JP6231503B2 - ｐＨセンサー - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許仮出願第６１／６０８，８０５号、２０１２年３月９日出願の優先権を主張し、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

蛍光センサー剤、ならびにその使用および製造の方法が本明細書に提供される。特に、周囲環境のｐＨの変化時（例えば、１つのｐＨ環境から別のものへの移動時）、蛍光（例えば、蛍光強度）に検出可能な変化を示す、センサー剤が提供される。

ｐＨの変化は、多くの生物学的および細胞プロセスを調節する。細胞内と細胞外の環境の間、ならびに多様な細胞区画の間にｐＨの差が存在する。

幾つかの実施形態において、本発明は、ローダミンクラスのコア構造と、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上）の置換ピペラジン基とを含むｐＨセンサー剤を提供する。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、２つの置換ピペラジン基を含む。幾つかの実施形態において、置換ピペラジン基は、ローダミンクラスのコア構造上のアミノ基に結合している。幾つかの実施形態において、置換ピペラジン基は、置換ピペラジンの第１の窒素でローダミンクラスのコア構造に結合している。幾つかの実施形態において、置換ピペラジン基は、置換ピペラジンの第２の窒素に結合した置換基を含む。幾つかの実施形態において、置換基はアルキル基を含む。幾つかの実施形態において、アルキル基はヘテロアルキル基を含む。幾つかの実施形態において、置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボン酸エステル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ、シアネート、ニトレート、ニトライト、ニトリル、ニトロ、ニトロソ、ピリジン、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スリフィン酸、スルホン酸、チオシアネート、チオン、チアール、ホスフィン、ホスホン酸、ホスフェート、および／またはホスホジエステル基の任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ１〜６、ｐＨ１、ｐＨ２、ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５）で蛍光性である。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、酸性ｐＨで最大限の蛍光性がある。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、中性ｐＨで最大蛍光性の１０％未満（例えば、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、約０．１％）を示す。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８）で非蛍光性である。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、中性または塩基性のｐＨで光イオン誘導性電子移動消光を受ける。幾つかの実施形態において、ローダミンクラスのコア構造は、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、カルボキシテトラメチルローダミン、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンのイソチオシアネート誘導体、スルホローダミン１０１、テキサスレッド、ローダミンレッド、またはＮＨＳ−ローダミンを含む。幾つかの実施形態において、置換ピペラジン基は、ピペラジン環および置換基を含み、置換基は、アルキル鎖または置換アルキル鎖から選択される。幾つかの実施形態において、置換アルキル鎖は、ＣＨ₂（ＣＨ₂）_nＳＯ₃ ^-およびＣＨ₂（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｈから選択され、式中、ｎ＝０〜２５（例えば、ｎ＝２〜６、ｎ＝３〜４など）である。

特定の実施形態において、ｐＨセンサーは、（式Ｉ）の一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁〜Ｒ₁₂は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み（例えば、Ｌ＝１＝）、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基であり、Ｘは、Ｏ、ＣＲ₁₇、ＭＲ₁₇であり、Ｒ₁₇は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｙ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択される。

特定の実施形態において、ｐＨセンサーは、（式ＩＩ）の一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₈は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基であり、Ｒ₉〜Ｒ₁₂は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳである。

特定の実施形態において、ｐＨセンサーは、（式ＩＩＩ）の一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₈は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基であり、Ｒ₉〜Ｒ₁₂は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基であり、Ｘは、Ｏ、ＣＲ₁₇、ＭＲ₁₇であり、Ｒ₁₇は、Ｈ、アルキル基、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択され、各ｎは、独立して２〜４であり、各個別のＲ₁₃、Ｒ₁₄、Ｒ₁₅、およびＲ₁₆は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳである。幾つかの実施形態において、１つ以上の環状構造は、Ｒ₁₃または関連するＣとＲ₃または関連するＣ、Ｒ₁₄または関連するＣとＲ₄または関連するＣ、Ｒ₁₅または関連するＣとＲ₈または関連するＣ、およびＲ₁₆または関連するＣとＲ₇または関連するＣから選択される基の間の結合により形成される。

他の実施形態において、ｐＨセンサー剤は、（式ＩＶ）の一般構造：
を含み、式中、Ｒ₂は、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₈は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、であり、Ｒ₉〜Ｒ₁₂は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基であり、Ｘは、Ｏ、ＣＲ₁₇、ＭＲ₁₇であり、Ｒ₁₇は、Ｈ、アルキル基、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択され、Ｙは、任意のＮ−Ｒ₁₈であり、Ｒ₁₈は、独立して、またはＲ₃もしくはＲ₄との環状構造の一部として環化されている任意のアルキル基またはアリール基である。

幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、（式Ｖ）の一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₆は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基である。

特定の実施形態において、ｐＨセンサー剤は、（式ＶＩ）の一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₆は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基である。

幾つかの実施形態において、本発明は、構造：
を含むｐＨセンサー剤を提供する

幾つかの実施形態において、本発明は、構造：
を含むｐＨセンサー剤を提供する。

幾つかの実施形態において、本発明は、ｐＨセンサー剤に（例えば、直接的、間接的、共有的、非共有的などにより）連結している目的の実体（entity of interest）を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、目的の実体は、タンパク質、ペプチド、多糖、脂質、巨大分子複合体、ポリヌクレオチド、核酸、または小分子から選択される。幾つかの実施形態において、目的の実体はタンパク質であり、タンパク質は、細胞表面受容体、抗体、または酵素である。幾つかの実施形態において、目的の実体は多糖であり、多糖はデキストランである。幾つかの実施形態において、目的の実体およびｐＨセンサー剤は、リンカー部分により連結されている。

本発明の特定の実施形態において、環境のｐＨを検出する方法であって、（ａ）環境にｐＨセンサー剤を接触させることと、（ｂ）ｐＨセンサー剤から蛍光（または、その欠如）を検出することと、（ｃ）蛍光におけるｐＨと相関させることと、を含む方法が提供される。幾つかの実施形態において、蛍光を相関させることは、蛍光強度を参照値（例えば、基準値、対照値、実験条件下での最大蛍光、対照条件下での最大蛍光など）と比較することを含む。

本発明の特定の実施形態は、環境のｐＨの変化をモニターする方法であって、（ａ）環境にｐＨセンサー剤を接触させることと、（ｂ）ｐＨセンサー剤から蛍光（または、その欠如）を経時的に検出することと、（ｃ）蛍光の変化を環境におけるｐＨの変化と相関させることと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、蛍光の変化は、蛍光の増加、蛍光の減少、またはその両方（例えば、蛍光の増加の後に続く減少、蛍光の減少の後に続く増加など）を含む。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤から蛍光を経時的に検出することは、蛍光のリアルタイム検出を含む。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤から蛍光を経時的に検出することは、蛍光を多様な時点で検出することを含む。

本発明の特定の実施形態は、目的の実体が第１のｐＨ環境から第２のｐＨ環境に移動するのを検出する方法であって、（ａ）第１のｐＨ環境にｐＨセンサー剤を接触させることと、（ｂ）第１のｐＨ環境におけるｐＨセンサー剤の蛍光（または、その欠如）を検出することと、（ｃ）ｐＨセンサー剤の蛍光をモニターすることと、を含み、蛍光の変化（例えば、増加または減少）が、第２のｐＨ環境へのｐＨセンサー剤の移動を示す方法を提供する。幾つかの実施形態において、第１のｐＨ環境は細胞外であり、第２のｐＨ環境は細胞内である。幾つかの実施形態において、蛍光はリアルタイムでモニターされる。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は多様な時点で検出される。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は目的の実体に連結されている。幾つかの実施形態において、目的の実体は、タンパク質、ペプチド、多糖、脂質、ポリヌクレオチド、核酸、または小分子から選択される。幾つかの実施形態において、目的の実体はタンパク質であり、タンパク質は、細胞表面受容体、抗体、または酵素である。

幾つかの実施形態において、本発明は、ローダミンクラスのコア構造と１つ以上（例えば、２つ）の置換ピペラジン基とを含むｐＨセンサー剤に連結されている目的の実体（例えば、分子、タンパク質、ペプチド、粒子、複合体、巨大分子、化合物、核酸、ポリヌクレオチドなど）を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、目的の実体は、粒子（例えば、ナノ粒子、ビーズ、ウイルス粒子など）、タンパク質、ペプチド、多糖、脂質、巨大分子複合体、ポリヌクレオチド、核酸、または小分子から選択される。幾つかの実施形態において、目的の実体は、タンパク質またはペプチドである。幾つかの実施形態において、タンパク質は、細胞表面受容体、抗体、または酵素である。幾つかの実施形態において、目的の実体は多糖であり、多糖はデキストランである。幾つかの実施形態において、目的の実体（例えば、分子、粒子、複合体、巨大分子、化合物など）およびｐＨセンサー剤は、リンカー部分により連結されている。幾つかの実施形態において、目的の実体は、ランタニド錯化基；ニッケル錯化基；コバルト錯化基；エチレンジアミン四酢酸；ニトリロ酢酸；ヌクレオチド；酵素の基質；酵素の阻害剤、好ましくは酵素と共有結合を形成する酵素の不可逆的阻害剤；受容体の作動薬；少なくとも１０μＭのＫＤで核酸に結合するリガンド；少なくとも１０μＭのＫＤでタンパク質に結合するリガンド；ＳＮＡＰタグの基質；ＣＬＩＰタグの基質；Ｈａｌｏタグの基質；ジヒドロ葉酸レダクターゼに結合するリガンド；メトトレキセート；トリメトプリム；ビオチンリガーゼの基質；ホスホパンテテイントランスフェラーゼの基質；リポ酸リガーゼの基質；ビオチン；ストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラアビジンに結合するリガンド；酵素の補助因子；ホルモン；毒素；蛍光体；核酸ポリマー；ハプテン；抗原；薬物；脂質会合体；非生物学的有機ポリマー；高分子微粒子；動物細胞植物細胞；細菌、酵母；ウイルス；または原生生物である。

幾つかの実施形態において、本発明は、環境のｐＨを検出する方法であって、（ａ）ローダミンクラスのコア構造および１つ以上の（例えば、２つ）の置換ピペラジン基を含むｐＨセンサー剤を、環境と接触させることと、（ｂ）ｐＨセンサー剤から蛍光（または、その欠如）を検出することと、（ｃ）蛍光をｐＨと相関させることと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、蛍光を相関させることは、蛍光強度を対照値（例えば、陽性もしくは陰性対照からのもの、異なる時点のセンサーからのもの、または異なる環境からのものなど）と比較することを含む。

幾つかの実施形態において、本発明は、環境のｐＨにおける変化をモニターする方法であって、（ａ）ローダミンクラスのコア構造および１つ以上の（例えば、２つ）の置換ピペラジン基を含むｐＨセンサー剤を、環境と接触させることと、（ｂ）ｐＨセンサー剤から蛍光（または、その欠如）を経時的に検出することと、（ｃ）蛍光の変化をｐＨの変化と相関させることと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤から蛍光を経時的に検出することは、蛍光のリアルタイム検出を含む。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤から蛍光を経時的に検出することは、蛍光を多様な時点（例えば、開始時点、終了時点、その間の時点）で検出することを含む。

幾つかの実施形態において、本発明は、目的の実体（例えば、分子、粒子、複合体、巨大分子、化合物、核酸、ポリヌクレオチドなど）が第１のｐＨ環境から第２のｐＨ環境に移動するのを検出する方法であって、（ａ）ローダミンクラスのコア構造および１つ以上（例えば、２つ）の置換ピペラジン基を含むｐＨセンサー剤を、第１のｐＨ環境と接触させることと、（ｂ）第１のｐＨ環境におけるｐＨセンサー剤の蛍光を検出することと、（ｃ）ｐＨセンサー剤の蛍光をモニターすることと、を含み、蛍光の変化が、第２のｐＨ環境へのｐＨセンサー剤の移動を示す方法を提供する。幾つかの実施形態において、第１のｐＨ環境は細胞外であり、第２のｐＨ環境は細胞内である。幾つかの実施形態において、第１のｐＨ環境は、細胞区画および／またはオルガネラであり、第２のｐＨ環境は、細胞質、または第２の細胞区画および／もしくはオルガネラである。幾つかの実施形態において、第１のｐＨ環境は、塩基性または中性であり、第２のｐＨ環境は酸性である。幾つかの実施形態において、第１のｐＨ環境は酸性であり、第２のｐＨ環境は、塩基性または中性である。幾つかの実施形態において、蛍光はリアルタイムでモニターされる。幾つかの実施形態において、蛍光は多様な時点で検出される。幾つかの実施形態において、蛍光の変化は、蛍光の増加である。幾つかの実施形態において、蛍光の変化は、蛍光の減少である。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、目的の実体（例えば、分子、粒子、複合体、巨大分子、化合物、核酸、ポリヌクレオチドなど）と連結されている。幾つかの実施形態において、目的の実体は、タンパク質、ペプチド、多糖、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、または小分子から選択される。幾つかの実施形態において、目的の実体はタンパク質であり、タンパク質は、細胞表面受容体、抗体、または酵素である。

特定の実施形態において、本発明は、ｐＨセンサー剤またはｐＨセンサー剤を含む組成物を容器の中に含むキットを提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、第２の実体に連結されているｐＨセンサー剤を容器の中に含むキットを提供する。特定の実施形態において、第２の実体は、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、小分子、分子、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、粒子（例えば、ウイルス粒子、ナノ粒子など）、複合体、巨大分子、化合物などから選択される。幾つかの実施形態において、キットは、追加の構成成分、試薬、対照、基質、および／または材料を更に含む。

ｐＨセンサー化合物（ａ）ＰＢＩ−４４５３、（ｂ）ＰＢＩ−４４７９、（ｃ）ＰＢＩ−４９５９、（ｄ）ＰＢＩ−５００４、および（ｅ）ＰＢＩ−５１８３の分子構造を示す。 （ａ）化合物ＰＢＩ−４４５３および（ｂ）化合物ＰＢＩ−４４７９の蛍光発光スペクトルを示す。 化合物（ａ）ＰＢＩ−４４５３、（ｂ）ＰＢＩ−４４７９の蛍光発光のｐＨ依存性を実証するグラフを示す。 化合物（ｃ）ＰＢＩ−４９５９、（ｄ）ＰＢＩ−５００４の蛍光発光のｐＨ依存性を実証するグラフを示す。 化合物（ｅ）ＰＢＩ−５１８３の蛍光発光のｐＨ依存性を実証するグラフを示す。 ＰＢＩ−４４７９の発光および励起蛍光強度プロフィールを実証するグラフを示す。 ＰＢＩ−４４７９の−２０℃での安定性プロフィールを表示するグラフを示す。 ＰＢＩ−４４７９の４℃での安定性プロフィールを実証するグラフを示す。 ＰＢＩ−４４７９の室温での安定性プロフィールを実証するグラフを示す。 ｐＨセンサーＰＢＩ−４４７９の蛍光発光強度および（ＨＰＬＣを介して）純度を示す。 Ｕ２−ＯＳ細胞におけるＰＢＩ−４４７９およびＰＢＩ−４４５３の毒性プロフィールを実証するグラフを示す。 Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＮＬＳ細胞におけるＰＢＩ−４４７９の不浸透性を実証する発光細胞生存率アッセイを示す。 Ｕ２−ＯＳ細胞におけるＰＢＩ−４４７９による非特異的標識化の欠如を示す。 ＰＢＩ−４４７９を使用したＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の内部移行の検出を示す。 ＰＢＩ−４４７９を使用したＨａｌｏＴａｇ−Ｂ２ＡＲの内部移行の検出を示す。 ＰＢＩ−４４７９を使用したＨａｌｏＴａｇ−ＤＯＲ１の内部移行の検出を示す。 ＰＢＩ−４４７９を使用したＨａｌｏＴａｇ−ＥＧＦＲの内部移行の検出を示す。 落射蛍光による受容体の内部移行の検出を示す。 ダイナミン（Ｋ４４Ａ）によるＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の内部移行の防止を示す。 ＤＹＮＡＳＯＲＥによるＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の内部移行の阻止を示す。 ＤＹＮＡＳＯＲＥの洗い出しによるＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の内部移行の回復を示す。 例示的なｐＨセンサー剤を示す。 細胞内におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４４７９、ＰＢＩ−４９５９、およびＰＢＩ−５００４の非毒性を示す。 野生型Ｕ２−ＯＳ細胞におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４４７９、ＰＢＩ−４９５８、ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９９４、ＰＢＩ−４９９５、およびＰＢＩ−５００４の非特異的結合の程度を示す。 非刺激Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４４７９の標識化およびバックグラウンドの程度を示す。 非刺激Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４９５８の標識化およびバックグラウンドの程度を示す。 非刺激Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４９５９の標識化およびバックグラウンドの程度を示す。 非刺激Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４９９４の標識化およびバックグラウンドの程度を示す。 非刺激Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４９９５の標識化およびバックグラウンドの程度を示す。 非刺激Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株におけるｐＨセンサーＰＢＩ−５００４の標識化およびバックグラウンドの程度を示す。 Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株における作動薬刺激の後の、ｐＨセンサーＰＢＩ−４４７９の輝度を示す。 Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株における作動薬刺激の後の、ｐＨセンサーＰＢＩ−４９５８の輝度を示す。 Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株における作動薬刺激の後の、ｐＨセンサーＰＢＩ−４９５９の輝度を示す。 Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株における作動薬刺激の後の、ｐＨセンサーＰＢＩ−４９９４の輝度を示す。 Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株における作動薬刺激の後の、ｐＨセンサーＰＢＩ−４９９５の輝度を示す。 Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１安定細胞株における作動薬刺激の後の、ｐＨセンサーＰＢＩ−５００４の輝度を示す。 ＨａｌｏＴａｇ−ＮＬＳを安定して発現しているＵ２−ＯＳ細胞におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４４７９の不浸透性を示す。 ＨａｌｏＴａｇ−ＮＬＳを安定して発現しているＵ２−ＯＳ細胞におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４９９４およびＰＢＩ−４９９５の不浸透性を示す。 ＨａｌｏＴａｇ−ＮＬＳを安定して発現しているＵ２−ＯＳ細胞におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４９５８およびＰＢＩ−４９５９の不浸透性を示す。 ＨａｌｏＴａｇ−ＮＬＳを安定して発現しているＵ２−ＯＳ細胞におけるｐＨセンサーＰＢＩ−５００４の浸透性を示す。 １ｕＭのＳ１Ｐを有する細胞不浸透性ｐＨセンサーＰＢＩ−４９５９を使用した、ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の内部移行を検出する能力を示す。 １ｕＭのＳ１Ｐを有さない細胞不浸透性ｐＨセンサーＰＢＩ−４９５９を使用した、ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１のバックグラウンド内部移行を検出する能力を示す。 １ｕＭのＳ１Ｐを有する細胞不浸透性ｐＨセンサーＰＢＩ−４９７９を使用した、ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の内部移行を検出する能力を示す。 １ｕＭのＳ１Ｐを有さない細胞不浸透性ｐＨセンサーＰＢＩ−４９５９を使用した、ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１のバックグラウンド内部移行を検出する能力を示す。 １ｕＭのＳ１Ｐを有する、または有さない刺激の後の、細胞浸透性ｐＨセンサーＰＢＩ−５００４を使用した、ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の内部移行を検出する能力を示す。 Ｕ２−ＯＳ細胞におけるＦＡＣＳ陰性対照を示す。 Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＣＳ細胞におけるｐＨセンサーＰＢＩ−４４７９を使用したＦＡＣＳ分析を示す。 塩基および酸により滴定されたときの、ＰＢＩ−４４７９の単一試料の蛍光強度の損失および回復を示す。

定義
本明細書で使用されるとき、用語「最大蛍光」は、任意の特定の蛍光剤の（例えば、特定のアッセイ、特定の条件下、特定の環境などにおける）ピーク蛍光強度を意味する。

本明細書で使用されるとき、用語「環境」は、空間に存在する薬剤または実体に影響を与え得る特定の化学的および物理的特性を有する任意の物理的空間を意味する。例示的な環境には、インビトロ環境、インビボ環境（例えば、動物の全身）、細胞内環境、エンドソーム環境、細胞外環境、膜内環境などが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用されるとき、用語「実体（entity）」は、任意の別個に識別可能または限定可能な分子単位を意味する。実体は、天然または合成の作成物であり得、水素分子（Ｈ₂）と同じくらい小さい、またはタンパク質、リボヌクレオタンパク質複合体、合成粒子、ポリヌクレオチド、核酸、またはウイルス粒子と同じほどの大きさであり得る。

本明細書で使用されるとき、用語「反応性基」は、共有結合のためにパートナー化学部分と反応することができる化学部分を意味する。部分は、単一のパートナー部分、一連のパートナー部分との高い反応性に基づいて、または多くのパートナーとの反応性に基づいて反応性基と考慮され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は、特定された数の炭素原子を有する、または数が特定されていない場合、２０個までの炭素原子を有する、直鎖、分岐鎖、および環状の基を含む飽和脂肪族基を意味する。用語「Ｃ₄〜Ｃ₆アルキル」は、本明細書で使用されるとき、炭素が４〜６個の炭素原子の直鎖または分岐鎖を意味する。用語「シクロアルキル」は、本明細書で使用されるとき、炭素の数が特定されない限り、３〜２０個の炭素原子を有する単環式、二環式、または三環式の脂肪族環（例えば、Ｃ₆シクロアルキル、シクロヘキサンなど）を意味する。「ヘテロアルキル」は、アルコキシ、アミノ、イミノ、イミド、アルキル、アルキルアミノ、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、メルカプト、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキサルデヒド、カルボキシル、カルボアルコキシ、およびカルボキサミドが含まれるが、これらに限定されない１、２、３つ、またはそれ以上の置換基で置換されているアルキル基を意味し、炭素環式アリール、複素環式アリール、およびビアリール基などが含まれるが、これらに限定されず、これらの全ては場合により置換され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は、非置換または置換芳香族環（例えば、Ｎ、Ｏ、およびＳから独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を含有する５〜６員環）を意味する。「ヘテロアリール」は、アルコキシ、アミノ、イミノ、イミド、アルキル、アルキルアミノ、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、メルカプト、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキサルデヒド、カルボキシル、カルボアルコキシ、およびカルボキサミドが含まれるが、これらに限定されない１、２、３つ、またはそれ以上の置換基で置換されているアリール基を意味し、炭素環式アリール、複素環式アリール、およびビアリール基などが含まれるが、これらに限定されず、これらの全ては場合により置換され得る。好ましいアリール基には、フェニル、ピリジルル、ピリミジル、ピラジニル、トリアジル、フリル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、チアジアゾリル、およびテトラゾリハロフェニル、低級アルキルフェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナントレニル、およびナフタセニルが含まれる。アリール基への結合点は、アリール基が結合していないときに水素原子を含有する環における、任意の炭素または窒素原子と定義される。炭素または窒素原子に存在する３個までのアリール環水素は、ヘテロシクロアルキル基を参照して上記に記載されたものから選択される基により独立して置換され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆおよび／またはＩ置換基を意味する。用語「ハロアルキル」などは、異なるハロ原子の混合物を含む、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、またはＩ原子に置き換えられている少なくとも１個の水素原子を有する脂肪族炭素ラジカルを意味する。

用語「アルコキシド」は、本明細書で使用されるとき、直鎖または分岐鎖に配列されている１〜２０個の炭素を有するアルコールのオキシアニオンを意味する。例示的なアルコキシドには、メトキシド、エトキシド、プロポキシド、イソプロポキシド、ブトキシド、およびｔ−ブトキシドが含まれる。

蛍光センサー剤（例えば、分子）、ならびにその使用および製造の方法が本明細書に提供される。特に、周囲環境のｐＨの変化時（例えば、１つの細胞環境から別のものへの移動時）、蛍光（例えば、強度）に検出可能な変化を示す、センサー剤が提供される。

幾つかの実施形態において、センサーが存在する範囲内（例えば、細胞外、細胞内、細胞質、核、エンドソームなど）の環境（例えば、近接環境）のｐＨの変更時、蛍光特性（例えば、発光、励起、波長、振幅、強度など）における検出可能な変化（例えば、増加または減少）を示す、蛍光センサーが提供される。幾つかの実施形態において、シグナルの検出可能な変化（例えば、蛍光発光のオン／オフ、蛍光強度の低減）は、ｐＨの変化時（例えば、中性から酸性へ、中性から塩基性へ、酸性から塩基性へ、塩基性から酸性へ、弱塩基性から高度な塩基性へ、弱酸性から高度な酸性へ、など）において検出可能である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、第１のｐＨ環境（例えば、酸性）において蛍光性である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、第２のｐＨ環境（例えば、中性、塩基性）において非蛍光性である。他の実施形態において、センサー剤は、第１のｐＨ環境と比較すると、第２のｐＨ環境（例えば、中性、塩基性）において低レベルの蛍光性を示す。幾つかの実施形態において、センサー剤は、タンパク質（例えば、酵素、受容体など）、目的の分子、複合体、抗体、多糖（例えば、デキストランなど）、ウイルス粒子、核酸、ポリヌクレオチド、脂質、小分子などに、（例えば、共有的に、非共有的に、直接的に、間接的に（例えば、リンカー、または他の基、部分、もしくは分子を介して））結合および／または連結するように構成されている。

幾つかの実施形態において、本発明は、Ｒ置換窒素が非保護である、または脱保護される場合、光誘導性電子移動（ＰＥＴ）消光を示すピペラジノローダミン分子を提供する。幾つかの実施形態において、そのようなピペラジノローダミン分子は、塩基性から中性のｐＨにおいて暗く（例えば、非蛍光性であり、低レベルの蛍光性（例えば、そうでなければ同じ条件下で最大蛍光の＜１０％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、＜１％）を示し）、酸性ｐＨにおいて蛍光性（例えば、最大蛍光の＞５０％、最大蛍光の＞７５％、最大蛍光の＞９０％、最大蛍光の＞９５％、最大蛍光の９９％）である、蛍光性ｐＨセンサーをもたらす。構造的に類似しているローザミン構造は、水溶性ではなく、好ましくない／望ましくない細胞相互作用に関与する、ならびに／または（例えば、細胞オルガネラおよび／もしくは区画内において）区画化する傾向がある。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているピペラジノローダミン分子は、有用な傾向センサー剤（例えば、ｐＨセンサー剤）をもたらす。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、ローダミンのコア構造（例えば、ローダミンクラスのコア構造、ローダミン様のコア構造など）を含む。幾つかの実施形態において、ローダミンのコア構造はローダミンクラスの化合物を含む。本明細書において提供されるセンサー剤は、ローダミンコア構造の構造に限定されない。任意のローダミンクラスの化合物、ローダミン関連構造、またはローダミン誘導体が、コア構造としての使用が見出され、例えば、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、ＴＭＲのイソチオシアネート誘導体（ＴＲＩＴＣ）スルホローダミン１０１、テキサスレッド、ローダミンレッド、ＮＨＳ−ローダミン、およびこれらの誘導体である。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、ローダミンクラスのコアに結合している１つ以上のピペラジン基、ピペラジンクラスの化合物、置換ピペラジン基、またはピペラジン誘導体を含む。幾つかの実施形態において、適切なピペラジンクラスの化合物には、フェニルピペラジン、ベンジルピペラジン、ジフェニルメチルピペラジン（ベンズヒドリルピペラジン）、ピリジニルピペラジン、ピリミジニルピペラジン、１，４−置換ピペラジン、および三環式化合物が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ピペラジン基は、任意の適切な置換基および／または官能基を含む。幾つかの実施形態において、１つ以上の置換基および／または官能基は、ピペラジンクラスの化合物の任意の位置に配置されている。幾つかの実施形態において、ピペラジン基は、ローダミンクラスのコア構造のアミノ基に結合している。幾つかの実施形態において、１つのピペラジン基は、ローダミンクラスのコアのそれぞれのアミノ基に結合している。幾つかの実施形態において、置換ピペラジン基は、前記ローダミンクラスのコア構造上のアミノ基に結合している。幾つかの実施形態において、センサー剤は、２つのピペラジン基（例えば、置換ピペラジン基）を含む。幾つかの実施形態において、ピペラジン基の環窒素のうちの１個は、ローダミンコア（例えば、アミノ基）に結合している。幾つかの実施形態において、ピペラジン基は、ピペラジン基の環窒素のうちの１個に結合している置換基および／または官能基を含む。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式Ｉの一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁〜Ｒ₁₂は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基であり、Ｘは、Ｏ、ＣＲ₁₇、ＭＲ₁₇であり、Ｒ₁₇は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｙ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択される。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式ＩＩの一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＳ−Ｌ−Ｗであり、Ｒ₃〜Ｒ₈は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基であり、Ｒ₉〜Ｒ₁₂は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、例えば、ＳＥ、ヨードアセトアミド、マレイミド、酸ハロゲン化物、イソシアネート、ハロゲン化スルホニルなどから選択される反応性基であり、Ｘは、Ｏ、ＣＲ₁₃、ＭＲ₁₇であり、Ｒ₁₇は、Ｈ、アルキル基、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、Ｌ−Ｒ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択される。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式ＩＩＩの一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₈は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基であり、Ｒ₉〜Ｒ₁₂は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基であり、Ｘは、Ｏ、ＣＲ₁₇、ＭＲ₁₇であり、Ｒ₁₇は、Ｈ、アルキル基、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択され、各ｎは、独立して２〜４であり、各個別のＲ₁₃、Ｒ₁₄、Ｒ₁₅、およびＲ₁₆は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳである。幾つかの実施形態において、Ｒ₁₃または関連するＣは、Ｒ₃または関連するＣと環状構造を形成し、Ｒ₁₄または関連するＣは、Ｒ₄または関連するＣと環状構造を形成し、Ｒ₁₅または関連するＣは、Ｒ₈または関連するＣと環状構造を形成し、および／あるいはＲ₁₆または関連するＣは、Ｒ₇または関連するＣと環状構造を形成する。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式ＩＶの一般構造：
を含み、式中、Ｒ₂は、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₈は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、であり、Ｒ₉〜Ｒ₁₂は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基であり、Ｘは、Ｏ、ＣＲ₁₇、ＭＲ₁₇であり、Ｒ₁₇は、Ｈ、アルキル基、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍは、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択され、Ｙは、任意のＮ−Ｒ₁₈であり、Ｒ₁₈は、独立して、またはＲ₃もしくはＲ₄との環状構造の一部として環化されている任意のアルキル基またはアリール基である。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式Ｖの一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₆は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基である。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式ＶＩの一般構造：
を含み、式中、Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ₃〜Ｒ₆は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌは、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合の任意の適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有結合であり、Ｗは、反応性基である。

特定の実施形態において、上記の構造（式Ｉ〜ＶＩ）のＲ基（Ｒ¹〜Ｒ¹⁸）は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボン酸エステル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ、シアネート、ニトレート、ニトライト、ニトリル、ニトロ、ニトロソ、ピリジン、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スリフィン酸、スルホン酸、チオシアネート、チオン、チアール、ホスフィン、ホスホン酸、ホスフェート、および／またはホスホジエステル基の任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、１つ以上のＲ基（Ｒ¹〜Ｒ¹⁸）は、置換アルキル部分を含む。幾つかの実施形態において、置換アルキル部分は、その長さに沿った１つ以上の位置で１つ以上の官能基（例えば、官能基を含有するＯ、Ｎ、Ｓ、またはＰ）を示すアルキル鎖を含む。

好ましい実施形態において、センサー剤は、ローダミンクラスのコアおよび１つ以上のＲ置換ピペラジノ基を含む。コアは、ローダミンクラスの化合物を含み得る、それらからなり得る、またはそれらから実質的になり得る。特定の実施形態において、Ｒ置換ピペラジノ基は、ローダミンクラスのコア上の１つ以上のアミノ基に（例えば、直接的に、または適切なリンカー基を介して）結合している。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式ＶＩＩ〜ＸＩＩのうちの１つの構造：


を含み、式中、各Ｒは、独立して、炭素が１〜２０個のアルキル基（例えば、直鎖、分岐鎖、環状、もしくはこれらの組み合わせ）、置換アルキル基（例えば、ＣＨ₂ＣＯＣＨ₂ＣＯＯＨ）、または末端置換アルキル基（例えば、（ＣＨ₂）₄ＳＯ₃ ^-）を含み、Ｒ₁は、アルキル基、アリール基、置換アルキルまたはアリール基、任意の適切な官能基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、リガンド、ＮＨ（ＣＨ₂Ｏ）_u（ＣＨ₂）_v−ハロゲン（ここで、ｕ＝０〜１０であり、ｖ＝０〜１０である）など）を含む。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式ＸＩＩＩのうちの１つの構造：
を含む。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、式ＸＩＶのうちの１つの構造：
を含む。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、第１のｐＨまたはｐＨ範囲（例えば、中性、塩基性、または酸性）において非蛍光性である（例えば、蛍光を示さない）。幾つかの実施形態において、センサー剤は、塩基性ｐＨ（例えば、ｐＨ＞７、ｐＨ＞８、ｐＨ＞９、ｐＨ＞１０、その間の範囲など）において非蛍光性である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、中性ｐＨまたは、弱酸性もしくは弱塩基性のｐＨ（例えば、ｐＨ７、ｐＨ５．５〜７．５、ｐＨ５〜８、その間の範囲など）において非蛍光性である。幾つかの実施形態、センサー剤は、約ｐＨ７．２において非蛍光性である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、第１のｐＨまたはｐＨ範囲（例えば、中性、塩基性、または酸性）において弱蛍光性（例えば、最大蛍光の＜１０％、最大蛍光の＜５％、最大蛍光の＜１％）である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、塩基性のｐＨ（例えば、ｐＨ＞７、ｐＨ＞８、ｐＨ＞９、ｐＨ＞１０、その間の範囲など）において弱蛍光性（例えば、最大蛍光の＜１０％、最大蛍光の＜５％、最大蛍光の＜１％）である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、中性のｐＨ、または弱酸性もしくは弱塩基性のｐＨ（例えば、ｐＨ７、ｐＨ５．５〜６．５、ｐＨ５〜８、その間の範囲など）において弱蛍光性（例えば、最大蛍光の＜１０％、最大蛍光の＜５％、最大蛍光の＜１％）である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、約ｐＨ７．２において弱蛍光性（例えば、最大蛍光の＜１０％、最大蛍光の＜５％、最大蛍光の＜１％）である。幾つかの実施形態において、蛍光は、任意の適切な単位（例えば、計数毎秒（ＣＰＳ））の使用により測定および／または比較される。幾つかの実施形態において、蛍光は、参照測定値（例えば、参照試料、対照試料、蛍光体無含有対照など）と比べて測定および／または報告される。幾つかの実施形態において、蛍光は、（例えば、モニターされている条件下、標準条件下、対照条件下などにおける）最大または最小蛍光シグナルと比べて測定および／または報告される。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、第２のｐＨまたはｐＨ範囲（例えば、中性、塩基性、または酸性）で蛍光する。幾つかの実施形態において、センサー剤は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ＜７、ｐＨ＜６、ｐＨ＜５、ｐＨ＜４、ｐＨ＜３，その間の範囲など）において蛍光性である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ＜７、ｐＨ＜６、ｐＨ＜５、ｐＨ＜４、ｐＨ＜３，その間の範囲など）において高度に蛍光性（例えば、最大蛍光の＞５０、最大蛍光の＞６０％、最大蛍光の＞７０％、最大蛍光の＞８０％、最大蛍光の＞９０％、最大蛍光の＞９５％、最大蛍光の＞９９％）である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、ｐＨ１．０〜５．５（例えば、ｐＨ１．０、ｐＨ１．１、ｐＨ１．２、ｐＨ１．３、ｐＨ１．４、ｐＨ１．５、ｐＨ１．６、ｐＨ１．７、ｐＨ１．８、ｐＨ１．９、ｐＨ２．０、ｐＨ２．１、ｐＨ２．２、ｐＨ２．３、ｐＨ２．４、ｐＨ２．５、ｐＨ２．６、ｐＨ２．７、ｐＨ２．８、ｐＨ２．９、ｐＨ３．０、ｐＨ３．１、ｐＨ３．２、ｐＨ３．３、ｐＨ３．４、ｐＨ３．５、ｐＨ３．６、ｐＨ３．７、ｐＨ３．８、ｐＨ３．９、ｐＨ４．０、ｐＨ４．１、ｐＨ４．２、ｐＨ４．３、ｐＨ４．４、ｐＨ４．５、ｐＨ４．６、ｐＨ４．７、ｐＨ４．８、ｐＨ４．９、ｐＨ５．０、ｐＨ５．１、ｐＨ５．２、ｐＨ５．３、ｐＨ５．４、およびｐＨ５．５）の間で最大蛍光性である。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、酸性範囲（例えば、ｐＨ１〜５、ｐＨ１〜５．５、ｐＨ１〜６、ｐＨ１〜６．５、ｐＨ１〜６．９）において最大励起を示し、ｐＨが増加すると励起強度が減少し、中性範囲（例えば、ｐＨ５．５〜８．５）においてゼロまたはほぼゼロ蛍光（例えば、最大蛍光の＜１％、最大蛍光の＜５％）に達する。幾つかの実施形態において、センサー剤の蛍光は、ｐＨが（例えば、酸性から中性または塩基性のｐＨに）増加すると、減少する。幾つかの実施形態において、中性、弱酸性、または弱塩基性のｐＨ範囲（例えば、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５）における蛍光強度は、酸性のｐＨ範囲（例えば、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０）における蛍光強度の１０％未満である。幾つかの実施形態において、ｐＨにおける小さな変化（例えば、ｐＨ０．１、ｐＨ０．２、ｐＨ０．３、ｐＨ０．４、ｐＨ０．５）は、蛍光強度の変化として検出可能である。

幾つかの実施形態において、適切なセンサー剤は、第１のｐＨ（例えば、中性または塩基性）において非蛍光性または低蛍光性であるが、第２のｐＨ（例えば、酸性）において鮮明に蛍光性であること、光に対して安定であること、化学的に安定していること、生物学的環境下で安定であること、生物学的環境下で非反応性であること、細胞に対して非毒性であること、接合し得ること、別の分子または複合体との共有結合のためにリンカーまたは官能基を含有すること、水溶性であること、細胞膜浸透性であること、細胞膜不浸透性であること、シグナルを可逆的に利得／損失すること（例えば、無限可逆性）、バックグラウンドが低いこと、生体系内で区画化しないこと、細胞内に局在化すること、細胞内に局在化しないことなどの特性のうちの１つを提供する。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、水性、生物学的、および／もしくは物理学的条件下（または他の望ましい条件下）において安定している。幾つかの実施形態において、センサー剤は、生理学的条件（または他の望ましい条件下）において安定しており、少なくとも１０分間…２０分間…３０分間…１時間…２時間…６時間…１２時間…２４時間…４８時間…７２時間…９６時間、その間の範囲、またはそれ以上）の半減期を示す。幾つかの実施形態において、センサー剤は、広範囲のｐＨ、例えば、ｐＨ０．５…ｐＨ１．０…ｐＨ２．０…ｐＨ３．０…ｐＨ４．０…ｐＨ５．０…ｐＨ６．０…ｐＨ７．０…ｐＨ８．０…ｐＨ９．０…ｐＨ１０．０、その間の範囲、またはそれ以上において安定している。幾つかの実施形態において、センサー剤は、広範囲の塩または緩衝剤濃度（例えば、０ｎＭ…１０ｎＭ…１００ｎＭ…１μＭ…１０μＭ…１００μＭ…１ｍＭ…１０ｍＭ…１００ｍＭ…１Ｍ…１０Ｍ、その間の範囲、またはそれ以上）において安定している。

幾つかの実施形態において、細胞膜（例えば、形質膜、核膜、オルガネラ膜（例えば、エンドソーム膜、ミトコンドリア膜、葉緑体膜など）など）を受動的に横断する蛍光センサー剤が提供される。幾つかの実施形態において、センサー剤は、１つのｐＨ環境（例えば、酸性、塩基性、中性、またはそれらの多様な程度）から別のもの（例えば、酸性、塩基性、中性、またはそれらの多様な程度）へ膜を横断する時に蛍光の検出可能な変化を示す。幾つかの実施形態において、センサー剤は膜不浸透性である。幾つかの実施形態において、センサー剤は、１種類以上の生体膜（例えば、形質膜、核膜、エンドソーム膜、ミトコンドリア膜、葉緑素膜など）を（例えば、受動的に、および／または他の方法で）横断することができない。幾つかの実施形態において、センサー剤は、担体なしでは１種類以上の膜を横断することができない。幾つかの実施形態において、センサー剤は、細胞浸入を得るためにエンドサイトーシスを必要とする。

幾つかの実施形態において、蛍光センサー剤は、目的の実体（例えば、ペプチド、タンパク質、多糖、脂質、小分子、分子、核酸、ポリヌクレオチド、粒子（例えば、ウイルス粒子、ナノ粒子など）、複合体、巨大分子、化合物など）に（例えば、共有的または非共有的に）結合している。幾つかの実施形態において、蛍光センサー剤は、第１の環境（例えば、細胞外、中性ｐＨなど）から第２の環境（細胞内、酸性など）への目的の実体（例えば、分子、粒子、複合体、巨大分子、化合物、核酸、ポリヌクレオチドなど）の移動をモニターする。幾つかの実施形態において、蛍光センサー剤は、目的の実体の周囲環境におけるｐＨの変化をモニターするために、目的の実体に結合している。幾つかの実施形態において、目的の実体への結合は可逆的（例えば、切断可能（例えば、光切断可能、化学的に切断可能、酵素的に切断可能））である。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、別の実体に共有結合している、非共有共役している、生体接合している（例えば、デキストラン）、および／または抗体接合している。幾つかの実施形態において、センサー剤は、細胞により内部移行している（例えば、エンドサイトーシスにより取り込まれている）別の実体に共有結合している、非共有共役している、生体接合している（例えば、デキストラン）、および／または抗体接合している。幾つかの実施形態において、センサー剤は、目的の実体（例えば、分子、粒子、複合体、巨大分子、化合物、核酸、ポリヌクレオチドなど）と共有結合している。幾つかの実施形態において、センサー剤は、目的のタンパク質（例えば、細胞表面受容体）および／またはタンパク質複合体に共有結合している。幾つかの実施形態において、センサー剤は、目的の実体に非共有的に配位されている。幾つかの実施形態において、センサー剤は、目的のタンパク質（例えば、細胞表面受容体）および／またはタンパク質複合体に非共有的に配位されている。幾つかの実施形態において、センサーは、細胞内部移行（例えば、細胞受容体の内部移行をモニターすることにより）、細胞外または細胞内のｐＨの変化（例えば、正常および／または病理学的な細胞プロセスに起因する）、細胞内輸送（例えば、１つの細胞領域またはオルガネラから別のものへの移動）、シグナル伝達事象（例えば、細胞内区画における局所的条件に変化を引き起こす）などを検出することができる。

幾つかの実施形態において、センサー剤は細胞表面を標的にする。幾つかの実施形態において、センサー剤は、細胞表面タンパク質および／または受容体に直接的または間接的に連結されている。幾つかの実施形態において、細胞表面タンパク質は、ｐＨセンサー剤と安定した（例えば、共有）結合を形成する、タンパク質（例えば、酵素、ヒドラーゼ、デハロゲナーゼ）との融合体として提供（例えば、発現）される。幾つかの実施形態において、センサー剤は、目的のタンパク質（例えば、細胞表面タンパク質、疾患マーカータンパク質）との融合体の一部であるタンパク質（例えば、酵素、ヒドラーゼ、デハロゲナーゼ）と安定した（例えば、共有）結合を形成する基質に（例えば、共有的または非共有的に）連結される。幾つかの実施形態において、センサー剤は、疾患状態（例えば、癌、感染など）を示す細胞表面受容体を標的にする。幾つかの実施形態において、センサー剤は、（例えば、腫瘍細胞の酸性周囲環境における）腫瘍標的化に有用性が見出される。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、第２の実体（例えば、薬剤、部分、タンパク質、化合物、巨大化合物、粒子、抗体、多糖など）への結合のために１つ以上の部位、置換基、および／または官能基を含む。幾つかの実施形態において、結合部位は、センサー剤の蛍光および／またはｐＨ感受性に影響を与えない位置に配置される。幾つかの実施形態において、結合部位は、センサー剤が第２の実体と（例えば、共有的または非共有的に）連結することができるように反応性基を提供する。幾つかの実施形態において、結合部位は、センサー剤を第２の実体に連結させる既知のカップリング化学（例えば、マレイミド／チオール、カルボン酸／チオール、クリックケミストリー、ディールス・アルダー、ジスルフィド交換、ヒドラジドカップリング、カルボン酸／アミン、ビオチン／ステプトアビビジンなど）を利用する官能基を提示する。本発明は、センサー剤を第２の実体にカップリングする化学に限定されるものではない。任意の適切なカップリング化学が、本発明の範囲内である。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、リンカー部分により、第２の実体を含む、または第２の実体に連結されている。幾つかの実施形態において、リンカー部分は、センサー剤の一部である。幾つかの実施形態において、リンカー部分は、第２の実体への結合のため、カップリング化学を介してセンサー剤に付加される。幾つかの実施形態において、リンカー部分（例えば、センサー剤および第２の実体を接続する部分）が提供される。本発明は、任意の特定のリンカー部分に限定されるものではない。事実、多様なリンカー部分が考慮され、適切なリンカーには、アルキル基、メチレン炭素鎖、エーテル、ポリエーテル、アルキルアミドリンカー、ペプチドリンカー、修飾ペプチドリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）リンカー、ストレプトアビジン−ビオチンもしくはアビジン−ビオチンリンカー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）、官能化ＰＥＧ、多糖、グリコサミノグリカン、樹状ポリマー（ＷＯ９３／０６８６８およびＴｏｍａｌｉａ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２９：１３８−１７５（１９９０）、これらはその全体が参照として本明細書に組み込まれる）、ＰＥＧ−キレート剤ポリマー（Ｗ９４／０８６２９、ＷＯ９４／０９０５６、およびＷＯ９６／２６７５４、これらはその全体が参照として本明細書に組み込まれる）、オリゴヌクレオチドリンカー、リン脂質誘導体、アルケニル鎖、アルキニル鎖、ジスルフィド、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、リンカーは、アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ブロモ、ヨード、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、ハロホルミル、カルボン酸エステル、カルボキシレート、カルボキシル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、エーテル、ヘミアセタール、ヘミケタール、アセタール、ケタール、オルトエステル、アミド、アミン、イミン、イミド、アジド、アゾ、シアネート、ニトレート、ニトライト、ニトリル、ニトロ、ニトロソ、ピリジン、チオール、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スリフィン酸、スルホン酸、チオシアネート、チオン、チアール、ホスフィン、ホスホン酸、ホスフェート、および／またはホスホジエステル基の任意の組み合わせを含む。任意の適切な官能基を利用する任意の適切なリンカーは、本発明の実施形態の範囲内である。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、細胞、細胞外、生物学的および／または病理的構成成分（例えば、タンパク質、核酸、小分子、脂質、多糖、ウイルスなど）に連結されている。幾つかの実施形態において、センサー剤は、細胞表面分析物または細胞外分析物に、それらの内部移行をモニターするために連結されている。幾つかの実施形態において、細胞表面分析物は、細胞表面構成成分（例えば、脂質、受容体など）である。幾つかの実施形態において、細胞表面分構成成分は、細胞表面受容体（例えば、イオンチャンネル結合受容体（例えば、アセチルコリン受容体）、酵素結合受容体（例えば、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／トレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体）、および／またはＧタンパク質共役受容体／７−膜貫通受容体）を含む。本明細書に記載される実施形態における使用が見出される特定の膜貫通受容体には、アンギオテンシン２ １型受容体（ＡＴ１Ｒ）、バソプレシン２受容体（Ｖ２Ｒ）、デルタ−オピオイド受容体（ＯＰＲＤ１）および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）デルタオピオイド受容体、バソプレシン２受容体、ＥＤＧ１受容体、β２−アドレナリン受容体（ＡＤＲＢ２）、アルギニンバソプレシン受容体２（ＡＶＰＲ２）、セロトニン受容体１ａ（ＨＴＲ１Ａ）、ｍ２ムスカリン性アセチルコリン受容体（ＣＨＲＭ２）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）、ドーパミンＤ２受容体（ＤＲＤ２）、カッパオピオイド受容体（ＯＰＲＫ）またはα１ａ−アドレナリン受容体（ＡＤＲＡ１Ａ）、インスリン増殖因子−１受容体（ＩＧＦ−Ｒ）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法および組成物は、本明細書に列記されている細胞表面構成成分（例えば、細胞膜タンパク質）に限定されないことが、理解されるべきである。幾つかの実施形態において、センサー剤からの蛍光シグナル（またはシグナルの欠如）は、連結構成成分の内部移行を検出するために、検出および／またはモニターされる。幾つかの実施形態において、内部移行時（例えば、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスなど）、連結構成成分は中性ｐＨ環境から酸性環境に移行する。幾つかの実施形態において、連結構成成分の内部移行は、センサー剤からの蛍光発光を検出またはモニターすることにより、検出および／またはモニターされる。幾つかの実施形態において、受容体内部移行（例えば、エンドサイトーシス）は、近中性から酸性へのｐＨの変化を伴う。幾つかの実施形態において、関連受容体の内部移行時に蛍光の変更を受けるセンサー剤が提供される。幾つかの実施形態において、中性ｐＨから酸性ｐＨへの移動時（例えば、センサーが結合している受容体の内部移行時）に、蛍光発光の（例えば、非蛍光性から検出可能な蛍光への）増加を経るセンサーが提供される。

幾つかの実施形態において、細胞の内部移行および／またはエンドサイトーシスをモニター、検出、または定量化するｐＨセンサー剤およびその使用方法が提供される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物および方法は、任意の種類のエンドサイトーシス、例えば、クラスリン仲介、カベオレ、マクロピノサイトーシス、またはファゴサイトーシスをモニターするために有用である。幾つかの実施形態において、エンドサイトーシスは、プロセスに関与するエンドサイトーシス経路および／またはエンドサイトーシス構成成分に関わりなくモニターされる。幾つかの実施形態において、本明細書に提供される組成物および方法は、細胞内部移行に関連するｐＨ変化を検出およびモニターし、それによって細胞内部移行（例えば、エンドサイトーシス）を検出および／またはモニターする。幾つかの実施形態において、組成物および方法は、全種類の細胞内部移行および／またはエンドサイトーシスを検出するように構成される。幾つかの実施形態において、ダイナミン依存性エンドサイトーシスを検出する組成物および方法が提供される。幾つかの実施形態において、組成物および方法は、１種類以上のエンドサイトーシス、例えば、クラスリン仲介、カベオレ、マクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、および／またはダイナミン依存性を検出するために提供される。幾つかの実施形態において、組成物および方法は、単一の種類のエンドサイトーシス、例えば、クラスリン仲介、カベオレ、マクロピノサイトーシス、ダイナミン依存性、またはファゴサイトーシスを検出するために提供される。

幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、酵素（例えば、ヒドラーゼ、デハロゲナーゼなど）の基質である、または酵素の基質に結合している。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、基質である、あるいは酵素（例えば、ヒドラーゼ、デハロゲナーゼなど）または突然変異酵素（例えば、センサー剤と共有結合を形成するもの、もしくは相互作用時に基質に結合するもの）の基質である。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサーは、基質と高度に安定した、および／または共有の結合を形成するように操作された酵素に共有的に、または非共有的に結合している。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサーは、基質と高度に安定した、および／または共有の結合を形成するように操作された酵素の基質に非共有的に結合している。そのような酵素および基質は、例えば、米国特許第７，９３５，８０３号、米国特許第７，８８８，０８６号、米国特許第７，８６７，７２６号、米国特許第７，４２５，４３６号、および米国特許第７，２３８，８４２号に記載されており、これらはそれぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー（または結合した酵素基質）と酵素（例えば、その基質と高度に安定した、および／または共有の結合を形成するように操作されたもの）との（例えば、共有結合性）相互作用は、酵素の局所環境のｐＨをモニターすることを可能にする。幾つかの実施形態において、酵素は、融合タンパク質の一部である。幾つかの実施形態において、融合タンパク質は、生体系（例えば、細胞）内の特定の領域または区画に局在化する。幾つかの実施形態において、融合タンパク質は、細胞表面、細胞膜、オルガネラ膜、細胞質、オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、核など）などに局在化する。幾つかの実施形態において、融合タンパク質の局在化は、ｐＨセンサーの局在化を（例えば、融合タンパク質、酵素基質、およびｐＨセンサーの共有結合性相互作用を介して）もたらす。

幾つかの実施形態において、ｐＨセンサーは、任意の適切な蛍光に基づいたアッセイ（例えば、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）、光退色による蛍光損失（ＦＬＩＰ）、光退色後蛍光局在化（ＦＬＡＰ）、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）、蛍光寿命画像化（ＦＬＩＭ）、生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）などに使用が見出される。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサーから、またはｐＨセンサーへのエネルギー移行は、適切なｐＨ条件（例えば、酸性ｐＨ）下においてのみ可能である、および／または検出可能である。

幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、担体（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、小分子、脂質、核酸、ポリヌクレオチド、巨大分子複合体など）に結合、連結、配位、および／または接合している。適切な担体は、水溶性または水不溶性であり得る。幾つかの実施形態において、センサー剤のｐＨ検知能に干渉しない任意の担体には、本発明の実施形態における使用が見出される。幾つかの実施形態において、センサー剤の蛍光、可溶性、安定性、膜浸透性、ｐＫａ、最大励起、最大発光、最大蛍光強度、ゼロ蛍光の範囲などに干渉しない任意の担体には、本発明の実施形態における使用が見出される。幾つかの実施形態において、担体は、ｐＨセンサーの細胞取り込みを促進する。幾つかの実施形態において、担体は、ｐＨセンサーの細胞局在化を促進する。幾つかの実施形態において、担体は、ｐＨセンサーの安定性、可溶性、膜浸透性などを増強する。幾つかの実施形態において、ｐＨセンサー剤は、多糖（例えば、分岐鎖グルカン（例えばデキストラン））に配位されている。幾つかの実施形態において、多糖接合センサー剤は、水溶性であり、生体系（例えば、細胞）内で安定している、ならびに／またはファゴサイトーシスおよび／もしくはエンドサイトーシス経路により内部移行され得る。適切な水溶性担体には、デキストラン、セファローズ、被覆ビーズ、量子ドット、非ｐＨ感受性蛍光体、ナノ粒子などが含まれるが、これらに限定されない。ｐＨセンサーを量子ドットまたは他の非ｐＨ感受性蛍光体（または他の検出可能な部分）と連結させることは、ｐＨの検知および局在化を（例えば、局所ｐＨにかかわりなく）可能にする。デキストランは、ｐＨ検知の担体分子として、エンドサイトーシスなしで膜浸透性であること、および包括的な内部移行を可能にすることを含む多数の利点を提供する。特定の実施形態では、複数のセンサー剤が単一のデキストラン（または他の担体）に連結している。幾つかの実施形態では、１つ以上のセンサー剤および１つ以上の他の検出可能な薬剤（例えば、蛍光標識、造影剤、蛍光標識など）が単一のデキストラン（または、他の担体）に連結している。

幾つかの実施形態において、ｐＨセンサーは、パートナー実体と特異的に会合する抗体（例えば、二次抗体）または他の標的部分と接合している。幾つかの実施形態において、抗体接合センサー剤は、抗体のｐＨ環境のモニタリングを提供する。幾つかの実施形態において、抗体接合センサー剤は、抗体（例えば、組み換え抗体）の細胞内部移行の検出またはモニタリングを提供する。幾つかの実施形態において、抗体接合ｐＨセンサーは、抗体誘発性内部移行をモニターする。例えば、多様な癌細胞が細胞膜抗原を発現する。抗原に結合することができ、癌細胞により内部移行される抗体をスクリーニングすることは、癌細胞の内部に特異的に送達される毒素、薬物、または短距離同位体を標的にする新規治療法の開発を助ける強力なツールを提供することができる。幾つかの実施形態において、細胞表面抗原への結合時の抗体の内部移行は、抗体連結ｐＨセンサー剤によりモニターされる。

幾つかの実施形態において、ｐＨセンサーは、特定の組織、細胞型、細胞領域、亜細胞領域などを、（例えば、標的部分または細胞構成成分（例えば、表面受容体）への（例えば、直接的または間接的な）連結により）標的にする。幾つかの実施形態において、標的化センサー剤は、特定の場所（例えば、細胞表面、細胞質、心外膜など）のｐＨの（例えば、時点またはリアルタイムでの）測定および／またはモニタリングを可能にする。

幾つかの実施形態において、センサー剤は、造影剤官能基を更に含み、画像化（例えば、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、核医学など）に有用性を提供する。幾つかの実施形態において、センサー剤は造影剤に連結している。幾つかの実施形態において、造影剤官能基を有するセンサー剤は、インビボ画像化用途に有用性が見出される。

幾つかの実施形態において、構成成分、試薬、センサー剤（例えば、反応性センサー剤）、対照、基質、および／または材料（例えば、マルチウエルプレート、細胞）を含有するキットが提供される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている方法またはアッセイを実施するキットが提供される。

幾つかの実施形態において、複数のフォーマットにより実施される方法およびアッセイが提供される。幾つかの実施形態において、方法およびアッセイは、ハイスループットの方法で実施される。幾つかの実施形態において、本明細書に提供されるアッセイは、マルチウエルプレート、例えば、９６ウエル、３８４ウエルなどにより素早く実施される。幾つかの実施形態において、アッセイおよび方法は、ハイスループットスクリーニング適合ミックスおよびリードフォーマット（例えば、非画像、フローなどに基づいたもの）を提供する。
幾つかの実施形態において、組成物、方法、および／またはアッセイを評価、定量化、検出、および／またはモニターする系、装置、または器機が提供される。幾つかの実施形態において、系、装置、および／または器機は、センサーにより発光される蛍光の量またはその変化を検出、定量化、またはモニターするために提供される。幾つかの実施形態において、検出、定量化、および／またはモニタリングは、１つ以上の分光光度計、蛍光光度計、照度計、光電子増倍管、フォトダイオード、比濁計、光子計数器、電極、電流計、電圧計、容量センサー、フローサイトメーター、ＣＣＤなどを含む装置、系、または器機により提供される。幾つかの実施形態において、方法およびアッセイは蛍光検出を化学的（例えば、ｐＨの変化）および／または生物学的（例えば、エンドサイトーシス、細胞内輸送、病原性などの）現象と相関させるために提供される。幾つかの実施形態において、センサー剤の検出に適した装置が選択され、および／または提供される。

実験
実施例１
ｐＨセンサー剤の蛍光
実験は、本発明の実施形態を開発する際に、例示的なｐＨセンサー剤ＰＢＩ−４４５３およびＰＢＩ−４４７９の蛍光特性を決定するために実施した（図１を参照すること）。蛍光励起および発光強度を一連の波長により測定した（図２を参照すること）。化合物ＰＢＩ−４４５３は、５４１ｎｍの最大励起および５７１ｎｍの最大発光を示す（図２Ａを参照すること）。化合物ＰＢＩ−４４７９は、５３４ｎｍの最大励起および５６２ｎｍの最大発光を示す（図２Ｂを参照すること）。蛍光検出は、一連のｐＨ値において実施した（図３を参照すること）。化合物ＰＢＩ−４４５３は、約５．８４のｐＫａを有し、ｐＨ４．１５以下で約５．８４の最大蛍光強度を示し、ｐＨ７．５３以上で最大蛍光損失の約５％以下を示す（図３Ａを参照すること）。化合物ＰＢＩ−４４７９は、約６．１のｐＫａを有し、ｐＨ３以下で約６．１の最大蛍光強度を示し、ｐＨ８以上で最大蛍光損失の約１％以下を示す（図３Ｂを参照すること）。

実施例２
安定性
ＰＢＩ−４４７９をＤＭＳＯにより２ｍＭに溶解して、およそ２．３３ｍｇ／ｍＬにした。２ｍＭ溶液の３５０ｕＬのアリコートを、光から遮蔽して−２０℃、４℃、および室温で保存した。安定性は、溶液を調製し、保存したときから０日目、１日目、１週間目、１か月目、４か月目、および６か月目に蛍光発光強度を測定し、ＨＰＬＣ純度を試験することによって確立した。蛍光測定では、それぞれのアリコートを４ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ４．０に希釈し（１ｕＬ）、４．５ｍＬのプラスチックキュベットに直接入れて、バイアルを逆さにして混合した。５６２ｎｍの最大発光ピークを、１．５ｎｍのスリット幅で５３２ｎｍの励起を使用するＨｏｒｉｂａＪｏｂｉｎＹｖｏｎフルオロメーターの使用により得た。ＨＰＬＣ測定では、それぞれのアリコートを０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ４．０で１ｍＭに希釈し、２ｕＬを試験した。それぞれのアリコートの純度を、四要素ポンプおよびダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００液体クロマトグラフィー系の使用により試験した。ダイオードアレイ検出器を２５４ｎｍおよび５３２ｎｍに設定した。溶出を、水中０．１％のＴＦＡを含有する移動相（Ａ）およびＨＰＬＣ等級アセトにトリルを含有する移動相（Ｂ）の使用により実施した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ＭＡＸ−ＲＰカラム（５０×４．６ｍｍ、２．６μｍ）を使用して、クロマトグラフィーを実施した。ＨＰＬＣは以下のように実施した。３％〜６０％の移動相（Ｂ）の勾配を３．６０分間実施し、６０％の移動相（Ｂ）を１分間保持し、６分間で１００％の移動相（Ｂ）まで傾斜させ、１００％の移動相（Ｂ）を２分間更に保持し、次に１．５分間かけて３％の移動相（Ｂ）に戻る。カラムには、出発条件に再平衡するまで２．５分間かけた。これらの条件下において、生成物はおよそ３．７分で溶出する。生成物の純度（面積率）を２５４ｎｍおよび５３２ｎｍで報告した。

蛍光発光強度およびＨＰＬＣによる純度の両方の結果は、１８０日間の研究にわたって極めて僅かな差を示す（表１および図４〜８を参照すること）。それぞれのデータセットの相対標準偏差（ＲＳＤ）は低く、色素の最小化学変化を示している。溶液が室温で保存されたとき、僅かな劣化が蛍光強度において観察される。これらのデータに基づくと、化合物ＰＢＩ−４４７９は、室温未満において少なくとも１８０日間安定している。

実施例３
毒性
色素ＰＢＩ−４４７９およびＰＢＩ−４４５３の毒性をＵ２ＯＳ細胞において試験した。細胞を、９６ウエルプレート中のＭｃＣｏｙ ５Ａ培地＋１０％ＦＢＳに２０，０００細胞／ウエルで平板培養した。次に化合物をＭｃＣｏｙ ５Ａ培地＋１０％ＦＢＳで２倍に段階的に希釈して、１０×の作業溶液にした。１０ｕｌの作業溶液を細胞に加えて、０ｎＭ〜２０ｕＭの最終濃度にした。次に処理細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。毒性は、製造会社のプロコールに従ってＰｒｏｍｅｇａのＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ発光細胞生存率アッセイを使用した試験した。２４時間にわたって多用な濃度の化合物には毒性が見られなかった（図９を参照すること）。

実施例４
浸透性および特異性
実験は、本発明の実施形態を開発する際に、ｐＨセンサーの浸透性および特異性を決定するために実施した。Ｕ２−ＯＳ細胞（特異性のため）およびＵ２−ＯＳ ＮＬＳ細胞（核局在化配列（ＮＬＳ）によりＨａｌｏＴａｇタンパク質を安定して発現するＵ２−ＯＳ細胞、浸透性のため）を、ＰＢＩ−４４７９センサーにより試験した。細胞を、ＬＴＩＩチャンバースライド上の２００ｕｌのＭｃＣｏｙ ５Ａ培地＋１０％ＦＢＳ（「完全培地」）に４０，０００細胞／ウエルで平板培養した。次に細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。次に細胞をＰＢＩ−４４７９により０〜２０ｕＭで１時間パルスした。次に培地を細胞から取り除き、ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地＋１０％ＦＢＳ中の１ｕＭのオレゴングリーンにより１５分間追跡し、続いて完全培地による５分間の洗浄を３回行った。次に細胞をＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ５００により画像化した。結果は、ＰＢＩ−４４７９が浸透性であり、Ｕ２−ＯＳ細胞において安定して発現しているＨａｌｏＴａｇ−ＮＬＳを標識しないことを実証している（図１０を参照すること）。更にＰＢＩ−４４７９は、非特異的に野生型Ｕ２−ＯＳ細胞に結合しない、または野生型Ｕ２−ＯＳ細胞を標識しない（図１１を参照すること）。

実施例５
ＧＰＣＲおよび非ＧＰＣＲ内部移行
実験は、本発明の実施形態を開発する際に、内部移行／エンドサイトーシスを検出およびモニターするために実施した。ＩＬ６シグナル配列を含有するＨａｌｏＴａｇ（ＨＴ７）−受容体融合タンパク質を（一時的または安定的に）発現するＵ２−ＯＳ細胞を使用した。以下のＨＴ７−受容体融合タンパク質が、Ｕ２−ＯＳ細胞において発現した。ＩＬ６−ＨＴ７−β２ＡＲ（β２アドレナリン受容体、ＮＭ＿００００２４．３）、ＩＬ６−ＨＴ７−ＥＤＧ１（内皮分化増殖遺伝子１、ＮＭ＿００１４００）、ＩＬ６−ＨＴ７−ＤＯＲ１（δ−オピオイド受容体、ＮＭ＿０００９１１）、およびＩＬ６−ＨＴ７−ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体、ＡＢ５２８４８２）。細胞を、ウエル中の完全培地において２×１０⁵細胞／ｍＬで平板培養した。次に細胞を３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。次に培地を、０．５％炭ストリップＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を有する２００ｕｌのＭｃＣｏｙ ５Ａ培地に代えて、３７℃、５％ＣＯ₂で約１時間インキュベートした。次に細胞を、１ｕＭのセンサーＰＢＩ−４４７９により標識し、３７℃、５％ＣＯ₂で１０分間インキュベートした。次に細胞を２００ｕｌの完全培地により３回洗浄して、あらゆる非結合センサーを除去した。次に細胞を、対応する作動薬（ＩＬ６−ＨＴ７−β２ＡＲには１ｕＭのイソプロテレノール、ＩＬ６−ＨＴ７−ＥＤＧ１には１ｕＭのＳ１Ｐ、ＩＬ６−ＨＴ７−ＤＯＲ１には１ｕＭのＳＮＣ８０、およびＩＬ６−ＨＴ７−ＥＧＦＲには１ｎｇ／ｍＬのｒｈＥＧＦ）により刺激し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ５００により５分毎に１時間かけて画像化した。実験は、多様な受容体（例えば、Ｇタンパク質共役受容体およびチロシンキナーゼ受容体、図１２〜１５を参照すること）の内部移行を検出する、および輸送をモニターするｐＨセンサーの能力を実証し、落射蛍光（共焦点検出に限定されない検出）を使用して、ｐＨセンサーの内部移行を検出する、および輸送をモニターすることができることを実証している（図１６を参照すること）。

実施例６
内部移行の阻止
実験は、本発明の実施形態を開発する際に、内部移行／エンドサイトーシスの阻止を検出およびモニターする、本明細書に記載されているｐＨセンサーの能力を実証するために実施した。

ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１融合タンパク質を安定して発現するＵ２−ＯＳ細胞を、実施例５に記載されように平板培養した。一晩インキュベートした後、細胞には、受容体仲介エンドサイトーシスを防止する優性陰性突然変異体である、（Ｄｒ．Ｒ．Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ ａｔ Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより提供された）Ｄｙｎａｍｉｎ Ｋ４４Ａ＋／−ＦＬＡＧを、製造会社のプロトコールに従ってＭｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＬＴ１形質移入試薬を使用して一時的に形質移入した。形質移入した２４時間後、細胞を、１ｕＭの不浸透性のＨａｌｏＴａｇ−Ａｌｅｘａ ４８８リガンドによりＭｃＣｏｙ ５Ａ＋１０％ＦＢＳ中で５分間標識した。非結合リガンドを、２００ｕｌのＭｃＣｏｙ ５Ａ＋１０％ＦＢＳで３回洗浄することにより素早く除去した。細胞を、１ｕＭのＳ１Ｐ（Ｄ−エリスロスフィンゴシン−１−リン酸、ＥＤＧ１作動薬）により６０分間刺激し、次に３．７％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）により固定し、０．１％のトリトンＸ−１００により浸透性にし、３％のＮＧＳ（正常ヤギ血清）により阻止し、一次抗体α−Ｍ２ ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ １：５００）およびヤギα−マウスＡｌｅｘａ ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により標識した。画像を前記に記載されたように取得した。ダイナミンはＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１タンパク質の内部移行を防止した（図１７を参照すること）。ｐＨセンサーは、この特定の実験には使用しなかった。しかし、系が作動していること、例えば、発現、標識化、局在化、および阻止が全て予想されたように機能したことが、補強証拠である。

ダイナミンに加えて、ダイナミンの可逆的で非競合的な阻害剤であるＤＹＮＡＳＯＲＥを、内部移行／エンドサイトーシスの阻止に使用することもでき、本発明のｐＨセンサーを使用して阻止が検出され、モニターされる。ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１融合タンパク質を安定して発現するＵ２−ＯＳ細胞を、上記に記載されたように平板培養した。一晩インキュベートした後、細胞を、１ｕＭのＨａｌｏＴａｇ ｐＨセンサー（ＰＢＩ−４４７９）および８０ｕＭのＤｙｎａｓｏｒｅ（Ｓｉｇｍａ）により３０分間同時に標識した。対照細胞は、１ｕＭのＨａｌｏＴａｇ ｐＨセンサーで標識したが、Ｄｙｎａｓｏｒｅでは処理しなかった。次に細胞を１ｕＭのＳ１Ｐで６０分間刺激し、前記に記載されたように画像化した。ＤＹＮＡＳＯＲＥは、ｐＨセンサーにより検出されたように、作動薬の存在下でＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１のダイナミン依存性内部移行／エンドサイトーシスを防止した（図１８を参照すること）。

実施例７
内部移行の回復
実験は、本発明の実施形態を開発する際に、内部移行をモニターおよび検出するｐＨセンサーの能力を更に実証するために実施した。そのような実験では、ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の阻止された内部移行が回復した。ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１融合タンパク質を安定して発現するＵ２−ＯＳ細胞を、上記に記載されたように平板培養した。一晩インキュベートした後、細胞を、ＨａｌｏＴａｇ ｐＨセンサー（ＰＢＩ−４４７９）および８０ｕＭのＤＹＮＡＳＯＲＥ（Ｓｉｇｍａ）により同時に標識した。対照細胞は、ＨａｌｏＴａｇ ｐＨセンサーで標識したが、ＤＹＮＡＳＯＲＥでは処理しなかった。次に細胞を１ｕＭのＳ１Ｐで刺激し、画像化した（図１７のＴ＝０）。この時点では、ＤＹＮＡＳＯＲＥは、ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１のダイナミン依存性内部移行／エンドサイトーシスを防止する。次にＤＹＮＡＳＯＲＥを、ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地＋１０％ＦＢＳにより５分間、３回洗浄して除去し、培地を、１ｕＭのＳ１Ｐを含有する完全培地に代えた。細胞を６０分間インキュベートし、前記に記載されたように画像化した。ＨａｌｏＴａｇ−ＥＤＧ１の内部移行は、ｐＨセンサーで検出およびモニターされたように、回復した（図１９を参照すること）。

実施例８
例示的なｐＨセンサー剤よび前駆体分子
多様なｐＨセンサーおよび前駆体分子が、本発明の実施形態の開発の際に生成された（図２０を参照すること）。）。そのようなセンサー剤および前駆体の例の構造および合成手順が、下記に提供される。これらの分子は、例であることが意図され、本発明の範囲を限定するものとして見なされるべきではない。

３′，６′−ビス（４−メチルピペラジン−１−イル）−ローダミン（５，６）−カルボン酸。
圧力管において、３′，６′−ジヨード−ローダミン（５′，６′）カルボン酸（５０．０ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）、１−メチル−ピペラジン（３３．５ｍｇ、０．３３４ｍｍｏｌ）、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１８．８ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）、Ｃｕｌ（１５．９ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）、および２２，２，２−トリフルオロエタノール（５ｍｌ）を油浴により１１０℃で１１日間加熱した。揮発物を減圧下で除去し、残渣を１：１：０．１のＡＣＮ／水／ＴＦＡに取った。固体を濾過し、粗混合物をＲＰ−ＨＰＬＣに付し、濃縮すると、橙色の固体（２９．０ｍｇ、６４．２％）を得た。

Ｎ−（２４−クロロ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサテトラコシル）−３′，６′−ビス（４−メチルピペラジン−１−イル）−ローダミン−（５，６）カルボキサミド（ＰＢＩ−４４５３）。
ＤＭＦ（３ｍｌ）中の３′，６′−ビス（４−メチルピペラジン−１−イル）−ローダミン（５，６）−カルボン酸（２９．０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）に、Ｏ−（Ｎスクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１９．４ｍｇ、０．０６４４ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（４６．７Ｉｌｌ、０．２６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（４６．７ｌ、０．２６８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１６０．９μｌ、０．０６４ｍｍｏｌ）中の０．４Ｍ溶液として、２４−クロロ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサテトラコサン−１−アミン−ＨＣｌを加える前に、３時間撹拌した。反応を一晩撹拌し、揮発物を減圧下で除去して、暗色の固体を得て、それを１：１：０．０１のＡＣＮ／水／ＴＦＡに溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣＨＰＬＣＨＰＬＣクロマトグラフィーに付して、生成物を赤色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₄₉Ｈ₆₈ＣｌＮ₅Ｏ₁₀₍Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値９２１．５、実測値９２２．６。

４−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）ブタン−ｌ−スルホン酸。
クロロベンゼン（１０ｍＬ）中のブタンスルトン（１．１５ｍｌ、１１．２８ｍｍｏｌ）および１−Ｂｏｃ−ピペラジン（２．０ｇ、１０．７４ｍｍｏｌ）を１１０℃で一晩加熱して、黄色の沈殿物を得た。混合物を室温に冷却し、溶媒をデカントし、ジエチルエーテルを、激しく撹拌しながら３０分間かけて加えた。得られた懸濁液を濾過して、生成物（３．２ｇ、９２．４％）を黄色の固体として得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ４．０１（ｔ，９．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．４５（ｔ，１１．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．１０（ｍ，４Ｈ）、２．９４（ｍ，２Ｈ）、１．７５（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，２Ｈ）、１．４１（ｓ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₁₃Ｈ₂₅Ｎ₂Ｏ₅Ｓ（Ｍ−Ｈ⁺）に対する計算値３２１．２、実測値３２１．２。

４−（ピペラジン−１−イル）ブタン−１−スルホン酸ＨＣｌ塩。
ＣＨ₃ＯＨ（１５ｍＬ）および濃ＨＣｌ（１．５ｍＬ）中の４−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）ブタン−ｌ−スルホン酸（１．０ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）を３時間撹拌した。揮発物を減圧下で除去し、得られた黄色の固体を高真空下で一晩乾燥した。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ３．６７（ｍ，ｂｒ，８Ｈ）、３．６１（ｔ，７．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．００（ｔ，７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．００−１．８３（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ₈Ｈ₁₉Ｎ₂Ｏ₃Ｓ（Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値２２３．１、実測値２２３．１。

３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）−ローダミン（５′，６′）カルボン酸（ＰＢＩ−４４７４）。
３′，６′−ジヨードローダミン（５′，６′）カルボン酸（５０．０ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）、４−（ピペラジン−１−イル）ブタン−ｌ−スルホン酸−ＨＣｌ（４３．３ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）、カリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシド（４６．９ｍｇ、０．４１８ｍｍｏｌ）、およびＣｕＩ（３１．８ｍｇ、０．１６８）を圧力管に投入し、２，２，２−トリフルオロエタノール（３ｍＬ）を加えた。管に蓋をして、油浴により１１０℃で１０日間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、粗物質を３０ｍｌの水に懸濁し、１０分間撹拌し、遠心分離した。母液をデカントし、濾過し、濃縮して１５ｍＬにし、ＲＰ−ＨＰＬＣに付して、生成物（６．５ｍｇ、９．５％）を赤色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₃₇Ｈ₄₅Ｎ₄Ｏ₁₁Ｓ₂（Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値７８５．３、実測値７８５．５。

４，４′−（４，４′−（（６′，５′）−（（２４−クロロ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサテトラコシル）−３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）カルボキサミド（ＰＢＩ−４４７９）。
ＰＢＩ−４４７４（６．５ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（３．０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（７．２１μｌ、０．０４１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍｌ）中で１時間撹拌した。溶液に、ＣＨ₂Ｃｌ₂（４６．７μｌ、０．２６８ｍｍｏｌ）中の０．４Ｍ溶液として、２４−クロロ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサテトラコサン−１−アミン−ＨＣｌを加え、１時間撹拌した。揮発物を減圧下で除去し、残渣を水に溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣＨＰＬＣに付して、生成物（９．６ｍｇ、９６．４％）を赤色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₅₅Ｈ₈₁ＣｌＮ₅Ｏ₁₆Ｓ₂（Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値１１６６．５、実測値１１６６．５。

ＰＢＩ−４４７９−１０，０００ＭＷアミノデキストラン（ＰＢＩ−４６２７）。
１ｍｌのＤＭＦ中のＰＢＩ−４４７４（１５．０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（６．９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（１６．６μｌ、０．０９５ｍｍｏｌ）を、２時間撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、赤色の膜を得て、それを０．１Ｍのリン酸緩衝液に溶解した。リン酸溶液に、１０，０００ＮＷのアミノデキストラン（３３ｍｇ）を加え、混合物を暗黒下で一晩撹拌した。得られた粗物質をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−５０、Ｈ２０溶出剤）により精製して、生成物を、凍結乾燥の後に赤色の固体として得た。

ジメチルアミノ−（４−メチルピペラジン−１−イル）−ローダミン（５′，６′）−カルボン酸。
磁気撹拌バーを備えた圧力管中の３′−（ジメチルアミノ）−６′−ヨード−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９′−キサンテン］−５，６−カルボン酸（２９ｍｇ、５７μｍｏｌ）、Ｎ−メチルピペラジン（１１．３ｍｇ、１１３μｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（５．４ｍｇ、２８μｍｏｌ）、およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５．４ｍｇ、５７μｍｏｌ））の混合物に、２ｍＬの２，２，２−トリフルオロエタノールを加えた。容器を密閉し、撹拌しながら、油浴により１２０℃で一晩（約１６時間）加熱した。この時間の後、反応物を油浴から取り出し、開放する前に室温に冷却した。約２ｍｌの水を加え、得られたスラリーを遠心分離した。上澄みを分取ＨＰＬＣに付し、適切な画分を蒸発させると、赤色の固体（１２ｍｇ、ＰＢＩ−４４％）を生じた。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₂₈Ｈ₂₈Ｎ₃Ｏ₅ ⁺（Ｍ⁺）に対する計算値４８６．２０。実測値４８６。Ｅｘ／Ｅｍ ５４５／５７２ｎｍ。

ヘキサヒドロキノイイジノ−（４−メチルピペラジン−１−イル｝−ローダミン−６′−カルボン酸。
磁気撹拌バーを備えた圧力管中の１２−ヨード−３′−オキソ−１，２，３，５，６，７−ヘキサヒドロ−３′Ｈ−スピロ［クロメノ［２，３−ｆ］ピリド［３，２，１−ｉｊ］キノリン−９，１′−イソベンゾフラン］−６′−カルボン酸（２１ｍｇ、３７μｍｏｌ）、Ｎ−メチルピペラジン（７．４ｍｇ、７４μｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（３．５ｍｇ、１９μｍｏｌ）、およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３．６ｍｇ、３７μｍｏｌ））の混合物に、２ｍＬの２，２，２−トリフルオロエタノールを加えた。容器を密閉し、撹拌しながら、油浴により１２０℃で一晩（約１６時間）加熱した。この時間の後、反応物を油浴から取り出し、開放する前に室温に冷却した。約２ｍｌの水を加え、得られたスラリーを遠心分離した。上澄みを分取ＨＰＬＣに付し、適切な画分を蒸発させると、赤色の固体（１５ｍｇ、７５％）を生じた。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₃₂Ｈ₃₂Ｎ₃Ｏ₅ ⁺（Ｍ⁺）に対する計算値５３８．２、実測値５３８．３。Ｅｘ／Ｅｍ ５５９／５８６ｎｍ。

２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−３−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ベンゾエート。
３−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）安息香酸（０．５ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（７１８．８ｍｇ、２．３９ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０４ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦに溶解し、１時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルに希釈し、水およびブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、白色の固体を得て、それをヘプタンで粉砕し、高真空下で乾燥して、生成物（４９２．０ｍｇ）を白色の固体として得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ８．０１（ｍ，１Ｈ）、７．６０（ｍ，１Ｈ）、７．４６（ｍ，１Ｈ）、４．３７（ｄ，６．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．８９（ｓ，４Ｈ）、１．４４（ｓ，９Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₁₇Ｈ₁₉Ｎ₂Ｏ₆（Ｍ−Ｈ⁺）に対する計算値３４７．１、実測値３４７．２。

ｔｅｒｔ−ブチル３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンジルカルバメート。
１０ｍＬのＤＭＦ中の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（５０．０ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミン−ＨＣｌ（５３．０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１４ｍＬ、０．７９ｍｍｏｌ）を加えた。反応物に蓋をして、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、黄色の固体を得て、それをＤＣＭに溶解し、セライトで吸収し、乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）精製に付して、生成物（３７．０ｍｇ、５６．４％）を白色の固体として得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ７．６１（ｍ，１Ｈ）、７．６３（ｍ，１Ｈ）、７．４０（ｍ，１Ｈ）、４．３４（ｄ，５．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．５４（ｍ，Ｈ）、１．７２（ｍ，２Ｈ）、１．５３（ｓ，９Ｈ）、１．４４（ｓ，９Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₂₃Ｈ₃₈ＣｌＮ₂Ｏ₅（Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値４５７．２、実測値４５７．２。

３−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド−ＨＣｌ。
ｔｅｒｔ−ブチル３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンジルカルバメートを、ＨＣｌ−ジオキサン（１ｍＬ）で処理し、一晩撹拌した。既発物を減圧下で除去し、残渣をＥｔ₂Ｏで粉砕して、生成物（４９．９ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を白色の固体として得た。

３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）スクシンイミジルエステル。
ＰＢＩ−４４７４（２５．０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１９．２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６．６μＬ、０．１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）中で１時間撹拌した。粗混合物を濃縮し、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製に付して、生成物を赤色の固体として得た。

４−（（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンジル）−３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）カルボキサミド（ＰＢＩ−４９５８）。
３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）スクシンイミジルエステル（１０．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．０５ｍＬ、０．０１ｍｍｏｌ）中０．２５Ｍの３−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド−ＨＣｌ、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、１ｍＬのＤＭＦ中で１時間撹拌した。粗混合物を水で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分取クロマトグラフィーに付して、生成物を、凍結乾燥の後に赤色の固体（１．３ｍｇ、１０．５％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₅₅Ｈ₇₂ＣｌＮ₆Ｏ₁₃Ｓ₂₍Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値１１２３．４、実測値１１２３．５。

ｔｅｒｔ−ブチル（１−（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）−３−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ２−アザヘプタデカン−１７−イル）カルバメート。
１ｍＬのＤＭＦ中の２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１，１４，１７−ペンタオキサ−５−アザイコサン−２０−酸（２０．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１９．８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３ｍＬ、０．１６ｍＬ）を加えた。混合物を０．５時間撹拌した。０．５ｍＬのアリコートを、３−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド（０．１ｍＬ、０．０３ｍＬ）の０．２５Ｍ溶液で処理した。混合物を、濃縮する前に１．５時間撹拌して、生成物を黄色の油状物として得た。

１−アミノ−Ｎ−（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンジル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド−ＨＣｌ。
ｔｅｒｔ−ブチル（１−（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）−３−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−２−アザヘプタデカン−１７−イル）カルバメート（２０．０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら４．０ＭのＨＣｌ−ジオキサン（０．８ｍＬ）により一晩処理した。混合物をセライトで吸収し、乾燥し、フラッシュクロマトグラフィーに付して、生成物（８．０ｍｇ、９８．９％）を無色の油状物として得た。

４−（（１−（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）−３−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−２−アザヘプタデカン−１７−イル）−３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）カルボキサミド（ＰＢＩ−４９９４）。
３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）スクシンイミジルエステル（５．０ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．２７ｍＬ、０．００７ｍｍｏｌ）中０．０２５Ｍの３−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド−ＨＣｌ、および３滴のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、１ｍＬのＤＭＦ中で１時間撹拌した。粗混合物を水で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分取クロマトグラフィーに付して、生成物を、凍結乾燥の後に赤色の固体（１．１ｍｇ、１４．２％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₆₆Ｈ₉₃ＣｌＮ₇Ｏ₁₈Ｓ₂（Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値１３７０．６、実測値１３７０．６。

２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ベンゾエート。
２０ｍｌのＤＭＦ中の４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）安息香酸（１．０ｇ、３．９８ｍｍｏｌ）およびＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１．４４ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｍＬ、５．９７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２時間撹拌し、減圧下で濃縮して、赤色の固体を得て、それをＥｔＯＡに溶解し、３０％クエン酸溶液で洗浄した。有機層を保持し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して、黄色の粘着性固体を得た。

ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンジルカルバメート。
１０ｍＬのＤＭＦ中の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）ベンゾエート（５０．０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミン−ＨＣｌ（４２．４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１３ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えた。反応物に蓋をして、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、黄色固体を得て、それをＥｔＯＡｃに溶解し、水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮した。残渣をＤＣＭに溶解し、セライトで吸収し、乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘプタン）精製に付して、生成物（３２．０ｍｇ、４８．８％）を白色の固体として得た。¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ７．７３（ｄ，８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．３２（ｄ，８．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．３４（ｄ，６．６，２Ｈ）、３．６５−３．４２（ｍ，８Ｈ）、２．７５（ｍ，４Ｈ）、１．５（ｓ，９Ｈ）１．２（ｍ，１０Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₂₃Ｈ₃₈ＣｌＮ₂Ｏ₅（Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値４５７．２、実測値４５７．７。

４−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンズアミド−ＨＣｌ。
ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンジルカルバメート（３２．０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を、ＨＣｌ−ジオキサン（１ｍＬ）で処理し、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去し、残渣をＥｔ₂Ｏで粉砕して、生成物（２７．０ｍｇ、９８．０％）を白色の固体として得た。

４−（（４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンジル））−３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）カルボキサミド（ＰＢＩ−４９５９）。
３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）スクシンイミジルエステル（１０．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．０５ｍＬ、０．０１ｍｍｏｌ）中０．２５Ｍの３−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド−ＨＣｌ、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、１ｍＬのＤＭＦ中で１時間撹拌した。粗混合物を水で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分取クロマトグラフィーに付して、生成物を、凍結乾燥の後に赤色の固体（１．１ｍｇ、８．９％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₅₅Ｈ₇₂ＣｌＮ₆Ｏ₁₃Ｓ₂（Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値１１２３．５、実測値１１２３．４。Ｅｘ／Ｅｍ ５３２／５６４ｎｍ。

ｔｅｒｔ−ブチル（１−（４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）−３−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−２−アザヘプタデカン−１７−イル）カルバメート。
１ｍＬのＤＭＦ中の２，２−ジメチル−４−オキソ−３，８，１１，１４，１７−ペンタオキサ−５−アザイコサン−２０−酸（２０．０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１９．８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３ｍＬ、０．１６ｍＬ）を加えた。混合物を０．５時間撹拌した。０．５ｍＬのアリコートを、４−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド−ＨＣｌ（０．１ｍＬ、０．０３ｍＬ）の０．２５Ｍ溶液で処理した。混合物を、濃縮する前に一晩撹拌して、生成物を黄色の油状物として得た。

１−アミノ−Ｎ−（４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンジル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド−ＨＣｌ。
ｔｅｒｔ−ブチル（１−（４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）−３−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−２−アザヘプタデカン−１７−イル）カルバメート（２０．０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら４．０ＭのＨＣｌ−ジオキサン（０．８ｍＬ）により一晩処理した。混合物をセライトで吸収し、乾燥し、フラッシュクロマトグラフィーに付して、生成物（１７．０ｍｇ、９３．５％）を無色の油状物として得た。

４−（（１−（４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）フェニル）−３−オキソ−６，９，１２，１５−テトラオキサ−２−アザヘプタデカン−１７−イル））３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）カルボキサミド（ＰＢＩ−４９９５）。
３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）スクシンイミジルエステル（１０．０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．５４ｍＬ、０．０１３６ｍｍｏｌ）中０．０２５Ｍの３−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）ベンズアミド−ＨＣｌ、および３滴のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、１ｍＬのＤＭＦ中で１時間撹拌した。粗混合物を水で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分取クロマトグラフィーに付して、生成物を、凍結乾燥の後に赤色の固体（４．９ｍｇ、３１．５％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₆₆Ｈ₉₃ＣｌＮ₇Ｏ₁₈Ｓ₂（Ｍ＋Ｈ⁺）に対する計算値１３７０．６、実測値１３７１．０。

２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）シクロヘキサンカルボキシレート。
４０ｍｌのＤＭＦ中の４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）シクロヘキサンカルボン酸（２．０ｇ、７．７７ｍｍｏｌ）およびＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（２．８１ｇ、９．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．７１ｍＬ、１５．５４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３時間撹拌し、減圧下で濃縮して、赤色の固体を得て、それをＥｔＯＡに溶解し、３０％クエン酸溶液で洗浄した。有機層を保持し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濃縮して、黄色を帯びた粘着性固体（０．６９ｇ、２４．９％）を得た。

ｔｅｒｔ−ブチル（（４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）シクロヘキシル）メチル）カルバメート。
５ｍＬのＤＭＦ中の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）メチル）シクロヘキサンカルボキシレート（８１．７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミン−ＨＣｌ（５０．０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１０ｍＬ、０．５７ｍｍｏｌ）を加えた。反応物に蓋をして、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、黄色の残渣を得て、それをＤＣＭに溶解し、セライトで吸収し、乾燥し、フラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）精製に付して、生成物（３５．０ｍｇ、３９．３％）を白色の固体として得た。

４−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）シクロヘキサンカルボキサミド−ＨＣｌ。
ｔｅｒｔ−ブチル（（４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）シクロヘキシル）メチル）カルバメート（３５．０ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）を、ＨＣｌ−ジオキサン（１ｍＬ）で処理し、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去し、残渣をＥｔ₂Ｏで粉砕して、生成物（２３．０ｍｇ、７６．２％）を白色の固体として得た。

４−（（（４−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）シクロヘキシル）メチル））３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）カルボキサミド（ＰＢＩ−５００４）。
３′，６′−ビス（４−（４−スルホブチル）ピペラジン−１−イル）ローダミン（５′，６′）スクシンイミジルエステル（１０．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．０５ｍＬ、０．０１ｍｍｏｌ）中（０．２５Ｍ）の４−（アミノメチル）−Ｎ−（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）シクロヘキサンカルボキサミド−ＨＣｌ、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを、１ｍＬのＤＭＦ中で１時間撹拌した。粗混合物を水で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣ分取クロマトグラフィーに付して、生成物を、凍結乾燥の後に赤色の固体（４．３ｍｇ、３３．６％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ₅₅Ｈ₇₇ＣｌＮ₆Ｏ₁₃Ｓ₂（Ｍ＋）に対する計算値１１２８．５、実測値１１２８．０。Ｅｘ／Ｅｍ ５３２／５６０ｎｍ。

４−（ブチルカルバモイル）−２−（３−（４−メチルピペラジン−１−イウム−１−イリデン）−６−（４−メチルピペラジン−１−イル）−３Ｈ−キサンテン−９−イル）ベンゾエート（ＰＢＩ−５１８３）。
ＤＭＦ（３ｍｌ）中の３′，６′−ビス（４−メチルピペラジン−１−イル）−ローダミン（５，６）−カルボン酸（１９．３ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）に、Ｏ−（Ｎスクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１５．４ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（１６．５μＬ、０．２６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、ブチルアミン（２９．０μＬｌ、０．０１７ｍｍｏｌ）を加える前に３時間撹拌した。反応を一晩撹拌し、揮発物を減圧下で除去して、暗色の固体を得て、それを１：１：０．０１のＡＣＮ／水／ＴＦＡに溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーに付して、生成物を赤色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ Ｃ３５Ｈ４２Ｎ５Ｏ４（Ｍ＋Ｈ＋）に対する計算値５９６．３、実測値５９６．４。

実施例９
Ｕ２−ＯＳ細胞におけるＨａｌｏＴａｇ ｐＨセンサーの毒性
ＨａｌｏＴａｇ ｐＨセンサーの非毒性を実証するため、Ｕ２−ＯＳ細胞をＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−５００４、およびＰＢＩ−４４７９に曝露した。Ｕ２−ＯＳ細胞を、９６ウエルプレートのウエルに１０，０００細胞／ウエルで平板培養し、一晩インキュベートした。翌日、０〜１０ｕＭの（１：２に段階的に希釈した）ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−５００４、またはＰＢＩ−４４７９を細胞に加え、再び一晩インキュベートした。インキュベートした後、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）ｐＨセンサーを含有した培地を取り除き、１００ｕｌの新たな培地（ＭｃＣｏｙ ５Ａ＋１０％ＦＢＳ）を加えた。細胞生存率を、製造会社のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に従ってＣＥＬＬＴＩＴＥＲ Ｇｌｏ細胞生存率アッセイの使用により決定した。発光は、ＧｌｏＭＡＸ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ照度計により読み取った。図２１は、野生型Ｕ２−ＯＳ細胞に対するｐＨセンサーの非毒性を実証している。

実施例１０
ｐＨセンサーの特異性
特異性を実証するため、Ｕ２−ＯＳ細胞を、ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９５８、およびＰＢＩ−４４７９に曝露した。Ｕ２−ＯＳ細胞を、８ウエルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩチャンバーカバーグラス系のウエルに４０，０００細胞／ウエルで平板培養し、３７℃／５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、２ｕＭのＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９５８、ＰＢＩ−４４７９、ＰＢＩ−４９９４、ＰＢＩ−４９９５、またはＰＢＩ−５００４＋５００ｎＭのＤＲＡＱ５により３７℃／５％ＣＯ₂で１５分間標識した。次に細胞をＭｃＣｏｙ ５Ａ＋０．５％ｃＦＢＳで３回洗浄し、３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間インキュベートした。画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ５００により３７℃／５％ＣＯ₂で連続的に取得した。図２２は、野生型Ｕ２−ＯＳ細胞においてｐＨセンサーの非特異的な結合がないことを実証している。

実施例１１
ｐＨセンサーの更なる評価
ｐＨセンサーの標識化、バックグラウンド、結合効率、および輝度の程度を更に評価するため、Ｕ２−ＯＳ細胞をＰＢＩ−４４４９、ＰＢＩ−４９５８、ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９９４、ＰＢＩ−４９９５、またはＰＢＩ−５００４に曝露した。Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ（商標）−ＥＤＧ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）細胞を、８ウエルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩチャンバーカバーグラス系に４０，０００細胞／ウエルで平板培養し、３７℃／５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。翌日、培地をＭｃＣｏｙ ５Ａ＋０．５％ｃＦＢＳに代え、３７℃／５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。インキュベートした後、細胞を、ＰＢＩ−４４４９、ＰＢＩ−４９５８、ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９９４、ＰＢＩ−４９９５、またはＰＢＩ−５００４（１：２に段階的に希釈して０〜４ｕＭ）により３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間パルスした。非結合ｐＨセンサーを細胞から除去し、１ｕＭのＨａｌｏＴａｇ（商標）Ａｌｅｘａ４８８＋５００ｎＭのＤＲＡＱ５により３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間追跡した。次に細胞をＭｃＣｏｙ ５Ａ＋０．５％ｃＦＢＳで３回洗浄し、３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間インキュベートした。次に、１ｕＭのＳ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）を細胞に加え、画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ５００により３７℃／５％ＣＯ₂で連続的に取得した。図２３〜２８は、ｔ＝０分で試験したｐＨセンサーの標識化およびバックグラウンドの程度を実証する。図２９〜３４は、Ｓ１Ｐによるｔ＝２０分でのｐＨセンサーの輝度を実証する。

実施例１２
ｐＨセンサーの浸透性
ｐＨセンサーの浸透性を評価するため、Ｕ２−ＯＳ細胞を、ＰＢＩ−４４７９、ＢＩ−４９５８、ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９９４、ＰＢＩ−４９９５、またはＰＢＩ−５００４に曝露した。Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＮＬＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）細胞を、８ウエルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩチャンバーカバーグラス系のウエルに４０，０００細胞／ウエルで平板培養し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、２ｕＭのＰＢＩ−４４４９、ＰＢＩ−４９５８、ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９９４、ＰＢＩ−４９９５、またはＰＢＩ−５００４により３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間標識した。ｐＨセンサーを細胞から除去し、１ｕＭのＨａｌｏＴａｇ（登録商標）オレゴングリーン（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋５００ｎＭのＤＲＡＱ５により３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間追跡した。次に細胞をＭｃＣｏｙ ５Ａで３回洗浄し、画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ５００により３７℃／５％ＣＯ₂で連続的に取得した。図３５〜３８は、試験したｐＨセンサーの浸透性および非浸透性を実証している。

実施例１３
ｐＨセンサーの使用による内部移行の検出
不浸透性のｐＨセンサーを使用して内部移行を評価するため、Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＤＧ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ＰＢＩ−４４７９、ＰＢＩ−４９５８、ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９９４、またはＰＢＩ−４９９５に曝露し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＤＧ１細胞の内部移行を評価した。Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＤＧ１細胞を、８ウエルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩチャンバーカバーグラス系のウエルに４０，０００細胞／ウエルで平板培養し、３７℃／５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。翌日、培地をＭｃＣｏｙ ５Ａ＋０．５％ｃＦＢＳに代え、３７℃／５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。インキュベートした後、細胞を、５００ｎＭのＰＢＩ−４４７９、ＰＢＩ−４９５８、ＰＢＩ−４９５９、ＰＢＩ−４９９４、またはＰＢＩ−４９９５＋５００ｎＭのＤＲＡＱ５により３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間パルスした。次に細胞をＭｃＣｏｙ ５Ａ＋０．５％ｃＦＢＳで３回洗浄し、３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間インキュベートした。次に、１ｕＭのＳ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）または担体（ＤＭＳＯ）を細胞に加え、画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ５００により３７℃／５％ＣＯ２で連続的に取得した。図３９〜４２は、試験した不浸透性ｐＨセンサーの使用による、受容体の内部移行およびバックグラウンドを検出する能力を実証している。

浸透性のｐＨセンサーを使用して内部移行を評価するため、Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＤＧ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ＰＢＩ−５００４に曝露し、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＤＧ１細胞の内部移行を評価した。Ｕ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）−ＥＤＧ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）細胞を、８ウエルＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）ＩＩチャンバーカバーグラス系のウエルに４０，０００細胞／ウエルで平板培養し、３７℃／５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。翌日、培地をＭｃＣｏｙ ５Ａ＋０．５％ｃＦＢＳに代え、３７℃／５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。インキュベートした後、１ｕＭのＳ１Ｐ（スフィンゴシン−１−リン酸）を加え、細胞を３７℃／５％ＣＯ₂で３０分間インキュベートした。次に細胞を、５００ｎＭのＰＢＩ−５００４＋５００ｎＭのＤＲＡＱ５により３７℃／５％ＣＯ₂で１０分間標識した。次に細胞をＭｃＣｏｙ ５Ａ＋０．５％ｃＦＢＳで３回洗浄し、画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ５００により３７℃／５％ＣＯ₂で連続的に取得した。図４３は、試験した細胞浸透性ｐＨセンサーの使用により刺激した後の、受容体内部移行を検出する能力を実証する。

実施例１４
ｐＨセンサーの使用によるＦＡＣＳ検出
ＦＡＣＳ検出における使用を実証するため、Ｕ２−ＯＳまたはＵ２−ＯＳ ＨａｌｏＴａｇ−ＥＣＳ（細胞外表面表示ＨａｌｏＴｇａ）を完全培地＋０．５％ｃＦＢＳによる６ウエルプレートのウエルに５００，０００細胞／ウエルで平板培養し、３７℃／５％ＣＯ₂で１８時間インキュベートした。インキュベートした後、細胞を、１ｕＭの不浸透性ｐＨセンサーＰＢＩ４４７９により３７℃／５％ＣＯ２で１５分間標識した。次に細胞を、完全培地＋０．５％ｃＦＢＳで３回洗浄し、３７℃／５％ＣＯ₂で１時間インキュベートした。次に細胞を収集し、ＰＢＳに再懸濁し、濾過し、Ｇｕａｖａ（Ｅｘ ５４６／５６０ｎｍ）により選別した。

図４４〜４５は、本発明のｐＨセンサーがＦＡＣＳ検出に使用され得ることを実証している。ＨａｌｏＴａｇを表面に表示する細胞は、ｐＨセンサーに結合する。１時間後、内部移行は、初期エンドソーム、後期エンドソーム、リソソーム、または酸性区分におけるｐＨセンサーの蛍光の増加により観察される。

実施例１５
塩基および酸により滴定されたときのＰＢＩ−４４７９の蛍光強度の損失および回復
この実施例は、ｐＨ４で最も蛍光性である本発明のｐＨセンサーのＰＢＩ−４４７９の蛍光強度が、塩基性ｐＨで滴定され、次に酸性ｐＨで滴定されたときに回復され得るかを決定するために実施した。センサーの濃度の乱れを制限するため、実験は大量で実施し、ｐＨは、濃塩基、次に酸を滴下して調整した。生成物を最初にＤＭＳＯに溶解して、濃縮貯蔵液を作り出し、次に少量を、１００ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ４．０に希釈した。蛍光は、２ｎｍスリット幅を維持しながら５２８ｎｍの励起および５５７ｎｍの発光を使用して、実験の全体にわたってＨｏｒｉｂａＪｏｂｉｎＹｖｏｎ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇに記録した。最大励起および発光も、分子の蛍光特性が変化した場合、それぞれのアリコートにおいて決定した。ｐＨは、較正ｐＨプローブ（Ｄｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｏｄｅｌ ２１５ｐＨメーター）を使用してモニターした。１ｍＬのアリコートを、溶液がおよそ１ｐＨ単位に増加したときに取り出し、蛍光は、上記に記述されたパラメーターを使用して測定した。溶液には、最初に２Ｎ水酸化ナトリウムを、ｐＨのおよそ８が得られるまで撹拌しながら滴下して滴定した。溶液には、次に４Ｎ塩酸を、ｐＨのおよそ４が得られるまで滴定した。

図４６は、塩基および酸により滴定されたときの、ＰＢＩ−４４７９の単一試料の蛍光強度の損失および回復を実証している。これは、本発明のｐＨセンサーが細胞へのＧＰＣＲ輸送（シグナルの増加）、ならびにＧＰＣＲ再循環（シグナルの損失）をモニターするために使用され得ることを更に実証している。一般に、本発明のｐＨセンサーは、シグナルの利得／損失による環境ｐＨのフラックスをモニターするために使用され得る。

本明細書に提供されている全ての出版物および特許は、それらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。本発明に記載されている組成物および方法の変更および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者には明白である。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施例に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。事実、本発明を実施するために記載された様式の、関連分野の当業者には明白である多様な変更は、本発明の範囲内であることが意図される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕ローダミンクラスのコア構造と、１つ以上の置換ピペラジン基とを含む、ｐＨセンサー剤。
〔２〕前記置換ピペラジン基が、前記ローダミンクラスのコア構造上のアミノ基に結合している、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔３〕２つの置換ピペラジン基を含む、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔４〕前記置換ピペラジン基が、前記置換ピペラジンの第１の窒素において前記ローダミンクラスのコア構造に結合している、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔５〕前記置換ピペラジン基が、前記置換ピペラジンの第２の窒素に結合している置換基を含む、前記〔４〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔６〕前記置換基がアルキル基を含む、前記〔５〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔７〕前記アルキル基がヘテロアルキル基を含む、前記〔５〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔８〕前記ｐＨセンサー剤が、酸性ｐＨで蛍光性である、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔９〕前記ｐＨセンサー剤が、酸性ｐＨで最大限に蛍光性である、前記〔８〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１０〕前記ｐＨセンサー剤が、中性ｐＨで最大蛍光の５％未満を示す、前記〔１０〕の記載のｐＨセンサー剤。
〔１１〕前記ｐＨセンサー剤が、中性ｐＨで非蛍光性である、前記〔１０〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１２〕前記ローダミンクラスのコア構造が、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、カルボキシテトラメチルローダミン、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンのイソチオシアネート誘導体、スルホローダミン１０１、テキサスレッド、ローダミンレッド、またはＮＨＳ−ローダミンを含む、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１３〕前記置換ピペラジン基が、ピペラジン環置換基を含み、前記置換基が、アルキル鎖または置換アルキル鎖から選択される、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１４〕前記置換アルキル鎖が、ＣＨ ₂ （ＣＨ ₂ ） _n ＳＯ ₃ ^- およびＣＨ ₂ （ＣＨ ₂ ） _n ＣＯ ₂ Ｈから選択され、式中、ｎ＝０〜２５である、前記〔１３〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１５〕一般構造：
を含み、式中、Ｒ ₁ 〜Ｒ ₁₂ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基であり、Ｘが、Ｏ、ＣＲ ₁₇ 、ＭＲ ₁₇ であり、Ｒ ₁₇ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−Ｙ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍが、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択される、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１６〕Ｒ ₁ およびＲ ₂ が、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ ₃ 〜Ｒ ₈ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基であり、Ｒ ₉ 〜Ｒ ₁₂ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳである、前記〔１５〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１７〕一般構造：
を含み、式中、Ｒ ₁ およびＲ ₂ が、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ ₃ 〜Ｒ ₈ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基であり、Ｒ ₉ 〜Ｒ ₁₂ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基であり、Ｘが、Ｏ、ＣＲ ₁₇ 、ＭＲ ₁₇ であり、Ｒ ₁₃ が、Ｈ、アルキル基、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍが、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択され、各ｎが、独立して２〜４であり、各個別のＲ ₁₃ 、Ｒ ₁₄ 、Ｒ ₁₅ 、およびＲ ₁₆ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳである、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１８〕１つ以上の環状構造が、Ｒ ₁₃ または関連するＣとＲ ₃ または関連するＣ、Ｒ ₁₄ または関連するＣとＲ ₄ または関連するＣ、Ｒ ₁₅ または関連するＣとＲ ₈ または関連するＣ、およびＲ ₁₆ または関連するＣとＲ ₇ または関連するＣから選択される基の間の結合により形成される、前記〔１７〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔１９〕一般構造：
を含み、式中、Ｒ ₂ が、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ ₃ 〜Ｒ ₈ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、であり、Ｒ ₉ 〜Ｒ ₁₂ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基であり、Ｘが、Ｏ、ＣＲ ₁₃ 、ＭＲ ₁₇ であり、Ｒ ₁₇ が、Ｈ、アルキル基、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｍが、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｇｅ、Ａｓ、Ｓｅ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔｅ、Ｐｂ、Ｂｌ、およびＰｏから選択され、Ｙが、Ｎ−Ｒ ₁₈ であり、Ｒ ₁₈ が、独立して、またはＲ ₃ もしくはＲ ₄ との環状構造の一部として環化されているアリール基またはアルキル基である、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔２０〕一般構造：
を含み、式中、Ｒ ₁ およびＲ ₂ が、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ ₃ 〜Ｒ ₆ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基である、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔２１〕一般構造：
を含み、式中、Ｒ ₁ およびＲ ₂ が、独立して、Ｈ、アルキル基、アリール基、Ｌ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｒ ₃ 〜Ｒ ₆ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、アルコキシド基、アルキル基、アリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−Ｒ、Ｌ−Ｗ、またはＬ−ＣＳであり、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基である、前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤。
〔２２〕前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤に連結されている目的の実体を含む、組成物。
〔２３〕前記目的の実体が、タンパク質、ペプチド、多糖、脂質、または小分子から選択される、前記〔２２〕に記載の組成物。
〔２４〕前記目的の実体がタンパク質であり、前記タンパク質が、細胞表面受容体、抗体、または酵素である、前記〔２３〕に記載の組成物。
〔２５〕前記目的の実体が多糖であり、前記多糖がデキストランである、前記〔２３〕に記載の組成物。
〔２６〕前記目的の実体および前記ｐＨセンサー剤がリンカー部分により連結されている、前記〔２２〕に記載の組成物。
〔２７〕環境のｐＨを検出する方法であって、
ａ）前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤を前記環境と接触させることと、
ｂ）前記ｐＨセンサー剤から蛍光を検出することと、
ｃ）前記蛍光を前記ｐＨと相関させることと、
を含む、方法。
〔２８〕前記蛍光を相関させることが、前記蛍光の強度を対照値と比較することを含む、前記〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕環境のｐＨの変化をモニターする方法であって、
ａ）前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤を前記環境と接触させることと、
ｂ）前記ｐＨセンサー剤から蛍光を経時的に検出することと、
ｃ）蛍光の変化をｐＨの変化と相関させることと、
を含む、方法。
〔３０〕前記ｐＨセンサー剤から蛍光を経時的に検出することが、蛍光をリアルタイムで検出することを含む、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３１〕前記ｐＨセンサー剤から蛍光を経時的に検出することが、蛍光を多様な時点で検出することを含む、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３２〕第１のｐＨ環境から第２のｐＨ環境への目的の実体の移動を検出する方法であって、
ａ）前記〔１〕に記載のｐＨセンサー剤を前記第１のｐＨ環境と接触させることと、
ｂ）前記第１のｐＨ環境における前記ｐＨセンサー剤の蛍光を検出することと、
ｃ）前記ｐＨセンサー剤の前記蛍光をモニターすることと、を含み、前記蛍光の変化が、前記ｐＨセンサー剤の第２のｐＨ環境への移動を示す、方法。
〔３３〕前記第１のｐＨ環境が細胞外であり、前記第２のｐＨ環境が細胞内である、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕前記蛍光がリアルタイムでモニターされる、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３５〕前記ｐＨセンサー剤が目的の実体と連結されている、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３６〕前記目的の実体が、タンパク質、ペプチド、多糖、脂質、または小分子から選択される、前記〔３５〕に記載の方法。
〔３７〕前記目的の実体がタンパク質であり、前記タンパク質が、細胞表面受容体、抗体、または酵素である、前記〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕容器の中に前記〔１〕〜〔２１〕のいずれか一項に記載のｐＨセンサー剤を含む、キット。
〔３９〕容器の中に前記〔２２〕〜〔２６〕のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。

Claims (4)

1. 下式：
   により表されるｐＨセンサー剤であって、式中、
   Ｒ ₁ が、直鎖アルキル基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、またはＣＯ ₂ ＨもしくはＳＯ ₃ Ｈにより置換された直鎖アルキル基を表し、
   Ｒ ₂ が、直鎖アルキル基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、またはＣＯ ₂ ＨもしくはＳＯ ₃ Ｈにより置換された直鎖アルキル基を表し、
   Ｒ ₃ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、
   Ｒ ₄ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、
   Ｒ ₅ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、
   Ｒ ₆ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、
   Ｒ ₇ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、
   Ｒ ₈ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、
   Ｒ ⁹ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ ₁ −Ｃ ₂₀ アルコキシド基、Ｃ ₁ −Ｃ ₂₀ アルキル基、０〜４個のＮ、Ｏ、およびＳから独立して選択されるヘテロ原子を含有する５〜６員環からなるアリール基、ＣＯ₂Ｈ、ＳＯ₃Ｈ、Ｌ−ＣＯ₂Ｈ、Ｌ−ＳＯ₃Ｈ、またはＬ−Ｗを表し、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基であり、前記反応性基が、パートナー化学部分と反応して共有連結を形成することができる化学部分であり、
   Ｒ ¹⁰ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ ₁ −Ｃ ₂₀ アルコキシド基、Ｃ ₁ −Ｃ ₂₀ アルキル基、０〜４個のＮ、Ｏ、およびＳから独立して選択されるヘテロ原子を含有する５〜６員環からなるアリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、またはＬ−Ｗを表し、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基であり、前記反応性基が、パートナー化学部分と反応して共有連結を形成することができる化学部分であり、
   Ｒ ¹¹ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ ₁ −Ｃ ₂₀ アルコキシド基、Ｃ ₁ −Ｃ ₂₀ アルキル基、０〜４個のＮ、Ｏ、およびＳから独立して選択されるヘテロ原子を含有する５〜６員環からなるアリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、またはＬ−Ｗを表し、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基であり、前記反応性基が、パートナー化学部分と反応して共有連結を形成することができる化学部分であり、
   Ｒ ¹² が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＨ、Ｃ ₁ −Ｃ ₂₀ アルコキシド基、Ｃ ₁ −Ｃ ₂₀ アルキル基、０〜４個のＮ、Ｏ、およびＳから独立して選択されるヘテロ原子を含有する５〜６員環からなるアリール基、ＣＯ ₂ Ｈ、ＳＯ ₃ Ｈ、Ｌ−ＣＯ ₂ Ｈ、Ｌ−ＳＯ ₃ Ｈ、またはＬ−Ｗを表し、Ｌが、０〜１６個の非水素原子を含み、かつエステル、酸、スルホン酸、スルファミド、アミン、アミド、アルコール、エーテル、チオエーテル、ハロゲン化物、単結合、二重結合、三重結合、および芳香族結合のうちの適切な組み合わせを含む、直鎖、分岐鎖、および／または環状の共有連結であり、Ｗが、反応性基であり、前記反応性基が、パートナー化学部分と反応して共有連結を形成することができる化学部分であり、かつ
   Ｘが、Ｏを表す、
   前記ｐＨセンサー剤。
2. Ｒ ⁹ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、
   Ｒ ¹¹ が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表し、かつ
   Ｒ ¹² が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを表す、
   請求項１に記載のｐＨセンサー剤。
3. Ｒ ¹⁰ が、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨＲ _x 、または
   を表し、
   Ｒ _x が、アルキル基、または（ＣＨ ₂ ＣＨ ₂ Ｏ） _u （ＣＨ ₂ ） _v −ハロゲンを表し、Ｒ _x が（ＣＨ ₂ ＣＨ ₂ Ｏ） _u （ＣＨ ₂ ） _v −ハロゲンである場合、ＮＨＲ _x により表される鎖のいずれかの部分は、アミド基、直鎖もしくは環状アルキレン基、またはフェニレン基、またはこれらの組合せにより中断または置換されてもよく、ｕ＝０〜１０であり、かつｖ＝０〜１０である、
   請求項２に記載のｐＨセンサー剤。
4. 下式：
   により表される、請求項３に記載のｐＨセンサー剤。