の方法。
(項目43)
目的の抗原へのpH依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体を選択するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および該改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、
該細胞内で発現した第二の抗体であって、中性pHでは、該目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性pHでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップと
を含む方法。
(項目44)
前記第一の抗体を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来する免疫グロブリン軽鎖配列を含む非ヒト動物において生成し、該免疫グロブリン軽鎖の前記改変を、該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列内に施す、項目43に記載の方法。
(項目45)
第一の抗体を、ヒトVHセグメント、ヒトDHセグメント、およびヒトJHセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む非ヒト動物において生成する、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列およびVκ3−20/Jκ1遺伝子配列から選択される、項目43に記載の方法。
(項目47)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Vκ1−39/Jκ5であり、前記第一の抗体の前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の前記改変を、105、106、108、111位、およびこれらの組合せから選択される位置でCDR3コドンにおいて施す、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Vκ3−20/Jκ1であり、前記第一の抗体の前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の前記改変を、105、106、107、109位、およびこれらの組合せから選択される位置でCDR3コドンにおいて施す、項目46に記載の方法。
(項目49)
前記抗体が、中性pHと比較して、酸性pHにおける解離半減期(t1/2)が少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、または少なくとも約30倍の短縮を提示する、項目43に記載の方法。
(項目50)
前記抗体が、酸性pHおよび37℃で、約2分間以下の解離半減期(t1/2)を示す、項目43に記載の方法。
(項目51)
前記非ヒト動物が、マウスである、項目44に記載の方法。
(項目52)
前記非ヒト動物が、マウスである、項目45に記載の方法。
(項目53)
遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製する方法であって、
非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリン軽鎖Vセグメントおよび軽鎖Jセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、
少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を該ゲノムに配置するステップと
を含む方法。
(項目54)
目的の抗原へのpH依存性結合を示す抗体が富化されたB細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記動物が、齧歯動物である、項目53に記載の方法。
(項目56)
前記動物が、マウスまたはラットである、項目55に記載の方法。
(項目57)
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列またはVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来し、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、CDR3コドンにおいてである、項目53に記載の方法。
Claims (55)
- ヒトVLセグメント配列およびヒトJLセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の該ヒトVLセグメント配列および該ヒトJLセグメント配列が、対応するヒト生殖細胞系列のVL遺伝子配列およびJL遺伝子配列によってコードされない少なくとも1つのヒスチジンコドンを含む、
遺伝子改変された非ヒト動物。 - 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、請求項1に記載の動物。
- 前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、請求項2に記載の動物。
- 前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、請求項3に記載の動物。
- 免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトVHセグメント、ヒトDHセグメント、およびヒトJHセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、請求項1に記載の動物。
- 前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、請求項5に記載の動物。
- 前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列である、請求項6に記載の動物。
- 機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、請求項1に記載の動物。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、請求項1に記載の動物。
- 前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、請求項5に記載の動物。
- 前記少なくとも1つのヒスチジンコドンが、相補性決定領域(CDR)3をコードするヌクレオチド配列内にある、請求項1に記載の動物。
- 前記少なくとも1つのヒスチジンコドンが、1つ、2つ、3つ、または4つのCDR3コドンである、請求項11に記載の動物。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントまたはヒトVκ3−20遺伝子セグメントに由来する、請求項1に記載の動物。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ1−39/Jκ5遺伝子配列またはVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来する、請求項13に記載の動物。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ1−39/Jκ5遺伝子配列に由来し、該Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列が、105、106、108、111位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、請求項14に記載の動物。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来し、該Vκ3−20/Jκ1遺伝子配列が、105、106、107、109位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、請求項14に記載の動物。
- 目的の抗原に応答するB細胞集団であって、中性pHと比較して、酸性pHにおける解離半減期(t1/2)が少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、または少なくとも約30倍の短縮を示す抗体が富化されたB細胞集団を含む、請求項1に記載の動物。
- 中性pHと比較して、酸性pHにおける解離半減期(t1/2)の前記短縮が、約30倍以上の短縮である、請求項17に記載の動物。
- 齧歯動物である、請求項1に記載の動物。
- ラットまたはマウスである、請求項19に記載の齧歯動物。
- マウスである、請求項20に記載の齧歯動物。
- 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内の前記少なくとも1つのヒスチジンコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも1つのヒスチジン残基を含むヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する、請求項1に記載の動物。
- ヒトVLセグメント配列およびヒトJLセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列の該ヒトVLセグメント配列および該ヒトJLセグメント配列が、対応するヒト生殖細胞系列のVL遺伝子配列およびJL遺伝子配列によってコードされない少なくとも1つのヒスチジンコドンを含み、
該マウスが、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、
遺伝子改変マウス。 - 前記単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、請求項23に記載のマウス。
- 前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される、請求項24に記載のマウス。
- 免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトVHセグメント、ヒトDHセグメント、およびヒトJHセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさらに含む、請求項23に記載のマウス。
- 前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である、請求項26に記載のマウス。
- 前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある、請求項23に記載のマウス。
- 前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、請求項26に記載のマウス。
- 前記少なくとも1つのヒスチジンコドンが、相補性決定領域(CDR)3をコードするヌクレオチド配列内にある、請求項23に記載のマウス。
- 前記少なくとも1つのヒスチジンコドンが、1つ、2つ、3つ、または4つのCDR3コドンである、請求項30に記載のマウス。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントまたはヒトVκ3−20遺伝子セグメントに由来する、請求項23に記載のマウス。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ1−39/Jκ5遺伝子配列またはVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来する、請求項32に記載のマウス。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ1−39/Jκ5遺伝子配列に由来し、該Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列が、105、106、108、111位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、請求項33に記載のマウス。
- 前記Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列が、105、106、108、および111位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、請求項34に記載のマウス。
- 前記Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列が、106、108、および111位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、請求項34に記載のマウス。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来し、該Vκ3−20/Jκ1遺伝子配列が、105、106、107、109位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む、請求項33に記載のマウス。
- 前記Vκ3−20/Jκ1遺伝子配列が、105、106、107、および109位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、請求項37に記載のマウス。
- 前記Vκ3−20/Jκ1遺伝子配列が、105、106、および109位においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、請求項37に記載のマウス。
- 目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、全ての抗体が、
対応するヒト生殖細胞系列のVL遺伝子配列およびJL遺伝子配列によってコードされない少なくとも1つのヒスチジンコドンを含むヒトVLセグメント配列およびヒトJLセグメント配列を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Vセグメント、ヒト重鎖Dセグメント、およびヒト重鎖Jセグメントのレパートリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と
を含む、請求項23に記載のマウス。 - 目的の抗原へのpH依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
請求項23に記載のマウスを生成するステップと、
該マウスを目的の抗原で免疫するステップと、
中性pHでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性pHでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップと
を含む方法。 - 前記抗体が、酸性pHおよび37℃で、約2分間以下の解離半減期(t1/2)を示す、請求項41に記載の方法。
- 目的の抗原へのpH依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
その生殖細胞系列内にヒトVLセグメント配列およびヒトJLセグメント配列を含む単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物において、目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体を生成するステップと、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の該ヒトVLセグメント配列および該ヒトJLセグメント配列を、対応するヒト生殖細胞系列のVLセグメント配列およびJLセグメント配列によってコードされないヒスチジンコドンを含むように改変するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および該改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、
該細胞内で発現した第二の抗体であって、中性pHでは、該目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性pHでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップと
を含む方法。 - 前記非ヒト動物において生成された前記第一の抗体が、ヒトVHセグメント、ヒトDHセグメント、およびヒトJHセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Vκ1−39/Jκ5遺伝子配列およびVκ3−20/Jκ1遺伝子配列から選択される、請求項43に記載の方法。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Vκ1−39/Jκ5であり、前記改変が、105、106、108、111位、およびこれらの組合せから選択される位置でのCDR3コドンにおけるヒスチジンコドンによる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの置換を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Vκ3−20/Jκ1であり、前記改変が、105、106、107、109位、およびこれらの組合せから選択される位置でのCDR3コドンにおけるヒスチジンコドンによる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの置換を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記抗体が、中性pHと比較して、酸性pHにおける解離半減期(t1/2)が少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、または少なくとも約30倍の短縮を提示する、請求項43に記載の方法。
- 前記抗体が、酸性pHおよび37℃で、約2分間以下の解離半減期(t1/2)を示す、請求項43に記載の方法。
- 前記非ヒト動物が、マウスである、請求項43に記載の方法。
- 遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物を作製する方法であって、
非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリン軽鎖Vセグメントおよび軽鎖Jセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、
対応するヒト生殖細胞系列のVLセグメント配列およびJLセグメント配列によってコードされない少なくとも1つのヒスチジンコドンを含むヒトVLセグメント配列およびヒトJLセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を該ゲノムに配置するステップと
を含む方法。 - 目的の抗原へのpH依存性結合を示す抗体が富化されたB細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす、請求項51に記載の方法。
- 前記動物が、齧歯動物である、請求項51に記載の方法。
- 前記動物が、マウスまたはラットである、請求項53に記載の方法。
- 前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、ヒトのVκ1−39/Jκ5遺伝子配列またはVκ3−20/Jκ1遺伝子配列に由来し、前記少なくとも1つのヒスチジンコドンが、CDR3コドンである、請求項51に記載の方法。
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