JP2021519062A - ペプチド−mhc複合体に対する治療用抗体を生成するための遺伝子改変非ヒト動物、ならびにその作製方法および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2018年3月24日に出願された米国仮特許出願第62/647,720号明細書、および2018年3月24日に出願された米国仮特許出願第62/647,724号明細書の優先権の利益を主張するものであり、それら各文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、(ii)当該ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA分子、またはその一部、(i)(ii)と複合体化された、当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有するペプチド−MHC複合体で免疫化されたときに、特異的B細胞反応を生じさせ、そしてヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび/またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含有するヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する。一部の実施形態では、方法は、
(a)
(i)ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列を、第一の異所性座位に挿入すること、または
(ii)非ヒト動物MHC Iポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ヒト(ヒト化)MHC Iポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物MHC I座位で置換し、および/または非ヒト動物MHC II分子をコードするヌクレオチド配列と、ヒト(ヒト化)MHC II分子をコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物MHC II座位で置換することであって、
任意で、当該ヒト(ヒト化)MHC I分子は、ヒトMHC Iのα1ドメイン、α2ドメインおよびα3ドメイン、ならびに内因性非ヒトMHC Iポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有し、
任意で、当該ヒト(ヒト化)MHC II分子は、ヒトMHC IIのα1ドメイン、α2ドメイン、β1ドメインおよびβ2ドメイン、ならびに内因性齧歯類MHC IIポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有する、置換すること、ならびに
(b)
(i)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を、第二の異所性座位に挿入すること、または
(ii)
(A)内因性非ヒト重鎖座位で、内因性非ヒト免疫グロブリン可変(VH)遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン可変(VH)遺伝子セグメントとを、置換すること、ならびに任意で内因性非ヒト免疫グロブリン多様性(diversity)(DH)遺伝子セグメントおよび/または内因性非ヒト結合(joining)(JH)遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン多様性(DH)遺伝子セグメントおよび/または非再構成ヒト免疫グロブリン結合(JH)遺伝子セグメントとを、それぞれ置換することであって、当該非再構成ヒトVH遺伝子セグメント、ならびに任意でDH遺伝子およびJH遺伝子セグメントは、内因性重鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、および/または
(B)内因性非ヒト軽鎖座位で、内因性非ヒト軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントおよび内因性非ヒト軽鎖結合(JL)遺伝子セグメントと、ヒト軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖結合(JL)遺伝子セグメントとを、置換することであって、それらは任意で再構成されてVL/JL遺伝子配列を形成し、当該ヒトVL遺伝子セグメントおよび結合JL遺伝子セグメントは、内因性軽鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、を含み、
(a)それぞれ、非ヒトMHC I分子および/または非ヒトMHC II分子をコードするヌクレオチド配列、ならびに(b)VH、DH、JH、VL、およびJL遺伝子セグメントは、
(I)一つの非ヒト胚性幹(ES)細胞中で、連続相同組み換えにより挿入もしくは置換され、または
(II)第一のES細胞および第二のES細胞においてそれぞれ使用され、第一の非ヒト動物および第二の非ヒト動物が作製され、および当該方法は、当該第一および第二の非ヒト動物を交配させることをさらに含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当分野の当業者により普遍的に理解される意味と同一の意味を有する。
(i)MHC分子、例えば、ヒトおよび/またはヒト化された(例えば、ヒト(ヒト化))MHC分子、またはその一部(例えば、そのペプチド結合溝、および例えばその細胞外部分)、および
(ii)抗原性ペプチド、を含み、
この場合において当該MHC分子および抗原性ペプチドは複合体化されて、当該pMHC複合体は、T細胞受容体に特異的に結合することができる。pMHC複合体は、細胞表面で発現されたpMHC複合体、および可溶性pMHC複合体を包含する。例示的な実施形態では、例えば生殖細胞系列ゲノムなどの自身のゲノム中に、ヒト(ヒト化)MHC分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝をコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、空のヒト(ヒト化)MHC分子に対して寛容となり、またはその空のヒトペプチド結合溝に対して寛容となる。非ヒト動物に抗原性pMHC複合体を投与した際に、例えばpMHC複合体が投与される宿主非ヒト動物に対して外来性であるペプチドと複合体化されたヒト(ヒト化)MHC分子を含む複合体を非ヒト動物に投与した際に、当該非ヒト動物は、当該抗原性pMHC複合体に対する抗体反応を生じさせる能力を有する。次いでそうした特異的抗原結合タンパク質を単離し、抗原性pMHCと特異的T細胞受容体の相互作用を特異的に調節する治療剤として使用してもよい。例示的な実施形態では、非ヒト動物が寛容化されたMHC分子と複合体化されたペプチド(pMHC複合体が投与される宿主非ヒト動物に対して外来性)を含む可溶性pMHC複合体は、投与されたpMHC複合体の可溶性の性質によって、T細胞免疫反応を惹起させない場合がある。しかし、そうした可溶性pMHC複合体でも、当該pMHC複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を生成するB細胞介在性免疫反応を惹起させ得るという点で、抗原性であるとみなされ得る。
(i)生理学的条件下で、第一のMHC分子の背景化で提示される第二のペプチドを含むpMHC複合体とは安定的に結合せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは同一ではなく、例えば第一のMHC分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ(立体構造)を呈し、
(ii)(a)第一のMHC分子を背景として提示される第一のペプチドを特異的に認識する第一のTCRと、(b)当該第一のペプチドと第一のMHC分子を含むpMHC複合体の間の相互作用に干渉(例えば妨害)し得るが、
(iii)(a)第一のMHC分子を背景として提示される第二のペプチドを特異的に認識する第二のTCR、または(b)第一のMHC分子を背景として提示される第二のペプチドを含むpMHC複合体の間の相互作用には干渉せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは異なっており、例えば第一のMHC分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ(立体構造)を呈する。第一のペプチドと第一のMHC分子を含むpMHC複合体に特異的に結合するpMHC結合タンパク質はさらに、または独立して、第一のMHC分子を背景とした第一のペプチドを提示する第一の細胞に結合し得るが、第一のMHC分子を背景とした第二のペプチドを提示する第二の細胞には結合せず、この場合において当該第一および第二のペプチドは異なっており、MHC分子のペプチド結合溝と関連付けられた際に異なるイディオタイプ(立体構造)を呈する。特異的結合はまた、低いマイクロモル〜ピコモルの範囲の平衡解離定数(KD)により特徴付けることもできる。特異性が高ければ、低いナノモル範囲であり得、非常に高い特異性であれば、ピコモル範囲内となる。二つの分子が特異的に結合するかどうかを判定するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。
例示的実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウスは、少なくとも一つの空のヒトもしくはヒト化MHC分子、または少なくともその空のヒトペプチド結合溝を発現し、これらに対して寛容である。しかしながら、例えば異種などの抗原性のペプチドと複合体化されたときに、ヒト(ヒト化)MHC分子に対する、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインを含む抗原結合タンパク質などの抗原結合タンパク質を生成することができる。一部の実施形態では、空のヒト(ヒト化)MHC分子に対する非ヒト動物の寛容は、当該非ヒト動物を、そのゲノム中に、当該ヒト(ヒト化)MHC分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝をコードするヌクレオチド配列を含有するように遺伝子改変して、当該非ヒト動物が、当該ヒト(ヒト化)MHC分子または少なくともそのヒトペプチド結合溝を、空のヒト(ヒト化)MHC分子として、またはその空のヒトペプチド結合溝として発現することにより実現される。ヒト(ヒト化)MHC分子をコードするヌクレオチドを含有するよう遺伝子改変された当該動物をさらに改変して、ヒト化免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖の座位を含有させて、ヒトまたはヒト化された抗原結合タンパク質、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインを有する抗原結合タンパク質を発現させてもよい。
(1)例えば、内因性MHC座位から、(b)非ヒトMHC I分子の非ヒト膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、(a)(b)に動作可能に連結されたヒトHLA分子の少なくともヒトペプチド−結合溝、例えばヒト細胞外部分、を含有するキメラヒト/非ヒトMHC分子を発現し、および
(2)ヒトHLA分子の少なくとも細胞外部分に対して寛容である。
(i)非ヒトMHC Iポリペプチド、例えば内因性MHC Iポリペプチドの膜貫通ドメインと細胞質ドメインを含む非ヒト部分に動作可能に連結された、ヒトMHC Iポリペプチドの細胞外部分(またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば、ペプチド結合溝)を含むヒト部分を含む、キメラヒト/非ヒトMHC Iポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、ならびに/または
(ii)非ヒト部分に動作可能に連結されたヒト部分を含むキメラヒト/非ヒトMHC IIαポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列であって、当該キメラMHC IIαポリペプチドのヒト部分は、ヒトMHCクラスII分子のαポリペプチドの細胞外部分(またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば、α1ドメイン)を含む、第二のヌクレオチド配列、および非ヒト部分に動作可能に連結されたヒト部分を含むキメラヒト/非ヒトMHC IIβポリペプチドをコードする第三のヌクレオチド配列であって、当該キメラMHC IIβポリペプチドのヒト部分は、ヒトMHCクラスII分子のβポリペプチドの細胞外部分(またはその一部。例えば、一つまたは複数の細胞外ドメイン、例えば少なくともβ1ドメイン)を含む、第三のヌクレオチド配列、を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供され、
当該非ヒト動物は、キメラヒト/非ヒトのMHC Iタンパク質および/またはMHC IIタンパク質を発現し、当該キメラヒト/非ヒトのMHC Iタンパク質および/またはMHC IIタンパク質に対して寛容である。一つの実施形態では、第一、第二、および/または第三のヌクレオチド配列はそれぞれ、内因性非ヒトMHC I、MHC IIαおよびMHC IIβ座位に位置する。一つの実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、第一、第二、および/または第三のヌクレオチド配列は、マウスの17番染色体上の内因性マウスMHC座位に位置する。一つの実施形態では、第一のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトMHC I座位に位置する。一つの実施形態では、第二のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトMHC IIα座位に位置する。一つの実施形態では、第三のヌクレオチド配列は、内因性非ヒトMHC IIβ座位に位置する。
一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、各配列が、ヒトもしくはヒト化MHC IIαポリペプチド、ヒトもしくはヒト化MHC IIβポリペプチド、およびヒトもしくはヒト化MHC Iαポリペプチド、またはそれらの一部からなる群から選択される異なるヒトまたはヒト化MHCポリペプチドをコードする第一、第二および/または第三のヌクレオチド配列を含むことに加え、例えばヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖および/または軽鎖の座位も含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する。
(a)内因性重鎖座位で、
(i)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域であって、当該非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域は、複数の非再構成ヒト重鎖可変領域VH遺伝子セグメント(例えば、すべて機能性のヒト非再構成非VH遺伝子セグメント)、一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントは、一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント(例えば、すべて機能性のヒトDH遺伝子セグメント)および/または一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメント(例えば、すべて機能性のヒトJH遺伝子セグメント)であり、
(ii)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域であって、当該拘束非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域は、一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメントおよび一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントと動作可能に連結された一つの非再構成ヒト重鎖可変領域VH遺伝子セグメントから本質的になり、任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントは、それぞれ、一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント、および/または一つもしくは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントであり、
(iii)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域配列を含む共通重鎖コード配列であって、当該再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域配列は、免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメントと再構成され、免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントと再構成される、ヒト重鎖可変領域VH遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメント、または免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメントは、それぞれ、ヒト免疫グロブリン重鎖DH遺伝子セグメント、および/またはヒト免疫グロブリン重鎖JH遺伝子セグメントであり、
(iv)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域は、相補性決定領域3(CDR3)コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を含み、
(v)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域を含む、重鎖のみの免疫グロブリンコード配列であって、当該内因性重鎖定常領域は、(1)軽鎖と関連するIgMアイソタイプをコードするインタクトな内因性IgM遺伝子、および(2)機能性CH1ドメインをコードする配列を欠く例えばIgG遺伝子などの非IgM遺伝子、を含み、この場合において、当該非IgM遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるCH1ドメインを欠く非IgMアイソタイプをコードし、または
(vi)ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト(ヒト化)ハイブリッド重鎖配列であって、当該非再構成ヒト(ヒト化)ハイブリッド重鎖配列は、内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントおよび非再構成結合(JL)遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該内因性重鎖定常領域は、(1)軽鎖と関連するIgMアイソタイプをコードするインタクトな内因性IgM遺伝子、および(2)機能性CH1ドメインをコードする配列を欠く例えばIgG遺伝子などの非IgM遺伝子、を含み、この場合において、当該非IgM遺伝子は、軽鎖定常ドメインと共有結合することができるCH1ドメインを欠く非IgMアイソタイプをコードし、
および/または
(b)内因性軽鎖座位で、
(i)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域であって、当該非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域は、複数の非再構成ヒト軽鎖可変領域VL遺伝子セグメント(例えば、すべて機能性のヒト非再構成非VL遺伝子セグメント)、および一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン軽鎖JL遺伝子セグメントを含み、
任意で、当該一つまたは複数の非再構成免疫グロブリン軽鎖JL遺伝子セグメントは、一つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖JL遺伝子セグメント(例えば、すべて機能性のヒトJHL遺伝子セグメント)であり、
任意で、当該内因性免疫グロブリン軽鎖座位は、内因性免疫グロブリン軽鎖カッパ(κ)座位であり、当該非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変κ(Vκ)遺伝子セグメントおよび結合κ(Jκ)遺伝子セグメントを含み、およびこの場合において当該内因性軽鎖定常領域は、内因性κ鎖定常領域配列であり、および/または当該内因性免疫グロブリン軽鎖軽鎖座位は、内因性免疫グロブリン軽鎖ラムダ(λ)であり、当該非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ヒト可変λ(Vλ)遺伝子セグメントおよび結合λ(Jλ)遺伝子セグメントを含み、および内因性軽鎖定常領域は、内因性λ鎖定常領域配列であり、任意でこの場合において当該内因性免疫グロブリン軽鎖λ座位は、(a)一つまたは複数のヒトVλ遺伝子セグメント、(b)一つまたは複数のヒトJλ遺伝子セグメント、および(c)一つまたは複数のヒトCλ遺伝子セグメントを含み、この場合において(a)および(b)は、(c)および齧歯類免疫グロブリン軽鎖定常(Cλ遺伝子セグメント)に動作可能に連結され、およびこの場合において当該内因性免疫グロブリンλ軽鎖座位はさらに、一つまたは複数のげっ歯類免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー(Eλ、および一つまたは複数のヒト免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー(Eλ)を含み、任意で三つのヒトEλを含み、
(ii)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域配列を含む共通軽鎖コード配列であって、当該再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域配列は、免疫グロブリン軽鎖JL遺伝子セグメントと再構成された、ヒト軽鎖可変領域VL遺伝子セグメントを含み、
(iii)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域であって、当該拘束非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域は、一つまたは複数の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖結合(JL)遺伝子セグメントに動作可能に連結された2個以下の非再構成ヒト免疫グロブリン軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントを含み、
(iv)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域は、相補性決定領域3(CDR3)コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含み、または
(v)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域であって、当該ヒスチジン改変再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域は、相補性決定領域3(CDR3)コード配列に、少なくとも一つの非ヒスチジンコドンとヒスチジンコドンの置換、または少なくとも一つのヒスチジンコドンの挿入を含む、再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含む、を含むように改変されたマウスが過去に報告されており、
任意で、当該マウスはさらに、
(i)機能性ADAM6遺伝子を含むヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、非ヒト動物の野生型の生殖能力を呈し、および/または
(ii)抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)遺伝子を含み、任意でそれにより再構成可変領域遺伝子の少なくとも10%は、鋳型には無い付加を含む。
例えば、米国特許第8,697,940号、第8,754,287号、第9,204,624号、第9,334,334号、第9,801,362号、第9,332,742号、および第9,516,868号、米国特許出願公開20110195454、20120021409、20120192300、20130045492、20150289489、20180125043、20180244804、PCT特許出願公開WO2017210586およびWO2011163314、Lee et al.(2014)Nature Biotechnology 32:356を参照のこと。それら各公表文献は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる
ヒトVH遺伝子セグメント、ヒトDH遺伝子セグメント、およびヒトJH遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン座位であって、当該免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、および/または
ヒトVL遺伝子セグメント、およびヒトJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内因性鎖座位であって、当該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、を含む、遺伝子改変非ヒト動物を含む。
ヒトVH遺伝子セグメント、ヒトDH遺伝子セグメント、およびヒトJH遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン重鎖座位であって、当該免疫グロブリン重鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、および/または
ヒトVL遺伝子セグメント、およびヒトJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む内因性免疫グロブリン軽鎖座位であって、当該免疫グロブリン軽鎖可変領域は、定常領域に動作可能に連結される座位、を含む、遺伝子改変非ヒト動物を含む。
一部の実施形態では、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ(例えば、乳牛、雄ウシ、水牛)、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類(例えば、マーモセット、アカゲザル)からなる群から選択されてもよい。好適な遺伝子改変可能なES細胞が直ちに利用可能ではない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法が採用される。かかる方法としては、例えば、非ES細胞ゲノム(例えば、線維芽細胞または誘発された多能性細胞)を改変すること、および核移植を利用して好適な細胞、例えば卵母細胞、に改変されたゲノムを導入すること、および改変された細胞(例えば、改変された卵母細胞)を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。
(a)ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
(b)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で当該(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
当該遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
当該遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび/またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、および
当該非ヒト動物は、当該ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、(ii)当該ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA分子またはその一部、(i)(ii)と複合体化された当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド−MHC(pMHC)複合体で免疫化されたときに、特異的B細胞反応を生じさせる。
(a)内因性重鎖座位で、
(i)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域、
(ii)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域、
(iii)共通重鎖コード配列、
(iv)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域、
(v)重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
(vi)ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト(ヒト化)ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および/または
(b)内因性軽鎖座位で、
(i)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域、
(ii)共通軽鎖コード配列、
(iii)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、
(iv)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、または
(v)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、を含み、
任意で、当該マウスはさらに、
(i)機能性ADAM6遺伝子を含むヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および/または
(ii)抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)遺伝子を含み、任意でそれにより再構成可変領域遺伝子の少なくとも10%は、鋳型には無い付加を含む。
(a)ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
(b)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で当該(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
その結果得られた遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
その結果得られた遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび/またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、および
その結果得られたヒト動物は、当該ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、(ii)当該ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA分子またはその一部、(i)(ii)と複合体化された当該非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド−MHC(pMHC)複合体で免疫化されたときに、特異的B細胞反応を生じさせる。
(a)内因性重鎖座位で、
(i)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域、
(ii)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域、
(iii)共通重鎖コード配列、
(iv)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域、
(v)重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
(vi)ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト(ヒト化)ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および/または
(b)内因性軽鎖座位で、
(i)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域、
(ii)共通軽鎖コード配列、
(iii)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、
(iv)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、または
(v)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、を含み、
任意で、当該細胞またはゲノムはさらに、
(i)機能性ADAM6遺伝子を含むヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および/または
(ii)抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)遺伝子を含み、それにより任意で、再構成可変領域遺伝子の少なくとも10%は、鋳型には無い付加を含む。
さらに遺伝子操作された非ヒト動物(例えば、遺伝子操作された齧歯類、例えば、マウスまたはラット)を作製する方法も提供される。概して、方法は、非ヒト細胞の例えば生殖細胞系列ゲノムなどのゲノムが、(a)第一のキメラヒト/非ヒトMHCポリペプチドをコードする第一の核酸配列、第二のキメラヒト/非ヒトMHCポリペプチドをコードする第二の核酸配列、第三のキメラヒト/非ヒトMHCポリペプチドをコードする第三の核酸配列、および/またはヒトもしくはヒト化β2マイクログロブリンポリペプチドをコードするβ2マイクログロブリン座位、ならびに(b)ヒトまたはヒト化抗体をコードする免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の座位、を含むように改変することを含む。一部の実施形態では、内因性MHCポリペプチド細胞外ドメイン、β2マイクログロブリンのすべてまたは一部、および免疫グロブリン可変領域、をコードする配列を標的化すること、ならびにそれらと、ヒトMHC細胞外ドメイン、ヒトβ2マイクログロブリンのすべてまたは一部、およびヒト免疫グロブリン可変領域とをそれぞれ置換させること、を含む。
(a)内因性重鎖座位で、
(i)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域、
(ii)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域、
(iii)共通重鎖コード配列、
(iv)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域、
(v)重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
(vi)ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト(ヒト化)ハイブリッド重鎖配列、
および/または
(b)内因性軽鎖座位で、
(i)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域、
(ii)共通軽鎖コード配列、
(iii)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、
(iv)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、または
(v)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域。
任意で、当該第二のマウスはさらに、
(i)機能性ADAM6遺伝子を含むヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖座位を含み、それにより当該マウスは、野生型の生殖能力を呈し、および/または
(ii)抗原受容体の多様性を増すために外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)遺伝子を含み、それにより任意で、再構成可変領域遺伝子の少なくとも10%は、鋳型には無い付加を含む。
(a)内因性重鎖座位で、
(i)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域、
(ii)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域、
(iii)共通重鎖コード配列、
(iv)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)重鎖可変領域、
(v)重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
(vi)ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒト(ヒト化)ハイブリッド重鎖配列、
および/または
(b)内因性軽鎖座位で、
(i)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域、
(ii)共通軽鎖コード配列、
(iii)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、
(iv)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域、または
(v)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒト(ヒト化)軽鎖可変領域。
任意で、当該ES細胞はさらに、
(i)機能性ADAM6遺伝子を含むヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖座位、および/または
(ii)抗原受容体の多様性を増加させるための外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)遺伝子を含む。
本明細書に記載されるMHCタンパク質に対し寛容化されたマウスは、抗原性ペプチド−MHC複合体で免疫化され、pMHC特異的抗原結合タンパク質を産生する。一部の実施形態では、抗原性ペプチド−MHC(pMHC)複合体の一部として有用なMHCとしては、天然型の全長MHC、ならびにMHCの個々の鎖(例えば、MHCクラスIα(重)鎖、β2マイクログロブリン、MHCクラスIIα鎖、およびMHCクラスIIβ鎖)、MHCのかかる鎖の個々のサブユニット(例えば、MHCクラスIα鎖のα1〜α3サブユニット、MHCクラスIIα鎖のα1〜α2サブユニット、MHCクラスIIβ鎖のβ1〜β2サブユニット)、ならびにそれらの断片、変異体および様々な誘導体(融合タンパク質を含む)が挙げられ、この場合において当該断片、変異体および誘導体は、抗原特異的TCRにより認識されるための抗原決定基を提示する能力を保持している。
一つの実施形態では、抗原性pMHC複合体に特異的に結合する抗原結合ドメインの可変ドメインをコードする核酸、および当該核酸を発現する細胞が提供される。
(1)非ヒト動物を、対象pMHC複合体で免疫化することであって、この場合において当該非ヒト動物は、自身のゲノム中に、
(i)ヒト(ヒト化)MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
(ii)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、
任意で、この場合において当該(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていないこと、
(2)当該非ヒト動物に、対象pMHC複合体、または担体に連結された対象pMHC複合体に対する免疫反応を開始させること、
(3)当該免疫化非ヒト動物から細胞(例えばリンパ球)を単離させることであって、この場合において当該細胞は、対象pMHC複合体に特異的に結合する抗原結合ドメインを形成するヒト重鎖可変ドメインとヒト軽鎖可変ドメイン(それら各々が独立してヒスチジン改変されていてもよく、およびその軽鎖可変ドメインは、共通軽鎖可変ドメインであってもよい)をコードする第一および第二の免疫グロブリン可変領域核酸配列を含むこと、
(4)対形成したときに、対象pMHC複合体に特異的に結合する、または担体に連結された対象pMHC複合体に特異的に結合する免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域核酸配列を特定すること、および
(5)(d)の核酸配列を、抗原結合タンパク質の発現に適した発現系で発現させ、対象pMHC複合体に結合する重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの二量体を含む抗原結合タンパク質を形成させること、を含む。
(1)非ヒト動物を、対象pMHC複合体で免疫化することであって、この場合において当該非ヒト動物は、自身のゲノム中に、
(i)ヒト(ヒト化)MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
(ii)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、それにより当該非ヒト動物は、例えばヒトまたはヒト化可変ドメインなどのヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、
任意で、この場合において当該(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていないこと、
(2)対象pMHC複合体に特異的に結合する抗体のヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび/またはヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをそれぞれコードするヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域配列および/またはヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を取得すること、
(c)当該ヒト(ヒト化)免疫グロブリン重鎖可変領域配列および/またはヒト(ヒト化)免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を採用して、pMHCに結合する抗体を生成すること、を含む。
対象pMHC複合体に特異的に結合するヒト可変ドメインを含む免疫グロブリン様結合タンパク質が提供される。そうした結合タンパク質を発現する細胞、当該細胞を生成するマウス、ならびに関連の方法および組成物も提供される。
a.N末端からC末端に向かって、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合領域、IgG1、IgG2およびIgG4から選択されるヒトIgGの第一のCH3領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第一のポリペプチドであって、当該第一のCH3領域は、プロテインAに結合するもの、および
b.N末端からC末端に向かって、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合領域、IgG1、IgG2およびIgG4から選択されるヒトIgGの第二のCH3領域を含む免疫グロブリン定常領域を含む第二のポリペプチドであって、当該第二のCH3領域は、プロテインAに対する当該第二のCH3領域の結合を低下させる、または抹消させる改変を含むもの、を含んでもよい。一部の実施形態では、改変は、IMGTエクソンナンバリングシステムの(a)95R、ならびに(b)95Rおよび96F、またはEUナンバリングシステムの(a’)435R、ならびに(b’)435Rおよび436F、からなる群から選択される。一部の実施形態では、第二のCH3領域はさらに、IMGTエクソンナンバリングシステムで、16E、18M、44S、52N、57Mおよび82I、またはEUナンバリングシステムで356E、358M、384S、392N、397Mおよび422Iからなる群から選択される改変を1〜5個含む。
抗原性pMHCを用いた非ヒト動物(例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット)の免疫化による、特異的pMHC−結合タンパク質の獲得は、当該非ヒト動物の免疫系が、非自己(すなわち外因性)として対象pMHC複合体を認識することが可能となる、非ヒト動物中の内因性タンパク質と提示される異種タンパク質の間の配列の相違に依存する。自己pMHCと高度な相同性を有するpMHCに対する抗体の生成は、自己pMHCに対する免疫寛容によって、困難な課題となる可能性がある。対象ペプチドと相同な自己ペプチドに対する寛容を破壊する方法は、当業者に公知である。例えば、米国特許出願公開20170332610を参照のこと。当該文献は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、内因性ペプチドに対する寛容を破壊する方法は、本明細書に記載の非ヒト動物を改変して、対象ペプチドと高度な相同性を有する自己ペプチドの削除、例えばノックアウト変異を含ませることを含む。
特定の実施形態では、本明細書において、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された少なくとも一つのpMHC−結合タンパク質を含有する組成物、例えば医薬組成物が提供される。
一部の実施形態では、組成物は、pMHC−結合タンパク質と、限定されないが緩衝剤、糖類、塩類、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール類、希釈剤、結合剤、安定剤、塩類、親油性溶媒、アミノ酸、キレーター、保存剤などをはじめとする任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤を、所望の最終濃度で、凍結乾燥組成物の形態で、または水性溶液の形態で、混合させることにより調製される(Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,12th edition,L.Brunton,et al.and Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.Ed.(1999))。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、採用される用量および濃度でレシピエントに対し非毒性であり、例えばヒスチジン、リン酸塩、クエン酸塩、グリシン、酢酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化剤;保存剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンズアルコニウム;塩化ベンズエトニウム;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;例えばメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(10〜15残基未満)ポリペプチド;例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質;例えばポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸;トレハロース、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の炭水化物;例えばEDTAなどのキレート剤;例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類;例えばナトリウムなどの塩形成カウンターイオン;金属錯体(例えばZn−タンパク質錯体);および/または例えばTWEEN(登録商標)、ポリソルベート80、PLURONICS(登録商標)またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
実施例1
実施例2
Claims (33)
- 遺伝子改変非ヒト動物であって、自身のゲノムが、
(a)ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
(b)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で前記(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されていない座位、を含み、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、前記ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分を発現し、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび/またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現し、および
前記非ヒト動物は、前記ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、(ii)前記ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA分子またはその一部、(i)(ii)と複合体化された前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド−MHC(pMHC)複合体で免疫化されたときに、特異的B細胞反応を生じさせる、遺伝子改変非ヒト動物。 - 前記ヒトまたはヒト化MHC分子は、ヒトもしくはヒト化MHCクラスI分子、ヒトもしくはヒト化MHCクラスIIα分子、ヒトもしくはヒト化MHCクラスIIβ分子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、および/または
前記遺伝子改変非ヒト動物が、
(a)内因性重鎖座位で、
(i)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒトまたはヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域、
(ii)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒトまたはヒト化重鎖可変領域、
(iii)共通重鎖コード配列、
(iv)内因性重鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒトまたはヒト化重鎖可変領域、
(v)重鎖のみの免疫グロブリンコード配列、または
(vi)ハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする非再構成ヒトまたはヒト化ハイブリッド重鎖配列、を含み、
および/または
(b)内因性軽鎖座位で、
(i)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された非再構成ヒトまたはヒト化免疫グロブリン軽鎖可変領域、
(ii)共通軽鎖コード配列、
(iii)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結された拘束非再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、
(iv)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変非再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、もしくは
(v)内因性軽鎖定常領域に動作可能に連結されたヒスチジン改変再構成ヒトまたはヒト化軽鎖可変領域、を含む、請求項1に記載の遺伝子改変非ヒト動物。 - 前記非ヒト動物が、機能性ADAM6遺伝子をさらに含み、任意で前記機能性ADAM6遺伝子が、内因性ADAM6遺伝子である、請求項1または請求項2に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物が、外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)遺伝子をさらに発現する、請求項1〜3のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記ヒトまたはヒト化MHC分子が、ヒトまたはヒト化MHCクラスI分子であり、任意で、前記ヒトまたはヒト化MHC分子は、HLA−A分子、HLA−B分子、HLA−C分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるHLAクラスI分子から誘導される、請求項1〜4のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 自身のゲノム中、任意で内因性β2マイクログロブリン座位で、ヒトまたはヒト化β2マイクログロブリンをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、
前記非ヒト動物が、前記ヒトまたはヒト化β2マイクログロブリンを発現し、それによって、前記非ヒト動物は、前記β2マイクログロブリンそれ自体に対して寛容であり、または前記ヒトもしくはヒト化MHCクラスI分子と関連付けられた前記β2マイクログロブリンに対して寛容である、請求項5に記載の遺伝子改変非ヒト動物。 - 前記ヒトまたはヒト化MHC分子は、ヒトまたはヒト化MHCクラスII分子であり、任意で、前記ヒトまたはヒト化MHC分子は、HLA−DP分子、HLA−DQ分子、HLA−DR分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるHLAクラスII分子のα鎖および/もしくはβ鎖、または少なくともそのペプチド結合溝から誘導される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記ヌクレオチド配列が、完全ヒトHLA分子をコードし、
任意で前記ヌクレオチド配列は、内因性非ヒトMHC座位を破壊せず、任意で前記ヌクレオチド配列は、内因性ROSA26座位に配置される、請求項1〜7のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。 - 前記ヌクレオチド配列が、内因性MHC分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに動作可能に連結されたヒトHLA分子の細胞外ドメインを含む、キメラヒト/非ヒトMHC分子をコードし、任意で前記ヌクレオチド配列は、
(i)内因性非ヒトMHCクラスi分子、例えば内因性マウスH−2Kポリペプチド、内因性マウスH−2Dポリペプチド、または内因性マウスH−DLポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結された、HLA−A、HLA−BおよびHLA−Cからなる群から選択されるヒトMHCクラスI分子のα1ドメイン、α2ドメイン、およびα3ドメインを含むキメラヒト/非ヒトMHCクラスI分子、および/または
(ii)内因性非ヒトMHCクラスIIα分子、例えば内因性マウスH−2Aαポリペプチドまたは内因性マウスH−2Eαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結されたヒトHLAクラスIIαポリペプチドのα1ドメインおよびα2ドメイン、および/または内因性非ヒトMHCクラスIIβ分子、例えば内因性マウスH−2Aαポリペプチドまたは内因性マウスH−2Eαポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと動作可能に連結されたヒトHLAクラスIβポリペプチドのβ1ドメインおよびβ2ドメイン、を含むキメラヒト/非ヒトMHCクラスII分子をコードする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。 - 前記ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA分子と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチドを含有する抗原性ペプチド−MHC(pMHC)複合体をさらに含む、請求項1〜9のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- (c)(ii)前記ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA分子またはその一部、(i)(ii)と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含有する抗原性ペプチド−MHC(pMHC)複合体、および
(d)前記抗原性ペプチド−MHCに特異的に結合し、前記ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導される前記ヒトHLA分子には結合しない、ヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質、をさらに含む、請求項1〜10のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。 - 前記非ヒト動物が、ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードする前記ヌクレオチド配列に関し、ヘテロ接合性である、請求項1〜11のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物が、例えばラットまたはマウスなどの齧歯類である、請求項1〜12のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 前記非ヒト動物が、マウスである、請求項1〜13のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
(b)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位であって、任意で前記(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは再構成されていない、座位を含むよう自身のゲノムを改変すること、を含み、
前記遺伝子改変非ヒト動物は、
A.前記ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分に対して寛容であり、それにより、(ii)前記ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA分子またはその一部、(i)(ii)と複合体化された前記非ヒト動物に対して異種であるペプチド、を含むペプチド−MHC(pMHC)複合体で免疫化されたときに、特異的B細胞反応を生じさせ、および
B.ヒトもしくはヒト化重鎖可変ドメインおよび/またはヒトもしくはヒト化軽鎖可変ドメインを含む、ヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有する、方法。 - 前記方法は、
(a)
(i)ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列を、第一の異所性座位に挿入すること、または
(ii)非ヒト動物MHC Iポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、キメラヒト/非ヒトMHC Iポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物MHC I座位で置換すること、および/もしくは非ヒト動物MHC II分子をコードするヌクレオチド配列と、キメラヒト/非ヒトMHC II分子をコードするヌクレオチド配列とを、内因性非ヒト動物MHC II座位で置換することであって、
前記キメラヒト/非ヒトMHC I分子は、ヒトMHC Iのα1ドメイン、α2ドメインおよびα3ドメイン、ならびに内因性非ヒトMHC Iポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有し、
前記キメラヒト/非ヒトMHC II分子は、ヒトMHC IIのα1ドメイン、α2ドメイン、β1ドメインおよびβ2ドメイン、ならびに内因性齧歯類MHC IIポリペプチドの少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、を含有する、置換すること、および
(b)
(i)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位、および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位を、第二の異所性座位に挿入すること、または
(ii)
(A)内因性非ヒト重鎖座位で、内因性非ヒト免疫グロブリン可変(VH)遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン可変(VH)遺伝子セグメントとを、置換すること、ならびに任意で内因性非ヒト免疫グロブリン多様性(DH)遺伝子セグメントおよび/または内因性非ヒト結合(JH)遺伝子セグメントと、非再構成ヒト免疫グロブリン多様性(DH)遺伝子セグメントおよび/または非再構成ヒト免疫グロブリン結合(JH)遺伝子セグメントとを、それぞれ置換することであって、前記非再構成ヒトVH遺伝子セグメント、ならびに任意のDH遺伝子セグメントおよびJH遺伝子セグメントは、内因性重鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、および/または
(B)内因性非ヒト軽鎖座位で、内因性非ヒト軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントおよび内因性非ヒト軽鎖結合(JL)遺伝子セグメントと、ヒト軽鎖可変(VL)遺伝子セグメントおよびヒト軽鎖結合(JL)遺伝子セグメントとを、置換することであって、それらは任意で再構成されてVL/JL遺伝子配列を形成し、前記ヒトVL遺伝子セグメントおよび結合JL遺伝子セグメントは、内因性軽鎖定常領域遺伝子配列に動作可能に連結される、置換すること、を含み、
(a)それぞれ、非ヒトMHC I分子および/または非ヒトMHC II分子をコードする前記ヌクレオチド配列、ならびに(b)前記VH、DH、JH、VL、およびJL遺伝子セグメントは、
(I)一つの非ヒト胚性幹(ES)細胞中で、連続相同組み換えにより挿入もしくは置換され、または
(II)第一のES細胞および第二のES細胞においてそれぞれ使用され、第一の非ヒト動物および第二の非ヒト動物が作製され、および前記方法は、前記第一および第二の非ヒト動物を交配させることをさらに含む、請求項15に記載の方法。 - 前記ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA分子と関連付けられた、前記非ヒト動物に対して異種であるペプチドを含む抗原性pMHC複合体を、前記非ヒト動物に投与することをさらに含み、任意で、前記抗原性pMHC複合体は、ヘルパーT細胞エピトープに連結され、任意で前記ヘルパーT細胞エピトープは、PADREである、請求項15または16に記載の方法。
- 対象の抗原性pMHC複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質、または前記タンパク質をコードする核酸配列を作製する方法であって、請求項1〜14のいずれか1項に記載の非ヒト動物、または請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法に従い作製された非ヒト動物を、前記非ヒト動物が、前記対象の抗原性pMHC複合体に対する免疫反応を開始するのに充分な条件下で維持することを含み、前記対象の抗原性pMHC複合体は、前記非ヒト動物に対して異種であり、前記ヒトまたはヒト化MHC分子が誘導されるヒトHLA、またはその一部を背景として提示されるペプチドを含む、方法。
- 第一の工程として、前記非ヒト動物を、前記対象の抗原性pMHC複合体で免疫化すること、および任意で前記免疫化非ヒト動物の免疫反応をブーストすることを含み、任意で免疫化および/またはブーストは、前記非ヒト動物に、ヘルパーT細胞エピトープに連結された前記対象のpMHC複合体を投与することを含み、任意で前記ヘルパーT細胞エピトープは、配列番号28に記載されるPADREを含む、請求項18に記載の方法。
- ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび/またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸を取得する方法であって、
請求項10〜14のいずれか1項に記載の非ヒト動物から、前記非ヒト動物のリンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されるヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を含む核酸を単離すること、を含み、
前記リンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現される前記ヒト免疫グロブリン可変ドメインは、その同系可変ドメインと関連して、前記抗原性pMHC複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成する、方法。 - 前記非ヒト動物を、対象の抗原性pMHC複合体で免疫化すること、および前記非ヒト動物に、前記抗原に対する免疫反応を開始させ、その後に前記核酸を取得すること、をさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記取得された再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも一つの体細胞超変異を含む、請求項20または21に記載の方法。
- 請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法により作製された再構成ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む核酸。
- 前記核酸は、前記再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列に動作可能に連結されたヒト定常領域遺伝子配列をさらに含む、請求項23に記載の核酸。
- 前記ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、5.5〜6.0の範囲のpHで、胎児性Fc受容体(FcRn)に対する、IgG重鎖定常領域アミノ酸配列のCH2−CH3領域のアフィニティを増加させる改変を含み、前記改変は、M428L、N434S、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256E、T250Q、H433K、N434Yおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるIgG重鎖定常領域アミノ酸配列における変異である、請求項22または請求項24に記載の核酸。
- 請求項23〜25のいずれか1項に記載の核酸を含む宿主細胞。
- ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび/またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現する細胞を取得する方法であって、
請求項10〜14のいずれか1項に記載の非ヒト動物からリンパ球を単離することを含み、前記リンパ球は、前記抗原性pMHC複合体に対し特異的な抗原結合ドメインを形成するヒト免疫グロブリン可変ドメインを発現する、方法。 - 前記単離リンパ球からハイブリドーマを作製することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 例えば生殖細胞、胚性幹細胞、体細胞(例えば、B細胞)などの単離細胞であって、
(a)ヒトもしくはヒト化MHC分子または少なくともそのペプチド結合部分をコードするヌクレオチド配列、および
(b)(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位、を含み、前記非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗原結合タンパク質を提供する能力を有し、任意で前記ヒトまたはヒト化抗原結合ドメインは、ヒトまたはヒト化可変ドメインを含み、
任意で、前記(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン重鎖座位および/または(非)再構成ヒトもしくはヒト化免疫グロブリン軽鎖座位のうちの少なくとも一つは、再構成されておらず、
任意で、前記単離細胞は、請求項27または請求項28に記載の方法に従い取得される、単離細胞。 - ヒト免疫グロブリン可変ドメインをインビトロで作製する方法であって、
請求項10〜14のいずれか1項に記載の非ヒト動物のリンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現されるヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を含む第一の核酸を、細胞中で発現させること、を含み、
前記リンパ球、または前記リンパ球から作製されたハイブリドーマにより発現される前記ヒト免疫グロブリン可変ドメインは、その同系可変ドメインと関連して、前記抗原性pMHC複合体に特異的な抗原結合ドメインを形成する、方法。 - 前記第一の核酸は、前記再構成ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列に動作可能に連結されたヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列をさらに含む、請求項30に記載の方法。
- 前記ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、重鎖定常領域遺伝子配列であり、5.5〜6.0の範囲のpHで、胎児性Fc受容体(FcRn)に対する、IgG重鎖定常領域アミノ酸配列のCH2−CH3領域のアフィニティを増加させる改変を含み、前記改変は、M428L、N434S、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256E、T250Q、H433K、N434Yおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるIgG重鎖定常領域アミノ酸配列における変異である、請求項31に記載の方法。
- 請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法に従って作製されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン。
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