ES2816624T3 - Anticuerpos que se unen a EGFR y ERBB3 - Google Patents

Anticuerpos que se unen a EGFR y ERBB3 Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable con un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo dominio variable con un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de NNAIN (SEQ ID NO: 18), WINTITGDPTYAQGFTG (SEQ ID NO: 20) y EEFLEWLFFDY (SEQ ID NO: 22) respectivamente, o una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 NNAIN (SEQ ID NO: 18), WINTITGDPTYAQGFTG (SEQ ID NO: 20) y EEFLEWLFFDY (SEQ ID NO: 22) y dicho segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91) y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92) respectivamente o una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91) y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92), y en donde dicho primer y segundo dominios variables comprenden una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos que se unen a EGFR y ERBB3
La invención se refiere al campo de los anticuerpos. En particular, se refiere al campo de los anticuerpos terapéuticos (humanos) para el tratamiento de enfermedades que involucran células aberrantes. Más en particular, se refiere a anticuerpos que se unen a EGFR y ErbB-3 y su uso en la unión de células positivas para EGFR y ErbB-3, particularmente células tumorales.
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGFR) es el receptor prototipo de la superficie celular para los miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (familia EGF) de ligandos proteicos extracelulares. El EGFR también se conoce como receptor ErbB-1. El receptor ha recibido varios nombres en el pasado (EGFR; ERBB; ERBB1; HER1; PIG61; mENA). En la presente invención, los nombres ErbB-1, EGFR o HER1 en humanos se usarán indistintamente. El EGFR es un miembro de la familia de receptores ErbB, una subfamilia de cuatro receptores de tirosina quinasas estrechamente relacionados: ErbB-1 (EGFR), ErbB-2 (HER2/c-neu; Her2), ErbB-3 (Her 3) y ErbB-4 (Her 4).
El EGFR existe en la superficie celular y se activa mediante la unión de sus ligandos específicos, incluido el factor de crecimiento epidérmico y el factor de crecimiento transformante a (TGFa). Tras la activación por sus ligandos de factor de crecimiento, el receptor sufre una transición de una forma inactiva mayormente monomérica a un homodímero activo. Además de formar homodímeros después de la unión al ligando, el EGFR puede emparejarse con otro miembro de la familia de receptores ErbB, como ErbB2, para crear un heterodímero activado. También hay evidencia que sugiere que los dímeros se forman en ausencia de unión al ligando y que se forman grupos de EGFR activados después de la unión al ligando.
La dimerización de EGFR estimula su actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa (PTK) intracelular. Esta actividad induce varias cascadas de transducción de señales que generan la proliferación y diferenciación celular. El dominio quinasa de EGFR puede fosforilar de forma cruzada residuos de tirosina de otros receptores con los que forma complejo, y puede activarse él mismo de esa manera.
Se han identificado mutaciones que involucran al EGFR en varios tipos de cáncer y es la diana de una clase en expansión de terapias contra el cáncer. Estas incluyen moléculas pequeñas dirigidas a EGFR como gefitinib y erlotinib para el cáncer de pulmón, y anticuerpos como cetuximab y panitumab para el cáncer de colon y el cáncer de cabeza y cuello.
El cetuximab y el panitumumab son anticuerpos monoclonales que inhiben el receptor. Otros monoclonales en desarrollo clínico son zalutumumab, nimotuzumab y matuzumab. Los anticuerpos monoclonales tienen como objetivo bloquear la activación del receptor inducida por ligando extracelular, principalmente bloqueando la unión del ligando al receptor. Con el sitio de unión bloqueado, las moléculas inductoras de señales no pueden unirse de manera efectiva y, de esta manera, tampoco activan la señalización aguas abajo. Sin embargo, la activación del receptor inducida por ligando también puede inhibirse mediante la estabilización de la conformación del receptor inactivo (matuzumab).
Aunque hay cierto éxito con la terapia con anticuerpos dirigidos a EGFR, la mayoría se asocia con el desarrollo de resistencia al tratamiento con el tiempo. Una de las formas en las que los tumores EGFR positivos pueden escapar de la terapia dirigida es mediante la señalización a través de otro receptor (dímero). Por ejemplo, el aumento de la señalización por los dímeros EGFR/ErbB-3 (HER1/HER3) debido al aumento de la expresión de h ER3 o la expresión de herregulina se asocia con la resistencia a fármacos relacionada con EGFR en los cánceres de pulmón y de cabeza y cuello. Además de la inducción de resistencia al tratamiento, se han observado algunos efectos secundarios de los anticuerpos dirigidos a EGFR. Un ejemplo es el desarrollo de una erupción cutánea, asociada con una inhibición eficaz del EGFR. Cuando son extremas, estas erupciones pueden provocar una reducción de los ciclos de tratamiento y/o la terminación prematura del tratamiento.
El ErbB-3 no tiene inactividad de quinasa inherente. Por lo tanto, la inhibición efectiva de la señalización del receptor ErbB-3 no puede lograrse con inhibidores de tirosina quinasa de molécula pequeña (TKI). Recientemente, se descubrió que un anticuerpo monoclonal denominado MEHD7945A era prometedor en un entorno preclínico de tumores positivos para EGFR. El MEHD7945A es un anticuerpo monoclonal con dos sitios de unión al antígeno idénticos. El MEHD7945A tiene la propiedad única de que tiene dos brazos de unión al antígeno idénticos, cada uno de los cuales tiene la capacidad de unirse a EGFR o ErbB-3, pero no a otros receptores. Una vez que se une un antígeno, el sitio de unión al antígeno se bloquea para el otro antígeno. Por lo tanto, el MEHD7945A (llamado anticuerpo 'dos en uno') puede considerarse tanto como un anticuerpo dirigido a EGFR como un anticuerpo dirigido a HER3 (WO2010/108127; Schaefer y otros (2011; Cancer cell, Volumen 20, No. 4 págs. 472-486; y US2013/259867).
Resumen de la invención
Se describe un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 y en donde el anticuerpo tiene una concentración inhibidora de crecimiento media máxima (CI50) de menos de 200 pM para inhibir el crecimiento inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 de células BxPC3 (ATCC CRL-1687) o células BxPc3-luc2 (Perkin Elmer 125058).
Se describe además un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a EGFR, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina con una región variable de cadena pesada que se une a EGFR y que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A, preferentemente en donde la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 11C.
Se describe además un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, que comprende una cadena pesada de inmunoglobulina con una región variable de cadena pesada que se une a ErbB-3 y que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 oMF6065 como se representa en la Figura 11B, preferentemente en donde la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 11C.
La invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable con un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo dominio variable con un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de NNAIN (SEQ ID NO: 18), WINTITGDPTYAQGFTG (SEQ ID NO: 20) y EEFLEWLFFDY (SEQ ID NO: 22) respectivamente, o una secuencia de aminoácidos de CDR1, c Dr2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 NNAIN (SEQ ID NO: 18), WINTITGDPTYAQGFTG (SEQ ID NO: 20) y EEFLEWLFFDY (SEQ ID NO: 22) y dicho segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91), y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92) respectivamente o una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91) y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92), y en donde dichos dominios variables primero y segundo comprenden una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos
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SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTV
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EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ
ID NO: 153).
La invención proporciona además un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable con un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo dominio variable con un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de ELSMH (SEQ ID NO: 9), GFDPEYGKTFFAQNFQG (SEQ ID NO: 11) y EGYYETTTYYYNLFDS (SEQ ID NO: 13) respectivamente o una secuencia de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 ELSMH (SEQ ID NO: 9), GFDPEYGKTFFAQNFQG (SEQ ID NO: 11) y EGYYETTTYYYNLFDS (SEQ ID NO: 13), y dicho segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91), y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92) respectivamente o una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91) y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92 ), y en donde dichos dominios variables primero y segundo comprenden una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQ
SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTV
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EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ
ID NO: 153).
En una modalidad, la invención comprende un anticuerpo biespecífico que comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFD PRYGKTFFAQNFQGRVTMTEDTSADTAYMEI/SSI ,RSEDTAVYYCATEGYYETT TYYYNLFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLEPPKPKDTEMISRTPEV'T CWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVIINAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSREEMTKNQVSL TCI,]VKGI,'YPSI)IAVKWIíSNGQPENNYKr]TPPVU)SI)GSI<'FLYSKi;PVI)KSRWQ QGNVFSOSVMHEALHNHYTQIvSLSUSPG (SEQ ID NO: 154) o
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFD PEYGKTFFAQNFQGRVTMTEDTSADTAYMELSSLRSEDTAVYYCATEGYYETT TYYYNLFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSREEMTKNQVSL TCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 154)
que tiene a lo máximo 15 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones; una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWI NPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGSRH FW SYW GFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPS VFPLAPS SKSTS GGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTKPPSR EEMTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 155) or QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWI NPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGSRH FW SYW GFDYW GQGTLVTVSS ASTKGPS VFPLAPS SKSTS GGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTKPPSR EEMTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 155),
que tiene a lo máximo 15 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones, en donde dicha primera y segunda cadena pesada comprenden una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQ
SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTV
AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT
EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ
ID NO: 1531.
Un anticuerpo de la invención es un anticuerpo biespecífico.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención.
También se describe un anticuerpo de la invención que además comprende un marcador, preferentemente un marcador para imágenes in vivo.
La invención proporciona además un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 o con riesgo de tener dicho tumor, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención. También se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3.
Descripción detallada de la invención
Como se usa en la presente, el término "sitio de unión al antígeno" se refiere a un sitio en un anticuerpo que es capaz de unirse al antígeno. El sitio de unión al antígeno no modificado está formado típicamente por el dominio variable del anticuerpo y está presente en él. En una modalidad, un dominio variable de anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL). El sitio de unión al antígeno puede estar presente en el dominio variable combinado VH/VL, o solo en la región VH o solo en la región VL. Cuando el sitio de unión al antígeno está presente en solo una de las dos regiones del dominio variable, la región variable contraparte puede contribuir al plegamiento y/o estabilidad de la región variable de unión, pero no contribuye significativamente a la unión del antígeno a sí mismo.
La unión al antígeno por un anticuerpo típicamente está mediado a través de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo y la estructura tridimensional específica tanto del antígeno como del dominio variable, lo que permite que estas dos estructuras se unan con precisión (una interacción similar a una cerradura y una llave), opuesto a la adherencia inespecífica aleatoria de anticuerpos. Como un anticuerpo típicamente reconoce solo una parte de un antígeno (llamado epítopo), y como tal, el epítopo puede estar presente también en otros compuestos, pero preferentemente no humanos, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención que se unen a EGFR y/o ErbB-3 también puede reconocer otras proteínas, pero preferentemente no otras proteínas humanas, si dichos otros compuestos contienen el mismo epítopo. Por tanto, el término "unión" no excluye la unión de los anticuerpos a otra proteína o proteínas que contienen el mismo epítopo. Dicha otra proteína(s) no es preferentemente una proteína humana. En cambio, se permite la reactividad cruzada. Un sitio de unión al antígeno EGFR y un sitio de unión al antígeno ErbB-3 como se define en la presente invención típicamente no se unen a otras proteínas en la membrana de las células en un ser humano postnatal, preferentemente adulto. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención es típicamente capaz de unirse a EGFR y ErbB-3 con una afinidad de unión (es decir, constante de disociación en equilibrio KD) de al menos 1x10e-6 M, como se describe con más detalle más abajo.
Como se usa en la presente, unión a antígeno se refiere a la capacidad de unión típica de un anticuerpo a su antígeno. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a EGFR, se une a EGFR y, en condiciones de cualquier otra manera idénticas, al menos 100 veces más bajo a los receptores homólogos ErbB-2 y ErbB-4 de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, se une a ErbB-3 y, en condiciones de cualquier otra manera idénticas, no se une a los receptores homólogos ErbB-2 y ErbB-4 de la misma especie. Teniendo en cuenta que la familia ErbB es una familia de receptores de superficie celular, la unión se evalúa típicamente en las células que expresan el receptor o receptores. La unión de un anticuerpo a un antígeno puede evaluarse de diversas formas.
El término "interfiere con la unión" como se usa en la presente significa que el anticuerpo se dirige a un epítopo en ErbB-3 y el anticuerpo compite con el ligando por la unión a ErbB-3. El anticuerpo puede disminuir la unión al ligando, desplazar el ligando cuando este ya está unido a ErbB-3 o puede, por ejemplo, a través de un impedimento estérico, evitar al menos parcialmente que el ligando pueda unirse a ErbB-3. Una forma de medir la unión de un sitio de unión al antígeno es incubar el anticuerpo con el antígeno (preferentemente en células que expresan el antígeno), eliminar el anticuerpo no unido (preferentemente mediante una etapa de lavado) y detectar el anticuerpo unido por medio de un anticuerpo marcado que se une al dominio constante del anticuerpo unido. La medición se compara preferentemente con una referencia positiva y negativa. En el caso de las células, la referencia negativa es una célula que no expresa el antígeno.
El término "anticuerpo" como se usa en la presente significa una molécula proteica que pertenece preferentemente a la clase de proteínas de inmunoglobulina, que contiene uno o más dominios variables que se unen a un epítopo en un antígeno, donde dichos dominios se derivan o comparten homología de secuencia con el dominio variable de un anticuerpo. Los anticuerpos de la invención comprenden preferentemente dos dominios variables. Los anticuerpos para uso terapéutico son preferentemente lo más cercanos posible a los anticuerpos naturales del sujeto a tratar (por ejemplo, anticuerpos humanos para sujetos humanos). La unión del anticuerpo puede expresarse en términos de especificidad y afinidad. La especificidad determina qué antígeno o epítopo del mismo se une específicamente al dominio de unión. La afinidad es una medida de la fuerza de unión a un antígeno o epítopo particular. La unión específica se define como la unión con afinidades (KD) de al menos 1x10e-6 M, con mayor preferencia 1x10e-7 M, con mayor preferencia superior a 1x10e-9 M. Típicamente, los anticuerpos para aplicaciones terapéuticas tienen afinidades de hasta 1x10e-10 M o superior. Los anticuerpos tales como los anticuerpos biespecíficos de la presente invención comprenden los dominios constantes (parte Fc) de un anticuerpo natural. Un anticuerpo de la invención es típicamente un anticuerpo biespecífico de longitud completa, preferentemente de la subclase IgG humana. Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención son de la subclase IgG1 humana. Tales anticuerpos de la invención tienen buenas propiedades ADCC, tienen una vida media favorable tras la administración in vivo a seres humanos y existe tecnología de ingeniería de CH3 que puede proporcionar cadenas pesadas modificadas que forman preferentemente heterodímeros sobre homodímeros tras la coexpresión en células clonales. Por ejemplo, la actividad ADCC de un anticuerpo puede mejorarse cuando el propio anticuerpo tiene una baja actividad ADCC, modificando ligeramente la región constante del anticuerpo (Junttila, TT, K. Parsons y otros (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer". Investigación sobre el cáncer 70 (11): 4481-4489)
Un anticuerpo de la invención es preferentemente un anticuerpo de "longitud completa". El término "longitud completa" de acuerdo con la invención se define como que comprende un anticuerpo esencialmente completo, que sin embargo no tiene necesariamente todas las funciones de un anticuerpo intacto. Para evitar dudas, un anticuerpo de longitud completa contiene dos cadenas pesadas y dos ligeras. Cada cadena contiene regiones constantes (C) y variables (V), que se pueden dividir en dominios designados CH1, CH2, CH3, VH y CL, VL. Un anticuerpo se une al antígeno a través de los dominios variables contenidos en la porción Fab y, después de la unión, puede interactuar con moléculas y células del sistema inmunológico a través de los dominios constantes, principalmente a través de la porción Fc. Los términos "dominio variable", "par VH/VL", "VH/VL" se usan en la presente descripción indistintamente. Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invención abarcan anticuerpos en donde pueden estar presentes mutaciones que proporcionan las características deseadas. Tales mutaciones no deberían ser deleciones de porciones sustanciales de ninguna de las regiones. Sin embargo, los anticuerpos en donde se eliminan uno o varios residuos de aminoácidos, sin alterar esencialmente las características de unión del anticuerpo resultante, se incluyen dentro del término "anticuerpo de longitud completa". Por ejemplo, un anticuerpo IgG puede tener inserciones de residuos de aminoácidos de 1-20, deleciones o sus combinaciones en la región constante.
Se prefieren los anticuerpos IgG de longitud completa debido a su vida media favorable y la necesidad de permanecer lo más cerca posible de moléculas completamente autólogas (humanas) por razones de inmunogenicidad. Un anticuerpo de la invención es preferentemente un anticuerpo IgG biespecífico, preferentemente un anticuerpo IgG1 biespecífico de longitud completa. La IgG1 se favorece por su larga vida media circulatoria en el hombre. Se prefiere que el anticuerpo IgG biespecífico de acuerdo con la invención sea una IgG1 humana.
El término "biespecífico" (bs) significa que una parte del anticuerpo (como se definió anteriormente) se une a un epítopo en un antígeno mientras que la segunda parte se une a un epítopo diferente en el antígeno, o en un antígeno diferente. El epítopo diferente está típicamente presente en un antígeno diferente. De acuerdo con la presente invención, dicho primer y segundo antígenos son de hecho dos proteínas diferentes. Un anticuerpo biespecífico preferido es un anticuerpo que comprende partes de dos anticuerpos monoclonales diferentes y, en consecuencia, se une a dos tipos diferentes de antígenos. Un brazo del anticuerpo biespecífico contiene típicamente un dominio variable de un anticuerpo y el otro brazo contiene un dominio variable de otro anticuerpo. Las regiones variables de cadena pesada del anticuerpo biespecífico de la invención son diferentes entre sí, mientras que las regiones variables de cadena ligera son las mismas en los anticuerpos biespecíficos de la invención, es decir, los anticuerpos biespecíficos de la invención se componen preferentemente de dos anticuerpos parentales que tienen la misma cadena ligera (es decir, anticuerpos de cadena ligera comunes). Un anticuerpo biespecífico en donde las regiones variables diferentes de la cadena pesada se asocian con la misma cadena ligera o común, también se denomina anticuerpo biespecífico con una cadena ligera común. Por lo tanto, se proporciona además un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en donde ambos brazos comprenden una cadena ligera común.
Los anticuerpos biespecíficos preferidos pueden obtenerse mediante la coexpresión de dos cadenas pesadas diferentes y una cadena ligera común en una sola célula. Cuando se usan dominios CH3 de tipo salvaje, la coexpresión de dos cadenas pesadas diferentes y una cadena ligera común dará como resultado tres especies diferentes, AA, AB y BB. Para aumentar el porcentaje del producto biespecífico deseado (AB) puede emplearse ingeniería de CH3, o en otras palabras, pueden usarse cadenas pesadas con dominios de heterodimerización compatibles como se define más adelante.
El término "dominios de heterodimerización compatibles" como se usa en la presente se refiere a dominios de proteínas que se diseñan de manera que el dominio A' formará preferentemente heterodímeros con el dominio B' modificado y viceversa, mientras que se desfavorece la homodimerización entre A'-A' y B'-B'.
El término "cadena ligera común" de acuerdo con la invención se refiere a cadenas ligeras que pueden ser idénticas o tener algunas diferencias en la secuencia de aminoácidos, mientras que la especificidad de unión del anticuerpo de longitud completa no se afecta. Por ejemplo, es posible dentro del alcance de la definición de cadenas ligeras comunes como se usa en la presente, preparar o encontrar cadenas ligeras que no sean idénticas, pero aún funcionalmente equivalentes, por ejemplo, introduciendo y probando cambios conservadores de aminoácidos, cambios de aminoácidos en regiones que no contribuyen o contribuyen sólo parcialmente a la especificidad de unión cuando se emparejan con la cadena pesada, y similares. Los términos "cadena ligera común", "VL común", "cadena ligera simple", "VL simple", con o sin la adición del término "reordenada", se usan todos de manera intercambiable en la presente descripción. Es un aspecto de la presente invención usar como cadena ligera común una cadena ligera humana que puede combinarse con diferentes cadenas pesadas para formar anticuerpos con dominios de unión al antígeno funcionales (WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant y otros 1998, Nissim y otros 1994). Preferentemente, la cadena ligera común tiene una secuencia de línea germinal. Una secuencia de línea germinal preferida es una región variable de cadena ligera usada con frecuencia en el repertorio humano y tiene buena estabilidad termodinámica, rendimiento y solubilidad. Una cadena ligera de la línea germinal preferida se basa en 012 , preferentemente es la cadena ligera kappa humana de la línea germinal reordenada IgVk1-39*01/IGJk1*01 o un fragmento o un equivalente funcional (es decir, el mismo segmento del gen IgVk1-39 pero diferente segmento del gen IGJk) del mismo (nomenclatura de acuerdo con la base de datos IMGT en la web mundial en imgt.org). Por lo tanto, se proporciona además un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en donde dicha cadena ligera común es una cadena ligera de la línea germinal, preferentemente una cadena ligera kappa humana de la línea germinal reordenada que comprende el segmento del gen IgVK1-39, con la máxima preferencia la cadena ligera kappa humana de la línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01. Los términos cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVk1-39*01/IGJk1*01, IGKV1-39/IGKJ1, cadena ligera huVk1-39 o, en resumen, huVk1-39 se usan indistintamente en toda la solicitud. Obviamente, los expertos en la técnica reconocerán que "común" también se refiere a equivalentes funcionales de la cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos no es idéntica. Existen muchas variantes de dicha cadena ligera en donde están presentes mutaciones (deleciones, sustituciones, adiciones) que no influyen materialmente en la formación de regiones de unión funcionales. La cadena ligera como se describe también puede ser una cadena ligera como se especifica anteriormente en la presente descripción, que tiene inserciones, deleciones, sustituciones de 1-5 aminoácidos o sus combinaciones.
También se contemplan anticuerpos en donde un VH es capaz de reconocer específicamente un primer antígeno y el VL, emparejado con el Vh en un dominio variable de inmunoglobulina, es capaz de reconocer específicamente un segundo antígeno. El par VH/VL resultante se unirá al antígeno 1 o al antígeno 2. Los denominados "anticuerpos dos en uno", descritos por ejemplo en WO 2008/027236, WO 2010/108127 y Schaefer y otros (Cancer Cell 20, 472-486, octubre de 20 11 ), son diferentes de los anticuerpos biespecíficos de la invención y se denominan además "anticuerpos dos en uno". Tales anticuerpos "dos en uno" tienen brazos idénticos y no son anticuerpos de la presente invención.
El EGFR es un miembro de una familia de cuatro receptores de tirosina quinasas (RTK), llamados Her- o cErbB-1, -2, -3 y -4. El EGFR tiene un dominio extracelular (ECD) que se compone de cuatro subdominios, dos de los cuales están involucrados en la unión al ligando y uno de los cuales está involucrado en la homodimerización y heterodimerización12 (para revisión, ver Referencia 3). Los números de referencia usados en esta sección se refieren a la numeración de las referencias en la lista titulada "Referencias citadas en la especificación". El EGFR integra señales extracelulares de una variedad de ligandos para producir diversas respuestas intracelulares.45 La principal trayectoria de transducción de señales activada por EGFR está compuesta por la cascada de señalización mitogénica de la proteína quinasa activada por mitógeno Ras (MAPK). La activación de esta trayectoria se inicia mediante el reclutamiento de Grb2 en el EGFR fosforilado de tirosina.67 Esto genera la activación de Ras a través del factor de intercambio de nucleótidos de guanina Ras enlazado al Grb2 Son of Sevenless (SOS). Además, la vía de transducción de señales PI3-quinasa-Akt también se activa por EGFR, aunque esta activación es mucho más fuerte en caso de coexpresión de Her3.89 El EGFR está implicado en varias neoplasias epiteliales humanas, en particular cánceres de mama, vejiga, cáncer de pulmón de células no pequeñas, colon, ovario, cabeza y cuello y cerebro. 10 Se han encontrado mutaciones activadoras en el gen, así como también sobreexpresión del receptor y de sus ligandos, dando lugar a lazos de activación autocrina (para revisión, ver Referencia. 11). Por lo tanto, este RTK se ha usado ampliamente como diana para la terapia del cáncer. Se han desarrollado tanto inhibidores de molécula pequeña dirigidos a RTK como anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a los dominios de unión al ligando extracelulares y hasta ahora han mostrado varios éxitos clínicos, aunque principalmente para un grupo selecto de pacientes.12 Los números de acceso a la base de datos para la proteína EGFR humana y el gen que la codifica son (GenBank NM_005228.3). El número de acceso se otorga principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de la proteína EGFR como diana, la secuencia real de la proteína EGFR unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. Cuando en la presente descripción se hace referencia a EGFR, la referencia se refiere a EGFR humano a menos que se indique de cualquier otra manera. El sitio de unión al antígeno que se une al EGFR, se une al EGFR y una variedad de variantes del mismo, como las que expresan algunos tumores positivos para EGFR.
El término "ErbB-3" como se usa en la presente se refiere a la proteína que en humanos está codificada por el gen ERBB3. Los nombres alternativos para el gen o la proteína son HER3; LCCs2; MDA-BF-1; c-ErbB-3; c-ErbB3; ErbB3-S; p180-ErbB3; p45-sErbB3; y p85-sErbB3. Cuando se hace en la presente descripción referencia a ErbB-3, la referencia se refiere a ErbB-3 humano. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, se une a ErbB-3 humano. El sitio de unión al antígeno ErbB-3 puede, debido a la similitud de secuencia y estructura terciaria entre ortólogos humanos y de otros mamíferos, también unirse a dicho ortólogo, pero no necesariamente. Los números de acceso a la base de datos para la proteína ErbB-3 humana y el gen que la codifica son (NP_001005915.1 NP_001973.2, NC_000012.11, NC_018923.2, NT_029419.12). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de ErbB-3 como diana, la secuencia real de la proteína ErbB-3 unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante como los que ocurren en algunos cánceres o similares. El sitio de unión al antígeno ErbB-3 se une a ErbB-3 y una variedad de variantes de la misma, como las expresadas por algunas células tumorales positivas para ErbB-2. El sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 preferentemente se une al dominio III de ErbB-3. En una modalidad preferida, la afinidad (KD) de un sitio de unión al antígeno por una célula positiva para ErbB-3 es menor o igual a 2,0 nM, con mayor preferencia menor o igual a 1,5 nM, con mayor preferencia menor o igual a 1,39 nM, con mayor preferencia menor o igual a 0,99 nM. En una modalidad preferida, un anticuerpo de acuerdo con la invención comprende preferentemente un sitio de unión al antígeno que se une al menos a un aminoácido del dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste en R426 y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se encuentran dentro de 11,2 A de R426 en la proteína ErbB-3 nativa. En una modalidad preferida, la afinidad (KD) de un sitio de unión al antígeno por ErbB-3 en células SK-BR-3 es menor o igual a 2,0 nM, con mayor preferencia menor o igual a 1,5 nM, con mayor preferencia menor que o igual a 1,39 nM, preferentemente menor o igual a 0,99 nM. En una modalidad, dicha afinidad (KD) está dentro del intervalo de 1,39-0,59 nM. En una modalidad preferida, la afinidad (KD) de un sitio de unión al antígeno por ErbB-3 en células BT-474 es menor o igual a 2,0 nM, con mayor preferencia menor o igual a 1,5 nM, con mayor preferencia menor o igual a 1,0 nM, con mayor preferencia inferior a 0,5 nM, con mayor preferencia inferior o igual a 0,31 nM, con mayor preferencia inferior o igual a 0,23 nM. En una modalidad, dicha afinidad (KD) está dentro del intervalo de 0,31-0,15 nM. Las afinidades mencionadas anteriormente se miden preferentemente mediante el uso de mediciones de afinidad celular en estado estacionario, en donde las células se incuban a 4 °C mediante el uso de anticuerpos marcados radiactivamente, donde después se mide la radioactividad unida a las células, como se describe en los Ejemplos.
Un sitio de unión al antígeno que se une al menos a un aminoácido del dominio III de ErbB-3 preferentemente se une a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R426 y residuos de aminoácidos expuestos en la superficie que se encuentran dentro de 11,2 A de R426 en la proteína ErbB-3 nativa. La numeración de los residuos de aminoácidos es la del Banco de Datos de Proteínas (PDB) ID #4P59. Como se muestra en los Ejemplos, los anticuerpos que se unen a esta región del dominio III de ErbB-3 exhiben características de unión particularmente buenas y son capaces de contrarrestar una actividad de ErbB-3 en células positivas para ErbB-3. El término "residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se encuentran dentro de 11,2 A de R426 en la proteína ErbB-3 nativa" se refiere a residuos de aminoácidos que están en la estructura terciaria de la proteína ErbB-3 espaciadamente ubicados dentro de 11,2 A de R426 y que están al menos en una parte expuesta al exterior de la proteína, de manera que los anticuerpos puedan alcanzarlas. Preferentemente, tales residuos de aminoácidos que se encuentran dentro de 11,2 A de R426 en la proteína ErbB-3 nativa se seleccionan del grupo que consiste en L423, Y424, N425, G427, G452, R453, Y455, E480, R481, L482, D483 y K485 (consulte, por ejemplo, la Figura 16 y la Tabla 8). En una modalidad preferida, se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en donde dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que se une al menos a R426 del dominio III de ErbB-3. Preferentemente, dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que se une al menos a R426 del dominio III de ErbB-3.
Se describe además un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de unión al antígeno que se une al menos a R426 del dominio III de ErbB-3. Preferentemente, dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que se une al menos a R426 del dominio III de ErbB-3. Preferentemente, dicho anticuerpo comprende además una región variable como se representa en la Figura 11B. En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende además un sitio de unión para EGFR. La región variable comprende preferentemente una secuencia como se representa en la Figura 11a.
Un anticuerpo biespecífico de la invención tiene preferentemente una actividad ADCC mejorada. Una técnica para mejorar la ADCC de un anticuerpo es la afucosilación. (Ver por ejemplo Junttila, TT, K. Parsons y otros (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer". Cancer Research 70(11): 4481­ 4489). Por lo tanto, se proporciona además un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, que está afucosilado. Alternativamente, o adicionalmente, pueden usarse muchas otras estrategias para lograr la mejora de ADCC, por ejemplo, incluida la glicoingeniería (Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt (Roche) y Eureka Therapeutics) y la mutagénesis (Xencor y Macrogenics), todas las cuales buscan mejorar la unión de Fc para activar FcyRIIIa de baja afinidad, y/o para reducir la unión al inhibidor de baja afinidad FcyRIIb. Un anticuerpo biespecífico de la invención se afucosila preferentemente con el fin de mejorar la actividad de ADCC. Un anticuerpo biespecífico de la invención comprende preferentemente una cantidad reducida de fucosilación de la estructura del carbohidrato unida a N en la región Fc, en comparación con el mismo anticuerpo producido en una célula CHO normal.
Se describe un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde el anticuerpo tiene una concentración inhibidora del crecimiento media máxima (CI50) de menos de 200 pM para inhibir el crecimiento inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 de células BxPC3 (ATCC CRL-1687) o células BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058). Dicho anticuerpo preferentemente tiene una CI50 para inhibir el crecimiento inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 de células BxPC3 (ATCC CRL 1687) o células BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058) de menos de 100 pM, preferentemente menos de 50 pM, con mayor preferencia menos de 20 pM. Dicho anticuerpo preferentemente tiene una CI50 de más de 1 pM para inhibir el crecimiento inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 de células BxPC3 (ATCC CRL 1687) o células BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058).
La invención describe además un biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde el anticuerpo tiene una concentración inhibidora de crecimiento media máxima (CI50) para inhibir el crecimiento inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 de células BxPC3 (ATCC CRL-1687) o células BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058) es menor que el CI50 del anticuerpo MEHD7945A para inhibir el crecimiento de estas células de cualquier otra manera en las mismas condiciones. El anticuerpo anti-EGFR /anti-HER3 MEHD7945A se describe en WO2010 /108127. Preferentemente, la CI50 para inhibir el crecimiento inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 de células BxPC3 o células BxPC3-luc2 de un anticuerpo de la invención es inferior al 90 % de la CI50 de MEHD7945A para inhibir el crecimiento de estas células de cualquier otra manera en las mismas condiciones, preferentemente menos del 80 %, con mayor preferencia menos del 60 %, con mayor preferencia menos del 50 %, con mayor preferencia del 40 %, con mayor preferencia menos del 30 %, con mayor preferencia menos del 20 %, con mayor preferencia menos del 10 % de la CI50 del anticuerpo MEHD7945A. Un anticuerpo de la invención tiene preferentemente una CI50 para inhibir el crecimiento inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 de células BxPC3 (ATCC CRL 1687) o células BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058) de más del 1% de la CI50 del anticuerpo MEHD7945A para inhibir el crecimiento de estas células de cualquier otra manera en las mismas condiciones. Un anticuerpo de la invención tiene preferentemente la CI50 indicada para inhibir el crecimiento inducido por ligando de EGFR y ErbB-3 de células BxPC3 (ATCC CRL 1687) o células BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058).
En la presente invención se prefiere un anticuerpo que sea efectivo a concentraciones relativamente bajas del anticuerpo. Dicho anticuerpo se puede proporcionar en cantidades más bajas y/o con una frecuencia de administración más baja, lo que hace que la utilidad del anticuerpo sea más económica. Un anticuerpo que es efectivo a concentraciones relativamente bajas del anticuerpo inhibe de manera más efectiva la proliferación de células tumorales in vivo, particularmente a concentraciones más bajas. Dicho anticuerpo también tiene una mejor ventana terapéutica y puede administrarse con menos frecuencia o con intervalos de administración más largos.
El EGFR y el ErbB-3 pueden unirse cada uno a varios ligandos y estimular el crecimiento de células BxPC3 o células BxPC3-luc2. En presencia de un ligando para uno o ambos receptores, se estimula el crecimiento de células BxPC3 o BxPC3-luc2. El crecimiento de células BxPC3 inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 puede medirse comparando el crecimiento de las células en ausencia y presencia del ligando. El ligando de EGFR preferido para medir el crecimiento inducido por el ligando de EGFR de células BxPC3 o BxPC3-luc2 es EGF. El ligando de ErbB-3 preferido para medir el crecimiento inducido por ligando de ErbB-3 de células BxPC3 o BxPC3-luc2 es NRG1. El crecimiento inducido por ligando se mide preferentemente mediante el uso de cantidades saturadas de ligando. En una modalidad preferida, el EGF se usa en una cantidad de 100 ng/ml de medio de cultivo. El NRG1 se usa preferentemente en 10 ng/ml de medio de cultivo. Se prefiere que la mitad de la concentración inhibidora del crecimiento máximo (CI50) se mida en células BxPC3 o BxPC3-luc2 inducidas por ligando de ErbB-3 y EGFR. Se prefiere que EGF sea el ligando de EGFR en este ensayo y que NRG1 sea el ligando de ErbB-3. En los ejemplos se describe una prueba adecuada para el ensayo de CI50.
En presencia de un exceso de ErbB-2, los heterodímeros de ErbB-2/ErbB-3 pueden proporcionar una señal de crecimiento a la célula de expresión en ausencia de un ligando detectable para la cadena ErbB-3 en el heterodímero. Esta función del receptor ErbB-3 se denomina en la presente descripción una función receptora independiente del ligando de ErbB-3. El heterodímero ErbB-2/ErbB-3 también proporciona una señal de crecimiento a la célula de expresión en presencia de un ligando de ErbB-3. Esta función del receptor ErbB-3 se denomina en la presente descripción una función del receptor inducida por ligando de ErbB-3.
El EGF y el NRG1 son preferentemente el EGF y el NRG1 de R&D Systems, número de catálogo 396-HB y 236-EG como se describe en los ejemplos.
Un anticuerpo de la invención que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 preferentemente puede reducir una función del receptor inducida por ligando de ErbB-3 en una célula positiva para ErbB-3. El anticuerpo es capaz de reducir la señalización de ErbB-3 mediante dimerización con EGFR. El anticuerpo es capaz de reducir la señalización de ErbB-3 a través de ErbB-2. La célula positiva para ErbB-3 es preferentemente también positiva para ErbB-2. La célula positiva para ErbB-3 es preferentemente también positiva para EGFR. La función del receptor inducida por ligando de ErbB-3 es preferentemente el crecimiento inducido por ligando de ErbB-3 de una célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3. En una modalidad preferida, la célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 comprende al menos 50 000 receptores ErbB-2 en la superficie celular. En una modalidad preferida, al menos 100000 receptores ErbB-2. En una modalidad preferida, la célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 comprende no más de 1000 000 de receptores ErbB-2 en la superficie celular. En una modalidad preferida, la célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 comprende más de 1 000 000 de receptores ErbB-2 en la superficie celular. En una modalidad preferida, dicha célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 es una célula BxPC3 (ATCC CRL-1687), una célula a o BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058); una célula MCF-7 (ATCC® HTB-22™), una célula SKBR3 (ATCC® HTB-30™) una célula NCI-87 (ATCC® CRL-5822™) o una célula A431 (ATCC® CRL-1555™). Preferentemente, dicha célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 también es positiva para EGFR. Dicha célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 es preferentemente una célula BxPC3 o BxPC3-luc2 como se indica anteriormente en la presente descripción.
Como se usa en la presente, la función del receptor inducida por ligando se reduce en al menos 20 %, preferentemente al menos 30, 40, 5060, o al menos 70 % en una modalidad particularmente preferida, la función del receptor inducida por ligando se reduce en 80, con mayor preferencia en un 90 %. La reducción se determina preferentemente determinando una función del receptor inducida por ligando en presencia de un anticuerpo biespecífico de la invención y comparándola con la misma función en ausencia del anticuerpo, en condiciones de cualquier otra manera idénticas. Las condiciones comprenden al menos la presencia de un ligando de ErbB-3. La cantidad de ligando presente es preferentemente una cantidad que induce la mitad del crecimiento máximo de una línea celular positiva para ErbB-2 y ErbB-3. La línea celular positiva para ErbB-2 y ErbB-3 para esta prueba es preferentemente la célula BxPC3 o BxPC3-luc2 como se indica en la presente descripción anteriormente. La prueba y/o el ligando para determinar la función del receptor inducida por ligando de ErbB-3 es preferentemente una prueba para la reducción del crecimiento inducida por ligando de ErbB-3 como se especifica en los ejemplos.
Un anticuerpo de la invención que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, preferentemente interfiere con la unión de un ligando de ErbB-3 a ErbB-3. Dichos anticuerpos son más efectivos para reducir el crecimiento inducido por ligando de células BxPC3 o BxPC3-luc2, particularmente en el contexto de un anticuerpo que comprende además un sitio de unión al antígeno que se une a EGFR.
El término "ligando de ErbB-3", como se usa en la presente, se refiere a polipéptidos que se unen y activan ErbB-3. Ejemplos de ligandos de ErbB-3 incluyen, pero no se limitan a, neuregulina 1 (NRG1) y neuregulina 2 (NRG2) (para revisión Olayioye MA y otros; EMBO J (2000) Volumen 19: págs. 3159-3167). El término incluye fragmentos y/o variantes biológicamente activas de un polipéptido de origen natural.
El término "ligando de EGFR" como se usa en la presente se refiere a polipéptidos que se unen y activan EGFR. Ejemplos de ligandos de EGFR incluyen, pero no se limitan a, EGF, TGF-a, HB-EGF, anfirregulina, betacelulina y epirregulina (para revisión Olayioye MA y otros; EMBO J (2000) Volumen 19: págs. 3159-3167). El término incluye fragmentos y/o variantes biológicamente activas de un polipéptido de origen natural
El primer sitio de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención se une al dominio III de EGFR. El anticuerpo inhibe preferentemente la proliferación inducida por EGF de células BxPC3 o BxPC3-luc2.
Un anticuerpo biespecífico de la invención preferentemente comprende citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Un anticuerpo que tiene una baja actividad ADCC intrínseca puede proporcionarse con actividad ADCC adicional. El anticuerpo puede diseñarse para mejorar la actividad de ADCC (para revisión, consulte Cancer Sci. Septiembre de 2009; 100(9): 1566-72. Engineered therapeutic antibodies with improved effectorfunctions. KubotaT, Niwa R, Satoh M, Akinaga S, Shitara K, Hanai N). Existen varios métodos in vitro para determinar la eficacia de los anticuerpos o de las células efectoras para provocar ADCC. Entre estos se encuentran los ensayos de liberación de cromo-51 [Cr51], los ensayos de liberación de europio [Eu] y los ensayos de liberación de azufre-35 [S35]. Por lo general, una línea de células diana marcada que expresa un cierto antígeno expuesto en la superficie se incuba con un anticuerpo específico para ese antígeno. Después del lavado, las células efectoras que expresan el receptor CD16 de Fc se coincuban con las células diana marcadas con anticuerpo. La lisis de las células diana se mide subsecuentemente mediante la liberación del marcaje intracelular mediante un contador de centelleo o espectrofotometría. Una prueba preferida se detalla en los ejemplos. Preferentemente, un anticuerpo biespecífico de la invención está afucosilado. Un anticuerpo biespecífico de la invención comprende preferentemente una cantidad reducida de fucosilación de la estructura del carbohidrato unida a N en la región Fc, en comparación con el mismo anticuerpo producido en una célula CHO normal.
Un anticuerpo biespecífico de la presente invención se usa preferentemente en humanos. Con este fin, un anticuerpo de la invención es preferentemente un anticuerpo humano o humanizado.
La tolerancia de un ser humano a un polipéptido se rige por muchos aspectos diferentes. La inmunidad, ya sea mediada por células T, mediada por células B u otra es una de las variables que se engloban en la tolerancia del ser humano a un polipéptido. La región constante de un anticuerpo biespecífico de la presente invención es preferentemente una región constante humana. La región constante puede contener una o más, preferentemente no más de 10, preferentemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región constante de un anticuerpo humano de origen natural. Se prefiere que la parte constante se derive completamente de un anticuerpo humano de origen natural. Varios anticuerpos producidos en la presente descripción se derivan de una biblioteca de dominio variable de anticuerpos humanos. Como tales, estos dominios variables son humanos. Las regiones CDR únicas pueden derivarse de humanos, ser sintéticas o derivadas de otro organismo. La región variable se considera una región variable humana cuando tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región variable de un anticuerpo humano natural, pero para las regiones CDR. La región variable de un VH de unión a EGFR, un VH de unión a ErbB-3 o una cadena ligera en un anticuerpo como se describió puede contener una o más, preferentemente no más de 10, preferentemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región variable de un anticuerpo humano de origen natural, sin contar las posibles diferencias en la secuencia de aminoácidos de las regiones CDR. Tales mutaciones también ocurren en la naturaleza en el contexto de la hipermutación somática.
Los anticuerpos pueden derivarse de diversas especies animales, al menos con respecto a la región variable de la cadena pesada. Es una práctica común humanizar tales, por ejemplo, regiones variables de cadena pesada murina. Hay varias formas de lograr esto, entre las que se encuentran el injerto de CDR en una región variable de cadena pesada humana con una estructura 3D que coincide con la estructura 3-D de la región variable de cadena pesada murina; desinmunización de la región variable de la cadena pesada murina, preferentemente realizada al retirar los epítopos de células T o B conocidos o sospechosos de la región variable de la cadena pesada murina. La eliminación se realiza típicamente sustituyendo uno o más de los aminoácidos en el epítopo por otro aminoácido (típicamente conservador), de manera que la secuencia del epítopo se modifica de manera que ya no es un epítopo de células B Tor.
Las regiones variables de cadena pesada murina desinmunizadas son menos inmunogénicas en humanos que la región variable de cadena pesada murina original. Preferentemente, una región o dominio variable de la invención se humaniza aún más, tal como, por ejemplo, el recubrimiento. Mediante el uso de técnicas de recubrimiento, los residuos exteriores que el sistema inmunológico encuentra fácilmente se reemplazan selectivamente con residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende una superficie recubierta débilmente inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica. Un animal como se usa en la invención es preferentemente un mamífero, con mayor preferencia un primate, con la máxima preferencia un ser humano.
Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención comprende preferentemente una región constante de un anticuerpo humano. De acuerdo con las diferencias en sus dominios constantes de cadena pesada, los anticuerpos se agrupan en cinco clases o isotipos: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Estas clases o isotipos comprenden al menos una de dichas cadenas pesadas que se nombra con una letra griega correspondiente. En una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención en donde dicha región constante se selecciona del grupo de regiones constantes de IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, con mayor preferencia dicha región constante comprende una región constante de IgG, con mayor preferencia una región constante de IgG1, preferentemente una región constante de IgG1 mutada. Alguna variación en la región constante de IgG1 ocurre en la naturaleza y/o se permite sin cambiar las propiedades inmunológicas del anticuerpo resultante. Típicamente, se permiten en la región constante entre aproximadamente 1-10 inserciones de aminoácidos, deleciones, sustituciones o sus combinaciones.
Se describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR, en donde dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia Cd R3 de una región variable de cadena pesada específica de EGFR seleccionada del grupo que consiste en MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A, o en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A. Dicho anticuerpo preferentemente comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; MF4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A.
Dicho anticuerpo preferentemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de EGf R seleccionada del grupo que consiste en MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente a lo máximo en un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada específica de EGFR seleccionada del grupo que consiste en MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A. Dicho anticuerpo preferentemente comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; Mf4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A.
También se describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a ErbB-3, en donde dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055- m F6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 como se representa en la Figura 11B, o en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 como se representa en la Figura 11B. Dicho anticuerpo preferentemente comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3178, m F3176 o MF3163, con la máxima preferencia al menos la secuencia CDR3 de MF3178. Dicho anticuerpo preferentemente comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de la cadena pesada específica de ErbB 3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 como se representa en la Figura 11B, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente a lo máximo en un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065. Dicho anticuerpo preferentemente comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178, MF3176 o MF3163, con la máxima preferencia al menos la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
La solicitud en una modalidad describe un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de EGFR seleccionada del grupo que consiste en MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A, o una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A, y en donde dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de la cadena pesada específica de ErbB 3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E, o una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 como se representa en la Figura 11B. Dicho primer sitio de unión al antígeno comprende preferentemente al menos la secuencia c DR3 de MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; MF4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A y dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende preferentemente al menos la secuencia CDR3 de MF3178, MF3176 o MF3163, con la máxima preferencia al menos la secuencia CDR3 de MF3178 de la Figura 11B. Dicho primer sitio de unión al antígeno comprende preferentemente al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de EGFR seleccionada del grupo que consiste en MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; MF4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente a lo máximo en un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3998; MF4280; MF4003; Mf4010; MF4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A, y dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende preferentemente al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB 3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 como se representa en la Figura 11B, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente a lo máximo en un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065. Dicho primer sitio de unión al antígeno comprende preferentemente al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; MF4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A, y dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende preferentemente al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178, MF3176 o MF3163, con la máxima preferencia al menos la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
Una modalidad preferida proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3998 como se representa en la Figura 11A, o una secuencia de CDR3 que difiere a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente en no más de un aminoácido de la secuencia CDR3 de MF3998 como se representa en la Figura 11A, y en donde dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos el secuencia CDR3 de MF3178, o una secuencia CDR3 que difiere a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente en no más de un aminoácido de la secuencia CDR3 de MF3178.
También se describe un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3998, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 que difieren a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente a lo máximo en un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3958, y en las que dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178, o secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que difieren a lo máximo en tres, preferentemente a lo máximo en dos, preferentemente a lo máximo en un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y c DR3 de MF3178.
La solicitud en una modalidad describe un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3998 y en donde dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3178.
La invención en una modalidad proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3998 y en donde dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
La solicitud en una modalidad describe un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF4280 y en donde dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3178.
La invención en una modalidad proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF4280 y en donde dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
Las secuencias CDR se varían, por ejemplo, con fines de optimización, preferentemente para mejorar la eficacia de unión o la estabilidad del anticuerpo. La optimización se realiza, por ejemplo, mediante procedimientos de mutagénesis en los que, después de probar preferentemente la estabilidad y/o la afinidad de unión de los anticuerpos resultantes, se selecciona preferentemente una secuencia CDR específica de ErbB3 o EGFR mejorada. Un experto en la materia es capaz de generar variantes de anticuerpos que comprendan al menos una secuencia CDR alterada de acuerdo con la invención. Por ejemplo, se aplica la sustitución conservadora de aminoácidos. Los ejemplos de sustitución conservadora de aminoácidos incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, y la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina.
La solicitud en una modalidad describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR, en donde la cadena VH de dicho dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A; o comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 representado en la Figura 11A que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11A. Dicho anticuerpo preferentemente comprende un dominio variable que se une a EGFR, en donde la cadena VH de dicho dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; MF4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A; o comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; MF4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11A. Un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR, preferentemente comprende además un dominio variable que se une a ErbB-3. El anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR es preferentemente un anticuerpo biespecífico que preferentemente comprende además un dominio variable que se une a ErbB-3. La cadena VH del dominio variable que se une a Erb-B3 comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 como se representa en la Figura 11B; o comprende la secuencia de aminoácidos de VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 representado en la Figura 11B que a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11B. La cadena VH del dominio variable que se une a Erb-B3 comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de MF3178, MF3176 o MF3163; o comprende la secuencia de aminoácidos de MF3178, MF3176 o MF3163 representada en la Figura 11B que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de cadena VH respectiva de la Figura 11A. En una modalidad preferida, la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende la secuencia de aminoácidos de MF3178; o comprende la secuencia de aminoácidos de MF3178 representada en la Figura 11B que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 amino inserciones, deleciones, sustituciones de ácido o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH.
Preferentemente, las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos mencionadas en un VH o VL como se especifica en la presente descripción no están presentes en la región CDR3. Las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos mencionadas también preferentemente no están presentes en las regiones CDR1 y CDR2. Las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos mencionadas también preferentemente no están presentes en la región FR4.
Se describe además un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a ErbB-3, en donde la cadena VH de dicha región variable comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178; MF3176; MF3163 o MF3307 como se representa en la Figura 11B, o comprende la secuencia de aminoácidos de VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3307; MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 representado en la Figura 11B que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11B. La cadena VH del dominio variable que se une a ErbB3 comprende preferentemente la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178, MF3176 o MF3163; o comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178, MF3176 o MF3163 representada en la Figura 11B que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente que tiene 1, 2, Inserciones, deleciones, sustituciones de 3, 4 o 5 aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11B. En una modalidad preferida, la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 representada en la Figura 11B; o comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 representada en la Figura 11B que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH. El anticuerpo preferentemente comprende además un dominio variable que se une a EGFR. La cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos de la cadena VH de la Figura Se describe además un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada específica de EGFR seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada de MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A, o en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere a lo máximo en 15 aminoácidos de las secuencias de región variable de cadena pesada de MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A.
Se describe además un anticuerpo, en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada específica de ErbB 3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de región variable de cadena pesada de MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 como se representa en la Figura 11B, o en donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere a lo máximo en 15 aminoácidos de las secuencias de región variable de cadena pesada de MF3178, MF3176, MF3163, MF3307, MF6055-MF6074, preferentemente MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065.
Se describe además un anticuerpo que comprende dos dominios variables que se unen cada uno a EGFR en donde un VH de los dominios variables comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A; o comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4002; MF4003; MF4010; MF4289; MF3370; MF3751; MF3752 como se representa en la Figura 11A, en donde dicha cadena VH tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11A. Dicho VH preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; MF4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998; MF4280; MF4003; MF4010; m F4289; o MF3370 como se representa en la Figura 11A, que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11A. Los dominios variables del anticuerpo comprenden preferentemente cadenas VH idénticas, que preferentemente tienen una secuencia como se representa en la Figura 11A. Un anticuerpo con dominios variables con cadenas VH idénticas no es un anticuerpo biespecífico. Las cadenas VH son idénticas para la presente invención si comprenden la misma secuencia de cadena Vh que se representa en la Figura 11 , o la misma secuencia de cadena VH, pero para 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11A.
Se describe además un anticuerpo que comprende dos dominios variables que se unen cada uno a ErbB3 en donde un VH de los dominios variables comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178; MF3176; MF3163 o MF3307 como se representa en la Figura 11B; o comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178; MF3176; MF3163 o MF3307 representado en la Figura 11B que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11B. Dicho VH preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178, MF3176 o MF3163; o comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178, MF3176 o MF3163 representada en la Figura 11B que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11B. Dicho VH preferentemente comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178; o comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 representada en la Figura 11B que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11B. Los dominios variables del anticuerpo comprenden preferentemente cadenas VH idénticas, que preferentemente tienen una secuencia como se representa en la Figura 11 B. Un anticuerpo con dominios variables con cadenas VH idénticas no es un anticuerpo biespecífico. Las cadenas VH son idénticas si comprenden la misma secuencia de cadena VH como se representa en la Figura 11B, o la misma secuencia de cadena VH, pero para 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 11B.
Se describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ErbB-3,
en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3998 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH; y
• en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH.
Se describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ErbB-3,
en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF4280 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF4280 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH; y
• en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH.
Se describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ErbB-3,
en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF4003 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF4003 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH; y
• en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH.
Se describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ErbB-3,
en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF4010 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF4010 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH; y
• en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH.
Se describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ErbB-3,
en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF4289 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF4289 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH; y
• en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH.
Se describe un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ErbB-3,
en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3370 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3370 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH; y
• en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3163 como se representa en la Figura 11; o
• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3163 como se representa en la Figura 11 que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a dicho VH. Este anticuerpo se une al EGFR humano y al EGFR murino y puede usarse para estudiar los efectos diana en ratones.
Cuando se compara con la secuencia en la Figura 11, el comportamiento de una cadena VH típicamente comienza a volverse notablemente diferente cuando tiene más de 15 cambios de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de una cadena VH como se representa en la Figura 11. Una cadena VH que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la cadena VH representada en la Figura 11, preferentemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la cadena VH representada en la Figura 11, preferentemente 1, 2, 3 o 4 inserciones, deleciones, sustituciones o sus combinaciones, preferentemente 1, 2 o 3 inserciones, deleciones, sustituciones o sus combinaciones, con mayor preferencia 1 o 2 inserciones, deleciones, sustituciones o sus combinaciones, y preferentemente 1 inserción, deleción, sustitución o sus combinaciones con respecto a la cadena VH representado en la Figura 11. Las una o más inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones preferentemente no están en la región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena VH. También preferentemente no están presentes en la región Fr4. Una sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución de aminoácidos conservadora.
Se describe un anticuerpo que tiene una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en la Figura 11d , o una secuencia de aminoácidos de la Figura 11D que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente con 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la Figura 11D. En una modalidad preferida, el anticuerpo tiene dos cadenas pesadas que comprenden cada una secuencia de aminoácidos como se representa en la Figura 11D, o una secuencia de aminoácidos de la Figura 11D que tiene a lo máximo 15, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente con 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones con respecto a la secuencia de la Figura 11D. Las 15 a lo máximo, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos son preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas. Las inserciones, deleciones, sustituciones o sus combinaciones no están preferentemente en la región CDR3 de la cadena VH, preferentemente no en la región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena VH y preferentemente no en la región FR4.
Los métodos racionales han evolucionado hacia la minimización del contenido de residuos no humanos en el contexto humano. Hay varios métodos disponibles para injertar con éxito la propiedad de unión al antígeno de un anticuerpo en otro anticuerpo. Las propiedades de unión de los anticuerpos descansan predominantemente en la secuencia exacta de la región CDR3, frecuentemente soportado por la secuencia de las regiones CDR1 y CDR2 en el dominio variable combinada con la estructura apropiada del dominio variable en su conjunto. Actualmente están disponibles varios métodos para injertar regiones CDR en un dominio variable adecuado de otro anticuerpo. Algunos de estos métodos se revisan en JC Almagrol y J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633, que se incluye en la presente descripción como referencia. Se describe además un anticuerpo biespecífico humano o humanizado que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión a EGFR comprende una secuencia de VH de CDR3 como se representa en la Figura 11A, y en donde el dominio variable que comprende el sitio de unión de ErbB-3 comprende una región VH de CDR3 como se representa en la Figura 11B. La región variable VH que comprende el sitio de unión a EGFR comprende preferentemente la secuencia de la región CDR1, la región CDR2 y la región CDR3 de una cadena VH en la Figura 11A. La región variable VH que comprende el sitio de unión de ErbB-3 comprende preferentemente la secuencia de la región CDR1, la región CDR2 y la región CDR3 de una cadena VH en la Figura 11B. El injerto de CDR también puede usarse para producir una cadena VH con las regiones CDR de un VH de la Figura 11, pero con un marco diferente. El marco diferente puede ser de otro VH humano o de un mamífero diferente.
Las 15 mencionadas a lo máximo, preferentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos son preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas, las inserciones, las deleciones, sustituciones o sus combinaciones no están preferentemente en la región CDR3 de la cadena VH, preferentemente no en la región CDR1, CDR2 o CDR3 de la cadena VH y preferentemente no en la región FR4.
La cadena ligera de un dominio variable que comprende una secuencia de cadena pesada variable como se representa en la Figura 11, es preferentemente una cadena ligera de la línea germinal de o basada en 012, preferentemente la cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVk1-S9*01/IGJk1*01 o un fragmento o un derivado funcional del mismo (nomenclatura de acuerdo con la base de datos IMGT en la web mundial en imgt.org). Se usan los términos cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVk1-39*01/IGJk1*01, IGKV1-39/IGKJ1, cadena ligera huVk1-39 o, en resumen, huVk1-39. La cadena ligera puede tener 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones. Las sustituciones de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos mencionadas son preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas, las inserciones, deleciones, sustituciones o combinaciones de las mismas no están preferentemente en la región CDR3 de la cadena VL, preferentemente no en la CDR1, CDR2 o región CDR3 o región FR4 de la cadena VL.
Hay varios métodos disponibles para producir anticuerpos biespecíficos. Un método implica la expresión de dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes en una célula y la recolección de anticuerpos producidos por la célula. El anticuerpo producido de esta manera contendrá típicamente una colección de anticuerpos con diferentes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras, algunas de las cuales son el anticuerpo biespecífico deseado. El anticuerpo biespecífico se puede purificar subsecuentemente de la colección. La relación de anticuerpos biespecíficos con respecto a otros que se producen por la célula puede aumentarse de varias formas. En una modalidad preferida de la invención, la relación aumenta expresando no dos cadenas ligeras diferentes sino dos cadenas ligeras esencialmente idénticas en la célula. Este concepto también se denomina en la técnica como el método de "cadena ligera común". Cuando las cadenas ligeras esencialmente idénticas trabajan junto con las dos cadenas pesadas diferentes, lo que permite la formación de dominios variables con diferentes sitios de unión al antígeno y diferentes propiedades de unión concomitantes, la relación del anticuerpo biespecífico a otro anticuerpo producido por la célula mejora significativamente con respecto a la expresión de dos cadenas ligeras diferentes. La relación del anticuerpo biespecífico que produce la célula puede mejorarse aún más estimulando el emparejamiento de dos cadenas pesadas diferentes entre sí sobre el emparejamiento de dos cadenas pesadas idénticas. La técnica describe varias formas en las que puede lograrse dicha heterodimerización de cadenas pesadas. Una forma es generar anticuerpos biespecíficos "botón en ojal". Ver Solicitud de Patente de Estados Unidos 20030078385 (Arathoon y otros - Genentech). Otro método es mediante el uso de ingeniería de carga como se describe en Gunasekaran (JBC 2010, Volumen 285, págs. 19637-19646). Otro método preferido se describe en Solicitud provisional de Estados Unidos 61/635,935, que ha sido seguida por la solicitud regular de Estados Unidos No. 13/866,747 y la solicitud PCT No. PCT/NL2013/050294 (WO 2013/157954 A1). Se describen métodos y medios para producir anticuerpos biespecíficos (a partir de una sola célula), de manera que se proporcionan medios siempre y cuando favorecen la formación de anticuerpos biespecíficos sobre la formación de anticuerpos monoespecíficos. Estos métodos también pueden emplearse favorablemente en la presente invención. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención (a partir de una sola célula), en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfaz, dicho método comprende proporcionar en dicha célula a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica un 1er dominio CH3 que comprende una cadena pesada, b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un 2do dominio CH3 que comprende una cadena pesada, en donde dichas moléculas de ácido nucleico están provistas de medios para el apareamiento preferencial de dicho 1er y 2do dominio CH3 que comprende cadenas pesadas, dicho método que comprende además la etapa de cultivar dicha célula huésped y permitir la expresión de dichas dos moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. Dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico pueden ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, vector o vehículo de suministro de genes y pueden integrarse en el mismo sitio del genoma de la célula huésped. Alternativamente, dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico se proporcionan por separado a dicha célula.
Una modalidad preferida proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención a partir de una sola célula, en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfaz, dicho método comprende proporcionar:
• una célula que tiene a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y que contiene un 1er dominio CH3, y b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende un sitio de unión al antígeno que se une ErbB-3 y que contiene un 2do dominio CH3, en donde dichas moléculas de ácido nucleico están provistas de medios para el emparejamiento preferencial de dichos 1er y 2do dominios CH3,
• dicho método que comprende además la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de las proteínas codificadas por dichas dos moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo IgG biespecífico del cultivo. En una modalidad particularmente preferida, dicha célula también tiene una tercera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera común. Dicha primera, segunda y tercera molécula de ácido nucleico puede ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, vector o vehículo de suministro de genes y puede integrarse en el mismo sitio del genoma de la célula huésped. Alternativamente, dichas primera, segunda y tercera moléculas de ácido nucleico se proporcionan por separado a dicha célula. Una cadena ligera común preferida se basa en 012, preferentemente es la cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVk1 39*01/IGJk1*01, como se describió anteriormente. Medios para el emparejamiento preferencial de dicho 1ro y 2do dominio CH3 son preferentemente las mutaciones correspondientes en el dominio CH3 de las regiones codificantes de la cadena pesada. Las mutaciones preferidas para producir esencialmente sólo anticuerpos biespecíficos son las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K (numeración de acuerdo con Kabat) en el primer dominio CH3 y las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E en el segundo dominio CH3, o viceversa. Por lo tanto, se describe además un método para producir un anticuerpo biespecífico, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K (numeración de acuerdo con Kabat) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E, dicho método que comprende además la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de proteínas codificadas por dichas moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. También se describe un método para producir un anticuerpo biespecífico, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E (numeración de acuerdo con Kabat) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K, dicho método que comprende además la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. Los anticuerpos que pueden producirse mediante estos métodos también forman parte de la presente invención. Los dominios de heterodimerización de CH3 son preferentemente dominios de heterodimerización de IgG1. Las regiones constantes de cadena pesada que comprenden los dominios de heterodimerización de CH3 son preferentemente regiones constantes de IgG1.
En una modalidad, se describe una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo de acuerdo con la invención. La molécula de ácido nucleico (típicamente una molécula de ácido nucleico aislada o recombinante in vitro,) codifica preferentemente una región variable de cadena pesada como se representa en la Figura 11A o Figura 11B, o una región variable de cadena pesada como se representa en la Figura 11A o Figura 11B que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia como se representa en la Figura 11. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico codifica la misma secuencia de aminoácidos que el ácido nucleico representado en la Figura 11 pero tiene una secuencia diferente porque codifica uno o más codones diferentes. La invención describe además una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de la Figura 11D.
Una molécula de ácido nucleico como se usa en la presente es típicamente pero no exclusivamente un ácido ribonucleico (ARN) o un ácido desoxirribonucleico (ADN). Los ácidos nucleicos alternativos están disponibles para un experto en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico está comprendido en una célula. Cuando dicho ácido nucleico se expresa en dicha célula, dicha célula puede producir un anticuerpo de acuerdo con la invención. Por tanto, en una modalidad se describe una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención y/o un ácido nucleico como se describe. Dicha célula es preferentemente una célula animal, con mayor preferencia una célula de mamífero, con mayor preferencia una célula de primate, con la máxima preferencia una célula humana. Para los fines de la invención, una célula adecuada es cualquier célula capaz de comprender y preferentemente de producir un anticuerpo de acuerdo con la invención y/o un ácido nucleico como se describe.
Se describe además una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferentemente dicha célula (típicamente una célula aislada o recombinante in vitro,) produce dicho anticuerpo. En una modalidad preferida, dicha célula es una célula de hibridoma, una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula NS0 o una célula PER-C6™. En una modalidad particularmente preferida, dicha célula es una célula CHO. Se describe además un cultivo celular que comprende una célula como se describe. Varias instituciones y empresas han desarrollado líneas celulares para la producción a gran escala de anticuerpos, por ejemplo, para uso clínico. Ejemplos no limitantes de tales líneas celulares son células CHO, células NS0 o células PER.C6TM. Estas células también se usan para otros fines, como la producción de proteínas. Las líneas celulares desarrolladas para la producción a escala industrial de proteínas y anticuerpos se denominan en la presente descripción líneas celulares industriales. Por tanto, en una modalidad preferida, la invención describe el uso de una línea celular desarrollada para la producción a gran escala de anticuerpos para la producción de un anticuerpo de la invención. La invención describe además una célula para producir un anticuerpo que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un VH, un VL y/o una cadena pesada como se representa en la Figura 11. Preferentemente, dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia como se representa en la Figura 11a o 11 b.
La invención describe además un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula de la invención y recolectar dicho anticuerpo de dicho cultivo. Preferentemente, dicha célula se cultiva en un medio sin suero. Preferentemente, dicha célula está adaptada para el crecimiento en suspensión. Se proporciona además un anticuerpo que puede obtenerse mediante un método para producir un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferentemente, el anticuerpo se purifica del medio del cultivo. Preferentemente, dicho anticuerpo está purificado por afinidad.
Una célula como se describe es, por ejemplo, una línea celular de hibridoma, una célula CHO, una célula 293F, una célula NS0 u otro tipo de célula conocida por su idoneidad para la producción de anticuerpos con fines clínicos. En una modalidad particularmente preferida, dicha célula es una célula humana. Preferentemente una célula que se transforma mediante una región E1 de adenovirus o un equivalente funcional de la misma. Un ejemplo preferido de tal línea celular es la línea celular PER.C6TM o el equivalente de la misma. En una modalidad particularmente preferida, dicha célula es una célula CHO o una variante de la misma. Preferentemente, una variante que hace uso de un sistema de vector de glutamina sintetasa (GS) para la expresión de un anticuerpo.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica comprende preferentemente un excipiente o portador preferentemente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende histidina de 5-50 mM, trehalosa de 100-300 mM, polisorbato 20 de 0,1-03 g/l o sus combinaciones. El pH se ajusta preferentemente a pH = 5,5 - 6,5. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende histidina 25 mM, trehalosa 220 mM, polisorbato 20 0,2 g/l o sus combinaciones. El pH se ajusta preferentemente a pH = 5,5 - 6,5, con la máxima preferencia a pH = 6.
Un anticuerpo de la invención preferentemente comprende además un marcador, preferentemente un marcador para imágenes in vivo. Típicamente, dicho marcador no es necesario para aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, en un entorno de diagnóstico, un marcador puede resultar útil. Por ejemplo, al visualizar células diana en el cuerpo. Varios marcadores son adecuados y muchas se conocen bien en la técnica. En una modalidad preferida, el marcador es un marcador radiactivo para la detección. En otra modalidad preferida, el marcador es un marcador infrarrojo. Preferentemente, el marcador infrarrojo es adecuado para imágenes in vivo. El experto en la técnica dispone de varios marcadores infrarrojo. Los marcadores infrarrojo preferidos son, por ejemplo, IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; Fosforamidita IRDye 700; Fosforamidita IRDye 800 (LI-COR USA; Calle superior 4647; Lincoln, Nebraska).
La invención proporciona además un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 o con riesgo de tener dicho tumor que comprende administrar al sujeto un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Antes del inicio de dicho tratamiento, el método comprende preferentemente determinar si dicho sujeto tiene, o está en riesgo de, dicho tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3. La invención proporciona además un anticuerpo o composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3.
Para establecer si un tumor es positivo para EGFR, el experto en la técnica puede, por ejemplo, determinar la amplificación y/o tinción de EGFR en inmunohistoquímica. Al menos el 10 % de las células tumorales en una biopsia deben ser positivas. La biopsia también puede contener 20 %, 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % o más células positivas. Para establecer si un tumor es positivo para HER3, el experto en la técnica puede, por ejemplo, determinar la amplificación y/o tinción de HER3 en inmunohistoquímica. Al menos el 10 % de las células tumorales en una biopsia deben ser positivas. La biopsia también puede contener 20 %, 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % o más células positivas.
El tumor es preferentemente un cáncer positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3. Preferentemente, dicho cáncer positivo es un cáncer de mama, como un cáncer de mama en estadio temprano. Sin embargo, la invención puede aplicarse a un amplio intervalo de cánceres positivos para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3, como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de vejiga y similares. El sujeto es preferentemente un sujeto humano. El sujeto es preferentemente un sujeto elegible para la terapia con anticuerpos mediante el uso de un anticuerpo específico de EGFR como cetuximab. En una modalidad preferida, el sujeto comprende un tumor, preferentemente un cáncer positivo para EGFR/ErbB-3, preferentemente un tumor/cáncer con un fenotipo resistente al anticuerpo monoclonal EGFR.
La cantidad de anticuerpo de acuerdo con la invención que se administrará a un paciente está típicamente en la ventana terapéutica, lo que significa que se usa una cantidad suficiente para obtener un efecto terapéutico, mientras que la cantidad no excede un valor umbral que genera una extensión inaceptable de efectos secundarios. Cuanto menor sea la cantidad de anticuerpo necesaria para obtener un efecto terapéutico deseado, mayor será típicamente la ventana terapéutica. Por tanto, se prefiere un anticuerpo de acuerdo con la invención que ejerza suficientes efectos terapéuticos a dosis bajas. La dosis puede estar en el intervalo del régimen de administración de cetuximab. La dosis también puede ser menor.
Por supuesto, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención preferentemente induce menos toxicidad cutánea en comparación con cetuximab en condiciones de cualquier otra manera similares. Por supuesto, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención produce preferentemente menos quimiocinas proinflamatorias, preferentemente CXCL14 en comparación con cetuximab en condiciones de cualquier otra manera similares. Por supuesto, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención induce preferentemente menos deterioro de las ARNasas antimicrobianas, preferentemente la ARNasa 7, en comparación con cetuximab en condiciones de cualquier otra manera similares.
La presente invención describe, entre otros, anticuerpos que se dirigen a los receptores EGFR y ErbB-3 y dan como resultado una potente inhibición de la proliferación de líneas celulares cancerosas in vitro e inhibición del crecimiento tumoral in vivo. Se identificó un panel diverso de brazos de unión humanos y Fab específicos para EGFR o ErbB-3. Estos se produjeron como anticuerpos biespecíficos clonándolos en vectores de expresión complementarios que contienen mutaciones en la región CH3 que impulsa la heterodimerización de cadenas pesadas. Se produjeron muchos anticuerpos biespecíficos a pequeña escala y se probaron en ensayos funcionales y de unión en líneas celulares cancerosas. Se seleccionaron y probaron varios anticuerpos biespecíficos en un modelo de xenoinjerto ortotópico mediante el uso de la línea celular BxPC3-luc2. Esta línea celular expresa los receptores EGFR y ErbB-3 y depende parcialmente de la presencia de un ligando EGFR y un ligando ErbB-3 para su crecimiento. Los modelos de BxPC3 son un modelo de cribado robusto y estricto. Un anticuerpo de la invención, particularmente un anticuerpo biespecífico de la invención, puede combinar perfiles de baja toxicidad con alta eficacia. Un anticuerpo de la invención puede ser útil en varios tipos y líneas de terapias dirigidas a EGFR. Un anticuerpo de la invención puede tener una ventana terapéutica aumentada cuando se compara con un anticuerpo que se une al(a los) mismo(s) antígeno(s) con ambos brazos. Un anticuerpo biespecífico de la invención puede exhibir mejores efectos inhibidores del crecimiento in vitro, in vivo o sus combinaciones en comparación con el anticuerpo MEHD7945A.
Las modalidades preferidas de la invención proporcionan usos de anticuerpos de acuerdo con la invención en condiciones de estrés por herregulina. La herregulina es un factor de crecimiento que participa en el crecimiento de células tumorales positivas para ErbB-3. Típicamente, cuando las células tumorales expresan niveles altos de herregulina (denominada estrés por herregulina), las terapias actualmente conocidas como trastuzumab, pertuzumab y lapatinib no son capaces de inhibir el crecimiento tumoral. Este fenómeno se llama resistencia a la herregulina. Sin embargo, sorprendentemente, un anticuerpo de acuerdo con la invención también es capaz de contrarrestar el crecimiento de células tumorales que expresan niveles elevados de herregulina. Como se usa en la presente descripción, un nivel de expresión de herregulina se considera alto si una célula tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos el 90 % o el 95 % del nivel de expresión de herregulina de las células BXPC3 o MCF7. Los niveles de expresión de herregulina se miden, por ejemplo, mediante el uso de qPCR con ARN tumoral (como se describe, por ejemplo, en Shames y otros PLOS ONE, Febrero de 2013, Volumen 8, Número 2, págs. 1-10 y en Yonesaka y otros, Sci.transl.Med., Volumen 3, Edición 99 (2011); págs. 1-11), o mediante el uso de métodos de detección de proteínas, como por ejemplo ELISA, preferentemente mediante el uso muestras de sangre, plasma o suero (como por ejemplo lo descrito en Yonesaka y otros, Sci.transl.Med., Volumen 3, Edición 99 (2011); págs. 1-11).
También se proporciona un método para contrarrestar la formación de una metástasis en un sujeto que tiene un tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3, en donde dicho tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de las células BXPC3 o MCF7, que comprende administrar para el sujeto, un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3. También se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para su uso en el tratamiento o prevención de la adhesión focal de una célula tumoral positiva para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3, o para su uso en el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en donde dicha célula tumoral positiva para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos del 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7. Se describe además el uso de un anticuerpo biespecífico como se describe para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la adhesión focal de una célula tumoral positiva para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3, o para el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en donde dicha célula tumoral positiva para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7. Dicho tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 es preferentemente cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de vejiga y similares. Con la máxima preferencia, dicho tumor es cáncer de mama. Por lo tanto, se describe además un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une al EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para su uso en el tratamiento o prevención de la adhesión focal o la formación de metástasis de cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de vejiga y similares, preferentemente células de cáncer de mama, en donde dichas células tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7. Dicho anticuerpo de acuerdo con la presente invención es típicamente capaz de reducir una función del receptor inducida por ligando, preferentemente crecimiento inducido por ligando, de ErbB 3 en una célula positiva para ErbB 2 y ErbB 3. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende preferentemente un sitio de unión al antígeno que se une al dominio III de ErbB-3. La afinidad (KD) de dicho sitio de unión al antígeno ErbB-3 para una célula ErbB-3 positiva es preferentemente menor o igual a 2,0 nM, con mayor preferencia menor o igual a 1,39 nM, con mayor preferencia menor o igual a 0,99 nM.
En una modalidad preferida, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende preferentemente un sitio de unión al antígeno que se une al menos a un aminoácido del dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste en R426 y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se encuentran dentro de 11,2 A de R426 en la proteína ErbB-3 nativa.
Una modalidad preferida describe el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor positivo a EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3, en donde las células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7. Dicho tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 es preferentemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, incluidos los no- cáncer de pulmón de células pequeñas, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel o melanoma. Con la máxima preferencia, dicho tumor es cáncer de mama. Por lo tanto, se describe adicionalmente un anticuerpo como se describe para su uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células no pequeñas, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel o melanoma, preferentemente cáncer de mama, en donde las células de dicho cáncer tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7.
Los niveles altos de herregulina están presentes típicamente durante la formación de metástasis (es decir, la migración, invasión, crecimiento y/o diferenciación de células tumorales o células iniciadoras de tumores). Típicamente, las células que inician tumores se identifican en función de marcadores de células madre como CD44. Por lo tanto, estos procesos apenas se pueden contrarrestar con terapias actualmente conocidas como trastuzumab y pertuzumab. Dado que un anticuerpo de acuerdo con la invención es capaz de contrarrestar el crecimiento y/o diferenciación de células tumorales o células iniciadoras de tumores que expresan niveles elevados de herregulina, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención también es particularmente adecuado para contrarrestar la formación de metástasis. Por lo tanto, se proporciona además un método para contrarrestar la formación de una metástasis en un sujeto que tiene un tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3, en donde dicha célula tumoral positiva a EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 tiene una nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3. También se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para su uso en el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en donde dicha célula tumoral positiva para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % de la nivel de expresión de herregulina de las células BXPC3 o MCF7. Se describe además el uso de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en donde dicha célula tumoral positiva para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 tiene una nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7. Dicho tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 es preferentemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, incluidos los cánceres de pulmón de células no pequeñas, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel o melanoma. Con la máxima preferencia, dicho tumor es cáncer de mama. Por lo tanto, se describe además un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a EGFR y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para su uso en el tratamiento o prevención de la formación de metástasis de cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, incluido el cáncer de pulmón de células no pequeñas, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel o células de melanoma, preferentemente células de cáncer de mama, en donde dichas células tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferentemente al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 85 %, con mayor preferencia al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7. Dicho anticuerpo de acuerdo con la presente invención es típicamente capaz de reducir una función del receptor inducida por ligando, preferentemente el crecimiento inducido por ligando, de ErbB-3 en una célula positiva para EGFR y ErbB-3. La afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno por una célula positiva para ErbB-3 es preferentemente menor o igual a 2,0 nM, con mayor preferencia menor o igual a 1,39 nM, con mayor preferencia menor o igual a 0,99 nM.
En una modalidad, dicho anticuerpo biespecífico se usa en el tratamiento de un sujeto en condiciones de estrés por herregulina, como se explica con más detalle anteriormente en la presente descripción.
Los anticuerpos de la invención pueden producirse a niveles > de 50 mg/L después de la transfección transitoria en células 293F en suspensión. Los anticuerpos biespecíficos pueden purificarse hasta una pureza superior al 98 % con rendimientos > de 70 %. Los estudios de caracterización analítica muestran perfiles de anticuerpos lgG1 biespecíficos que son comparables a los de IgG1 monoespecífico bivalente. En términos de actividad funcional, un anticuerpo biespecífico de la invención puede demostrar una potencia superior en comparación con MEHD7945A in vitro e in vivo.
Para mayor claridad y una descripción concisa, las características se describen en la presente descripción como parte de las mismas modalidades o modalidades separadas, sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención puede incluir modalidades que tienen combinaciones de todas o algunas de las características descritas.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Secuencia anotada de la construcción que codifica el EGFR quimérico de cynomolgus y humano. Los sitios de restricción usados para volver a clonar (Nhe1-Not1) se indican en mayúsculas. El comienzo del péptido maduro está subrayado y se indica en negrita. La región transmembrana está en negrita y cursiva.
Figura 2: Secuencias de aminoácidos del dominio extracelular (ECD) de las 'variantes de dominio de intercambio' de EGFR: se usó el ECD de EGFR humano como cadena principal y los dominios específicos se intercambiaron por la secuencia de HER3 humana. Se indican las secuencias derivadas de HER3. Estas secuencias se clonaron en un marco con un marcador de epítopo derivada de c-Myc y la región transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR).
Figura 3: Mapeo de epítopos de Fab anti-EGFR (número MF; seleccionado de las bibliotecas de fagos "inmunes") expresados en fagos por competencia para la unión con anticuerpos conocidos derivados de la literatura. Valores de DO representativos obtenidos después de la prueba de unión de fagos a EGFR inmovilizado en ELISA en presencia (o ausencia) de los anticuerpos indicados ND: no determinado. Se indica la especificidad del dominio de los anticuerpos de control.
Figura 4: ejemplo de mapeo de epítopos de IgG de cadena ligera común (cLC) anti-EGFR seleccionada (números PG) mediante tinción FACS mediante el uso de mutantes de dominio de intercambio de EGFR. Se ensayó la unión de los anticuerpos a células CHO que expresan de forma estable los mutantes de intercambio de EGFR indicados (dominios en la secuencia de wtEGFR que se intercambiaron por el dominio correspondiente de HER3). Línea clara: tinción del control negativo (anticuerpo irrelevante); línea oscura: tinción de anticuerpos. vIII: Variante III de EGFR, que carece del dominio I y la mayor parte del dominio II). Ctr: tinción del control negativo (agregado de anticuerpo primario irrelevante). La especificidad de dominio determinada se indica a la derecha de la figura.
Figura 5: ejemplo de la funcionalidad de IgG anti-EGFR cLC (números PG) en la inhibición de la muerte inducida por EGF de células A431.
El eje Y (recuentos) muestra la lectura de fluorescencia del ensayo, que recuerda el número de células metabólicamente activas, en función de la concentración de anticuerpo usado (eje X). Los anticuerpos que muestran actividad bloqueadora de EGFR funcional inhiben de forma dependiente de la dosis la muerte celular inducida por EGF y, por lo tanto, muestran un mejor crecimiento de las células con una concentración creciente de anticuerpos. El anticuerpo cetuximab usado clínicamente se usó en todos los experimentos como patrón interno (diamantes).
Figura 6: descripción general del cribado de biespecíficos anti-EGFRxHER3, en comparación con la actividad del anticuerpo MEHD7945A. Cada barra representa la actividad de un anticuerpo anti-EGFRxHER3 biespecífico en el ensayo BxPC-3 independiente de ligando (barras claras) y controlado por ligando (barras oscuras). La actividad promedio del anticuerpo MEHD7945A se indica mediante una línea clara (superior) y oscura (inferior) para el ensayo independiente y dependiente, respectivamente. El crecimiento se normalizó a los controles no tratados. Se analizaron más de 800 anticuerpos anti-EGFRxHER3 biespecíficos.
Figura 7: Determinación de CI50 para la inhibición de la proliferación celular de BxPC-3 de los dos biespecíficos de mejor rendimiento (números PB), en comparación con MEHD7945A. El eje Y representa el porcentaje de crecimiento, normalizado a la situación de control (es decir, crecimiento desinhibido en presencia de ambos ligandos) y el eje X la concentración de anticuerpo usada. Se indican los valores de CI50.
Figura 8: efecto terapéutico del tratamiento con anticuerpos biespecíficos (números PB) sobre el crecimiento de células BxPC-3 implantadas ortotópicamente. El eje Y muestra la lectura de bioluminiscencia (BLI) (que recuerda el número de células tumorales vivas) después de la inyección de luciferina en los ratones en función del tiempo (eje X). El anticuerpo MEHD7945A se usó como referencia y un anticuerpo irrelevante (anti-RSV) como anticuerpo de control negativo (cuadrados). En aras de la claridad, se omitieron las barras de error de la Figura.
Figura 9: efecto terapéutico del PB4522 biespecífico de mayor potencial en comparación con el de MEHD7945A a una dosis de 0,3 mg/kg. El eje Y muestra la bioluminiscencia in vivo (BLI), que recuerda el número de células tumorales vivas en función del tiempo (eje X). NC: anticuerpo de control negativo (anti-RSV, dosis de 30 mg/kg). En aras de la claridad, se omitieron las barras de error de la figura.
Figura 10: pesos de los tumores medidos ex vivo el día 38 del estudio de tumores aislados de ratones tratados con MEHD7945A (grupo G4) o PB4522 (grupo G7) a 0,3 mg/kg. El panel de la izquierda muestra el peso del tumor de cada ratón individual y el panel de la derecha muestra el peso promedio de los 7 ratones que fueron tratados. ** p < 0,05.
Figura 11: Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de cadenas VH, cadenas ligeras comunes y cadenas pesadas de anticuerpos de la invención. Cuando en esta figura se indica una secuencia líder, ésta no es parte de la cadena VH o del anticuerpo, pero típicamente se escinde durante el procesamiento de la proteína en la célula que produce la proteína. La secuencia de la cadena VH de una cadena pesada indicada con las mayúsculas MG seguida de un número en el texto se indica en la presente descripción con el mismo número precedido por las letras VH. La Figura 11b especifica además las secuencias de aminoácidos de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo de unión a erbB-3, MF6055 - MF6074. Las secuencias de cadena pesada variable son variantes de la región variable de cadena pesada MF3178. Los puntos indican el mismo aminoácido que en MF3178, en esa posición. Las regiones CDR están separadas por un espacio y se indican en negrita.
Figura 12: Expresión de CXCL14 y Rnasa7 en queratinocitos primarios estimulados con diferentes IgG. La expresión se midió mediante Q-PCR en presencia de dos concentraciones de anticuerpos.
Figura 13: Actividad ADCC de PB4522 afucosilado en comparación con MEHD7945Ay cetuximab en células que expresan EGFR alto (A431) e intermedio (BxPC3 y A549). El 'Ctrl Ab' es un IgG dirigido contra el toxoide tetánico
Figura 14: Curvas de titulación de anticuerpos monoclonales HER3 en el ensayo N87 dependiente de HRG. Las variantes PG6058, PG6061 y PG6065 son variantes de PG3178. El PG1337 es un control negativo específico para el toxoide tetánico. Los datos se normalizaron a la proliferación basal con ligando presente en cada placa.
Figura 15: Perfiles CIEX-HPLC de anticuerpos monoclonales HER3. Las variantes PG6058, PG6061 y PG6065 son variantes de PG3178. El punto isoeléctrico calculado (pI) de la región VH y el tiempo de retención (tR) del pico principal se dan para cada anticuerpo.
Figura 16:
a) Estructura cristalina de HER3 (PDB #4P59) que muestra el residuo de epítopo Arg 426 en esferas grises y todos los residuos expuestos en la superficie dentro de un radio de 11,2 A de Arg 426 en esferas negras. b) Superficie expuesta al solvente de la región del epítopo con Arg 426 y residuos distantes mostrados en gris y todos los residuos expuestos a la superficie dentro de un radio de 11,2 A de Arg 426 mostrados en negro. c) Residuos en la región del epítopo Arg 426 en gris claro y residuos circundantes (todos marcados) en gris oscuro. Se realizaron las figuras y los análisis con Yasara (www.yasara.org).
Figura 17: Residuos críticos para la unión de PG3178 representados en la estructura cristalina de HER3. Los residuos críticos identificados para la unión de PG3178 se representan como esferas negras en la estructura cristalina de HER3 (PDB ID # 4P59).
Figura 18: Confirmación de R426 como residuo de unión crítico para PG3175 a HER3. Se incluyeron dos anticuerpos anti-HER3 como anticuerpos de control. La unión se determinó en una titulación FACS y la unión se expresa como AUC en comparación con la unión aW T HER3.
EJEMPLOS
Líneas celulares
Se adquirieron BxPC-3-luc2 (Perkin Elmer 125058), CHO-K1 (DSMZ ACC110), 293F (Invitrogen R790-07), A549 ATCC ® CCL-185™ Carcinoma de pulmón de Homo sapiens, BxPC-3 ATCC ® CRL-1687™ adenocarcinoma de páncreas de Homo sapiens, y células A431 DSMZ ACC 91 y se mantuvieron de forma rutinaria en medio de crecimiento suplementado con suero bovino inactivado por calor fetal al 10 % (FBS). Las células 293F Freestyle se obtuvieron de Invitrogen y se mantuvieron rutinariamente en medio 293 FreeStyle. La línea celular BxPc-3-luc2 (Bioware® Ultra Light Producing) es una línea celular que expresa luciferasa, que se transfectó de manera estable con el gen de luciferasa de luciérnaga (luc2). La línea celular se estableció transduciendo lentivirus (pGL4 luc2) que contiene el gen de luciferasa 2 bajo el control del promotor de ubiquitina C humana. La línea celular se conoce comúnmente como BxPc-3-luc2, es una línea celular de adenocarcinoma de páncreas de células humanas derivada de BxPC-3 ATCC (CRL-1687™). Bioluminiscencia In Vitro: Aproximadamente 37o fotones/s/célula. El número exacto variará en dependencia de las condiciones de obtención de imágenes y cultivo.
Clonación del ADNc que codifica las construcciones de dominio de intercambio EGFR y EGFR de cynomolgus
Una construcción que codifica un receptor quimérico que comprende el dominio extracelular de cynomolgus EGFR fusionado al dominio transmembrana humano y la cola intracelular se copió de una solicitud de patente publicada por Micromet (US 2010/0183615 A1). La secuencia se representa en la Figura 1. Este ADNc se elaboró sintéticamente por GeneArt y se clonó en el vector pMK-RQ, flanqueado por los sitios de restricción. NheI y NotI. El ADNc se liberó de este vector mediante el uso de estas dos enzimas y luego se clonó en el vector de expresión de mamífero pCDNA3.1. El ADNc se secuenció por completo para garantizar de que coincidía con la construcción diseñada y no se encontraron mutaciones.
Para fines de mapeo de epítopos, se generaron construcciones en las que los diferentes dominios en el dominio extracelular (ECD) de EGFR (L1, CR1, L2 y CR2, también llamados dominios I-IV: [1]) se intercambiaron por los dominios correspondientes de HER3: Figura 2. A continuación, se clonaron en un vector de expresión para la expresión transitoria en células CHO (negativas al antígeno), en el marco con un marcador de epítopo extracelular derivado de cMyc y la región transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas. Las construcciones fueron diseñadas, sintetizadas por GeneArt y subsecuentemente clonadas en pDisplay como fragmentosS//1-Sa/1. Se secuenciaron todas las construcciones, se demostró que eran correctas y se ensayó su expresión. Sólo se demostró que la variante de intercambio del dominio I (dominio I de HER3 con dominios II-IV de HER1) no da lugar a cantidades detectables de proteína en la superficie de las células transfectadas (no mostrado).
Los números de referencia usados en los Ejemplos se refieren a la numeración de las referencias en la lista titulada "Referencias citadas en los Ejemplos".
Inmunizaciones de MeMo con la proteína de fusión rhEGFR-Fc y las células A431 que sobreexpresan el antígeno
Se inmunizaronratones que son transgénicos para una VL humana reordenada y un conjunto de diversos segmentos de genes VH, DH y JH humanos no reordenados operativamente ligados a genes de región constante murina (MeMo®; ver también WO2009/157771) con proteína EGFR-Fc (R&D Systems, número de catálogo 344-ER) emulsionada con adyuvante TitermaxGold (TMG, Sigma Aldrich, número de catálogo T2684) en un intervalo de 14 días. Los ratones MeMo producen anticuerpos de cadena ligera común (cLC) tras la exposición a un antígeno, es decir: todos los anticuerpos que salen de Memo llevan esencialmente la misma cadena ligera, pero están diversificados en sus cadenas pesadas. En los días 0 y 14, los ratones se vacunaron por vía subcutánea (s.c.) para minimizar la incomodidad por TMG en los ratones. En todos los puntos de tiempo posteriores, los ratones se inmunizaron a través de la ruta intraperitoneal (i.p.) para garantizar que el antígeno sea absorbido y presentado de manera eficiente en el bazo. El día 35, se determinó el título anti-EGFR en suero por FACS mediante el uso de la línea celularA431 que sobreexpresa EGFR. Los ratones que desarrollaron en el día 35 un título en suero >1/1000 recibieron un refuerzo i.p. final con la proteína EGFR-Fc disuelta en PBS el día 42, seguido de recolección de bazo y ganglio linfático tres días después. Los ratones con un título en suero de EGFR demasiado bajo el día 35 recibieron un refuerzo i.p. adicional de EGFR-Fc en TMG el día 49. Subsecuentemente, los títulos en suero se determinaron el día 56 mediante ELISA. Aquellos ratones que en el día 56 tenían un título en suero por encima de los criterios de aceptación recibieron un refuerzo i.p. final con la proteína EGFR-Fc disuelta en PBS el día 63 seguido de recolección de bazo y ganglio linfático. Se inyectaron a los ratones 20 |jg de la proteína EGFR-Fc disuelta en 125 j l de TMG o 200 j l de PBS.
Dos ratones MeMo inmunizados con EGFR-Fc recibieron también un refuerzo con células A431. Esto se debió a que estos ratones habían desarrollado un título bajo en suero de IgG a-EGFR-Fc que estaba dirigido principalmente contra la cola Fc. Para reforzar específicamente la respuesta de EGFR, estos ratones se reforzaron con una única inyección i.p. de 2E 6 células A431 en 200 j l de PBS el día 49.
Se demostró que todos los ratones habían aumentado una respuesta significativa dirigida al dominio extracelular de EGFR, como lo demuestra su reactividad con células CHO que expresan de forma estable EGFR humano de longitud completa y con células A431 que sobreexpresan EGFR en FACS.
Generación de bibliotecas de anticuerpos de fagos 'inmunes' de ratones inmunizados
Después de la inmunización, se extrajo el ARN de tejidos linfoides (ganglios linfáticos, bazo) y se amplificó el conjunto policlonal de ADNc que codifica VH mediante el uso de cebadores específicos de la familia VH como se describió anteriormente (por ejemplo, EP 2604625). El material de dos ratones se combinó para la construcción de la biblioteca. Los productos de PCR resultantes se cortaron luego con las enzimas de restricción Sfi1 y BstEII y se clonaron en el marco con el gen del bacteriófago III para visualizarlo en el bacteriófago filamentoso, esencialmente como se describe en [2], solo el vector fagémido ya contenía el gen VL de la línea germinal Vk1-39. La biblioteca de fagos ML1155 se generó a partir de los dos ratones con el título sérico de a-EGFR más alto (ratones E094 # 12 y E094 # 18). La biblioteca ML1156 se generó a partir de los dos ratones que recibieron el refuerzo adicional de A431 (ratones E094 # 14 y E094 # 16). Las características de las bibliotecas se representan en la Tabla 1.
Selecciones de fagos para clones de unión a EGFR
La inmunofusión (Fc-) del ectodominio de EGFR (R&D Systems) se diluyó en PBS (hasta 5 jg/m l y en diluciones dobles del mismo) y se recubrieron los pocillos de las inmunoplacas Maxisorp. A continuación, los fagos se cribaron para la unión como se describió [3]. La selección de clones reactivos con Fc se evitó por contraselección rigurosa mediante el uso (10 jg de) IgG soluble durante la incubación del fago con el antígeno recubierto. Para dirigir las selecciones en EGFR hacia el dominio I de unión al ligando (L1), también se realizó competencia con un exceso de la variante III (vIII) de inmunofusión de EGFR. Para obtener anticuerpos cLC con funcionalidad en la inhibición del receptor, se realizaron selecciones de fagos en antígenos inmovilizados en combinación con elución específica de epítopo [4] mediante el uso del ligando (EGF), o anticuerpos copiados de la literatura (Matuzumab, Cetuximab). También se realizaron eluciones de fagos reactivos con EGFR mediante el uso del anticuerpo específico del dominio I ICR10 (Abcam, nr. ab231) y el anticuerpo EGFR específico del dominio II. 1 (Thermo Scientific, nr. MS-311). Como se ha demostrado que las células A431 [5] portan una amplificación del gen EGFR [6] y, por tanto, expresan un elevado número de EGFR, se usaron para la selección de fagos reactivos a EGFR.
Se determinaron los títulos de salida de fagos y para cada selección en la que el título de salida de fagos fue 1,5 veces superior al fondo (selección en un pocillo no recubierto de antígeno), se seleccionaron 48 clones diferentes y se cribaron los fagos para determinar la unión a los antígenos respectivos en ELISA. Todos los clones también se ensayaron para determinar la unión a IgG humana en ELISA para identificar los que se unen a la porción Fc de las inmunofusiones usadas para la selección. Se encontró un alto porcentaje de clones positivos (definidos como clones que reconocen las respectivas inmunofusiones en ELISA, pero que no son reactivos con IgG) en todas las salidas de selección (hasta 0,625 jg/m l) de inmunofusión revestida. A continuación, se secuenciaron los clones que puntuaron positivos en ELISA de fagos en EGFR-Fc, pero no en hIgG y se compararon las secuencias. Las secuencias se analizaron como se describió anteriormente (EP 2604625) y agruparon sobre la base de su uso del segmento del gen VH y la secuencia de CDR3 de cadena pesada (HCDR3). Un grupo de anticuerpos se definió como todas las secuencias que usan el mismo segmento VH de la línea germinal que tiene un HCDR3 con la misma longitud y más del 70 % de identidad de secuencia en ese HCDR3. En total, se identificaron 17 grupos de anticuerpos de ratones MeMo inmunizados.
Mediante el uso de grandes repertorios de cLC sintéticos (sintetizados internamente) y selecciones en rhEGFR-Fc (como se describió anteriormente) se aislaron muchos clones específicos de EGFR, de los cuales solo uno (MF3370) demostró más tarde que era capaz de inhibir la muerte celular de A431 inducida por EGF. Por tanto, este clon también se analizó con más detalle y se usó en ensayos de cribado de EGFRxHER3 posteriores.
Prueba de anticuerpos de fagos anti-EGFR seleccionados para la unión competitiva con anticuerpos de control
Para delinear el epítopo reconocido por Fab anti-EGFR representativos, se probaron (como Fab expresados en fagos: denominados 'MF') para la unión a EGFR en presencia de un exceso de control, IgG derivada de la literatura [7]. Las IgG de control usadas para estos experimentos de competición se enumeran en la Tabla 2.
Cuando se analizó la unión de fagos que expresan los Fab seleccionados al antígeno en ELISA en presencia de un exceso de estos anticuerpos de control, se encontró que varios competían por la unión de uno o más de los anticuerpos de control: Figura 3. Estos resultados muestran que el panel anti-EGFR es diverso en el reconocimiento de epítopos.
Reclonación de Fab de cLC anti-EGFR seleccionados, expresión y purificación de IgG1 de cLC
Los clones de fagos específicos de EGFR (denominados 'MF') se volvieron a clonar como IgG bivalente monoespecífica (denominada 'PG') volviendo a clonar el fragmento del gen que codifica VH (como Sfi1-BstEII) en un vector de expresión (denominado 'MG') para la expresión transitoria de IgG en células 293F. Después de la producción por transfección transitoria de células 293F, la IgG secretada (denominada "PG") se purificó del sobrenadante del cultivo por cromatografía de afinidad a proteína A mediante el uso de procedimientos estandarizados.
Prueba de anticuerpos anti-EGFR para determinar su reactividad cruzada con EGFR de cynomolgus y EGFR de ratón
Para probar si las IgG de cLC anti-EGFR eran reactivas con el EGFR de cynomolgus, las construcciones que codifican el EGFR humano de longitud completa, así como también la construcción de expresión recién sintetizada que codifica el EGFR quimérico cynomolgus/humano (Figura 1) se transfectaron en (antígeno negativo) las células CHO y las células se tiñeron a continuación con el IgG de cLC anti-EGFR (PG) a 5 pg/ml y finalmente se analizaron mediante FACS. Como control positivo para la tinción, se usó el anticuerpo cetuximab usado clínicamente, ya que se conoce que este anticuerpo tiene una reacción cruzada con el EGFR de cynomolgus [8]. La construcción que codifica el receptor quimérico de cynomolgus y humano dio lugar a niveles elevados de la construcción quimérica que se expresaba en la superficie de las células transfectadas (como se juzga por la tinción mediante el uso de cetuximab). Además, se demostró que todas las IgG de cLC eran reactivas con el EGFR de cynomolgus, ya que la tinción de las células que expresaban el EGFR humano era prácticamente indistinguible de la de las células que expresaban el receptor quimérico.
Para probar la IgG de cLC anti-EGFR por su reactividad cruzada con EGFR murino, se realizó un ELISA. La proteína purificada, compuesta de EGFR ECD de ratón, fusionada con Fc de IgG1 humana se compró de Sino Biologicals (número de catálogo 51091-M02H) y se usó una dilución en serie de 2 veces de este antígeno para recubrir los pocillos de una placa ELISA, comenzando a 5 pg/ml. A continuación, se probó la unión de la IgG de cLC anti-EGFR a este antígeno a una concentración fija de 5 pg/ml. Como control positivo de la inmunorreactividad de los anticuerpos, se realizó la misma configuración de ELISA mediante el uso de la proteína de fusión EGFR ECD-Fc humana como antígeno (R&D Systems). De los 17 grupos de anticuerpos como se describió anteriormente, se probó al menos un anticuerpo representativo. Además, el clon MF3370 de la biblioteca sintética también se probó como IgG (PG3370). Se demostró que todos menos uno de los anticuerpos cLC no reconocen el EGFR de ratón, ya que no reaccionaron con la proteína de fusión en ELISA. Sin embargo, se demostró que el anticuerpo PG3370 reconoce el EGFR murino, así como también el EGFR humano con una afinidad similar (datos no mostrados): La Tabla 3 resume los datos.
Prueba de la especificidad de dominio de anticuerpos anti-EGFR mediante el uso de construcciones de dominio de intercambio de EGFR en FACS
Para demostrar de manera inequívoca la especificidad de dominio de la IgG de cLC anti-EGFR, se probaron para determinar su unión a células CHO que expresan de manera estable construcciones de 'dominio de intercambio': es decir, células CHO que expresan mutantes de EGFR en las que los dominios específicos se habían reemplazado por los dominios correspondientes de Her3 en FACS (Figura 2). La Figura 4 da un ejemplo de los datos de FACS obtenidos; los datos se resumen en la Tabla 3.
Prueba de anticuerpos anti-EGFR para determinar su efecto sobre la señalización inducida por ligandos
Para probar la IgG de cLC anti-EGFR seleccionada por sus efectos sobre la señalización inducida por EGF, se probó su capacidad para prevenir la muerte celular inducida por EGF de las células A431. En resumen, las concentraciones altas (10 nM) de EGF inducen la muerte celular (apoptótica) en las células A431 [9]. Este efecto puede revertirse en función de la dosis mediante la adición de anticuerpos anti-EGFR que bloquean el ligando, como cetuximab (el anticuerpo 225 murino es el equivalente de cetuximab en ratón: [9]) Los anticuerpos se probaron en este ensayo para determinar su efecto sobre la inhibición del receptor en una dilución semilogarítmica en serie a partir de 10 pg/ml. En cada ensayo, se incluyó como control positivo el anticuerpo cetuximab que bloquea el EGFR y que se usa clínicamente. Se encontró que los anticuerpos anti-EGFR tienen diferentes potencias para inhibir la muerte celular inducida por EGF: algunos eran más potentes que cetuximab para rescatar el efecto inducido por EGF (por ejemplo, PG3998: Figura 5), algunos eran menos potentes (por ejemplo, PG4289, Figura 5) y algunos tenían muy poca o ninguna actividad (por ejemplo, PG4000, Figura 5). La Tabla 3 muestra la actividad de los anticuerpos cLC dirigidos a EGFR en la inhibición del receptor, en comparación con la de cetuximab.
Cribado de anticuerpos anti-EGFRxHER3 biespecíficos por su capacidad para inhibir la proliferación de células BxPC-3
Los fragmentos de ADNc que codifican VH del panel de anticuerpos EGFR y HER3 se volvieron a clonar en vectores que codifican dominios CH3 modificados por ingeniería de carga que forzaron la generación de anticuerpos biespecíficos (Gunasekaran y otros, JBC 2010; PCT/NL2013/050294) después de la transfección transitoria en células 293F (denominado 'PB' para proteína biespecífica). Se usaron tres estrategias diferentes para combinar los brazos de EGFR y HER3 en formato de IgG biespecífica: I) biespecíficos de los cuales ambos anticuerpos parentales habían demostrado actividad bloqueadora de ligando para el receptor en ensayos celulares respectivos (el ensayo A431 para EGFR y el ensayo MCF-7 para Her3) dando como resultado 120 anticuerpos biespecíficos únicos (Tabla 4); II) biespecíficos de los cuales solo uno de los brazos (el anti-Her3 o el anti-EGFR) tenía funcionalidad en los ensayos mencionados anteriormente (un total de 440 anticuerpos biespecíficos únicos, no mostrados) y III) biespecíficos de los cuales ambos brazos Fab no tenían (o casi no tenían) funcionalidad en estos ensayos (un total de 320 anticuerpos biespecíficos únicos, no mostrados). En total, se probaron 880 anticuerpos biespecíficos únicos para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de células BxPC-3.
Los 880 anticuerpos biespecíficos se produjeron mediante cotransfección y coexpresión transitoria en células 293F; la IgG se purificó del sobrenadante del cultivo y el tampón en donde se mantenía la proteína se cambió a PBS de acuerdo con procedimientos estandarizados. La proteína purificada se cuantificó mediante el uso de un análisis de octetos. Los biespecíficos se probaron a dos concentraciones (1 pg/ml y 100 ng/ml) en un ensayo dependiente de ligando (EGF y NRG) (adición de 100 ng/ml de EGF, junto a 10 ng/ml de NRG), así como también en un ensayo independiente de ligando (sin ligando añadido).
Primero, los anticuerpos se diluyeron en medio de inanición químicamente definido (medio CDS: RPMI1640, que contenía 80U de penicilina y 80 pg de estreptomicina por ml, 0,05 % (p/v) de BSA y 10 pg/ml de holotransferrina) y se añadieron 50 pl de anticuerpo diluido a los pocillos de una placa de fondo transparente negro de 96 pocillos (Costar). Se añadió el ligando (50 pl por pocillo de una solución madre que contiene 40 ng/ml de NRG y 400 ng/ml de EGF, diluido en CDS: R&D Systems, números de catálogo 396-HB y 236-EG). En el caso del ensayo independiente de ligando, no se añadió ligando, en su lugar, sólo 50 pl de CDS. Las células BxPC-3 se tripsinizaron, recolectaron y contaron y se añadieron 8000 células en 100 pl de CDS a cada pocillo de la placa. Las placas se dejaron durante una hora a temperatura ambiente antes de colocarlas en un contenedor dentro de una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante tres días. En el cuarto día, se añadió azul Alamar (Invitrogen, # DAL1100) (20 pl por pocillo) y se midió la fluorescencia después de 6 horas de incubación (a 37 °C) con azul Alamar mediante el uso de una excitación de 560 nm y una lectura de 590 nm en un Lector de microplacas Biotek Synergy 2 Multi-mode. Los valores de fluorescencia se normalizaron a un crecimiento desinhibido (sin anticuerpo, pero se añadieron ambos ligandos).
Determinación de CI50
En la Figura 6 se ofrece una descripción general de los datos de cribado de los 880 anticuerpos biespecíficos. El MEHD7945A sirvió como anticuerpo de referencia; la línea de puntos superior en la Figura 5 representa la actividad promedio observada en el ensayo independiente de ligando y la línea de puntos inferior la actividad promedio de ese anticuerpo observado en el ensayo dependiente de ligando. Luego se volvieron a producir veinte biespecíficos que tenían una potencia en ambos ensayos que era al menos tan buena como la del anticuerpo MEHD7945A, se volvieron a purificar y se volvieron a probar en los ensayos de proliferación de BxPC-3 controlados por ligando para determinar los valores de CI50. Los anticuerpos se diluyeron en serie en CDS desde 10 pg/ml hacia abajo y se añadieron 50 pl de solución de anticuerpo por pocillo. Se añadieron ligandos y células como se describió anteriormente y las células se incubaron durante tres días antes de la adición de Alamar Blue y la lectura de fluorescencia. Nuevamente, los valores se normalizaron para el crecimiento no inhibido y los valores de CI50 se calcularon mediante el uso del software GraphPad Prism (ajuste de curva no lineal). Los seis biespecíficos de mejor rendimiento se seleccionaron basándose en que su CI50 era más baja que la del anticuerpo comparador MEHD7945A en ambos ensayos. La Figura 7 muestra la determinación de CI50 de dos de estos anticuerpos de mejor rendimiento; la Tabla 6 resume los datos para estos seis biespecíficos, en comparación con la actividad de una mezcla de cada uno de los anticuerpos monoclonales parentales (ver más abajo).
Prueba de biespecíficos anti-EGFR x HER3 para determinar su efecto sobre el crecimiento de tumores BxPC-3 implantados ortotópicamente
Se injertaron ortotópicamente ratones hembra CB17 SCID, de 8-10 semanas de edad al comienzo del estudio, en el páncreas con 1*106 células tumorales en 20 pl. Por lo tanto, los ratones se anestesiaron y se colocaron sobre el lado derecho para exponer el lado izquierdo y se hizo una incisión de 0,5 cm en la región del flanco izquierdo. El páncreas y el bazo se exteriorizaron y se inyectaron 1 * 10® células tumorales en 20 pl en el espacio subcapsular de la cola del páncreas. Una semana después de la implantación, se generaron datos de bioluminiscencia (BLI). Para la obtención de imágenes BLI (una o dos veces por semana) en la vista lateral izquierda, todos los ratones recibieron 15 minutos antes de la toma de imágenes inyecciones i.p. de 150 mg/kg de luciferina (D-Luciferina-EF, sal de potasio, número de catálogo E6552, Promega). Los animales atípicos, basados en BLI/volumen tumoral, se eliminaron y los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 7 ratones cada uno. El día experimental 8 se inició el tratamiento. Los animales del grupo de tratamiento con anticuerpos se dosificaron semanalmente durante 3 semanas consecutivas (días 0, 7, 14 y 21) con 30 mg/kg de anticuerpo. El día 0 del tratamiento, los animales reciben el doble de la dosis de carga, es decir, ®0 mg/kg de anticuerpo. La imagen final se realizó el día 31.
Se demostró que los seis biespecíficos disminuían significativamente el crecimiento del tumor BxPC-3 en el modelo (p <0,001) (Figura 8). Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre el efecto terapéutico del anticuerpo comparador MEHD7945A y dos de estos seis biespecíficos, PB4522 y PB4510 (datos no mostrados). Por lo tanto, se realizó un estudio de escalada de dosis con uno de los anticuerpos biespecíficos, PB4522, y el anticuerpo comparador MEHD7945A. Mediante el uso de exactamente el mismo modelo in vivo y programa de dosificación, diferentes grupos de ratones se trataron con una dosis de anticuerpo decreciente, rebajada de 30 mg/kg a 3 y finalmente 0,3 mg/kg. La figura 9 muestra los datos de los grupos tratados con 0,3 mg/kg. No hubo diferencias significativas en el efecto terapéutico entre todos los grupos tratados con MEHD7945A o PB4522 a 30 y 3 mg/kg (datos no mostrados). Sin embargo, hubo una diferencia significativa en el efecto terapéutico entre el tratamiento con MEHD7945A y PB4522 a la dosis de 0,3 mg/kg, siendo este último más potente en la reducción del crecimiento tumoral. Después de que los ratones se retiraron del estudio, se determinó el peso de todos sus tumores ex vivo. La Figura 10 muestra que el peso promedio de los tumores extraídos de ratones tratados con PB4522 (a 0,3 mg/kg) fue significativamente menor (P = 0,007, prueba T no apareada) que el de los ratones tratados con MEHD7945A (a 0,3 mg/kg).
Comparación de la potencia de diferentes formatos de anticuerpos en la inhibición de la proliferación celular de BxPC-3
Para comparar la potencia de diferentes formatos de anticuerpos en la inhibición de la proliferación celular, se ensayó la capacidad de los anticuerpos anti-EGFR x HER3 biespecíficos purificados para inhibir la proliferación de células BxPC-3 en comparación con una mezcla equimolar de los anticuerpos parentales. En cada placa de ensayo, se usó MEHD7945A como control positivo para poder comparar el CI50 del anticuerpo que se estaba probando directamente con el MEHD7945A 'dos en uno'. Las titulaciones se realizaron a partir de 10 pg/ml y en 6 diluciones de diez veces. Estas diluciones en serie de anticuerpos se probaron por duplicado en todo el intervalo de concentración. A partir de las curvas sigmoideas obtenidas, se calcularon los valores de CI50 mediante el uso del software GraphPad Prism. La Tabla 6 resume los datos.
Como puede verse en la Tabla 6, en todos los casos el formato biespecífico fue más potente que la mezcla de los dos anticuerpos parentales en la inhibición de la proliferación de células tumorales BxPC-3 y, por lo tanto, este formato fue el formato preferido para la cofocalización de e Gf R y HER3. Cuando se midió varias veces el valor de CI50 para la inhibición de la proliferación del mismo biespecífico, se obtuvieron valores ligeramente diferentes en los diferentes ensayos. Sin embargo, se consideró que estas diferencias eran pequeñas variaciones experimentales inevitables.
Ensayo de queratinocitos
Se ha demostrado que el bloqueo de EGFR afecta la expresión de las quimiocinas en los queratinocitos (Pastore, Mascia y otros 2005). Análisis recientes de toxicidades cutáneas del inhibidor de EGFR (EGFRI) muestran que el infiltrado inflamatorio temprano de la erupción está dominado por células dendríticas, macrófagos, granulocitos, mastocitos y células T. La inhibición de EGFR induce la expresión de quimiocinas (CCL2, CCL5, CCL27, CXCL14) en los queratinocitos epidérmicos, mientras que la producción de péptidos antimicrobianos y proteínas de la barrera cutánea como la ARNasa 7 se ve afectada. La toxicidad cutánea observada in vivo podría traducirse in vitro mediante el uso de un sistema de queratinocitos primario en combinación con el análisis Q-PCR. (Lichtenberger, Gerber y otros, Science Translational Medicine, 2013). El efecto de PB4522 en comparación con MEHD7945A y cetuximab se probó a concentraciones de 10 y 100 nM en queratinocitos epidérmicos primarios humanos. Se aislaron y sembraron queratinocitos epidérmicos primarios humanos a una densidad de 100 000 células por pocillo en placas de 6 pocillos en medio de crecimiento celular SFM (Invitrogen) a 37 °C, 5 % de CO2. Las células se trataron en ausencia o presencia de 10 ng/ml de TNF-a (AbD Serotec, Kidlington, Reino Unido) y 5 ng/ml de IL-1p (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) durante 24 horas. Se prepararon duplicados de cada condición. Veinticuatro horas más tarde, se recolectaron las células y se extrajo el ARN de las células mediante el uso del reactivo TRIzol®. El ADNc se sintetizó a partir de diferentes moldes de ARN mensajero (ARNm) mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos específicos de genes para qPCR se obtuvieron como ensayos de expresión génica TaqMan® por Applied Biosystems. Se determinó la expresión de CXCL14 y ARNasa 7, así como también los genes de mantenimiento de 18S y GAPDH. El PB4522 induce menos CXCL14 en comparación con Cetuximab y MEHD7945A. Por el contrario, la expresión de ARNasa 7 fue menos severamente obstaculizada por PB4522 en comparación con Cetuximab y MEHD7945A.
El PB4522 muestra una actividad ADCC superior en comparación con MEHD7945A
La actividad de ADCC es un mecanismo de acción antitumoral importante para los anticuerpos terapéuticos en el cáncer. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos a la familia de receptores HER como cetuximab y trastuzumab inducen la ADCC. Se han usado múltiples estrategias para lograr la mejora de ADCC, incluida la glicoingeniería y la mutagénesis. Todos ellos buscan mejorar la unión de Fc a FcYRIIIa de activación de baja afinidad y/o reducir la unión al inhibidor de baja afinidad FcYRIlb. Uno de los métodos usados en glicoingeniería para lograr la mejora de ADCC es la eliminación de fucosa. La eliminación de fucosa ha resultado en un aumento de la actividad antitumoral en varios modelos in vivo [Junttila, 2010]. Para maximizar la actividad de PB4522, se aplicó esta tecnología de afucosilación (Liu y Lee. 2009 [13-17]) para eliminar la fucosa de la estructura de carbohidratos ligada a N en la región Fc.
Para determinar la actividad ADCC de PB4522 en comparación con MEDH7945a y cetuximab, se usó el Bioensayo Reportero de ADCC (Promega). Se probaron tres líneas celulares diferentes; la línea celular A431 de cabeza y cuello que expresa EGFR amplificada y alta, la línea celular A549 de cáncer de pulmón que expresa EGFR intermedia y la línea celular BxPC3 de cáncer de páncreas que expresa EGFR intermedia.
El bioensayo usa células Jurkat modificadas genéticamente que expresan de forma estable el receptor de FcYRIIIa, V158 (alta afinidad) o la variante F158 (baja afinidad), y un elemento de respuesta NFAT que impulsa la expresión de luciferasa de luciérnaga, que es una medida para la activación de FcyR. El ensayo se ha validado comparando los datos obtenidos con este Bioensayo Reportero de ADCC con el ensayo de liberación de 51Cr clásico y ambos ensayos arrojan resultados similares. Los ensayos de ADCC se realizaron mediante el uso del kit Promega ADCC Bioassay mediante el uso de placas de 384 pocillos blancos. En esta configuración experimental, se sembraron en placa células A431, células BxPC3 y células A549, a una densidad de 1000 células/pocillo en 30 pl de medio de ensayo (RPMI con suero de IgG bajo al 4 %) 20-24H antes del bioensayo. Al día siguiente, se retiró el medio de cultivo. A continuación, se prepararon por duplicado una dilución en serie de anticuerpos, PB4522 y sus anticuerpos comparadores cetuximab, MEHD7945A y un anticuerpo Ctrl. Se añadieron a los pocillos 10 pl de estas diluciones de anticuerpos. Las concentraciones iniciales de los anticuerpos fueron 10 pg/ml y se generaron diluciones seriadas de 10 puntos 5 veces para proporcionar curvas de dosis-respuesta completas. Finalmente, se añadieron 5 pl de células efectoras del bioensayo de ADCC (15000 células/pocillo, V158). Las células se incubaron durante 6 horas a 37 °C. A continuación, se añadieron 15 pl de sustrato de luciferasa BIO-Glo y 5 minutos después se detectó luminiscencia en un lector de placas. Los datos obtenidos se muestran en la Figura 13. Tanto PB4522 como cetuximab mostraron actividad ADCC hacia el medio EGFR que expresa células BxPC3 y A549 de manera que la CE50 de cetuximab fue menor en comparación con PB4522. Sin embargo, la actividad de ADCC total (área bajo la curva (AUC)) y la actividad de ADCC máxima de PB4522 fueron más altas en comparación con cetuximab. Los tres anticuerpos mostraron actividad ADCC hacia la línea celular A431 amplificada con EGFR, de manera que cetuximab mostró la actividad ADCC más alta seguida por PB4522 y Cetuximab. Es de destacar que las líneas celulares que expresan EGFR intermedias son representativas del número de EGFR expresadas en muestras de células tumorales derivadas de pacientes. En las tres líneas celulares, la ADCC máxima y el AUC de PB4522 son mayores en comparación con MEHD7945A. En las tres líneas celulares, la CE50 de PB4522 es menor en comparación con MEHD7945A.
HER3
El análisis de la unión de IgG PG3178 a 0,25 pg/ml a mutantes de HER3 ECD en FACS dio como resultado la identificación de dos residuos denominados "críticos" (F409, R426) para los que la mutación a alanina causó una pérdida sustancial de unión en comparación con WT HER3, mientras que se retuvo la unión del mAb de control (Tabla 7 y Figura 17). Ambos residuos están ubicados en el dominio III de h ER3 y espacialmente distantes. Además, el F409 está enterrado en el núcleo hidrófobo de HER3, lo que hace que sea poco probable que forme parte del epítopo PG3178.
Experimentos de confirmación del epítopo de HER3
Se transfectaron células CHO-K1 con construcciones de mutación de HER3 ECD (enumeradas en la Tabla 7), WT HER3 ECD y dos construcciones de control (H407A e Y424A). La unión de PG3178 a las variantes de ECD de He R3 se probó en un experimento de titulación de FACS. Se incluyeron dos anticuerpos de control, dominio I (MM-121) de unión y dominio III (MEHD7945A) de HER3 para verificar la expresión de ECD de HER3 en la superficie celular. Se trazaron los valores medios de MFI y para cada curva se calculó el AUC mediante el uso del software GraphPad Prism 5. Se usó la unión de WT HER3 para normalizar los datos. Se demostró que la mutación R426A es crítica para la unión de PG3178, mientras que la unión a F409A no pudo confirmarse debido a la pérdida de expresión en la superficie celular (Figura 18).
Referencias citadas en los ejemplos
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5. Giard, D.J., y otros, In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. J Natl Cancer Inst, 1973. 51(5): p. 1417-23.
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10. Pastore S, Mascia F, Mariotti F, Dattilo C, Mariani V, Girolomoni G. ERK1/2 regulates epidermal chemokine expression and skin inflammation. J Immunol. 2005;174(8):5047-5056.
11. Lichtenberger BM, Gerber P a., Holcmann M, y otros. Epidermal EGFR Controls Cutaneous Host Defense and Prevents Inflammation. Sci Transl Med. 2013;5:199ra111-199ra111. doi:10.1126/scitranslmed.3005886.
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13. ADCC Enhancement Technologies for Next Generation Therapeutic Antibody. Cheng Liu y Andreia Lee. Antibody therapeutics -Trends in Bio/Pharmaceutical Industry 2009 [13-17]
Tabla 1: Descripción general de las bibliotecas de anticuerpos en fagos generadas a partir de ratones inmunizados con EGFR.
N o . R a tó n T a m a ñ o d e F re c u e n c ia C lo n e s ú n ic o s B ib lio te c a la b ib lio te c a d e l in s e r to
M U 155 E 094 # r ¿ y . 1 Í0 Q 4 # 18 a .M E q e
Figure imgf000029_0001
¡V1L1156 E0Í?4#14 y 1 ÍQ 94 # 1 (i f i i f iO l i+ O f i 100 % í)7 %
Tabla 2: Descripción general de los anticuerpos anti-EGFR conocidos usados para mapear los epítopos de los anticuerpos de fagos seleccionados. N/A: no aplica.
N o m b r e d e l a n t ic u e rp o P G n r ( p r o v e e d o r N ú m e ro d e C a tá lo g o E s p e c if ic id a d d e d o m in io ICR10 Abcam ab231 1
E G F R .l Th erm o scientific M S -311 -P ll
M a tu iu M a b PG29B2pQ2 n/.a III
C etuxim ab M e r c k f lo t e c lín ic o ] n /a III
Tabla 3: Descripción general de la especificidad de dominio (según lo evaluado por FACS usando los mutantes de “dominio de intercambio” y la funcionalidad de los anticuerpos anti-EGFR. Se comparó la funcionalidad con el anticuerpo cetuximab usado clínicamente. Actividad IgG de cLC anti-EGFR (códigos PG) en la inhibición de muerte celular inducida por EGF en células A431, en comparación con la actividad de cetuximab en ese ensayo. ND no determinado. Variante III: específica de la variante III de EGFR. Los códigos PG representan anticuerpos monoclonales IgG1 de longitud completa.
N ú m e r o A n t ic u e r p o O r ig e n d e l E s p e c if ic id a d R e a c t iv id a d R e a c t iv id a d A ctiv ida d de b lo q u e o d( d e l g r u p o r e p r e s e n t a t iv o a n t ic u e r p o d e l d o m in io c ru z a d a d e c ru z a d a c o n EGFR en co rrp a ra c ió n p r o b a d o E G F R r a tó n c y n o m o lg u s con ce tu x irra b 1 F G 309 S M e M o N o Sí
Figure imgf000029_0002
P G 401 Ü M t*M o m
2 P G 42 R Í) M pM j N o Sí
Figure imgf000029_0003
P U 4003 M e M o i
3 ■ P G 400 O M é M o Í V N o ' . S í < 5 %
4 P G 4 Ó 16 M e M n i N o Sí < 5 %
5 P & 4033 M eM o II No S í j '
6 PG4034 M oM o 11 No Sí '
*7 ... PG4Ü35 M e íío IV No Sí
8 PG4032 Mp Mo 111 No Sí
9 PG4284 M eM o IG No Sí
10 P G ii s f i M pMo 1L1 No Sí
11 PG4280 M rM o . Nn
[11 Sí '
12 PG42KÍ M eM o No
Variante III Sí
13 PG4281 M eM o U1 No Sí
14 P G 4 m M eM o I1I/IV No Sí
Figure imgf000030_0001
15 PG4285 MoMo Variante III No Sí
10 PG4287 M eM o lll No Sí <10%
IT PG435& M éM o No N D Sí N D
10 PG3870 Librería S í Sí 80%
sintética III
Tabla 4: Lista de anticuerpos biespecíficos antagonistas anti-EGFR x anti-HER3 (códigos PB) probados para la inhibición de la proliferación celular de BxPC3-Luc2. Se demostró que estos brazos anti-EGFR y anti-HER3 eran activos como un anticuerpo monoclonal monoespecífico en la inhibición del crecimiento de células tumorales controlado por ligando (EGF o NRG). La tabla muestra el número de la proteína biespecífica (PB) que se compone de los brazos de unión respectivos a EGFR y HER3 (por ejemplo, PB4510 se compone de MG3998 y MG3178). La secuencia de cadena VH de varias cadenas de MG se indica con MF seguido por el número en la Figura 11. Los códigos PB representan anticuerpos biespecíficos IgG1 de longitud completa.
HKR3
EG FK MG3178 MG3176 MG3163 MG3157 MGS156 MG3125
MG3908 PB4ñ 10 PB4&5B PB 4533 PB4ñ79 P B 463Í FB 4854
MG3999 P B 451 i PB4557 PB4534 PB4580 PB4t¡](í PB4639
MG4010 PB4512 PB4&58 PB 4536 PB4581 PB 4817 PB464Ó
MG4013 PB4514 PB 4660 PB4537 PB4583 PB4Ü18 PH4tí4l
MG3751 PB4518 FE45G4 PB4541 PB4587 PP4G20 F134643
MG3752 PB4519 PB4065 PB4542 PIM588 PB4Ü21 PB4844
MG4025 PB4521 PB4537 P B 15Í4 PB45Í50 PP4G22 PB1ÍH5
MG4280 PB 4522 PB45G8 PB4545 PB45ÍU P134623 PD404G
MG4290 ÍPB4523 PB 4539 PR4540 FB4592 Fri4fs24 PB4647
MG4281 PB4524 PB4570. PB4547 PE4SB3 PB4ÍÍ25 PB4G48
MG4284 PB 4525 PB4571 PB 4648 PB45D4 PB4G26 PB4G49
MG3370 PB 4626 PB4572 PB4549 PD4595 PÍ34827 PB4850
MG4002 PB 4527 PB4573 PB 4550 PE45ÍXÍ PB 4628 PB4G51
MG4003 PB 4528 PB4574 PB4551 PB4597 PB4G29 PB4G52
MG4280 PB4529 TE4575 PB4552 FB45ÍÜB PB 4630 PB4653
MG4011 Pl?451$ PB4559 PB4536 PB4582 PB 4832 PB4655
MG4014 r B 4515 PE4R61 PB 4538 PB 4584 PB4G33 PB4G5G
MG3756 PB4517 PB4/568 PB 4540 PB4G86 PB4G34 PB4657
MG4023 PB4520 PIPI 568 PH4543 PB4589 PB4G3G PH4(i58
Tabla 5: Lista de seis anticuerpos biespecíficos anti-EGFR x anti-HER3 que se seleccionaron para pruebas in vivo en el modelo ortotópico BxPC3-Luc2 y su valor CI50 para la inhibición de la proliferación celular BxPC3 controlada por ligando.
Figure imgf000031_0001
P B 4510 MG3178 MG3998 D o m in io III t
P B 4522 MG3178 MG4280 D o m in io III 13
P B 4528 MG3178 MG4003 D o m in io 1 29
PB 4535 MG3163 MG4010 D o m in io III 65
P B 1519 MG31G3 MG3370 D o m in io III 250
P B 4552 MG3163 MG4289 D o m in io 1 62
M EHD7945A N/A N/A D o m in io III 2G0
Tabla 6: Valores de CI50 para la inhibición de la proliferación celular BxPC3 para los diferentes formatos de anticuerpos probados: los anticuerpos biespecíficos (PB) anti-EGFR x HER3 de mayor potencial, o una mezcla de los anticuerpos parentales bivalentes monoespecíficos (PG).
Figure imgf000031_0002
. [•
P B 4510 M G3178 M G3998 13
P G 3178 260
P G 3998
P B 4522 M G3178 M C4280 27
P G 3178 390
P G 4280
P B 4528 M G3Í78 MG4003 29
P G 3178 80
PG40G3
P B 4535
Figure imgf000031_0003
M C 4010 65
P G 3163 670
P G 4010
P B 4549 MG3163 M G 3370 25:3
P G 3163 7-53
P G 3370
P B 4ñ 52 MR31&3 M C4289 62
P G 3163 767
P G 4289
M EH D 7945A N/A N/A 287
Tabla 7. Las reactividades (e intervalos) de la proteína de unión media se enumeran para ambos residuos críticos. Los residuos críticos implicados en la unión de PG3178 se identificaron como aquellos mutados en clones que eran negativos para la unión del mAb PG3178 (< de 20 % en peso) pero positivos para la unión del mAb control 66223 (> de 70 % en peso). La numeración de residuos es la de PDB ID # 4P59.
Figure imgf000031_0004
Tabla 8. Lista de residuos expuestos dentro de un radio de 11,2 A de Arg 426 en HER3:
Figure imgf000032_0001
Referencias citadas en la descripción
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13. Merchant y otros, Nature Biotechnology, Volumen 16, Julio 1998 pp 677-681
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24. WO 2013/157954 A1

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable con un primer sitio de unión al antígeno que se une a e Gf R y un segundo dominio variable con un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de NNAIN (SEQ ID NO: 18), WINTITGDPTYAQGFTG (SEQ ID NO: 20) y EEFLEWLFFDY (SEQ ID NO: 22) respectivamente, o una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 NNAIN (SEQ ID NO: 18), WINTITGDPTYAQGFTG (SEQ ID NO: 20) y EEFLEWLFFDY (SEQ ID NO: 22) y dicho segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91) y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92) respectivamente o una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 Gy Y m H (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91) y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92), y en donde dicho primer y segundo dominios variables comprenden una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG
    VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSV
    FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS
    TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 153).
    Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable con un primer sitio de unión al antígeno que se une a e Gf R y un segundo dominio variable con un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en donde dicho primer dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de ELSMH (SEQ ID NO: 9), GFDPEYGKTFFAQNFQG (SEQ ID NO: 11) y EGYYETTTYYYNLFDS (SEQ ID NO: 13) respectivamente o una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 ELSMH (SEQ ID NO: 9), GFDPEYGKTFFAQNFQG (SEQ ID NO: 11) y EGYYETTTYYYNLFDS (SEQ iD NO: 13), y dicho segundo dominio variable comprende una región variable de cadena pesada (VH) con una región CDR1, CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91) y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92) respectivamente o una secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difiere a lo máximo en tres aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 GYYMH (SEQ ID NO: 90), WINPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 91) y DHGSRHFWSYWGFDY (SEQ ID NO: 92), y en donde dicho primer y segundo dominios variables comprenden una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG
    VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSV
    FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS
    TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 153).
    El anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende una primera cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de:
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPE Y GKTFF AQNFQGR VTMTEDTS ADTAYMEIÜSLRSE OTA VYY C ATEG YYETTTYYY NLFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVKPKSCDKTIITCPPCPAPEU /GGPSVKLFPPKPKUTLMlSRTPEVn'CVWDVSH K
    DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKAEPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSREEMTKNQV.SETCEVKGFYPSDIAVE
    WESNGQPKNNYKTTPPVEDSIJGSFFEYSKETVDKSRWQQGNVFSCSVMIIEAUIN HYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 154) o
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPE YGKTFFAQNFQGRVTMTEDTSADTAYMELSSLRSEDTAVYYCATEGYYETTTYYY NLFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK RVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 154)
    que tiene a lo máximo 15 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones; una segunda cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de:
    QVQ [ A'QSGAÜVK KTGASVKVSC KASGYTFTGYYM H W VRQAPGQ GLEWMGWINI ’
    NSGGTNYAQKFQ G R VTMTRUTS1STAY M EUSRLKSDDTAV Y Y CAKD1IGSRLIF WS Y
    WGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSfiKSTSGGT
    AADGCLVKD YFPEPVTVSW NS GALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSS W T V P S S STXíTQ
    TYICNVNIIKPSNTKVDKRVEPKSCDKT1ITCPPCP APELLG G PSYFLFPPKPKD TLM
    IjSRTPEVTCVW DVSH ED PEVKFN W YVDG VEVH N AKTKPREEQ YN STYEW SVLT
    VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP1EKTISKAKGQPREPQVYTKPPSIÍEE6ÍTKNQ
    VS LKC ] .VKG ÍH,Y PS I) IA V B W ESN GQ P JÍNN Y K 1TP PV LDSI) GS Fl*' I -YS KI /I1 VI3 KSRWQ
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINP NSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGSRHFWSY WGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTKPPSREEMTKNQ VSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 155), que tiene a lo máximo 15 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o sus combinaciones, en donde dicha primera y segunda cadena pesada comprenden una cadena ligera común que comprende la secuencia de aminoácidos
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG
    VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSV
    FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS
    TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 153).
    Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 88 (MF3178), SEQ ID NO: 113 (MF6055), SEQ ID NO: 115 (MF6056), SEQ ID NO: 117 (MF6057), SEQ ID NO: 119 (MF6058), SEQ ID NO: 121 (MF6059), SEQ ID NO: 123 (MF6060), SEQ ID NO: 125 (MF6061), SEQ ID NO: 127 (MF6062), SEQ ID NO: 129 (MF6063), SEQ ID NO: 131 (MF6064), SEQ ID NO: 135 (MF6066), SEQ ID NO: 137 (MF6067), SEQ ID NO: 139 (MF6068), SEQ ID NO: 141 (MF6069), SEQ ID NO: 145 (MF6071), SEQ ID NO: 147 (MF6072), SEQ ID NO: 149 (MF6073) y SEQ ID NO: 151 (MF6074).
    Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, que exhibe citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).
    Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que se afucosila para mejorar la ADCC.
    Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que es un anticuerpo humano o humanizado.
    Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina diferentes con dominios de heterodimerización compatibles.
    9. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dichos dominios de heterodimerización compatibles son dominios de heterodimerización de CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina compatibles.
    10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
    11. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3.
    12. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho sujeto tiene un tumor positivo para EGFR o EGFR/ErbB-3 que tiene menos de 1000 000 de receptores de superficie celular ErbB-2 por célula.
    13. Un anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde dicha célula tumoral es una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer gástrico, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de páncreas o una célula de cáncer de pulmón.
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