ES2816645T3 - Anticuerpos anti-EGFR y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (hEGFR), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/lCVR 5 de las SEQ ID NO: 130/138 y una región Fc de IgG1 humana.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-EGFR y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son específicos para el EGFR humano, y a métodos de uso de los mismos.

Antecedentes

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, también conocido como HER1 o ErbB1) es un miembro de la familia ErbB/HER de tirosina cinasas receptoras (RTK) de tipo 1. Otros miembros de esta familia incluyen ErbB2 (HER2 o Neu), ErbB3 (HER3) y ErbB4 (HER4). Los ligandos conocidos para el EGFR incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a). La unión de ligandos al EGFR induce la fosforilación de tirosina y la dimerización del receptor con otros miembros de la familia ErbB.

Las RTK tales como el EGFR actúan permitiendo que las células respondan a estímulos externos diversos. Sin embargo, la activación anómala y/o la sobreexpresión del EGFR se asocian al desarrollo y la progresión de varios cánceres humanos. En consecuencia, el EGFR es una diana para terapias antineoplásicas. Los fármacos aprobados que actúan sobre el EGFR incluyen inhibidores de molécula pequeña tales como el gefitinib (Iressa®) y el erlotinib (Tarceva®), y anticuerpos anti-EGFR tales como el cetuximab (Erbitux®) y el panitumumab (Vectibix®). Se mencionan anticuerpos anti-EGFR en, por ejemplo, el documento US 4.943.533, el documento US 5.844.093, el documento US 7.060.808, el documento u S 7.247.301, el documento US 7.595.378, el documento US 7.723.484 y el documento US 7.939.072. No obstante, existe la necesidad en la técnica de antagonistas del EGFR novedosos, tales como anticuerpos anti-EGFR, para el tratamiento del cáncer y otros trastornos relacionados.

El documento US 7.662.394 B2 describe anticuerpos que se unen a miembros activados de la familia erbB, TNF y IgSF de receptores, y composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos. Gajadhar et al. (Mol Cancer Res. marzo de 2012; 10(3): 428-40) describe el análisis in situ de EGFR mutantes que prevalecen en el glioblastoma multiforme y la dimerización anómala, la activación y la respuesta diferencial a la terapia dirigida anti-EGFR. El documento WO 2004/008099 A2 describe métodos para identificar tumores que responden al tratamiento con anticuerpos anti-ErbB2. El documento WO 2005/079434 A2 describe la modulación de la actividad del heterodímero del factor de crecimiento epidérmico. El documento WO 2010/108127 A1 describe anticuerpos multiespecíficos EGFR/HER3. Cai et al. (Oncogene 2008

ErbB3-p185her2/neu y los complejos de EGFR-p185her2/neu.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen al EGFR humano. Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para inhibir la señalización mediada por el EGFR y para tratar enfermedades y trastornos provocados por o relacionados con la actividad y/o la señalización del EGFR. Los anticuerpos de la invención también son útiles para inducir la muerte celular en células que expresan niveles altos de EGFR en sus superficies.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos IgG1 de longitud completa o una porción de unión a antígeno que comprenda una región Fc de IgG1 humana, y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Inmunol. 164: 1925-1933).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención comprende el par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/lCVR) de la SEQ ID NO: 130/138. También se describen en el presente documento anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden un par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/lCVR) seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362 y 370/378.

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada ^{(HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:} 8^{, 24, 40, 56, 72,} 88^{, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 y 376, o una} secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 y 384, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, también se describe en el presente documento.

El anticuerpo o porción de unión a antígeno de un anticuerpo que se describe en el presente documento puede comprender un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/ICDR3 seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368 y 376/384.

Un anticuerpo o fragmento del mismo que se describe en el presente documento puede comprender además un dominio de cadena pesada CDR1 (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que ^{consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52,} 68^{, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292,} 308, 324, 340, 356 y 372, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada ^{(HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:} 6^{, 22, 38, 54, 70,} 86^{, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 y 374, o una} secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio de cadena ligera CDR1 (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 y 380, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 y 382, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que se describen en el presente documento pueden comprender los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16 (por ejemplo, H1M085N); 20­ 22-24-28-30-32 (por ejemplo, H1M086N); 36-38-40-44-46-48 (por ejemplo, H1M089N); 52-54-56-60-62-64 (por ejemplo, H1M102N); 68-70-72-76-78-80 (por ejemplo, H1M103N); 84-86-88-92-94-96 (por ejemplo, H1M116N); 100­ 102-104-108-110-112 (por ejemplo, H1H134P); 116-118-120-124-126-128 (por ejemplo, H1H136P); 132-134-136­ 140-142-144 (por ejemplo, H1H141P); 148-150-152-156-158-160 (por ejemplo, H1H142P); 164-166-168-172-174-176 (por ejemplo, H1H143P); 180-182-184-188-190-192 (por ejemplo, H1H144P); 196-198-200-204-206-208 (por ejemplo, H1H145P); 212-214-216-220-222-224 (por ejemplo, H1H147P); 228-230-232-236-238-240 (por ejemplo, H1H151P); 244-246-248-252-254-256 (por ejemplo, H1H153P); 260-262-264-268-270-272 (por ejemplo, H1H155P); 276-278­ 280-284-286-288 (por ejemplo, H1H157P); 292-294-296-300-302-304 (por ejemplo, H1H158P); 308-310-312-316­ 318-320 (por ejemplo, H1H159P); 324-326-328-332-334-336 (por ejemplo, H1H161P); 340-342-344-348-350-352 (por ejemplo, H1H163P); 356-358-360-364-366-368 (por ejemplo, H1H169P); y 372-374-376-380-382-384 (por ejemplo, H1H171P).

En el presente documento se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al EGFR, en donde el anticuerpo o fragmento comprende los dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos dentro de secuencias de región variable de cadena pesada y ligera (HCVR/lCVR) seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362 y 370/378. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácido de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se desvelan en el presente documento. Las convenciones de ejemplo que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un término medio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.

^{273: 927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA} 86^{: 9268-9272 (1989). También hay disponibles bases} de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se describen en el presente documento vectores de expresión recombinantes que transportan los ácidos nucleicos, y células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.

En el presente documento se describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353 y 369, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.

En el presente documento también se describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201,217, 233, 249, 265, 281,297, 313, 329, 345, 361 y 377, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.

En el presente documento también se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359 y 375, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367 y 383, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.

En el presente documento también se describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende además un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51,67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355 y 371, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357 y 373, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11,27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251,267, 283, 299, 315, 331,347, 363 y 379, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365 y 381, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.

En algunos casos que se describen en el presente documento, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera codificadas por las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 1 y 9 (por ejemplo, H1M085N), 17 y 25 (por ejemplo, H1M086N), 33 y 41 (por ejemplo, H1M089N), 49 y 57 (por ejemplo, H1M102N), 65 y 73 (por ejemplo, H1M103N), 81 y 89 (por ejemplo, H1M116N), 97 y 105 (por ejemplo, H1H134P), 113 y 121 (por ejemplo, H1H136P), 129 y 137 (por ejemplo, H1H141P), 145 y 153 (por ejemplo, H1H142P), 161 y 169 (por ejemplo, H1H143P), 177 y 185 (por ejemplo, H1H144P), 193 y 201 (por ejemplo, H1H145P), 209 y 217 (por ejemplo, H1H147P), 225 y 233 (por ejemplo, H1H151P), 241 y 249 (por ejemplo, H1H153P), 257 y 265 (por ejemplo, H1H155P), 273 y 281 (por ejemplo, H1H157P), 289 y 297 (por ejemplo, H1H158P), 305 y 313 (por ejemplo, H1H159P), 321 y 329 (por ejemplo, H1H161P), 337 y 345 (por ejemplo, H1H163P), 353 y 361 (por ejemplo, H1H169P), o 369 y 377 (por ejemplo, H1H171P).

La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para retirar sitios de glucosilación indeseables, o un anticuerpo que carezca de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede hacerse modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo de la invención que se une específicamente al EGFR y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-EGFR de la invención y un segundo agente terapéutico para su uso en un método de inhibición o atenuación del crecimiento tumoral en un sujeto. El segundo agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, ErbB3, ErbB4, cMet, IGF1R, Ang2, PDGFR -a, PDGFR-p, o un antagonista de VEGF. Los agentes de ejemplo que pueden combinarse ventajosamente con un anticuerpo anti-EGFR incluyen, sin limitación, otros agentes que inhiben la actividad de EGFR (incluyendo otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhibidores peptídicos, antagonistas de molécula pequeña, etc.) y/o agentes que no se unen directamente al EGFR pero, a pesar de ello, interfieren con, bloquean o atenúan la señalización mediada por el EGFR.

En otro aspecto más, la invención proporciona la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método de inhibición del crecimiento tumoral. En el presente documento también se describen métodos para inhibir la actividad de EGFR usando un anticuerpo anti-EGFR o porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, mitigue, inhiba o prevenga mediante la supresión, inhibición o reducción de la actividad de EGFR. Los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de anticuerpos de la invención pueden actuar bloqueando la interacción entre el EGFR y un compañero de unión al EGFR (por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico [EGF], el factor de crecimiento transformante alfa [TGF-a], etc.) o inhibiendo de otro modo la actividad de señalización del EGFR.

Otras realizaciones resultarán evidentes tras la revisión de la descripción detallada adjunta.

Descripción detallada

Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a métodos ni condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

Las expresiones "EGFR" y "fragmento de EGFR", como se usan en el presente documento, se refieren a la proteína EGFR humana o a un fragmento de la misma, a menos que se especifique que procede de una especie no humana (por ejemplo, "EGFR de ratón", "fragmento de EGFR de ratón", "EGFR de mono", "fragmento de EGFR de mono", etc.). El dominio extracelular del EGFR humano tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en, por ejemplo, los aminoácidos 25 a 645 de la SEQ ID NO: 385.

Como se usa en el presente documento, "un anticuerpo que se une al EGFR" o un "anticuerpo anti-EGFR" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un fragmento soluble de una proteína EGFR (por ejemplo, una porción del dominio extracelular del EGFR) y/o al EGFR expresado sobre la superficie celular. La expresión "EGFR expresado sobre la superficie celular" significa una proteína EGFR o una porción de la misma que se expresan sobre la superficie de una célula in vitro o in vivo, de manera que al menos una porción de la proteína EGFR (por ejemplo, los aminoácidos 25 a 645 de la SEQ ID NO: 385) queda expuesta en el lado extracelular de la membrana celular y accesible a una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. Las moléculas solubles de EGFR incluyen, por ejemplo, construcciones de EGFR monomérico y dimérico como se describen en el Ejemplo 3 en el presente documento (es decir, "EGFR.mmh", SEQ ID NO: 386 y "EGFR.mFc", SEQ ID NO: 387, respectivamente) o construcciones sustancialmente similares a las mismas.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interactúa con un antígeno particular (por ejemplo, EGFR). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las FR de un anticuerpo anti-EGFR (o la porción de unión a antígeno del mismo) que se describen en el presente documento pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones de ejemplo no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo del presente documento incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) V l-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se describe en el presente documento puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).

Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable puede unirse específicamente con un antígeno distinto o con un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico de ejemplo que se desvelan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.

Los anticuerpos de la presente invención pueden actuar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, Linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la ADCC pueden medirse usando ensayos que son bien conocidos y están disponibles en la técnica. (Véanse, por ejemplo, los documentos US 5.500.362 y 5.821.337 y Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. De esta manera, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos que se describen en el presente documento pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específicas de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en donde las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como de un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios y recombinante (que se describe con más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinados casos, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de Vh y Vl de línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150­ 160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta se debe, pero sin limitación, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles normalmente observados usando una bisagra de IgG1 humana. la presente invención incluye anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, Ch2 o Ch3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o retirado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde existe de forma natural o se produce de forma natural el anticuerpo, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión al EGFR: (i) interfiere con la interacción entre el EGFR o un fragmento de EGFR y un ligando del EGFR (por ejemplo, EGF, TGF-a, etc.) y/o (ii) da como resultado la inhibición de al menos una función biológica del EGFR. La inhibición provocada por un anticuerpo neutralizador o bloqueante del EGFR no tiene por qué ser completa siempre que sea detectable usando un ensayo apropiado. En el presente documento se describen ensayos de ejemplo para detectar la inhibición del EGFR.

Los anticuerpos anti-EGFR que se desvelan en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de aminoácidos en las regiones marco conservadas y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que derivan los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se desvelan en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se desvelan en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco conservadas y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservadora del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto habitual en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera que se desvelan en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En determinados casos, todos los restos de la región marco conservada y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl mutan de vuelta a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal humana de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros casos, únicamente determinados restos mutan de vuelta a la secuencia de la línea germinal ^{original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los primeros} 8 ^{aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos} 8 ^{aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o} CDR3. En otros casos, uno o más de entre el resto o los restos de la región marco conservada y/o de la CDR están mutados al resto o los restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal diferente que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que derivó originariamente el anticuerpo). Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco conservadas y/o CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden someterse a ensayo fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), menor inmunogenicidad, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están incluidos en la presente divulgación.

La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-EGFR que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR que se desvelan en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-EGFR que tienen ^{secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos,} 8 ^{o menos,} 6 ^{o menos, 4 o} menos, etc., sustituciones conservadoras de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR que se desvelan en el presente documento.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. De esta manera, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, medida mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencias, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en donde un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que ^{tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (}1^{) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina,} valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) ^{cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (}6^{) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas} laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservadora preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 desvelada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente usando un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, supresiones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) citado anteriormente). Otro algoritmo preferente al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402.

Características biológicas de los anticuerpos

La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que unen moléculas de EGFR monomérico o dimérico con alta afinidad. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen al EGFR dimérico con una Kd inferior a aproximadamente 20 pM medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. En determinadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen al EGFR dimérico con una Kd inferior a aproximadamente 15 pM, ^{inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente} 8 ^{pM, inferior a aproximadamente} 6 ^{pM, inferior a} aproximadamente 4 pM, inferior a aproximadamente 2 pM o inferior a aproximadamente 1 pM, medida mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al EGFR dimérico con una t© superior a aproximadamente 200 minutos medida mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. En determinadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen al EGFR dimérico con una t© superior a aproximadamente 210 minutos, superior a aproximadamente 220 minutos, superior a aproximadamente 250 minutos, superior a aproximadamente 260 minutos, superior a aproximadamente 280 minutos, superior a aproximadamente 300 minutos, superior a aproximadamente 320 minutos, superior a aproximadamente 340 minutos, superior a aproximadamente 360 minutos, superior a aproximadamente 380 minutos, superior a aproximadamente 400 minutos, superior a aproximadamente 450 minutos, superior a aproximadamente 500 minutos, superior a aproximadamente 550 minutos, superior a aproximadamente 600 minutos, superior a aproximadamente 650 minutos, superior a aproximadamente 800 minutos, superior a ^{aproximadamente} 1000 ^{minutos o más, medida mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el} formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan EGFR. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan niveles altos de EGFR sobre su superficie (por ejemplo, células de carcinoma epidermoide A431), con una CI50 (es decir, la concentración que da como resultado una inhibición máxima de crecimiento del 50 %) inferior a aproximadamente 200 pM. Los valores de CI50 pueden determinarse usando el ensayo de inhibición del crecimiento celular ejemplificado en el Ejemplo 4 del presente documento o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son capaces de inhibir el crecimiento de células A431 in vitro con una CI50 inferior a aproximadamente 180 pM, inferior a aproximadamente 160 pM, inferior a aproximadamente 140 pM, inferior a aproximadamente 120 pM, inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 80 pM, inferior a aproximadamente 60 pM, inferior a aproximadamente 40 pM, inferior a aproximadamente 20 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente 5 pM o inferior a aproximadamente 2 pM, determinada usando el ensayo de inhibición del crecimiento celular ejemplificado en el Ejemplo 4 del presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inducen la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de células que expresan EGFR. Se conocen en la técnica ensayos para medir la ADCC. En el Ejemplo 5 del presente documento se ilustra un formato de ensayo de ejemplo, en el que se añaden anticuerpos anti-EGFR a una mezcla celular de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y células de carcinoma epidermoide A431 (es decir, células que expresan niveles altos de EGFR). El alcance de la destrucción celular se evalúa con respecto a la señal máxima de lisis celular observada en condiciones en las que se lisaron células sin tratar mediante adición de digitonina; la extensión de la ADCC puede expresarse, por tanto, en términos del porcentaje máximo de destrucción celular. La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR que producen un porcentaje máximo de destrucción celular superior al 25 %, cuando se sometieron a ensayo en el formato de ensayo de ADCC del Ejemplo 5 o un ensayo sustancialmente similar. En determinadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención inducen ADCC con un porcentaje máximo de destrucción celular de aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 % o más, medido en el formato de ensayo de ADCC del Ejemplo 5 o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento tumoral in vitro o in vivo. En determinadas circunstancias, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención provocan regresión o encogimiento tumoral. La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento de xenoinjertos de ^{tumores humanos en ratones inmunocomprometidos. Por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo} 6 ^{del presente} documento, el anticuerpo anti-EGFR de ejemplo H1H141P inhibió significativamente el crecimiento de células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (por ejemplo, células tumorales FaDu), células tumorales pancreáticas (BxPC3) y células tumorales de pulmón (Calu3 y NCI-H358), en modelos de xenoinjertos de ratón. La invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento de células tumorales en ratones portadores de tumores en más de aproximadamente el 50 % (por ejemplo, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % o más) en comparación con ratones portadores de tumores tratados con hFc de control.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inducen la internalización del EGFR expresado en la superficie celular.

Cartografiado de epítopos y tecnologías relacionadas

La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro del dominio extracelular del EGFR humano (por ejemplo, dentro del dominio extracelular I, II, III y/o IV). El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, ^5, 6^{, 7,} 8^{, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos ubicados dentro del dominio extracelular del} EGFR. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) ubicados dentro del dominio extracelular del EGFR.

Pueden usarse diversas técnicas conocidas para los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas de ejemplo incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248: 443-463) y análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos excepto los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2): 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.

En el presente documento se describen anticuerpos anti-EGFR que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos de ejemplo específicos que se describen en el presente documento (por ejemplo, H1M085N, H1M086N, H1M089N, H1M102N, H1M103N, H1M116N, H1H134P, H1H136P, H1H141P, H1H142P, H1H143P, H1H144P, H1H145P, H1H147P, H1H151P, H1H153P, H1H155P, H1H157P, H1H158P, H1H159P, H1H161P, H1H163P, H1H169P, H1H171P, etc.). En el presente documento también se describen anticuerpos anti-EGFR que compiten por la unión al EGFR con cualquiera de los anticuerpos específicos de ejemplo que se describen en el presente documento (por ejemplo, H1M085N, H1M086N, H1M089N, H1M102N, H1M103N, H1M116N, H1H134P, H1H136P, H1H141P, H1H142P, H1H143P, H1H144P, H1H145P, H1H147P, H1H151P, H1H153P, H1H155P, H1H157P, H1H158P, H1H159P, H1H161P, H1H163P, H1H169P, H1H171P, etc.).

Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-EGFR de referencia usando métodos de rutina conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-EGFR de referencia, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína EGFr (por ejemplo, una porción soluble del dominio extracelular de EGFR o de EGFR expresado sobre la superficie celular). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula de EGFR. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse al EGFR después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-EGFR de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-EGFR de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula de EGFR después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-EGFR de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-EGFR de referencia. Entonces puede realizarse experimentación de rutina adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. En algunos casos, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a epítopos solapantes) si, por ejemplo, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso un 99 %, medida en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990: 50: 1495-1502). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-EGFR de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína EGFR (por ejemplo, una porción soluble del dominio extracelular de EGFR o de EGFR expresado sobre la superficie celular) en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de EGFR. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de EGFR en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de EGFR. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la molécula de EGFR, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión al EGFR. Como apreciará un experto en la materia, es posible que un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia no se una necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.

Preparación de anticuerpos humanos

Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos son conocidos en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a EGFR humano.

Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra EGFR que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, entre las que se incluyen la afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana de IgG1 para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

Bioequivalentes

Los anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse a EGFR humano. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Análogamente, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-EGFR de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, supresiones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia desvelada, pero que codifican un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo de la divulgación. Anteriormente se han analizado ejemplos de dichas secuencias variantes de aminoácido y ADN.

Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la velocidad de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en donde se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en donde se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Pueden construirse variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-EGFR que se describen en el presente documento, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o suprimiendo restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden suprimirse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-EGFR que comprenden cambios de aminoácido que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.

Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie

En algunos casos, los anticuerpos anti-EGFR se unen al EGFR humano pero no al EGFR de otras especies. La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-EGFR que se unen al EGFR humano y al EGFR de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-EGFR pueden unirse al EGFR humano y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más de entre EGFR de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, ovejas, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, macaco de la India o chimpancé.

Inmunoconjugados

La invención abarca anticuerpos monoclonales anti-EGFR conjugados con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterápico, un inmunodepresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la técnica se conocen ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterápicos adecuados para formar inmunoconjugados, (véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081).

Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Inmunol. 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Los anticuerpos anti-EGFR de la presente invención pueden unirse a o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina es específico para el EGFR humano o un fragmento del mismo, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para una segunda diana terapéutica o está conjugado con un resto terapéutico.

Un formato de anticuerpo biespecífico de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente invención se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.

Formulación terapéutica y administración

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una transferencia, una entrega, una tolerancia y similares mejoradas. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.

La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del paciente, la enfermedad diana, afecciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida se calcula normalmente de acuerdo con el peso corporal o el área superficial del cuerpo. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para tratar una afección o enfermedad asociada con la actividad de EGFR en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única ^{dosis de aproximadamente} 0,01 ^{a aproximadamente} 20 ^{mg/kg de peso corporal, más preferentemente de} aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones eficaces y posologías para administrar anticuerpos anti-EGFR pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente por evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Por otra parte, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, ^{Pharmaceut. Res.} 8^{: 1351).}

Se conocen diversos sistemas de entrega y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.

262: 4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y otras vías. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la entrega subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la entrega de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable usa en general un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.

Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DlSETRONlC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofiaventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede entregarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, "Medical Applications of Controlled Release", Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Florida. En otra realización más, puede ubicarse un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana de la composición, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en "Medical Applications of Controlled Release", citado anteriormente, vol. 2, pág. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para la vía intravenosa, subcutánea, inyecciones intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros coadyuvantes, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.

Usos terapéuticos de los anticuerpos

Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado o mediado por la expresión o la actividad de EGFR, o tratable mediante el bloqueo de la interacción entre el EGFR y un ligando del EGFR (por ejemplo, EGF o TGF-a) o inhibiendo de otro modo la actividad y/o señalización del EGFR, y/o promoviendo la internalización del receptor y/o disminuyendo el número de receptores de la superficie celular. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son útiles para el tratamiento de tumores que expresan niveles altos de EGFR. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención pueden usarse parar tratar, por ejemplo, tumores primarios y/o metastásicos que surgen en el cerebro y las meninges, la orofaringe, el árbol pulmonar y bronquial, el tracto gastrointestinal, el sistema reproductor masculino y femenino, el músculo, el hueso, la piel y anejos cutáneos, el tejido conectivo, el bazo, el sistema inmunitario, las células que forman la sangre y la médula ósea, el hígado y el sistema urinario, y órganos sensoriales especiales tales como el ojo. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica de la invención que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se usa para tratar uno o más de los siguientes cánceres: carcinoma de células renales, carcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (por ejemplo, cáncer gástrico con amplificación MET), mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico dependiente de EGFR), sarcoma sinovial, cáncer de tiroides o melanoma.

Terapias y formulaciones combinadas

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser para su uso en posologías de administración terapéutica que comprenden administrar un anticuerpo anti-EGFR de la presente invención en combinación con al menos un componente terapéuticamente activo adicional. Los ejemplos no limitantes de dichos componentes activos terapéuticos adicionales incluyen otros antagonistas del EGFR (por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia EGFR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, anticuerpo anti-ErbB2, anti-ErbB3 o anti-ErbB4 o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de EGFRvIII (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvlll), un antagonista de cmET (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF1R), un inhibidor de B-raf (por ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de pDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-p (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-p), un antagonista de VEGF (por ejemplo, una trampa de VEGF, véase, por ejemplo, el documento US 7087411 (también denominado en el presente documento "proteína de fusión inhibidora de VEGF"), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib)), un antagonista de DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL4 desvelado en el documento US 2009/0142354 tal como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2 desvelado en el documento US 2011/0027286 tal como H1H685P), etc. Otros agentes que pueden administrarse de forma beneficiosa en combinación con los anticuerpos anti-EGFR de la invención incluyen inhibidores de citocina, incluyendo inhibidores de ^{citocina de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-}6^{, IL-}8^, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 o a sus receptores respectivos.

La presente invención también incluye combinaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo anti-EGFR de la invención y un inhibidor de uno o más de entre VEGF, Ang2, DLL4, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-a, PDGFR-p o cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente, en donde el inhibidor es un aptámero, una molécula antisentido, una ribozima, un ARNip, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de ^{anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')}2^{; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; u otras} moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades de reconocimiento mínimas). Los anticuerpos anti-EGFR de la invención también pueden administrarse y/o formularse conjuntamente en combinación con antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o AINE. Los anticuerpos anti-EGFR de la invención también pueden administrarse como parte de una posología de tratamiento que también incluye tratamiento con radiación y/o quimioterapia convencional.

El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse justo antes de, simultáneamente con o poco después de la administración de un anticuerpo anti-EGFR de la presente invención; (para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-EGFR "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional). La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo anti-EGFR de la presente invención se formula conjuntamente con uno o más del componente o los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.

La presente invención también incluye composiciones, opcionalmente para su uso en un método que se describe en el presente documento, que comprende una combinación de un "anticuerpo degradante" y un "anticuerpo bloqueante de ligando". Un "anticuerpo degradante" significa un anticuerpo anti-EGFR que provoca la degradación del EGFR en las células sin bloquear necesariamente las interacciones ligando-receptor. Un ejemplo de un anticuerpo degradante es el anticuerpo denominado H1H134P. Un "anticuerpo bloqueante de ligando" es un anticuerpo anti-EGFR que bloquea la interacción entre el EGFR y uno o más de sus ligandos (por ejemplo, EGF o TGF-a). Un ejemplo no limitante de un anticuerpo bloqueante de ligando de la presente invención es el anticuerpo denominado H1H141P. Otro ejemplo de un anticuerpo bloqueante de ligando es cetuximab. Los actuales inventores han concebido la combinación de un anticuerpo degradante y un anticuerpo bloqueante de ligando con el fin de mejorar sinérgicamente o de otro modo la eficacia antitumoral. En consecuencia, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo degradante y al menos un anticuerpo bloqueante de ligando. La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas para su uso en métodos terapéuticos que comprenden administrar a un sujeto una combinación de un anticuerpo degradante y un anticuerpo bloqueante de ligando de la invención (ya sea como administraciones por separado o como coformulaciones).

Usos de diagnóstico de los anticuerpos

Los anticuerpos anti-EGFR de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir EGFR, o células que expresan EGFR, en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR, o un fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de EGFR. Los ensayos diagnósticos de ejemplo para el EGFR pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-EGFR de la invención, en donde el anticuerpo anti-EGFR está marcado con una etiqueta detectable o molécula indicadora. Como alternativa, un anticuerpo anti-EGFR sin marcar puede usarse en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de manera detectable. ^{El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como} 3^H, 14^C, 32^{P, 35S o} 125^{I; un resto} fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos de ejemplo específicos que pueden usarse para detectar o medir EGFR en una muestra incluyen el ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Las muestras que pueden usarse en ensayos de diagnóstico de EGFR incluyen cualquier tejido o muestra de fluido que se puede obtener de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína EGFR o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, se medirán los niveles de EGFR en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada a niveles o actividad de EGFR anómalos) para establecer un nivel basal, o patrón, de EGFR. Este nivel basal de EGFR después puede compararse con los niveles de EGFR medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen un trastorno o afección relacionado con EGFR.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra EGFR

Se administró directamente una estirpe celular que expresaba EGFR, con un adyuvante para estimular la repuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria de anticuerpo se controló por un inmunoensayo específico de EGFR. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar estirpes celulares que producían anticuerpos específicos para EGFR. Usando esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-EGFR (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos de ejemplo generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H1M085N, H1M086N, H1M089N, H1M102N, H1M103N y H1M116N.

También se aislaron anticuerpos anti-EGFR directamente de linfocitos B positivos a antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-EGFR completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos de ejemplo generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H1H134P, H1H136P, H1H141P, H1H142P, H1H143P, H1H144P, H1H145P, H1H147P, H1H151P, H1H153P, H1H155P, H1H157P, H1H158P, H1H159P, H1H161P, H1H163P, H1H169P y H1H171P.

Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-EGFR de ejemplo generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle en los Ejemplos que se exponen a continuación.

Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera

La Tabla 1 expone las parejas de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-EGFR seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes.

Tabla 1

continuación

Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: Prefijo Fc (por ejemplo, "H1H" o "H1M"), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "085" o "134" como se muestra en la Tabla 1), seguido de un sufijo "P" o "N". De esta manera, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H1M085N" o "H1H134P", etc. Los prefijos ^{H1H y H}1^{M en las denominaciones de los anticuerpos utilizados en el presente documento indican la región Fc} particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, mientras que un anticuerpo "H1H" tiene una Fc de IgG1 humana. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo H1M puede convertirse ^{en un anticuerpo H}1^{H y viceversa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR) - que se indican} por los identificadores numéricos mostrados en la Tabla 1 - permanecerán iguales.

Construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos

Se incluyeron diversas construcciones de control (anticuerpos anti-EGFR) en los siguientes experimentos con fines comparativos. Las construcciones de control se denominan del siguiente modo:

Control I: un anticuerpo anti-EGFR quimérico con secuencias variables de cadena pesada y ligera de "mAb 225" como se expone en el documento US 7.060.808; y Control II: un anticuerpo monoclonal anti-EGFR totalmente humano disponible en el mercado denominado ABX-EGF, también conocido como Panitumumab o Vectibix®.

Ejemplo 3. Unión de anticuerpo al EGFR humano determinada mediante resonancia de plasmón superficial

Se determinaron constantes de disociación en equilibrio (valores Kd) para la unión de antígenos a anticuerpos monoclonales anti-EGFR humano purificados seleccionados usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T100) a 37 °C. La superficie del sensor Biacore se derivatizó con anticuerpo monoclonal anti-Fc humano de ratón (GE Biosciences) para capturar anticuerpos monoclonales anti-EGFR, expresado en el formato de Fc de IgG1 humana (prefijo de anticuerpo HlH). Se inyectaron diferentes concentraciones de proteínas monoméricas (EGFR.mmh; SEQ ID NO: 386) y diméricas (EGFR.mFc; SEQ ID NO: 387) humanas sobre la superficie capturada de anticuerpo monoclonal anti-EGFR a una caudal de 50 pl/min. La asociación antígenoanticuerpo se controló durante 4-5 minutos, mientras que la disociación del antígeno de la superficie del anticuerpo monoclonal capturado se controló durante 10 min. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y de disociación (kd) ^{cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión} 1:1 ^{usando el programa informático} de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd / ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd). Se muestran parámetros de unión cinética para diferentes anticuerpos monoclonales anti-EGFR en la Tabla 2.

Tabla 2: Características de unión de anticuer os anti-EGFR a EGFR monomérico dimérico

continuación

Como se muestra en la Tabla 2, varios de los anticuerpos anti-EGFR presentaron propiedades de unión superiores en comparación con los anticuerpos de control. Por ejemplo, determinados anticuerpos anti-EGFR presentaron valores de Kd inferiores a 10 pM y valores de t1^ superiores a 400 minutos, cuando se sometieron a ensayo para determinar la unión a EGFR dimérico ("EGFR.mFc") en el ensayo de resonancia de plasmón superficial descrito anteriormente; por ejemplo, H1H086N (5,98 pM/1018 min), H1H134P (7,99 pM/468 min), H1H141P (8,31 pM/1539 min), H1H159P (3,44 pM/2059 min), H1H161P (1,59 pM/4187 min) y H1H169P (7,36 pM/684 min). Por el contrario, el Control I presentó una Kd de 30,3 pM y una t1^ de 107 min y el Control II presentó una Kd de 42,3 pM y una t1^ de 198 min cuando se sometieron a ensayo para determinar la unión a EGFR dimérico en condiciones experimentales idénticas.

Ejemplo 4. Inhibición del crecimiento celular por anticuerpos anti-EGFR

Se sometieron a ensayo anticuerpos anti-EGFR para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de células de carcinoma epidermoide A431 in vivo. Las células A431 tienen una amplificación del gen de EGFR y presentan una fuerte dependencia de la señalización de EGFR para el crecimiento. Se sembraron células A431 a una densidad de ^5,0x103 ^{células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron en medio DMEM que contenía BSA al 0,5 % y} penicilina/estreptomicina/glutamina al 1 %. Se añadieron mAb específicos de EGFR a las células en diluciones en serie 1:3 comenzando a 60 nM. Después de 7 días se cuantificaron las células viables tiñendo con Alamar Blue (Invitrogen) y midiendo la fluorescencia con un espectrofotómetro Flexstation III. Los valores de absorbencia se representaron usando una ecuación logística de cuatro parámetros sobre la serie de diluciones de 12 puntos (Prisma GraphPad). Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabl - GFR

continuación

Como se muestra en la Tabla 3, los anticuerpos sometidos a ensayo presentaron un amplio intervalo de valores de CI50, algunos anticuerpos poseían poca o ninguna actividad bloqueante mientras que otros mostraron valores de CI50 más bajos que el anticuerpo de referencia Control I. Por ejemplo, los anticuerpos anti-EGFR H1H141P, H1H143P, H1H144P y H1H147P presentaron todos valores de CI50 inferiores a 200 pM, mientras que, el anticuerpo Control I presentó un valor de CI50 superior a 334 pM.

Ejemplo 5. Inducción de ADCC en células A431 por anticuerpos anti-EGFR

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) es un proceso celular que se produce cuando se activan receptores de Fc en linfocitos citolíticos naturales para inducir la liberación de enzimas de lisis celular contra las células diana. La capacidad de los anticuerpos anti-EGFR para inducir ADCC in vitro se evaluó usando células mononucleares de sangre periférica (CMSP) como efector, o linfocitos "citolíticos" primarios, contra las células diana A431 que sobreexpresan EGFR endógenamente.

Brevemente, se añadieron anticuerpos anti-EGFR en un amplio intervalo de concentraciones (40 nM - 0 nM; diluciones 1:3) a una mezcla celular de CMSP y células A431 (relación 30:1) en placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37 °C, en CO2 al 5 %, se equilibraron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se añadió reactivo CytoTox-Glo a los pocillos. Se lisaron las células no tratadas en los pocillos de control mediante la adición de digitonina para determinar la señal máxima de lisis celular. Las placas se incubaron brevemente a temperatura ambiente y se midió la luminiscencia de cada pocillo usando un lector de placas.

La respuesta citotóxica se calculó restando la señal para células A431 incubadas con CMSP sin la adición de anticuerpos anti-EGFR (fondo) de la señal generada por las células diana mezcladas con CMSP en presencia de mAb anti-EGFR. El porcentaje de citotoxicidad se calculó dividiendo la respuesta citotóxica de las células contra el fondo por la respuesta citotóxica máxima obtenida de la lisis celular a través de digitonina. Los datos se analizaron mediante una ecuación logística de cuatro parámetros con una curva dosis-respuesta sigmoidea (Prisma GraphPad). Los resultados se resumen en la Tabla 4. (SA = sin actividad).

Tabla 4: Actividad ADCC de anticuer os anti-EGFR seleccionados

Como se muestra en la Tabla 4, varios mAb anti-EGFR indujeron ADCC en células A431 incubadas conjuntamente con células efectoras CMSP. Adicionalmente, varios mAb anti-EGFR mostraron un porcentaje alto de destrucción celular máxima comparable al del anticuerpo de control (Control I). Por ejemplo, los anticuerpos anti-EGFR H1H089N, H1H102N, H1H141P, H1H144P, H1H151P, H1H159P y H1H163P presentaron cada uno más del 40 % de destrucción celular máxima en el ensayo de ADCC, mientras que el anticuerpo Control I presentó menos del 25 % de destrucción celular máxima en este ensayo.

Ejemplo 6. Inhibición del crecimiento tumoral por un anticuerpo anti-EGFR

El anticuerpo anti-EGFR H1H141P se sometió a ensayo para determinar su capacidad de inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor humano en ratones inmunocomprometidos. Brevemente, se implantaron por vía subcutánea 2 x 10A6 células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello FaDu en el flanco de ratones C.B.-17 SCID. Después de que los tumores alcanzasen un tamaño promedio de aproximadamente 200 mm3, los ratones se asignaron ^{al azar a grupos para el tratamiento (N =} 6 ^{ratones por grupo) y se les inyectó dos veces por semana por vía subcutánea} con proteína de control de Fc humana (12,5 mg/kg; SEQ ID NO: 388) o con H1H141P (10 mg/kg). Los ratones se trataron durante 15 días.

Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana durante todo el experimento y se determinaron los pesos de los tumores tras la extirpación al concluir el experimento. Se determinó para cada grupo el crecimiento tumoral promedio (el cambio promedio en el volumen tumoral desde el inicio del tratamiento hasta el final del experimento) y el peso tumoral promedio. Los resultados se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5: Inhibición del crecimiento tumoral de FaDu en ratones SCID

____ ____

En un experimento similar, se determinó el efecto de H1H141P sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor ^{pancreático BxPC3, como se resume en la Tabla} 6^.

Tabla 6: Inhibición del crecimiento tumoral de BxPC3 en ratones SCID

_{___ ___}

En un experimento similar, se determinó el efecto de H1H141P sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor de pulmón Calu3, como se resume en la Tabla 7.

Tabla 7: Inhibición del crecimiento tumoral de Calu3 en ratones SCID

____ ____

En un experimento similar, se determinó el efecto de H1H141P sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor de ^{pulmón NCI-H358, como se resume en la Tabla} 8^.

Tabla 8: Inhibición del crecimiento tumoral de NCI-H358 en ratones SCID

En un experimento similar, se determinó el efecto de H1H141P sobre el crecimiento de xenoinjertos de carcinoma epidermoide A431, como se resume en la Tabla 9.

Tabla 9: Inhibición del crecimiento tumoral de A431 en ratones SCID

En conjunto, estos hallazgos indican que H1H141P como monoterapia puede inhibir el crecimiento de múltiples xenoinjertos de tumores humanos, que representan varios tipos de tumores diferentes.

El alcance de la presente invención no debe limitarse a las realizaciones específicas que se describen en el presente documento. De hecho, a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas, diversas modificaciones de la invención, además de las que se describen en el presente documento, serán obvias para los expertos en la materia. Se pretende incluir dichas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. El alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

<120> Anticuerpos anti-EGFR y usos de los mismos

<130> 8200A-WO

<140> Por asignar

<141> Presentado en este documento

<150> 61/663.984

<151> 25-06-2012

<150> 61/821.000

<151> 08-05-2013

<160> 388

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

^<210^> 1

<211> 360

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Sintético

<400> 1

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attaattgga atagtgataa aatagcctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagaa ctccctgttt 240

ctgcaaatga atagtctgag acctgaggac acggccttgt attactgtgt aaaaaggggc 300

gatttttgga ctgagtatta tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

^<210>2

^<211^> 120

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Sintético

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val

1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly lie Asn Trp Asn Ser Asp Lys lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Lys Arg Gly Asp

100

Gly Thr Leu Val Thr

115 120

^<210^{> 3}

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

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<223> Sintético

<400> 3

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Sintético

<400> 4

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<212> ADN

<213> Secuencia artificial

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<400> 5

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<213> Secuencia artificial

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<211> 336

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

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<223> Sintético

<400> 9

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcctt catagtaatg gatacaacta tttagattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacac ctcctgatct atttggtttc tactcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgca tacaggctct acaaactccg 300 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336

^<210^> 10

^<211^> 112

<212> PRT

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<400> 10

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20 25 30

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35 40 45

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<210> 13

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<210> 14

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1

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lie Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr

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gaagtgcagt tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccaggaaagg gcctggagtg ggtctcaggt attaattgga atagtgataa gatagcctat 180 gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagaa ctccctgttt 240 ctgcaaatga atagtctgag acctgaggac acggccttgt attactgtgt aaaaaggggc 300 gatttttgga ctgattatta tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Lys Gly ArgPhe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe

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Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Val Lys Arg Gly Asp Phe Trp Thr Asp Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln

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<210> 19

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^<210^> 210

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<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Sintético

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Asn Ser Gly

20 25 30

Asp Phe Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

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Trp lie Gly His lie Tyr Tyr Ser Gly lie Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser 50 55 60

Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu LysLeu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Lys Arg Val Thr Gly Glu Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

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lie Tyr Tyr Ser Gly lie Thr

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Ala Arg Lys Arg Val Thr Gly Glu Val Asp Tyr

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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagaatcacc 60 atcacttgcc aggcgaatca ggacattaac aactatttaa attggtatca gcaaaagcca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctccgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180 agattcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tccctcccac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa acga 324

^<210^{> 218}

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^<220^>

<223> Sintético

<400> 218

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg lie Thr lie Thr Cys Gln Ala Asn Gln Asp lie Asn Asn Tyr

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50^ 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg

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tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atctcagtgg acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaaac tgagctctgt gactgtcgcg gacacggccg tatattactg tgcgagagtg 300 ggctacagta aagggtactt tgactcctgg ggccagggaa ccctggtcac tgtctcctca 360

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

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Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr Gly

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lie Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys

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Ala Lys Asp Arg lie Thr Gly Thr His Tyr Tyr Gly Met Asp Val

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gacatccaga tgacccagtc tccgtcctca ctgtctgcat ctgtcggaga cagaatcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca ggacattgcc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120 ggtaatgccc ctacgtccct gatctatgct gcatccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaccag cctgcagcca 240 gaagattttg caagttatta ctgccaacaa tataatagaa agccgtggac gttcggccga 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321

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Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg lie Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ala Asn Tyr

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Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Thr Ser Leu lie

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Tyr Ala Ala Ser lie Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

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Glu Asp

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Ala Ala Ser

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caacaatata atagaaagcc gtggacg 27

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Gln Gln Tyr Asn Arg Lys Pro Trp Thr 1 5

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 385

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60

Leu Glu lie Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr lie Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu lie Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95

Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu Gln lie lie Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu lie Leu 130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser lie Gln Trp Arg Asp lie Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335

Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser lie Asn

340 345 350

Ala Thr Asn lie Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser lie Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His lie Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp lie Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 lie Thr Gly Phe Leu Leu lie Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu lie lie Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn lie Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser 450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys lie lie Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly con cOc_{o o w} ^-J oo _c•J/hitWn

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys lie Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn lie Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575

Asp Asn Cys lie Gln Cys Ala His Tyr lie Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys lie Pro Ser lie Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655

Leu Leu Val Val Ala Leu Gly lie Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His

660 665 670

lie Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu

675 680 685

Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700

Arg lie Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys lie Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp lie Pro Glu Gly Glu 725 730 735

Lys Val Lys lie Pro Val Ala lie Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser

740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu lie Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser

755 760 765

Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly lie Cys Leu Thr Ser 770 775 780

Thr Val Gln Leu lie Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn lie Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815

Trp Cys Val Gln lie Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg

820 825 830

Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro

835 840 845

Gln His Val Lys lie Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860

Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro lie Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser lie Leu His Arg lie Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895

Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser

900 905 910

Lys Pro Tyr Asp Gly lie Pro Ala Ser Glu lie Ser Ser lie Leu Glu

915 920 925

Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro lie Cys Thr lie Asp Val Tyr 930 935 940

Met lie Met Val Lys Cys Trp Met lie Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys

945 950 955 960

Phe Arg Glu Leu lie lie Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975

Arg Tyr Leu Val lie Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro

980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp

995 1000 1005

Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu lie Pro Gln Gln Gly Phe Phe 1010 1015 1020

Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys lie Asp Arg Asn Gly Leu Gln 1045 1050 1055

Ser Cys Pro lie Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp

1060 1065 1070

Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser lie Asp Asp Thr Phe Leu Pro

1075 1080 1085

Val Pro Glu Tyr lie Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser 1090 1095 1100

Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser

1105 1110 1115 1120

Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro 1125 1130 1135

Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp

1140 1145 1150

Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln lie Ser Leu Asp

1155 1160 1165

Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn 1170 1175 1180

Gly lie Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val

1185 1190 1195 1200

Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe lie Gly Ala

1205 1210

<210> 386

^<211^{> 660}

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^<220^>

<223> Sintético

<400> 386

Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln 1 5 10 15

Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn

20 25 30

Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu lie Thr Tyr Val Gln Arg

35 40 45

Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr lie Gln Glu Val Ala Gly Tyr 50 55 60

Val Leu lie Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln lie lie Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala 85 90 95

Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro

100 105 110

Met Arg Asn Leu Gln Glu lie Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn

115 120 125

ñsn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser lie Gln Trp Arg Asp lie Val 130 135 140

Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp 165 170 175

Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala

180 185 190

Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys

195 200 205

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Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn 245 250 255

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260 265 270

Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly

275 280 285

Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys 290 295 300

Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Asp Ser Leu Ser lie Asn Ala Thr Asn lie Lys His Phe Lys 325 330 335

Asn Cys Thr Ser lie Ser Gly Asp Leu His lie Leu Pro Val Ala Phe

340 345 350

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Asp lie Leu Lys Thr Val Lys Glu lie Thr Gly Phe Leu Leu lie Gln 370 375 380

Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 385 390 395 400 lie lie Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 405 410 415

Val Ser Leu Asn lie Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie

420 425 430

Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala

435 440 445

Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr 450 455 460

Lys lie lie Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln 465 470 475 480 Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro 485 490 495

Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val

500 505 510

Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn

515 520 525

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lie Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys lie Gln Cys Ala His 545 550 555 560 Tyr lie Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met 565 570 575

Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val

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Gln Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Ser Gly His His His His His 645 650 655

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660

<210> 387

<211> 856

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 387

Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln 1 5 10 15

Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn

20 25 30

Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu lie Thr Tyr Val Gln Arg

35 40 45

Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr lie Gln Glu Val Ala Gly Tyr 50 55 60

Val Leu lie Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln lie lie Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala 85 90 95

Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro

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Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp 165 170 175

Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala

180 185 190

Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys

195 200 205

His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys 210 215 220

Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn 245 250 255

Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro

260 265 270

Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly

275 280 285

Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys 290 295 300

Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Asp Ser Leu Ser lie Asn Ala Thr Asn lie Lys His Phe Lys 325 330 335

Asn Cys Thr Ser lie Ser Gly Asp Leu His lie Leu Pro Val Ala Phe

340 345 350

Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu

355 360 365

Asp lie Leu Lys Thr Val Lys Glu lie Thr Gly Phe Leu Leu lie Gln 370 375 380

Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 385 390 395 400 lie lie Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 405 410 415

Val Ser Leu Asn lie Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie

420 425 430

Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala

435 440 445

Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr 450 455 460

Lys lie lie Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln 465 470 475 480 Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro 485 490 495

Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val

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Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn

515 520 525

Ser Glu Cys lie Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn 530 535 540

lie Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys lie Gln Cys Ala His 545 550 555 560 Tyr lie Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met 565 570 575

Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val

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Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly

595 600 605

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Lys Asp Val Leu Met lie Ser Leu Ser Pro lie Val Thr Cys Val Val

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Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln lie Ser Trp Phe Val

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Leu Pro Ala Pro lie Glu Arg Thr lie Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val

740 745 750

Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr

755 760 765

Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu 770 775 780

Asp lie Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr 785 790 795 800 Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr 805 810 815

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850 855

<210> 388

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 388

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

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65 70 75 80

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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie

100 105 110

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115 120 125

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145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220

Pro Gly Lys

225

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (hEGFR), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/lCVR de las SEQ ID NO: 130/138 y una región Fc de IgG1 humana.

2. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2 para su uso en un método de inhibición del crecimiento tumoral.

4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el tumor se selecciona entre el grupo que consiste en un tumor renal, un tumor pancreático, un tumor de cabeza y cuello, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor gástrico y un tumor ovárico, un tumor pulmonar y un tumor de piel.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2, y un segundo agente terapéutico, para su uso en un método de inhibición o atenuación del crecimiento tumoral en un sujeto, en donde el segundo agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, ErbB3, ErbB4, cMet, IGF1R, Ang2, PDGFR-a, PDGFR-p, o un antagonista de VEGF.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2, para su uso en un método de inhibición o atenuación del crecimiento tumoral en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o la composición farmacéutica y un segundo agente terapéutico, en donde el segundo agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, ErbB3, ErbB4, cMet, IGF1R, Ang2, PDGFR-a, PDGFR-p, o un antagonista de VEGF.

7. Un agente terapéutico para su uso en un método de inhibición o atenuación del crecimiento tumoral en un sujeto, en donde el agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, ErbB3, ErbB4, cMet, IGF1R, Ang2, PDGFR -a, PDGFR-p, o un antagonista de VEGF, y en donde el método comprende administrar al sujeto el agente terapéutico y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2.