JP6563472B2 - 抗ＥｒｂＢ３抗体およびその使用 - Google Patents

Description

本発明はヒトＥｒｂＢ３に対して特異的である抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。

ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３としても知られる）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーのメンバーである。このファミリーの他のメンバーとしては、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１またはＨＥＲ１としても知られる）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２またはＮｅｕとしても知られる）およびＨＥＲ４が挙げられる。ＥｒｂＢ受容体は、遺伝子発現の変化を導く細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することによって細胞の増殖、生存および分化を調節する。

ＥｒｂＢ受容体は、ホモまたはヘテロ二量体の形成によって活性化される。たとえば、ＥｒｂＢ３がＥｒｂＢ２と共発現したとき、活性ヘテロ二量体型シグナル伝達複合体が形成される。ＥｒｂＢ３二量体形成は、そのリガンド結合によって促進される。ニューレグリン１（ＮＲＧ１）は、受容体のホモまたはヘテロ二量体化を促進するＥｒｂＢ３の一次リガンドである。

ＥｒｂＢ３は、乳がん、消化管がんおよび膵がんを含むさまざまながんタイプで過剰発現することが見出されている。抗ＥｒｂＢ３抗体は、マウス異種移植モデルでいくつかのヒト腫瘍細胞系の増殖を阻害することが示されている。抗ＥｒｂＢ３抗体は、たとえば、特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；および特許文献６に記載されている。それにもかかわらず、がんおよび他の関連障害を治療するため、新規なＥｒｂＢ３アンタゴニスト、たとえば抗ＥｒｂＢ３抗体が当分野で必要とされている。

ＵＳ５，４８０，９６８ ＵＳ５，９６８，５１１ ＵＳ２００４／０１９７３３２ ＵＳ７，３３２，５８０ ＵＳ７，７０５，１３０ ＵＳ７，８４６，４４０

本発明は、ヒトＥｒｂＢ３を結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、とりわけ、ＥｒｂＢ３介在性シグナル伝達の阻害ならびにＥｒｂＢ３活性および／またはシグナル伝達によって生じるか、またはそれに関連する疾患および障害の治療に有用である。

特定の実施態様による本発明の抗体は、ＥｒｂＢ３とＥｒｂＢ３リガンド（たとえば、ＮＲＧ１および／またはＮＲＧ２）との間の相互作用を遮断する。抗体は、たとえば、細胞表面ＥｒｂＢ３の内部移行の誘導、in vitroのＮＲＧ１刺激性腫瘍増殖の阻害、および／またはin vitroの腫瘍増殖の阻害といったような１つまたはそれ以上のさらなる生物学的性質を備えていてもよい。

本発明の抗体は、完全長（たとえば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であることができ、または抗原結合性部分（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでもよく、また、修飾して官能基に影響を及ぼしてもよく、たとえば残基のエフェクター機能を排除してもよい（Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933）。

本発明は、配列番号：２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６および４８２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを提供する。

また、本発明は、配列番号：１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを提供する。

また、本発明は、配列番号：２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３７０／３７８、３８６／３９４、４０２／４１０、４１８／４２６、４３４／４４２、４５０／４５８、４６６／４７４および４８２／４９０からなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）配列対を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。

また、本発明は、配列番号：８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２および４８８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）ドメイン；ならびに配列番号：１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０および４９６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）ドメイン；を含む抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを提供する。

特定の実施態様において、抗体または抗体の抗原結合性部分は、配列番号：８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／１１２、１２０／１２８、１３６／１４４、１５２／１６０、１６８／１７６、１８４／１９２、２００／２０８、２１６／２２４、２３２／２４０、２４８／２５６、２６４／２７２、２８０／２８８、２９６／３０４、３１２／３２０、３２８／３３６、３４４／３５２、３６０／３６８、３７６／３８４、３９２／４００、４０８／４１６、４２４／４３２、４４０／４４８、４５６／４６４、４７２／４８０および４８８／４９６からなる群から選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。

また、本発明は、配列番号：４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８および４８４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）ドメイン；配列番号：６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０および４８６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）ドメイン；配列番号：１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６および４９２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）ドメイン；ならびに配列番号：１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、３９８、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８および４９４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）ドメイン；をさらに含む抗体またはそのフラグメントを提供する。

本発明の特定の非限定的な例となる抗体および抗原結合性フラグメントは、それぞれ、配列番号：４−６−８−１２−１４−１６（たとえばＨ４Ｈ２０８４Ｐ）；２０−２２−２４−２８−３０−３２（たとえばＨ４Ｈ２０９２Ｐ）；３６−３８−４０−４４−４６−４８（たとえばＨ４Ｈ２０９４Ｐ）；５２−５４−５６−６０−６２−６４（たとえばＨ４Ｈ２０９８Ｐ）；６８−７０−７２−７６−７８−８０（たとえばＨ４Ｈ２１０２Ｐ）；８４−８６−８８−９２−９４−９６（たとえばＨ４Ｈ２１０８Ｐ）；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２（たとえばＨ４Ｈ２１１１Ｐ）；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８（たとえばＨ４Ｈ２１１４Ｐ）；１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４（たとえばＨ４Ｈ２１３２Ｐ）；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０（たとえば、Ｈ４Ｈ２１３８Ｐ）；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（たとえばＨ４Ｈ２１４０Ｐ）；１８０−１８２−１８４−１８８−１９０−１９２（たとえば、Ｈ４Ｈ２１４３Ｐ）；１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８（たとえばＨ４Ｈ２１４６Ｐ）；２１２−２１４−２１６−２２０−２２２−２２４（たとえばＨ４Ｈ２１４７Ｐ）；２２８−２３０−２３２−２３６−２３８−２４０（たとえばＨ４Ｈ２１４８Ｐ）；２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６（たとえばＨ４Ｈ２１５１Ｐ）；２６０−２６２−２６４−２６８−２７０−２７２（たとえばＨ４Ｈ２１５３Ｐ）；２７６−２７８−２８０−２８４−２８６−２８８（たとえばＨ４Ｈ２１５４Ｐ）；２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４（たとえばＨ４Ｈ２２９０Ｐ）；３０８−３１０−３１２−３１６−３１８−３２０（たとえばＨ１Ｍ１８１９Ｎ）；３２４−３２６−３２８−３３２−３３４−３３６（たとえばＨ２Ｍ１８２１Ｎ）；３４０−３４２−３４４−３４８−３５０−３５２（たとえばＨ２Ｍ１８２４Ｎ）；３５６−３５８−３６０−３６４−３６６−３６８（たとえばＨ２Ｍ１８２７Ｎ）；３７２−３７４−３７６−３８０−３８２−３８４（たとえばＨ１Ｍ１８２８Ｎ）；３８８−３９０−３９２−３９６−３９８−４００（たとえばＨ２Ｍ１８２９Ｎ）；４０４−４０６−４０８−４１２−４１４−４１６（たとえばＨ２Ｍ１９３０Ｎ）；４２０−４２２−４２４−４２８−４３０−４３２（たとえばＨ２Ｍ１９４３Ｎ）；４３６−４３８−４４０−４４４−４４６−４４８（たとえばＨ２Ｍ１９３６Ｎ）；４５２−４５４−４５６−４６０−４６２−４６４（たとえばＨ２Ｍ１９３７Ｎ）；４６８−４７０−４７２−４７６−４７８−４８０（たとえばＨ２Ｍ１９３８Ｎ）；および４８４−４８６−４８８−４９２−４９４−４９６（たとえばＨ１Ｍ１９４０Ｎ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。

関連した実施態様において、本発明は、ＥｒｂＢ３を特異的に結合する抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを含み、ここで、この抗体またはフラグメントは、配列番号：２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３７０／３７８、３８６／３９４、４０２／４１０、４１８／４２６、４３４／４４２、４５０／４５８、４６６／４７４および４８２／４９０からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列内に含まれる重鎖および軽鎖ＣＤＲドメインを含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内でＣＤＲを同定する方法および技術は、当分野でよく知られており、本明細書に開示された特定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内でＣＤＲを同定するために用いることができる。ＣＤＲの境界を同定するために用いることができる例となる規則としては、たとえば、カバット（Kabat）定義、チョシア（Chothia）定義およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般的には、カバット定義は配列変異性に基づいており、チョシア定義は、構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義は、カバットとチョシアアプローチとの間の折衷案である。たとえば、Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)；Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997)；およびMartin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)を参照のこと。また、抗体内のＣＤＲ配列の同定には公開データベースが利用可能である。

別の態様において、本発明は、抗ＥｒｂＢ３抗体またはそのフラグメントをコードする核酸分子を提供する。また、本発明の核酸を担持している組換え発現ベクター、およびこのようなベクターが導入された宿主細胞も、本発明によって包含されており、抗体を産生できる条件下で宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することによって抗体を産生する方法も同様である。

一実施態様において、本発明は、配列番号：１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３２１、３３７、３５３、３６９、３８５、４０１、４１７、４３３、４４９、４６５および４８１からなる群から選択される核酸配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされたＨＣＶＲを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。

また、本発明は、配列番号：９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２９、３４５、３６１、３７７、３９３、４０９、４２５、４４１、４５７、４７３および４８９からなる群から選択される核酸配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされたＬＣＶＲを含む抗体またはそのフラグメントを提供する。

また、本発明は、配列番号：７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、３１１、３２７、３４３、３５９、３７５、３９１、４０７、４２３、４３９、４５５、４７１および４７８からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされたＨＣＤＲ３ドメイン；ならびに配列番号：１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、３１９、３３５、３５１、３６７、３８３、３９９、４１５、４３１、４４７、４６３、４７９および４９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされたＬＣＤＲ３ドメイン；を含む抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを提供する。

また、本発明は、配列番号：３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０７、３２３、３３９、３５５、３７１、３８７、４０３、４１９、４３５、４５１、４６７および４８３からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされたＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号：５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３２５、３４１、３５７、３７３、３８９、４０５、４２１、４３７、４５３、４６９および４８５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされたＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号：１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、３１５、３３１、３４７、３６３、３７９、３９５、４１１、４２７、４４３、４５９、４７５および４９１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされたＬＣＤＲ１ドメイン；ならびに配列番号：１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３３３、３４９、３６５、３８１、３９７、４１３、４２９、４４５、４６１、４７７および４９３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされたＬＣＤＲ２ドメイン；をさらに含む抗体またはそのフラグメントを提供する。

特定の実施態様によれば、抗体またはそのフラグメントは、配列番号：１および９（たとえばＨ４Ｈ２０８４Ｐ）、１７および２５（たとえばＨ４Ｈ２０９２Ｐ）、３３および４１（たとえばＨ４Ｈ２０９４Ｐ）、４９および５７（たとえばＨ４Ｈ２０９８Ｐ）、６５および７３（たとえばＨ４Ｈ２１０２Ｐ）、８１および８９（たとえばＨ４Ｈ２１０８Ｐ）、９７および１０５（たとえばＨ４Ｈ２１１１Ｐ）、１１３および１２１（たとえばＨ４Ｈ２１１４Ｐ）、１２９および１３７（たとえばＨ４Ｈ２１３２Ｐ）、１４５および１５３（たとえばＨ４Ｈ２１３８Ｐ）、１６１および１６９（たとえばＨ４Ｈ２１４０Ｐ）、１７７および１８５（たとえばＨ４Ｈ２１４３Ｐ）、１９３および２０１（たとえばＨ４Ｈ２１４６Ｐ）、２０９および２１７（たとえばＨ４Ｈ２１４７Ｐ）、２２５および２３３（たとえばＨ４Ｈ２１４８Ｐ）、２４１および２４９（たとえばＨ４Ｈ２１５１Ｐ）、２５７および２６５（たとえばＨ４Ｈ２１５３Ｐ）、２７３および２８１（たとえばＨ４Ｈ２１５４Ｐ）、２８９および２９７（たとえばＨ４Ｈ２２９０Ｐ）、３０５および３１３（たとえばＨ１Ｍ１８１９Ｎ）、３２１および３２９（たとえばＨ２Ｍ１８２１Ｎ）、３３７および３４５（たとえばＨ２Ｍ１８２４Ｎ）、３５３および３６１（たとえばＨ２Ｍ１８２７Ｎ）、３６９および３７７（たとえばＨ１Ｍ１８２８Ｎ）、３８５および３９３（たとえばＨ２Ｍ１８２９Ｎ）、４０１および４０９（たとえばＨ２Ｍ１９３０Ｎ）、４１７および４２５（たとえばＨ２Ｍ１９３４Ｎ）、４３３および４４１（たとえばＨ２Ｍ１９３６Ｎ）、４４９および４５７（たとえばＨ２Ｍ１９３７Ｎ）、４６５および４７３（たとえばＨ２Ｍ１９３８Ｎ）または４８１および４８９（たとえばＨ１Ｍ１９４０Ｎ）の配列番号の核酸配列によってコードされた重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列を含む。

本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。いくつかの用途では、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾が、有用となることがあり、または、オリゴ糖鎖に存在するフコース部分が欠如した抗体は、たとえば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を高めるのに有用となることがある（Shield et al. (2002) JBC 277:26733を参照のこと）。別の用途において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改良するために行うことができる。

別の態様において、本発明は、ＥｒｂＢ３を特異的に結合する組換えヒト抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。関連した態様において、本発明は、ＥｒｂＢ３阻害剤と第２の治療剤との組合せである組成物を特徴とする。一実施態様において、ＥｒｂＢ３阻害剤は、抗体またはそのフラグメントである。一実施態様において、第２の治療剤は、ＥｒｂＢ３阻害剤と都合よく組み合わせた任意の薬剤である。ＥｒｂＢ３阻害剤と都合よく組み合わせてもよい例となる薬剤としては、ＥｒｂＢ３活性を阻害する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合性フラグメント、ペプチド阻害剤、小分子アンタゴニスト、などを含む）および／またはＥｒｂＢ３上流または下流シグナル伝達を妨げる薬剤が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体または抗体の抗原結合性部分を用いるＥｒｂＢ３活性を阻害する方法を提供し、ここで、この治療方法は、本発明の抗体または抗体の抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。治療される障害は、ＥｒｂＢ３活性の除去、阻害または減少によって改善、向上、阻害または予防されるあらゆる疾患または状態である。本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体または抗体フラグメントは、ＥｒｂＢ３とＥｒｂＢ３結合パートナー（たとえば、ニューレグリン−１）との間の相互作用を遮断するために機能してもよいし、または、そうでない場合、ＥｒｂＢ３のシグナル伝達活性を阻害してもよい。

また、本発明は、患者におけるＥｒｂＢ３活性に関連するか、またはそれによって生じる疾患または障害の治療のための薬剤の製造における本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体または抗体の抗原結合性部分の使用を含む。

別の実施態様は、次の詳細な説明の総説から明らかになる。

詳細な説明
本発明を記述する前に、記述された特定の方法および実験条件は変化することがあるため、本発明はこのような方法および条件に限定されないことを理解しなければならない。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に用いる専門用語は、特定の実施態様を記述するためだけにあり、限定を意図しないことを理解しなければならない。

特に明記しない限り、本明細書に用いるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に用いるように、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して用いる場合、その値が列挙された値から１％を超えずに逸脱してもよいことを意味する。たとえば、本明細書に用いるように、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにその間のすべての値（たとえば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、など）を含む。

本発明の実施または試験においては、本明細書に記述したものと類似のまたは同等のあらゆる方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料を、ここに記述する。

定義
本明細書に用いる「ＥｒｂＢ３」および「ＥｒｂＢ３フラグメント」という発現は、非ヒト種からのもの（たとえば、「マウスＥｒｂＢ３」、「マウスＥｒｂＢ３フラグメント」、「サルＥｒｂＢ３」、「サルＥｒｂＢ３フラグメント」、など）であると明記されていなければ、ヒトＥｒｂＢ３タンパク質またはフラグメントのことをいう。ヒトＥｒｂＢ３の細胞外ドメインは、示されるアミノ酸配列を有する、例えば、配列番号のアミノ酸１−６１３：４９７−４９９。

本明細書に用いる「ＥｒｂＢ３リガンド」という用語は、in vivoで生物学的シグナル
を伝達するヒトＥｒｂＢ３タンパク質の細胞外ドメインに結合可能なタンパク質を意味する。「ＥｒｂＢ３リガンド」という用語は、ニューレグリン−１（ＮＲＧ１）およびニューレグリン−２（ＮＲＧ２）を包含する。

本明細書に用いる「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（たとえば、ＩｇＭ）のことをいうものとする。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶ_Hと略する）および重鎖定常領域を含む。重
鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_H１、Ｃ_H２およびＣ_H３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変
領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶ_Lと略する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常
領域は、１つのドメイン（Ｃ_L１）を含む。Ｖ_HおよびＶ_L領域は、フレームワーク領域（
ＦＲ）と称する十分に保存される領域の間に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域にさらに細かく分けることができる。Ｖ_HおよびＶ_Lは、それぞれ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。本発明の異なる実施態様において、抗ＥｒｂＢ３抗体（またはその抗原結合性部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一あってもよいし、または自然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸のコンセンサス配列は、２つまたはそれ以上のＣＤＲの比較分析に基づいて定義してもよい。

また、本明細書に用いる「抗体」という用語は、完全な抗体分子の抗原結合性フラグメントも包含する。本明細書に用いる抗体の「抗原結合性部分」、抗体の「抗原結合性フラグメント」などの用語は、抗原を特異的に結合して複合体を形成する、なんらかの天然の、酵素によって入手可能な、合成の、または遺伝子組換えのポリペプチドまたは糖タンパク質を包含する。抗体の抗原結合性フラグメントは、たとえば、タンパク分解のような任意の適した標準技術または抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子工学技術を用いて完全な抗体分子から誘導してもよい。このようなＤＮＡは、知られており、かつ／または、たとえば、商業的な供給源、ＤＮＡライブラリー（たとえば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、または合成することができる。ＤＮＡを、化学的に、または分子生物学的技術を用いることによって配列決定し、操作して、たとえば、１つもしくはそれ以上の可変および／または定常ドメインを適した配置に配列するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失させる、などしてもよい。

抗原結合性フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（たとえば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、または限定されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小限の認識単位が挙げられる。また、他の改変された分子、たとえばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体（CDR-grafted antibodies）、二重特異性抗体、三重特性抗体、四重特異性抗体、ミニ抗体（minibodies）、ナノ抗体（nanobodies）（たとえば、一価のナノ抗体、二価のナノ抗体、など）、小モジュラー免疫医薬（small modular immunopharmaceuticals）（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメイン（shark variable IgNAR domains）、も、また本明細書に用いる「抗原結合性フラグメント」の表現に包含される。

抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの可変ドメインを典型的に含む。可変ドメインは、任意の寸法またはアミノ酸組成であってもよく、１つもしくはそれ以上のフレームワーク配列に隣接するか、またはそれを有するフレーム中にある少なくとも１つのＣＤＲを一般に含むことになる。Ｖ_Lドメインと会合したＶ_Hドメインを有する抗原結合性フラグメントにおいて、Ｖ_HおよびＶ_Lドメインは、任意の適した配置で互いに相対した位置にあってもよい。たとえば、可変領域は、二量体であり、Ｖ_H−Ｖ_H、Ｖ_H−Ｖ_LまたはＶ_L−Ｖ_L二量体を含んでもよい。代わりに、抗体の抗原結合性フラグメントは、単量体のＶ_HまたはＶ_Lドメインを含んでもよい。

特定の実施態様において、抗体の抗原結合性フラグメントは、少なくとも１つの定常領域に共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含んでもよい。本発明の抗体の抗原結合性フラグメントに見いだすことができる可変および定常ドメインの非限定的な例となる配置としては、（ｉ）Ｖ_H−Ｃ_H１；（ｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_H２；（ｉｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_H３；（ｉｖ）Ｖ_H−Ｃ_H１−Ｃ_H２；（ｖ）Ｖ_H−Ｃ_H１−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｖｉ）Ｖ_H−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｖｉｉ）Ｖ_H−Ｃ_L；（ｖｉｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１；（ｉｘ）Ｖ_L−Ｃ_H２；（ｘ）Ｖ_L−Ｃ_H３；（ｘｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１−Ｃ_H２；（ｘｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H１−Ｃ_H２−Ｃ_H３；（ｘｉｉｉ）Ｖ_L−Ｃ_H２−Ｃ_H３；および（ｘｉｖ）Ｖ_L−Ｃ_Lが挙げられる。上記の例となる配置のいずれかを含む可変および定常ドメインの任意の配置において、可変ドメインと定常ドメインとは、互いに直接結合していてもよいし、または完全もしくは不完全なヒンジもしくはリンカー領域によって結合されてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子中の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間に柔軟性または半柔軟性の結合を生じる少なくとも２個（たとえば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個またはそれ以上）のアミノ酸からなってもよい。さらに、本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、上記の可変および定常領域配置のホモ二量体またはヘテロ二量体（または、他の多量体）を、互いにおよび／または１つもしくはそれ以上の単量体のＶ_HドメインもしくはＶ_Lドメインとの非共有結合性会合状態（たとえば、ジスルフィド結合による）で含んでもよい。

完全な抗体分子と同様に、抗原結合性フラグメントは、単一特異性または多重特異性（たとえば、二重特異性）であってもよい。抗体の多重特異性抗原結合性フラグメントは、典型的に少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここにおいて、それぞれの可変ドメインは、別々の抗原にまたは同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示された例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当分野で利用可能な常用技術を用いて本発明の抗体の抗原結合性フラグメントに関する使用に合わせてもよい。

本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を通して機能してもよい。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）とは、補体の存在下での本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解のことをいう。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、それによって標的細胞の溶解を導く細胞媒介反応のことをいう。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、当分野でよく知られており、かつ入手可能なアッセイを用いて測定することができる。（たとえば、米国特許第５，５００，３６２号および同第５，８２１，３３７号ならびにClynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656を参照のこと）。抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害性を媒介する抗体の能力において重要である。したがって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害性を媒介することが望ましいかどうかに基づいて選択してもよい。

本明細書に用いる「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。本発明のヒト抗体は、たとえばＣＤＲ、特にＣＤＲ３中にヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（たとえば、in vitroでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはin vivoでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよ
い。しかし、本明細書に用いる「ヒト抗体」という用語は、マウスのような他の哺乳動物種の生殖系列から誘導されたＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体を包含しないものとする。

本明細書に用いる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離されたすべてのヒト抗体、たとえば宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体（さらに下に記述する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（さらに下に記述する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（たとえば、マウス）から単離された抗体（たとえば、Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295を参照のこと）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むなんらかの他の手段によって調製、発現、作製もしくは単離された抗体を含むものとする。このような組換えヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン生殖系列配列から誘導された可変および定常領域を有する。しかし、特定の実施態様では、このような組換えヒト抗体は、in vitroで突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を用いるときは、in vivoでの体細胞突然変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶ_HおよびＶ_L領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_HおよびＶ_L配列から誘導され、かつそれに関連するが、in vivoヒト抗体生殖系列レパートリー内で天然に存在しなくてもよい配列である。

ヒト抗体は、ヒンジ不均一性（hinge heterogeneity）に伴って２つの形態で存在する
ことができる。１つの形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって共に保持されている、約１５０〜１６０ｋＤａの安定な４つの鎖構築物を含む。第２の形態では、二量体が鎖間ジスルフィド結合を介して結合されておらず、約７５〜８０ｋＤａの分子が共有結合した軽鎖および重鎖（半分の抗体）で構成され形成されている。これらの形態は、アフィニティー精製の後でさえ、分離するのが極めて困難である。

さまざまな無傷のＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度（frequency of appearance）は、限定されるわけではないが、抗体のヒンジ領域アイソタイプに伴う構造の違いによるものである。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現（Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105）を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを用いて典型的に観察されるレベルに有意に低減することができる。本発明は、たとえば、産生において、所望の抗体形態の収率を改善するため、望ましいことでありうる、ヒンジ、Ｃ_H２またはＣ_H３領域中に１つまたはそれ以上の突然変異を有する抗体を包含する。

本明細書に用いる「単離された抗体」は、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定され、かつ分離および／または回収された抗体を意味する。たとえば、生物の少なくとも１つの成分から、または抗体が自然に存在するもしくは自然に産生される組織もしくは細胞から分離または除去された抗体は、本発明の目的の「単離された抗体」である。また、単離された抗体は、組換え細胞内の原位置の抗体を含む。単離された抗体は、少なくとも１つの精製または単離ステップにかけられた抗体である。特定の実施態様によれば、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

「特異的に結合する」などの用語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが、抗原と生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当分野でよく知られており、たとえば、平衡透折、表面プラスモン共鳴などが挙げられる。たとえば、本発明の文脈に用いる、ヒトＥｒｂＢ３を「特異的に結合する」抗体としては、表面プラスモン共鳴アッセイで測定して、約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満または約０．５ｎＭ未満のＫＤを有するヒトＥｒｂＢ３またはその一部を結合する抗体が挙げられる（たとえば、本明細書の実施例３を参照のこと）。しかし、ヒトＥｒｂＢ３を特異的に結合する単離された抗体は、他の（非ヒト）種からのＥｒｂＢ３分子のような他の抗原に対する交差反応性を有する。

本明細書に用いる「中和」または「遮断」抗体は、ＥｒｂＢ３に結合すると（ｉ）ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ３フラグメントとＥｒｂＢ３リガンド（たとえば、ニューレグリン１）との間の相互作用を妨げる、および／または（ｉｉ）ＥｒｂＢ３の少なくとも１つの生物学的機能を阻害する抗体のことをいうものとする。ＥｒｂＢ３中和または遮断抗体によって生じる阻害は、適当なアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。ＥｒｂＢ３阻害を検出するための例となるアッセイを本明細書に記述する。

本明細書に開示された抗ＥｒｂＢ３抗体は、抗体が誘導された対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域中に１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含んでもよい。このような突然変異は、本明細書に開示されたアミノ酸配列を、たとえば公開された抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されたアミノ酸配列のいずれかから誘導された抗体およびその抗原結合性フラグメントを含み、ここにおいて、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、抗体が誘導された生殖系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、または対応する生殖系列残留物の同類アミノ酸置換に突然変異する（このような配列変化は、本明細書においてひとまとめにして「生殖細胞突然変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示された重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つまたはそれ以上の個々の生殖系列突然変異またはその組合せを含む多くの抗体および抗原結合性フラグメントを容易に産生することができる。特定の実施態様において、Ｖ_Hおよび／またはＶ_Lドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のすべては、抗体が誘導された最初の生殖系列配列中に見いだされる残基に逆に突然変異する。別の実施態様では、特定の残基のみ、たとえば、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見いだされる突然変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見いだされる突然変異残基のみ、最初の生殖系列配列に逆に突然変異する。別の実施態様では、１つまたはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基が、異なる生殖系列配列（すなわち、最初に抗体が誘導された生殖系列配列と異なる生殖系列配列）の対応する残基に突然変異する。さらにまた、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つまたはそれ以上の生殖系列突然変異の任意の組合せを含んでもよく、たとえば、ここでは、特定の個々の残基が、特定の生殖系列配列の対応する残基に突然変異する一方で、最初の生殖系列配列と異なる特定の他の残基が、維持されているか、または異なる生殖系列配列の対応する残基に突然変異する。１つまたはそれ以上の生殖系列突然変異を含む抗体および抗原結合性フラグメントは、一旦得られたら、改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善または増強されたアンタゴニストまたはアゴニストの生物学的性質（ありうる場合として）、低減された免疫原性などのような１つまたはそれ以上の所望の性質について容易に試験することができる。この一般的なやり方で得られる抗体および抗原結合性フラグメントは、本発明内に包含される。

また、本発明は、１つまたはそれ以上の同類置換を有する、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＥｒｂＢ３抗体を包含する。たとえば、本発明は、本明細書に開示されたＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して、たとえば、１０またはそれより少ない、８またはそれより少ない、６またはそれより少ない、４またはそれより少ない、などの同類アミノ酸置換を有する、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＥｒｂＢ３抗体の使用を包含する。

本明細書に用いる「表面プラスモン共鳴」という用語は、たとえば、BIAcore^TMシステム（Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化の検出によってリアルタイム相互作用の分析を可能にする光学的現象のことをいう。

本明細書に用いる「Ｋ_D」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数のことをいうものとする。

「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基のことをいう。１つの抗原が複数のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体が抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的作用を有してもよい。エピトープは、立体配置的または線状であってもよい。立体配置的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なる部分からの空間的に並置されたアミノ酸によって生じる。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって生じたものである。特定の状況において、エピトープは、抗原上に糖類の部分、ホスホリル基またはスルホニル基を含んでもよい。

「実質的同一性」または「実質的に同一の」という用語は、核酸またはそのフラグメントについて言及する場合、別の核酸（または、その相補的鎖）を用いて適当なヌクレオチド挿入物または欠失物を最適に整列したときに、任意のよく知られた配列同一性のアルゴリズム、たとえば以下で議論するＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐによって測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示している。参照核酸分子と実質的同一性を有する核酸分子は、特定の例では、参照核酸分子によってコードされたポリペプチドと同一か、または実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしてもよい。

ポリペプチドに適用されるように、「実質的類似性」または「実質的に類似した」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いて、たとえばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列させたときに、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、同類アミノ酸置換によって異なる。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した化学的性質（たとえば、電荷または疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。一般に、同類アミノ酸置換はタンパク質の機能的性質を実質的に変えないことになる。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が同類置換によって互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度を上向きに調整して置換の保存的性質（conservative nature）を補正してもよい。この調整を行う手段は、当業者によく知られている。たとえば、Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331を参照のこと。類似した化学的性質の側鎖を有するアミノ酸基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパルテートおよびグルタメート、および（７）硫黄含有側鎖はシステインおよびメチオニンである、が挙げられる。好ましい同類アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテートおよびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、同類置換は、Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445に開示されたＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度な同類」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。

ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性とも呼ばれており、配列分析ソフトウェアを用いて典型的に測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、同類アミノ酸置換を含む、さまざまな置換、欠失および他の修飾に割り当てられる類似性の計測を用いて類似した配列をマッチングさせる。たとえば、ＧＣＧソフトウェアには、ＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔのようなプログラムがあり、これらは、デフォルトパラメータを用いて異なる生物種からの相同性ポリペプチドのような密接に関連したポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。たとえば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列は、ＦＡＳＴＡを用い、デフォルトまたは推奨パラメータ、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムを用いて比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（たとえば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリーと探索配列との間の最良の重複部分の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する（前出、Pearson (2000)）。本発明の配列をさまざまな生物からの多数の配列を含むデータベースと比較するときの別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮであり、デフォルトパラメータを用いる。たとえば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 および Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402を参照のこと。

抗体の生物学的特徴
本発明の抗体は、ＥｒｂＢ３とそのリガンドニューレグリン−１（ＮＲＧ１）との間の相互作用を遮断する。本明細書に用いるように、「ＥｒｂＢ３とＮＲＧ１との間の相互作用を遮断する」という表現は、ＥｒｂＢ３とＮＲＧ１との間の物理的相互作用を検出および／または定量化することができるアッセイにおいて、本発明の抗体を添加するとＥｒｂＢ３とＮＲＧ１との間の相互作用が少なくとも５０％低減することを意味する。抗体がヒトＥｒｂＢ３とＮＲＧ１との間の相互作用を遮断するかどうかを決定するために用いることができる非限定的な例となるアッセイを、本明細書において実施例４に説明する。この実施例では、抗体をＥｒｂＢ３タンパク質と混合し、次いで抗体／ＥｒｂＢ３混合物をＮＲＧ１タンパク質でコーティングした表面に塗布する。非結合分子を洗浄した後、ＮＲＧ１コーティングした表面に結合したＥｒｂＢ３の量を測定する。このアッセイフォーマットでは様々な量の抗体を用いて、ＮＲＧ１に対するＥｒｂＢ３の結合の５０％を遮断するのに必要な抗体の量を算出し、ＩＣ₅₀値として表すことができる。本発明は、上記のようなＥｒｂＢ３／ＮＲＧ１結合アッセイ、または実質的に類似したアッセイにおいて試験したときに約６００未満ｐｍのＩＣ₅₀を示す抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。たとえば、本発明は、上記のようなＥｒｂＢ３／ＮＲＧ１結合アッセイ、または実質的に類似したアッセイにおいて試験したときに、約６００、５００、４００、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、１８、１６、１４、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐＭ未満のＩＣ₅₀を示す抗ＥｒｂＢ３抗体を含む

別法として、ＮＲＧ１誘発性細胞内シグナル伝達における変化を検出する細胞ベースのアッセイフォーマットを用いて、抗体がＥｒｂＢ３とＮＲＧ１との間の相互作用を遮断するかどうかを決定することができる。このタイプの例となるアッセイフォーマットを、本明細書において実施例６および８に説明する。これらの実施例では、さまざまな量の抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下でＮＲＧ１を用いて処置した後の、細胞中のキナーゼＡｋｔおよび／またはＥｒｂＢ３のリン酸化の程度を測定する。これらのアッセイフォーマットでは、抗ＥｒｂＢ３抗体の存在によって生じるＡｋｔおよび／またはＥｒｂＢ３リン酸化のパーセント阻害は、抗体がＥｒｂＢ３とＮＲＧ１との間の相互作用を遮断する程度の指標として役立つ。本発明は、上記のようなＡｋｔもしくはＥｒｂＢ３リン酸化アッセイ、または実質的に類似したアッセイにおいて試験したときに、ＡｋｔまたはＥｒｂＢ３リン酸化を少なくとも６０％阻害する抗体を含む。たとえば、本発明は、上記のようなＡｋｔもしくはＥｒｂＢ３リン酸化アッセイ、または実質的に類似したアッセイにおいて試験したときに、ＡｋｔまたはＥｒｂＢ３リン酸化を少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％阻害する抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。

また、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体は、以下の性質の１つまたはそれ以上を示す：（１）細胞表面で発現したＥｒｂＢ３の内部移行を誘導する能力（たとえば、本明細書における実施例５を参照のこと）；（２）単独で、またはＥＧＦＲ阻害と組み合わせたいずれかで、in vitroでＮＲＧ１刺激性腫瘍細胞増殖を阻害する能力（たとえば、本明細書における実施例７を参照のこと）；および（３）動物における腫瘍増殖を阻害する能力（たとえば、本明細書における実施例９を参照のこと）。

エピトープマッピングおよび関連技術
ＥｒｂＢ３タンパク質は、すべてのＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーメンバーと同様に、「ドメインＩ」、「ドメインＩＩ」、「ドメインＩＩＩ」および「ドメインＩＶ」と称する４つの細胞外ドメインを含む。ドメインＩは、配列番号：４９８のアミノ酸１〜１９０によって表されるアミノ酸の配列であり；ドメインＩＩは、配列番号：４９８のアミノ酸１９１〜３０８によって表されるアミノ酸の配列であり；ドメインＩＩＩは、配列番号：４９８のアミノ酸３０９〜４９９によって表されるアミノ酸の配列であり；そしてドメインＩＶは、配列番号：４９８のアミノ酸５００〜６２４によって表されるアミノ酸の配列である。

本発明は、ＥｒｂＢ３の細胞外ドメインのドメインＩＩＩ中に見られる１つまたはそれ以上のエピトープと相互作用する抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。エピトープは、ＥｒｂＢ３のドメインＩＩＩ中にある３またはそれ以上の（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の）アミノ酸の１つまたはそれ以上の隣接配列からなってもよい。あるいは、エピトープは、ＥｒｂＢ３のドメインＩＩＩ中にある複数の非隣接アミノ酸（または、アミノ酸配列）のからなってもよい。本発明の特定の実施態様によれば、配列番号：４９８のアミノ酸３４５−３６７、配列番号：４９８のアミノ酸４２３−４３９；および配列番号：４９８のアミノ酸４５１−４６３からなる群から選択される１つまたはそれ以上のドメインＩＩＩアミノ酸セグメント中にある１つまたはそれ以上のアミノと相互作用する抗ＥｒｂＢ３抗体が提供される。たとえば、本発明は、上記ドメインＩＩＩアミノ酸セグメントのそれぞれの中（すなわち、配列番号：４９８のアミノ酸３４５−３６７、４２３−４３９および４５１−４６３のそれぞれの中）の少なくとも１つのアミノ酸と相互作用する抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。

抗体がポリペプチドまたはタンパク質中の「１つまたはそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するためには、当業者に知られているさまざまな技術を用いることができる。例となる技術としては、たとえば、常用のクロスブロッキングアッセイ（cross-blocking assay）たとえば、Antibodies, Harlow and Lane（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY）に記述されたもの、アラニンスキャニンング突然変異解析（alanine scanning mutational analysis）、ペプチドブロット解析（peptide blots analysis）（Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463）、およびペプチド切断解析（peptide cleavage analysis）が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出および抗原の化学修飾のような方法を用いることができる（Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496）。抗体が相互作用するポリペプチド中のアミノ酸を同定するために用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。（たとえば、本明細書における実施例１１を参照のこと）。一般的には、水素／重水素交換方法は、興味のタンパク質を重水素標識し、続いて抗体を重水素標識タンパク質に結合することを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体によって保護された残基（これは重水素標識されたままである）以外のすべての残基で水素−重水素交換を起こさせる。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析にかけ、それによって抗体が相互作用する特異的アミノ酸に相当する重水素標識残基を明らかにする。たとえば、Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265Aを参照のこと。

本発明は、本明細書に記述された特定の例となる抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＥｒｂＢ３抗体（たとえば、Ｈ１Ｍ１８１９Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２１Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２４Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２７Ｎ、Ｈ１Ｍ１８２８Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２９Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３０Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３４Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３８Ｎ、Ｈ１Ｍ１９４０Ｎ、など）をさらに含む。同様に、本発明は、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ３フラグメントへの結合について、本明細書に記述された特定の例となる抗体のいずれかと競合する抗ＥｒｂＢ３抗体（たとえば、Ｈ１Ｍ１８１９Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２１Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２４Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２７Ｎ、Ｈ１Ｍ１８２８Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２９Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３０Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３４Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３８Ｎ、Ｈ１Ｍ１９４０Ｎ、など）も含む。

抗体が、参照抗ＥｒｂＢ３抗体と同じエピトープに結合するかどうか、またはそれとの結合について競合するかどうかは、当分野で知られている常法を用いることにより容易に決定することができる。たとえば、試験抗体が本発明の参照抗ＥｒｂＢ３抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するには、参照抗体を飽和条件下でＥｒｂＢ３タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、ＥｒｂＢ３分子に結合する試験抗体の能力を評価する。参照抗ＥｒｂＢ３抗体で飽和結合後、試験抗体がＥｒｂＢ３に結合することができる場合、試験抗体が参照抗ＥｒｂＢ３抗体とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。一方、参照抗ＥｒｂＢ３抗体で飽和結合後、試験抗体がＥｒｂＢ３に分子に結合することができない場合、試験抗体が本発明の参照抗ＥｒｂＢ３抗体によって結合されたエピトープと同じエピトープに結合している可能性がある。そこで、さらなる常用実験（たとえば、ペプチド変異および結合分析）を実施して、試験抗体の結合が観察されなかったのが実際に参照抗体と同じエピトープに結合したことによるものかどうか、または立体障害（または、別の現象）が、結合が観察されなかった原因であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリーまたは当分野で利用可能な他のなんらかの定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。本発明の特定の実施態様によれば、競合的結合アッセイで測定して、たとえば、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰の１つの抗体が、他の結合を少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％またはさらに９９％阻害する場合、２つの抗体は、同じ（またはオーバーラップ）エピトープに結合している（たとえば、Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502を参照のこと）。あるいは、１つの抗体の結合を低減または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると考えられる。１つの抗体の結合を低減または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は「オーバーラップエピトープ（overlapping epitopes）」を有すると考えられる。

抗体が結合について参照抗ＥｒｂＢ３抗体と競合するかどうかを決定するため、上記の結合方法論を２つの方針で実施する。第１の方針では、参照抗体を飽和条件下でＥｒｂＢ３分子に結合させた後、ＥｒｂＢ３分子に対する試験抗体の結合を評価する。第２の方針では、試験抗体を飽和条件下でＥｒｂＢ３分子に結合させた後、ＥｒｂＢ３分子に対する参照抗体の結合を評価する。いずれの方針でも、最初の（飽和）抗体のみがＥｒｂＢ３分子に結合可能である場合、試験抗体および参照抗体は、結合についてＥｒｂＢ３と競合すると結論づけられる。当業者に認められるように、結合について参照抗体と競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてもよいが、しかし、オーバーラップまたは隣接エピトープを結合することによって参照抗体の結合を立体的に妨害することもある。

ヒト抗体の調製
完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成する方法は、当分野で知られている。本発明の文脈では、任意のこのような知られている方法を用いてヒトＥｒｂＢ３に特異的に結合するヒト抗体を作ることができる。

VELOCIMMUNE^TM技術またはモノクローナル抗体を生成するための他のなんらかの知られ
ている方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＥｒｂＢ３に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。下の実験部分におけるように、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について抗体を特徴づけし、選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置換して本発明の完全ヒト抗体、たとえば野生型または修飾されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４を生成する。選択する定常領域は特定の使用に応じて変化してもよいが、高親和性の抗原結合性およびターゲット特異性の特徴は可変領域に存在する。

生物学的同等性
本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体および抗体フラグメントは、記述された抗体のものとは異なるが、ヒトＥｒｂＢ３を結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような変異抗体および抗体フラグメントは親配列と比較したときにアミノ酸の１つまたはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが、記述された抗体のもの本質的に同等の生物活性を示す。同様に、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較したときにヌクレオチドの１つまたはそれ以上の付加、欠失または置換を含むが、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等である抗ＥｒｂＢ３抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。このような変異アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上で議論されている。

２つの抗原結合性タンパク質または抗体は、たとえば、類似の実験条件下、単一用量または複数用量のいずれかで、同モル用量で投与したときに、それらが、それらの吸収の速度および程度において有意差を示さない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、生物学的に同等であると考えられる。いくつかの抗体は、それらがそれらの吸収の程度において同等であるが、それらの吸収速度ではそうではなくても、生物学的に同等であると考えてもよい場合、同等物または薬学的代替物であるとみなされることになり、その理由は、吸収速度におけるこのような違いが、意図的であり、かつ標識化において反映され、たとえば、慢性的使用において、有効な体の薬物濃度の達成に不可欠でなく、そして研究された特定の医薬品にとって医学的に重要でないと考えられるからである。

一実施態様において、２つの抗原結合性タンパク質は、それらの安全性、純度および効力において臨床的に意義のある違いがない場合、生物学的に同等である。

一実施態様において、２つの抗原結合性タンパク質は、患者が、参照生成物と生物学的生成物との間で１回またはそれ以上切り替えることができて、このようなスイッチングのない連続した療法と比較して、免疫原性における臨床的に有意な変化、または減少した有効性を含む、有害効果のリスクにおける予想された増加がない場合、生物学的に同等である。

一実施態様において、２つの抗原結合性タンパク質は、それらがいずれも、条件または使用条件に共通の機構または作用機構によって、このような機構が知られている範囲で作用する場合、生物学的に同等である。

生物学的同等性は、in vivoおよびin vitro方法によって示してもよい。生物学的同等性の計測としては、たとえば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度を、時間の関数として血液、血漿、血清または他の生液体中で測定するヒトまたは他の哺乳動物におけるin vivo試験；（ｂ）ヒトin vivo生物学的利用能データを関連づけて合理的に予測するin vitro試験；（ｃ）抗体（または、その標的）の適当な急性薬理学的作用を時間の関数として測定するヒトまたは他の哺乳動物におけるin vivo試験；および（ｄ）抗体の安全性、有効性または生物学的利用能または生物学的同等性を確立する管理良好の臨床試験が挙げられる。

本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体の生物学的に同等な変異体は、たとえば、残基もしくは配列のさまざまな置換を行うか、または生物活性に必要でない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることによって作製してもよい。たとえば、生物活性に必須でないシステイン残基は、欠失させるか、または他のアミノ酸と置換して再生時に不必要なもしくは間違った分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体は、抗体の糖鎖修飾の特徴を改良するアミノ酸変化、たとえば、糖鎖修飾を排除または除去する突然変異を含む抗ＥｒｂＢ３抗体変異体を含んでもよい。

種選択性および種交差反応性
本発明の特定の実施態様によれば、抗ＥｒｂＢ３抗体は、ヒトＥｒｂＢ３に結合するが、他の種からのＥｒｂＢ３には結合しない。また、本発明は、ヒトＥｒｂＢ３に結合し、かつ１つまたはそれ以上の非ヒト種からのＥｒｂＢ３に結合する抗ＥｒｂＢ３抗体を含む。たとえば、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体は、ヒトＥｒｂＢ３に結合してもよく、かつ、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＥｒｂＢ３の１つまたはそれ以上に結合してもよいし、または結合しなくてもよい。

免疫複合体
本発明は、サイトトキシン、化学療法薬、免疫抑制薬または放射性同位体のような治療部分に結合した抗ＥｒｂＢ３モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。細胞傷害性薬剤には、細胞に有害なあらゆる薬剤が含まれる。免疫複合体を形成するのに適した細胞傷害性薬剤および化学療法剤の例は、当分野で知られている（たとえば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと）。

多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってもよい。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープについて特異的であってもよいし、または１つを超える標的ポリペプチドについて特異的な抗原結合性ドメインを含んでもよい。たとえば、Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244を参照のこと。本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体は、別の機能
性分子、たとえば、別のペプチドまたはタンパク質に結合するか、またはそれと共に共発現することができる。たとえば、抗体またはそのフラグメントは、１つまたはそれ以上の他の分子単位、たとえば別の抗体または抗体フラグメントに機能的に結合して（たとえば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合またはその他によって）、第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を産生することができる。たとえば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームが、ヒトＥｒｂＢ３またはそのフラグメントについて特異的であり、かつこの免疫グロブリンの他のアームが第２の治療標的（たとえば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ４、ＶＥＧＦまたはＡｎｇ２）について特異的であるか、または治療部分に結合している二重特異性抗体を含む。

本発明の文脈で用いることができる例となる二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｃ_H３ドメインおよび第２のＩｇＣ_H３ドメインの使用を含み、ここで、第１および第２のＩｇＣ_H３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸によって互いに
異なり、そして少なくとも１つのアミノ酸の違いにより、アミノ酸の違いがない二重特異性抗体と比較してプロテインＡに対する二重特異性抗体の結合が低減される。一実施態様において、第１のＩｇＣ_H３ドメインはプロテインＡに結合し、第２のＩｇＣ_H３ドメインは、プロテインＡ結合を低減または消失させる突然変異、たとえばＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソンナンバリングによる；ＥUナンバリングによるＨ４３５Ｒ）を含む。第２のＣ_H３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含んでもよい。第２のＣ_H３中に見出されうるさらなる修飾としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）；そしてＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上述の二重特異性抗体フォーマットにおけるバリエーションは、本発明の範囲内に企図される。

治療製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、適した担体、賦形剤および改善された伝達、送達、耐性などをもたらす他の薬剤を用いて処方する。多くの適当な製剤は、すべての薬剤師に知られている処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PAに見出すことができる。これらの製剤としては、たとえば、散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー、ロウ、油、脂質、ベシクルを含む脂質（カチオン性またはアニオン性）（たとえばLIPOFECTIN^TM）、ＤＮＡコンジュゲート（DNA conjugates）、無水吸収ペースト剤、水中油型および油中水型乳剤、エマルジョンカーボワックス（emulsions carbowax）（さまざまな分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲルおよびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。また、Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311を参照のこと。

患者に投与する抗体の用量は、患者の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変化してもよい。好ましい用量は、典型的に体重または体表面積により算出される。本発明の抗体を成人患者におけるＥｒｂＢ３活性に関連する状態または疾患の治療に用いる場合、本発明の抗体を、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２〜約７、約０．０３〜約５、または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単一用量で静脈内に投与することは好都合でありうる。頻度および治療期間は、状態の重症度に応じて調整することができる。抗ＥｒｂＢ３抗体の投与に有効な投与量およびスケジュールは、経験的に決定してもよく、たとえば、患者の経過を定期的評価によってモニターし、それに応じて用量を調整することができる。さらに、投与量の種間スケーリングは、当分野でよく知られた方法を用いて実施することができる（たとえば、Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351）。

さまざまな送達システム、たとえば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現可能な組換え細胞、受容体介在性エンドサイトーシス（たとえば、Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照のこと）が、知られてお
り、本発明の医薬組成物の投与に用いることができる。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。組成物は、任意の都合のよい経路によって、たとえば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（たとえば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜、など）を通した吸収によって投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与してもよい。投与は全身または局所であることができる。

本発明の医薬組成物は、標準の針およびシリンジを用いて皮下または静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達における用途を容易に有する。このようなペン型送達デバイスは再使用可能または使い捨てであることができる。再使用可能なペン型送達デバイスは、一般に、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを用いる。カートリッジ内の医薬組成物をすべて投与してカートリッジが空になったら、空のカートリッジを直ちに捨てて医薬組成物を含む新たなカートリッジと交換することができる。その場合、ペン型送達デバイスは、再利用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスでは、交換可能なカートリッジがない。つまり、使い捨てのペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバー中に保持された医薬組成物で予め充填されている。リザーバーから医薬組成物が空になったら、デバイス全体を廃棄する。

多くの再使用可能なペンおよび自己注射器送達デバイスは、本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ほんの少し例を挙げれば、AUTOPEN^TM（Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK）、DISETRONIC^TMペン（Disetronic Medical Systems, Bergdorf, スイス）、HUMALOG MIX 75/25^TMペン、HUMALOG^TMペン、HUMALIN 70/30^TMペン（Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN）、NOVOPENTM I, II and III（Novo Nordisk, Copenhagen, デンマーク）、NOVOPEN JUNIOR^TM（Novo Nordisk, Copenhagen, デンマーク）、BD^TMペン（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM、およびOPTICLIK^TM（sanofi-aventis, Frankfurt, ドイツ）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てのペン型送達デバイスの例としては、ほんの少し例を挙げれば、SOLOSTAR^TMペン（sanofi-aventis）、FLEXPEN^TM（Novo Nordisk）、およびKWIKPEN^TM（Eli Lilly）、SURECLICK^TM自己注射器（Amgen, Thousand Oaks, CA）、PENLET^TM（Haselmeier, Stuttgart, ドイツ）、EPIPEN（Dey, L.P.）、およびHUMIRA^TMペン（Abbott Labs, Abbott Park IL）、が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

特定の状況では、医薬組成物を放出制御システムで送達することができる。一実施態様では、ポンプを用いてもよい（Langer, 前出; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201を参照のこと）。別の実施態様では、ポリマー物質を用いることができる；Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida参照。さらに別の実施態様では、放出制御システムを組成物の標的の近くに配置することができるため、全身用量の一部分しか必要としない（たとえば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138を参照のこと）。他の放出制御システムは、Langer, 1990, Science 249:1527-1533による総説に議論されている。

注射用製剤は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含んでもよい。これらの注射用製剤は、公知の方法によって製造してもよい。例として、注射用製剤は、たとえば、上記の抗体またはその塩を、注射に慣用的に用いられる滅菌水性媒体または油性媒体中に溶解、懸濁または乳化することによって製造してもよい。注射用の水性媒体としては、たとえば、生理食塩水、グルコースおよび他の補助剤を含有する等張性溶液、などがあり、これらを、適当な可溶化剤、たとえばアルコール（たとえば、エタノール）、ポリアルコール（たとえば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［たとえば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］、などと組み合わせて用いてもよい。油性媒体としては、たとえば、ゴマ油、ダイズ油、などが用いられ、これらを、可溶化剤、たとえば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール、などと組み合わせて用いてもよい。このように製造された注射剤は、適当なアンプル中に充填するのが好ましい。

上記の経口または非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量で剤形に製造することが有利である。単位用量のこのような剤形としては、たとえば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含まれる前述の抗体の量は、一般に単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇ；特に注射剤の形態では、前述の抗体を、約５〜約１００ｍｇ、他の剤形については、約１０〜約２５０ｍｇ含むことが好ましい。

抗体の治療上の使用
本発明の抗体は、とりわけ、ＥｒｂＢ３活性に関連するか、もしくはそれによって媒介されるか、またはＥｒｂＢ３とＥｒｂＢ３リガンド（たとえば、ＮＲＧ１）との間に相互作用を遮断することによって治療できるあらゆる疾患または障害の治療、予防および／または回復に有用である。本発明の抗体および抗原結合性フラグメントは、たとえば、脳および髄膜、中咽頭、肺および気管支樹、消化管、男性および女性生殖器系、筋肉、骨、皮膚および付属器、結合組織、脾臓、免疫系、造血細胞および骨髄、肝臓および尿路、ならびに眼のような特殊な感覚器官に生じる原発性および／または転移性腫瘍の治療に用いてもよい。特定の実施態様では、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントを、以下のがん：腎細胞がん、膵がん、乳がん、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん（たとえば、ＭＥＴ増幅（amplification）による胃がん）、悪性中
皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん（たとえば、ＥＧＦＲ依存性非小細胞肺がん）、滑膜肉腫、甲状腺がんまたは黒色腫の１つまたはそれ以上の治療に用いる。

また、本発明は、抗ＥＧＦＲまたは抗ＨＥＲ２療法に対して抵抗性であるか、または抵抗性となった腫瘍を治療する方法を提供する。たとえば、本発明は、（ａ）抗ＥＧＦＲ抗体（たとえば、セツキシマブ）、ＥＧＦＲの小分子阻害剤（たとえば、エルロチニブ）、抗ＨＥＲ２抗体（たとえばトラスツズマブ）、および／またはＨＥＲ２の小分子阻害剤の１つまたはそれ以上に対して抵抗性であるか、または抵抗性になった腫瘍を有する患者を確定すること；および（ｂ）本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体を、単独で、または抗ＥＧＦＲ抗体（たとえば、セツキシマブ）、ＥＧＦＲ（たとえば、エルロチニブ）の小分子阻害剤、抗ＨＥＲ２抗体（たとえばトラスツズマブ）および／もしくはＨＥＲ２の小分子阻害剤と組み合わせて患者に投与すること；を含む方法を含む。以下、併用療法をより詳細に議論する。

併用療法
本発明は、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体を少なくとも１つのさらなる治療活性成分と併用して投与することを含む治療投与レジメンを含む。このようなさらなる治療活性成分の非限定的な例としては、他のＥｒｂＢ３アンタゴニスト（たとえば、第２の抗ＥｒｂＢ３抗体またはＥｒｂＢ３の小分子阻害剤）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２のアンタゴニスト（たとえば、抗ＨＥＲ２抗体［たとえば、トラスツズマブ］またはＨＥＲ２活性の小分子阻害剤）、ＥｒｂＢ４のアンタゴニスト（たとえば、抗ＥｒｂＢ４抗体またはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のアンタゴニスト（たとえば、抗ＥＧＦＲ抗体［たとえば、セツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲ活性の小分子阻害剤［たとえば、エルロチニブまたはゲフィチニブ］）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（たとえば、ＥＧＦＲｖＩＩＩを特異的に結合する抗体）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（たとえば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、たとえば、ＵＳ７，０８７，４１１参照（本明細書においては「ＶＥＧＦ阻害性の融合タンパク質」とも称する）、抗ＶＥＧＦ抗体（たとえば、ビバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（たとえば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ）、または抗ＤＬＬ４抗体（たとえば、ＵＳ２００９／０１４２３５４に開示された抗Ｄｌｌ４抗体、たとえばＲＥＧＮ４２１）、など）が挙げられる。本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体と併用して有益に投与してもよい他の薬剤としては、小分子サイトカイン阻害剤およびサイトカイン、たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはそれらのそれぞれの受容体に結合する抗体を含む、サイトカイン阻害剤を含む。また、本発明は、本明細書に記載された抗ＥｒｂＢ３抗体のいずれかおよび１つまたはそれ以上のＶＥＧＦ、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲの阻害剤、または上記のサイトカインのいずれかを含む治療的併用を含み、ここで、阻害剤は、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ペプチボディ（peptibody）、ナノ抗体または抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；Ｆｄフラグメント；Ｆｖフラグメント；ｓｃＦｖ；ｄＡｂフラグメント；または、他の改変分子、たとえば二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特性抗体、ミニ抗体および最小限の認識ユニット）である。また、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体は、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイドおよび／またはＮＳＡＩＤと併用して投与してもよい。本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体は、放射線治療および／または従来の化学療法も含む治療レジメンの一部として投与してもよい。さらなる治療活性成分を、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体の投与の前に、同時に、または後に投与してもよい（本開示の目的では、このような投与レジメンは、本発明の治療活性成分「と併用した」抗ＥｒｂＢ３抗体の投与と考えられる）。

投与レジメン
本発明の特定の実施態様によれば、抗ＥｒｂＢ３抗体の複数用量（multiple doses）を、所定の時間経過にわたって対象に投与してもよい。本発明のこの態様による方法は、抗ＥｒｂＢ３抗体の複数用量を対象に順に投与することを含む。本明細書に用いるように、「順に投与する」とは、抗ＥｒｂＢ３抗体の各用量を、たとえば、予め定めた間隔（たとえば、時間、日、週あるいは月）をあけた異なる日の異なる時点で対象に投与することを意味する。本発明は、抗ＥｒｂＢ３抗体の１回の初期用量（initial dose）、続いて抗ＥｒｂＢ３抗体の１回またはそれ以上の二次用量（secondary dose）、場合により、続いて抗ＥｒｂＢ３抗体の１回またはそれ以上の三次用量（tertiary dose）を患者に順に投与することを含む方法を含む。

「初期用量」、「二次用量」および「三次用量」という用語は、抗ＥｒｂＢ３抗体の投与の時系列のことをいう。したがって、「初期用量」は、治療レジメンの開始時に投与する用量（「ベースライン用量」とも称する）であり、「二次用量」は、初期用量の後に投与する用量であり、そして「三次用量」は、二次用量の後に投与する用量である。初期、二次および三次用量は、すべて同量の抗ＥｒｂＢ３抗体を含んでもよいが、投与の頻度に関しては互いに異なってもよい。しかし、特定の実施態様において、初期、二次および／または三次用量に含まれる抗ＥｒｂＢ３抗体の量は、治療の経過中に互いに変動する（たとえば、必要に応じて上または下に調整する）。特定の実施態様では、２回またはそれ以上の（たとえば、２、３、４または５回）用量を「負荷量」として治療レジメンの開始時に投与し、続いてより少ない頻度で投与するその後の用量（たとえば、「維持量」）を投与する。

本発明の一例となる実施態様では、それぞれ二次および／または三次用量を、直前の用量の１〜２６（たとえば、１、１¹/₂、２、２¹/₂、３、３¹/₂、４、４¹/₂、５、５¹/₂、６、６¹/₂、７、７¹/₂、８、８¹/₂、９、９¹/₂、１０、１０¹/₂、１１、１１¹/₂、１２、１２¹/₂、１３、１３¹/₂、１４、１４¹/₂、１５、１５¹/₂、１６、１６¹/₂、１７、１７¹/₂、１８、１８¹/₂、１９、１９¹/₂、２０、２０¹/₂、２１、２１¹/₂、２２、２２¹/₂、２３、２３¹/₂、２４、２４¹/₂、２５、２５¹/₂、２６、２６¹/₂またはそれ以上）週後に投与する。本明細書に用いる「直前の用量」という成句は、一連の複数投与において、介在用量のない順序ですぐ次の用量の投与前に患者に投与する抗ＥｒｂＢ３抗体の用量を意味する。

本発明のこの態様による方法は、任意の回数の二次および／または三次用量の抗ＥｒｂＢ３抗体を患者に投与することを含んでもよい。たとえば、特定の実施態様では、１回の二次用量のみを患者に投与する。別の実施態様において、２回またはそれ以上の（たとえば、２、３、４、５、６、７、８回またはそれ以上の）二次用量を患者に投与する。同様に、特定の実施態様では、１回の三次用量のみを患者に投与する。別の実施態様において、２回またはそれ以上の（たとえば、２、３、４、５、６、７、８回またはそれ以上）三次用量を患者に投与する。

複数回の二次用量を含む実施態様では、それぞれの二次用量を他の二次用量と同じ頻度で投与してもよい。たとえば、それぞれの二次用量を、直前の用量の１〜２週後に患者に投与してもよい。同様に、複数回の三次用量を含む実施態様では、それぞれの三次用量を他の三次用量と同じ頻度で投与してもよい。たとえば、それぞれの三次用量を、直前の用量の２〜４週後に患者に投与してもよい。あるいは、二次および／または三次用量を患者に投与する頻度を、治療レジメンの経過にわたって変えることができる。また、投与の頻度を、臨床試験後に個々の患者の必要性に応じて医師による治療経過中に調整してもよい。

また、前述の投与レジメンの文脈では、本明細書に開示した例となる抗ＥｒｂＢ３抗体のいずれかを用いてもよい。

抗体の診断上の使用
また、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体を、たとえば、診断目的で、試料中のＥｒｂＢ３の検出および／または測定に用いてもよい。たとえば、抗ＥｒｂＢ３抗体またはそのフラグメントを用いてＥｒｂＢ３の異常発現（たとえば、過剰発現、過小発現、発現の欠如、など）を特徴とする状態または疾患を診断してもよい。ＥｒｂＢ３の例となる診断分析は、たとえば、患者から得た試料を、抗ＥｒｂＢ３抗体が検出可能な標識またはレポーター分子で標識化された本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体と接触させることを含んでもよい。別法として、非標識抗ＥｒｂＢ３抗体を、それ自体で検出可能に標識された二次抗体と併用して診断用途に用いることができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、放射性同位体、たとえば³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³⁵Ｓもしくは¹²⁵Ｉ；蛍光もしくは化学発光部分、たとえばフルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミン；または、酵素、たとえばアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼであることができる。試料中のＥｒｂＢ３を検出または測定するのに用いることができる具体例となるアッセイとしては、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が挙げられる。

本発明によるＥｒｂＢ３診断分析に用いることができる試料としては、正常または病理学的条件下で、検出可能な量のＥｒｂＢ３タンパク質またはそのフラグメントを含む、患者から入手可能な任意の組織または液体試料が挙げられる。一般に、健康な患者（たとえば、異常なＥｒｂＢ３レベルまたは活性に関連する疾患または状態を患っていない患者）から得られる特定の試料中のＥｒｂＢ３のレベルを測定して最初にベースラインまたは標準（ＥｒｂＢ３のレベル）を確立する。次いで、このＥｒｂＢ３のベースラインレベルを、ＥｒｂＢ３関連の疾患または状態を有することが疑われる個体から得た試料で測定したＥｒｂＢ３のレベルと比較することができる。

以下の実施例は、当業者に本発明の方法および組成物を製造および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために記載するが、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定しようとするものではない。使用した数（たとえば、量、温度、など）に関しては、正確さを確保するように努めたが、しかし、ある程度の実験的な誤差および偏差を考慮しなければならない。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の度であり、そして圧力は大気圧またはその近くである。

〔実施例１〕ヒトＥｒｂＢ３に対するヒト抗体の生成
ヒトＥｒｂＢ３の外部ドメインを含む免疫原を、免疫応答を刺激するアジュバントと共に、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むVELOCIMMUNE^(R)マウスに直接投与した。抗体免疫応答を、ＥｒｂＢ３特異的免疫測定法によってモニターした。所望の免疫応答が達成されたら、脾細胞を集め、マウス骨髄腫細胞を融合させてその生存能力を維持し、ハイブリドーマ細胞系を形成する。ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択してＥｒｂＢ３特異的抗体を産生する細胞系を同定した。この技術を用いて、いくつかの抗ＥｒｂＢ３キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常を備えた抗体）を得た。このように生成した例となる抗体を、以下のように表わした：Ｈ１Ｍ１８１９Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２１Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２４Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２７Ｎ、Ｈ１Ｍ１８２８Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２９Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３０Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３４Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３６Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３７Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３８Ｎ、およびＨ１Ｍ１９４０Ｎ。

また、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記述されたように、骨髄腫細胞への融合なしに、抗原陽性Ｂ細胞から抗ＥｒｂＢ３抗体を直接単離した。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＥｒｂＢ３抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを備えた抗体）を得た。このように生成した例となる抗体を、以下のように表わした：Ｈ４Ｈ２０８４Ｐ、Ｈ４Ｈ２０９２Ｐ、Ｈ４Ｈ２０９４Ｐ、Ｈ４Ｈ２０９８Ｐ、Ｈ４Ｈ２１０２Ｐ、Ｈ４Ｈ２１０８Ｐ、Ｈ４Ｈ２１１１Ｐ、Ｈ４Ｈ２１１４Ｐ、Ｈ４Ｈ２１３２Ｐ、Ｈ４Ｈ２１３８Ｐ、Ｈ４Ｈ２１４０Ｐ、Ｈ４Ｈ２１４３Ｐ、Ｈ４Ｈ２１４６Ｐ、Ｈ４Ｈ２１４７Ｐ、Ｈ４Ｈ２１４８Ｐ、Ｈ４Ｈ２１５１Ｐ、Ｈ４Ｈ２１５３Ｐ、Ｈ４Ｈ２１５４Ｐ、およびＨ４Ｈ２２９０Ｐ。

この実施例の方法に従って生成した例となる抗ＥｒｂＢ３抗体の特定の生物学的性質を下記の実施例で詳細に記述する。

〔実施例２〕重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列
表１に、選択された抗ＥｒｂＢ３抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列対ならびにそれらの対応する抗体識別子を記載する。

抗体は、典型的に本明細書では以下の命名法にしたがって参照する：Ｆｃ接頭辞（たとえば「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」）、の後に数値的識別子（たとえば、表１に示す「２０８４」）が続き、その後に「Ｐ」または「Ｎ」の接尾辞が続く。したがって、この命名法によれば、本明細書において、たとえば、「Ｈ４Ｈ２０８４Ｐ」ように抗体を参照してもよい。本明細書に用いる抗体表示におけるＨ４Ｈ、Ｈ１ＭおよびＨ２Ｍの接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。たとえば、「Ｈ２Ｍ」抗体がマウスＩｇＧ２Ｆｃを有するのに対して、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４Ｆｃを有する。当業者に認められるように、Ｈ１ＭまたはＨ２Ｍ抗体はＨ４Ｈ抗体に変換することができ、その逆も同じであるが、任意の事象において、表１に示す数値的識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は、同じままとなる。本明細書に用いる抗体表示におけるＰおよびＮの接尾辞は、同一のＣＤＲ配列を有するが、ＣＤＲ配列の外側に区分される領域における（すなわち、フレームワーク領域における）配列変化を伴う重鎖および軽鎖を有する抗体のことをいう。したがって、特定の抗体のＰおよびＮ変異体は、それらの重鎖および軽鎖可変領域内で同一のＣＤＲ配列を有するが、それらのフレームワーク領域内で互いに異なる。

以下の実施例で用いる対照構築物
以下の実験には、比較のために、さまざまな対照構築物（抗ＥｒｂＢ３抗体）が含まれた。対照構築物は、以下のように表わす：
対照Ｉ：ＵＳ７，８４６，４４０に記載された「Ｍａｂ＃６」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変ドメインを有するヒト抗ＥｒｂＢ３抗体；
対照ＩＩ：ＵＳ７，７０５，１３０に記載された「Ｕ１−５９」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変ドメインを有するヒト抗ＥｒｂＢ３抗体；および
対照ＩＩＩ：ＵＳ７，７０５，１３０に記載された「Ｕ１−５３」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変ドメインを有するヒト抗ＥｒｂＢ３抗体。

〔実施例３〕表面プラスモン共鳴から誘導されたヒトモノクローナル抗ＥｒｂＢ３の結合親和性および速度定数
ヒトモノクローナル抗ＥｒｂＢ３抗体の抗体結合親和性および速度定数を、２５℃および３７℃で表面プラスモン共鳴によって決定した（表２〜４）。測定は、Biacore 2000
またはT100機器において実施した。マウスＦｃ（接頭辞Ｈ１Ｍ；Ｈ２Ｍ）またはヒトＩｇＧ４Ｆｃ（接頭辞Ｈ４Ｈ）を用いて発現させた抗体を、抗マウスまたは抗ヒトＦｃセンサ表面（Ｍａｂキャプチャーフォーマット）上で捕捉し、可溶性単量体（ＥｒｂＢ３．ｍｍｈ；配列番号：４９７）または二量体（ＥｒｂＢ３−ｈＦｃ；配列番号：４９８またはＥｒｂＢ３−ｍＦｃ；配列番号：４９９）タンパク質を表面に注射した。動的結合（kinetic association）（ｋ_a）および解離（dissociation）（ｋ_d）速度定数（rate constants）は、スクラバー２．０曲線適合ソフトウェアを用いて、データを処理して１：１結合モデルに適合させることによって決定した。結合解離平衡定数（Ｋ_D）および解離半減期（ｔ_1/2）は、以下のように動的速度定数から算出した：Ｋ_D（Ｍ）＝ｋ_d／ｋ_a；およびｔ_1/2（分）＝、（ｌｎ２／（６０^*ｋ_d）。いくつかのクローンは、単量体（ｈＥｒｂＢ３．ｍｍｈ）ＥｒｂＢ３タンパク質に対してナノモル以下の親和性を示した。

表２〜４に示すように、本実施例で試験した例となる抗体の多くは、試験した対照抗体の結合親和性よりも優れたまたは同等の、ＥｒｂＢ３に結合する高い親和性を示した。注目すべきことに、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体のいくつかは、単量体（ｈＥｒｂＢ３．ｍｍｈ）ＥｒｂＢ３タンパク質に対してナノモル以下の親和性を示した。

〔実施例４〕抗ＥｒｂＢ３抗体は、ヒトＥｒｂＢ３にニューレグリン１ｂ結合を遮断する
さらに本発明の抗ｈＥｒｂＢ３ｍＡｂを特徴づけるため、リガンド結合を遮断するそれらの能力をＥＬＩＳＡにより試験した。プレートをニューレグリン１ｂ（１μｇ／ｍｌ）で一夜コートし、次いで、抗体（０〜５０ｎＭ）を、５０ｐＭ ＥｒｂＢ３−ｈＦｃ（配
列番号：４９８；ハイブリドーマ用）または５０ｐＭ ＥｒｂＢ３−ｍＦｃ（配列番号：
４９９；ｈＩｇＧ４抗体用）のいずれかと共にインキュベートし（１時間、２５℃）、次いで、コーティングしたプレートに加え、２５℃でさらに１時間インキュベートするにまかせた。プレートを洗浄し、非隔絶（non-sequestered）（プレート結合した）ＥｒｂＢ
３を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗Ｆｃポリで検出した。プレートをＴＭＢ（３,３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）で展開し、硫酸で中和した後、Victor X5プレートリーダー上４５０ｎｍで吸光度を読み取った。データ分析は、Prismソフトウェア内のシグモイド型用量反応モデルを用いた。算出されたＩＣ₅₀値は、最大遮断を達成するのに必要な抗体濃度の５０％として定義され、効力を遮断する指標として用いた。各抗体の最大遮断は、阻害曲線上のゼロから５０ｎＭ抗体までの吸光度の差を、用量曲線上の５０ｐｍからゼロＥｒｂＢ３までの吸光度の差によって割ることによって算出した。結果を表５および６に示す。

表５および６に示すように、本発明のいくつかの抗ＥｒｂＢ３抗体は、強力な遮断を示し、アッセイの理論的最低値（２５ｐｍ）となるＩＣ₅₀値を有した。

〔実施例５〕抗ＥｒｂＢ３ｍＡｂは、細胞表面ＥｒｂＢ３を効果的に内部移行する
抗ＥｒｂＢ３ｍＡｂが細胞表面結合したＥｒｂＢ３を効果的に内部移行するかどうかを決定するため、ＭＣＦ−７細胞を選択抗ＥｒｂＢ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）と共に氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、次いで氷上で３０分間、Dylight 488結合抗ヒトＦ
ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）で染色した。次いでチューブを洗浄し、氷上と３７℃のインキュベーションとの間は、１時間離した。インキュベーション後、すべてのチューブを氷上に置き、Dylight 488クエンチング抗体（５０μｇ／ｍｌ）を加えた。溶液を氷上でさらに
１時間インキュベートした。蛍光シグナルは、Accuri流量血球計算器を用いて測定した。

抗体結合およびその後の３７℃でのインキュベーションにより内部移行したＥｒｂＢ３の相対的尺度として、内部移行した平均蛍光強度（ＭＦＩ）を以下のように算出した：

ＱＥ（クエンチング効率）の算出は、内部移行が４℃で起こらないと仮定する。表７は、試験したすべての抗体がＨＥＲ３内部移行を誘発することを示す。

〔実施例６〕抗ＥｒｂＢ３抗体によるＮＲＧ１依存性Ａｋｔリン酸化の阻害
抗ＥｒｂＢ３抗体を、ＤＵ１４５前立腺がん細胞中のＡｋｔのリン酸化を阻害するそれらの能力について試験した。ＥｒｂＢ３に対するＮＲＧ１の結合は、ＥｒｂＢ３リン酸化を生じ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）の漸増および活性化を導く。活性化されたＰＩ３−ＫはキナーゼＡｋｔをリン酸化し、活性化する。したがって、Ａｋｔリン酸化は、ＥｒｂＢ３受容体活性化の下流マーカーである。ＤＵ１４５細胞を９６ウェルプレートに接種し、１％ＦＢＳを含有する培地中で一夜、血清不足にした。次いで、０．５μｇ／ｍｌのヒトＦｃ対照タンパク質または０．０１、０．１もしくは０．５μｇ／ｍｌの濃度のさまざまな抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下で３０分間、細胞を０．５ｎＭ ＮＲＧ１（R&D Systems）で刺激した。抗体の各濃度を３回試験した。細胞を溶解し、ホスホＡｋｔ細胞ベースのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用い、製造元の説明書にしたがって、リン酸化されたＡｋｔの相対レベルを決定した。各抗ＥｒｂＢ３抗体対Ｆｃ対照基についてのＡｋｔリン酸化の平均パーセント阻害を表８に示す。

本実施例は、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体のいくつかがＡｋｔリン酸化において対照抗ＥｒｂＢ３抗体よりも強力な遮断を示すことを説明している。たとえば、抗体Ｈ１Ｍ１８１９Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２１Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２４Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２７Ｎ、Ｈ１Ｍ１８２８Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２９Ｎ、Ｈ２Ｍ１９３０ＮおよびＨ２Ｍ１９３８Ｎは、０．１μｇ／ｍｌの用量でＡｋｔリン酸化を少なくとも６０％阻害するのに対して、その用量で４６％を超える阻害を達成した対照ＥｒｂＢ３抗体はなかった。

〔実施例７〕抗ＥｒｂＢ３抗体による腫瘍細胞増殖の阻害
選択抗ＥｒｂＢ３抗体を、ＥＧＦＲ遮断剤と併用して用いたときのＡ４３１表皮がん細胞の成長を阻害するそれらの能力について試験した。９６ウェルプレート中のＡ４３１細胞を、０．５％ＦＢＳを含有する培地中でインキュベートし、抗ＥＧＦＲ抗体（１μｇ／ｍｌ）、抗ＥｒｂＢ３抗体（１μｇ／ｍｌ）または抗ＥＧＦＲ（１μｇ／ｍｌ）＋抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下、０．０５、０．２５または１．０μｇ／ｍｌで１ｎＭニューレグリン−１（ＮＲＧ１）により刺激した。リガンド（ＮＲＧ１）および遮断抗体（ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ３）を、７２時間実験中０、２４および４８時間で加えた。処置開始から７２時間の時点までに達成された生細胞数における相対変化を、標準的な方法（Cell Proliferation Assay Kit; Promega）を用いて決定した。各抗ＥｒｂＢ３抗体対アイソタイプ対照群についての細胞増殖における平均パーセント減少を表９に示す。

本実施例は、本発明の抗ＥｒｂＢ３抗体のいくつかが、Ａ４３１細胞増殖において対照抗ＥｒｂＢ３抗体より強力な阻害を示したことを説明している。たとえば、抗体Ｈ１Ｍ１８１９Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２１Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２４Ｎ、Ｈ２Ｍ１８２７Ｎ、Ｈ１Ｍ１８２８ＮおよびＨ２Ｍ１８２９Ｎは、抗ＥＧＦＲ抗体と併用したとき、０．２５μｇ／ｍｌの用量で細胞増殖を少なくとも６０％阻害したのに対して、対照抗体ＩおよびＩＩＩは、それぞれ、これらの実験条件下で細胞増殖を３７％および２１％しか阻害しなかった。

〔実施例８〕抗ＥｒｂＢ３抗体によるＥｒｂＢ３およびＡｋｔリン酸化の阻害
選択抗ＥｒｂＢ３抗体を、Ａ４３１類表皮がんおよびＭＣＦ７乳がん細胞におけるＥｒｂＢ３およびＡｋｔのＮＲＧ１刺激性リン酸化を阻害するその能力について試験した。第１の実験では、Ａ４３１細胞を６ウェルプレートに播種し、完全培地中で一夜インキュベートした。次いで、細胞を１時間血清不足（０．５％ＦＢＳ）にし、５．０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照または０．０５、０．２５もしくは５．０μｇ／ｍｌの抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下で１ｎＭ ＮＲＧ１（R&D Systems）を用いて３０分間刺激した。細胞を溶解し、ＥｒｂＢ３およびＡｋｔに対する抗体ならびにそれらのリン酸化形態を用い、標準方法を用いてウェスタンブロットを実施した。全ＥｒｂＢ３またはＡｋｔに対するリン酸化されたＥｒｂＢ３またはＡｋｔの比率を算出し、これを用いてアイソタイプ対照と比較した抗ＥｒｂＢ３抗体のそれぞれについてのＡｋｔまたはＥｒｂＢ３リン酸化のパーセント阻害を決定した。Ａ４３１細胞におけるＥｒｂＢ３またはＡＫＴリン酸化の阻害についての結果を、それぞれ表１０および１１に示す。

類似の実験において、ＭＣＦ７細胞を６ウェルプレート中に播種し、完全培地中で２日間インキュベートした。次いで、細胞を１時間血清不足（serum-starved）（０．５％ＦＢＳ）にし、次いで、５．０μｇ／ｍｌのアイソタイプ対照または０．０５、０．２５、１．０もしくは５．０μｇ／ｍｌの抗ＥｒｂＢ３抗体の存在下で１ｎＭ ＮＲＧ１（R&D Systems）を用いて３０分間刺激した。Ａ４３１細胞を用いて実施したそれらの実験と同様のやり方でウェスタンブロットおよびデータ分析を実施した。ＭＣＦ７細胞におけるＥｒｂＢ３またはＡＫＴリン酸化の阻害について結果を、それぞれ表１２および１３に示す。

本実施例は、本発明の代表的な抗ＥｒｂＢ３抗体が、試験したほとんどの実験条件下で対照抗体と比較して、ＥｒｂＢ３およびＡｋｔのリン酸化を阻害する優れた能力を示したことを説明している。Ａ４３１細胞では、たとえば、Ｈ４Ｈ１８１９ＮおよびＨ４Ｈ１８２１Ｎは、０．２５μｇ／ｍｌでＥｒｂＢ３およびＡｋｔリン酸化を完全に阻害したのに対して、対照抗体は５．０μｇ／ｍｌでも完全阻害を達成することができなかった。同様に、ＭＣＦ７細胞では、１．０μｇ／ｍｌのＨ４Ｈ１８１９ＮおよびＨ４Ｈ１８２１Ｎは、５．０μｇ／ｍｌの対照抗ＥｒｂＢ３抗体のいずれかよりも大幅にＥｒｂＢ３およびＡｋｔリン酸化を阻害した。

〔実施例９〕抗ＥｒｂＢ３抗体による腫瘍増殖の阻害
選択抗ＥｒｂＢ３抗体を、免疫不全マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻害するその能力について試験した。簡潔には、１〜５×１０⁶のＡ４３１ヒト表皮がん細胞またはＡ５４９ヒト非小細胞肺がん細胞（ＡＴＣＣ）を、６〜８週齢ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下移植した（Taconic, Hudson, NY）。腫瘍が１００〜１５０ｍｍ³の平均体積に達した後、マウスを処置のため群（ｎ＝１群につき６匹のマウス）に無作為化した。第１の実験では、Ａ４３１腫瘍を有するマウスに、ヒトＦｃ（配列番号：５００、１２．５ｍｇ／ｋｇ）、または抗ＥｒｂＢ３抗体（０．５または１２．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。すべての抗体は、週２回の皮下注射により約３週間投与した。腫瘍体積を、実験経過の間、週２回測定し、実験の終わりに腫瘍を切除して腫瘍重量を決定した。Ｆｃ処置群と比較した平均腫瘍寸法の他に最終的な腫瘍重量を各群について算出した。
結果を表１４にまとめる。

類似の実験では、ヒトＩｇＧ４フォーマットにおいて選択された抗体を用いて、類似の結果を得、表１５にまとめた。

類似の実験において、Ａ５４９腫瘍異種移植片の増殖におけるさまざまな抗ＥｒｂＢ３抗体の効果を決定し、表１６にまとめた。

本実施例で示すように、抗体Ｈ４Ｈ１８１９ＮおよびＨ４Ｈ１８２１Ｎは、それぞれ、in vivo腫瘍増殖を、試験した対照抗ＥｒｂＢ３抗体の投与で観察された腫瘍増殖阻害の程度よりも優れた、または同等の程度まで有意に阻害した。

〔実施例１０〕他のＥｒｂＢファミリーメンバーを遮断する薬剤と併用した抗ＥｒｂＢ３抗体による腫瘍増殖の阻害
ヒト腫瘍異種移植片増殖におけるＨ４Ｈ１８２１Ｎ＋阻害性抗ＥＧＦＲ抗体（「抗ＥＧＦＲｍＡｂ」）との併用治療の効果を試験した。簡潔には、２×１０⁶のＦａＤｕヒト下
咽頭がん細胞（ＡＴＣＣ）を、６〜８週齢ＳＣＩＤマウス（Taconic, Hudson,NY）の側腹部に皮下移植した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ³の平均体積に達した後、マウスを、処置のための群（ｎ＝１群につき６匹のマウス）に無作為化した。マウスに、ヒトＦｃ対照タンパク質（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ４Ｈ１８２１Ｎ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＥＧＦＲｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＨ４Ｈ１８２１Ｎ＋抗ＥＧＦＲｍＡｂ（２．５＋１０ｍｇ／ｋｇ）の組合せを投与した。すべての抗体は、週２回皮下注射により投与した。腫瘍体積を、実験経過の間、週２回測定し、実験の終わりに腫瘍を切除して腫瘍重量を決定した。処置開始からの腫瘍増殖の平均（平均値＋／−標準偏差）および腫瘍重量を、各処置群について算出した。腫瘍増殖および腫瘍重量のパーセント減少をＦｃ対照基との比較から算出した。結果を表１７に示す。

類似の実験では、ヒト腫瘍異種移植片増殖において、Carter el al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992)に記述された阻害性抗ＨＥＲ２抗体クローン４Ｄ５ｖ８およびＨ４Ｈ１８２１Ｎを用いた併用処置の効果を試験した。簡潔には、１×１０⁷ＢＴ４７４のヒト乳がん細胞（ＡＴＣＣ）を、６〜８週齢ＮＣＲヌードマウス（Taconic, Hudson, NY）の側腹部に皮下移植した。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ³の平均体積に達した後、マウスを、処置のため群（ｎ＝１群につき５匹のマウス）に無作為化した。マウスに、ヒトＦｃ対照タンパク質（２５ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ４Ｈ１８２１Ｎ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、４Ｄ５ｖ８（１２．５ｍｇ／ｋｇ）またはＨ４Ｈ１８２１Ｎ＋４Ｄ５ｖ８（１２．５＋１２．５ｍｇ／ｋｇ）の組合せを投与した。すべての抗体は、週２回皮下注射により投与した。腫瘍体積を、実験経過の間、週２回測定した。処置開始からの平均（平均値＋／−標準偏差）腫瘍増殖を、各治療群について算出した。腫瘍増殖のパーセント減少を、Ｆｃ対照群との比較から算出した。結果を表１８に示す。

本実施例は、Ｈ４Ｈ１８２１Ｎおよび抗ＥＧＦＲまたは抗ＨＥＲ２抗体の併用処置が、単一薬剤処置よりも、より強力な腫瘍増殖の阻害を提供することを説明している。ＦａＤｕおよびＢＴ４７４バーツの腫瘍異種移植片では、いずれも、併用治療により平均腫瘍寸法が縮小（腫瘍退縮）したが、単一薬剤ではそうならなかった。

〔実施例１１〕Ｈ／Ｄ交換によるＥｒｂＢ３に対するＨ４Ｈ１８２１Ｎ結合のエピトープマッピング
Ｈ４Ｈ１８２１Ｎが相互作用するＥｒｂＢ３のアミノ酸残基を決定するために実験を行った。この目的のために、Ｈ／Ｄ交換エピトープマッピングを実施した。Ｈ／Ｄ交換方法の一般的な説明は、たとえば、Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259；およびEngen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265Aに記載されている。

Ｈ／Ｄ交換によりＥｒｂＢ３における抗体Ｈ４Ｈ１８２１Ｎの結合エピトープをマップするため、Ｃ末端ｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジン標識（「ｈＥｒｂＢ３−ｍｍＨ」）付きのｈＥｒｂＢ３（配列番号：４９８のアミノ酸１−６１３）の細胞外ドメインからなる組換え構築物を用いた。最初に、ｈＥｒｂＢ３−ｍｍＨを、天然条件下でPNGase F（New England BioLabs）により脱グリコシルした。抗体Ｈ４Ｈ１８２１ＮをＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）アガロースビーズ（GE Lifescience）に共有結合で取り付けた。

「オン−溶液／オフ−ビーズ（on-solution/off-beads）」実験（溶液中のオン−交換（on-exchange）に続いてビーズ上でオフ−交換（off-exchange））、リガンド（脱グリコシル化ｈＥｒｂＢ３−ｍｍＨ）を、Ｄ₂Ｏで調製したＰＢＳ緩衝液中で５分または１０分間、重水素化し、次いで、２分のインキュベーションを通してＨ４Ｈ１８２１Ｎビーズに結合させた。ＥｒｂＢ３結合したビーズを、ＰＢＳ水性緩衝液（Ｈ₂Ｏで調製した）で
洗浄し、オン−交換時間の半分の間、ＰＢＳ緩衝液中でインキュベートした。オフ−交換後、結合したＥｒｂＢ３を、低ｐＨの氷冷ＴＦＡ溶液を用いてビーズから溶離した。溶離したＥｒｂＢ３を、次いで固定化ペプシン（Thermo Scientific）で５分間消化した。得られたペプチドを、ＺｉｐＴｉｐ^(R)クロマトグラフィーピペットチップを用いて脱塩し、UltrafleXtremeマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）によって直ちに分析した。

「オン−ビーズ／オフ−ビーズ（on-beads/off-beads）」実験（ビーズ上のオン−交換に続いてビーズ上のオフ−交換）では、ＥｒｂＢ３を最初にＨ４Ｈ１８２１Ｎビーズに結合し、次いで、オン−交換のためＤ₂Ｏ中で５分または１０分間インキュベートした。以
下のステップ（オフ−交換、ペプシン消化およびＭＳ分析）は、「オン−溶液／オフ−ビーズ」手順について記述したとおり実施した。検出されたすべてのペプチドの重心値（centroid values）または平均質量電荷比（ｍ／ｚ）を算出し、これらの２セットの実験間で比較した。

結果を表１９にまとめる。これは、Ｈ／Ｄ交換およびペプシン消化手順後に液体クロマトグラフィー−マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＬＣ−ＭＡＬＤＩ）ＭＳによって確認されたすべての検出ペプチドについての重心ｍ／ｚ値の比較を提供する。観察された消化ペプチドの大部分では、オン−溶液／オフ−ビーズおよびオン−ビーズ／オフ−ビーズ実験の両方について、類似した重心値を得たが、ＥｒｂＢ３（配列番号：４９８）の細胞外ドメインの残基３４５−３６７、４２３−４３９および４５１−４６３に対応する３つのセグメントは、「５分オン−／２．５分オフ−交換」実験（実験Ｉ）および「１０分オン−／５分オフ−交換」実験（実験ＩＩ）の両方において、０．２０ｍ／ｚより大きいまたはそれと等しいデルタ重心値（Δ）を有した。本実施例の目的では、両方の実験において少なくとも０．２０ｍ／ｚのプラスの差（Δ）は、抗体結合によって保護されたアミノ酸を示す。この基準を満たすセグメントは、表１９において太字テキストおよびアスタリスク（^*）によって示す。

表１９にまとめたＨ／Ｄ交換結果は、配列番号：４９８のアミノ酸３４５−３６７、４２３−４３９および４５１−４６３に対応する３つの領域が、オン−交換後のＥｒｂＢ３に対するＨ４Ｈ１８２１Ｎ結合によって完全なオフ−交換から保護されることを示している。重要なことに、３つのすべての領域は、ＥｒｂＢ３細胞外ドメインのドメインＩＩＩ内にある。したがって、本実施例は、抗体Ｈ４Ｈ１８２１Ｎが、これらの３つのアミノ酸セグメントからなるヒトＥｒｂＢ３細胞外ドメインのドメインＩＩＩ内の不連続エピトープに結合するか、または、そうでない場合、（たとえば、抗体結合による立体配置的変化またはアロステリズム効果を介して）これらの残基をＨ／Ｄ交換から保護することになることを示唆している。

〔実施例１２〕進行結腸直腸がん（ＣＲＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または頭頸部がん（ＳＣＣＨＮ）を有する患者におけるエルロチニブまたはセツキシマブと併用した抗ＥｒｂＢ３抗体の臨床試験
進行結腸直腸がん（ＣＲＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）または頭頸部がん（ＳＣＣＨＮ）を有する患者において例となる抗ＥｒｂＢ３抗体Ｈ４Ｈ１８２１Ｎを用いて臨床試験を行う。試験を、二相：用量漸増相および安全性拡張相（safety expansion phase）に分ける。用量漸増相では、すべての患者に、最初にＨ４Ｈ１８２１Ｎを３、１０または２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に（ＩＶ）投与する。Ｈ４Ｈ１８２１Ｎの初期用量の後、治療レジメンは、がんタイプに基づいて変更する。ＮＳＣＬＣ患者では、１日１回１５０ｍｇのエルロチニブを、１４日毎に１回、３、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＩＶのＨ４Ｈ１８２１Ｎと併用したレジメンを開始し；ＣＲＣおよびＳＣＣＨＮ患者では、週１回ＩＶセツキシマブ２５０ｍｇ／ｍ２を１４日毎に１回、３、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＩＶのＨ４Ｈ１８２１Ｎと併用したレジメンを開始する。安全性拡張相では、ＮＳＣＬＣ患者は、１４日毎に１回のＩＶのＨ４Ｈ１８２１Ｎ（推奨された第２相の用量）を１日１回１５０ｍｇのエルロチニブと併用して受け；ＣＲＣおよびＳＣＣＨＮ患者は、１４日毎に１回、ＩＶのＨ４Ｈ１８２１Ｎ（推奨された第２相の用量で）を週１回ＩＶセツキシマブ２５０ｍｇ／ｍ²と併用して受ける。

抗ＥｒｂＢ３抗体Ｈ４Ｈ１８２１Ｎおよびエルロチニブまたはセツキシマブを含む併用療法は、ＮＳＣＬＣ、ＣＲＣおよび／またはＳＣＣＨＮを有する患者においてエルロチニブまたはセツキシマブ単独による単剤治療よりも大幅に観察可能な臨床的な改善をもたらすことが期待される。

本発明は、本明細書に記述した特定の実施態様によって範囲を限定されることはない。実際に、本明細書に記述したものに加えて本発明のさまざまな変更は、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになる。このような変更は添付の特許請求項の範囲内に帰属するものとする。

Claims (20)

1. 腫瘍を患った対象における腫瘍増殖を阻害するための医薬の製造における、ＥｒｂＢ３を特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用であって、
   該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号３０６／３１４及び３２２／３３０から選択される重鎖可変領域／軽鎖可変領域のアミノ酸配列対の相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、そして、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、水素／重水素交換によって決定したように、配列番号：４９８のアミノ酸３４５−３６７、配列番号：４９８のアミノ酸４２３−４３９；および配列番号：４９８のアミノ酸４５１−４６３と相互作用し、かつ２５℃でＥＬＩＳＡにおいて３０ｐＭ未満のＩＣ50でＥｒｂＢ３に対するＮＲＧ１の結合を遮断する、単離された抗体または抗原結合性フラグメントである、
   上記使用。
2. 腫瘍を患った対象における腫瘍増殖を阻害するための医薬の製造における、ＥｒｂＢ３を特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用であって、
   該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それぞれ、配列番号：３０８、３１０、３１２、３１６、３１８及び３２０；並びに３２４、３２６、３２８、３３２、３３４及び３３６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ドメインを含み、かつ２５℃でＥＬＩＳＡにおいて３０ｐＭ未満のＩＣ50でＥｒｂＢ３に対するＮＲＧ１の結合を遮断する、
   上記使用。
3. 該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それぞれ、配列番号：３２４、３２６、３２８、３３２、３３４及び３３６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項２に記載の使用。
4. 腫瘍を患った対象における腫瘍増殖を阻害するための医薬の製造における、ＥｒｂＢ３を特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用であって、
   該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号：３０６／３１４、および３２２／３３０からなる群から選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含み、かつ２５℃でＥＬＩＳＡにおいて３０ｐＭ未満のＩＣ50でＥｒｂＢ３に対するＮＲＧ１の結合を遮断する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである、
   上記使用。
5. 該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号：３２２のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ、および配列番号：３３０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項４に記載の使用。
6. 腫瘍が、腎腫瘍、膵腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、および皮膚腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 医薬が、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである第２の治療剤と組み合わせる使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. ＥｒｂＢ３を特異的に結合する抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号：２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３７０／３７８、３８６／３９４、４０２／４１０、４１８／４２６、４３４／４４２、４５０／４５８、４６６／４７４および４８２／４９０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体または抗原結合性フラグメントである、請求項７に記載の使用。
9. 第２の治療剤が、ＥＧＦＲを特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項７に記載の使用。
10. 第２の治療剤が、ＨＥＲ２を特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項７に記載の使用。
11. ＥｒｂＢ３を特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、腫瘍を患った対象における腫瘍増殖を阻害するための医薬組成物であって、
    該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号３０６／３１４及び３２２／３３０から選択される重鎖可変領域／軽鎖可変領域のアミノ酸配列対の相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、そして、該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、水素／重水素交換によって決定したように、配列番号：４９８のアミノ酸３４５−３６７、配列番号：４９８のアミノ酸４２３−４３９；および配列番号：４９８のアミノ酸４５１−４６３と相互作用し、かつ２５℃でＥＬＩＳＡにおいて３０ｐＭ未満のＩＣ50でＥｒｂＢ３に対するＮＲＧ１の結合を遮断する、単離された抗体または抗原結合性フラグメントである、
    上記組成物。
12. ＥｒｂＢ３を特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、腫瘍を患った対象における腫瘍増殖を阻害するための医薬組成物であって、
    該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それぞれ、配列番号：３０８、３１０、３１２、３１６、３１８及び３２０；並びに３２４、３２６、３２８、３３２、３３４及び３３６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ドメインを含み、かつ２５℃でＥＬＩＳＡにおいて３０ｐＭ未満のＩＣ50でＥｒｂＢ３に対するＮＲＧ１の結合を遮断する、
    上記組成物。
13. 該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、それぞれ、配列番号：３２４、３２６、３２８、３３２、３３４及び３３６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１２に記載の組成物。
14. ＥｒｂＢ３を特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む、腫瘍を患った対象における腫瘍増殖を阻害するための医薬組成物であって、
    該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号：３０６／３１４、および３２２／３３０からなる群から選択されたＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含み、かつ２５℃でＥＬＩＳＡにおいて３０ｐＭ未満のＩＣ50でＥｒｂＢ３に対するＮＲＧ１の結合を遮断する、
    単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントである、
    上記組成物。
15. 該抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号：３２２のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ、および配列番号：３３０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１４に記載の組成物。
16. 腫瘍が、腎腫瘍、膵腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、および皮膚腫瘍からなる群から選択される、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２を特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである第２の治療剤と組み合わせて使用するための、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. ＥｒｂＢ３を特異的に結合する抗体または抗原結合性フラグメントが、配列番号：２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、３３８／３４６、３５４／３６２、３７０／３７８、３８６／３９４、４０２／４１０、４１８／４２６、４３４／４４２、４５０／４５８、４６６／４７４および４８２／４９０からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む抗体または抗原結合性フラグメントである、請求項１７に記載の組成物。
19. 第２の治療剤が、ＥＧＦＲを特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１７に記載の組成物。
20. 第２の治療剤が、ＨＥＲ２を特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントである、請求項１７に記載の組成物。