JP2015521629A - 抗ｅｇｆｒ抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＥＧＦＲへ結合する抗体及びその使用方法を提供する。本発明のある実施態様によれば、抗体は、高親和性でヒトＥＧＦＲへ結合する完全ヒト抗体である。ある実施態様において、本発明の抗体は、高レベルのＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害すること及び／又はこのような細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発することができる。本発明の抗体は、様々な癌並びに他のＥＧＦＲ関連障害の治療に有用である。

Description

本発明は、ヒトＥＧＦＲに対して特異的である抗体及びその抗原結合性フラグメント、並びにその使用方法に関する。

上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ１又はＥｒｂＢ１としても公知の、ＥＧＦＲ）は、１型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーのメンバーである。このファミリーの他のメンバーとしては、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２又はＮｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）及びＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）が挙げられる。ＥＧＦＲについての公知のリガンドとしては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）及びトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）が挙げられる。ＥＧＦＲへのリガンド結合は、チロシンリン酸化及び他のＥｒｂＢファミリーメンバーとの受容体二量体化を誘導する。

ＥＧＦＲなどのＲＴＫは、細胞が多様な外部刺激に反応することを可能にするように機能する。しかし、ＥＧＦＲの異常な活性化及び／又は過剰発現は、いくつかのヒト癌の発生及び進行と関連している。従って、ＥＧＦＲは抗癌療法の標的である。ＥＧＦＲを標的にする承認薬としては、小分子阻害剤、例えば、ゲフィチニブ（Iressa（登録商標））及びエルロチニブ（Tarceva（登録商標））、並びに抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブ（Erbitux（登録商標））及びパニツムマブ（Vectibix（登録商標））が挙げられる。抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、特許文献１〜７に記載されている。それにもかかわらず、癌及び他の関連障害の治療のための、抗ＥＧＦＲ抗体などの、新規のＥＧＦＲアンタゴニストについての必要性が当技術分野において存在する。

ＵＳ４，９４３，５３３ ＵＳ５，８４４，０９３ ＵＳ７，０６０，８０８ ＵＳ７，２４７，３０１ ＵＳ７，５９５，３７８ ＵＳ７，７２３，４８４ ＵＳ７，９３９，０７２

本発明は、ヒトＥＧＦＲに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、特に、ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達の阻害について、並びにＥＧＦＲ活性及び／又はシグナル伝達によって引き起こされるか又はＥＧＦＲ活性及び／又はシグナル伝達に関連する疾患及び障害の治療について、有用である。本発明の抗体はまた、それらの表面上に高レベルのＥＧＦＲを発現する細胞における細胞死の誘発について有用である。

本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であることができ、又は抗原結合性部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂又はｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでもよく、かつ機能性に影響を及ぼすように、例えば、残存するエフェクター機能を除去するように、改変されてもよい（Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933）。

本発明は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４及び３７０からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

本発明はまた、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２及び３７８からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントを提供する。

本発明はまた、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２及び３７０／３７８からなる群より選択されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む抗体又はその抗原結合性フラグメントを提供する。

本発明はまた、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０及び３７６からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；並びに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８及び３８４からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメインを含む、抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントを提供する。

ある実施態様において、抗体又は抗体の抗原結合性部分は、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／１１２、１２０／１２８、１３６／１４４、１５２／１６０、１６８／１７６、１８４／１９２、２００／２０８、２１６／２２４、２３２／２４０、２４８／２５６、２６４／２７２、２８０／２８８、２９６／３０４、３１２／３２０、３２８／３３６、３４４／３５２、３６０／３６８、及び３７６／３８４からなる群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。

本発明はまた、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６及び３７２からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８及び３７４からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４及び３８０からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；並びに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６及び３８２からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメインをさらに含む抗体又はそのフラグメントを提供する。

本発明のある非限定的で例示的な抗体及び抗原結合性フラグメントは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む：配列番号４−６−８−１２−１４−１６（例えばＨ１Ｍ０８５Ｎ）；２０−２２−２４−２８−３０−３２（例えばＨ１Ｍ０８６Ｎ）；３６−３８−４０−４４−４６−４８（例えばＨ１Ｍ０８９Ｎ）；５２−５４−５６−６０−６２−６４（例えばＨ１Ｍ１０２Ｎ）；６８−７０−７２−７６−７８−８０（例えばＨ１Ｍ１０３Ｎ）；８４−８６−８８−９２−９４−９６（例えばＨ１Ｍ１１６Ｎ）；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２（例えばＨ１Ｈ１３４Ｐ）；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８（例えばＨ１Ｈ１３６Ｐ）；１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４（例えばＨ１Ｈ１４１Ｐ）；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０（例えば、Ｈ１Ｈ１４２Ｐ）；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（例えばＨ１Ｈ１４３Ｐ）；１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２（例えば、Ｈ１Ｈ１４４Ｐ）；１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８（例えばＨ１Ｈ１４５Ｐ）；２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４（例えばＨ１Ｈ１４７Ｐ）；２２８−２３０−２３２−２３６−２３８−２４０（例えばＨ１Ｈ１５１Ｐ）；２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６（例えばＨ１Ｈ１５３Ｐ）；２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２（例えばＨ１Ｈ１５５Ｐ）；２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８（例えばＨ１Ｈ１５７Ｐ）；２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４（例えばＨ１Ｈ１５８Ｐ）；３０８−３１０−３１２−３１６−３１８−３２０（例えばＨ１Ｈ１５９Ｐ）；３２４−３２６−３２８−３３２−３３４−３３６（例えばＨ１Ｈ１６１Ｐ）；３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２（例えばＨ１Ｈ１６３Ｐ）；３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８（例えばＨ１Ｈ１６９Ｐ）；及び３７２−３７４−３７６−３８０−３８２−３８４（例えばＨ１Ｈ１７１Ｐ）。

関連する実施態様において、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントを含み、ここで、抗体又はフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２及び３７０／３７８からなる群より選択される重鎖及び軽鎖可変領域（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列内に含有される重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は、当技術分野において周知であり、本明細書に開示された特定のＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内でＣＤＲを同定するために用いることができる。ＣＤＲの境界を同定するために用いることができる例示的な規則としては、例えば、カバット（Kabat）定義、チョシア（Chothia）定義及びＡｂＭ定義が挙げられる。一般的には、カバット定義は配列変異性に基づいており、チョシア定義は、構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義は、カバットとチョシアアプローチとの間の折衷案である。例えば、Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)；Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997)；及びMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)を参照のこと。また、抗体内のＣＤＲ配列の同定には公開データベースが利用可能である。

別の局面において、本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を担持している組換え発現ベクター、及びこのようなベクターが導入された宿主細胞も、本発明によって包含されており、抗体を産生できる条件下で宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することによって抗体を産生する方法も同様である。

一実施態様において、本発明は、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３２１、３３７、３５３及び３６９からなる群より選択される核酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＶＲを含む抗体又はそのフラグメントを提供する。

本発明はまた、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２９、３４５、３６１及び３７７からなる群より選択される核酸配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＶＲを含む抗体又はそのフラグメントを提供する。

本発明はまた、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、３１１、３２７、３４３、３５９及び３７５からなる群より選択されるヌクレオチド配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＤＲ３ドメイン；並びに配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、３１９、３３５、３５１、３６７及び３８３からなる群より選択されるヌクレオチド配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＤＲ３ドメインを含む、抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントを提供する。

本発明はまた、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０７、３２３、３３９、３５５及び３７１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３２５、３４１、３５７及び３７３からなる群より選択されるヌクレオチド配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、３１５、３３１、３４７、３６３及び３７９からなる群より選択されるヌクレオチド配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＤＲ１ドメイン；並びに配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３３３、３４９、３６５及び３８１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、又はその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＤＲ２ドメインをさらに含む、抗体又はそのフラグメントを提供する。

ある実施態様によれば、抗体又はそのフラグメントは、配列番号１及び９（例えばＨ１Ｍ０８５Ｎ）、１７及び２５（例えばＨ１Ｍ０８６Ｎ）、３３及び４１（例えばＨ１Ｍ０８９Ｎ）、４９及び５７（例えばＨ１Ｍ１０２Ｎ）、６５及び７３（例えばＨ１Ｍ１０３Ｎ）、８１及び８９（例えばＨ１Ｍ１１６Ｎ）、９７及び１０５（例えばＨ１Ｈ１３４Ｐ）、１１３及び１２１（例えばＨ１Ｈ１３６Ｐ）、１２９及び１３７（例えばＨ１Ｈ１４１Ｐ）、１４５及び１５３（例えばＨ１Ｈ１４２Ｐ）、１６１及び１６９（例えばＨ１Ｈ１４３Ｐ）、１７７及び１８５（例えばＨ１Ｈ１４４Ｐ）、１９３及び２０１（例えばＨ１Ｈ１４５Ｐ）、２０９及び２１７（例えばＨ１Ｈ１４７Ｐ）、２２５及び２３３（例えばＨ１Ｈ１５１Ｐ）、２４１及び２４９（例えばＨ１Ｈ１５３Ｐ）、２５７及び２６５（例えばＨ１Ｈ１５５Ｐ）、２７３及び２８１（例えばＨ１Ｈ１５７Ｐ）、２８９及び２９７（例えばＨ１Ｈ１５８Ｐ）、３０５及び３１３（例えばＨ１Ｈ１５９Ｐ）、３２１及び３２９（例えばＨ１Ｈ１６１Ｐ）、３３７及び３４５（例えばＨ１Ｈ１６３Ｐ）、３５３及び３６１（例えばＨ１Ｈ１６９Ｐ）、又は３６９及び３７７（例えばＨ１Ｈ１７１Ｐ）の核酸配列によってコードされる重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。

本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＥＧＦＲ抗体を含む。いくつかの用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾が、有用となることがあり、又は、オリゴ糖鎖に存在するフコース部分が欠如した抗体は、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を高めるのに有用となることがある（Shield et al. (2002) JBC 277:26733を参照のこと）。別の用途において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改良するために行うことができる。

別の局面において、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する組換えヒト抗体又はそのフラグメント及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。関連した局面において、本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体と第２の治療剤との組合せである組成物を特徴とする。一実施態様において、第２の治療剤は、抗ＥＧＦＲ抗体と都合よく組み合わせた任意の薬剤である。抗ＥＧＦＲ抗体と都合よく組み合わせてもよい例示的な薬剤としては、ＥＧＦＲ活性を阻害する他の薬剤（他の抗体又はその抗原結合性フラグメント、ペプチド阻害剤、小分子アンタゴニスト、などを含む）、及び／又はＥＧＦＲに直接結合しないが、それにもかかわらずＥＧＦＲ媒介シグナル伝達を妨げる、遮断する又は弱める薬剤が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

さらに別の局面において、本発明は、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又は抗体の抗原結合性部分を使用してＥＧＦＲ活性を阻害するための方法を提供し、ここで、この治療方法は、本発明の抗体又は抗体の抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物の治療有効量を投与することを含む。治療される障害は、ＥＧＦＲ活性の除去、阻害又は減少によって改善、向上、抑制又は予防されるあらゆる疾患又は状態である。本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又は抗体フラグメントは、ＥＧＦＲとＥＧＦＲ結合パートナー（例えば、上皮増殖因子［ＥＧＦ］、トランスフォーミング増殖因子α［ＴＧＦ−α］など）との相互作用を遮断するように機能してもよいし、又は、そうでない場合、ＥＧＦＲのシグナル伝達活性を阻害してもよい。

また、本発明は、患者におけるＥＧＦＲ活性に関連するか、又はそれによって生じる疾患又は障害の治療のための医薬の製造における本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又は抗体の抗原結合性部分の使用を含む。

他の実施態様は、次の詳細な説明の総説から明らかになる。

詳細な説明
本発明を記述する前に、記述された特定の方法及び実験条件は変化することがあるため、本発明はこのような方法及び条件に限定されないことを理解しなければならない。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に用いる専門用語は、特定の実施態様を記述するためだけにあり、限定を意図しないことを理解しなければならない。

特に明記しない限り、本明細書に用いるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に用いるように、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して用いる場合、その値が列挙された値から１％を超えずに逸脱してもよいことを意味する。例えば、本明細書に用いるように、「約１００」という表現は、９９及び１０１並びにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本発明の実施又は試験においては、本明細書に記述したものと類似の又は同等のあらゆる方法及び材料を用いることができるが、好ましい方法及び材料を、ここに記述する。

定義
本明細書に用いる「ＥＧＦＲ」及び「ＥＧＦＲフラグメント」という表現は、非ヒト種由来である（例えば、「マウスＥＧＦＲ」、「マウスＥＧＦＲフラグメント」、「サルＥＧＦＲ」、「サルＥＧＦＲフラグメント」など）と指定されない限り、ヒトＥＧＦＲタンパク質又はフラグメントを指す。ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインは、例えば、配列番号３８５のアミノ酸２５〜６４５で示される、アミノ酸配列を有する。

本明細書において使用される場合、「ＥＧＦＲに結合する抗体」又は「抗ＥＧＦＲ抗体」は、ＥＧＦＲタンパク質の可溶性フラグメント（例えば、ＥＧＦＲの細胞外ドメインの部分）及び／又は細胞表面発現ＥＧＦＲに結合する、抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。表現「細胞表面発現ＥＧＦＲ」は、ＥＧＦＲタンパク質の少なくとも部分（例えば、配列番号３８５のアミノ酸２５〜６４５）が細胞膜の細胞外側へ露出されかつ抗体の抗原結合性部分がアクセス可能であるように、インビトロ又はインビボで細胞の表面上に発現されているＥＧＦＲタンパク質又はその部分を意味する。可溶性ＥＧＦＲ分子としては、例えば、本明細書の実施例３に記載されるような単量体及び二量体ＥＧＦＲ構築物（即ち、それぞれ、「ＥＧＦＲ．ｍｍｈ」、配列番号３８６、及び「ＥＧＦＲ．ｍＦｃ」、配列番号３８７）、又はそれらに実質的に類似した構築物が挙げられる。

本明細書に用いる「抗体」という用語は、特定の抗原（例えば、ＥＧＦＲ）と特異的に結合又は相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合性分子又は分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶ_Hと略する）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_H１、Ｃ_H２及びＣ_H３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶ_Lと略する）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_L１）を含む。Ｖ_H及びＶ_L領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存される領域の間に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域にさらに細かく分けることができる。各Ｖ_H及びＶ_Lは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。本発明の異なる実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体（又はその抗原結合性部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一あってもよいし、又は自然に若しくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸のコンセンサス配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲの比較分析に基づいて定義してもよい。

また、本明細書に用いる「抗体」という用語は、完全な抗体分子の抗原結合性フラグメントも包含する。本明細書に用いる抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、なんらかの天然の、酵素によって入手可能な、合成の、又は遺伝子組換えのポリペプチド又は糖タンパク質を包含する。抗体の抗原結合性フラグメントは、例えば、タンパク分解のような任意の適した標準技術又は抗体可変ドメイン及び場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組換え遺伝子工学技術を用いて完全な抗体分子から誘導してもよい。このようなＤＮＡは、公知であり、かつ／又は、例えば、商業的な供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、又は合成することができる。ＤＮＡを、化学的に、又は分子生物学的技術を用いることによって配列決定し、操作して、例えば、１つ若しくはそれ以上の可変及び／又は定常ドメインを適した配置に配列するか、又はコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、若しくは欠失させる、などしてもよい。

抗原結合性フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、又は限定されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小限の認識単位が挙げられる。また、他の改変された分子、例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体（CDR-grafted antibody）、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニ抗体（minibody）、ナノ抗体（nanobody）（例えば、一価のナノ抗体、二価のナノ抗体、など）、小モジュラー免疫医薬（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメイン（shark variable IgNAR domain）、も、また本明細書に用いる「抗原結合性フラグメント」の表現に包含される。

抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの可変ドメインを典型的に含む。可変ドメインは、任意の寸法又はアミノ酸組成であってもよく、１つ若しくはそれ以上のフレームワーク配列に隣接するか、又はそれを有するフレーム中にある少なくとも１つのＣＤＲを一般に含むことになる。Ｖ_Lドメインと会合したＶ_Hドメインを有する抗原結合性フラグメントにおいて、Ｖ_H及びＶ_Lドメインは、任意の適した配置で互いに相対した位置にあってもよい。例えば、可変領域は、二量体であり、Ｖ_H−Ｖ_H、Ｖ_H−Ｖ_L又はＶ_L−Ｖ_L二量体を含んでもよい。代わりに、抗体の抗原結合性フラグメントは、単量体のＶ_H又はＶ_Lドメインを含んでもよい。

特定の実施態様において、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合性フラグメントに見いだすことができる可変及び定常ドメインの非限定的な例示的な配置としては、（ｉ）Ｖ_H−Ｃ_H１；（ｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_H２；（ｉｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_H３；（ｉｖ）Ｖ_H−Ｃ_H１−Ｃ_H２；（ｖ）Ｖ_H−Ｃ_H１−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｖｉ）Ｖ_H−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｖｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_L；（ｖｉｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１；（ｉｘ）Ｖ_L−Ｃ_H２；（ｘ）Ｖ_L−Ｃ_H３；（ｘｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１−Ｃ_H２；（ｘｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H２−Ｃ_H３；及び（ｘｉｖ）Ｖ_L−Ｃ_Lが挙げられる。上記の例示的な配置のいずれかを含む可変及び定常ドメインの任意の配置において、可変ドメインと定常ドメインとは、互いに直接結合していてもよいし、又は完全若しくは不完全なヒンジ若しくはリンカー領域によって結合されてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中の隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメイン間に柔軟性又は半柔軟性の結合を生じる少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個又はそれ以上）のアミノ酸からなってもよい。さらに、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、上記の可変及び定常ドメイン配置のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は、他の多量体）を、互いに及び／又は１つ若しくはそれ以上の単量体のＶ_Hドメイン若しくはＶ_Lドメインとの非共有結合性会合状態（例えば、ジスルフィド結合による）で含んでもよい。

完全な抗体分子と同様に、抗原結合性フラグメントは、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合性フラグメントは、典型的に少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここにおいて、それぞれの可変ドメインは、別々の抗原に又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示された例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能な常用技術を用いて本発明の抗体の抗原結合性フラグメントに関する使用に合わせてもよい。

本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を通して機能してもよい。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）とは、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解のことをいう。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解を導く細胞媒介反応のことをいう。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当技術分野で周知かつ入手可能なアッセイを用いて測定することができる。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号並びにClynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656を参照のこと）。抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかどうかに基づいて選択してもよい。

本明細書に用いる「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域及び定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３中にヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよい。しかし、本明細書に用いる「ヒト抗体」という用語は、マウスのような他の哺乳動物種の生殖系列から誘導されたＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体を包含しないものとする。

本明細書に用いる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離されたすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（さらに下に記述する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（さらに下に記述する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照のこと）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むなんらかの他の手段によって調製、発現、作製若しくは単離された抗体を含むものとする。このような組換えヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン生殖系列配列から誘導された可変及び定常領域を有する。しかし、特定の実施態様では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を用いるときは、インビボで体細胞突然変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶ_H及びＶ_L領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_H及びＶ_L配列から誘導され、かつそれに関連するが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくてもよい配列である。

ヒト抗体は、ヒンジ不均一性（hinge heterogeneity）に伴って２つの形態で存在することができる。１つの形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって共に保持されている、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４つの鎖構築物を含む。第２の形態では、二量体が鎖間ジスルフィド結合を介して結合されておらず、約７５〜８０ｋＤａの分子が共有結合した軽鎖及び重鎖（半分の抗体）で構成され形成されている。これらの形態は、アフィニティー精製の後でさえ、分離するのが極めて困難である。

さまざまなインタクトなＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度（frequency of appearance）は、限定されるわけではないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプに伴う構造の違いによるものである。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現（Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105）を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルに有意に低減することができる。本発明は、例えば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するため、望ましいことでありうる、ヒンジ、Ｃ_H２又はＣ_H３領域中に１つ又はそれ以上の突然変異を有する抗体を包含する。

本明細書に用いる「単離された抗体」は、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定され、かつ分離及び／又は回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１つの成分から、又は抗体が自然に存在する若しくは自然に産生される組織若しくは細胞から分離又は除去された抗体は、本発明の目的の「単離された抗体」である。また、単離された抗体は、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製又は単離ステップにかけられた抗体である。特定の実施態様によれば、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。

本明細書に用いる「中和」又は「遮断」抗体は、ＥＧＦＲに結合すると（ｉ）ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲフラグメントとＥＧＦＲリガンド（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−αなど）との間の相互作用を妨げる、及び／又は（ｉｉ）ＥＧＦＲの少なくとも１つの生物学的機能を阻害する抗体のことをいうものとする。ＥＧＦＲ中和又は遮断抗体によって生じる阻害は、適当なアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。ＥＧＦＲ阻害を検出するための例示的なアッセイを本明細書に記述する。

本明細書に開示された抗ＥＧＦＲ抗体は、抗体が誘導された対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域中に１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含んでもよい。このような突然変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、例えば公開された抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されたアミノ酸配列のいずれかから誘導された抗体及びその抗原結合性フラグメントを含み、ここにおいて、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上のアミノ酸が、抗体が誘導された生殖系列配列の対応する残基に、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、又は対応する生殖系列残基の同類アミノ酸置換に突然変異する（このような配列変化は、本明細書においてひとまとめにして「生殖系列突然変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示された重鎖及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ又はそれ以上の個々の生殖系列突然変異又はその組合せを含む多くの抗体及び抗原結合性フラグメントを容易に産生することができる。特定の実施態様において、Ｖ_H及び／又はＶ_Lドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基のすべては、抗体が誘導された最初の生殖系列配列中に見いだされる残基に逆に突然変異する。別の実施態様では、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内若しくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見いだされる突然変異残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内に見いだされる突然変異残基のみ、最初の生殖系列配列に逆に突然変異する。別の実施態様では、１つ又はそれ以上のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基が、異なる生殖系列配列（すなわち、最初に抗体が誘導された生殖系列配列と異なる生殖系列配列）の対応する残基に突然変異する。さらにまた、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内に２つ又はそれ以上の生殖系列突然変異の任意の組合せを含んでもよく、例えば、ここでは、特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基に突然変異する一方で、最初の生殖系列配列と異なる特定の他の残基が、維持されているか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基に突然変異する。１つ又はそれ以上の生殖系列突然変異を含む抗体及び抗原結合性フラグメントは、一旦得られたら、改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善又は増強されたアンタゴニスト又はアゴニストの生物学的性質（ありうる場合として）、低減された免疫原性などのような１つ又はそれ以上の所望の性質について容易に試験することができる。この一般的なやり方で得られる抗体及び抗原結合性フラグメントは、本発明内に包含される。

また、本発明は、１つ又はそれ以上の同類置換を有する、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＥＧＦＲ抗体を包含する。例えば、本発明は、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して、例えば、１０又はそれより少ない、８又はそれより少ない、６又はそれより少ない、４又はそれより少ない、などの同類アミノ酸置換を有する、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲ抗体を包含する。

「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基のことをいう。１つの抗原が複数のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体が抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的作用を有してもよい。エピトープは、立体配置的又は線状であってもよい。立体配置的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なる部分からの空間的に並置されたアミノ酸によって生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって生じたものである。特定の状況において、エピトープは、抗原上に糖類の部分、ホスホリル基又はスルホニル基を含んでもよい。

「実質的同一性」又は「実質的に同一の」という用語は、核酸又はそのフラグメントについて言及する場合、別の核酸（又は、その相補的鎖）を用いて適当なヌクレオチド挿入物又は欠失物を最適に整列したときに、任意の周知の配列同一性のアルゴリズム、例えば以下で議論するＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示している。参照核酸分子と実質的同一性を有する核酸分子は、特定の例では、参照核酸分子によってコードされたポリペプチドと同一か、又は実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。

ポリペプチドに適用されるように、「実質的類似性」又は「実質的に類似した」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いて、例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列させたときに、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、同類アミノ酸置換によって異なる。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、同類アミノ酸置換はタンパク質の機能的性質を実質的に変えないことになる。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が同類置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は類似性の程度を上向きに調整して置換の保存的性質（conservative nature）を補正してもよい。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照のこと。類似した化学的性質の側鎖を有するアミノ酸基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン及びヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパルテート及びグルタメート、及び（７）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンである、が挙げられる。好ましい同類アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、同類置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度な同類」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。

ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性とも呼ばれており、配列分析ソフトウェアを用いて典型的に測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、同類アミノ酸置換を含む、さまざまな置換、欠失及び他の修飾に割り当てられる類似性の計測を用いて類似した配列をマッチングさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアには、Ｇａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムがあり、これらは、デフォルトパラメータを用いて異なる生物種からの相同性ポリペプチドのような密接に関連したポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性又は配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列は、ＦＡＳＴＡを用い、デフォルト又は推奨パラメータ、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムを用いて比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリーと探索配列との間の最良の重複部分の領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する（前出、Pearson (2000)）。本発明の配列をさまざまな生物からの多数の配列を含むデータベースと比較するときの別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮであり、デフォルトパラメータを用いる。例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 及び Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402を参照のこと。

抗体の生物学的特徴
本発明は、高親和性で単量体又は二量体ＥＧＦＲ分子に結合する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例３に指定されるようなアッセイ形式を使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に約２０ｐＭ未満のＫ_Dで二量体ＥＧＦＲに結合する抗体及び抗体の抗原結合性フラグメントを含む。ある実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に指定されるようなアッセイ形式を使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に約１５ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約８ｐＭ未満、約６ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約２ｐＭ未満、又は約１ｐＭ未満のＫ_Dで二量体ＥＧＦＲに結合する。本発明はまた、例えば、本明細書の実施例３に指定されるようなアッセイ形式を使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に約２００分を超えるｔ 1/2で二量体ＥＧＦＲに結合する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。ある実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３に指定されるようなアッセイ形式を使用して、表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、約２１０分を超える、約２２０分を超える、約２５０分を超える、約２６０分を超える、約２８０分を超える、約３００分を超える、約３２０分を超える、約３４０分を超える、約３６０分を超える、約３８０分を超える、約４００分を超える、約４５０分を超える、約５００分を超える、約５５０分を超える、約６００分を超える、約６５０分を超える、約８００分を超える、約１０００分を超える、又はそれ以上のｔ 1/2で二量体ＥＧＦＲに結合する。

本発明はまた、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の増殖を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。例えば、本発明は、約２００ｐＭ未満のＩＣ₅₀（即ち、５０％最大増殖阻害をもたらす濃度）で、それらの表面上に高レベルのＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞（例えば、Ａ４３１類表皮癌細胞）の増殖を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。ＩＣ₅₀値は、本明細書の実施例４に例証される細胞増殖阻害アッセイ、又は実質的に類似したアッセイを使用して決定することができる。本発明のある実施態様によれば、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントは、本明細書の実施例４に例証される細胞増殖阻害アッセイ、又は実質的に類似したアッセイを使用して決定した場合に、約１８０ｐＭ未満、約１６０ｐＭ未満、約１４０ｐＭ未満、約１２０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、又は約２ｐＭ未満のＩＣ₅₀でインビトロにてＡ４３１細胞の増殖を阻害することができる。

本発明はまた、ＥＧＦＲを発現する細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。ＡＤＣＣを測定するためのアッセイは当技術分野において公知である。例示的なアッセイ形式を本明細書の実施例５に示し、ここで、抗ＥＧＦＲ抗体を、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びＡ４３１類表皮癌細胞（即ち、高レベルのＥＧＦＲを発現する細胞）の細胞混合物へ添加する。細胞死滅の程度を、未処理細胞をジギトニンの添加によって溶解させた条件下で観察された最大細胞溶解シグナルに対して評価し；それによってＡＤＣＣの程度を最大細胞死滅のパーセントで表すことができる。本発明は、実施例５のＡＤＣＣアッセイ形式又は実質的に類似したアッセイで試験した場合に、約２５％を超える最大細胞死滅パーセンテージをもたらす抗ＥＧＦＲ抗体を含む。ある実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、実施例５のＡＤＣＣアッセイ形式又は実質的に類似したアッセイにおいて測定した場合に、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、又はそれ以上の最大細胞死滅パーセンテージでＡＤＣＣを誘発する。

本発明はまた、インビトロ又はインビボで腫瘍増殖を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。ある状況で、本発明の抗体又は抗原結合性フラグメントは、腫瘍退縮又は縮小を引き起こす。本発明は、免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。例えば、本明細書の実施例６に示されるように、例示的な抗ＥＧＦＲ抗体Ｈ１Ｈ１４１Ｐは、マウス異種移植モデルにおいて、頭頸部扁平上皮癌細胞（例えば、ＦａＤｕ腫瘍細胞）、膵腫瘍細胞（ＢｘＰＣ３）、及び肺腫瘍細胞（Ｃａｌｕ３及びＮＣＩ−Ｈ３５８）の増殖を有意に阻害した。本発明は、ｈＦｃ対照処置腫瘍担持マウスと比較して約５０％を超えて（例えば、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又はそれ以上）腫瘍担持マウスにおいて腫瘍細胞増殖を阻害する抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。

本発明はまた、細胞表面発現されたＥＧＦＲのインターナリゼーションを誘導する抗ＥＧＦＲ抗体及びその抗原結合性フラグメントを含む。

エピトープマッピング及び関連技術
本発明は、ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン内（例えば、細胞外ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及び／又はＩＶ内）に見られる１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＥＧＦＲ抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン内にある３又はそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）のアミノ酸の単一の隣接配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン内にある複数の非隣接アミノ酸（又は、アミノ酸配列）からなってもよい。

抗体がポリペプチド又はタンパク質中の「１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するためには、当業者に公知のさまざまな技術を用いることができる。例示的な技術としては、例えば、常用のクロスブロッキングアッセイ（cross-blocking assay）例えば、Antibodies, Harlow and Lane（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY）に記述されたもの、アラニンスキャニンング突然変異解析（alanine scanning mutational analysis）、ペプチドブロット解析（peptide blots analysis）（Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463）、及びペプチド切断解析（peptide cleavage analysis）が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾のような方法を用いることができる（Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496）。抗体が相互作用するポリペプチド中のアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的には、水素／重水素交換方法は、興味のタンパク質を重水素標識し、続いて抗体を重水素標識タンパク質に結合することを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体によって保護された残基（これは重水素標識されたままである）以外のすべての残基で水素−重水素交換を起こさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析にかけ、それによって抗体が相互作用する特異的アミノ酸に相当する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265Aを参照のこと。

本発明はさらに、本明細書に記載の特異的で例示的な抗体のいずれかと同一のエピトープへ結合する抗ＥＧＦＲ抗体を含む（例えば、Ｈ１Ｍ０８５Ｎ、Ｈ１Ｍ０８６Ｎ、Ｈ１Ｍ０８９Ｎ、Ｈ１Ｍ１０２Ｎ、Ｈ１Ｍ１０３Ｎ、Ｈ１Ｍ１１６Ｎ、Ｈ１Ｈ１３４Ｐ、Ｈ１Ｈ１３６Ｐ、Ｈ１Ｈ１４１Ｐ、Ｈ１Ｈ１４２Ｐ、Ｈ１Ｈ１４３Ｐ、Ｈ１Ｈ１４４Ｐ、Ｈ１Ｈ１４５Ｐ、Ｈ１Ｈ１４７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３Ｐ、Ｈ１Ｈ１５５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５９Ｐ、Ｈ１Ｈ１６１Ｐ、Ｈ１Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１Ｈ１６９Ｐ、Ｈ１Ｈ１７１Ｐなど）。同様に、本発明はまた、本明細書に記載の特異的で例示的な抗体のいずれかとＥＧＦＲへの結合について競合する抗ＥＧＦＲ抗体を含む（例えば、Ｈ１Ｍ０８５Ｎ、Ｈ１Ｍ０８６Ｎ、Ｈ１Ｍ０８９Ｎ、Ｈ１Ｍ１０２Ｎ、Ｈ１Ｍ１０３Ｎ、Ｈ１Ｍ１１６Ｎ、Ｈ１Ｈ１３４Ｐ、Ｈ１Ｈ１３６Ｐ、Ｈ１Ｈ１４１Ｐ、Ｈ１Ｈ１４２Ｐ、Ｈ１Ｈ１４３Ｐ、Ｈ１Ｈ１４４Ｐ、Ｈ１Ｈ１４５Ｐ、Ｈ１Ｈ１４７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３Ｐ、Ｈ１Ｈ１５５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５９Ｐ、Ｈ１Ｈ１６１Ｐ、Ｈ１Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１Ｈ１６９Ｐ、Ｈ１Ｈ１７１Ｐなど）。

当技術分野において公知の常法を使用して、抗体が、参照抗ＥＧＦＲ抗体と同一のエピトープへ結合するかどうか、又は参照抗ＥＧＦＲ抗体と結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗ＥＧＦＲ抗体と同一のエピトープへ結合するかどうかを決定するために、参照抗体を、ＥＧＦＲタンパク質（例えば、ＥＧＦＲ細胞外ドメインの可溶性部分、又は細胞表面発現ＥＧＦＲ）へ結合させる。次に、ＥＧＦＲ分子へ結合する試験抗体の能力を評価する。参照抗ＥＧＦＲ抗体での飽和結合後に、試験抗体がＥＧＦＲへ結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＥＧＦＲ抗体とは異なるエピトープへ結合すると結論付けることができる。一方、参照抗ＥＧＦＲ抗体での飽和結合後に、試験抗体がＥＧＦＲ分子へ結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＥＧＦＲ抗体によって結合されるエピトープと同一のエピトープへ結合する可能性がある。そこで、さらなる常用実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を実施して、試験抗体の結合が観察されなかったのが、実際に、参照抗体と同一のエピトープへの結合によるものかどうか、又は立体障害（又は、別の現象）が、結合が観察されなかった原因であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用可能な他のなんらかの定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。本発明の特定の実施態様によれば、競合的結合アッセイで測定して、例えば、１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰の一方の抗体が、他方の結合を少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％又はさらに９９％阻害する場合、２つの抗体は、同一の（又はオーバーラップ）エピトープに結合している（例えば、Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502を参照のこと）。あるいは、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同一のエピトープに結合すると考えられる。一方の抗体の結合を低減又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は「オーバーラップエピトープ（overlapping epitope）」を有すると考えられる。

抗体が結合について参照抗ＥＧＦＲ抗体と競合するかどうかを決定するため、上記の結合方法論を２つの方針で実施する。第１の方針では、参照抗体を飽和条件下でＥＧＦＲタンパク質（例えば、ＥＧＦＲ細胞外ドメインの可溶性部分、又は細胞表面発現ＥＧＦＲ）に結合させた後、ＥＧＦＲ分子に対する試験抗体の結合を評価する。第２の方針では、試験抗体を飽和条件下でＥＧＦＲ分子に結合させた後、ＥＧＦＲ分子に対する参照抗体の結合を評価する。いずれの方針でも、最初の（飽和）抗体のみがＥＧＦＲ分子に結合可能である場合、試験抗体及び参照抗体は、ＥＧＦＲへの結合について競合すると結論づけられる。当業者に認められるように、結合について参照抗体と競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合しなくてもよく、しかし、オーバーラップ又は隣接エピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に妨害することもある。

ヒト抗体の作製
完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で公知である。本発明の文脈では、任意のこのような公知の方法を用いて、ヒトＥＧＦＲへ特異的に結合するヒト抗体を作ることができる。

VELOCIMMUNE^TM技術又はモノクローナル抗体を生成するための他のなんらかの公知の方法を用いて、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、ＥＧＦＲに対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。下の実験部分におけるように、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について抗体を特徴づけし、選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置換して本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型又は修飾されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４を生成する。選択する定常領域は特定の使用に応じて変化してもよいが、高親和性の抗原結合性及びターゲット特異性の特徴は可変領域に存在する。

生物学的同等性
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体及び抗体フラグメントは、記述された抗体のものとは異なるが、ヒトＥＧＦＲに結合する能力を保持する、アミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような変異抗体及び抗体フラグメントは、親配列と比較したときにアミノ酸の１つ又はそれ以上の付加、欠失又は置換を含むが、記述された抗体のもの本質的に同等の生物活性を示す。同様に、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較したときにヌクレオチドの１つ又はそれ以上の付加、欠失又は置換を含むが、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又は抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等である抗ＥＧＦＲ抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を包含する。このような変異アミノ酸及びＤＮＡ配列の例は、上で議論されている。

２つの抗原結合性タンパク質又は抗体は、例えば、類似の実験条件下、単一用量又は複数用量のいずれかで、同モル用量で投与したときに、それらが、それらの吸収の速度及び程度において有意差を示さない薬学的同等物又は薬学的代替物である場合、生物学的に同等であると考えられる。いくつかの抗体は、それらがそれらの吸収の程度において同等であるが、それらの吸収速度ではそうではなくても、生物学的に同等であると考えてもよい場合、同等物又は薬学的代替物であるとみなされることになり、その理由は、吸収速度におけるこのような違いが、意図的であり、かつ標識化において反映され、例えば、慢性的使用において、有効な体の薬物濃度の達成に不可欠でなく、そして研究された特定の医薬品にとって医学的に重要でないと考えられるからである。

一実施態様において、２つの抗原結合性タンパク質は、それらの安全性、純度及び効力において臨床的に意義のある違いがない場合、生物学的に同等である。

一実施態様において、２つの抗原結合性タンパク質は、患者が、参照生成物と生物学的生成物との間で１回又はそれ以上切り替えることができて、このようなスイッチングのない連続した療法と比較して、免疫原性における臨床的に有意な変化、又は減少した有効性を含む、有害効果のリスクにおける予想された増加がない場合、生物学的に同等である。

一実施態様において、２つの抗原結合性タンパク質は、それらがいずれも、使用条件に共通の作用機構によって、このような機構が知られている範囲で作用する場合、生物学的に同等である。

生物学的同等性は、インビボ及びインビトロ方法によって示してもよい。生物学的同等性の計測としては、例えば、（ａ）抗体又はその代謝産物の濃度を、時間の関数として血液、血漿、血清又は他の体液中で測定するヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトインビボ生物学的利用能データを関連づけて合理的に予測するインビトロ試験；（ｃ）抗体（又は、その標的）の適当な急性薬理学的作用を時間の関数として測定するヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；及び（ｄ）抗体の安全性、有効性又は生物学的利用能又は生物学的同等性を確立する管理良好の臨床試験が挙げられる。

本発明の抗ＥＧＦＲ抗体の生物学的に同等な変異体は、例えば、残基若しくは配列のさまざまな置換を行うか、又は生物活性に必要でない末端若しくは内部の残基若しくは配列を欠失させることによって作製してもよい。例えば、生物活性に必須でないシステイン残基は、欠失させるか、又は他のアミノ酸と置換して再生時に不必要な若しくは間違った分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体は、抗体の糖鎖修飾の特徴を改良するアミノ酸変化、例えば、糖鎖修飾を排除又は除去する突然変異を含む抗ＥＧＦＲ抗体変異体を含んでもよい。

種選択性及び種交差反応性
本発明の特定の実施態様によれば、抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒトＥＧＦＲに結合するが、他の種からのＥＧＦＲには結合しない。また、本発明は、ヒトＥＧＦＲに結合し、かつ１つ又はそれ以上の非ヒト種からのＥＧＦＲに結合する抗ＥＧＦＲ抗体を含む。例えば、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒトＥＧＦＲに結合してもよく、かつ、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル又はチンパンジーのＥＧＦＲの１つ又はそれ以上に結合してもよいし、又は結合しなくてもよい。

免疫複合体
本発明は、サイトトキシン、化学療法薬、免疫抑制薬又は放射性同位体のような治療部分に結合した抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。細胞傷害性薬剤には、細胞に有害なあらゆる薬剤が含まれる。免疫複合体を形成するのに適した細胞傷害性薬剤及び化学療法剤の例は、当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと）。

多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、又は多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープについて特異的であってもよいし、又は１つを超える標的ポリペプチドについて特異的な抗原結合性ドメインを含んでもよい。例えば、Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244を参照のこと。本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、別の機能性分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質に結合するか、又はそれと共に共発現することができる。例えば、抗体又はそのフラグメントは、１つ又はそれ以上の他の分子単位、例えば別の抗体又は抗体フラグメントに機能的に結合して（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合又はその他によって）、第２の結合特異性を有する二重特異性又は多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームが、ヒトＥＧＦＲ又はそのフラグメントについて特異的であり、かつこの免疫グロブリンの他のアームが第２の治療標的について特異的であるか、又は治療部分に結合している二重特異性抗体を含む。

本発明の文脈で用いることができる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｃ_H３ドメイン及び第２のＩｇＣ_H３ドメインの使用を含み、ここで、第１及び第２のＩｇＣ_H３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸によって互いに異なり、そして少なくとも１つのアミノ酸の違いにより、アミノ酸の違いがない二重特異性抗体と比較してプロテインＡに対する二重特異性抗体の結合が低減される。一実施態様において、第１のＩｇＣ_H３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣ_H３ドメインは、プロテインＡ結合を低減又は消失させる突然変異、例えばＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）を含む。第２のＣ_H３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。第２のＣ_H３中に見出されうるさらなる修飾としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ及びＶ４２２Ｉ）；そしてＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上述の二重特異性抗体フォーマットにおけるバリエーションは、本発明の範囲内に企図される。

治療製剤及び投与
本発明は、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、適した担体、賦形剤及び改善された伝達、送達、耐性などをもたらす他の薬剤を用いて処方する。多くの適当な製剤は、すべての薬剤師に知られている処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PAに見出すことができる。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー、ロウ、油、脂質、ベシクルを含む脂質（カチオン性又はアニオン性）（例えばLIPOFECTIN^TM、Life Technologies, Carlsbad, CA）、ＤＮＡコンジュゲート（DNA conjugate）、無水吸収ペースト剤、水中油型及び油中水型乳剤、エマルジョンカーボワックス（emulsions carbowax）（さまざまな分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル及びカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。また、Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311を参照のこと。

患者に投与する抗体の用量は、患者の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化してもよい。好ましい用量は、典型的に体重又は体表面積により算出される。本発明の抗体を成人患者におけるＥＧＦＲ活性に関連する状態又は疾患の治療に用いる場合、本発明の抗体を、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、又は約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単一用量で静脈内に投与することは好都合でありうる。頻度及び治療期間は、状態の重症度に応じて調整することができる。抗ＥＧＦＲ抗体の投与に有効な投与量及びスケジュールは、経験的に決定してもよく、例えば、患者の経過を定期的評価によってモニターし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当技術分野で周知の方法を用いて実施することができる（例えば、Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351）。

さまざまな送達システム、例えば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現可能な組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシス（例えば、Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照のこと）が、知られており、本発明の薬学的組成物の投与に用いることができる。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。組成物は、任意の都合のよい経路によって、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜、など）を通した吸収によって投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与してもよい。投与は全身又は局所であることができる。

本発明の薬学的組成物は、標準の針及びシリンジを用いて皮下又は静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の送達における用途を容易に有する。このようなペン型送達デバイスは再使用可能又は使い捨てであることができる。再使用可能なペン型送達デバイスは、一般に、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを用いる。カートリッジ内の薬学的組成物をすべて投与してカートリッジが空になったら、空のカートリッジを直ちに捨てて、薬学的組成物を含む新たなカートリッジと交換することができる。その場合、ペン型送達デバイスは、再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジがない。つまり、使い捨てのペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバー中に保持された薬学的組成物で予め充填されている。リザーバーから薬学的組成物が空になったら、デバイス全体を廃棄する。

多くの再使用可能なペン及び自己注射器送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ほんの少し例を挙げれば、AUTOPEN^TM（Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK）、DISETRONIC^TMペン（Disetronic Medical Systems, Bergdorf, スイス）、HUMALOG MIX 75/25^TMペン、HUMALOG^TMペン、HUMALIN 70/30^TMペン（Eli
Lilly and Co., Indianapolis, IN）、NOVOPEN^TM I、II及びIII（Novo Nordisk, Copenhagen, デンマーク）、NOVOPEN JUNIOR^TM（Novo Nordisk, Copenhagen, デンマーク）、BD^TMペン（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM、及びOPTICLIK^TM（sanofi-aventis, Frankfurt, ドイツ）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てのペン型送達デバイスの例としては、ほんの少し例を挙げれば、SOLOSTAR^TMペン（sanofi-aventis）、FLEXPEN^TM（Novo Nordisk）、及びKWIKPEN^TM（Eli Lilly）、SURECLICK^TM自己注射器（Amgen, Thousand Oaks, CA）、PENLET^TM（Haselmeier, Stuttgart, ドイツ）、EPIPEN（Dey, L.P.）、及びHUMIRA^TMペン（Abbott Labs, Abbott Park IL）、が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

特定の状況では、薬学的組成物を放出制御システムで送達することができる。一実施態様では、ポンプを用いてもよい（Langer, 前出; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed.
Eng. 14:201を参照のこと）。別の実施態様では、ポリマー物質を用いることができる；Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida参照。さらに別の実施態様では、放出制御システムを組成物の標的の近くに配置することができるため、全身用量の一部分しか必要としない（例えば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138を参照のこと）。他の放出制御システムは、Langer, 1990, Science 249:1527-1533による総説に議論されている。

注射用製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含んでもよい。これらの注射用製剤は、公知の方法によって製造してもよい。例として、注射用製剤は、例えば、上記の抗体又はその塩を、注射に慣用的に用いられる滅菌水性媒体又は油性媒体中に溶解、懸濁又は乳化することによって製造してもよい。注射用の水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張性溶液、などがあり、これらを、適当な可溶化剤、例えばアルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］、などと組み合わせて用いてもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油、などが用いられ、これらを、可溶化剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール、などと組み合わせて用いてもよい。このように製造された注射剤は、適当なアンプル中に充填するのが好ましい。

上記の経口又は非経口使用のための薬学的組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量で剤形に製造することが有利である。単位用量のこのような剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含まれる前述の抗体の量は、一般に単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇであり；特に注射剤の形態では、前述の抗体を、約５〜約１００ｍｇ、他の剤形については、約１０〜約２５０ｍｇ含むことが好ましい。

抗体の治療上の使用
本発明の抗体は、とりわけ、ＥＧＦＲ発現又は活性に関連するか若しくはそれによって媒介されるか、又はＥＧＦＲとＥＧＦＲリガンド（例えば、ＥＧＦ又はＴＧＦ−α）との相互作用を遮断することによって、又はそうでなければＥＧＦＲ活性及び／又はシグナル伝達を阻害することによって、及び／又は受容体インターナリゼーションを促進することによって、及び／又は細胞表面受容体数を減少させることによって治療できる、あらゆる疾患又は障害の治療、予防及び／又は回復に有用である。例えば、本発明の抗体及び抗原結合性フラグメントは、高レベルのＥＧＦＲを発現する腫瘍の治療に有用である。本発明の抗体及び抗原結合性フラグメントは、例えば、脳及び髄膜、中咽頭、肺及び気管支樹、消化管、男性及び女性生殖器系、筋肉、骨、皮膚及び付属器、結合組織、脾臓、免疫系、造血細胞及び骨髄、肝臓及び尿路、並びに眼のような特殊な感覚器官に生じる原発性及び／又は転移性腫瘍の治療に用いてもよい。特定の実施態様では、本発明の抗体及び抗原結合性フラグメントを、以下のがん：腎細胞がん、膵がん、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん（例えば、ＭＥＴ増幅による胃がん）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（例えば、ＥＧＦＲ依存性非小細胞肺がん）、滑膜肉腫、甲状腺がん又は黒色腫の１つ又はそれ以上の治療に用いる。

併用療法及び製剤
本発明は、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を少なくとも１つのさらなる治療活性成分と併用して投与することを含む治療投与レジメンを含む。このようなさらなる治療活性成分の非限定的な例としては、他のＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、第２の抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブ又はパニツムマブ］又はＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブ又はエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４などの別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２抗体、抗ＥｒｂＢ３抗体若しくは抗ＥｒｂＢ４抗体、又はＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３若しくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１を参照のこと（本明細書においては「ＶＥＧＦ阻害性の融合タンパク質」とも称する）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ又はパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＵＳ２００９／０１４２３５４に開示される抗ＤＬＬ４抗体、例えばＲＥＧＮ４２１）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、ＵＳ２０１１／００２７２８６に開示される抗Ａｎｇ２抗体、例えばＨ１Ｈ６８５Ｐ）などが挙げられる。本発明の抗ＥＧＦＲ抗体と併用して有益に投与してもよい他の薬剤としては、小分子サイトカイン阻害剤、及びサイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８又はそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含む、サイトカイン阻害剤が挙げられる。

また、本発明は、本明細書に記載された抗ＥＧＦＲ抗体のいずれかと、１つ又はそれ以上のＶＥＧＦ、Ａｎｇ２、ＤＬＬ４、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ−ｒａｆ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、又は上記のサイトカインのいずれかの阻害剤とを含む治療的併用を含み、ここで、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ（peptibody）、ナノ抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；又は、他の改変分子、例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特性抗体、ミニ抗体及び最小限の認識ユニット）である。また、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド及び／又はＮＳＡＩＤと併用して投与及び／又は共処方（co-formulate）してもよい。また、発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、放射線治療及び／又は従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与してもよい。

さらなる治療活性成分を、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体の投与の直前に、同時に、又は直後に投与してもよい（本開示の目的では、このような投与レジメンは、さらなる治療活性成分「と併用した」抗ＥＧＦＲ抗体の投与と考えられる）。本発明は、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体が本明細書の他のところに記載の１つ又はそれ以上のさらなる治療活性成分と共処方されている薬学的組成物を含む。

本発明はまた、「分解抗体」及び「リガンド遮断抗体」の組み合わせを含む、組成物及び方法を含む。「分解抗体」は、リガンド-受容体相互作用を必ずしも遮断しなくても、細胞においてＥＧＦＲの分解を引き起こす抗ＥＧＦＲ抗体を意味する。本発明の分解抗体の非限定的な例は、Ｈ１Ｈ１３４Ｐと称する抗体である。「リガンド遮断抗体」は、ＥＧＦＲと１つ又はそれ以上のそのリガンド（例えば、ＥＧＦ又はＴＧＦ−α）との相互作用を遮断する抗ＥＧＦＲ抗体を意味する。本発明のリガンド遮断抗体の非限定的な例は、Ｈ１Ｈ１４１Ｐと称する抗体である。リガンド遮断抗体の別の例はセツキシマブである。本発明者らは、抗腫瘍効果を相乗的に又は他の方法で改善するために、分解抗体及びリガンド遮断抗体を組み合わせることを考え出した。従って、本発明は、少なくとも１つの分解抗体及び少なくとも１つのリガンド遮断抗体を含む薬学的組成物を含む。本発明はまた、（個別投与又は共製剤のいずれかとして）分解抗体及びリガンド遮断抗体の組み合わせを対象へ投与する工程を含む治療方法を含む。

抗体の診断上の使用
また、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体を、例えば、診断目的で、試料中のＥＧＦＲ又はＥＧＦＲ発現細胞の検出及び／又は測定に用いてもよい。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体又はそのフラグメントを用いてＥＧＦＲの異常発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現の欠如、など）を特徴とする状態又は疾患を診断してもよい。ＥＧＦＲの例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得た試料を、抗ＥＧＦＲ抗体が検出可能な標識又はレポーター分子で標識化された本発明の抗ＥＧＦＲ抗体と接触させることを含んでもよい。別法として、非標識抗ＥＧＦＲ抗体を、それ自体で検出可能に標識された二次抗体と併用して診断用途に用いることができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、放射性同位体、例えば³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓ若しくは¹²⁵Ｉ；蛍光若しくは化学発光部分、例えばフルオレセインイソチオシアネート若しくはローダミン；又は、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ若しくはルシフェラーゼであることができる。試料中のＥＧＦＲを検出又は測定するのに用いることができる具体的で例示的なアッセイとしては、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が挙げられる。

本発明によるＥＧＦＲ診断分析に用いることができる試料としては、正常又は病理学的条件下で、検出可能な量のＥＧＦＲタンパク質又はそのフラグメントを含む、患者から入手可能な任意の組織又は液体試料が挙げられる。一般に、健康な患者（例えば、異常なＥＧＦＲレベル又は活性に関連する疾患又は状態を患っていない患者）から得られる特定の試料中のＥＧＦＲのレベルを測定して、最初にＥＧＦＲのベースライン又は標準レベルを確立する。次いで、このＥＧＦＲのベースラインレベルを、ＥＧＦＲ関連の疾患又は状態を有することが疑われる個体から得た試料中で測定したＥＧＦＲのレベルと比較することができる。

以下の実施例は、当業者に本発明の方法及び組成物を製造及び使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために記載するが、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定しようとするものではない。使用した数（例えば、量、温度、など）に関しては、正確さを確保するように努めたが、しかし、ある程度の実験的な誤差及び偏差を考慮しなければならない。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の度であり、そして圧力は大気圧又はその近くである。

実施例１．ＥＧＦＲに対するヒト抗体の作製
ＥＧＦＲ発現細胞系を、免疫応答を刺激するアジュバントと共に、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むVELOCIMMUNE（登録商標）マウスに直接投与した。抗体免疫応答を、ＥＧＦＲ特異的免疫測定法によってモニターした。所望の免疫応答が達成されたら、脾細胞を集め、マウス骨髄腫細胞を融合させてその生存能力を維持し、ハイブリドーマ細胞系を形成した。ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択してＥＧＦＲ特異的抗体を産生する細胞系を同定した。この技術を用いて、いくつかの抗ＥＧＦＲキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常を備えた抗体）を得た。このように生成した例示的な抗体を、以下のように表わした：Ｈ１Ｍ０８５Ｎ、Ｈ１Ｍ０８６Ｎ、Ｈ１Ｍ０８９Ｎ、Ｈ１Ｍ１０２Ｎ、Ｈ１Ｍ１０３Ｎ、及びＨ１Ｍ１１６Ｎ。

また、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記述されたように、骨髄腫細胞への融合なしに、抗原陽性Ｂ細胞から抗ＥＧＦＲ抗体を直接単離した。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＥＧＦＲ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを備えた抗体）を得た。このように生成した例示的な抗体を、以下のように表わした：Ｈ１Ｈ１３４Ｐ、Ｈ１Ｈ１３６Ｐ、Ｈ１Ｈ１４１Ｐ、Ｈ１Ｈ１４２Ｐ、Ｈ１Ｈ１４３Ｐ、Ｈ１Ｈ１４４Ｐ、Ｈ１Ｈ１４５Ｐ、Ｈ１Ｈ１４７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５３Ｐ、Ｈ１Ｈ１５５Ｐ、Ｈ１Ｈ１５７Ｐ、Ｈ１Ｈ１５８Ｐ、Ｈ１Ｈ１５９Ｐ、Ｈ１Ｈ１６１Ｐ、Ｈ１Ｈ１６３Ｐ、Ｈ１Ｈ１６９Ｐ、及びＨ１Ｈ１７１Ｐ。

この実施例の方法に従って生成した例示的な抗ＥＧＦＲ抗体の特定の生物学的性質を下記の実施例で詳細に記述する。

実施例２．重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列
表１に、選択された抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列対並びにそれらの対応する抗体識別子を記載する。

抗体は、典型的に本明細書では以下の命名法にしたがって参照する：Ｆｃ接頭辞（例えば「Ｈ１Ｈ」又は「Ｈ１Ｍ」）、の後に数値的識別子（例えば、表１に示す「０８５」又は「１３４」）が続き、その後に「Ｐ」又は「Ｎ」の接尾辞が続く。したがって、この命名法によれば、本明細書において、例えば、「Ｈ１Ｍ０８５Ｎ」又は「Ｈ１Ｈ１３４Ｐ」ように抗体を参照してもよい。本明細書に用いる抗体表示におけるＨ１Ｈ及びＨ１Ｍの接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ１Ｍ」抗体がマウスＩｇＧ１Ｆｃを有するのに対して、「Ｈ１Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ１Ｆｃを有する。当業者に認められるように、Ｈ１Ｍ抗体はＨ１Ｈ抗体に変換することができ、その逆も同じであるが、任意の事象において、表１に示す数値的識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は、同じままとなる。

以下の実施例で用いる対照構築物
以下の実験には、比較のために、さまざまな対照構築物（抗ＥＧＦＲ抗体）が含まれた。対照構築物は、以下のように表わす：対照Ｉ：ＵＳ７，０６０，８０８に記載された「ｍＡｂ２２５」の重鎖及び軽鎖可変配列を有するキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；並びに対照ＩＩ：パニツムマブ又はVectibix（登録商標）としても公知の、ＡＢＸ−ＥＧＦと呼ばれる市販の完全ヒトモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体。

実施例３．表面プラズモン共鳴によって測定したヒトＥＧＦＲへの抗体結合
選択した精製抗ヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体への抗原結合についての平衡解離定数（Ｋ_D値）を、３７℃でリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＢｉａｃｏｒｅＴ１００）アッセイを使用して測定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面をモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（GE Biosciences）で誘導体化し、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃフォーマット（抗体接頭辞Ｈ１Ｈ）で表される、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を捕捉した。種々の濃度のヒト単量体（ＥＧＦＲ．ｍｍｈ；配列番号３８６）及び二量体（ＥＧＦＲ．ｍＦｃ；配列番号３８７）タンパク質を、５０μｌ／分の流量で抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体捕捉表面上に注射した。抗体−抗原結合を４〜５分間モニターし、一方、捕捉モノクローナル抗体表面からの抗原の解離を１０分間モニターした。動的結合（Ｋ_a）及び解離（Ｋ_d）速度定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０曲線適合ソフトウェアを用いて、データを処理して１：１結合モデルに適合させることによって決定した。結合解離平衡定数（Ｋ_D）及び解離半減期（ｔ 1/2）は、以下のように動的速度定数から算出した：Ｋ_D（Ｍ）＝ｋ_d／ｋ_a；及びｔ 1/2（分）＝（ｌｎ２／（６０^*ｋ_d）。異なる抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体についての動的結合パラメータを表２に示す。

表２に示されるように、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体のいくつかは、対照抗体と比較して優れた結合特性を示した。例えば、本発明のある抗ＥＧＦＲ抗体は、上述の表面プラズモン共鳴アッセイにおいて二量体ＥＧＦＲ（「ＥＧＦＲ．ｍＦｃ」）への結合について試験した場合、１０ｐＭ未満のＫ_D値及び４００分を超えるｔ 1/2値を示した；例えば、Ｈ１Ｈ０８６Ｎ（５．９８ｐＭ／１０１８分）、Ｈ１Ｈ１３４Ｐ（７．９９ｐＭ／４６８分）、Ｈ１Ｈ１４１Ｐ（８．３１ｐＭ／１５３９分）、Ｈ１Ｈ１５９Ｐ（３．４４ｐＭ／２０５９分）、Ｈ１Ｈ１６１Ｐ（１．５９ｐＭ／４１８７分）、及びＨ１Ｈ１６９Ｐ（７．３６ｐＭ／６８４分）。対照的に、同一の実験条件下で二量体ＥＧＦＲへの結合について試験した場合、対照Ｉは３０．３ｐＭのＫ_D及び１０７分のｔ 1/2を示し、対照IIは４２．３ｐＭのＫ_D及び１９８分のｔ 1/2を示した。

実施例４．抗ＥＧＦＲ抗体による細胞増殖の阻害
抗ＥＧＦＲ抗体を、インビトロでのＡ４３１類表皮癌細胞の増殖を阻害するそれらの能力について試験した。Ａ４３１細胞はＥＧＦＲ遺伝子の増幅を有し、増殖についてＥＧＦＲシグナル伝達への強い依存性を示す。Ａ４３１細胞を９６ウェルプレート中において１ウェル当たり５．０ｘ１０³細胞の密度で播種し、０．５％ＢＳＡ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを含有するＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。ＥＧＦＲ特異的ｍＡｂを、６０ｎＭで開始して１：３連続希釈で細胞へ添加した。７日後、Alamar Blue（Invitrogen）で染色し、Flexstation III分光光度計で蛍光を測定することによって、生存細胞を定量化した。吸光度値を、１２点希釈シリーズにわたって４パラメータロジスティック方程式を使用してプロットした（GraphPad Prism）。結果を表３に要約する。

表３に示されるように、試験した抗体は広範囲のＩＣ₅₀値を示し、一部の抗体は遮断活性をほとんど又は全く有さず、一方、他のものは参照対照Ｉ抗体よりも低いＩＣ₅₀値を示した。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体であるＨ１Ｈ１４１Ｐ、Ｈ１Ｈ１４３Ｐ、Ｈ１Ｈ１４４Ｐ及びＨ１Ｈ１４７Ｐは全て、２００ｐＭ未満のＩＣ₅₀値を示し、一方、対照Ｉ抗体は、３３４ｐＭを超えるＩＣ₅₀値を示した。

実施例５．抗ＥＧＦＲ抗体によるＡ４３１細胞におけるＡＤＣＣの誘導
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、ナチュラルキラー細胞上のＦｃ受容体が活性化され、標的細胞に対して細胞溶解酵素の放出を誘導する場合に生じる細胞プロセスである。インビトロでＡＤＣＣを誘導する抗ＥＧＦＲ抗体の能力を、ＥＧＦＲを内因的に過剰発現するＡ４３１標的細胞に対して、エフェクターとして末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、又は主な「キラー」細胞を使用して評価した。

簡潔には、広い濃度範囲（４０ｎＭ〜０ｎＭ；１：３希釈）にわたる抗ＥＧＦＲ抗体を、９６ウェルプレート中のＰＢＭＣ及びＡ４３１細胞（３０：１比）の細胞混合物へ添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ₂で４時間インキュベートし、１０分間室温へ平衡させ、CytoTox-Glo試薬をウェルへ添加した。対照ウェル中の未処理細胞をジギトニンの添加によって溶解させ、最大細胞溶解シグナルを決定した。プレートを室温で短時間インキュベートし、プレートリーダーを使用して各ウェルからのルミネセンスを測定した。

抗ＥＧＦＲ ｍＡｂの存在下でＰＢＭＣと混合した標的細胞から発生されたシグナルから、抗ＥＧＦＲ抗体を添加せずにＰＢＭＣと共にインキュベートしたＡ４３１細胞についてのシグナル（バックグラウンド）を引くことによって、細胞傷害反応を計算した。ジギトニンによる細胞溶解から得られた最大細胞傷害反応によってバックグラウンドに対する細胞の細胞傷害反応を割ることによって、細胞傷害性のパーセンテージを計算した。Ｓ字状用量応答曲線を有する４パラメータロジスティック方程式によって、データを解析した（GraphPad Prism）。結果を表４に要約する。（ＮＡ＝活性なし）。

表４に示されるように、いくつかの抗ＥＧＦＲ ｍＡｂは、ＰＢＭＣエフェクター細胞と共インキュベートされたＡ４３１細胞においてＡＤＣＣを誘発した。さらに、いくつかの抗ＥＧＦＲ ｍＡｂは、対照抗体（対照I）と匹敵する高い最大細胞死滅パーセンテージを示す。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体であるＨ１Ｈ０８９Ｎ、Ｈ１Ｈ１０２Ｎ、Ｈ１Ｈ１４１Ｐ、Ｈ１Ｈ１４４Ｐ、Ｈ１Ｈ１５１Ｐ、Ｈ１Ｈ１５９Ｐ及びＨ１Ｈ１６３Ｐは、各々、ＡＤＣＣアッセイにおいて４０％を超える最大細胞死滅を示し、一方、対照Ｉ抗体は、このアッセイにおいて２５％未満の最大細胞死滅を示した。

実施例６．抗ＥＧＦＲ抗体による腫瘍増殖の阻害
抗ＥＧＦＲ抗体Ｈ１Ｈ１４１Ｐを、免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害するその能力について試験した。簡潔には、２ｘ１０＾６ ＦａＤｕ頭頸部扁平上皮癌細胞を、Ｃ．Ｂ．−１７ ＳＣＩＤマウスの側腹部へ皮下移植した。腫瘍がおよそ２００ｍｍ³の平均サイズに達した後、マウスを処置のためにグループに無作為化し（１群当たりＮ＝６マウス）、ヒトＦｃ対照タンパク質（１２．５ｍｇ／ｋｇ；配列番号３８８）又はＨ１Ｈ１４１Ｐ（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを週２回皮下注射した。マウスを１５日間処置した。

腫瘍体積を実験の間週２回測定し、腫瘍重量を実験の最後の切除時に測定した。平均腫瘍増殖（処置開始から実験終了までの腫瘍体積の平均変化）及び平均腫瘍重量を各群について測定した。結果を表５に要約する。

同様の実験において、表６に要約するように、ＢｘＰＣ３膵腫瘍異種移植片の増殖に対するＨ１Ｈ１４１Ｐの効果が測定された。

同様の実験において、表７に要約するように、Ｃａｌｕ３肺腫瘍異種移植片の増殖に対するＨ１Ｈ１４１Ｐの効果が測定された。

同様の実験において、表８に要約するように、ＮＣＩ−Ｈ３５８肺腫瘍異種移植片の増殖に対するＨ１Ｈ１４１Ｐの効果が測定された。

同様の実験において、表９に要約するように、Ａ４３１類表皮癌異種移植片の増殖に対するＨ１Ｈ１４１Ｐの効果が測定された。

まとめると、これらの知見は、単剤療法としてのＨ１Ｈ１４１Ｐが、いくつかの異なる腫瘍タイプを代表する、複数のヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害することができることを示している。

本発明は、本明細書に記述した特定の実施態様によって範囲を限定されることはない。実際に、本明細書に記述したものに加えて本発明のさまざまな変更は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになる。このような変更は添付の特許請求項の範囲内に帰属するものとする。

Claims (19)

1. ３７℃で表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合に約２０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（Ｋ_D）で二量体ヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲ）に特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメント。
2. 抗体又はその抗原結合性フラグメントが、３７℃で表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定した場合に４００分を超える解離半減期（ｔ 1/2）で二量体ｈＥＧＦＲに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
3. 抗体又はその抗原結合性フラグメントが、ＥＧＦＲを発現する細胞のインビトロ増殖を阻害する、請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
4. 抗体又はその抗原結合性フラグメントが、２００ｐＭ未満のＩＣ₅₀で、ＥＧＦＲを発現する細胞のインビトロ増殖を阻害する、請求項３に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
5. 抗体又はその抗原結合性フラグメントが、３．０ｐＭ未満のＥＣ₅₀で、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の存在下にて、ＥＧＦＲ発現細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
6. 抗体又はその抗原結合性フラグメントが、配列番号１３０／１３８を有するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体とｈＥＧＦＲへの結合について競合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
7. 抗体又はその抗原結合性フラグメントが、配列番号１３０／１３８を有するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と同一のｈＥＧＦＲ上のエピトープへ結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
8. 抗体又はその抗原結合性フラグメントが、配列番号９８／１０６を有するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体とｈＥＧＦＲへの結合について競合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
9. 抗体又はその抗原結合性フラグメントが、配列番号９８／１０６を有するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列対を含む参照抗体と同一のｈＥＧＦＲ上のエピトープへ結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント。
10. ヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲ）に特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、ここで、抗体又は抗原結合性フラグメントが、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４及び３７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２及び３７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメント。
11. 抗体又は抗原結合性フラグメントが、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２及び３７０／３７８からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１０に記載の単離された抗体又は抗原結合性フラグメント。
12. 抗体又は抗原結合性フラグメントが、配列番号４−６−８−１２−１４−１６；２０−２２−２４−２８−３０−３２；３６−３８−４０−４４−４６−４８；５２−５４−５６−６０−６２−６４；６８−７０−７２−７６−７８−８０；８４−８６−８８−９２−９４−９６；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８；１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６；１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２；１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８；２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４；２２８−２３０−２３２−２３６−２３８−２４０；２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６；２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２；２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８；２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４；３０８−３１０−３１２−３１６−３１８−３２０；３２４−３２６−３２８−３３２−３３４−３３６；３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２；３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８；及び３７２−３７４−３７６−３８０−３８２−３８４からなる群よりそれぞれ選択される、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１１に記載の単離された抗体又は抗原結合性フラグメント。
13. ヒト上皮増殖因子受容体（ｈＥＧＦＲ）に特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、ここで、抗体又は抗原結合性フラグメントが、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４及び３７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）；並びに（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２及び３７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、単離された抗体又はその抗原結合性フラグメント。
14. 抗体又は抗原結合性フラグメントが、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２及び３７０／３７８からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１３に記載の単離された抗体又は抗原結合性フラグメント。
15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む、薬学的組成物。
16. 腫瘍に苦しむ対象へ請求項１５に記載の薬学的組成物を投与する工程を含む、腫瘍増殖を阻害するための方法。
17. 腫瘍が、腎腫瘍、膵腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、及び卵巣腫瘍、肺腫瘍、及び皮膚腫瘍からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 対象における腫瘍増殖を阻害又は軽減するための方法であって、方法が、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント又は請求項１５に記載の薬学的組成物、及び第２治療剤を対象へ投与する工程を含み、ここで、第２治療剤が、ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ｃＭｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、Ａｎｇ２、ＰＤＧＦＲ−α又はＰＤＧＦＲ−βに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性フラグメントである、方法。
19. 対象における腫瘍増殖を阻害又は軽減するための方法であって、方法が、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合性フラグメント又は請求項１５に記載の薬学的組成物、及び第２治療剤を対象へ投与する工程を含み、ここで、第２治療剤がＶＥＧＦアンタゴニストである、方法。