ES2816645T3 - Anticuerpos anti-EGFR y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (hEGFR), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/lCVR 5 de las SEQ ID NO: 130/138 y una región Fc de IgG1 humana.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-EGFR y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son específicos para el EGFR humano, y a métodos de uso de los mismos.
Antecedentes
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, también conocido como HER1 o ErbB1) es un miembro de la familia ErbB/HER de tirosina cinasas receptoras (RTK) de tipo 1. Otros miembros de esta familia incluyen ErbB2 (HER2 o Neu), ErbB3 (HER3) y ErbB4 (HER4). Los ligandos conocidos para el EGFR incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a). La unión de ligandos al EGFR induce la fosforilación de tirosina y la dimerización del receptor con otros miembros de la familia ErbB.
Las RTK tales como el EGFR actúan permitiendo que las células respondan a estímulos externos diversos. Sin embargo, la activación anómala y/o la sobreexpresión del EGFR se asocian al desarrollo y la progresión de varios cánceres humanos. En consecuencia, el EGFR es una diana para terapias antineoplásicas. Los fármacos aprobados que actúan sobre el EGFR incluyen inhibidores de molécula pequeña tales como el gefitinib (Iressa®) y el erlotinib (Tarceva®), y anticuerpos anti-EGFR tales como el cetuximab (Erbitux®) y el panitumumab (Vectibix®). Se mencionan anticuerpos anti-EGFR en, por ejemplo, el documento US 4.943.533, el documento US 5.844.093, el documento US 7.060.808, el documento u S 7.247.301, el documento US 7.595.378, el documento US 7.723.484 y el documento US 7.939.072. No obstante, existe la necesidad en la técnica de antagonistas del EGFR novedosos, tales como anticuerpos anti-EGFR, para el tratamiento del cáncer y otros trastornos relacionados.
El documento US 7.662.394 B2 describe anticuerpos que se unen a miembros activados de la familia erbB, TNF y IgSF de receptores, y composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos. Gajadhar et al. (Mol Cancer Res. marzo de 2012; 10(3): 428-40) describe el análisis in situ de EGFR mutantes que prevalecen en el glioblastoma multiforme y la dimerización anómala, la activación y la respuesta diferencial a la terapia dirigida anti-EGFR. El documento WO 2004/008099 A2 describe métodos para identificar tumores que responden al tratamiento con anticuerpos anti-ErbB2. El documento WO 2005/079434 A2 describe la modulación de la actividad del heterodímero del factor de crecimiento epidérmico. El documento WO 2010/108127 A1 describe anticuerpos multiespecíficos EGFR/HER3. Cai et al. (Oncogene 2008
ErbB3-p185her2/neu y los complejos de EGFR-p185her2/neu.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen al EGFR humano. Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para inhibir la señalización mediada por el EGFR y para tratar enfermedades y trastornos provocados por o relacionados con la actividad y/o la señalización del EGFR. Los anticuerpos de la invención también son útiles para inducir la muerte celular en células que expresan niveles altos de EGFR en sus superficies.
Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos IgG1 de longitud completa o una porción de unión a antígeno que comprenda una región Fc de IgG1 humana, y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Inmunol. 164: 1925-1933).
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención comprende el par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/lCVR) de la SEQ ID NO: 130/138. También se describen en el presente documento anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden un par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/lCVR) seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362 y 370/378.
Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 y 376, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 y 384, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, también se describe en el presente documento.
El anticuerpo o porción de unión a antígeno de un anticuerpo que se describe en el presente documento puede comprender un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/ICDR3 seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368 y 376/384.
Un anticuerpo o fragmento del mismo que se describe en el presente documento puede comprender además un dominio de cadena pesada CDR1 (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 y 372, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 y 374, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio de cadena ligera CDR1 (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 y 380, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 y 382, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que se describen en el presente documento pueden comprender los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16 (por ejemplo, H1M085N); 20­ 22-24-28-30-32 (por ejemplo, H1M086N); 36-38-40-44-46-48 (por ejemplo, H1M089N); 52-54-56-60-62-64 (por ejemplo, H1M102N); 68-70-72-76-78-80 (por ejemplo, H1M103N); 84-86-88-92-94-96 (por ejemplo, H1M116N); 100­ 102-104-108-110-112 (por ejemplo, H1H134P); 116-118-120-124-126-128 (por ejemplo, H1H136P); 132-134-136­ 140-142-144 (por ejemplo, H1H141P); 148-150-152-156-158-160 (por ejemplo, H1H142P); 164-166-168-172-174-176 (por ejemplo, H1H143P); 180-182-184-188-190-192 (por ejemplo, H1H144P); 196-198-200-204-206-208 (por ejemplo, H1H145P); 212-214-216-220-222-224 (por ejemplo, H1H147P); 228-230-232-236-238-240 (por ejemplo, H1H151P); 244-246-248-252-254-256 (por ejemplo, H1H153P); 260-262-264-268-270-272 (por ejemplo, H1H155P); 276-278­ 280-284-286-288 (por ejemplo, H1H157P); 292-294-296-300-302-304 (por ejemplo, H1H158P); 308-310-312-316­ 318-320 (por ejemplo, H1H159P); 324-326-328-332-334-336 (por ejemplo, H1H161P); 340-342-344-348-350-352 (por ejemplo, H1H163P); 356-358-360-364-366-368 (por ejemplo, H1H169P); y 372-374-376-380-382-384 (por ejemplo, H1H171P).
En el presente documento se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al EGFR, en donde el anticuerpo o fragmento comprende los dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos dentro de secuencias de región variable de cadena pesada y ligera (HCVR/lCVR) seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362 y 370/378. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácido de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se desvelan en el presente documento. Las convenciones de ejemplo que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un término medio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.
273: 927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
En el presente documento se describen moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se describen en el presente documento vectores de expresión recombinantes que transportan los ácidos nucleicos, y células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.
En el presente documento se describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353 y 369, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201,217, 233, 249, 265, 281,297, 313, 329, 345, 361 y 377, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359 y 375, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367 y 383, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende además un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51,67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355 y 371, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357 y 373, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11,27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251,267, 283, 299, 315, 331,347, 363 y 379, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365 y 381, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
En algunos casos que se describen en el presente documento, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende las secuencias de CDR de cadena pesada y ligera codificadas por las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 1 y 9 (por ejemplo, H1M085N), 17 y 25 (por ejemplo, H1M086N), 33 y 41 (por ejemplo, H1M089N), 49 y 57 (por ejemplo, H1M102N), 65 y 73 (por ejemplo, H1M103N), 81 y 89 (por ejemplo, H1M116N), 97 y 105 (por ejemplo, H1H134P), 113 y 121 (por ejemplo, H1H136P), 129 y 137 (por ejemplo, H1H141P), 145 y 153 (por ejemplo, H1H142P), 161 y 169 (por ejemplo, H1H143P), 177 y 185 (por ejemplo, H1H144P), 193 y 201 (por ejemplo, H1H145P), 209 y 217 (por ejemplo, H1H147P), 225 y 233 (por ejemplo, H1H151P), 241 y 249 (por ejemplo, H1H153P), 257 y 265 (por ejemplo, H1H155P), 273 y 281 (por ejemplo, H1H157P), 289 y 297 (por ejemplo, H1H158P), 305 y 313 (por ejemplo, H1H159P), 321 y 329 (por ejemplo, H1H161P), 337 y 345 (por ejemplo, H1H163P), 353 y 361 (por ejemplo, H1H169P), o 369 y 377 (por ejemplo, H1H171P).
La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para retirar sitios de glucosilación indeseables, o un anticuerpo que carezca de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede hacerse modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo de la invención que se une específicamente al EGFR y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-EGFR de la invención y un segundo agente terapéutico para su uso en un método de inhibición o atenuación del crecimiento tumoral en un sujeto. El segundo agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, ErbB3, ErbB4, cMet, IGF1R, Ang2, PDGFR -a, PDGFR-p, o un antagonista de VEGF. Los agentes de ejemplo que pueden combinarse ventajosamente con un anticuerpo anti-EGFR incluyen, sin limitación, otros agentes que inhiben la actividad de EGFR (incluyendo otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhibidores peptídicos, antagonistas de molécula pequeña, etc.) y/o agentes que no se unen directamente al EGFR pero, a pesar de ello, interfieren con, bloquean o atenúan la señalización mediada por el EGFR.
En otro aspecto más, la invención proporciona la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método de inhibición del crecimiento tumoral. En el presente documento también se describen métodos para inhibir la actividad de EGFR usando un anticuerpo anti-EGFR o porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, mitigue, inhiba o prevenga mediante la supresión, inhibición o reducción de la actividad de EGFR. Los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de anticuerpos de la invención pueden actuar bloqueando la interacción entre el EGFR y un compañero de unión al EGFR (por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico [EGF], el factor de crecimiento transformante alfa [TGF-a], etc.) o inhibiendo de otro modo la actividad de señalización del EGFR.
Otras realizaciones resultarán evidentes tras la revisión de la descripción detallada adjunta.
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a métodos ni condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
Definiciones
Las expresiones "EGFR" y "fragmento de EGFR", como se usan en el presente documento, se refieren a la proteína EGFR humana o a un fragmento de la misma, a menos que se especifique que procede de una especie no humana (por ejemplo, "EGFR de ratón", "fragmento de EGFR de ratón", "EGFR de mono", "fragmento de EGFR de mono", etc.). El dominio extracelular del EGFR humano tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en, por ejemplo, los aminoácidos 25 a 645 de la SEQ ID NO: 385.
Como se usa en el presente documento, "un anticuerpo que se une al EGFR" o un "anticuerpo anti-EGFR" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un fragmento soluble de una proteína EGFR (por ejemplo, una porción del dominio extracelular del EGFR) y/o al EGFR expresado sobre la superficie celular. La expresión "EGFR expresado sobre la superficie celular" significa una proteína EGFR o una porción de la misma que se expresan sobre la superficie de una célula in vitro o in vivo, de manera que al menos una porción de la proteína EGFR (por ejemplo, los aminoácidos 25 a 645 de la SEQ ID NO: 385) queda expuesta en el lado extracelular de la membrana celular y accesible a una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. Las moléculas solubles de EGFR incluyen, por ejemplo, construcciones de EGFR monomérico y dimérico como se describen en el Ejemplo 3 en el presente documento (es decir, "EGFR.mmh", SEQ ID NO: 386 y "EGFR.mFc", SEQ ID NO: 387, respectivamente) o construcciones sustancialmente similares a las mismas.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interactúa con un antígeno particular (por ejemplo, EGFR). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las FR de un anticuerpo anti-EGFR (o la porción de unión a antígeno del mismo) que se describen en el presente documento pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones de ejemplo no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo del presente documento incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) V l-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se describe en el presente documento puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable puede unirse específicamente con un antígeno distinto o con un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico de ejemplo que se desvelan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
Los anticuerpos de la presente invención pueden actuar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, Linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la ADCC pueden medirse usando ensayos que son bien conocidos y están disponibles en la técnica. (Véanse, por ejemplo, los documentos US 5.500.362 y 5.821.337 y Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. De esta manera, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos que se describen en el presente documento pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específicas de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en donde las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como de un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios y recombinante (que se describe con más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinados casos, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de Vh y Vl de línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150­ 160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta se debe, pero sin limitación, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles normalmente observados usando una bisagra de IgG1 humana. la presente invención incluye anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, Ch2 o Ch3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o retirado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde existe de forma natural o se produce de forma natural el anticuerpo, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.
Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión al EGFR: (i) interfiere con la interacción entre el EGFR o un fragmento de EGFR y un ligando del EGFR (por ejemplo, EGF, TGF-a, etc.) y/o (ii) da como resultado la inhibición de al menos una función biológica del EGFR. La inhibición provocada por un anticuerpo neutralizador o bloqueante del EGFR no tiene por qué ser completa siempre que sea detectable usando un ensayo apropiado. En el presente documento se describen ensayos de ejemplo para detectar la inhibición del EGFR.
Los anticuerpos anti-EGFR que se desvelan en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de aminoácidos en las regiones marco conservadas y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que derivan los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se desvelan en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se desvelan en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco conservadas y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservadora del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto habitual en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera que se desvelan en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En determinados casos, todos los restos de la región marco conservada y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl mutan de vuelta a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal humana de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros casos, únicamente determinados restos mutan de vuelta a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros casos, uno o más de entre el resto o los restos de la región marco conservada y/o de la CDR están mutados al resto o los restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal diferente que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que derivó originariamente el anticuerpo). Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco conservadas y/o CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden someterse a ensayo fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), menor inmunogenicidad, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están incluidos en la presente divulgación.
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-EGFR que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR que se desvelan en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-EGFR que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservadoras de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR que se desvelan en el presente documento.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. De esta manera, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, medida mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencias, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en donde un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservadora preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 desvelada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente usando un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, supresiones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) citado anteriormente). Otro algoritmo preferente al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402.
Características biológicas de los anticuerpos
La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que unen moléculas de EGFR monomérico o dimérico con alta afinidad. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen al EGFR dimérico con una Kd inferior a aproximadamente 20 pM medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. En determinadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen al EGFR dimérico con una Kd inferior a aproximadamente 15 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente 8 pM, inferior a aproximadamente 6 pM, inferior a aproximadamente 4 pM, inferior a aproximadamente 2 pM o inferior a aproximadamente 1 pM, medida mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al EGFR dimérico con una t© superior a aproximadamente 200 minutos medida mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. En determinadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen al EGFR dimérico con una t© superior a aproximadamente 210 minutos, superior a aproximadamente 220 minutos, superior a aproximadamente 250 minutos, superior a aproximadamente 260 minutos, superior a aproximadamente 280 minutos, superior a aproximadamente 300 minutos, superior a aproximadamente 320 minutos, superior a aproximadamente 340 minutos, superior a aproximadamente 360 minutos, superior a aproximadamente 380 minutos, superior a aproximadamente 400 minutos, superior a aproximadamente 450 minutos, superior a aproximadamente 500 minutos, superior a aproximadamente 550 minutos, superior a aproximadamente 600 minutos, superior a aproximadamente 650 minutos, superior a aproximadamente 800 minutos, superior a aproximadamente 1000 minutos o más, medida mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan EGFR. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento de células tumorales que expresan niveles altos de EGFR sobre su superficie (por ejemplo, células de carcinoma epidermoide A431), con una CI50 (es decir, la concentración que da como resultado una inhibición máxima de crecimiento del 50 %) inferior a aproximadamente 200 pM. Los valores de CI50 pueden determinarse usando el ensayo de inhibición del crecimiento celular ejemplificado en el Ejemplo 4 del presente documento o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son capaces de inhibir el crecimiento de células A431 in vitro con una CI50 inferior a aproximadamente 180 pM, inferior a aproximadamente 160 pM, inferior a aproximadamente 140 pM, inferior a aproximadamente 120 pM, inferior a aproximadamente 100 pM, inferior a aproximadamente 80 pM, inferior a aproximadamente 60 pM, inferior a aproximadamente 40 pM, inferior a aproximadamente 20 pM, inferior a aproximadamente 10 pM, inferior a aproximadamente 5 pM o inferior a aproximadamente 2 pM, determinada usando el ensayo de inhibición del crecimiento celular ejemplificado en el Ejemplo 4 del presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inducen la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de células que expresan EGFR. Se conocen en la técnica ensayos para medir la ADCC. En el Ejemplo 5 del presente documento se ilustra un formato de ensayo de ejemplo, en el que se añaden anticuerpos anti-EGFR a una mezcla celular de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y células de carcinoma epidermoide A431 (es decir, células que expresan niveles altos de EGFR). El alcance de la destrucción celular se evalúa con respecto a la señal máxima de lisis celular observada en condiciones en las que se lisaron células sin tratar mediante adición de digitonina; la extensión de la ADCC puede expresarse, por tanto, en términos del porcentaje máximo de destrucción celular. La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR que producen un porcentaje máximo de destrucción celular superior al 25 %, cuando se sometieron a ensayo en el formato de ensayo de ADCC del Ejemplo 5 o un ensayo sustancialmente similar. En determinadas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención inducen ADCC con un porcentaje máximo de destrucción celular de aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 % o más, medido en el formato de ensayo de ADCC del Ejemplo 5 o un ensayo sustancialmente similar.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento tumoral in vitro o in vivo. En determinadas circunstancias, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención provocan regresión o encogimiento tumoral. La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento de xenoinjertos de tumores humanos en ratones inmunocomprometidos. Por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo 6 del presente documento, el anticuerpo anti-EGFR de ejemplo H1H141P inhibió significativamente el crecimiento de células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (por ejemplo, células tumorales FaDu), células tumorales pancreáticas (BxPC3) y células tumorales de pulmón (Calu3 y NCI-H358), en modelos de xenoinjertos de ratón. La invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el crecimiento de células tumorales en ratones portadores de tumores en más de aproximadamente el 50 % (por ejemplo, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % o más) en comparación con ratones portadores de tumores tratados con hFc de control.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inducen la internalización del EGFR expresado en la superficie celular.
Cartografiado de epítopos y tecnologías relacionadas
La presente invención incluye anticuerpos anti-EGFR que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro del dominio extracelular del EGFR humano (por ejemplo, dentro del dominio extracelular I, II, III y/o IV). El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos ubicados dentro del dominio extracelular del EGFR. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) ubicados dentro del dominio extracelular del EGFR.
Pueden usarse diversas técnicas conocidas para los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas de ejemplo incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248: 443-463) y análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos excepto los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2): 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.
En el presente documento se describen anticuerpos anti-EGFR que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos de ejemplo específicos que se describen en el presente documento (por ejemplo, H1M085N, H1M086N, H1M089N, H1M102N, H1M103N, H1M116N, H1H134P, H1H136P, H1H141P, H1H142P, H1H143P, H1H144P, H1H145P, H1H147P, H1H151P, H1H153P, H1H155P, H1H157P, H1H158P, H1H159P, H1H161P, H1H163P, H1H169P, H1H171P, etc.). En el presente documento también se describen anticuerpos anti-EGFR que compiten por la unión al EGFR con cualquiera de los anticuerpos específicos de ejemplo que se describen en el presente documento (por ejemplo, H1M085N, H1M086N, H1M089N, H1M102N, H1M103N, H1M116N, H1H134P, H1H136P, H1H141P, H1H142P, H1H143P, H1H144P, H1H145P, H1H147P, H1H151P, H1H153P, H1H155P, H1H157P, H1H158P, H1H159P, H1H161P, H1H163P, H1H169P, H1H171P, etc.).
Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-EGFR de referencia usando métodos de rutina conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-EGFR de referencia, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína EGFr (por ejemplo, una porción soluble del dominio extracelular de EGFR o de EGFR expresado sobre la superficie celular). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula de EGFR. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse al EGFR después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-EGFR de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-EGFR de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula de EGFR después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-EGFR de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-EGFR de referencia. Entonces puede realizarse experimentación de rutina adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. En algunos casos, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a epítopos solapantes) si, por ejemplo, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso un 99 %, medida en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990: 50: 1495-1502). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-EGFR de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína EGFR (por ejemplo, una porción soluble del dominio extracelular de EGFR o de EGFR expresado sobre la superficie celular) en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de EGFR. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de EGFR en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de EGFR. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la molécula de EGFR, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión al EGFR. Como apreciará un experto en la materia, es posible que un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia no se una necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos son conocidos en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a EGFR humano.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra EGFR que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, entre las que se incluyen la afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana de IgG1 para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-EGFR y fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse a EGFR humano. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Análogamente, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-EGFR de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, supresiones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia desvelada, pero que codifican un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo de la divulgación. Anteriormente se han analizado ejemplos de dichas secuencias variantes de aminoácido y ADN.
Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la velocidad de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en donde se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en donde se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Pueden construirse variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-EGFR que se describen en el presente documento, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o suprimiendo restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden suprimirse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-EGFR que comprenden cambios de aminoácido que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.
Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie
En algunos casos, los anticuerpos anti-EGFR se unen al EGFR humano pero no al EGFR de otras especies. La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-EGFR que se unen al EGFR humano y al EGFR de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-EGFR pueden unirse al EGFR humano y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más de entre EGFR de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, ovejas, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, macaco de la India o chimpancé.
Inmunoconjugados
La invención abarca anticuerpos monoclonales anti-EGFR conjugados con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterápico, un inmunodepresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la técnica se conocen ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterápicos adecuados para formar inmunoconjugados, (véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081).
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Inmunol. 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Los anticuerpos anti-EGFR de la presente invención pueden unirse a o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina es específico para el EGFR humano o un fragmento del mismo, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para una segunda diana terapéutica o está conjugado con un resto terapéutico.
Un formato de anticuerpo biespecífico de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente invención se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Formulación terapéutica y administración
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-EGFR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una transferencia, una entrega, una tolerancia y similares mejoradas. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del paciente, la enfermedad diana, afecciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida se calcula normalmente de acuerdo con el peso corporal o el área superficial del cuerpo. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para tratar una afección o enfermedad asociada con la actividad de EGFR en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones eficaces y posologías para administrar anticuerpos anti-EGFR pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente por evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Por otra parte, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8: 1351).
Se conocen diversos sistemas de entrega y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem.
262: 4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y otras vías. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la entrega subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la entrega de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable usa en general un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.
Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DlSETRONlC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofiaventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede entregarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, "Medical Applications of Controlled Release", Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Florida. En otra realización más, puede ubicarse un sistema de liberación controlada en las proximidades de la diana de la composición, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en "Medical Applications of Controlled Release", citado anteriormente, vol. 2, pág. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para la vía intravenosa, subcutánea, inyecciones intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros coadyuvantes, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla apropiada.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado o mediado por la expresión o la actividad de EGFR, o tratable mediante el bloqueo de la interacción entre el EGFR y un ligando del EGFR (por ejemplo, EGF o TGF-a) o inhibiendo de otro modo la actividad y/o señalización del EGFR, y/o promoviendo la internalización del receptor y/o disminuyendo el número de receptores de la superficie celular. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son útiles para el tratamiento de tumores que expresan niveles altos de EGFR. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención pueden usarse parar tratar, por ejemplo, tumores primarios y/o metastásicos que surgen en el cerebro y las meninges, la orofaringe, el árbol pulmonar y bronquial, el tracto gastrointestinal, el sistema reproductor masculino y femenino, el músculo, el hueso, la piel y anejos cutáneos, el tejido conectivo, el bazo, el sistema inmunitario, las células que forman la sangre y la médula ósea, el hígado y el sistema urinario, y órganos sensoriales especiales tales como el ojo. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica de la invención que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención se usa para tratar uno o más de los siguientes cánceres: carcinoma de células renales, carcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (por ejemplo, cáncer gástrico con amplificación MET), mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico (por ejemplo, cáncer de pulmón no microcítico dependiente de EGFR), sarcoma sinovial, cáncer de tiroides o melanoma.
Terapias y formulaciones combinadas
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser para su uso en posologías de administración terapéutica que comprenden administrar un anticuerpo anti-EGFR de la presente invención en combinación con al menos un componente terapéuticamente activo adicional. Los ejemplos no limitantes de dichos componentes activos terapéuticos adicionales incluyen otros antagonistas del EGFR (por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia EGFR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, anticuerpo anti-ErbB2, anti-ErbB3 o anti-ErbB4 o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de EGFRvIII (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvlll), un antagonista de cmET (por ejemplo, un anticuerpo anti-CMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF1R), un inhibidor de B-raf (por ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de pDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-p (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-p), un antagonista de VEGF (por ejemplo, una trampa de VEGF, véase, por ejemplo, el documento US 7087411 (también denominado en el presente documento "proteína de fusión inhibidora de VEGF"), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib)), un antagonista de DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL4 desvelado en el documento US 2009/0142354 tal como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2 desvelado en el documento US 2011/0027286 tal como H1H685P), etc. Otros agentes que pueden administrarse de forma beneficiosa en combinación con los anticuerpos anti-EGFR de la invención incluyen inhibidores de citocina, incluyendo inhibidores de citocina de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 o a sus receptores respectivos.
La presente invención también incluye combinaciones terapéuticas que comprenden un anticuerpo anti-EGFR de la invención y un inhibidor de uno o más de entre VEGF, Ang2, DLL4, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-a, PDGFR-p o cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente, en donde el inhibidor es un aptámero, una molécula antisentido, una ribozima, un ARNip, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')2; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; u otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades de reconocimiento mínimas). Los anticuerpos anti-EGFR de la invención también pueden administrarse y/o formularse conjuntamente en combinación con antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o AINE. Los anticuerpos anti-EGFR de la invención también pueden administrarse como parte de una posología de tratamiento que también incluye tratamiento con radiación y/o quimioterapia convencional.
El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse justo antes de, simultáneamente con o poco después de la administración de un anticuerpo anti-EGFR de la presente invención; (para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-EGFR "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional). La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo anti-EGFR de la presente invención se formula conjuntamente con uno o más del componente o los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.
La presente invención también incluye composiciones, opcionalmente para su uso en un método que se describe en el presente documento, que comprende una combinación de un "anticuerpo degradante" y un "anticuerpo bloqueante de ligando". Un "anticuerpo degradante" significa un anticuerpo anti-EGFR que provoca la degradación del EGFR en las células sin bloquear necesariamente las interacciones ligando-receptor. Un ejemplo de un anticuerpo degradante es el anticuerpo denominado H1H134P. Un "anticuerpo bloqueante de ligando" es un anticuerpo anti-EGFR que bloquea la interacción entre el EGFR y uno o más de sus ligandos (por ejemplo, EGF o TGF-a). Un ejemplo no limitante de un anticuerpo bloqueante de ligando de la presente invención es el anticuerpo denominado H1H141P. Otro ejemplo de un anticuerpo bloqueante de ligando es cetuximab. Los actuales inventores han concebido la combinación de un anticuerpo degradante y un anticuerpo bloqueante de ligando con el fin de mejorar sinérgicamente o de otro modo la eficacia antitumoral. En consecuencia, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo degradante y al menos un anticuerpo bloqueante de ligando. La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas para su uso en métodos terapéuticos que comprenden administrar a un sujeto una combinación de un anticuerpo degradante y un anticuerpo bloqueante de ligando de la invención (ya sea como administraciones por separado o como coformulaciones).
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-EGFR de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir EGFR, o células que expresan EGFR, en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR, o un fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de EGFR. Los ensayos diagnósticos de ejemplo para el EGFR pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-EGFR de la invención, en donde el anticuerpo anti-EGFR está marcado con una etiqueta detectable o molécula indicadora. Como alternativa, un anticuerpo anti-EGFR sin marcar puede usarse en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de manera detectable. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos de ejemplo específicos que pueden usarse para detectar o medir EGFR en una muestra incluyen el ensayo de inmunosorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Las muestras que pueden usarse en ensayos de diagnóstico de EGFR incluyen cualquier tejido o muestra de fluido que se puede obtener de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína EGFR o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, se medirán los niveles de EGFR en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada a niveles o actividad de EGFR anómalos) para establecer un nivel basal, o patrón, de EGFR. Este nivel basal de EGFR después puede compararse con los niveles de EGFR medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen un trastorno o afección relacionado con EGFR.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra EGFR
Se administró directamente una estirpe celular que expresaba EGFR, con un adyuvante para estimular la repuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria de anticuerpo se controló por un inmunoensayo específico de EGFR. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar estirpes celulares que producían anticuerpos específicos para EGFR. Usando esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-EGFR (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos de ejemplo generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H1M085N, H1M086N, H1M089N, H1M102N, H1M103N y H1M116N.
También se aislaron anticuerpos anti-EGFR directamente de linfocitos B positivos a antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-EGFR completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos de ejemplo generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H1H134P, H1H136P, H1H141P, H1H142P, H1H143P, H1H144P, H1H145P, H1H147P, H1H151P, H1H153P, H1H155P, H1H157P, H1H158P, H1H159P, H1H161P, H1H163P, H1H169P y H1H171P.
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-EGFR de ejemplo generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle en los Ejemplos que se exponen a continuación.
Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera
La Tabla 1 expone las parejas de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-EGFR seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes.
Tabla 1
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continuación
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Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: Prefijo Fc (por ejemplo, "H1H" o "H1M"), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "085" o "134" como se muestra en la Tabla 1), seguido de un sufijo "P" o "N". De esta manera, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H1M085N" o "H1H134P", etc. Los prefijos H1H y H1M en las denominaciones de los anticuerpos utilizados en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, mientras que un anticuerpo "H1H" tiene una Fc de IgG1 humana. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo H1M puede convertirse en un anticuerpo H1H y viceversa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR) - que se indican por los identificadores numéricos mostrados en la Tabla 1 - permanecerán iguales.
Construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos
Se incluyeron diversas construcciones de control (anticuerpos anti-EGFR) en los siguientes experimentos con fines comparativos. Las construcciones de control se denominan del siguiente modo:
Control I: un anticuerpo anti-EGFR quimérico con secuencias variables de cadena pesada y ligera de "mAb 225" como se expone en el documento US 7.060.808; y Control II: un anticuerpo monoclonal anti-EGFR totalmente humano disponible en el mercado denominado ABX-EGF, también conocido como Panitumumab o Vectibix®.
Ejemplo 3. Unión de anticuerpo al EGFR humano determinada mediante resonancia de plasmón superficial
Se determinaron constantes de disociación en equilibrio (valores Kd) para la unión de antígenos a anticuerpos monoclonales anti-EGFR humano purificados seleccionados usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T100) a 37 °C. La superficie del sensor Biacore se derivatizó con anticuerpo monoclonal anti-Fc humano de ratón (GE Biosciences) para capturar anticuerpos monoclonales anti-EGFR, expresado en el formato de Fc de IgG1 humana (prefijo de anticuerpo HlH). Se inyectaron diferentes concentraciones de proteínas monoméricas (EGFR.mmh; SEQ ID NO: 386) y diméricas (EGFR.mFc; SEQ ID NO: 387) humanas sobre la superficie capturada de anticuerpo monoclonal anti-EGFR a una caudal de 50 pl/min. La asociación antígenoanticuerpo se controló durante 4-5 minutos, mientras que la disociación del antígeno de la superficie del anticuerpo monoclonal capturado se controló durante 10 min. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y de disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (t1/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd / ka; y t1/2 (min) = (In2/(60*kd). Se muestran parámetros de unión cinética para diferentes anticuerpos monoclonales anti-EGFR en la Tabla 2.
Tabla 2: Características de unión de anticuer os anti-EGFR a EGFR monomérico dimérico
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continuación
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Como se muestra en la Tabla 2, varios de los anticuerpos anti-EGFR presentaron propiedades de unión superiores en comparación con los anticuerpos de control. Por ejemplo, determinados anticuerpos anti-EGFR presentaron valores de Kd inferiores a 10 pM y valores de t1^ superiores a 400 minutos, cuando se sometieron a ensayo para determinar la unión a EGFR dimérico ("EGFR.mFc") en el ensayo de resonancia de plasmón superficial descrito anteriormente; por ejemplo, H1H086N (5,98 pM/1018 min), H1H134P (7,99 pM/468 min), H1H141P (8,31 pM/1539 min), H1H159P (3,44 pM/2059 min), H1H161P (1,59 pM/4187 min) y H1H169P (7,36 pM/684 min). Por el contrario, el Control I presentó una Kd de 30,3 pM y una t1^ de 107 min y el Control II presentó una Kd de 42,3 pM y una t1^ de 198 min cuando se sometieron a ensayo para determinar la unión a EGFR dimérico en condiciones experimentales idénticas.
Ejemplo 4. Inhibición del crecimiento celular por anticuerpos anti-EGFR
Se sometieron a ensayo anticuerpos anti-EGFR para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de células de carcinoma epidermoide A431 in vivo. Las células A431 tienen una amplificación del gen de EGFR y presentan una fuerte dependencia de la señalización de EGFR para el crecimiento. Se sembraron células A431 a una densidad de 5,0x103 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron en medio DMEM que contenía BSA al 0,5 % y penicilina/estreptomicina/glutamina al 1 %. Se añadieron mAb específicos de EGFR a las células en diluciones en serie 1:3 comenzando a 60 nM. Después de 7 días se cuantificaron las células viables tiñendo con Alamar Blue (Invitrogen) y midiendo la fluorescencia con un espectrofotómetro Flexstation III. Los valores de absorbencia se representaron usando una ecuación logística de cuatro parámetros sobre la serie de diluciones de 12 puntos (Prisma GraphPad). Los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabl - GFR
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continuación
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Como se muestra en la Tabla 3, los anticuerpos sometidos a ensayo presentaron un amplio intervalo de valores de CI50, algunos anticuerpos poseían poca o ninguna actividad bloqueante mientras que otros mostraron valores de CI50 más bajos que el anticuerpo de referencia Control I. Por ejemplo, los anticuerpos anti-EGFR H1H141P, H1H143P, H1H144P y H1H147P presentaron todos valores de CI50 inferiores a 200 pM, mientras que, el anticuerpo Control I presentó un valor de CI50 superior a 334 pM.
Ejemplo 5. Inducción de ADCC en células A431 por anticuerpos anti-EGFR
La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) es un proceso celular que se produce cuando se activan receptores de Fc en linfocitos citolíticos naturales para inducir la liberación de enzimas de lisis celular contra las células diana. La capacidad de los anticuerpos anti-EGFR para inducir ADCC in vitro se evaluó usando células mononucleares de sangre periférica (CMSP) como efector, o linfocitos "citolíticos" primarios, contra las células diana A431 que sobreexpresan EGFR endógenamente.
Brevemente, se añadieron anticuerpos anti-EGFR en un amplio intervalo de concentraciones (40 nM - 0 nM; diluciones 1:3) a una mezcla celular de CMSP y células A431 (relación 30:1) en placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37 °C, en CO2 al 5 %, se equilibraron a temperatura ambiente durante 10 minutos y se añadió reactivo CytoTox-Glo a los pocillos. Se lisaron las células no tratadas en los pocillos de control mediante la adición de digitonina para determinar la señal máxima de lisis celular. Las placas se incubaron brevemente a temperatura ambiente y se midió la luminiscencia de cada pocillo usando un lector de placas.
La respuesta citotóxica se calculó restando la señal para células A431 incubadas con CMSP sin la adición de anticuerpos anti-EGFR (fondo) de la señal generada por las células diana mezcladas con CMSP en presencia de mAb anti-EGFR. El porcentaje de citotoxicidad se calculó dividiendo la respuesta citotóxica de las células contra el fondo por la respuesta citotóxica máxima obtenida de la lisis celular a través de digitonina. Los datos se analizaron mediante una ecuación logística de cuatro parámetros con una curva dosis-respuesta sigmoidea (Prisma GraphPad). Los resultados se resumen en la Tabla 4. (SA = sin actividad).
Tabla 4: Actividad ADCC de anticuer os anti-EGFR seleccionados
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Como se muestra en la Tabla 4, varios mAb anti-EGFR indujeron ADCC en células A431 incubadas conjuntamente con células efectoras CMSP. Adicionalmente, varios mAb anti-EGFR mostraron un porcentaje alto de destrucción celular máxima comparable al del anticuerpo de control (Control I). Por ejemplo, los anticuerpos anti-EGFR H1H089N, H1H102N, H1H141P, H1H144P, H1H151P, H1H159P y H1H163P presentaron cada uno más del 40 % de destrucción celular máxima en el ensayo de ADCC, mientras que el anticuerpo Control I presentó menos del 25 % de destrucción celular máxima en este ensayo.
Ejemplo 6. Inhibición del crecimiento tumoral por un anticuerpo anti-EGFR
El anticuerpo anti-EGFR H1H141P se sometió a ensayo para determinar su capacidad de inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumor humano en ratones inmunocomprometidos. Brevemente, se implantaron por vía subcutánea 2 x 10A6 células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello FaDu en el flanco de ratones C.B.-17 SCID. Después de que los tumores alcanzasen un tamaño promedio de aproximadamente 200 mm3, los ratones se asignaron al azar a grupos para el tratamiento (N = 6 ratones por grupo) y se les inyectó dos veces por semana por vía subcutánea con proteína de control de Fc humana (12,5 mg/kg; SEQ ID NO: 388) o con H1H141P (10 mg/kg). Los ratones se trataron durante 15 días.
Los volúmenes de los tumores se midieron dos veces por semana durante todo el experimento y se determinaron los pesos de los tumores tras la extirpación al concluir el experimento. Se determinó para cada grupo el crecimiento tumoral promedio (el cambio promedio en el volumen tumoral desde el inicio del tratamiento hasta el final del experimento) y el peso tumoral promedio. Los resultados se resumen en la Tabla 5.
Tabla 5: Inhibición del crecimiento tumoral de FaDu en ratones SCID
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____ ____
En un experimento similar, se determinó el efecto de H1H141P sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor pancreático BxPC3, como se resume en la Tabla 6.
Tabla 6: Inhibición del crecimiento tumoral de BxPC3 en ratones SCID
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___ ___
En un experimento similar, se determinó el efecto de H1H141P sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor de pulmón Calu3, como se resume en la Tabla 7.
Tabla 7: Inhibición del crecimiento tumoral de Calu3 en ratones SCID
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____ ____
En un experimento similar, se determinó el efecto de H1H141P sobre el crecimiento de xenoinjertos de tumor de pulmón NCI-H358, como se resume en la Tabla 8.
Tabla 8: Inhibición del crecimiento tumoral de NCI-H358 en ratones SCID
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En un experimento similar, se determinó el efecto de H1H141P sobre el crecimiento de xenoinjertos de carcinoma epidermoide A431, como se resume en la Tabla 9.
Tabla 9: Inhibición del crecimiento tumoral de A431 en ratones SCID
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En conjunto, estos hallazgos indican que H1H141P como monoterapia puede inhibir el crecimiento de múltiples xenoinjertos de tumores humanos, que representan varios tipos de tumores diferentes.
El alcance de la presente invención no debe limitarse a las realizaciones específicas que se describen en el presente documento. De hecho, a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas, diversas modificaciones de la invención, además de las que se describen en el presente documento, serán obvias para los expertos en la materia. Se pretende incluir dichas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. El alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> Anticuerpos anti-EGFR y usos de los mismos
<130> 8200A-WO
<140> Por asignar
<141> Presentado en este documento
<150> 61/663.984
<151> 25-06-2012
<150> 61/821.000
<151> 08-05-2013
<160> 388
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 1
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attaattgga atagtgataa aatagcctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccgagaa ctccctgttt 240
ctgcaaatga atagtctgag acctgaggac acggccttgt attactgtgt aaaaaggggc 300
gatttttgga ctgagtatta tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210>2
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val
Figure imgf000024_0001
1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly lie Asn Trp Asn Ser Asp Lys lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Lys Arg Gly Asp
Figure imgf000024_0002
100
Figure imgf000024_0003
Gly Thr Leu Val Thr
Figure imgf000024_0004
115 120
<210> 3
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 3
ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
<210> 4
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 5
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 5
attaattgga atagtgataa aata 24
<210>6
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400>6
lie Asn Trp Asn Ser Asp Lys lie
1 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 8
Val Lys Arg Gly Asp Phe Trp Thr Glu Tyr Tyr Asp Tyr 1 5 10
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 9
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 10
Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro His Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys lie Gln Ala 85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105 110
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<212>ADN
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<223> Sintético
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10
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<211> 9
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<223> Sintético
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ttggtttct 9
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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Leu Val Ser
1
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<220>
<223> Sintético
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lie Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr
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<223> Sintético
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly lie Asn Trp Asn Ser Asp Lys lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly ArgPhe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Lys Arg Gly Asp Phe Trp Thr Asp Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
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<211>8
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<223> Sintético
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<223> Sintético
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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lie Asn Trp Asn Ser Asp Lys lie
1 5
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<223> Sintético
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gtaaaaaggg gcgatttttg gactgattat tatgactat 39
<210> 24
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<223> Sintético
<400> 24
Val Lys Arg Gly Asp Phe Trp Thr Asp Tyr Tyr Asp Tyr 1 5 10
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<220>
<223> Sintético
<400> 25
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 26
Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro His Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105 110
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<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 27
cagagcctcc ttcatagtaa tggatacaac tat 33
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 28
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr
1 5 10
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 29
ttggtttct 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Leu Val Ser
1
<210> 31
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 33
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 33
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<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly lie Asn Trp Asn Ser Asp Lys lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg
Figure imgf000032_0001
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn AlaGlu Asn Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met
Figure imgf000032_0002
Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp ThrAla Leu Tyr 85 90 95
Val Lys Arg Gly Asp Phe Trp Thr Asp Tyr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 35
ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
<210> 36
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 37
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 37
attaattgga atagtgataa aata 24
<210> 38
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 38
lie Asn Trp Asn Ser Asp Lys lie
1 5
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<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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gtaaaaaggg gcgatttttg gactgattat tatgactat 39
<210> 40
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Val Lys Arg Gly Asp Phe Trp Thr Asp Tyr Tyr Asp Tyr 1 5 10
<210> 41
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<211> 112
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 42
Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly His Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro His Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys lie Gln Ala 85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
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<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 43
cagagcctcc ttcatagtaa tggacacaac tat 33
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<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 44
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly His Asn Tyr
1 5 10
<210> 45
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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ttggtttct 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Leu Val Ser
1
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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atacaggctc tacaaactcc gtggacg 27
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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lie Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
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Leu Glu Ser Arg Val Thr lie Thr Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Asp Tyr Tyr
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<210> 54
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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1 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Ala Arg Thr Ala lie lie Gly Thr Met Asp Asn
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<210> 57
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 58
Glu lie Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie
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Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly
Figure imgf000038_0001
Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu
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Glu Asp
Figure imgf000038_0002
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Trp 85 90 95
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
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gatgcatcc 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 62
Asp Ala Ser
1
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<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 63
cagcaatata atacctggtg gacg 24
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 64
Gln Gln Tyr Asn Thr Trp Trp Thr
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<220>
<223> Sintético
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<211> 120
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Thr Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly lie Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Val Gly Tyr Asp Trp Asn Phe Val Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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lie Gly Thr Ala Gly Asp Thr
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Ala Arg Val Gly Tyr Asp Trp Asn Phe Val Ala Phe Asp Tyr
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Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu lie His Leu Val Ser lie Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly lie Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95
Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
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ttggtctct 9
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35 40 45
Trp lie Gly His lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Phe
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Ala lie His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Leu Ser Trp Asn Ser Ala Tyr lie Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Lys Asp Thr Asp lie His Leu Trp Phe Leu Phe Asp Phe Trp Gly
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<212> PRT
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Leu Ser Trp Asn Ser Ala Tyr lie
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<223> Sintético
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Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys
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1
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<223> Sintético
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Figure imgf000051_0001
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly lie Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Gln
Figure imgf000052_0001
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Ala Tyr Asp Tyr Ser Asn Tyr Trp Asp His Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp
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<223> Sintético
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atcagtggta gtggagatag caca 24
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lie Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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Ala Tyr Asp Tyr Ser Asn Tyr Trp Asp His Tyr Gly Met Asp Val
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<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 122
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Ser Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
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<220>
<223> Sintético
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cagagtatta gtagctgg 18
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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Gln Ser lie Ser Ser Trp
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<223> Sintético
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<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Lys Ala Ser
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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<223> Sintético
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Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Ser Arg Thr
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<213> Secuencia artificial
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Figure imgf000068_0001
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Figure imgf000068_0002
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 193
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccgtcaagct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctctctt attagtgggg atggtggtag cacatactat 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag aactgaggac accgccttgt attactgtgc aaaaaattat 300 gatagtagtg gttattacta cccttactac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc otea 384
<210> 194
<211> 128
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu lie Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asn Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 195
ggattcacct ttgatgatta tgcc 24
<210> 196
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 196
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala
1 5
<210> 197
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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attagtgggg atggtggtag caca 24
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 198
lie Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr
1 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 199
gcaaaaaatt atgatagtag tggttattac tacccttact actactacta cggtatggac 60 gtc 63
<210> 200
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 200
Ala Lys Asn Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val
20
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<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 201
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagct tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagtag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 202
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly SerGly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp PheAla Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
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<211> 18
<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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cagagtatta gtagctgg 18
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<211>6
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<220>
<223> Sintético
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Gln Ser lie Ser Ser Trp
1 5
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<220>
<223> Sintético
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aaggcgtct 9
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Lys Ala Ser
1
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caacagtata atagttattc tcggacg 27
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Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg Thr
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<220>
<223> Sintético
<400> 210
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Asn Ser Gly
20 25 30
Asp Phe Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp lie Gly His lie Tyr Tyr Ser Gly lie Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser 50 55 60
Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu LysLeu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Lys Arg Val Thr Gly Glu Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Gly Gly Ser lie Asn Ser Gly Asp Phe Tyr
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atatattaca gtgggatcac c 21
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lie Tyr Tyr Ser Gly lie Thr
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gcgagaaaga gggtaactgg ggaagttgac tac 33
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Ala Arg Lys Arg Val Thr Gly Glu Val Asp Tyr
1 5 10
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<212> ADN
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<223> Sintético
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<211>108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 218
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg lie Thr lie Thr Cys Gln Ala Asn Gln Asp lie Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Ser Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr (—01—v J. Val Pro Ser Aro Phe Ser (—01—v j.
50^ 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys Arg
100 105
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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caggacatta acaactat 18
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<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Gln Asp lie Asn Asn Tyr
1 5
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<223> Sintético
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gatgcatcc 9
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<223> Sintético
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Asp Ala Ser
1
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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caacagtatg ataatctccc tcccacc 27
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<211> 9
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<220>
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Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro Thr
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 226
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser lie Asn Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp lie Gly Tyr lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> Sintético
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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Gly Gly Ser lie Asn Ser Gly Asp Tyr Tyr
1 5 10
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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atctattaca gtgggagcac c 21
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<220>
<223> Sintético
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lie Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 232
Ala Arg Val Gly Tyr Ser Lys Gly Tyr Phe Asp Ser
1 5 10
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<220>
<223> Sintético
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gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtga gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaggtcct gatctatgat gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa tacactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgactttg caagttatta ctgccaacag tataaaagtt attggacgtt cggccaaggg 300 accaaggtgg aaatcaaa 318
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<223> Sintético
<400> 234
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser lie Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu lie
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
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<212> ADN
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<223> Sintético
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gagagtatta gtagctgg 18
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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<212> ADN
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1
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<212> ADN
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<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Trp Thr
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<223> Sintético
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 242
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
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Ala Val lie Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Arg Gly ArgPhe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr Gly
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<212> ADN
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lie Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 248
Ala Lys Asp Arg lie Thr Gly Thr His Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 249
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 249
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 250
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 251
caggacattg ccaattat 18
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<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Gln Asp lie Ala Asn Tyr
1 5
<210> 253
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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caacaatata atagaaagcc gtggacg 27
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 256
Gln Gln Tyr Asn Arg Lys Pro Trp Thr
1 5
<210> 257
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 257
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<210> 258
<211> 122
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 258
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Val lie Ser Asp Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Figure imgf000088_0002
100 105 110
Gly Gln Gly Thr
Figure imgf000088_0001
115 120
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<211> 24
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 259
ggattcacct tcagtatcta tggc 24
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 260
Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr Gly
1 5
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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atatcagacg atggaagtaa aaaa 24
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 262
lie Ser Asp Asp Gly Ser Lys Lys
1 5
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 264
Ala Arg Asp Arg lie Thr Gly Thr Asn Trp Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
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<212> ADN
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<220>
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 266
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Gly Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys
100 105
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<211> 18
<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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caggacatta gcaattat 18
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<211>6
<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
<400> 268
Gln Asp lie Ser Asn Tyr
1 5
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<220>
<223> Sintético
<400> 269
gctgcatcc 9
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<223> Sintético
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Ala Ala Ser
1
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caacagtata atcgttaccc attcact 27
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<223> Sintético
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Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Phe Thr
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 274
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr
20 25 30
Gly lie Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Val lie Ser Asp Asp Gly Ser Asp Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Arg Phe Thr Gly Asn His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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ggattcacct tcagtatcta tggc 24
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr Gly
1 5
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<223> Sintético
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atttcagatg atggaagtga taag 24
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 278
lie Ser Asp Asp Gly Ser Asp Lys
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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Ala Lys Asp Arg Phe Thr Gly Asn His Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 282
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser lie Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asn Arg Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
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<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 283
caggacatta gcgattat 18
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<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 284
Gln Asp lie Ser Asp Tyr
1 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 285
gctgcatcc 9
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
<400> 286
Ala Ala Ser
1
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 287
catcagtata atcgtttccc gtggacg 27
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
<400> 288
His Gln Tyr Asn Arg Phe Pro Trp Thr
1 5
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<211> 366
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 289
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcgtgtgcag cctctggatt cacgttcagt atctatggca tacactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggcagtc atatctgatg atggaagtaa taaaaagtat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctatat tttactgtgc gaaagatcgg 300 ataactggaa cccactacta cggaatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 290
<211> 122
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 290
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr
20 25 30
Gly lie His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val lie Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg
Figure imgf000096_0001
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala lie Phe 85 90 95
Ala Lys Asp Arg lie Thr Gly Thr His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 291
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 291
ggattcacgt tcagtatcta tggc 24
<210> 292
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 292
Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr Gly
1 5
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 293
atatctgatg atggaagtaa taaa 24
<210> 294
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 294
lie Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
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<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 295
gcgaaagatc ggataactgg aacccactac tacggaatgg acgtc 45
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<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 296
Ala Lys Asp Arg lie Thr Gly Thr His Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 297
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 297
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcagc 60 atcacttgtc gggcgagtca ggacattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcttccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aaattcagcg gcagtggatc tgggatagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttt caacttatta ctgccatcaa tataatcgtt tcccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
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<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 298
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly lie Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Asn Arg Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
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<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 299
caggacatta gcaattat 18
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<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 300
Gln Asp lie Ser Asn Tyr
1 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 301
gctgcttcc 9
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<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 302
Ala Ala Ser
1
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<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 303
catcaatata atcgtttccc gtggacg 27
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 304
His Gln Tyr Asn Arg Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 305
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgaggctc 60 tcatgtgcag cctctagatt cacctttact aactattgga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaaa ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180 ctggactctg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactttat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagtagcagc 300 agctggtacg actactacta cggtatggac gtctggggcc acgggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366
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<211> 122
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 306
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys lie Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Leu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg
Figure imgf000100_0001
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Ser Ser Trp Tyr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 307
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 307
agattcacct ttactaacta ttgg 24
<210> 308
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 308
Arg Phe Thr Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 309
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 309
ataaagcaag atggaagtga gaaa 24
<210> 310
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 310
lie Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys
1 5
<210> 311
<211> 45
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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gcgagtagca gcagctggta cgactactac tacggtatgg acgtc 45
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 312
Ala Ser Ser Ser Ser Trp Tyr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 313
<211> 324
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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gatcagtctc caaagctcct catcaagttt gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240 gaagatgctg caacgtatta ctgtcatcag actaactttt tacctcacac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggaaatcaa acga 324
<210> 314
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 314
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Gly Thr Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Thr Asn Phe Leu Pro His 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg
100 105
<210> 315
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 315
cagagcattg gtactaac 18
<210> 316
<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 316
Gln Ser lie Gly Thr Asn
1 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 317
tttgcttcc 9
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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1
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<220>
<223> Sintético
<400> 319
catcagacta actttttacc tcacact 27
<210> 320
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 320
His Gln Thr Asn Phe Leu Pro His Thr
1 5
<210> 321
<211> 366
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 321
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatggca tgtactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacattc atatcatatg atggaagtaa taaaaactat 180 gtagactcca tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agttgaggac acggctgtat attactgtgc gaaagatcgt 300 ataagtggaa ctccatggta cggtatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 322
<211> 122
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 322
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Asn Tyr Val Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg PheThr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln
Figure imgf000104_0001
t Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ty 85 90 95
Ala Lys Asp Arg lie Ser Gly Thr Pro Trp Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 323
ggattcacct tcagtaacta tggc 24
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 324
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 325
atatcatatg atggaagtaa taaa 24
<210> 326
<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 326
lie Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 327
gcgaaagatc gtataagtgg aactccatgg tacggtatgg acgtc 45
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 328
Ala Lys Asp Arg lie Ser Gly Thr Pro Trp Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 329
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca ggacattgcc gattatttag cctggtttca acagaaacca 120 gggaaagccc ctaagtccct gatctttgct gcatccagtc tggaaagttg ggttccctta 180 aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tatagtaggt tcccgatcac cttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 330
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ala Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Trp Val Pro Leu Lys Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Pro lie 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
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<212> ADN
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<223> Sintético
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caggacattg ccgattat 18
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<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Gln Asp lie Ala Asp Tyr
1 5
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<212> ADN
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Ala Ala Ser
1
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<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
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caacagtata gtaggttccc gatcacc 27
<210> 336
<211> 9
<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Pro lie Thr
1 5
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<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 338
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Leu lie Glu His Asp Gly Ser Asn Lys Asn Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Ala Lys Asp Arg lie Thr Gly Thr Pro Trp Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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ggattcacct tcagtaacta tggc 24
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<211>8
<212> PRT
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<220>
<223> Sintético
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Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
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<223> Sintético
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atagaacatg atggaagtaa taaa 24
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<211>8
<212> PRT
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<223> Sintético
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Figure imgf000109_0001
<210> 343
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<212>ADN
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<220>
<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
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Ala Lys Asp Arg lie Thr Gly Thr Pro Trp Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
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<212> ADN
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<223> Sintético
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<210> 346
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 346
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ala Asp Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie
35 40 45
Phe Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Trp Val Pro Leu Lys Phe Ser Gly sn ss fin
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Phe Pro lie 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys
100 105
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<211> 18
<212> ADN
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<223> Sintético
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caggacattg ccgattat 18
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<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Gln Asp lie Ala Asp Tyr
1 5
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<223> Sintético
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Ala Ala Ser
1
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<212>ADN
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<223> Sintético
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caacagtata ataggttccc gatcacc 27
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<223> Sintético
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Gln Gln Tyr Asn Arg Phe Pro lie Thr
1 5
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 354
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys lie Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Leu Asp Ser Val 50 55 60
Lys Asp ArgPhe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ser Ser lie Thr Trp Tyr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly His Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<223> Sintético
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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Arg Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Trp
1 5
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
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ataaagcaag atggaagtga gaaa 24
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<211>8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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lie Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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Ala Ser Ser lie Thr Trp Tyr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
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<212> ADN
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<223> Sintético
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 362
Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Gly Ser Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Asn Leu Leu lie
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Thr Asn Phe Leu Pro His 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
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<220>
<223> Sintético
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cagagcattg gtagtaac 18
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<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
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<223> Sintético
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Gln Ser lie Gly Ser Asn
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<212> ADN
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tttgcttcc 9
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 366
Phe Ala Ser
1
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<212>ADN
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<220>
<223> Sintético
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catcagacta attttttacc tcacact 27
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<220>
<223> Sintético
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Figure imgf000115_0001
<210> 369
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<220>
<223> Sintético
<400> 370
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Val lie Ser Asp Asp Gly Ser Asn Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Ser Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Arg lie Thr Gly Thr His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<220>
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ggattcacct tcagtatcta tggc 24
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<212> PRT
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<223> Sintético
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Gly Phe Thr Phe Ser lie Tyr Gly
1 5
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<211> 24
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atttcagatg atggaagtaa taaa 24
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<223> Sintético
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Ala Lys Asp Arg lie Thr Gly Thr His Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
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<223> Sintético
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<220>
<223> Sintético
<400> 378
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg lie Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp lie Ala Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Thr Ser Leu lie
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser lie Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly ThrAsp Phe Thr Leu Thr lie Thr Ser Leu Gln
65 70 75 80
Glu Asp
Figure imgf000118_0001
Phe AlaSerTyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Lys Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 379
caggacattg ccaattat 18
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<211>6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 380
Gln Asp lie Ala Asn Tyr
1 5
<210> 381
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<220>
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Ala Ala Ser
1
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Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn 50 55 60
Leu Glu lie Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Thr lie Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu lie Ala Leu Asn Thr Val 85 90 95
Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu Gln lie lie Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu lie Leu 130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu 145 150 155 160 Ser lie Gln Trp Arg Asp lie Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met 165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys 225 230 235 240 Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp 245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His 290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu 305 310 315 320 Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val 325 330 335
Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser lie Asn
340 345 350
Ala Thr Asn lie Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser lie Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His lie Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp lie Leu Lys Thr Val Lys Glu 385 390 395 400 lie Thr Gly Phe Leu Leu lie Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp 405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu lie lie Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn lie Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser 450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys lie lie Ser Asn Arg Gly Glu 485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly con cOco o w -J oo c•J/hitWn
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys lie Gln Cys His Pro 545 550 555 560 Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn lie Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro 565 570 575
Asp Asn Cys lie Gln Cys Ala His Tyr lie Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys 610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly 625 630 635 640 Pro Lys lie Pro Ser lie Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu 645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly lie Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
lie Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu 690 695 700
Arg lie Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys lie Lys Val Leu Gly Ser 705 710 715 720 Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp lie Pro Glu Gly Glu 725 730 735
Lys Val Lys lie Pro Val Ala lie Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu lie Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly lie Cys Leu Thr Ser 770 775 780
Thr Val Gln Leu lie Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp 785 790 795 800 Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn lie Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn 805 810 815
Trp Cys Val Gln lie Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820 825 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
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Gln His Val Lys lie Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala 850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro lie Lys Trp 865 870 875 880 Met Ala Leu Glu Ser lie Leu His Arg lie Tyr Thr His Gln Ser Asp 885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly lie Pro Ala Ser Glu lie Ser Ser lie Leu Glu
915 920 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro lie Cys Thr lie Asp Val Tyr 930 935 940
Met lie Met Val Lys Cys Trp Met lie Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945 950 955 960
Phe Arg Glu Leu lie lie Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln 965 970 975
Arg Tyr Leu Val lie Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980 985 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995 1000 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu lie Pro Gln Gln Gly Phe Phe 1010 1015 1020
Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala
1025 1030 1035 1040
Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys lie Asp Arg Asn Gly Leu Gln 1045 1050 1055
Ser Cys Pro lie Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp
1060 1065 1070
Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser lie Asp Asp Thr Phe Leu Pro
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Val Pro Glu Tyr lie Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser 1090 1095 1100
Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser
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Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln lie Ser Leu Asp
1155 1160 1165
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Gly lie Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val
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Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe lie Gly Ala
1205 1210
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 386
Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln 1 5 10 15
Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn
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Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu lie Thr Tyr Val Gln Arg
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Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr lie Gln Glu Val Ala Gly Tyr 50 55 60
Val Leu lie Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln lie lie Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala 85 90 95
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ñsn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser lie Gln Trp Arg Asp lie Val 130 135 140
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Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala
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Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys
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Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn 245 250 255
Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro
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Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly
275 280 285
Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys 290 295 300
Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Asp Ser Leu Ser lie Asn Ala Thr Asn lie Lys His Phe Lys 325 330 335
Asn Cys Thr Ser lie Ser Gly Asp Leu His lie Leu Pro Val Ala Phe
340 345 350
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
355 360 365
Asp lie Leu Lys Thr Val Lys Glu lie Thr Gly Phe Leu Leu lie Gln 370 375 380
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 385 390 395 400 lie lie Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 405 410 415
Val Ser Leu Asn lie Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie
420 425 430
Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
435 440 445
Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr 450 455 460
Lys lie lie Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln 465 470 475 480 Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro 485 490 495
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
500 505 510
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
515 520 525
Ser Glu Cys lie Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn 530 535 540
lie Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys lie Gln Cys Ala His 545 550 555 560 Tyr lie Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met 565 570 575
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
580 585 590
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
595 600 605
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys lie Pro Ser lie Ala Cys 610 615 620
Pro Gly Gly Glu Gln Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu
625 630 635 640
Gln Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Ser Gly His His His His His 645 650 655
His Ser Ser Gly
660
<210> 387
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 387
Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln 1 5 10 15
Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn
20 25 30
Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn Leu Glu lie Thr Tyr Val Gln Arg
35 40 45
Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys Thr lie Gln Glu Val Ala Gly Tyr 50 55 60
Val Leu lie Ala Leu Asn Thr Val Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu 65 70 75 80 Gln lie lie Arg Gly Asn Met Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala 85 90 95
Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro
100 105 110
Met Arg Asn Leu Gln Glu lie Leu His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn
115 120 125
Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu Ser lie Gln Trp Arg Asp lie Val 130 135 140
Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu 145 150 155 160 Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp 165 170 175
Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala
180 185 190
Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys
195 200 205
His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys 210 215 220
Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys 225 230 235 240 Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn 245 250 255
Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro
260 265 270
Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly
275 280 285
Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys 290 295 300
Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu 305 310 315 320 Phe Lys Asp Ser Leu Ser lie Asn Ala Thr Asn lie Lys His Phe Lys 325 330 335
Asn Cys Thr Ser lie Ser Gly Asp Leu His lie Leu Pro Val Ala Phe
340 345 350
Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu
355 360 365
Asp lie Leu Lys Thr Val Lys Glu lie Thr Gly Phe Leu Leu lie Gln 370 375 380
Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu 385 390 395 400 lie lie Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val 405 410 415
Val Ser Leu Asn lie Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie
420 425 430
Ser Asp Gly Asp Val lie lie Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala
435 440 445
Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr 450 455 460
Lys lie lie Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln 465 470 475 480 Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro 485 490 495
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
500 505 510
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
515 520 525
Ser Glu Cys lie Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn 530 535 540
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580 585 590
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
595 600 605
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys lie Pro Ser lie Ala Glu 610 615 620
Pro Arg Gly Pro Thr lie Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala 625 630 635 640 Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Lys lie 645 650 655
Lys Asp Val Leu Met lie Ser Leu Ser Pro lie Val Thr Cys Val Val
660 665 670
Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln lie Ser Trp Phe Val
675 680 685
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp 690 695 700
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Leu Pro Ala Pro lie Glu Arg Thr lie Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val
740 745 750
Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr
755 760 765
Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu 770 775 780
Asp lie Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr 785 790 795 800 Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr 805 810 815
Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr
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Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys
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<210> 388
<211> 227
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 388
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95
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100 105 110
Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220
Pro Gly Lys
225

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (hEGFR), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/lCVR de las SEQ ID NO: 130/138 y una región Fc de IgG1 humana.
2. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2 para su uso en un método de inhibición del crecimiento tumoral.
4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el tumor se selecciona entre el grupo que consiste en un tumor renal, un tumor pancreático, un tumor de cabeza y cuello, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor gástrico y un tumor ovárico, un tumor pulmonar y un tumor de piel.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2, y un segundo agente terapéutico, para su uso en un método de inhibición o atenuación del crecimiento tumoral en un sujeto, en donde el segundo agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, ErbB3, ErbB4, cMet, IGF1R, Ang2, PDGFR-a, PDGFR-p, o un antagonista de VEGF.
6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2, para su uso en un método de inhibición o atenuación del crecimiento tumoral en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o la composición farmacéutica y un segundo agente terapéutico, en donde el segundo agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, ErbB3, ErbB4, cMet, IGF1R, Ang2, PDGFR-a, PDGFR-p, o un antagonista de VEGF.
7. Un agente terapéutico para su uso en un método de inhibición o atenuación del crecimiento tumoral en un sujeto, en donde el agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2, ErbB3, ErbB4, cMet, IGF1R, Ang2, PDGFR -a, PDGFR-p, o un antagonista de VEGF, y en donde el método comprende administrar al sujeto el agente terapéutico y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de la reivindicación 2.
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