JP2022520649A - Ｅｇｆｒ、ｈｅｒ２及びｈｅｒ３に結合する結合部分の組み合わせ - Google Patents

Abstract

本発明は、２つ以上の結合部分を含む組成物であって、当該結合部分の各々の各々が、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む組成物を提供し、第１の当該結合部分は、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の当該結合部分は、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。本発明はまた、組成物を製造するための、及び当該組成物を用いて対象を治療するための手段及び方法に関する。

Description

本発明は、抗体などの結合部分の分野に関し、詳細には、治療用結合部分の分野に関する。本結合部分は、ヒトの治療に使用することができる。より詳細には、本発明は、２つ以上の多重特異性結合部分を含む組成物に関し、好ましくは、多重特異性抗体を含む組成物に関する。本結合部分は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３に結合する。単一の宿主細胞は、複数の結合部分を産生することができる。

上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（ＥＧＦＲ）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーのためのプロトタイプの細胞表面受容体である。このファミリーは、現在、４つの密接に関連する受容体チロシンキナーゼ：ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ－２／ｃ－ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ－３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ－４）を有する。

ＥＧＦＲは、細胞表面に存在し、上皮成長因子及びトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）を含むその特異的リガンドの結合によって活性化される。その成長因子リガンドによって活性化されると、受容体は、不活性でほとんどがモノマーである形態から、活性なホモ二量体へ転移する。リガンド結合後にホモ二量体を形成することに加えて、ＥＧＦＲは、ＨＥＲ２などのＥｒｂＢ受容体ファミリーの別のメンバーと対合して、活性化ヘテロ二量体を生成し得る。リガンド結合の非存在下で二量体が形成され、リガンド結合後に活性化ＥＧＦＲのクラスターが形成されることを示唆する証拠も存在する。

ＥＧＦＲ二量体化は、その固有の細胞内タンパク質－チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）活性を刺激する。この活性は、細胞の増殖及び分化をもたらすいくつかのシグナル伝達カスケードを誘導する。ＥＧＦＲのキナーゼドメインは、それが複合体化している他の受容体のチロシン残基を交差リン酸化することができ、そのようにして、それ自体を活性化することができる。

ＥＧＦＲが関与する突然変異及び過剰発現は、いくつかのタイプのがんで確認されており、それは、抗がん療法の拡大するクラスの標的である。これらには、肺がんに関するゲフィチニブ及びエルロチニブのようなＥＧＦＲ標的小分子、並びに、結腸がんや頭頸部がんに関するセツキシマブ及びパニツムマブのような抗体が含まれる。

ＥＧＦＲ標的化療法はある程度成功しているが、ほとんどの場合、時間が経つにつれて治療耐性の発生を伴う。ＥＧＦＲ陽性腫瘍が標的療法から逃れることができる方法の１つは、別の受容体の二量体を介したシグナル伝達によるものである。例えば、ＨＥＲ３発現又はヘレグリン発現の増加によるＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二量体によるシグナル伝達の増加は、例えば、肺がんや頭頸部がんにおけるＥＧＦＲ標的薬耐性を伴う。治療耐性を惹起することとは別に、ＥＧＦＲ標的化抗体のいくつかの副作用が観察されている。一例は、ＥＧＦＲ阻害又は抗ＥＧＦＲ生物学的治療に関連する皮膚発疹の発症である。極端な場合、そのような発疹は、治療サイクルの減少、及び／又は治療の時期尚早な終了につながることがある。

ＥＧＦ受容体ファミリーのシグナル伝達の様々な様式が確認されている。これらの中には、シグナル伝達のリガンド依存性及びリガンド非依存性の活性化がある。過剰発現したＨＥＲ２は、ＨＥＲ３リガンドの非存在下であっても、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体を介して発がん性シグナル伝達を生じさせることができる（Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ａｋｉｔａら、２００９）。ＨＥＲ２活性は、ＨＥＲ２特異的抗体によって阻害することができる。かかるＨＥＲ２特異的抗体は、例えば、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）腫瘍の治療に使用される。そのような治療に伴う問題は、腫瘍がしばしばＨＥＲ２特異的治療から逃れ、阻害抗体の存在下でさえ成長し続けることである。乳房、卵巣、子宮頸部及び胃の腫瘍などのＨＥＲ２陽性腫瘍が、アップレギュレートされたＨＥＲ３発現（Ｏｃａｎａ、Ｖｅｒａ－Ｂａｄｉｌｌｏら、２０１３）及び／又はＨＥＲ３リガンド発現（Ｗｉｌｓｏｎ、Ｆｒｉｄｌｙａｎｄら、２０１２）を示す腫瘍細胞の亜集団の選択的増殖によって治療から逃れる場合があることが観察されている。ＨＥＲ３受容体における活性化変異も確認されている。

このように、ＥＧＦ受容体ファミリーメンバーを特異的に標的とする抗体治療の将来有望な成果にもかかわらず、全ての腫瘍が応答又は十分に応答するわけではないことが観察されている。本発明は、ＥＧＦ受容体ファミリーの様々なメンバーを標的とする結合部分の組み合わせ及びそれらを産生する方法を提供する。本発明の組み合わせは良好な有効性を示す。本組み合わせは、費用効果が高く効率的な方法で産生することができる。

本発明は、２つ以上の結合部分を含む組成物であって、
各結合部分が、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、
第１の当該結合部分が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の当該結合部分が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む、組成物を提供する。

好ましくは、２つ以上の結合部分の少なくとも１つは抗体である。好ましい実施形態では、２つ以上の結合部分のうちの少なくとも２つが抗体である。抗体は、好ましくは、多重特異性抗体であり、好ましくは、二重特異性抗体である。好ましくは、抗体の少なくとも１つ、より好ましくは、少なくとも２つはＩｇＧ抗体である。本発明の好ましい実施形態では、本組成物は２つの二重特異性抗体を含む。

本明細書に記載の多重特異性抗体は、好ましくは、ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を含む。一態様において、第１及び／又は第２の多重特異性抗体のＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインは、ＥＧＦＲ可変ドメインの重鎖と、ＨＥＲ２可変ドメイン及びＨＥＲ３可変ドメインのそれぞれの重鎖とのヘテロ二量体化を促進するように操作される。

本発明はまた、がんの治療に使用するための本明細書に記載の組成物を提供する。複数の実施形態では、がんは、固形上皮がんである。好ましくは、本組成物は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３を発現するがんに使用される。本組成物は、好ましくは、膵臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、上皮性卵巣がん、上皮性卵管がん、上皮性腹膜がん、膀胱がん、又は前立腺がんに用いられる。いくつかの実施形態では、本組成物の使用によって治療されるがんは進行がんである。本組成物は、好ましくは、転移性がんに使用される。本組成物は、好ましくは、転移性膵臓がん、転移性結腸直腸がん、転移性頭頸部がん、転移性上皮卵巣がん、転移性上皮卵管がん、転移性上皮腹膜がん、転移性膀胱がん又は転移性前立腺がんに用いられる。いくつかの実施形態では、本組成物は、好ましくは、胃がん、肺がん、乳がん又は食道がんのために使用される。好ましくは、本組成物は、転移性胃がん、転移性肺がん、転移性乳がん又は転移性食道がんに使用される。

本発明は更に、それぞれがＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む２つ以上の結合部分を含む産物を提供し、第１の当該結合部分は、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の当該結合部分は、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを、がんの処置における同時使用、個別的使用又は逐次使用のための組み合わせ調製物として含む。

本発明は更に、本発明による組成物を製造するための方法を提供し、この方法は、
細胞を提供することであって、
共通軽鎖と一緒になってＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、を有する細胞を提供することを含み、
当該核酸のうちの２つ以上が物理的に連結されていてもいなくてもよく、当該核酸の各々が、当該細胞におけるコードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含み、当該方法は、当該重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために当該細胞を培養することと、任意選択で、当該２つ以上の結合部分を収集することとを更に含む。

更に、細胞であって、
共通軽鎖と一緒になってＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、を有する細胞を提供することを含み、
ここで、２つ以上の当該核酸は、物理的に連結されていてもいなくてもよく、当該核酸の各々は、当該細胞におけるコードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含む。

更なる態様では、本発明は、核酸を含む容器であって、
共通軽鎖と一緒になってＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、を有する細胞を提供することを含み、
ここで、任意選択で、２つ以上の当該核酸が物理的に連結されていてもいなくてもよく、当該核酸のそれぞれが、細胞におけるコードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含む。

本発明は更に、ＥＧＦＲの細胞外部分及びＨＥＲ２の細胞外部分に特異的に結合する結合部分を含む組成物を提供する。

本発明はまた、ＥＧＦＲの細胞外部分及びＨＥＲ３の細胞外部分に特異的に結合する結合部分を含む組成物を提供する。

結合部分は、好ましくは、抗体、好ましくは、ＩｇＧ抗体、より好ましくは、多重特異性抗体である。

本明細書で使用されるＥＧＦＲという用語は、ヒトにおいて上皮増殖因子受容体遺伝子（ＥＧＦＲ）によってコードされるタンパク質を指す。このタンパク質は、いくつかの別名で知られており、その中にはＥｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ１、がん原遺伝子Ｃ－ＥｒｂＢ－１、ＥＲＢＢ１、及びＨＥＲ１がある。ヒトＥＧＦＲタンパク質及びそれをコードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００５２２８．３）である。この登録番号は、主に、ＥＧＦＲタンパク質を標的として同定する更なる方法を提供するために与えられ、抗体によって結合されたＥＧＦＲタンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどで生じるものなどのコード遺伝子における変異のために変化し得る。本明細書において、ＥＧＦＲに言及される場合、特に明記しない限り、ヒトＥＧＦＲを指す。ＥＧＦＲ可変ドメインは、ヒトと他の哺乳動物との間のＥＧＦＲのオルソログの配列及び三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し得るが、必ずしも結合するとは限らない。ＥＧＦＲに結合する可変ドメインは、ＥＧＦＲ及びその様々な変異体（いくつかのＥＧＦＲ陽性腫瘍上に発現される変異体など）に結合し得る。

本発明の抗体又は結合部分のＥＧＦＲ結合可変ドメインは、好ましくは、ＥＧＦＲのドメインＩ又はドメインＩＩＩに結合する。ＥＧＦＲタンパク質の構造は、とりわけ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ（２００８：Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００８；３７：３５３－３７３．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．３７．０３２８０７．１２５８２９）に記載されている。ヒトＥＧＦＲのドメインは、上述したＦｅｒｇｕｓｏｎの参考文献の図１に記載されている。本明細書中に開示される本発明の実施形態のＥＧＦＲ結合可変ドメインは、好ましくは、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する。この抗体は、好ましくは、ＢｘＰＣ－３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６８７）又はＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２細胞（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）のＥＧＦ誘導性増殖を阻害する。

本明細書で使用されるＨＥＲ２という用語は、ヒトにおいてＥＲＢＢ－２遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子又はタンパク質の代替名としては、ＣＤ３４０、ＥｒｂＢ－２；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＭＬＮ １９、ＮＥＵ、ＮＧＬ、ＴＫＲ１。ＥＲＢＢ－２遺伝子は、ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ヒト表皮増殖因子受容体２）と呼ばれることが多い。本明細書においてＨＥＲ２に言及する場合、当該言及はヒトＨＥＲ２を指す。ＨＥＲ２に結合する可変ドメインを含む抗体は、ヒトＨＥＲ２に結合する。ＨＥＲ２可変ドメインは、ヒトと他の哺乳動物の間におけるＨＥＲ２のオルソログの配列及び三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し得るが、必ずしも結合するとは限らない。ヒトＨＥＲ２タンパク質及びそれをコードする遺伝子のデータベース受託番号は（ＮＰ＿００１００５８６２．１、ＮＰ＿００４４３９．２、ＮＣ＿００００１７．１０、ＮＴ＿０１０７８３．１５）である。この受託番号は、主として、標的としてのＨＥＲ２を識別する更なる方法を提供するために与えられるものであり、抗体に結合したＨＥＲ２タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどにおいて生じる突然変異などのコード遺伝子の突然変異のために変動し得る。ＨＥＲ２可変ドメインは、ＨＥＲ２及びその様々な変異体、例えば、いくつかのＨＥＲ２陽性腫瘍細胞によって発現される変異体に結合し得る。

ＨＥＲ２タンパク質は、いくつかのドメインを含む（Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ｒ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；９（１）：２０２－の図１を参照のこと）。細胞外ドメインは、ドメインＩ～ＩＶと呼ばれる。ＨＥＲ２に結合する本明細書に開示される本発明の実施形態の可変ドメインは、好ましくは、ＨＥＲ２のドメインＩ又はドメインＩＶに結合し、好ましくは、ドメインＩＶに結合する。

本明細書で使用されるＨＥＲ３という用語は、ヒトにおいてＥＲＢＢ３遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。遺伝子又はタンパク質の代替名は、ＬＣＣＳ２；ＭＤＡ－ＢＦ－１；ｃ－ＥｒｂＢ－３、ｃ－ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ３－Ｓ；ｐ１８０－ＥｒｂＢ３；ｐ４５－ｓＥｒｂＢ３；及びｐ８５－ｓＥｒｂＢ３である。本明細書においてＨＥＲ３に言及する場合、その言及はヒトＨＥＲ３を指す。ＨＥＲ３に結合する可変ドメインを含む抗体は、ヒトＨＥＲ３に結合する。ＨＥＲ３可変ドメインは、ヒトと他の哺乳動物との間のＨＥＲ３のオルソログの配列及び三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し得るが、必ずしも結合するとは限らない。ヒトＨＥＲ３タンパク質及びそれをコードする遺伝子についてのデータベース受託番号（ＮＰ＿００１００５９１５．１；ＮＰ＿００１９７３．２，ＮＣ＿００００１２．１１，ＮＴ＿０２９４１９．１２）。この受託番号は、主として、標的としてのＨＥＲ３を識別する更なる方法を提供するために与えられるものであり、抗体に結合したＨＥＲ３タンパク質の実際の配列は、例えば、いくつかのがんなどにおいて生じる突然変異などのコード遺伝子の突然変異のために変動し得る。ＨＥＲ３可変ドメインは、ＨＥＲ３及びその様々な変異体、例えば、いくつかのＨＥＲ２陽性腫瘍細胞によって発現される変異体に結合し得る。

ＨＥＲ３の構造は、とりわけ、Ｃｈｏら（２００２；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７，１３３０～１３３３：ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０７４６１１）に記載される。ヒトタンパク質は、４つの細胞外ドメインを有する。ＨＥＲ３に結合する本明細書に開示される本発明の実施形態の可変ドメインは、好ましくは、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する。好ましい実施形態では、ＨＥＲ３陽性細胞に対する可変ドメインの親和性（ＫＤ）は、２．０ｎＭ以下であり、より好ましくは、１．５ｎＭ以下、より好ましくは、１．３９ｎＭ以下、より好ましくは、０．９９ｎＭ以下である。好ましい実施形態では、本発明による抗体は、好ましくは、Ｒ４２６、及び天然ＨＥＲ３タンパク質中のＲ４２６から１１．２Å以内に位置するアミノ酸残基からなる群から選択されるＨＥＲ３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する可変ドメインを含む。好ましい一実施形態では、ＳＫ－ＢＲ－３細胞上のＨＥＲ３に対する可変ドメインの親和性（ＫＤ）は、２．０ｎＭ以下であり、より好ましくは、１．５ｎＭ以下、より好ましくは、１．３９ｎＭ以下、好ましくは、０．９９ｎＭ以下である。一実施形態では、当該親和性（ＫＤ）は、１．３９～０．５９ｎＭの範囲内である。好ましい一実施形態では、ＢＴ－４７４細胞上のＨＥＲ３に対する可変ドメインの親和性（ＫＤ）は、２．０ｎＭ以下であり、より好ましくは、１．５ｎＭ以下、より好ましくは、１．０ｎＭ以下、より好ましくは、０．５ｎＭ以下、より好ましくは、０．３１ｎＭ以下、より好ましくは、０．２３ｎＭ以下である。一実施形態では、当該親和性（ＫＤ）は、０．３１～０．１５ｎＭの範囲内である。上述した親和性は、好ましくは、定常状態の細胞親和性の測定値を使用して測定されるものであり、細胞は、放射性標識抗体を使用して４℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射能が測定される。

ＨＥＲ３のドメインＩＩＩの少なくとも１つのアミノ酸に結合する可変ドメインは、好ましくは、天然ＨＥＲ３タンパク質中のＲ４２６及びＲ４２６から１１．２Å以内に位置するアミノ酸残基を含む群から選択されるアミノ酸に結合する。好ましくは、天然ＨＥＲ３タンパク質中のＲ４２６から１１．２Å以内に位置する当該アミノ酸残基は、Ｌ４２３、Ｙ４２４、Ｎ４２５、Ｇ４２７、Ｇ４５２、Ｒ４５３、Ｙ４５５、Ｅ４８０、Ｒ４８１、Ｌ４８２、Ｄ４８３及びＫ４８５からなる群から選択される（例えば、図９及び表１を参照のこと）。アミノ酸残基のナンバリングは、ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（ＰＤＢ）ＩＤ番号４Ｐ５９である。ＨＥＲ３のドメインＩＩＩのこの領域に結合する抗体は、特に良好な結合特性を示し、ＨＥＲ３陽性細胞に対するＨＥＲ３の活性を打ち消すことができる。ＨＥＲ３結合特性を有する可変ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１３０１７２号明細書に記載されている。好ましい一実施形態では、本発明による二重特異性抗体であって、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩの少なくともＲ４２６に結合する可変ドメインを含む抗体が提供される。好ましくは、当該抗体は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩの少なくともＲ４２６に結合する可変ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、２つ以上の抗体を含む組成物であって、当該抗体のそれぞれが、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第１の当該抗体がＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の当該抗体がＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態では、第１及び第２の抗体のＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインは、本質的に同じアミノ酸配列を有する。一実施形態では、当該第１及び第２の抗体は、ＥＧＦＲのドメインＩに結合する可変ドメインを含み、当該第１の抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩに結合する可変ドメインを含み、当該第２の抗体は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する可変ドメインを含む。別の実施形態では、当該第１及び第２の抗体は、ＥＧＦＲのドメインＩに結合する可変ドメインを含み、当該第１の抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する可変ドメインを含み、当該第２の抗体は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する可変ドメインを含む。更なる実施形態では、当該第１及び第２の抗体は、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する可変ドメインを含み、当該第１の抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩに結合する可変ドメインを含み、当該第２の抗体は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する可変ドメインを含む。更なる実施形態では、当該第１及び第２の抗体は、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する可変ドメインを含み、当該第１の抗体は、ＨＥＲ２のドメインＩＶに結合する可変ドメインを含み、当該第２の抗体は、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する可変ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、結合部分は、タンパク質又はアプタマーである。本明細書に記載の結合部分は、典型的には、２以上の結合特異性を有する。結合部分は、好ましくは、抗体の２つ以上の可変ドメインを含む。可変ドメインは、様々な方法で提供することができる。いくつかの抗体可変ドメイン含有断片は、「Ｎｅｌｓｏｎ ２０１０：ＭＡｂｓ．２０１０ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；２（１）：７７～８３」に記載されており、当該断片には、種々のＦＡＢフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、及びいわゆる単一ドメイン抗体、例えば、ＶＨＨフラグメントが含まれる。種々のＦＡＢフラグメント又は一本鎖Ｆｖフラグメントは、現在周知である。単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである。抗体全体と同様に、これは特定の抗原に選択的に結合することができる。分子量がわずか１２～１５ｋＤａの単一ドメイン抗体は、２つの重タンパク質鎖と２つの軽鎖で構成される一般的な抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、Ｆａｂフラグメント（～約５０ｋＤａ、軽鎖と重鎖の半分）及び単鎖可変断片（～約２５ｋＤａ、二つの可変ドメイン、一つは軽鎖由来、もう一つは重鎖由来）よりも更に小さい。単一ドメインフラグメントを最初にラクダ重鎖抗体から作製した。同様の単一ドメインフラグメントは、現在、人工的に作製することができ、他の生物に由来し得る。可変ドメインは、好ましくは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。可変ドメインは、ＶＨ／ＶＬ組み合わせ（ＶＨが重鎖の可変領域を表し、ＶＬが軽鎖の可変領域を表す）と呼ばれることもある。

２つ以上のフラグメントを連結して、それと同じ数の結合特異性を有する結合部分を作製することができる。連結は、典型的には、２つ以上のアミノ酸残基を含む連結ペプチドを用いて行われる。連結部分はまた、タンパク質の一部又は全部であり得る。例えば、ヒト血清アルブミンが使用される場合がある。本明細書に記載される結合部分は、好ましくは、例えば、図７又は図８に記載されるようなＭＦの重鎖可変領域と、軽鎖可変領域（例えば、軽鎖可変領域）とが対になった少なくとも１つの可変ドメインを含む。好ましい実施形態では、結合部分は、２つ以上のかかる可変ドメインを含む。

ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合する結合部分は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に結合する結合部分とは異なる結合部分である。結合部分の少なくとも１つが多重特異性抗体である場合、少なくとも１つの多重特異性抗体は、少なくともＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合し得るか、又は少なくともＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に結合し得る。好ましい実施形態では、結合部分は、一つの二重特異性抗体がＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合し、もう一つの二重特異性抗体がＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に結合する二重特異性抗体を含む。

本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、抗原上のエピトープに結合する１つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、このようなドメインは、抗体の可変領域に由来するか又は配列相同性を共有する。抗体は、典型的には、基本的な構造単位で構成されており、それぞれに２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する。治療用の抗体は、好ましくは、可能な限り治療される対象の天然抗体（例えば、ヒト対象のヒト抗体）に近いものである。本発明による抗体は、任意の特定のフォーマット又はそれを産生する方法に限定されない。

抗体は、典型的には、抗原のエピトープを認識し、かかるエピトープは他の化合物にも存在し得るので、抗原、例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３を「特異的に認識する」本発明による抗体は、他の化合物が同じ種類のエピトープを含む場合、かかる他の化合物を同様に認識し得る。したがって、抗原と抗体との相互作用に関して、「特異的に認識する」若しくは「特異的に結合する」という用語又は同じ意味を有する用語は、同じ又は同じ種類のエピトープを含む他の化合物への抗体の結合を排除するものではない。

「二重特異性抗体」は、抗体の１つの可変ドメインが第１の抗原に結合する一方で、抗体のもう一つの可変ドメインが第２の抗原に結合し、当該第１及び第２の抗原が同一ではない、本明細書に記載の抗体である。「二重特異性抗体」という用語はまた、一つの重鎖可変領域／軽鎖可変領域（ＶＨ／ＶＬ）の組み合わせが抗原上の第１のエピトープに結合し、もう一つのＶＨ／ＶＬの組み合わせが第２のエピトープに結合する抗体を包含する。第２のエピトープは、同じ抗原上の異なるエピトープであり得る。この用語は、ＶＨが第１の抗原を特異的に認識することができ、ＶＬが免疫グロブリン可変領域中のＶＨと対になって、第２の抗原を特異的に認識することができる抗体を更に含む。得られたＶＨ／ＶＬ対は、抗原１又は抗原２のいずれかに結合する。例えば、国際公開第２００８／０２７２３６号明細書、国際公開第２０１０／１０８１２７号明細書及びＳｃｈａｅｆｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０，４７２－４８６，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１１）に記載されているそのようないわゆる「ツーインワン抗体」。本発明による二重特異性抗体は、任意の特定の二重特異性フォーマット又はそれを産生する方法に限定されない。

二重特異性抗体は、多重特異性抗体の一例である。三重（及びそれ以上の）特異性抗体は、ｓｃＦｖフラグメントなどの結合部分を１つ以上の重鎖に付加することによって作製することができる。一般的な抗体又は二重特異性抗体の可変領域に１つ以上の可変ドメインを付加することも可能である。共通軽鎖と、２つの異なる重鎖であって、各々が共通軽鎖と機能的可変ドメインを形成することができる重鎖とを産生する細胞は、とりわけ、２つの異なる重鎖と軽鎖の組み合わせを有する二重特異性抗体を産生する。同様に、共通軽鎖及び３つ以上の異なる重鎖を産生する細胞は、一緒になって３つ以上の抗原を標的化することが可能ないくつかの二重特異性抗体を形成することができる。現在、抗体の標準的なフォーマット（すなわち、定常部分と２つの可変ドメイン）に基づいて構築し、更なる結合ドメインを付加することが可能である。したがって、抗体の定常ドメイン又は１つ以上の可変ドメインに結合する付加的な結合特異性を備える１つ以上の一本鎖Ｆｖを有する多重特異性抗体を作製することができる。２つ以上の可変領域を有する重鎖を作製することも可能である。付加的な重鎖領域は、異なる又は共通軽鎖可変領域と有利に会合することができる。そのような抗体の説明については、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６２／６５０４６７号明細書を参照されたい。

本明細書において、核酸又はアミノ酸配列について言及する場合、「パーセント（％）同一性」は、最適な比較目的のために配列をアラインメントした後、選択された配列中の残基と同一である候補配列中の残基の百分率として定義される。核酸配列を比較するパーセント配列同一性は、デフォルト設定を使用してＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ １０．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して求められる。この設定には、変更されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３～４６８０）、ｓｗｇａｐｄｎａｒｎｔスコアマトリックス、１５のギャップオープンペナルティ、及び６．６６のギャップエクステンションペナルティを用いる。アミノ酸配列は、デフォルト設定を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ１１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用し、れは、修正ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．１９９４）、ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２スコアマトリックス、１０のギャップオープンペナルティ、及び０．１のギャップ伸長ペナルティを採用して、アライメントされる。

本明細書で使用される「共通軽鎖」という用語は、例えば、多重特異性抗体で使用することができる軽鎖を指す。二重特異性抗体では、２つの軽鎖は共通軽鎖（又はそのＶＬ部分）であり得る。全長抗体の結合特異性は影響を受けないが、２つの軽鎖（又はそのＶＬ部分）は、同一であってもよく、いくつかのアミノ酸配列の違いを有してもよい。「再構成された」という用語の追加の有無にかかわらず、「共通軽鎖」、「共通ＶＬ」、「単一軽鎖」、「単一ＶＬ」という用語は、全て本明細書で互換的に使用される。「共通」は、同じ配列を有する軽鎖を指し、アミノ酸配列が同一ではないが機能的に等価なものも指す。当該軽鎖の多くの変異体が存在し、機能的結合領域の形成に影響を与えない変異（欠失、置換、挿入及び／又は付加）が存在する。本発明の軽鎖はまた、０から１０個、好ましくは、０から５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はそれらの組み合わせを有する、本明細書で指定される軽鎖であり得る。例えば、保存的アミノ酸の変化、重鎖と対合するときに結合特異性に寄与しない又は部分的にのみ寄与する領域におけるアミノ酸の変化などを導入し試験することによって、同一ではないが依然として機能的に同等である軽鎖を調製又は見出すことは、本明細書に使用される共通軽鎖の定義の範囲内である。いくつかの実施形態では、３つ以上の可変ドメインを有する多重特異性抗体は、異なる重鎖と、同じ軽鎖を有する可変ドメイン又はいくつかのアミノ酸の相違を有する軽鎖とを有するが、全長の多重特異性抗体の結合特異性は影響を受けない。かかる軽鎖は、有利には、本明細書中に記載される共通軽鎖でもある。好ましい実施形態では、多重特異性抗体の全ての可変ドメインが共通軽鎖を含む。本発明の多価抗体において使用するための共通軽鎖（可変領域）は、ラムダ軽鎖であり得、したがって、これも本発明の文脈において提供されるが、カッパ軽鎖が好ましい。本発明の共通軽鎖は、カッパ又はラムダ軽鎖の定常領域を含み得る。それは、好ましくは、カッパ軽鎖の定常領域であり、好ましくは、当該共通軽鎖は、生殖系列軽鎖であり、好ましくは、ＩｇＶＫ１－３９遺伝子セグメントを含む再構成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖、例えば、再構成された生殖系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶＫ１－３９^＊０１／ＩＧＪＫ１^＊０１である。共通軽鎖のアミノ酸配列の例を、図７の配列１０，１１又は１２に示す。

本発明による「全長ＩｇＧ」又は「全長抗体」という用語は、本質的に完全なＩｇＧを含むものとして定義されるが、必ずしも完全なＩｇＧの全ての機能を有するわけではない。誤解を避けるために、全長ＩｇＧは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。各鎖は、定常（Ｃ）領域及び可変（Ｖ）領域を含有し、これはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ及びＣＬ、ＶＬと表示されるドメインに分解することができる。ＩｇＧ抗体は、Ｆａｂ部分に含まれる可変領域ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメイン、主にＦｃ部分を介して免疫系の分子及び細胞と相互作用することができる。本発明による全長抗体は、所望の特性を提供する変異が存在し得るＩｇＧ分子を包含する。全長ＩｇＧは、領域のうちのいずれの実質的な部分の欠失も有さない必要がある。しかしながら、得られるＩｇＧ分子の結合特性を本質的に変えることなく、１つ又はいくつかのアミノ酸残基が欠失しているＩｇＧ分子は、用語「全長ＩｇＧ」に含まれる。例えば、かかるＩｇＧ分子は、好ましくは、非ＣＤＲ領域において、１から１０アミノ酸残基の欠失を有することができ、この欠失アミノ酸は、ＩｇＧの抗原特異性又はエピトープ結合特異性に必須ではない。ＩｇＧ抗体の例は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩＧ４抗体である。本発明のいくつかの実施形態では、ＩｇＧはＩｇＧ１である。

好ましくは、２つ以上の結合部分の少なくとも１つは抗体である。抗体は、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインと、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインとを含むことができる。別の実施形態では、抗体は、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインと、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインとを含む。

２つ以上の結合部分は、好ましくは、２つ以上の抗体を含み、好ましくは、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインをそれぞれ含む多重特異性抗体を含み、第１の当該抗体がＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の当該抗体がＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。２つ以上の多重特異性抗体を含む組成物の好ましい例は、２つ以上の二重特異性抗体を含む組成物である。本明細書に記載の２つの二重特異性抗体を含む組成物の非限定的な例を図１に概略的に示す。それぞれが２つの重鎖（１）及び２つの軽鎖（４）を有する２つの二重特異性抗体が示されている。２つの抗体は、重鎖可変領域（５）を有する重鎖を共有する。これらは、もう一方の重鎖の可変領域が異なる。一方の抗体は、重鎖可変領域（６）を有する。他方の抗体は、重鎖可変領域（７）を有する。全ての重鎖可変領域は、共通軽鎖（４）と対合して機能的結合ドメインを形成することができる。同じ細胞によって産生される場合、重鎖は、ヘテロ二量体化ドメイン（２，３）の存在によってヘテロ二量体化するように誘導される。ヘテロ二量体化ドメインは、２つの部分を有し、一方の重鎖上に１つの部分を有し、他方の重鎖上に適合部分を有する。ヘテロ二量体化ドメインは、しばしば、ＩｇＧ１ ＣＨ３領域にある。ヘテロ二量体化は、適切な部分を選択された重鎖に提供することによって誘導することができる。

本発明では、ＥＧＦＲｘＨＥＲ２二重特異性抗体及びＥＧＦＲｘＨＥＲ３二重特異性抗体の選択的な形成は、重鎖形成ＥＧＦＲ可変ドメインにヘテロ二量体化ドメインの一部分（３）を組み込み、かつ、ＨＥＲ２結合ドメイン及びＨＥＲ３結合ドメインを形成する重鎖に親和性の部分（２）を組み込むことによって誘導され得る。

軽鎖と一緒になって、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３などの抗原に結合する可変ドメインを形成する重鎖可変領域を有する重鎖は、本明細書では、ＥＧＦＲ重鎖、又はＨＥＲ２重鎖などとも呼ばれる。本発明の好ましい実施形態では、第１及び／又は第２の抗体の重鎖のＣＨ３領域は、ＨＥＲ２重鎖とＥＧＦＲ重鎖とのヘテロ二量体化、及び、ＨＥＲ３重鎖とＥＧＦＲ重鎖とのヘテロ二量体化を促進するように操作される。好ましい実施形態では、ヘテロ二量体化を促進するための操作は、以前に、米国特許第９，２４８，１８２号明細書、９，３５８，２８６；同９，２４８，１８２号明細書、及び同９，７５８，８０５号明細書に記載されたＤＥＫＫ残基位置を使用する。

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲへの組成物の抗体の結合は、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断し、及び／又は、ＨＥＲ３への組成物の抗体の結合は、ＨＥＲ３へのニューレグリン１（ＮＲＧ）の結合を遮断する。好ましい実施形態では、ＥＧＦＲに対する組成物の抗体の結合は、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断し、ＨＥＲ３に対する組成物の抗体の結合は、ＨＥＲ３に対するニューレグリン１（ＮＲＧ）の結合を遮断する。

ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＣＤＲ１配列ＮＹＡＭＮ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＡＮＴＧＤＰＴＹＡＱＧＦＴＧ、及び、ＣＤＲ３配列ＥＲＦＬＥＷＬＨＦＤＹ、を含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＣＤＲ１配列ＳＹＧＭＨ、ＣＤＲ２配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、及び、ＣＤＲ３配列ＤＹＹＲＲＴＡＲＡＧＦＤＹ、を含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインは、好ましくは、ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ、及び、ＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹ、を含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

好ましい実施形態では、組成物は、２つの二重特異性抗体を含み、第１の当該二重特異性抗体は、ＣＤＲ１配列ＮＹＡＭＮ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＡＮＴＧＤＰＴＹＡＱＧＦＴＧ、及びＣＤＲ３配列ＥＲＦＬＥＷＬＨＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中の１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。好ましい実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、ＣＤＲ１配列ＮＹＡＭＮ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＡＮＴＧＤＰＴＹＡＱＧＦＴＧ、及びＣＤＲ３配列ＥＲＦＬＥＷＬＨＦＤＹ、又は、ＣＤＲ中の１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む重鎖可変領域を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。

好ましい実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、ＣＤＲ１配列ＮＹＡＭＮ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＡＮＴＧＤＰＴＹＡＱＧＦＴＧ、及びＣＤＲ３配列ＥＲＦＬＥＷＬＨＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第１の二重特異性抗体が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを更に含み、この可変ドメインが、好ましくは、ＣＤＲ１配列ＳＹＧＭＨ、ＣＤＲ２配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、及びＣＤＲ３配列ＤＹＹＲＲＴＡＲＡＧＦＤＹ、又は、ＣＤＲ中に１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む重鎖可変領域を含み、当該第２の二重特異性抗体が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを更に含み、この可変ドメインが、好ましくは、ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ、及びＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹ、又は、ＣＤＲ中に１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む重鎖可変領域を含む。

好ましい実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、ＣＤＲ１配列ＮＹＡＭＮ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＡＮＴＧＤＰＴＹＡＱＧＦＴＧ、及びＣＤＲ３配列ＥＲＦＬＥＷＬＨＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第１の二重特異性抗体が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを更に含み、この可変ドメインが、好ましくは、ＣＤＲ１配列ＳＹＧＭＨ、ＣＤＲ２配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、及びＣＤＲ３配列ＧＤＹＧＳＹＳＳＹＡＦＤＹ、又は、ＣＤＲ中に１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む重鎖可変領域を含み、当該第２の二重特異性抗体が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを更に含み、この可変ドメインが、好ましくは、ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ、及びＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹ、又は、ＣＤＲ中に１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む重鎖可変領域を含む。

列挙されたＣＤＲ配列からの１、２、又は３アミノ酸残基の保存的変異は、種類として同じ結合活性（本質的に同等なのであって、その量は必ずしも同等ではない）を保持させつつ可能である。したがって、当該重鎖ＣＤＲ１、２及び３配列は、好ましくは、列挙されたＣＤＲ配列から３つ以下、好ましくは２つ以下、より好ましくは１つ以下のアミノ酸を逸脱する配列を含有する。特定の実施形態において、重鎖ＣＤＲ１、２及び３配列は、列挙されたＣＤＲ配列と同一である。

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ可変ドメインは、図７又は図８に記載のＥＧＦＲＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。好ましくは、図７又は図８のＭＦ３７５５のそれを含む。

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ可変ドメインは、図７又は図８に記載のＥＧＦＲＶＨ領域のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％同一、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。好ましくは、図７又は図８のＭＦ３７５５のそれを含む。

例えば、いくつかの実施形態では、ヒトＥＧＦＲに結合する二重特異性抗体の重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ配列の外側の重鎖可変領域の配列において、０～１０個、好ましくは、０～５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを有することができる。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、示されたアミノ酸配列に対する、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、好ましくは０～３、好ましくは０～２、好ましくは０～１、好ましくは０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを含む。

特定の実施形態では、ＥＧＦＲ可変ドメインは、図７又は図８から選択されるＥＧＦＲＶＨ領域由来のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。好ましくは、図７又は図８のＭＦ３７５５のそれを含む。

いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２可変ドメインは、図７又は図８に記載のＨＥＲ２ＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、好ましくは、図７又は図８のＭＦ２０３２のそれを含む。

いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２可変ドメインは、図７又は図８に記載のＨＥＲ２ＶＨ領域のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％同一、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、好ましくは、図７又は図８のＭＦ２０３２のそれを含む。

例えば、いくつかの実施形態において、ヒトＨＥＲ２に結合する二重特異性抗体の重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ配列の外側の重鎖可変領域の配列において、０～１０個、好ましくは０～５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを有することができる。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、示されたアミノ酸配列に対する、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、好ましくは０～３、好ましくは０～２、好ましくは０～１、好ましくは０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを含む。

特定の実施形態では、ＨＥＲ２可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ１８４９又はＭＦ２０３２から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。好ましくは、図７又は図８のＭＦ２０３２のそれを含む。

いくつかの実施形態では、ＨＥＲ３可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ３１７８のＶＨ領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＨＥＲ３可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ３１７８に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％同一、又は１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

例えば、いくつかの実施形態では、ヒトＨＥＲ３に結合する二重特異性抗体の重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ配列の外側の重鎖可変領域の配列における０～１０個、好ましくは、０～５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを有することができる。いくつかの実施形態において、重鎖可変領域は、示されたアミノ酸配列に対する、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、好ましくは０～３、好ましくは０～２、好ましくは０～１、好ましくは０のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを含む。

特定の実施形態では、ＨＥＲ３可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ３１７８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。

好ましい実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、図７又は図８から選択されるＥＧＦＲ ＶＨ領域由来のアミノ酸配列又はそれらの変異体、好ましくは、図７若しくは図８のＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくはＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含む、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第１の二重特異性抗体が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを更に含み、この可変ドメインが、図７若しくは図８のＭＦ１８４９若しくはＭＦ２０３２又はそれらの変異体、好ましくは、図７若しくは図８のＭＦ２０３２のアミノ酸配列又はそれらの変異体から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、当該変異体が、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２又は３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含み、当該第２の二重特異性抗体が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを更に含み、この可変ドメインが、図７若しくは図８のＭＦ３１７８のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含む重鎖可変領域を含み、当該変異体が、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２又は３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む。

好ましい実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、図７若しくは図８のＭＦ３７５５のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲに中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第１の二重特異性抗体が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを更に含み、この可変ドメインが、図７若しくは図８のＭＦ２０３２のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含み、当該第２の二重特異性抗体が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを更に含み、この可変ドメインが、図７若しくは図８のＭＦ３１７８のアミノ酸配列又はそれらの変異体を含む重鎖可変領域を含み、当該変異体が、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む。

一実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、図７若しくは図８のＭＦ４２８０のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第１の二重特異性抗体が、更に、図７若しくは図８のＭＦ１８４９のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第２の二重特異性抗体が、更に、図７若しくは図８のＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。

一実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、図７若しくは図８のＭＦ４２８０のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第１の二重特異性抗体が、更に、図７若しくは図８のＭＦ２０３２のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第２の二重特異性抗体が、更に、図７若しくは図８のＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。

一実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、図７若しくは図８のＭＦ４００３のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第１の二重特異性抗体が、更に、図７若しくは図８のＭＦ１８４９のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第２の二重特異性抗体が、更に、図７若しくは図８のＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。

一実施形態では、第１及び第２の当該二重特異性抗体は、図７若しくは図８のＭＦ４００３のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第１の二重特異性抗体が、更に、図７若しくは図８のＭＦ２０３２のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、当該第２の二重特異性抗体が、更に、図７若しくは図８のＭＦ３１７８のアミノ酸配列、又はそれらの変異体であって、好ましくは、ＣＤＲ中に存在しない、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含む変異体を含む重鎖可変領域を含むＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。

例示的なＥＧＦＲ重鎖可変領域は、国際公開第２０１５／１３０１７２号明細書及び国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１８／０５０５３７号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＨＥＲ２重鎖可変領域は、国際公開第２０１５／１３０１７３号明細書に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＨＥＲ３重鎖可変領域は、国際公開第２０１５／１３０１７２号明細書及び国際公開第２０１５／１３０１７３号明細書に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３の結合を保持する開示されたアミノ酸配列の更なる変異体は、例えば、再構成されたヒトＩＧＫＶｌ－３９／ＩＧＫＪｌ ＶＬ領域（ＤｅＫｒｕｉｆら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１０（１０６）７４１－５０）及び、前述のように本明細書に開示されるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３ ＶＨ領域のアミノ酸配列にアミノ酸の置換を組み込んだＶＨ領域の集合を含むファージディスプレイライブラリーから得ることができる。ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３に結合するＦａｂ領域をコードするファージを選択し、フローサイトメトリーによって分析し、配列決定することで、アミノ酸の置換、挿入、欠失又は付加を伴う抗原結合を保持する変異体を同定することができる。

本発明は更に、ＥＧＦＲの細胞外部分及びＨＥＲ２の細胞外部分に特異的に結合する結合部分を提供する。この結合部分は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメイン及びＨＥＲ２に結合する可変ドメインを含む。ＥＧＦＲに結合する可変ドメインは、好ましくは、本明細書に記載のＥＧＦＲ可変ドメインである。ＨＥＲ２に結合する可変ドメインは、好ましくは、本明細書に記載のＨＥＲ２可変ドメインである。好ましくは、ＥＧＦＲ可変ドメイン及びＨＥＲ２可変ドメインは、いずれも、本明細書に記載の可変ドメインである。

本発明は更に、ＥＧＦＲの細胞外部分及びＨＥＲ３の細胞外部分に特異的に結合する結合部分を提供する。この結合部分は、好ましくは、ＥＧＦＲに結合する可変ドメイン及びＨＥＲ３に結合する可変ドメインを含む。ＥＧＦＲに結合する可変ドメインは、好ましくは、本明細書に記載のＥＧＦＲ可変ドメインである。ＨＥＲ３に結合する可変ドメインは、好ましくは、本明細書に記載のＨＥＲ３可変ドメインである。好ましくは、ＥＧＦＲ可変ドメイン及びＨＥＲ３可変ドメインは、いずれも、本明細書に記載の可変ドメインである。

本発明は更に、ＥＧＦＲの細胞外部分及びＨＥＲ２の細胞外部分に特異的に結合する結合部分と、ＥＧＦＲの細胞外部分及びＨＥＲ３の細胞外部分に特異的に結合する結合部分とを含む組成物を提供する。

本明細書に記載の結合部分は、好ましくは、抗体であり、好ましくは、多重特異性抗体であり、好ましくは、二重特異性抗体である。

二重特異性抗体などの結合部分のＥＧＦＲ可変ドメイン、ＨＥＲ２可変ドメイン及びＨＥＲ３可変ドメインの軽鎖可変領域（ＶＬ）は、親ＥＧＦＲ単一特異性抗体のＶＬ領域、親ＨＥＲ２単一特異性抗体のＶＬ領域、及び／又は、親ＨＥＲ３単一特異性抗体の同じものと同じであり得る。可変ドメインがそれぞれＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３への結合を保持する限り、代替のＶＬ領域を、１つ以上のＶＨ／ＶＬ領域の組み合わせに使用することができる。

いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ可変ドメイン、ＨＥＲ２可変ドメイン及びＨＥＲ３可変ドメインのＶＬ領域は類似している。特定の実施形態では、結合部分の可変ドメインの全てのＶＬ領域が同一である。

特定の実施形態では、本発明の結合部分の１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインの軽鎖可変領域は、共通軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインの共通軽鎖可変領域は、生殖系列可変領域Ｖセグメントを含む。特定の実施形態では、１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインの軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖ＶセグメントＩｇＶκ１－３９^＊０１を含む。ＩｇＶκ１－３９は、免疫グロブリン可変カッパ１－３９遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１－３９、ＩＧＫＶ１３９；ＩＧＫＶ１－３９。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５７４０、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。Ｖ領域のアミノ酸配列を、図７の配列１０に示す。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。好ましいＪ領域はｊｋ１及びｊｋ５であり、接合された配列はＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１及びＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５として示される。代替名は、ＩｇＶκ１－３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１又はＩｇＶκ１－３９^＊０１／ＩＧＪκ５^＊０１である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。特定の実施形態では、ＶＨ／ＶＬ結合領域の一方又は両方の軽鎖可変領域が、カッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０１、又は、ＩｇＶκ１－３９^＊０１／ＩＧＪκ１^＊０５を含む（それぞれ、図７の配列１１又は配列１２）。

いくつかの実施形態では、本発明の結合部分の１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインの軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（図７の配列７）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳを含むＬＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰ（図７の配列９）を含むＬＣＤＲ３（すなわち、ＩＭＧＴによるＩＧＫＶ１－３９のＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の結合部分の１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインの軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＱＳＩＳＳＹ（図７の配列７）を含むＬＣＤＲ１、アミノ酸配列ＡＡＳＬＱＳを含むＬＣＤＲ２（図７の配列８）、及びアミノ酸配列ＱＱＳＹＳＴＰ（図７の配列９）を含むＬＣＤＲ３を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の結合部分の１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインは、図７の配列１１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明の結合部分の１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインは、図７の配列１１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

例えば、いくつかの実施形態では、本発明の結合部分の１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインの可変軽鎖は、図７の配列１１又は図７の配列１２に関して、０から１０個、好ましくは、０から５個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加又はそれらの組み合わせを有し得る。いくつかの実施形態では、本発明の結合部分の１つ、２つ、又は３つ以上の可変ドメインの軽鎖可変領域は、示されたアミノ酸配列に対して、０から９個、０から８個、０から７個、０から６個、０から５個、０から４個、好ましくは、０から３個、好ましくは、０から２個、好ましくは、０から１個、好ましくは、０個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、付加、又はそれらの組み合わせを含む。

他の実施形態では、本発明の結合部分の１つ、２つ、又は３以上の可変ドメインの軽鎖可変領域は、図７の配列１１又は図７の配列１２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の結合部分の全ての可変ドメインは、同一のＶＬ領域を含む。一実施形態では、本発明の結合部分の全ての可変ドメインのＶＬは、図７の配列１１に記載のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明の結合部分の全ての可変ドメインのＶＬは、図７の配列１２又は図７の配列１２に記載のアミノ酸配列を含む。

本明細書に開示される二重特異性抗体などの多重特異性抗体は、複数のフォーマットで提供することができる。多重特異性抗体の多くの異なるフォーマットが当技術分野で公知であり、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ、２０１５ Ｊｕｌ；２０（７）：８３８－４７；ＭＡｂ、；２０１２ Ｍａｒ－Ａｐｒ；４（２）：１８２～９７）及びＳｐｉｅｓｓら（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１５．０１．００３）によって概説されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。例えば、２つの可変ドメインを有する、標準的な抗体ではない二重特異性抗体フォーマットなどの多重特異性抗体フォーマットは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む少なくとも１つの可変ドメインを有する。この可変ドメインは、第２の結合活性を提供する、一本鎖Ｆｖフラグメント、モノボディ、ＶＨＨ及びＦａｂフラグメントに連結され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法において使用される多重特異性抗体は、一般に、ヒトＩｇＧサブクラス（例えば、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のものである。特定の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。半減期が有利で免疫原性が低いため、全長ＩｇＧ抗体が好ましい。かかる多重特異性抗体は、ヘテロ二量体化ドメインを含む２つの異なる重鎖を有し得る。したがって、特定の実施形態では、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二重特異性抗体及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二重特異性抗体は、全長ＩｇＧ分子である。一実施形態では、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二重特異性抗体及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二重特異性抗体は、全長ＩｇＧ１分子である。

したがって、特定の実施形態では、多重特異性ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体は、結晶化可能なフラグメント（Ｆｃ）を含む。多重特異性抗体のＦｃ領域は、好ましくは、ヒト定常領域からなる。多重特異性抗体の定常領域又はＦｃは、天然に存在するヒト抗体の定常領域との間に、１個以上、好ましくは、１０個以下、好ましくは、５個以下のアミノ酸の相違を含み得る。例えば、特定の実施形態において、二重特異性抗体の各Ｆａｂアームは、二重特異性抗体の形成を促進する修飾、Ｆｃ媒介エフェクター機能に影響を与える修飾、及び／又は本明細書に記載の他の特徴を含むＦｃ領域を更に含み得る。

好ましい実施形態では、多重特異性、好ましくは、二重特異性の全長ＩｇＧ抗体は、当該二重特異性ＩｇＧ抗体とＦｃガンマ（Ｆｃγ）受容体との相互作用が増強されるように、より低いヒンジ及び／又はＣＨ２ドメインを有する。抗体自体が低いＡＤＣＣ活性を有する場合には、多くの場合、抗体のＡＤＣＣ活性とも呼ばれる抗体依存性細胞傷害性が改善され得る。これは、例えば、抗体のグリコシル化部分からフコース残基を除去することによって達成される。脱フコシル化によってＡＤＣＣを増強するための一技術は、例えば、Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．，Ｋ．Ｐａｒｓｏｎｓら（２０１０）．「Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２－Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．」ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ７０（１１）：４４８１－４４８９）に記載されている。本明細書に記載の多重特異性抗体は、好ましくは、脱フコシル化されている。好ましくは、両方の多重特異性抗体が脱フコシル化される。例えば、糖鎖工学（協和発酵／Ｂｉｏｗａ、ＧｌｙｃＡｒｔ（Ｒｏｃｈｅ）及びＥｕｒｅｋａＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）及び突然変異誘発（Ｘｅｎｃｏｒ及びＭａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）を含む他の戦略がＡＤＣＣ増強を達成することが報告されており、これらは全て、低親和性活性化ＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃ結合を改善すること、及び／又は、低親和性阻害ＦｃγＲＩＩｂへの結合を減少させることを目指している。

二重特異性抗体は、典型的には、抗体をコードする核酸を発現する細胞によって産生される。したがって、いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合する多重特異性抗体と、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に結合する多重特異性抗体とを含む組成物を製造するための方法が提供され、当該方法は、
共通軽鎖と一緒になってＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、を有する細胞を提供することを含み、
ここで、２つ以上の当該核酸は、物理的に連結されていてもいなくてもよく、当該核酸の各々は、更に、当該細胞におけるコードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を含み、当該方法は、更に、当該重鎖及び軽鎖の発現を可能にするために当該細胞を培養すること、及び、任意選択で、当該２つ以上の抗体を収集することを含む。２つ以上の当該抗体は、細胞及び／又は上清から収集され得る。

それぞれの鎖が細胞内で産生されるレベルは、例えば、適切な発現制御配列を選択することによって、又は核酸の導入コピー数を選択することによって、又はその両方によって調整することができる。好ましい実施形態では、細胞の集団に当該核酸が提供され、それぞれの鎖の適切なレベルを発現するクローンが選択される。クローンは、典型的には、産生される抗体の量にも基づいて選択される。一実施形態では、当該方法は、当該核酸を含む細胞の集団を提供すること、及び、当該集団から、重鎖及び軽鎖のそれぞれの所望の発現比を有する細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態では、当該２つ以上の結合部分は、抗体であり、好ましくは、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、細胞は、好ましくは、本質的に等モル量の２つ以上の結合部分を産生する。他の実施形態では、細胞は、当該２つ以上の結合部分のうち、一つの結合部分を、もう一つの結合部分よりも多く産生する。

本発明は、また、
共通軽鎖と一緒になってＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、を有する細胞を提供することを含み、
ここで、２つ以上の当該核酸は、物理的に連結されていてもいなくてもよく、当該核酸の各々は、当該細胞におけるコードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含む。

本発明は、更に、
共通軽鎖と一緒になってＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
当該共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、を有する細胞を提供することを含み、
２つ以上の当該核酸は、物理的に連結されていてもいなくてもよく、当該核酸の各々が、更に、当該細胞におけるコードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を含む、容器を含む。

結合部分を産生する細胞は、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、霊長類細胞、最も好ましくは、ヒト細胞である。好適な細胞は、本明細書に記載の結合部分、好ましくは、多重特異性抗体、好ましくは、二重特異性抗体を含み、好ましくは、それを産生することができる任意の細胞である。

抗体産生に適した細胞は、当技術分野で公知であり、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３－Ｆ細胞又はＰＥＲ－Ｃ６細胞が挙げられる。様々な機関及び企業は、例えば、臨床使用のために、抗体の大規模生産のための細胞株を開発してきた。かかる細胞株の非限定的な例は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞である。特に好ましい実施形態では、当該細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、アデノウイルスＥ１領域又はその機能的等価物によって形質転換される細胞。特に好ましい実施形態では、当該細胞は、ＣＨＯ細胞又はそれらの変異体である。好ましくは、抗体の発現のためにグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）ベクター系を利用する変異体。好ましい一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞は、３つの異なる重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を発現する。１つの好ましい実施形態において、細胞は、異なる抗体種（異なる重鎖及び軽鎖の組み合わせ）の数を低減するために、本明細書に記載されるような「共通軽鎖」を発現する。例えば、それぞれのＶＨ領域は、二重特異性ＩｇＧ（国際公開第２０１３／１５７９５４号；参照により本明細書に組み込まれる）の産生のための当技術分野で知られている方法を使用して、再構成ヒトＩＧＫＶ１３９／ＩＧＫＪ１（ｈｕＶκ１３９）軽鎖と併せて、発現ベクターにクローン化される。ｈｕＶκ１ ３９は、２つ以上の重鎖と対合することができ、それによって多様な特異性を有する抗体を生じさせ、二重特異性分子の生成を促進することが以前に示された（国際公開第２００９／１５７７７１号明細書）。

共通軽鎖及び等量の２つの重鎖を発現する抗体産生細胞は、典型的には、５０％の二重特異性抗体と、各々２５％の単一特異性抗体を産生する（すなわち、同一の重軽鎖の組み合わせを有する）。それぞれの単一特異性抗体の産生よりも、二重特異性抗体の産生に有利であるいくつかの方法が公開されている。このようなものは、典型的には、重鎖の定常領域を、これらがホモ二量体化よりもヘテロ二量体化（すなわち、他の重鎖／軽鎖の組み合わせの重鎖と二量体化）に有利になるように修飾することによって達成される。好ましい実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。様々な適合性ヘテロ二量体化ドメインが、技術分野において記載されている。この適合性ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、適合性免疫グロブリン重鎖ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインである。技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。

本明細書に記載の多重特異性抗体を産生するための好ましい方法の一例は、米国特許第９，２４８，１８１号明細書及び米国特許第９，３５８，２８６号明細書に開示されている。具体的には、本質的に二重特異性全長ＩｇＧ分子のみを産生するための好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付け）（「ＫＫ－変異体」重鎖）、及び第２のドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ－変異体」重鎖）、又はその逆である。前述のように、ＤＥ－変異体及びＫＫ－変異体は、優先的に対合して、ヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）を形成する。ＤＥ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥＤＥホモ二量体）又はＫＫ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＫＫＫＫホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３－ＣＨ３界面における荷電残基間の強い反発力のために、ほとんど発生しない。ＤＥ－変異体重鎖又はＫＫ－変異体重鎖のいずれかを有する更なる重鎖を導入することにより、更なるＤＥＫＫ二重特異性分子の産生が可能になる。新たに導入されたＤＥ－重鎖（ＤＥ^２）は、既存のＫＫ重鎖と会合することができる。したがって、細胞は、２つの二重特異性抗体、ＤＥ^１ＫＫ二重特異性抗体及びＤＥ^２ＫＫ二重特異性抗体を産生する。新しいＤＥ重鎖の代わりに新しいＫＫ重鎖（ＫＫ^２）を導入した場合、ＤＥＫＫ^１及びＤＥＫＫ^２の組み合わせを有する二重特異性抗体が産生される。異なる抗体が細胞によって産生され得るレベルは、ＨＥＲ２鎖及びＨＥＲ３鎖の互いに対する相対的発現を調節することによって調節され得る。軽鎖は、典型的には、単一の重鎖のレベルを低下させるのに十分に産生され、ＥＧＦＲ鎖が産生されるレベルは、典型的には、ＨＥＲ２鎖やＨＥＲ３鎖との効率的な対合を可能にするのに十分である。

したがって、一実施形態では、ＥＧＦＲに結合する可変ドメインを含む重鎖／軽鎖の組み合わせは、重鎖のＤＥ変異体を含む。この実施形態では、ＨＥＲ２に結合する可変ドメインを含む重鎖／軽鎖の組み合わせ及びＨＥＲ３に結合する可変ドメインを含む重鎖／軽鎖の組み合わせは、重鎖のＫＫ変異体を含む。

任意の適切なアッセイを使用して、候補のＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ ＩｇＧ二重特異性抗体又はＥＧＦＲ／ＨＥＲ３ ＩｇＧ二重特異性抗体の結合について試験することができる。例えば、膜発現ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３への結合について試験することができる。これは、典型的には、通常、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３を発現せず、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３のうちの１つを発現するように形質転換された細胞で行われる。非形質転換細胞ではなく形質転換細胞への抗体の結合は、抗体の特異的結合を示唆する。結合は、例えば、フローサイトメトリー（国際公開第２０１５／１３０１７２号明細書、ＰＣＴ／ＮＬ２０１８／０５０５３７号明細書及び国際公開第２０１５／１３０１７３号明細書に以前に記載されたＦＡＣＳ手順に従う）によって評価し得る。それぞれの単一特異性抗体は、コントロール及び無関係なＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂとして使用することができる。

抗体などの結合部分は、細胞及び／又は細胞培養物の上清から収集することができる。典型的には、それらは産生細胞の上清から収集される。抗体などの結合部分は、上清から精製することができる。当技術分野では、多くの精製方法が公知である。いくつかのより一般的な方法は、親和性精製を使用する。

細胞によって産生された抗体は、親和性精製によって精製することができる。これは、プロテインＡ抽出によって有利に行われる。溶出した抗体の特異的結合特性（すなわち、ＥＧＦＲとの結合、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３との結合）の存在について、ＥＬＩＳＡによって試験することができる。抗体調製物は、イオン交換カラムクロマトグラフィーによって更に分析することができる。個々の二重特異性抗体は、日常的な技術により、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、互いから精製することができる。それぞれの二重特異性抗体の存在をＥＬＩＳＡによって分析することもできる。調製物をＨＥＲ２へ結合させて洗浄すると、全てのＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体が除去される。標識された可溶性ＨＥＲ３による染色はシグナルを与えないが、標識された可溶性ＥＧＦＲによる染色はシグナルを与える。調製物をＨＥＲ３へ結合させて洗浄すると、全てのＥＧＦＲ／ＨＥＲ２抗体が除去される。標識された可溶性ＨＥＲ２による染色はシグナルを与えないが、標識された可溶性ＥＧＦＲによる染色はシグナルを与える。調製物をＥＧＦＲへ結合させて洗浄すると、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体は除去されない。標識された可溶性ＨＥＲ２による染色並びに標識された可溶性ＨＥＲ３による染色は、シグナルを与える。調製物中のそれぞれの抗体のレベルは、単一の二重特異性抗体の既知レベルを有する適切なコントロールを用いる、そのようなＥＬＩＳＡを使用して推定することもできる。

２つ以上の二重特異性抗体を含む組成物を製造するための方法は、
二重特異性抗体をコードする核酸を細胞に提供すること、
当該細胞を培養すること、
回収物の清澄化、
培養物から二重特異性抗体を収集すること、及び
産生された二重特異性抗体を半抗体からイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）によって分離すること、を含み、
方法は、上記二重特異性抗体が、同様のＩＥＸ保持時間、好ましくは、使用されるＩＥＸ条件下での個々の抗体の保持時間の平均から１０％以下だけ逸脱するＩＥＸ保持時間を示すことを特徴とする。一実施形態では、抗体は、使用されるＩＥＸ条件下での個々の抗体の保持時間の平均から１０％以下だけ逸脱するＩＥＸ保持時間を有するように選択される。抗体は、最初に培養物中の他のタンパク質から精製され得る。これは、典型的には、親和性精製によって、好ましくは、プロテインＡ抽出によって行われる。二重特異性抗体は、好ましくは、抗体の保持時間が及ぶ範囲外の保持時間を有する半抗体を有するように選択される。二重特異性抗体の組み合わせが産生され、単一特異性抗体が望ましくない場合、二重特異性抗体は、好ましくは、単一特異性抗体の保持時間とは異なる保持時間を有するように選択される。この実施形態における単一特異性抗体の保持時間は、好ましくは、それぞれの二重特異性抗体の保持時間が及ぶ範囲外である。培養物中の細胞は、好ましくは、３つの重鎖を同時に発現し、これらの重鎖は、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ３重鎖ヘテロ二量体化の形成を促進するＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインを含む。細胞は、好ましくは、図７の共通軽鎖を発現する。一実施形態における二重特異性抗体は、当該少なくとも２つの二重特異性抗体の平均ＰＩと類似しており、好ましくは、０、５単位を超えて異ならない等電点（ＰＩ）を有する。

標的に対する候補ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２又はＥＧＦＲ／ＨＥＲ二重特異性抗体のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３ ＦＡＢの親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定することができる。抗ヒトＩｇＧマウスモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ｃａｔ．Ｎｒ．５５５７８４）は、遊離アミン化学（ＮＨＳ／ＥＤＣ）を使用して、ＣＭ５センサーチップの表面に結合される。次に、ｂｓＡｂがセンサー表面に捕捉される。続いて、組換え精製抗原であるヒトＥＧＦＲ－Ｆｃ、ＨＥＲ２－Ｆｃ及びＨＥＲ３－Ｆｃタンパク質をセンサー表面上に濃度範囲で流して、オンレート及びオフレートを測定する。各サイクルの後、センサー表面をＨＣｌのパルスによって再生し、ｂｓＡｂを再び捕捉する。得られたセンサーグラムから、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、ヒトＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３に結合するためのオンレート及びオフレート並びに親和性値を決定する。

本発明はまた、がんの治療に使用するための本明細書に記載の組成物を提供する。複数の実施形態では、がんは、固形上皮がんである。好ましくは、本組成物は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３を発現するがんに使用される。本組成物は、好ましくは、膵臓がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、上皮性卵巣がん、上皮性卵管がん、上皮性腹膜がん、膀胱がん、又は前立腺がんに用いられる。いくつかの実施形態では、本組成物の使用によって治療されるがんは進行がんである。本組成物は、好ましくは、転移性がんに使用される。本組成物は、好ましくは、転移性膵臓がん、転移性結腸直腸がん、転移性頭頸部がん、転移性上皮卵巣がん、転移性上皮卵管がん、転移性上皮腹膜がん、転移性膀胱がん又は転移性前立腺がんに用いられる。いくつかの実施形態では、本組成物は、好ましくは、胃がん、肺がん、乳がん又は食道がんのために使用される。好ましくは、本組成物は、転移性胃がん、転移性肺がん、転移性乳がん又は転移性食道がんに使用される。

本発明は更に、それぞれがＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む２つ以上の結合部分を提供し、第１の当該結合部分は、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の当該結合部分は、がんの治療に使用するためのＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。それぞれがＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む２つ以上の結合部分を含む産物も提供され、第１の当該結合部分は、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の当該結合部分は、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを、がんの処置における同時使用、個別的使用又は逐次使用のための組み合わせ調製物として含む。

本発明の実施形態によって治療されるがんは、好ましくは、本明細書の他の箇所に示されるがんである。がんは、好ましくは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）による治療に対して細胞を耐性にするＥＧＦＲ変異を有する細胞を含む。いくつかの実施形態では、がんは、ＥＧＦＲ Ｒ５２１Ｋ多型を有する細胞を含む。本明細書に記載される本発明の治療されるがん及び治療方法は、好ましくは、胃がん、肺がん又は食道がんである。更なる実施形態では、本発明は、がんを有するか、又はがんの再発、再燃のリスクがある対象を治療する方法を提供し、当該方法は、それぞれがＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む２つ以上の結合部分を、それを必要とする対象に投与することを含み、第１の当該結合部分が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の当該結合部分が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む、組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は互換的に使用され、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物（例えば、がんを有するヒト患者などの患者）を指す。

本明細書で使用するとき、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患に関連する症状、合併症、条件又は生化学的兆候の進行、発達、重症度又は再発を、逆転、緩和、回復、阻害、又は減速若しくは予防することを目的とする、実施される任意の種類の介入若しくは処理、又は活性剤若しくは活性剤の組み合わせを対象に投与することを指す。

本明細書で使用される場合、「有効治療」又は「陽性治療反応」は、有益な効果、例えば、がんなどの疾患又は障害の少なくとも１つの症状の回復をもたらす治療を指す。有益な効果により、本方法による療法の開始前に行われた測定又は観察を超える改善などの、ベースラインを超える改善された状態を得ることができる。例えば、疾患の臨床的若しくは診断的症状の減少若しくは排除、又はがんのマーカーの減少若しくは排除によって証明されるように、有益な効果により、任意の臨床段階での対象におけるがんの進行を減速、安定化、停止、又は逆転させる状態を得ることができる。有効治療により、例えば、腫瘍サイズを減少、循環腫瘍細胞の存在を減少、腫瘍の転移を低減若しくは防止、腫瘍成長を減速若しくは阻止、及び／又は腫瘍の再発若しくは再燃を防止若しくは遅延させることができる。

用語「有効量」又は「治療有効量」は、所望の生物学的、治療的、及び／又は予防的結果を提供する薬剤又は薬剤の組み合わせの量を指す。その結果は、疾患の１つ以上の徴候、症状、又は原因の低減、回復、緩解、減少、遅延、及び／又は緩和、あるいは生態系における他の所望の変化であり得る。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の発生を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍再発を予防又は遅らせるのに十分な量である。有効量を１回以上の投与で投与することができる。本薬物又は本組成物の有効量は、（ｉ）がん細胞の数を低減する；（ｉｉ）腫瘍のサイズを低減する；（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞浸潤を、ある程度阻害、阻止、減速し、停止させ得る；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する；（ｖ）腫瘍成長を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生及び／又は再発を防止又は遅延させる；及び／又は（ｖｉｉ）がんに関連する１つ以上の症状をある程度和らげることができる。一例では、「有効量」は、がんの減少（例えば、がん細胞の数の減少）又はがんの進行の遅延をもたらすための本発明の組成物の量である。有効量の併用療法は、本明細書に記載の方法に従って、本明細書に示される結合部分の組み合わせを指す「有効レジメン」で投与され、投与の順序及び投与頻度は治療を行うのに十分である。

本明細書で使用される場合、「シナジー」、「治療的相乗効果」、及び「相乗効果」という用語は、本明細書に示される結合部分の組み合わせ（例えば、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に結合する結合部分と、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に結合する結合部分とを含む組成物）を用いた患者の治療が、組み合わせの個々の構成要素がそれぞれ単独で使用された場合に達成される結果よりも治療上優れた結果を呈する現象を指す（例えば、Ｔ．Ｈ．Ｃｏｒｂｅｔｔら、１９８２、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｐｏｒｔｓ、６６、１１８７を参照されたい）。これに関連して、治療的に優れた結果には、以下のうちの１つ以上が含まれる。（ａ）本組み合わせと同じ用量での、それぞれの結合部分単独の個別の効果の合計よりも治療応答が増大すること；（ｂ）治療有効性の減少を伴わないで、本組み合わせにおける１つ以上の薬剤の用量が低減されること；（ｃ）本組み合わせと同じ用量での、各薬剤の単剤療法以上の治療効果を得つつ、有害事象の発生率が低下すること；（ｄ）各薬剤の単剤療法よりも大きな治療効果を得つつ、用量制限毒性が低減されること；（ｅ）薬物耐性の誘導が遅延又は最小化されること。

異種移植モデルでは、その各構成要素が一般にその個々の最大耐量を超えない用量で存在する最大耐量で使用される組み合わせは、その組み合わせの投与によって達成される腫瘍成長の減少が、最良の構成要素が単独で投与された場合のその構成要素の腫瘍成長の減少の値よりも大きい場合に、治療的相乗効果が証明される。薬物の組み合わせの相乗作用は、例えば、Ｃｈｏｕ－Ｔａｌａｌａｙの組み合わせ指数（ＣＩ）定理に従って決定することができる（Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．１９８４；２２：２７－５５；Ｃｈｏｕ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０；７０（２）：４４０－４４６）。

本発明は更に、がんの治療に使用するための本発明の組成物を提供する。使用される実施形態は、好ましくは、胃がん、大腸がん、結腸がん、胃食道がん、食道がん、子宮内膜がん、卵巣がん、肝臓がん、非小細胞肺がんを含む肺がん、明細胞肉腫、唾液腺がん、頭頸部がん、脳がん、膀胱がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、皮膚がん、黒色腫等を治療する。一実施形態では、実施形態は、胃がん、肺がん又は食道がんを治療する。その使用は、好ましくは、胃がんを治療する。

本明細書に記載の発明は、好ましくは、細胞膜上のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３の存在について試験されるがんの治療に適用される。これは日常的な方法によって行うことができ、典型的には、免疫組織化学によって分析される。

がんは、好ましくは、ＨＥＲ２を発現する。がんは、好ましくは、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３も発現する。がんは、好ましくは、ＥＧＦＲを発現する。がんは、好ましくは、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３も発現する。がんは、好ましくは、ＨＥＲ３を発現する。がんは、好ましくは、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２も発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される本発明によって治療されるがんの細胞及び／又は間質細胞は、ＥＧＦＲリガンド、若しくはＨＥＲ３リガンド、又はその両方を発現する。したがって、リガンド及び受容体の発現は、がんの細胞に増殖刺激を提供し得る。本発明の組み合わせは、そのような細胞を含むがんを治療するのに特に適している。

本発明の治療におけるＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３のうちの１つの発現は、少なくとも一部の腫瘍が逃れることを遅らせることができる。単一特異的療法で標的化される腫瘍は、別のＥＧＦＲ、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３の発現を開始することによって、又は受容体に対するリガンドを発現することによって、治療から逃れることができる。

そのような細胞は、それが発生する場合に、本発明の結合部分によっても攻撃されるので、それらが成長して多様化する前に除去することができる。一実施形態では、変異ＥＧＦＲの存在についてがんを試験する。多くのＥＧＦＲ陽性腫瘍は、細胞をチロシンキナーゼ阻害剤による治療に耐性にする遺伝子において変異を有する。

本発明の組成物は、がん細胞をチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）による治療に対して耐性にするＥＧＦＲ変異を用いてがんを治療するのに適している。一実施形態では、がんは、ＥＧＦＲ Ｒ５２１Ｋ多型を有する細胞を含む。いくつかの実施形態では、がんは、ゲフィチニブ及びエルロチニブなどの第１世代ＴＫＩ阻害剤に耐性であることが知られている。

本明細書に示されるがんの治療は、がんの更なる治療と組み合わせることができる。そのような治療は、抗体及び／又は細胞増殖抑制薬、又はプロテインキナーゼ阻害剤などの更なる結合部分を含み得る。プロテインキナーゼ阻害剤は、好ましくは、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３チロシンキナーゼ阻害剤以外の阻害剤である。更なる治療の非限定的な例には、放射線療法、化学療法、手術、血管成長阻害療法、及び温熱療法が含まれる。

本発明の組成物は、ＥＧＦＲ阻害に耐性があるがん（ＥＧＦＲ耐性は、ＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３の過剰発現の結果である）の治療における使用に適し得る。

本発明の組成物は、ＨＥＲ２阻害に耐性があるがん（ＨＥＲ２耐性は、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ３の過剰発現の結果である）の治療における使用に適し得る。

本発明の組成物は、ＨＥＲ３阻害に耐性があるがん（ＨＥＲ３耐性は、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２の過剰発現の結果である）の治療における使用に適し得る。

本明細書に記載の抗体、結合部分、組成物又は製品の文脈における「Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）」という用語は、１つの調製物に、複数の、典型的には１０以下の異なる抗体又は結合部分が存在していること（二重特異性の存在を含む）を指す。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）の例には、２つの二重特異性抗体の組み合わせが含まれる。

本発明は更に、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメイン及びＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む結合部分又は二重特異性抗体を提供し、ここで、上記ＥＦＧＲ可変ドメインは、図８の重鎖可変領域ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０、ＭＦ４００３、若しくはＭＦ４０１６のＣＤＲを含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含み、上記ＨＥＲ２可変ドメインは、重鎖可変領域ＭＦ２０３２若しくはＭＦ１８４９のＣＤＲを含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメイン及びＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む結合部分又は二重特異性抗体も提供され、ここで、上記ＥＦＧＲ可変ドメインは、図８の重鎖可変領域ＭＦ３７５５のＣＤＲを含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含み、上記ＨＥＲ２可変ドメインは、重鎖可変領域ＭＦ２０３２のＣＤＲを含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

本発明は更に、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメイン及びＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む結合部分又は二重特異性抗体を提供し、ここで、上記ＥＦＧＲ可変ドメインは、図８の重鎖可変領域ＭＦ３７５５、ＭＦ４２８０、ＭＦ４００３、又はＭＦ４０１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含み、上記ＨＥＲ２可変ドメインは、重鎖可変領域ＭＦ２０３２、又はＭＦ１８４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

本発明は更に、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメイン及びＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む結合部分又は二重特異性抗体を提供し、ここで、上記ＥＦＧＲ可変ドメインは、図８の重鎖可変領域ＭＦ３７５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含み、上記ＨＥＲ２可変ドメインは、重鎖可変領域ＭＦ２０３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメイン及びＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む結合部分又は二重特異性抗体も提供され、ここで、上記ＥＦＧＲ可変ドメインは、図８の重鎖可変領域ＭＦ３７５５のＣＤＲを含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含み、上記ＨＥＲ２可変ドメインは、重鎖可変領域ＭＦ１８４９のＣＤＲを含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

本発明は更に、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメイン及びＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む結合部分又は二重特異性抗体を提供し、ここで、上記ＥＦＧＲ可変ドメインは、図８の重鎖可変領域ＭＦ３７５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含み、上記ＨＥＲ２可変ドメインは、重鎖可変領域ＭＦ１８４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は、そのＣＤＲ中に、１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む。

明確さ及び簡潔な説明のために、特徴は本明細書では同じ又は別個の実施形態の一部として記載されているが、本発明の範囲は、記載される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含んでもよいことが理解されよう。

組成物が共通のアームを共有する２つの二重特異性抗体を含む実施形態の概略図。この図は、重鎖（１）及び軽鎖（４）を有する抗体を示す。４つの重鎖は、３つの異なる可変領域（５，６，７）を有する。共有可変領域（５）を有する重鎖は、ヘテロ二量体化ドメインの一部分（３）を有する。可変領域（６）及び（７）を有する重鎖は、ヘテロ二量体化ドメイン（２）の適合部分を有する。ヘテロ二量体化領域（２）及び（３）の好ましい対合によって、二重特異性抗体の形成を誘導することができる。 増殖因子依存性細胞株ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １２５０５８）及びＮ８７細胞（ＮＣＩ－８７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５８２２（商標）））の増殖に対する２つのＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）の阻害効果。 ２つのＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）を、ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２（左側パネル）及びＮ８７（右側パネル）の細胞増殖に対する効果について試験した。パネルスクリーニングの結果を、２つの単一特異性抗体の組み合わせ（ＥＧＦＲ結合抗体セツキシマブ及びＨＥＲ３単一特異性抗体ＰＧ３１７８）又はＥＧＦＲｘＨＥＲ３結合二重特異性抗体ＰＢ４５２２と比較した。細胞を、飽和量のＨＲＧ及びＥＧＦの存在下で増殖させた。ＨＲＧ及びＥＧＦを含む場合と抗体を含まない場合（基底ｗ／リガンド）のそれぞれの細胞の細胞増殖のレベル、並びに、ＨＲＧ及びＥＧＦを含まない場合と抗体を含まない場合（ｗ／ｏリガンド）の基底レベルが示される。 単一特異性抗体ＰＧ３１７８は、図７又は図８のＭＦ３１７８の重鎖可変領域及び図７の配列１１の共通軽鎖可変領域を有するＩｇＧ１定常領域及び２つの可変ドメインを有する。 二重特異性抗体ＰＢ４５２２は、ＩｇＧ１定常領域及び２つの可変ドメインを有する。ＨＥＲ３可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ３１７８の重鎖可変領域を有する。ＥＧＦＲ可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ４２８０の重鎖可変領域を有する。両方の抗体の軽鎖可変領域は同じであり、図７の配列１１の共通軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する）。 Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のパネルのＡＤＣＣ活性。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のパネルのＡＤＣＣ活性を、Ｎ８７及びＣＤ１６／ＮＦＡＴレポーターアッセイを用いて試験した。二重特異性抗体は、ＩｇＧ１定常領域及び２つの可変ドメインを有する。可変ドメインの重鎖可変領域のアミノ酸配列を図７又は図８に示す。抗体中の軽鎖可変領域は同じであり、図７の配列１１の共通軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する。 様々なＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のナンバリング及び特異性、並びに、そのＡＤＣＣ活性。「－」は、活性が観察されなかったことを示す。 各行は、２つの二重特異性抗体を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）を表す。二重特異性抗体の内部コードを二重特異性１及び２の列に示す。ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ結合ドメインの重鎖可変領域を、ＭＦＡ、ＭＦＢ及びＭＦＣと記された列に示す。ＭＦ番号３１７８及び２７０３は、共通軽鎖と組み合わせて、ＨＥＲ３結合可変ドメインを形成する。ＭＦ番号４２８０、３７５５、４００３、４０１６は、共通軽鎖と組み合わせて、ＥＧＦＲ結合可変ドメインを形成し、ＭＦ番号１８７１、１８４７、１８４９及び２０３２は、共通軽鎖と組み合わせて、ＨＥＲ２結合可変ドメインを形成する。二重特異性抗体は、ＩｇＧ１定常領域及び２つの可変ドメインを有する。可変ドメインの重鎖可変領域のアミノ酸配列を図７又は図８に示す。抗体中の軽鎖可変領域は同じであり、図７の配列１１の共通軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する。 Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。０日目に、ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２細胞、又はＮ８７細胞を異種移植モデルに注入した。二重特異性抗体ＰＢ４５１６×ＰＢ６８９２（図４参照）を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）、又はコントロールを、１、７、１４、２１及び２８日目に注入した。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）（ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２）の結果を示す。ビヒクル及びセツキシマブをコントロールとして用いた。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 様々なＰＤＸモデルにおける二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のインビボ試験。 ＰＤＸモデルに０日目に注入し、抗体又はコントロールによる処置を１、７、１４、２１及び２８日目に行った。抗体を２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注入した。 ＭＦ番号によって示される様々な可変ドメインの重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１～６を参照のこと）、並びにＣＤＲ及び軽鎖可変領域（配列番号７～１２を参照のこと）。 本明細書で言及される様々なＭＦのアミノ酸配列。ＦＲ１－４は、フレームワーク領域１～４を指す。ＣＤＲ１－３は、相補性決定領域１～３を指す。ＴＴは、破傷風トキソイドである。 灰色の球における残基Ａｒｇ４２６、及び黒い球におけるＡｒｇ４２６から半径１１．２Å以内の残基を示すＨＥＲ３結晶構造（ＰＤＢ番号４Ｐ５９）。図及び分析は、Ｙａｓａｒａ（ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ）を用いて行った。 残基Ａｒｇ４２６、及び黒色で示されるＡｒｇ４２６から１１．２Å半径内に灰色で示される離れた残基。図及び分析は、Ｙａｓａｒａ（ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ）を用いて行った。 領域Ａｒｇ４２６中の明るい灰色の残基、及び、周囲の暗い灰色の残基（全て標識されている）。図及び分析は、Ｙａｓａｒａ（ｗｗｗ．ｙａｓａｒａ．ｏｒｇ）を用いて行った。

実施例
細胞株
Ｈｅｋ２９３細胞、ＮＣＩ－８７細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－５８２２（商標）、ＢｘＰＣ－３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６８７）、ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２及びＣＨＯ－Ｋ１を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した増殖培地において維持した。

二重特異性抗体の作製
効率的なヘテロ二量体化及び二重特異性抗体の形成のために上記のＤＥＫＫ ＣＨ３技術を使用して二重特異性抗体を作製した。ＣＨ３技術は、以前に記載されたように（国際公開第２０１３／１５７９５４号明細書）、２つの異なる重鎖分子の効率的な対合を可能にするためにＣＨ３領域における電荷に基づく点突然変異を使用する。

ＶＨ遺伝子を２つの異なる主鎖ＩｇＧ１ベクターのうちの１つにクローニングした。結合パートナーに応じて、ＶＨを、ヘテロ二量体化変異体「ＤＥ」を有するＣＨ３変異体を含むＩｇＧ１骨格、又は、相補的ＣＨ３ヘテロ二量体化変異体「ＫＫ」を含むＩｇＧ１骨格にクローニングした。２つ以上の抗体が重鎖を共有する二重特異性抗体又は多重特異性抗体の場合。その共有される鎖は、好ましくは、ＣＨ３ヘテロ二量体化変異体「ＤＥ」（ＤＥ重鎖とも呼ばれる）を有し、２つ以上の固有の重鎖はＣＨ３ヘテロ二量体化変異体「ＫＫ」（ＫＫ重鎖とも呼ばれる）を有する。

接着性Ｈｅｋ２９３細胞を６ウェルプレートで８０％の培養密度になるまで培養した。細胞をＤＮＡ－ＦＵＧＥＮＥ混合物で一過性トランスフェクションを行い、更に培養した。トランスフェクションの７日後、上清を回収し、培地をリフレッシュした。トランスフェクションの１４日後、上清を合わせ、０．２２μＭで濾過した。滅菌上清を４℃で保存した。懸濁液に適合させたＨｅｋ２９３細胞を、３．０×１０ｅ６細胞／ｍｌの密度になるまでＴ１２５フラスコ中でシェーカープラトーで培養した。細胞を、０．３～０．５×１０ｅ６生存細胞／ｍｌの密度で２４ディープウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を個々の滅菌ＤＮＡ：ＰＥｌ－ＭＩＸで一過性トランスフェクションを行い、更に培養した。トランスフェクションの７日後、上清を回収し、０．２２μＭで濾過した。滅菌上清を４℃で保存した。

２つの二重特異性抗体を共発現する安定な細胞株プールの作製
ＣＨＯ細胞に、３つの重鎖構築物と１つの共通軽鎖構築物を、共通軽鎖構築物（ｃＬＣ）：ＥＧＦＲ重鎖：ＨＥＲ２重鎖：ＨＥＲ３重鎖＝２．５：２：１：１のモル比でトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞の１０個のプールを得た（Ａ～Ｊ）。抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体のＥＬＩＳＡ分析を、１０個のプールの３日目及び６日目の上清について行った。全てのプールで、３つ全ての特異性を検出することができた。

上記プールを半固体培地にプレーティングすることによって、２つの二重特異性抗体を共発現する安定な細胞株クローンを作製した。プレーティングした細胞を７～１０日間増殖させた。２回の単一細胞クローニングを、単一コロニーの播種及び選別によって行った。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓは、フェッドバッチ発酵によって単一細胞から産生された。

抗体価の測定
細胞上清を、総ＩｇＧ濃度に基づいてＰＢＳ中で１：４及び１：５０に希釈した。３種全ての抗体の存在を検出するために、単一抗原ＥＬＩＳＡを最初に行った。以下の抗原を、２．５μｇ／ｍｌ希釈で使用して、ＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングした：組換えヒトＥＧＦＲ－ＥＣＤＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３４４－ＥＲ）、組換えヒトＥｒｂＢ２－ＥＣＤＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１２９－ＥＲ）、及び組換えヒトＥｒｂＢ３－ＥＣＤＦｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３４８－ＥＲ）。

次いで、２つのサンドイッチＥＬＩＳＡを行って、２つの二重特異性分子を検出及び定量し、２つの二重特異性間の比の推定を可能にした。ＥＧＦＲｘＨＥＲ２二重特異性の検出のために、ＥＧＦＲ－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３４４－ＥＲ）抗原をウェル上にコーティングし、ＥｒｂＢ２－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１２９－ＥＲ）で検出した。ＥＧＦＲｘＨＥＲ３二重特異性の検出のために、ＥＧＦＲ－Ｆｃ抗原をウェル上にコーティングし、ＥｒｂＢ３－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，３４８－ＲＢ）で検出した。

ＩｇＧ精製
ＩｇＧの精製は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて行った。精製は、真空濾過を用いて滅菌条件下で行った。最初に培地のｐＨをｐＨ８．０に調整し、続いて、産生物をプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂビーズ（５０％ｖ／ｖ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に２５℃、６００ｒｐｍの振盪プラットフォームで２時間インキュベートした。次に、ビーズを真空濾過によって回収した。ビーズをＰＢＳ ｐＨ７．４で２回洗浄した。ＩｇＧを０．１Ｍクエン酸緩衝液を用いてｐＨ３．０で溶出し、ＩｇＧ画分をトリスｐＨ８．０によって直ちに中和した。Ｕｌｔｒａｃｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた遠心分離により緩衝液交換を行った。試料は最終的にｐＨ７．４の最終緩衝液（ＰＢＳ）になった。

カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＩＥＸ）
ＣＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーは、イオン交換カラムのＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ（粒径７μｍ、内径４．６ｍｍ×長さ１０ｃｍ、東ソー２１９６４）シリーズを使用して行った。カラムには、生体分子の高速かつ高分解能の分析及び単離のために非多孔質樹脂粒子を充填する。ＴＳＫｇｅｌ ＳＴＡＴカラム内の粒子は、ローディング容量のために多層イオン交換基のオープンアクセスネットワークを含むが、粒径が比較的大きいために、これらのカラムはＨＰＬＣ及びＦＰＬＣシステムに適している。

ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ（粒径７μｍ、内径４．６ｍｍ×長さ１０ｃｍ、東ソー２１９６４）を緩衝液Ａ（リン酸ナトリウム緩衝液、２５ｍＭ、ｐＨ６．０）を用いて平衡化し、その後、塩濃度を増加させ、緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の勾配を実行することによって抗体をカラムから移動させる。流速は０．５ｍＬ／分に設定した。全ての試験試料及びコントロール（ＰＢＳ中）の注入試料質量は１０μｇであり、注入体積は１０～１００μｌであった。クロマトグラムを、２２０ｎｍの結果に基づき、観察された主要なピークのピークパターン、保持時間、及びピーク面積について分析する。

ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２及びＮ８７増殖阻害アッセイ
抗体組成物を全抗体の濃度範囲で試験した。抗体を、重量あたりの等量の重量に基づいて２つずつプールした。ＨＲＧ及びＥＧＦを培養物に添加し、ＢｘＰＣ３－ｌｕｃ２細胞については、０．１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧを添加し、あるいは、Ｎ８７細胞については、０．１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ及び１ｎｇ／ｍｌのＨＲＧを添加した。基底ｗ／リガンドは、抗体を含まないが、それぞれの成長因子を含むコントロールであった。基底ｗ／ｏリガンドは、示された増殖因子を含まず、かつ、抗体を含まないコントロールであった。

抗体を合成飢餓培地（ＣＤＳ：８０Ｕペニシリン及び８０μｇストレプトマイシン／ｍｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１０μｇ／ｍｌホロトランスフェリンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地）で希釈し、５０μｌの希釈抗体を９６ウェル黒色ウェル透明底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに添加した。リガンドを添加した（ＣＤＳで希釈した、４０ｎｇ／ｍｌ又は４ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ、及び４００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、すなわち、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ．ｎｒ．３９６－ＨＢ及び２３６－ＥＧ、を含有するストック溶液５０μｌ／ウェル）。プレートを室温で１時間放置した後、３７℃細胞培養インキュベーター内の容器に３日間（Ｎ８７細胞）又は４日間（ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２細胞）入れた。４日目に、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号ＤＡＬ１１００）を加え（２０μｌ／ウェル）、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅと（３７℃で）６時間（Ｎ８７細胞）又は４時間（ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２細胞）インキュベートした後に、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２マルチモードマイクロプレートリーダーで５６０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ読み出しを用いて蛍光を測定した。蛍光値を非阻害増殖（抗体なし、ただし、両方のリガンドが添加された）に対して正規化した。

様々なＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）のＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。２つの異なる細胞株、ＥＧＦＲ発現膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３及び胃がんＮ８７細胞株を試験した。

バイオアッセイは、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体Ｖ１５８（高親和性）変異体、及び、ＦｃγＲ活性化の尺度であるホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントのいずれかを安定的に発現する、操作されたＪｕｒｋａｔ細胞を使用する。アッセイは、このＡＤＣＣレポーターバイオアッセイで得られたデータを標準的な５１Ｃｒ放出アッセイと比較することによって検証され、両方のアッセイは同様の結果をもたらす。ＡＤＣＣアッセイは、３８４白色ウェルプレートを用いるＰｒｏｍｅｇａ ＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙキットを使用して実施した。この実験の設定では、バイオアッセイの２０～２４時間前に、ＢｘＰＣ３細胞及びＮ８７細胞を１０００細胞／ウェルの密度で３０μｌのアッセイ培地（４％低ＩｇＧ血清を含むＲＰＭＩ）にプレーティングした。翌日に、培地を除去した。次に、Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）の段階希釈液と比較抗体セツキシマブを２連で調製した。１０μｌのこれらの抗体希釈液をウェルに添加した。抗体を含まないコントロールウェルも含めた（基底）。抗体の出発濃度から５倍の段階希釈を行って、用量応答曲線を得た。最後に、５μＬのＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ（１５０００細胞／ウェル、Ｖ１５８）を加えた。細胞を３７℃で６時間インキュベートした。次に、１５μｌのＢＩＯ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を加え、５分後にプレートリーダーで発光を検出した。得られたデータを図３に示す。セツキシマブは、ＢｘＰＣ３細胞及びＮ８７細胞に対してＡＤＣＣ活性を示した。様々なオリゴクロニック抗体もまた、ＢｘＰＣ３細胞及び／又はＮ８７細胞に対してＡＤＣＣ活性を示した。

ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２腫瘍（同所移植）及びＮ８７腫瘍（側腹部に移植された胃細胞）の増殖に対する、二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）の効果についての試験

試験開始時において８～１０週齢のＣＢ１７ ＳＣＩＤ雌性マウスの膵臓に、２０μｌ中の１×１０ｅ６ＢｘＰＣ－３－ｌｕｃ２腫瘍細胞を同所移植した。マウスを麻酔し、右側に横臥させて左側を露出させ、左側腹部領域を０．５ｃｍ切開する。膵臓及び脾臓を摘出し、２０μｌ中１×１０ｅ６個の腫瘍細胞を膵尾の被膜下空間に注入した。移植の１週間後、生物発光（ＢＬＩ）データを生成した。左側面図をイメージングするＢＬＩ（週に１回又は２回）では、全ての注入を受けるマウスのイメージングの１５分前に、全てのマウスに、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン（Ｄ－ルシフェリン－ＥＦカリウム塩、カタログ番号Ｅ６５５２、Ｐｒｏｍｅｇａ）を腹腔内注入した。ＢＬＩ／腫瘍体積に基づいて外れ値の動物を除去し、マウスをそれぞれ７匹のマウスの群に無作為に振り分けた。実験８日目に、処置を開始した。

抗体処置群の動物に、０．３ｍｇ／ｋｇの抗体を４週間連続して毎週投与した（０、７、１４及び２１日目）。処置の０日目に、動物は、負荷用量の２倍、すなわち、０．６ｍｇ／ｋｇの抗体を受ける。最後のイメージングを３５日目又は４０日目に行った。ビヒクルのみ処置群及びセツキシマブ処置群をコントロールとした。

セツキシマブ及びオリゴクロニックは、モデルにおいてＢｘＰＣ－３腫瘍の増殖を有意に減少させる（ｐ＜０．０５）（図５）。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）ＰＢ４５１６及びＰＢ６８９２による腫瘍増殖は、セツキシマブよりも顕著に小さかった。セツキシマブは、Ｎ８７細胞の増殖を有意に減少させなかった。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）は、モデルにおいてＮ８７腫瘍の増殖を有意に減少させた（ｐ＜０．０５）（図５）。

Ｎ８７腫瘍：
試験開始時において８～１２週齢のＣＢ１７ＳＣＩＤ雌マウスの脇腹に、５０％マトリゲルｓｃ中の１×１０ｅ７Ｎ８７腫瘍細胞を接種した。細胞注入量は０．２ｍＬ／マウスとした。腫瘍が１５０～２００ｍｍ３の平均サイズに達したときに処置を開始した。抗体をマウス１ｋｇ当たり２５ｍｇで腹腔内注入によって４週間にわたって週に１回投与した。体重を、腫瘍細胞注入後は、１週間に１回測定し、処置開始から最後までは隔週で測定した。腫瘍の成長をカリパス測定によって隔週でモニターした。実験の終点は、８００ｍｍ３又は６０日のどちらか早い方の腫瘍体積とした。

様々なＰＤＸモデルにおけるＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）ＰＢ１１２４４及びＰＢ４５１６の活性
二重特異性抗体ＰＢ１１２４４及びＰＢ４５１６を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）の活性を、一連のＰＤＸモデルにおいて評価した。多数のがんモデルにおける候補治療薬の試験は、臨床的有効性の予測を容易にし、患者選択戦略のための因子を特定することができる。

二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ１１２４４は、ＩｇＧ１定常領域及び２つの可変ドメインを有する。

ＰＢ４５１６のＨＥＲ３可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ３１７８の重鎖可変領域を有する。ＥＧＦＲ可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ３７５５の重鎖可変領域を有する。

ＰＢ１１２４４のＨＥＲ２可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ２０３２の重鎖可変領域を有する。ＥＧＦＲ可変ドメインは、図７又は図８のＭＦ３７５５の重鎖可変領域を有する。

両方の抗体の軽鎖可変領域は同じであり、図７の配列番号１１の共通軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有していた。）

いくつかの胃がん、食道がん、及び非小細胞肺がんのＰＤＸモデルを選択した（図６）。

二重特異性抗体ＰＢ４５１６及びＰＢ１１２４４を含むＯｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）を作製し、精製した。これらの抗体を１：１の比で混合した。Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）をモデルで試験し、セツキシマブ及びビヒクル（ＰＢＳ）と比較した。

ＰＤＸモデルは、まず、ドナーＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下（ｓ．ｃ．）に拡がった。腫瘍を摘出し、小片（直径２～３ｍｍ）に切断し、新しいアクセプターＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下移植した。腫瘍のレシピエントは、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスであった。腫瘍が１００～２００ｍｍ３の平均サイズに達するまでカリパス測定により腫瘍の成長を観察した。１日目として示されるこの段階で、動物を各モデルについて３つの群に無作為に分けた。処置は、同日に開始され、
ＰＢ４５１６×ＰＢ６８９２２５ｍｇ／ｋｇ、毎週５回の投与、腹腔内注入
セツキシマブ２５ｍｇ／ｋｇ、毎週５回、腹腔内注入
ビヒクル（ＰＢＳ）、毎週５回投与、腹腔内注入、を含んだ。

Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）は、モデルにおいて腫瘍細胞の増殖を有意に減少させたことが分かる。増殖の減少は、セツキシマブと同等又はより良好であった。

Claims (33)

1. ２つ以上の結合部分を含む組成物であって、
   前記結合部分の各々が、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、
   第１の前記結合部分が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の前記結合部分が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む、組成物。
2. 前記２つ以上の結合部分のうちの少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つが抗体である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記２つ以上の結合部分のうちの少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つがＩｇＧである、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
4. 第１及び／又は第２の抗体の重鎖のＣＨ３領域が、ＨＥＲ２結合可変ドメインを有する重鎖を有するＥＧＦＲ結合可変ドメインとの重鎖のヘテロ二量体化、及び／又は、ＨＥＲ３結合可変ドメインを有する重鎖を有するＥＧＦＲ結合可変ドメインとの重鎖のヘテロ二量体化を促進するように操作される、請求項２又は請求項３に記載の組成物。
5. 前記２つ以上の抗体のうちの少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つが二重特異性抗体である、請求項２から４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記第１及び第２の抗体のＥＧＦＲの細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、実質的に同じ重鎖可変領域を含む、請求項２から５のいずれか一項に記載の組成物。
7. ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＥＧＦＲのドメインＩ又はドメインＩＩＩ、好ましくは、ドメインＩＩＩに結合する、請求項２から６のいずれか一項に記載の組成物。
8. ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインが、ＨＥＲ２のドメインＩ又はドメインＩＶ、好ましくは、ドメインＩＶに結合する、請求項２から７のいずれか一項に記載の組成物。
9. ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する、請求項２から８のいずれか一項記載の組成物。
10. ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＥＧＦＲのドメインＩ又はドメインＩＩＩ、好ましくは、ドメインＩＩＩに結合し、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＨＥＲ２のドメインＩ又はドメインＩＶ、好ましくは、ドメインＩＶに結合し、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する、請求項６から９のいずれか一項に記載の組成物。
11. ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、少なくともＨＥＲ３のドメインＩＩＩのＲ４２６に結合する、請求項９又は請求項１０に記載の組成物。
12. ＨＥＲ３陽性ＳＫ－ＢＲ－３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－３０（商標））への結合についての、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する前記可変ドメインの親和性（ＫＤ）が、２．０ｎＭ以下、好ましくは、２．０から０、１ｎＭである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. ＥＧＦＲにＥＧＦＲを結合する可変ドメインの結合が、ＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を遮断し、及び／又は、ＨＥＲ３にＨＥＲ３を結合する可変ドメインの結合が、ＨＥＲ３へのニューレグリン１（ＮＲＧ）の結合を遮断する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＣＤＲ１配列ＮＹＡＭＮ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＡＮＴＧＤＰＴＹＡＱＧＦＴＧ、及びＣＤＲ３配列ＥＲＦＬＥＷＬＨＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＣＤＲ１配列ＳＹＧＭＨ、ＣＤＲ２配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、及びＣＤＲ３配列ＤＹＹＲＲＴＡＲＡＧＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ、及びＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＣＤＲ１配列ＮＹＡＭＮ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＡＮＴＧＤＰＴＹＡＱＧＦＴＧ、及びＣＤＲ３配列ＥＲＦＬＥＷＬＨＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中の１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含み、
    ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＣＤＲ１配列ＳＹＧＭＨ、ＣＤＲ２配列ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ、及びＣＤＲ３配列ＤＹＹＲＲＴＡＲＡＧＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中の１、２若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含み、
    ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する前記可変ドメインが、ＣＤＲ１配列ＧＹＹＭＨ、ＣＤＲ２配列ＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧ、及びＣＤＲ３配列ＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹを含む重鎖可変領域、又は、ＣＤＲ中に１、２、若しくは３個のアミノ酸の置換、欠失及び／若しくは挿入を含むそれらの変異体を含む、
    請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 治療に使用するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. がん、好ましくは、胃がん、肺がん又は食道がんの治療に使用するための、請求項１８に記載の組成物。
20. 請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。
21. それぞれがＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含む２つ以上の結合部分；第１の前記結合部分が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の前記結合部分が、がん、好ましくは、胃がん、肺がん又は食道がんの治療に使用するためのＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む。
22. ２つ以上の結合部分を含む産物であって、前記結合部分のそれぞれが、ＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第１の前記結合部分が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の前記結合部分が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを、がん、好ましくは、胃がん、肺がん又は食道がんの治療における同時使用、個別的使用又は逐次使用のための組み合わせ調製物として含む、産物。
23. 前記がんが、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）による治療に対して細胞を耐性にするＥＧＦＲ変異を有する細胞を含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の使用のための組成物、医薬組成物、結合部分又は産物。
24. 前記がんが、ＥＧＦＲ Ｒ５２１Ｋ多型を有する細胞を含む、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の使用のための組成物、医薬組成物、結合部分又は産物。
25. 前記がんが、胃がんである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の使用のための組成物、結合部分又は産物。
26. がんを有するか、又はがんの再発若しくは再燃のリスクがある対象を治療する方法であって、治療有効量の２つ以上の結合部分をそれを必要とする対象に投与することを含み、前記結合部分のそれぞれがＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第１の前記結合部分が、ＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを含み、第２の前記結合部分が、ＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを含む、方法。
27. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
    細胞を提供することであって、前記細胞が、
    共通軽鎖と対合してＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成することができる重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    前記共通軽鎖と対合してＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成することができる重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    前記共通軽鎖と対合してＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成することができる重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    前記共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸とを含み、
    任意選択で、２つ以上の前記核酸が物理的に連結されていてもよく、前記核酸の各々が、前記細胞における前記コードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含む、細胞を提供すること、
    前記細胞を培養して前記重鎖及び軽鎖の発現を可能にすること、及び、任意選択で、
    前記２つ以上の結合部分を回収すること、を含む方法。
28. 複数の細胞に前記核酸を提供すること、及び、前記収集物から前記重鎖及び軽鎖の所望の発現比を有する細胞を選択することを含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記２つ以上の結合部分が、抗体、好ましくは、二重特異性抗体である、請求項２７又は請求項２８に記載の方法。
30. 前記細胞が、本質的に等モル量の前記２つ以上の結合部分を産生する、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記細胞が、前記２つ以上の結合部分のうちの第２の結合部分よりも多くの第１の結合部分を産生する、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 細胞であって、
    共通軽鎖と一緒になってＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    前記共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    前記共通軽鎖と一緒になってＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成する重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    前記共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸とを含み、
    ２つ以上の前記核酸が物理的に連結されていてもいなくてもよく、前記核酸の各々が、前記細胞における前記コードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含む、細胞。
33. 核酸を含む容器であって、
    共通軽鎖と対合してＥＧＦＲの細胞外部分に結合する可変ドメインを形成することができる重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    共通軽鎖と対合してＨＥＲ２の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成することができる重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    共通軽鎖と対合してＨＥＲ３の細胞外部分に結合する可変ドメインを形成することができる重鎖を含むポリペプチドをコードする核酸と、
    前記共通軽鎖を含むポリペプチドをコードする核酸とを含み、
    任意選択で、２つ以上の前記核酸が物理的に連結されていてもよく、前記核酸の各々が、細胞における前記コードされた重鎖及び軽鎖の発現を可能にする発現制御配列を更に含む、容器。

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