TW202206460A - 使用結合lgr5及egfr之抗體的癌症治療 - Google Patents
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- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
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- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
本揭露內容係關於癌症治療之手段及方法。本揭露內容尤其關於一種使用結合LGR5及EGFR之抗體治療個體之癌症的方法。本發明進一步關於用於此類方法之組合及用於製造用於治療胃腸癌之藥劑的組合。此類抗體尤其適用於治療胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。
Description
發明領域
本揭露內容係關於癌症治療之手段及方法。本揭露內容尤其關於一種使用結合LGR5及EGFR之抗體治療個體之癌症的方法。本發明進一步關於用於此類方法之組合及用於製造用於治療胃腸癌之藥劑的組合。此類抗體尤其適用於治療胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。
發明背景
傳統上，大部分癌症藥物發現聚焦於阻斷基本細胞功能且經由化學療法殺死分裂細胞的藥劑。然而，化學療法很少引起完全治癒。在大多數情況下，患者中之腫瘤停止生長或暫時縮小(稱作緩解)，結果卻再次開始增殖，有時更加快速(稱作再發)，且變得愈來愈難以治療。最近，癌症藥物開發之焦點已遠離廣泛細胞毒性化學療法移動至具有較少毒性之靶向細胞生長抑制療法。用特異性抑制信號傳導路徑組分之靶向療法治療晚期癌症已在白血病中臨床驗證。然而，在大部分癌中，靶向方法仍證明無效。
儘管在疾病治療中已取得許多進展且對導致癌症之分子事件的認識得到提高，但癌症仍為世界上的主要死亡原因。舉例而言，胃癌為全世界第5常見診斷出之癌症，且為第3致命之癌症。在2018年，估計783,000人死於胃癌。食道癌為第9常見之癌症，且為第6常見之癌症死亡原因。據報導，表皮生長因子受體(EGFR)在超過30%胃腺癌(GAC)及食道腺癌(EAC)病例中過度表現。然而，評述六項不同研究之分析得出結論，將抗EGFR劑添加至化學療法中不改良患有晚期/轉移性EAC、GAC或胃-食道接合部腺癌(GEJAC)之患者的總存活期或無進展存活期(Kim等人2017 Oncotarget. 2017年11月17日；8(58): 99033-99040)。因此，存在對癌症治療，尤其對胃癌及食道癌治療的需要。
發明概要
本揭露內容提供以下較佳實施例。然而，本發明不限於此等實施例。
在一些實施例中，本揭露內容提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域，用於治療個體之癌症，其中該用途包含向個體提供1500 mg抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之固定劑量(flat dose)。本揭露內容進一步提供治療個體之癌症的方法，包含向有需要之個體提供1500 mg抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之固定劑量。
在一些實施例中，本揭露內容提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域，用於治療個體之胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。本揭露內容進一步提供在個體中治療個體之胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌的方法，包含向有需要之個體提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物。較佳地，該用途包含向個體提供1500 mg抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之固定劑量。
在一些實施例中，治療化合物之投與可每週、每二週或每月進行一次。在一些實施例中，治療化合物每2週投與一次。
在一些實施例中，本揭露內容提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域，用於治療Her2陰性個體之胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。本揭露內容進一步提供治療Her2陰性個體之胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌的方法，包含向有需要之個體提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物。較佳地，該用途包含向個體提供1500 mg抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之固定劑量。在一些實施例中，向Her2陰性個體投與治療化合物可每週、每二週或每月進行一次。較佳地，治療化合物每2週投與一次。
較佳地，靜脈內提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物。
較佳地，癌症在一或多種選自以下之基因中具有突變：TP53、MLH1、PIK3CA、CDKN2A、UGT1A、UGT1A8、BRAF、PTEN及KRAS，較佳其中癌症在一或多種選自以下之基因中具有突變：TP53、MLH1、CDKN2A、UGT1A、UGT1A8、BRAF及PTEN。較佳地，癌症具有一或多種選自以下之突變：TP53 R196T；TP53 R342T；TP53 R248Q；MLH1 V384D；PIK3CA H1047R；CDKN2A W110T；UGT1A1 G71R；UGT1A8 G71R；及KRAS G12C。
較佳地，癌症在編碼TP53之基因中具有突變，較佳其中突變為R196T。較佳地，癌症在編碼TP53之基因中具有突變，較佳其中突變為R342T，且癌症在編碼MLH1之基因中具有突變，較佳其中突變為V384D。
較佳地，癌症在編碼TP53之基因中具有突變，較佳其中突變為R248Q；癌症在編碼PIK3CA之基因中具有突變，較佳其中突變為H1047R；癌症在編碼CDKN2A之基因中具有突變，較佳其中突變為W110T；癌症在編碼UGT1A1之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R；且癌症在編碼UGT1A8之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R。
較佳地，癌症為食道癌，較佳食道鱗狀細胞癌(ESCC)。
較佳地，癌症在編碼BRAF之基因中具有突變。然而，較佳地，癌症在BRAF中不具有突變V600E，且其中癌症在編碼PTEN之基因中具有突變。然而，較佳地，癌症在PTEN中並不另外具有突變R130Ter。
較佳地，癌症在編碼KRAS之基因中具有突變，較佳其中突變為G12C；癌症在編碼UGT1A1之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R；且癌症在編碼UGT1A8之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R。
較佳地，癌症在編碼UGT1A1之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R，且癌症在編碼UGT1A8之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R。較佳地，癌症進一步在PIK3CA中具有突變，較佳其中突變為E545K。
較佳地，癌症為胃癌。
較佳地，結合EGFR之可變區域的VH鏈包含如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列；或在如圖3中所描繪之VH鏈MF3755中相對於該VH具有至多15個，較佳不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個且較佳具有不超過5、4、3、2或1個包括插入、缺失、取代或其組合之胺基酸修飾的胺基酸序列；且其中結合LGR5之可變區域的VH鏈包含如圖3中所描繪之VH鏈MF5816的胺基酸序列；或在如圖3中所描繪之VH鏈MF5816中相對於該VH具有至多15個，較佳不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個且較佳具有不超過5、4、3、2或1個包括插入、缺失、取代或其組合之胺基酸修飾的胺基酸序列。
較佳地，結合LGR5之可變區域結合位於圖1中所描繪之人類LGR5序列之胺基酸殘基21-118內的抗原決定基。較佳地，人類LGR5之位置43、44、46、67、90及91處之胺基酸殘基參與LGR5結合可變區域與LGR5之結合。較佳地，LGR5結合可變區域與包含選自43A、44A、46A、67A、90A及91A之胺基酸殘基變異中之一或多者之LGR5蛋白的結合較弱。
較佳地，結合EGFR之可變區域結合位於圖2中所描繪之人類EGFR序列之胺基酸殘基420-480內的抗原決定基。較佳地，人類EGFR之位置I462、G465、K489、I491、N493及C499處之胺基酸殘基參與EGFR結合可變區域與EGFR之結合。較佳地，EGFR結合可變區域與包含選自I462A、G465A、K489A、I491A、N493A及C499A之胺基酸殘基取代中之一或多者之EGFR蛋白的結合較弱。
較佳地，抗體經ADCC增強。較佳地，抗體經去岩藻醣基化(afucosylated)。
較佳實施例之詳細說明
為了使本說明書可更容易理解，首先對某些術語進行定義。其他定義在整個實施方式中闡述。除非本文中單獨定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義，且採用免疫學、蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。
如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。術語「包含(comprising)」、「具有(having)」、「包括(including)」以及其他形式，諸如「包含(comprise/comprises/comprised)」、「具有(has/have/had)」及「包括(include/includes/included)」的使用不具限制性。
如本文所用，術語「抗體」意謂屬於免疫球蛋白類別之蛋白質的蛋白質分子，其含有結合抗原上之抗原決定基之一或多個區域，其中此類區域為或衍生自抗體之可變區或與該可變區具有序列同源性。抗體通常由基礎結構單元構成-各基礎結構單元具有二條重鏈及二條輕鏈。根據本發明之抗體不限於任何特定格式或其產生方法。
「雙特異性抗體」為如本文所描述之抗體，其中抗體之一個區域結合至第一抗原，而抗體之第二區域結合至第二抗原，其中該第一抗原及該第二抗原不相同，或其中一個區域結合抗原上之第一抗原決定基，而第二區域結合至抗原上之第二抗原決定基。術語「雙特異性抗體」亦涵蓋其中一個重鏈可變區/輕鏈可變區(VH/VL)組合結合第一抗原或抗原上之第一抗原決定基，且第二VH/VL組合結合第二抗原或抗原上之第二抗原決定基的抗體。該術語進一步包括其中VH能夠特異性識別第一抗原且免疫球蛋白可變區中與VH配對之VL能夠特異性識別第二抗原的抗體。所得VH/VL對將結合抗原1或抗原2。此類所謂的「二合一抗體」描述於例如WO 2008/027236、WO 2010/108127以及Schaefer等人(Cancer Cell 20, 472-486, 2011年10月)中。根據本發明之雙特異性抗體不限於任何特定雙特異性格式或其產生方法。
如本文所用，『共同輕鏈』係指雙特異性抗體中之二條輕鏈(或其VL部分)。二條輕鏈(或其VL部分)可相同或具有一些胺基酸序列差異，同時全長抗體之結合特異性不受影響。在添加或不添加術語『重排』之情況下，術語『共同輕鏈』、『共同VL』、『單一輕鏈』、『單一VL』均可在本文中互換使用。「共同」亦指胺基酸序列不相同的輕鏈之功能等效物。該輕鏈存在許多變異體，其中存在不影響功能結合區之形成的突變(缺失、取代、插入及/或添加)。本發明之輕鏈亦可為如本文所指定之輕鏈，其具有0至10個，較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或其組合。舉例而言，例如藉由引入且測試守恆的胺基酸變化，在與重鏈配對時不促成或僅部分促成結合特異性之區中的胺基酸變化及其類似者，製備或發現不相同但仍在功能上等效的輕鏈屬於如本文所用之共同輕鏈之定義的範疇內。
如本文所用，「包含」及其詞形變化形式以其非限制性意義使用，意謂包括該詞之後的項目，但不排除未具體提及的項目。另外，動詞「由……組成」可由「基本上由……組成」替換，意謂如本文所定義之化合物或佐劑化合物可包含除具體鑑別之組分外的(多種)額外組分，該(等)額外組分不改變本發明之獨特特徵。
根據本發明之術語『全長IgG』或『全長抗體』定義為包含基本上整個IgG，然而其不一定具有完整IgG之所有功能。為免生疑問，全長IgG含有二條重鏈及二條輕鏈。各鏈含有恆定(C)及可變(V)區，其可分解成命名為CH1、CH2、CH3、VH及CL、VL之區域。IgG抗體經由Fab部分中所含之可變區區域結合至抗原，且結合之後可經由恆定區域，主要經由Fc部分與免疫系統之分子及細胞相互作用。根據本發明之全長抗體涵蓋其中可存在提供所要特徵之變異的IgG分子。全長IgG不應具有任一區之實質性部分的缺失。然而，其中一個或數個胺基酸殘基缺失而基本上不改變所得IgG分子之結合特徵的IgG分子包涵在術語「全長IgG」內。舉例而言，此類IgG分子可具有1與10個胺基酸殘基之間的缺失，較佳在非CDR區中，其中缺失之胺基酸並非IgG之抗原結合特異性所必需。
「抗體之衍生物」為除CDR區外與天然抗體之胺基酸序列在至多20個胺基酸中有偏差的蛋白質。如本文所揭露之抗體的衍生物為與該胺基酸序列在至多20個胺基酸中有偏差的抗體。
當在本文中提及核酸或胺基酸序列時，「一致性百分比(%)」定義為在出於最佳比較目的比對序列之後，候選序列中與選定序列中之殘基一致的殘基之百分比。比較核酸序列之序列一致性百分比係使用Vector NTI Advance®
11.5.2軟體之AlignX應用程式，使用預設設置測定，該等預設設置採用改進之ClustalW演算法(Thompson, J.D., Higgins, D.G.及Gibson T.J., (1994) Nuc. Acid Res. 22(22): 4673-4680)、swgapdnamt分數矩陣、空位開放罰分15及空位延伸罰分6.66。胺基酸序列係利用Vector NTI Advance®
11.5.2軟體之AlignX應用程式，使用預設設置比對，該等預設設置採用改進之ClustalW演算法(Thompson, J.D., Higgins, D.G.及Gibson T.J., (1994) Nuc. Acid Res. 22(22): 4673-4680)、blosum62mt2分數矩陣、空位開放罰分10及空位延伸罰分0.1。
由於抗體通常識別抗原之抗原決定基，且此類抗原決定基亦可存在於其他化合物中，因此若此類其他化合物含有相同種類之抗原決定基，則「特異性識別」抗原，例如EGFR或LGR5的根據本發明之抗體亦可識別其他化合物。因此，關於抗原及抗體相互作用之術語「特異性識別」不排除抗體與含有相同種類之抗原決定基之其他化合物的結合。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合之位點。抗原決定基可由連續胺基酸或因蛋白質之三級摺疊而相鄰之非連續胺基酸形成(所謂的線性抗原決定基及構形抗原決定基)。由連續線性胺基酸形成之抗原決定基通常在暴露於變性溶劑後保留，而藉由三級摺疊、構形形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理後損失。抗原決定基通常可包括呈獨特空間構形之3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。
如本文所用，術語「個體」及「患者」可互換使用且係指哺乳動物，諸如人類、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、貓、犬、猴、牛、馬豬及其類似動物(例如患有癌症之患者，諸如人類患者)。
如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」係指對個體進行之任何類型的干預或方法，或向個體投與活性劑或活性劑組合，目標為逆轉、緩解、改善、抑制或減緩或預防與疾病相關之症狀、併發症、病狀或生物化學標誌的進展、發展、嚴重程度或復發。
如本文所用，「有效治療」或「陽性治療反應」係指產生有益效果，例如改善疾病或病症(例如癌症)之至少一種症狀的治療。有益效果可呈相對於基線之改善的形式，包括相對於根據方法開始療法之前進行之量測或觀測的改善。舉例而言，有益效果可呈在任何臨床階段減緩、穩定、停止或逆轉個體之癌症進展的形式，如疾病之臨床或診斷症狀或癌症標記物的減少或消除所證明。有效治療可例如減小腫瘤大小、減少循環腫瘤細胞之存在、減少或預防腫瘤轉移、減緩或遏制腫瘤生長及/或預防或延遲腫瘤復發或再發。
術語「有效量」或「治療有效量」係指提供所要生物、治療及/或預防結果之藥劑或藥劑組合的量。該結果可為疾病之病徵、症狀或病因中之一或多者的減少、改善、緩和、減輕、延遲及/或緩解，或生物系統之任何其他所要改變。在一些實施例中，有效量為足以延遲腫瘤發展的量。在一些實施例中，有效量為足以預防或延遲腫瘤復發的量。有效量可以一或多次投藥來投與。藥物或組合物之有效量可以：(i)減少癌細胞之數目；(ii)減小腫瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、阻滯、減緩且可停止癌細胞向周邊器官中之浸潤；(iv)抑制腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤之發生及/或復發；及/或(vii)在一定程度上緩解一或多種癌症相關症狀。在一個實例中，「有效量」為EGFR/LGR5抗體實現癌症減少(例如癌細胞數目減少)；減緩癌症進展或預防癌症再生或復發的量。
本揭露內容提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域，用於治療癌症。本文中使用詞語癌症及腫瘤，且除非另外具體說明，否則通常均指癌症。
表皮生長因子(EGF)受體(EGFR，ErbB1或HER1)為命名為Her-或cErbB-1、-2、-3及-4之四受體酪胺酸激酶(RTK)家族的成員。EGFR以各種同義詞為人所知，其中最常見的為EGFR。EGFR具有由四個亞區域構成之胞外區域(ECD)，該四個亞區域中之二個參與配位體結合且二個參與同二聚化及異二聚化。EGFR整合來自各種配位體之胞外信號以產生多樣胞內反應。由EGFR活化之主要信號轉導路徑由Ras-促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)促分裂信號級聯構成。此路徑之活化藉由將Grb2募集至酪胺酸磷酸化EGFR來起始。此引起經由Grb2結合Ras-鳥嘌呤核苷酸交換因子無七之子(Son of Sevenless，SOS)進行之Ras活化。另外，PI3-激酶-Akt信號轉導路徑亦由EGFR活化，但此活化在存在ErbB-3 (HER3)共表現之情況下強得多。EGFR牽涉到數種人類上皮惡性疾病，尤其乳癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、肺癌、大腸癌、卵巢癌、頭頸癌及腦癌。已發現基因中之活化突變以及受體及其配位體之過度表現，此等情況產生自分泌活化環。因此，此RTK已廣泛用作癌症療法之目標。靶向RTK之小分子抑制劑及針對胞外配位體結合區域之單株抗體(mAb)二者均已得到研發且迄今已顯示數項臨床成功，即使大部分係精選患者組之臨床成功。人類EGFR蛋白及其編碼基因之資料庫寄存編號為GenBank NM_005228.3。此寄存編號主要為了提供鑑別作為目標之EGFR蛋白之另一方法而給出，抗體所結合之EGFR蛋白之實際序列可變化，此例如歸因於編碼基因突變，諸如在一些癌症或其類似疾病中出現之編碼基因突變。
除非另外說明，否則在本文提及EGFR之情況下，提及係指人類EGFR。結合EGFR之可變區域抗原結合位點結合EGFR及其各種變異體，諸如在一些EGFR陽性腫瘤上表現之彼等。
術語「LGR」係指被稱為含富白胺酸重複序列之G蛋白偶聯受體之蛋白質家族。已知該家族之數種成員參與WNT信號傳導路徑，值得注意的是LGR4；LGR5及LGR6。
LGR5為含富白胺酸重複序列之G蛋白偶聯受體5。基因或蛋白質之替代名稱為含富白胺酸重複序列之G蛋白偶聯受體5；含有富白胺酸重複序列之G蛋白偶聯受體5；G蛋白偶聯受體HG38；G蛋白偶聯受體49；G蛋白偶聯受體67；GPR67；GPR49；孤兒G蛋白偶聯受體HG38；G蛋白偶聯受體49；GPR49；HG38及FEX。結合LGR5之本發明之蛋白質或抗體結合人類LGR5。歸因於人類與其他哺乳動物異種同源物之間的序列及三級結構類似性，本發明之LGR5結合蛋白或抗體亦可結合此類異種同源物，但未必如此。人類LGR5蛋白及其編碼基因之資料庫寄存編號為(NC_000012.12；NT_029419.13；NC_018923.2；NP_001264155.1；NP_001264156.1；NP_003658.1)。寄存編號主要為了提供鑑別作為目標之LGR5之另一方法而給出，所結合之LGR5蛋白之實際序列可變化，此例如歸因於編碼基因突變，諸如在一些癌症或其類似疾病中出現之編碼基因突變。LGR5抗原結合位點結合LGR5及其各種變異體，諸如由一些LGR5陽性腫瘤細胞表現之彼等。
在一些實施例中，癌症為胃腸癌，諸如大腸直腸癌。較佳地，癌症為胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。胃癌(gastric cancer/stomach cancer)為自胃黏膜且尤其其中發現之產生黏液之腺細胞發展的癌症。此類癌症亦稱為腺癌，或在此情況下胃腺癌，因為其自胃黏膜發展。在一較佳實施例中，癌症因此為胃腺癌或自胃黏膜發展之癌症，該術語在本文中可互換使用。食道癌為自食道發展之癌症。二種主要次型為食道鱗狀細胞癌(ESCC)及食道腺癌(EAC)。胃-食道接合部癌(亦稱為胃-食道接合部腺癌)來源於胃-食道接合部。
在一些實施例中，癌症表現LGR5及/或表現EGFR。如本文所用，若癌症包含表現LGR5之細胞，則癌症表現LGR5。表現LGR5之細胞包含可偵測位準的編碼LGR5之RNA。如本文所用，若癌症包含表現EGFR之細胞，則癌症表現EGFR。表現EGFR之細胞包含可偵測位準的編碼LGR5之RNA。通常亦可藉由將細胞與結合至LGR5或EGFR之抗體一起培育來偵測表現。然而，一些細胞並不以對於此類抗體測試而言足夠高之量表現蛋白質。在此類情況下，mRNA或其他形式之核酸序列偵測較佳。
在一些實施例中，本揭露內容提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域，用於治療個體之胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌，該個體之Her2狀態選自Her2陽性、Her2高、Her2 3+、Her2 2+、Her2 1+、Her2 0或Her2陰性個體。較佳地，個體為Her2陰性。本揭露內容進一步提供治療Her2陰性個體之胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌的方法，包含向有需要之個體提供抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物。較佳地，該用途包含向個體提供1500 mg抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之固定劑量。在一些實施例中，向Her2陰性個體投與治療化合物可每週、每二週或每月進行一次。較佳地，治療化合物每2週投與一次。
用於確定個體之人類表皮生長因子受體2 (HER2)之表現的方法為此項技術中所熟知。舉例而言，Her2之表現位準可使用免疫組織化學(IHC)或(螢光)原位雜交(ISH)建立，其使得可鑑別Her2狀態，包括鑑別Her2陰性個體。IHC或ISH均為常規用於建立人類個體中之Her2狀態的良好定義且標準的程序。本文參考例如根據Bartley等人,(HER2 Testing and Clinical Decision Making in Gastroesophageal Adenocarcinoma. Arch Pathol Lab Med. 2016;140:1345-1363)之ASCO/CAP指南。舉例而言，使用抗HER-2/neu抗體(純系4B5)使得可使用IHC半定量偵測FFPE胃/胃食道腺癌、胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌之切片中的HER-2抗原。根據此癌症類型之共識指南進行染色及評分。此類IHC測試通常提供0至3+之評分，其量度癌症組織樣品中細胞表面上HER2受體蛋白之量。基於IHC評分，患者可分類為Her2陰性，諸如當量測到0或1+之評分時。倘若ISH測試用於建立Her2表現，諸如使用HER2探針(17q11.2-q12)及著絲點17探針(Cen 17)，則診斷為「陽性」抑或「陰性」，有時亦報告為HER2為「零」。本揭露內容之治療方法為較佳如藉由IHC及/或ISH建立為Her2陰性之個體。
在本文中，Her2陰性個體意謂具有Her2陰性之癌症、癌細胞或腫瘤之個體。Her2狀態可如上文所描述根據IHC及/或ISH確定。
較佳地，在一些實施例中，使用抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物治療之前為診斷個體之Her2狀態的步驟。較佳地，在一些實施例中，選擇具有Her2陰性狀態之個體進行治療。較佳地，在一些實施例中，治療個體之前為診斷患有Her2陰性胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌之個體的步驟。藉由本揭露內容之方法治療的此類癌症包括具有鱗狀細胞癌組織學之胃腺癌及食道癌。
該Her2陰性診斷較佳涉及對Her2狀態進行ISH或IHC測試。
較佳地，在一些實施例中，治療Her2陰性個體之前為篩選患有Her2陰性胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌之個體的步驟。此類癌症尤其為腺癌。該篩選較佳涉及對Her2狀態進行ISH或IHC測試。
癌症，諸如胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌可能與存在突變相關。此類突變包括已知致癌基因，諸如PIK3CA、KRAS及BRAF中之突變。致癌突變一般描述為活化突變或產生新功能之突變。另一類型之癌症突變涉及腫瘤抑制基因，諸如TP53、MLH1、CDKN2A及PTEN。腫瘤抑制基因中之突變一般為失活性的。
TP53編碼調節包括壓力反應及細胞增殖之多種活動的轉錄因子。TP53中之突變與各種癌症相關，且估計在超過50%之人類癌症，包括胃癌及食道癌中發生。特定而言，TP53 R248Q突變顯示為與包括胃癌及食道癌之癌症相關(Pitolli等人Int. J. Mol. Sci.2019 20:6241)。位置R196及R342處之無意義突變已在多種腫瘤中鑑別出，諸如分別來自乳房及食道；及卵巢、前列腺、乳房、胰臟、胃、大腸/直腸、肺、食道、骨的腫瘤(Priestly等人Nature 2019 575: 210-216)。在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療具有TP53突變，尤其導致TP53表現或活性降低之突變的癌症。
MutL同源物1 (MLH1)編碼參與DNA錯配修復之蛋白質且為已知腫瘤抑制基因。MLH1中之突變與包括胃腸癌之各種癌症相關。低位準之MLH1亦與具有食道癌家族病史之食道癌患者相關(Chang et al. Oncol Lett. 2015 9:430-436)，且1.39%之惡性食道腫瘤患者中MLH1突變(The AACR Project GENIE Consortium. AACR Project GENIE: powering precision medicine through an international consortium. Cancer Discovery. 2017;7(8):818-831.資料集第6版)。特定而言，MLH1 V384D突變顯示為與癌症，例如大腸直腸癌相關(Ohsawa等人Molecular Medicine Reports 2009 2:887-891)。在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療具有MLH1突變，尤其導致MLH1表現或活性降低之突變的癌症。
磷脂醯肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化次單元α (PIK3CA)編碼磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)之110 kDa催化次單元。PIK3CA中之突變與各種癌症相關，包括胃腸癌。據美國癌症研究協會(American Association for Cancer Research)報導，12.75%之惡性實體腫瘤患者中PIK3CA突變。特定而言，PIK3CA H1047R突變在所有惡性實體腫瘤患者之2.91%中存在，且PIK3CA E545K在所有惡性實體腫瘤患者之2.55%中存在(參見The AACR Project GENIE Consortium. AACR Project GENIE: powering precision medicine through an international consortium. Cancer Discovery. 2017;7(8):818-831.資料集第6版)。在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療具有PIK3CA突變，尤其PIK2CA中之致癌突變的癌症。
週期蛋白依賴型激酶抑制劑2A (CDKN2A)編碼抑制CDK4及ARF之蛋白質。據美國癌症研究協會報導，22.21%之食道癌患者、28.7%之食道鱗狀細胞癌患者及6.08%之胃腺癌患者中CDKN2A突變。特定而言，CDKN2A W110Ter突變在大約0.11%之癌症患者中存在。(The AACR Project GENIE Consortium. AACR Project GENIE: powering precision medicine through an international consortium. Cancer Discovery. 2017;7(8):818-831.資料集第6版)。在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療具有CDKN2A突變，尤其導致CDKN2A表現或活性降低之突變的癌症。
磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)編碼磷脂醯肌醇3,4,5-三磷酸3-磷酸酶。據美國癌症研究協會報導，6.28%之癌症患者、3.41%之胃腺癌患者、2.37%之食道癌患者及2.22%之食道腺癌患者中PTEN突變。特定而言，PTEN R130Ter突變(其中Ter係指終止(termination/stop)密碼子)在所有大腸直腸癌患者之0.21%中存在(The AACR Project GENIE Consortium. AACR Project GENIE: powering precision medicine through an international consortium. Cancer Discovery. 2017;7(8):818-831.資料集第6版)。在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療具有PTEN突變，尤其導致PTEN表現或活性降低之突變的癌症。
BRAF編碼絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶B-Raf，其參與生長信號傳導。據美國癌症研究協會報導，1.91%之胃癌瘤患者及1.93%之胃腺癌患者中BRAF突變。特定而言，BRAF V600E突變在2.72%之癌症患者中存在(參見The AACR Project GENIE Consortium. AACR Project GENIE: powering precision medicine through an international consortium. Cancer Discovery. 2017;7(8):818-831.資料集第6版)。在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療具有BRAF突變，尤其BRAF中之致癌突變的癌症。然而，在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療不具有BRAF突變V600E之胃癌。
基爾斯滕大鼠肉瘤(Kirsten RAt Sarcoma，KRAS)編碼作為RAS/MAPK路徑之一部分的蛋白質。據美國癌症研究協會報導，14.7%之惡性實體腫瘤患者中KRAS突變，其中KRAS G12C在所有惡性實體腫瘤患者之2.28%中存在(參見The AACR Project GENIE Consortium. AACR Project GENIE: powering precision medicine through an international consortium. Cancer Discovery. 2017;7(8):818-831.資料集第6版)。在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療具有KRAS突變，尤其KRAS中之致癌突變的癌症。
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A1 (UGT1A1)及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶1A8 (UGT1A8)編碼葡萄糖醛酸化路徑之酶。已知降低酶活性之數種多型現象影響伊立替康(irinotecan)之代謝及效果。舉例而言，UGT1A1*6對偶基因(G71R多型現象)在中國、韓國及日本人群中具有大約0.13%之對偶基因頻率，且UGT1A1*28對偶基因(啟動子區之TATA序列中的二核苷酸重複多型現象)為伊立替康誘導之嗜中性白血球減少症的風險因子。在一些實施例中，本文所揭露之治療化合物適用於治療具有UGT1A1及/或UGT1A8突變，尤其導致UGT1A1及/或UGT1A8表現或活性降低之突變的癌症。
毛細血管擴張性失調突變蛋白(Ataxia Telangiectaisa Mutated，ATM)為絲胺酸-蘇胺酸激酶家族成員，且經由活化獨特DNA修復及信號傳導路徑協調對DNA損傷之細胞反應。ATM生殖系突變與毛細血管擴張性失調相關，且ATM體細胞突變通常在子宮內膜癌、大腸癌、胰臟癌、乳癌及尿道上皮癌中觀測到。
在較佳實施例中，本揭露內容提供用於治療在編碼TP53、MLH1、PIK3CA、CDKN2A、UGT1A、UGT1A8、BRAF、PTEN及KRAS之基因中具有突變之癌症的方法。較佳地，癌症具有一或多種選自以下之突變：TP53 R196T；TP53 R342T；TP53 R248Q；MLH1 V384D；PIK3CA H1047R；PIK3CA E545K；CDKN2A W110T；UGT1A1 G71R；UGT1A8 G71R；及KRAS G12C。在一些實施例中，癌症為KRAS野生型。或者，本揭露內容提供用於治療在編碼ATM之基因中具有突變，尤其突變W57T之癌症的方法。特定而言，本揭露內容提供用於治療在編碼ATM之基因中具有突變，尤其突變W57T之食道癌，尤其ESCC的方法。
在一些實施例中，癌症在編碼TP53之基因中具有突變，較佳其中突變為R342T，且癌症在編碼MLH1之基因中具有突變，較佳其中突變為V384D。
在一些實施例中，癌症在編碼TP53之基因中具有突變，較佳其中突變為R248Q；癌症在編碼PIK3CA之基因中具有突變，較佳其中突變為H1047R；癌症在編碼CDKN2A之基因中具有突變，較佳其中突變為W110T；癌症在編碼UGT1A1之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R；且癌症在編碼UGT1A8之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R。較佳地，癌症為食道癌，較佳食道鱗狀細胞癌(ESCC)。
在一些實施例中，癌症在編碼BRAF之基因中具有突變。然而，癌症較佳在編碼BRAF之基因中不具有突變V600E，且較佳在編碼PTEN之基因中不具有突變R130Ter。在一些實施例中，癌症在編碼KRAS之基因中具有突變，較佳其中突變為G12C；癌症在編碼UGT1A1之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R；且癌症在編碼UGT1A8之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R。在一些實施例中，癌症在編碼UGT1A1之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R，且癌症在編碼UGT1A8之基因中具有突變，較佳其中突變為G71R。在一些實施例中，癌症在PIK3CA中具有突變，較佳其中突變為E545K。較佳地，癌症為胃癌。
如本文所描述之抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物包含結合表皮生長因子(EGF)受體之胞外部分的可變區域及結合LGR5之可變區域。EGFR較佳為人類EGFR。LGR5較佳為人類LGR5。如本文所描述之抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物包含結合人類表皮生長因子(EGF)受體之胞外部分的可變區域及結合人類LGR5之可變區域。
較佳地，如本文所描述之抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物包含結合表皮生長因子(EGF)受體之胞外部分且干擾EGF與受體結合的可變區域及結合LGR5之可變區域，其中抗體與表現LGR5之細胞上之LGR5的相互作用不阻斷R脊椎蛋白(Rspondin，RSPO)與LGR5之結合。用於確定抗體阻斷還是不阻斷R脊椎蛋白與LGR5之結合的方法描述於WO2017069528中，其在此以引用之方式併入。
在本文中給出蛋白質/基因之寄存編號或替代名稱時，其主要為了提供鑑別作為目標之所提及蛋白質之另一方法而給出，本發明抗體所結合之目標蛋白的實際序列可變化，此例如歸因於編碼基因中之突變及/或選擇性剪接，諸如在一些癌症或其類似疾病中出現之彼等。目標蛋白由抗體結合，只要抗原決定基存在於蛋白質中且抗原決定基為抗體可接近的即可。
如本文所描述之抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物較佳干擾EGFR之配位體與EGFR的結合。如本文所用，術語「干擾結合」意謂抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物與EGFR之結合同配位體競爭與EGF受體之結合。抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物可減弱配位體結合，在此已結合至EGF受體時取代配位體，或其可例如經由位阻至少部分阻止配位體可結合至EGF受體。
如本文所揭露之EGFR抗體較佳分別抑制EGFR配位體誘導之信號傳導，其量測為配位體誘導之BxPC3細胞(ATCC CRL-1687)或BxPC3-luc2細胞(Perkin Elmer 125058)之生長，或配位體誘導之A431細胞(ATCC CRL-1555)的細胞死亡。EGFR可結合多種配位體且刺激所提及之BxPC3細胞或BxPC3-luc2細胞的生長。在EGFR配位體存在下，BxPC3或BxPC3-luc2細胞之生長受到刺激。可藉由比較在不存在及存在配位體之情況下的細胞生長來量測EGFR配位體誘導之BxPC3細胞生長。用於量測EGFR配位體誘導之BxPC3或BxPC3-luc2細胞生長的較佳EGFR配位體為EGF。配位體誘導之生長較佳使用飽和量之配位體來量測。在一較佳實施例中，EGF以100 ng/ml培養基之量使用。EGF較佳為EGF R&D systems，目錄號396-HB及236-EG (亦參見WO2017/069628；其以引用之方式併入本文中)。
如本文所揭露之EGFR抗體較佳抑制EGFR配位體誘導之BxPC3細胞(ATCC CRL-1687)或BxPC3-luc2細胞(Perkin Elmer 125058)的生長。EGFR可結合多種配位體且刺激所提及之BxPC3細胞或BxPC3-luc2細胞的生長。在配位體存在下，BxPC3或BxPC3-luc2細胞之生長受到刺激。可藉由比較在不存在及存在配位體之情況下的細胞生長來量測EGFR配位體誘導之BxPC3細胞生長。用於量測EGFR配位體誘導之BxPC3或BxPC3-luc2細胞生長的較佳EGFR配位體為EGF。配位體誘導之生長較佳使用飽和量之配位體來量測。在一較佳實施例中，EGF以100 ng/ml培養基之量使用。EGF較佳為R&D systems，目錄號396-HB及236-EG之EGF (亦參見WO2017/069628；其以引用之方式併入本文中)。
為免生疑問，如本文所用提及細胞生長係指細胞數目之變化。生長抑制係指原本將獲得之細胞數目的減少。生長增加係指原本將獲得之細胞數目的增加。細胞生長通常係指細胞增殖。
如本文所描述之抗體是否以多特異性格式抑制信號傳導或抑制生長較佳藉由如上文所描述之方法，使用單特異性單價或單特異性二價形式之抗體來確定。此類抗體較佳具有信號傳導待確定之受體的結合位點。單特異性單價抗體可具有帶有不相關結合特異性，諸如破傷風類毒素特異性之可變區域。較佳抗體為二價單特異性抗體，其中抗原結合可變區域由結合EGF受體家族成員之可變區域組成。
Merus在其Biclonics®抗體計劃中開發出靶向EGFR及LGR5 (含富白胺酸重複序列之G蛋白偶聯受體)之多特異性抗體。已分別使用患者源CRC類器官及小鼠PDX模型活體外及活體內評定此類多特異性抗體之功效(參見例如WO2017/069628；其以引用之方式併入本文中)。靶向EGFR及LGR5之多特異性抗體顯示抑制腫瘤生長。此類抑制性抗體之效力顯示為與來自癌症之細胞的LGR5 RNA表現位準相關。如WO2017/069628中所描述之靶向EGFR及LGR5之多特異性抗體尤佳。
如本文所描述之抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物包含結合LGR5之胞外部分的可變區域。結合LGR5之胞外部分的可變區域較佳結合位於圖1之序列之胺基酸殘基21-118內的抗原決定基，該序列中胺基酸殘基D43；G44、M46、F67、R90及F91參與抗體與抗原決定基之結合。
LGR5可變區域較佳為一可變區域，其中LGR5中之胺基酸殘基取代D43A；G44A、M46A、F67A、R90A及F91A中之一或多者減弱可變區域與LGR5之結合。
LGR5之胞外部分上的抗原決定基較佳位於圖1之序列的胺基酸殘基21-118內。其較佳為一抗原決定基，其中LGR5可變區域與LGR5之結合藉由LGR5中之以下胺基酸殘基取代中之一或多者減弱：D43A；G44A、M46A、F67A、R90A及F91A。
本揭露內容進一步提供具有結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體，其中LGR5可變區域結合LGR5上位於圖1之序列之胺基酸殘基21-118內的抗原決定基。
LGR5上之抗原決定基較佳為構形抗原決定基。抗原決定基較佳位於圖1之序列的胺基酸殘基40-95內。抗體與LGR5之結合較佳經以下胺基酸殘基取代中之一或多者減弱：D43A；G44A、M46A、F67A、R90A及F91A。
在不受理論束縛的情況下，咸信如圖1中所描繪之LGR5的M46、F67、R90及F91為如上文所指示之可變區域的接觸殘基，亦即可變區域結合LGR5抗原決定基之抗原結合位點。胺基酸殘基取代D43A及G44A減弱抗體之結合可能歸因於此等殘基亦為接觸殘基，然而，亦有可能此等胺基酸殘基取代誘導LGR5中具有其他接觸殘基(亦即在位置46、67、90或91處)中之一或多者之部分之構形的(輕微)修改，且該構形變化使得抗體結合減弱。抗原決定基之特徵在於所提及之胺基酸取代。抗體是否結合相同抗原決定基可以各種方式確定。在例示性方法中，CHO細胞將LGR5表現於細胞膜，或丙胺酸取代突變體，較佳包含取代M46A、F67A、R90A或F91A中之一或多者的突變體。使測試抗體與CHO細胞接觸，且比較抗體與細胞之結合。若測試抗體結合至LGR5，且以較低程度結合至具有M46A、F67A、R90A或F91A取代之LGR5，則測試抗體結合抗原決定基。將與各自包含一個丙胺酸殘基取代之一組突變體的結合進行比較為較佳的。此類結合研究為此項技術中所熟知。通常該組包含覆蓋基本上所有胺基酸殘基之單一丙胺酸取代突變體。對於LGR5，該組僅需要覆蓋蛋白質之胞外部分，且當使用細胞時當然覆蓋保證與細胞膜締合之部分。特定突變體之表現可受到損害，但此容易藉由一或多種結合至(多種)不同區之LGR5抗體來偵測。若對於此等對照抗體，表現亦降低，則對於此特定突變體，膜上之蛋白質位準或摺疊受到損害。測試抗體與該組之結合特徵容易鑑別出測試抗體是否展現與具有M46A、F67A、R90A或F91A取代之突變體的結合減弱，且因此測試抗體是否為本發明抗體。與具有M46A、F67A、R90A或F91A取代之突變體的結合減弱亦鑑別出抗原決定基位於圖1之序列的胺基酸殘基21-118內。在一較佳實施例中，該組包括D43A取代突變體、G44A取代突變體或二者。具有MF5816之VH之VH序列的抗體展現與此等取代突變體之結合減弱。
在不受任何理論束縛的情況下，咸信如圖2描繪之胺基酸殘基I462；G465；K489；I491；N493；及C499參與由包含如上文所指示之可變區域的抗體結合抗原決定基。參與結合較佳藉由觀測可變區域與具有選自以下之胺基酸殘基取代中之一或多者之EGFR的結合減弱來確定：I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；及C499A。
在一個態樣中，結合人類EGFR之胞外部分上之抗原決定基的可變區域為結合位於圖2中所描繪之序列之胺基酸殘基420-480內之抗原決定基的可變區域。較佳地，可變區域與EGFR之結合藉由EGFR中之以下胺基酸殘基取代中之一或多者減弱：I462A；G465A；K489A；I491A；N493A；及C499A。抗體與人類EGFR之結合較佳干擾EGF與受體之結合。EGFR上之抗原決定基較佳為構形抗原決定基。在一個態樣中，抗原決定基位於圖2中所描繪之序列的胺基酸殘基420-480內，較佳位於圖2中所描繪之序列的430-480；較佳位於圖2中所描繪之序列的438-469內。
在不受理論束縛的情況下，咸信抗原決定基之接觸殘基，亦即可變區域接觸人類EGFR之位置可能為I462；K489；I491；及N493。胺基酸殘基G465及C499可能間接參與抗體與EGFR之結合。
結合人類EGFR之可變區域較佳為具有重鏈可變區的可變區域，該重鏈可變區包含至少如圖3中所描繪之MF3755之VH的CDR3序列，或與如圖3中所描繪之MF3755之VH的CDR3序列在至多三個，較佳至多二個，較佳不超過一個胺基酸中不同的CDR3序列。
結合人類EGFR之可變區域較佳為具有重鏈可變區之可變區域，該重鏈可變區包含至少如圖3中所描繪之MF3755之VH的CDR1、CDR2及CDR3序列；或具有至多三個，較佳至多二個，較佳至多一個胺基酸取代的如圖3中所描繪之MF3755之VH的CDR1、CDR2及CDR3序列。
結合人類EGFR之可變區域較佳為具有重鏈可變區之可變區域，該重鏈可變區包含如圖3中所描繪之MF3755之VH鏈的序列；或圖3中所描繪之MF3755之VH鏈的胺基酸序列，其相對於MF3755之VH鏈具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
在一個實施例中，本揭露內容提供包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體，
其中該可變區域之重鏈可變區包含至少選自由如圖3中所描繪之MF3370；MF3755；MF4280或MF4289組成之群的EGFR特異性重鏈可變區之CDR3序列，或其中該可變區域之重鏈可變區包含與選自由如圖3中所描繪之MF3370；MF3755；MF4280或MF4289組成之群的VH之CDR3序列在至多三個，較佳至多二個，較佳不超過一個胺基酸中不同的重鏈CDR3序列。該可變區域較佳包含有包含至少如圖3中所描繪之MF3370；MF3755；MF4280或MF4289之CDR3序列的重鏈可變區。
該可變區域較佳包含有包含至少選自由如圖3中所描繪之MF3370；MF3755；MF4280或MF4289組成之群的EGFR特異性重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區，或包含至少與選自由如圖3中所描繪之MF3370；MF3755；MF4280或MF4289組成之群的EGFR特異性重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3序列在至多三個，較佳至多二個，較佳至多一個胺基酸中不同的CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區。該可變區域較佳包含有包含至少如圖3中所描繪之MF3370；MF3755；MF4280或MF4289之CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區。較佳重鏈可變區為MF3755。另一較佳重鏈可變區為MF4280。
包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域，其中EGFR結合可變區域具有如上文所指示之CDR3，CDR1、CDR2及CDR3及/或VH序列的抗體較佳具有結合LGR5之可變區域，該可變區域包含至少選自由如圖3中所描繪之MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818組成之群的LGR5特異性重鏈可變區之CDR3序列，或與選自由如圖3中所描繪之MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818組成之群的VH之CDR3序列在至多三個，較佳至多二個，較佳不超過一個胺基酸中不同的重鏈CDR3序列。該可變區域較佳包含有包含至少如圖3中所描繪之MF5790；MF5803；MF 5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818之CDR3序列的重鏈可變區。
LGR5可變區域較佳包含重鏈可變區，其包含至少選自由如圖3中所描繪之MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818組成之群的LGR5特異性重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3序列，或與選自由如圖3中所描繪之MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818組成之群的LGR5特異性重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3序列在至多三個，較佳至多二個，較佳至多一個胺基酸中不同的重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。該可變區域較佳包含有包含至少如圖3中所描繪之MF5790；MF5803；MF5805；MF5808；MF5809；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818之CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區。較佳重鏈可變區為MF5790；MF5803；MF5814；MF5816；MF5817；或MF5818。尤佳重鏈可變區為MF5790；MF5814；MF5816；及MF5818；較佳MF5814、MF5818及MF5816，重鏈可變區MF5816尤佳。另一較佳重鏈可變區為MF5818。
已顯示當用於抑制EGFR配位體反應性癌症或細胞之生長時，包含一或多個具有重鏈可變區MF3755或其一或多個CDR之可變區域的抗體具有較好有效性。在雙特異性或多特異性抗體之情形下，包含具有重鏈可變區MF3755或其一或多個CDR之可變區域的抗體之臂與包含具有重鏈可變區MF5818或其一或多個CDR之可變區域的臂良好組合。
結合EGFR或LGR5之可變區域的VH鏈相對於圖3中所描繪之序列可具有一或多個胺基酸取代。VH鏈較佳具有圖3之EGFR或LGR5 VH的胺基酸序列，其相對於圖3之VH鏈序列具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
CDR序列相對於圖中之CDR序列可具有一或多個胺基酸殘基取代。此類一或多個取代例如出於最佳化目的而進行，較佳為了改良抗體之結合強度或穩定性。最佳化例如藉由突變誘發程序進行，其中較佳測試所得抗體之穩定性及/或結合親和力之後，較佳選擇改良之EGFR特異性CDR序列或LGR5特異性CDR序列。熟習此項技術者完全能夠產生包含至少一個改變的根據本發明之CDR序列的抗體變異體。舉例而言，可應用守恆的胺基酸取代。守恆的胺基酸取代之實例包括將一個疏水性殘基(諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸或甲硫胺酸)取代為另一疏水性殘基，且將一個極性殘基取代為另一極性殘基，諸如將精胺酸取代為離胺酸，麩胺酸取代為天冬胺酸或麩醯胺酸取代為天冬醯胺。
較佳地，如本文所指定之VH或VL中所提及的至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳1、2、3、4或5個胺基酸取代較佳為守恆的胺基酸取代。如本文所指定之VH或VL中之胺基酸插入、缺失及取代較佳不存在於CDR3區中。所提及之胺基酸插入、缺失及取代較佳亦不存在於CDR1及CDR2區中。所提及之胺基酸插入、缺失及取代較佳亦不存在於FR4區中。
所提及之至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳1、2、3、4或5個胺基酸取代較佳為守恆的胺基酸取代，插入、缺失、取代或其組合較佳不處於VH鏈之CDR3區中，較佳不處於VH鏈之CDR1、CDR2或CDR3區中，且較佳不處於FR4區中。
包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體較佳包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合；且
其中結合LGR5之可變區域的VH鏈包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5790的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5790的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體較佳包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合；且
其中結合LGR5之可變區域的VH鏈包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5803的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5803的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體較佳包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合；且
其中結合LGR5之可變區域的VH鏈包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5814的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5814的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體較佳包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合；且
其中結合LGR5之可變區域的VH鏈包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5816的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5816的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體較佳包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合；且
其中結合LGR5之可變區域的VH鏈包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5817的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5817的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體較佳包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合；且
其中結合LGR5之可變區域的VH鏈包含
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5818的胺基酸序列；或
-如圖3中所描繪之VH鏈MF5818的胺基酸序列，其相對於該VH具有至多15個，較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳具有1、2、3、4或5個胺基酸插入、缺失、取代或其組合。
所揭露之胺基酸序列保留EGFR或LGR5結合的額外變異體可獲自例如含有重排人類IGKVl-39/IGKJl VL區之噬菌體呈現庫(De Kruif等人Biotechnol Bioeng. 2010 (106)741-50)，及將胺基酸取代併入至本文所揭露之EGFR或LGR5 VH區之胺基酸序列中的VH區之集合，如先前所描述(例如WO2017/069628)。編碼結合EGFR或LGR5之Fab區的噬菌體可藉由流式細胞術選擇並分析，且經定序以鑑別具有保留抗原結合之胺基酸取代、插入、缺失或添加的變異體。
EGFR/LGR5抗體之VH/VL EGFR及LGR5可變區域的輕鏈可變區可相同或不同。在一些實施例中，EGFR/LGR5抗體之VH/VL EGFR可變區域的VL區類似於VH/VL LGR5可變區域的VL區。在某些實施例中，第一及第二VH/VL可變區域中之VL區相同。
在某些實施例中，EGFR/LGR5抗體之一或二個VH/VL可變區域的輕鏈可變區包含共同輕鏈可變區。在一些實施例中，一或二個VH/VL可變區域之共同輕鏈可變區包含生殖系IgVκ1-39可變區V段。在某一實施例中，一或二個VH/VL可變區域之輕鏈可變區包含κ輕鏈V段IgVκ1-39*01。IgVκ1-39為免疫球蛋白可變κ1-39基因之簡寫。該基因亦稱為免疫球蛋白κ可變1-39；IGKV139；IGKV1-39。基因外部Id為HGNC：5740；Entrez基因：28930；Ensembl：ENSG00000242371。適合V區之胺基酸序列提供於圖4中。V區可與五個J區中之一者組合。較佳J區為jk1及jk5，且接合序列指示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據IMGT資料庫全球資訊網imgt.org命名)。在某些實施例中，一或二個VH/VL可變區域之輕鏈可變區包含κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ1*05 (描述於圖4中)。
在一些實施例中，EGFR/LGR5雙特異性抗體之一或二個VH/VL可變區域的輕鏈可變區包含有包含胺基酸序列QSISSY之LCDR1 (描述於圖4中)、包含胺基酸序列AAS之LCDR2 (描述於圖4中)及包含胺基酸序列QQSYSTP之LCDR3 (描述於圖4中) (亦即，根據IMGT之IGKV1-39的CDR)。在一些實施例中，EGFR/LGR5抗體之一或二個VH/VL可變區域的輕鏈可變區包含有包含胺基酸序列QSISSY之LCDR1 (描述於圖4中)、包含胺基酸序列AASLQS之LCDR2 (描述於圖4中)及包含胺基酸序列QQSYSTP之LCDR3 (描述於圖4中)。
在一些實施例中，EGFR/LGR5抗體之一或二個VH/VL可變區域包含輕鏈可變區，其包含與圖4中所闡述之胺基酸序列至少90%，較佳至少95%，更佳至少97%，更佳至少98%，更佳至少99%一致或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，EGFR/LGR5抗體之一或二個VH/VL可變區域包含輕鏈可變區，其包含與圖4中所闡述之胺基酸序列至少90%，較佳至少95%，更佳至少97%，更佳至少98%，更佳至少99%一致或100%一致的胺基酸序列。
舉例而言，在一些實施例中，EGFR/LGR5抗體之一或二個VH/VL可變區域的可變輕鏈相對於圖4中之序列可具有0至10個，較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或其組合。在一些實施例中，EGFR/LGR5抗體之一或二個VH/VL可變區域的輕鏈可變區相對於指定胺基酸序列包含0至9、0至8、0至7、0至6、0至5、0至4，較佳0至3，較佳0至2，較佳0至1且較佳0個胺基酸插入、缺失、取代、添加或其組合。
在其他實施例中，EGFR/LGR5抗體之一或二個VH/VL可變區域的輕鏈可變區包含如圖4中所描繪之序列的胺基酸序列。在某些實施例中，EGFR/LGR5抗體之二個VH/VL可變區域包含相同的VL區。在一個實施例中，EGFR/LGR5雙特異性抗體之二個VH/VL可變區域的VL包含圖4中所闡述的胺基酸序列。在一個實施例中，EGFR/LGR5雙特異性抗體之二個VH/VL可變區域的VL包含圖4中所闡述的胺基酸序列。
如本文所描述之EGFR/LGR5抗體較佳為具有二個可變區域之雙特異性抗體，一個可變區域結合EGFR且另一可變區域結合LGR5，如本文所描述。用於本文所揭露之方法的EGFR/LGR5雙特異性抗體可以多種格式提供。此項技術中已知許多不同格式之雙特異性抗體，且其已由Kontermann (Drug Discov Today, 2015年7月;20(7):838-47；MAbs, 2012年3月-4月;4(2):182-97)及Spiess等人, (Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies. Mol. Immunol. (2015) http: //dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003)中評述，該等文獻各自以引用之方式併入本文中。舉例而言，並非具有二個VH/VL組合之典型抗體的雙特異性抗體格式具有至少一個包含重鏈可變區及輕鏈可變區之可變區域。此可變區域可連接至提供第二結合活性之單鏈Fv片段、單功能抗體(monobody)、VH及Fab片段。
在一些實施例中，本文提供之方法中所使用之EGFR/LGR5雙特異性抗體一般為人類IgG子類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在某些實施例中，抗體為人類IgG1子類。全長IgG抗體歸因於其有利的半衰期且出於低免疫原性之原因而較佳。因此，在某些實施例中，EGFR/LGR5雙特異性抗體為全長IgG分子。在一實施例中，EGFR/LGR5雙特異性抗體為全長IgG1分子。
因此，在某些實施例中，EGFR/LGR5雙特異性抗體包含可結晶片段(Fc)。EGFR/LGR5雙特異性抗體之Fc較佳由人類恆定區構成。EGFR/LGR5雙特異性抗體之恆定區或Fc可含有一或多個，較佳不超過10個，較佳不超過5個與天然存在之人類抗體恆定區的胺基酸差異。舉例而言，在某些實施例中，雙特異性抗體之Fab臂可進一步包括包含促進雙特異性抗體形成、促進穩定性及/或本文所描述之其他特徵之修飾的Fc區。
雙特異性抗體通常由表現編碼抗體之(多種)核酸的細胞產生。因此，在一些實施例中，本文所揭露之雙特異性EGFR/LGR5抗體藉由提供細胞產生，該細胞包含一或多種編碼雙特異性EGFR/LGR5抗體之重鏈及輕鏈可變區及恆定區的核酸。細胞較佳為動物細胞，更佳哺乳動物細胞，更佳靈長類動物細胞，最佳人類細胞。適合之細胞為能夠包含且較佳能夠產生EGFR/LGR5雙特異性抗體之任何細胞。
適用於抗體產生之細胞為此項技術中已知，且包括融合瘤細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞或PER-C6細胞。各種機構及公司已開發出用於大規模生產抗體之細胞株，例如用於臨床用途。此類細胞株之非限制性實例為CHO細胞、NS0細胞或PER.C6細胞。在一尤佳實施例中，該細胞為人類細胞。較佳地，細胞經腺病毒E1區或其功能等效物轉型。此類細胞株之較佳實例為PER.C6細胞株或其等效物。在一尤佳實施例中，該細胞為CHO細胞或其變異體。較佳地，變異體利用麩醯胺酸合成酶(GS)載體系統以便表現抗體。在一個較佳實施例中，細胞為CHO細胞。
在一些實施例中，細胞表現構成EGFR/LGR5雙特異性抗體之不同輕鏈及重鏈。在某些實施例中，細胞表現二種不同重鏈及至少一種輕鏈。在一個較佳實施例中，細胞表現如本文所描述之「共同輕鏈」以減少不同抗體物種(不同重鏈及輕鏈之組合)之數目。舉例而言，使用此項技術中已知的用於產生雙特異性IgG之方法(WO2013/157954；以引用之方式併入本文中)，將各別VH區與重排人類IGKV1 39/IGKJ1 (huVκ1 39)輕鏈一起選殖至表現載體中，該輕鏈先前顯示為能夠與超過一種重鏈配對，藉此產生具有多樣特異性之抗體，此促進雙特異性分子之產生(De Kruif等人J. Mol. Biol. 2009 (387) 548 58；WO2009/157771)。
表現共同輕鏈及等量的二條重鏈之抗體產生細胞通常產生50%雙特異性抗體及25%之單特異性抗體中之各者(亦即具有一致重輕鏈組合)。已公開數種方法以使雙特異性抗體之產生優先於各別單特異性抗體之產生。此通常藉由修飾重鏈之恆定區，使得相對於同二聚化，其有利於異二聚化(亦即，與另一重/輕鏈組合之重鏈二聚化)來達成。在一較佳實施例中，本發明之雙特異性抗體包含具有相容性異二聚化區域之二條不同的免疫球蛋白重鏈。此項技術中已描述各種相容性異二聚化區域。相容性異二聚化區域較佳為相容性免疫球蛋白重鏈CH3異二聚化區域。此項技術描述可達成重鏈之此類異二聚化的各種方式。
一種用於產生EGFR/LGR5雙特異性抗體之較佳方法揭露於US 9,248,181及US 9,358,286中。具體而言，基本上僅產生雙特異性全長IgG分子之較佳突變為在第一CH3區域中的胺基酸取代L351K及T366K (EU編號) (『KK變異體』重鏈)，及在第二區域中的胺基酸取代L351D及L368E (『DE變異體』重鏈)，或反之亦然。如先前所描述，DE變異體及KK變異體優先配對形成異二聚體(所謂的『DEKK』雙特異性分子)。DE變異體重鏈之同二聚化(DEDE同二聚體)或KK變異體重鏈之同二聚化(KKKK同二聚體)由於在一致重鏈之間CH3-CH3界面中帶電殘基之間的強斥力而幾乎不會發生。
因此，在一個實施例中，包含結合EGFR之可變區域的重鏈/輕鏈組合包含重鏈之DE變異體。在此實施例中，包含結合LGR5之可變區域的重鏈/輕鏈組合包含重鏈之KK變異體。
可使用任何適合之分析測試候選EGFR/LGR5 IgG雙特異性抗體之結合。舉例而言，可藉由流式細胞術(根據如先前在WO2017/069628中所描述之FACS程序)評定與CHO細胞上之膜表現EGFR或LGR5的結合。在一個實施例中，藉由根據此項技術中已知的標準程序進行的流式細胞術證明候選EGFR/LGR5雙特異性抗體與CHO細胞上LGR5之結合。將與CHO細胞之結合與尚未經EGFR及/或LGR5之表現卡匣轉染的CHO細胞進行比較。使用經EGFR表現構築體轉染之CHO細胞確定候選雙特異性IgG1與EGFR之結合；分析中包括LGR5單特異性抗體及EGFR單特異性抗體，以及不相關IgG1同型對照mAb作為對照(例如結合LGR5及諸如破傷風毒素(TT)之另一抗原的抗體)。
候選EGFR/LGR5雙特異性抗體之LGR5及EGFR Fab對其目標之親和力可使用BIAcore T100，藉由表面電漿子共振(SPR)技術量測。簡言之，將抗人類IgG小鼠單株抗體(Becton and Dickinson，目錄號555784)使用自由胺化學(NHS/EDC)偶聯至CM5感測器晶片之表面。隨後，將bsAb捕獲至感測器表面上。隨後，使重組純化抗原人類EGFR (Sino Biological Inc，目錄號11896-H07H)及人類LGR5蛋白以一定濃度範圍在感測器表面上流動且量測締合及解離速率。在各循環之後，藉由HCl脈衝使感測器表面再生且再次捕獲bsAb。根據所獲得之感測器圖譜，使用BIAevaluation軟體確定與人類LGR5及EGFR結合之締合及解離速率及親和力值，如先前在US 2016/0368988中針對CD3所描述。
如本文所揭露之抗體通常為雙特異性全長抗體，較佳為人類IgG子類，較佳為人類IgG1子類。此類抗體具有必要時可藉由此項技術中已知的技術增強的良好ADCC特性，在向人類活體內投與時具有有利半衰期，且存在CH3工程改造技術，其可提供在純系細胞中共表現時優先於同二聚體形成異二聚體的經修飾重鏈。
當抗體自身具有低ADCC活性時，可藉由對抗體恆定區進行修飾來改良抗體之ADCC活性。改良抗體之ADCC活性的另一方式為藉由酶干擾醣基化路徑，引起岩藻糖減少。存在數種用於確定抗體或效應細胞在引發ADCC方面之功效的活體外方法。其中有鉻-51 [Cr51]釋放分析、銪[Eu]釋放分析及硫-35 [S35]釋放分析。通常，將表現某一表面暴露抗原之標記目標細胞株與對該抗原具特異性之抗體一起培育。在洗滌之後，將表現Fc受體CD16之效應細胞與經抗體標記之目標細胞共培育。隨後藉由閃爍計數器或分光光度法由胞內標記之釋放來量測目標細胞溶解。
如本文所揭示之雙特異性抗體可經ADCC增強。在一個實施例中，雙特異性抗體可為去岩藻醣基化的。當與正常CHO細胞中產生之相同抗體相比時，雙特異性抗體較佳在Fc區中包含降低量之N連接碳水化合物結構的岩藻醣基化。
包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體可進一步包含一或多個可結合一或多個其他目標之額外可變區域。其他目標較佳為蛋白質，較佳包含胞外部分之膜蛋白。如本文所用之膜蛋白為細胞膜蛋白，諸如處於細胞外膜，亦即將細胞與外部世界分離之膜中的蛋白質。膜蛋白具有胞外部分。若膜蛋白含有處於細胞之細胞膜中的跨膜區，則膜蛋白至少處於細胞上。
具有超過二個可變區域之抗體為此項技術中已知。舉例而言，有可能將額外可變區域連接至抗體之恆定部分。具有三個或更多個可變區域之抗體較佳為如PCT/NL2019/050199中所描述之多價多聚體抗體，該專利以引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，抗體為包含二個可變區域之雙特異性抗體，其中一個可變區域結合EGFR之胞外部分且另一可變區域結合LGR5之胞外部分。可變區域較佳為如本文所描述之可變區域。
如本文所描述之抗體的功能性部分包含至少如本文所描述之結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域。因此，其包含如本文所描述之抗體的抗原結合部分，且通常含有抗體之可變區域。功能性部分之可變區域可為單鏈Fv片段或所謂的單區域抗體片段。單區域抗體片段(sdAb)為具有單一單體可變抗體區域之抗體片段。與完整抗體相同，其能夠選擇性結合至特異性抗原。單區域抗體片段之分子量僅為12-15 kDa，比由二條重蛋白鏈及二條輕鏈構成的常見抗體(150-160 kDa)小得多，且甚至小於Fab片段(約50 kDa，一條輕鏈及半條重鏈)及單鏈可變片段(約25 kDa，二個可變區域，一個來自輕鏈且一個來自重鏈)。單區域抗體本身不比正常抗體小很多(通常為90-100 kDa)。單區域抗體片段主要由駱駝中發現之重鏈抗體工程改造得到；此等片段稱為VHH片段(Nanobodies®)。一些魚亦具有僅含重鏈之抗體(IgNAR，『免疫球蛋白新抗原受體』)，由該等抗體可獲得稱為VNAR片段之單區域抗體片段。一種替代方法係將來自人類或小鼠之常見免疫球蛋白G (IgG)的二聚體可變區域分裂成單體。儘管當前針對單區域抗體之大多數研究基於重鏈可變區域，但亦顯示衍生自輕鏈之奈米抗體特異性結合至目標抗原決定基。抗體部分之此類可變區域的非限制性實例為VHH、人類區域抗體(dAb)及單抗體(Unibody)。較佳抗體部分或衍生物具有抗體之至少二個可變區域或其等效物。此類可變區域或其等效物之非限制性實例為F(ab)片段及單鏈Fv片段。雙特異性抗體之功能性部分包含雙特異性抗體之抗原結合部分，或結合部分之衍生物及/或類似物。如上文所提及，抗體之結合部分涵蓋在可變區域中。
亦提供如本文所揭示之抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物(亦即，治療化合物)及醫藥學上可接受之載劑。此類醫藥組合物適用於治療癌症，尤其適用於治療胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂由政府管理機構批准或在美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或另一公認藥典中列出用於動物，尤其人類，且包括生理相容之任何及所有溶劑、鹽、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。術語「載劑」係指與化合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、甘油蓖麻醇酸酯及其類似物。可採用水或生理食鹽水溶液以及右旋糖及甘油水溶液作為載劑，尤其對於可注射溶液而言。用於非經腸投與之液體組合物可調配用於藉由注射或連續輸注投與。藉由注射或輸注之投與途徑包括膀胱內、瘤內、靜脈內、腹膜內、肌內、鞘內及皮下。視投與途徑(例如靜脈內、皮下、關節內及其類似者)而定，可將活性化合物包覆於保護化合物不受酸作用及可使化合物失活之其他天然條件影響的物質中。
適合於向人類患者投與之醫藥組合物通常經調配用於非經腸投與，例如在液體載劑中或適合於復原成用於靜脈內投與之液體溶液或懸浮液。組合物可以單位劑型調配以易於投與且使劑量均一。亦包括意欲在使用之前即刻轉化為用於經口或非經腸投與之液體製劑的固體製劑。此類液體形式包括溶液、懸浮液及乳液。
所揭露之治療化合物可根據適合劑量及適合途徑(例如靜脈內、腹膜內、肌內、鞘內或皮下)投與。舉例而言，可投與單次推注，可隨時間投與數個分次劑量，或可如治療情況之緊急需要所指示而按比例減少或增加劑量。在一個實施例中，個體投與單次劑量之如本文所揭露之抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物。在一些實施例中，治療化合物將在治療過程中反覆投與。舉例而言，在某些實施例中，向需要治療之個體投與多次(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10次或跟多次)劑量之治療化合物。在一些實施例中，治療化合物之投與可每週、每二週或每月進行一次。
臨床醫師可利用適合於所治療之患者病狀的較佳劑量。劑量可視多種因素而定，包括疾病階段等。基於一或多種此類因素之存在來確定應投與之特定劑量在技術人員之技術範圍內。一般而言，治療始於比化合物之最佳劑量小的較小劑量。其後，少量增加劑量，直至達至在該等情況下之最佳效果。為方便起見，必要時，可將總日劑量分次且在一天期間以數份之形式投與。亦可使用間歇療法(例如三週中之一週或四週中之三週)。
在某些實施例中，以0.1、0.3、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10毫克/公斤體重之劑量投與治療化合物。在另一實施例中，以0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10毫克/公斤體重之劑量投與治療化合物。
在一較佳實施例中，以1500 mg之劑量向個體提供治療化合物(亦即，包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物)。固定劑量提供優於體表或體重給藥之數種優點，因為其縮短製備時間且減少潛在劑量計算錯誤。在一些實施例中，以至少1100 mg之劑量，較佳以1100至2000 mg之間的劑量，更佳以1100至1800 mg之間的劑量提供治療化合物。如熟習此項技術者所理解，劑量可隨時間推移投與。舉例而言，劑量可藉由IV投與，例如以1-6小時輸注，較佳2-4小時輸注投與。在一些實施例中，治療化合物每2週投與一次。在一些實施例中，本文所揭露之固定劑量適用於成人及/或體重為至少35 kg之個體。較佳地，個體罹患胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。
在一些實施例中，可使用前置用藥(premedication)方案。此類方案可適用於降低輸液相關之反應的似然度或嚴重程度。一般而言，在抗體治療之前投與(例如經口、靜脈內)類固醇，諸如地塞米松(dexamethasone)及/或抗組織胺，諸如右氯菲安明(dexchlorpheniramine)、苯海拉明(diphenhydramine)或氯芬尼拉明(chlorpheniramine)。
本文所描述之治療方法通常持續，只要監管患者護理之臨床醫師認為治療方法有效，亦即患者對治療有反應即可。指示治療方法有效之非限制性參數可包括以下中之一或多者：腫瘤細胞減少；腫瘤細胞增殖抑制；腫瘤細胞消除；無進展存活期；適合腫瘤標記物(若適用)之適當反應。
關於投與治療化合物之頻率，一般熟習此項技術者將能夠確定適當頻率。舉例而言，臨床醫師可決定相對不頻繁地(例如每二週一次)投與治療化合物，且逐漸縮短患者所耐受之劑量之間的時間段。與根據所主張之方法的療法過程相關的例示性時間長度包括：約一週；二週；約三週；約四週；約五週；約六週；約七週；約八週；約九週；約十週；約十一週；約十二週；約十三週；約十四週；約十五週；約十六週；約十七週；約十八週；約十九週；約二十週；約二十一週；約二十二週；約二十三週；約二十四週；約七個月；約八個月；約九個月；約十個月；約十一個月；約十二個月；約十三個月；約十四個月；約十五個月；約十六個月；約十七個月；約十八個月；約十九個月；約二十個月；約二十一個月；約二十二個月；約二十三個月；約二十四個月；約三十個月；約三年；約四年；約五年；永久(例如持續存在之維持療法)。前述持續時間可能與一或多輪/週期之治療相關。
可使用任何適合手段評定本文所提供之治療方法的功效。在一個實施例中，使用癌細胞數目減少作為客觀反應標準來分析治療之臨床功效。根據本文所揭露之方法治療之患者(例如人類)較佳經歷至少一種癌症病徵的改善。在一些實施例中，可出現以下中之一或多者：癌細胞之數目可減少；癌症復發經預防或延遲；一或多種與癌症相關之症狀可在一定程度上得到緩解。另外，活體外分析以確定T細胞介導之目標細胞溶解。在一些實施例中，腫瘤評定基於CT掃描及/或MRI掃描，參見例如RECIST 1.1指南(實體腫瘤反應評估準則(Response Evaluation Criteria in Solid Tumours)) (Eisenhauer等人, 2009 Eur J Cancer 45:228-247)。此類評定一般在治療後每4-8週進行。
在一些實施例中，在如本文所描述之治療後腫瘤細胞不再可偵測。在一些實施例中，個體處於部分或完全緩解。在某些實施例中，個體之總存活期、中值存活率及/或無進展存活期增加。
治療化合物(亦即，包含結合EGFR之胞外部分的可變區域及結合LGR5之胞外部分的可變區域的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物)亦可與因針對所治療之癌症的特定有用性而選擇的其他熟知療法(例如化學療法或放射療法)一起使用。
安全且有效投與化學治療劑之方法為熟習此項技術者所知。另外，其投與描述於標準文獻中。舉例而言，許多化學治療劑之投與描述於Physicians' Desk Reference (PDR)，例如1996版(Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)中；其揭露內容以引用之方式併入本文中。
熟習此項技術者將顯而易見，(多種)化學治療劑及/或放射療法之投與可視所治療之疾病及(多種)化學治療劑及/或放射療法對該疾病之已知作用而變化。此外，根據熟練臨床醫師之知識，治療方案(例如劑量及投與時間)可鑒於觀測到的所投治療劑對患者之作用且鑒於觀測到的疾病對所投治療劑之反應而變化。
本文所揭露之化合物及組合物適用作療法且適用於治療性治療，且因此可適用作藥劑且用於製備藥劑之方法。
本文所描述之所有文件及參考文獻，包括Genbank條目、專利及公開專利申請案及網站各自明確地以引用之方式併入本文中，其程度就如同完整或部分地編寫在本文件中一般。
出於清楚且簡潔描述之目的，特徵在本文中描述為相同或獨立實施例之一部分，然而，應瞭解，本發明之範疇可包括具有所描述特徵中之全部或一些之組合的實施例。
本發明現參考以下實例描述，該等實例僅為說明性的，且不意欲限制本發明。雖然已參考本發明之特定實施例詳細描述本發明，但對熟習此項技術者而言將顯而易見，可在不偏離本發明之精神及範疇的情況下對本發明作出各種改變及修改。
實例
如本文所用，其中X獨立地為數字0-9之「MFXXXX」係指包含可變區域之Fab，其中VH具有由圖3中所描繪之4位阿拉伯數字鑑別之胺基酸序列。除非另外指示，否則可變區域之輕鏈可變區通常具有圖4b之序列。實例中之輕鏈具有如圖4a中所描繪之序列。「MFXXXX VH」係指由4位阿拉伯數字鑑別之VH的胺基酸序列。MF進一步包含輕鏈之恆定區及通常與輕鏈之恆定區相互作用的重鏈之恆定區。重鏈之VH/可變區不同，且通常CH3區亦不同，其中重鏈中之一者的CH3區域具有KK突變且另一者的CH3區域具有互補DE突變(參見PCT/NL2013/050294 (公開為WO2013/157954)及圖5d及5e供參考。實例中之雙特異性抗體具有如圖5中所指示之具有KK/DE CH3異二聚化區域之Fc尾、CH2區域及CH1區域，如圖4a中所指示之共同輕鏈及如MF數字所指定之VH。舉例而言，由MF3755×MF5816指示之雙特異性抗體具有以上通用序列，及具有具MF3755之序列之VH的可變區域及具有具MF5816之序列之VH的可變區域。
各種重鏈可變區(VH)之胺基酸及核酸序列在圖3中指示。雙特異性抗體EGFR/LGR5，MF3755×MF5816；包含重鏈可變區MF3755及MF5816及共同輕鏈，且包括由去岩藻醣基化增強ADCC之修飾，以及如圖3中所描繪之其他LGR5及EGFR組合已在WO2017/069628中顯示為有效。雙特異性抗體之產生
使用專用CH3工程改造技術以確保有效異二聚化及雙特異性抗體形成，藉由用二個編碼具有不同VH區域之IgG的質體短暫共轉染來產生雙特異性抗體。亦將共同輕鏈在同一質體或另一質體上共轉染於同一細胞中。在吾人之申請案(例如WO2013/157954及WO2013/157953，以引用之方式併入本文中)中，吾人已揭露用於自單個細胞產生雙特異性抗體之方法及手段，其中提供使雙特異性抗體形成優先於單特異性抗體形成之手段。此等方法亦可有利地用於本發明中。具體而言，基本上僅產生雙特異性全長IgG分子之較佳突變為在第一CH3區域中位置351及366處之胺基酸取代，例如L351K及T366K (根據EU編號進行編號) (『KK變異體』重鏈)，及在第二CH3區域中位置351及368處之胺基酸取代，例如L351D及L368E (『DE變異體』重鏈)，或反之亦然(參見圖5d及5e)。先前在所提及之申請案中證明帶負電之DE變異體重鏈及帶正電之KK變異體重鏈優先配對形成異二聚體(所謂的『DEKK』雙特異性分子)。DE變異體重鏈之同二聚化(DE-DE同二聚體)或KK變異體重鏈之同二聚化(KK-KK同二聚體)由於在一致重鏈之間CH3-CH3界面中帶電殘基之間的強斥力而幾乎不會發生。
將上文所描述之結合LGR5之可變區域的VH基因選殖至編碼帶正電之CH3區域的載體中。將結合EGFR之可變區域的VH基因，諸如WO 2015/130172 (以引用之方式併入本文中)中所揭示之彼等選殖至編碼帶負電之CH3區域的載體中。在搖動器平台上在T125燒瓶中培育懸浮生長調適之293F Freestyle細胞，直至密度為3.0×10e6個細胞/毫升。將細胞以0.3-0.5×10e6個活細胞/毫升之密度接種在24深孔盤之各孔中。將細胞用二種編碼不同抗體、選殖於專用載體系統中之質體的混合物短暫轉染。轉染後七天，收集細胞上清液且經由0.22 μM過濾器(Sartorius)過濾。將無菌上清液儲存在4℃下，直至進行抗體純化。IgG 純化及定量
在無菌條件下在過濾盤中使用蛋白A親和層析進行純化。首先，將培養基之pH調節至pH 8.0，且隨後將含IgG上清液與蛋白A瓊脂糖凝膠CL-4B珠粒(50% v/v) (Pierce)一起在搖動平台上在600 rpm下在25℃下培育2小時。接下來，藉由過濾收集珠粒。用PBS pH 7.4洗滌珠粒二次。隨後，在pH 3.0下用0.1 M檸檬酸鹽緩衝液溶析經結合IgG，且緊接著使用Tris pH 8.0中和溶析液。藉由使用multiscreen Ultracel 10多盤(Millipore)離心來進行緩衝液交換。最後，在PBS pH 7.4中收集樣品。使用Octet量測IgG濃度。將蛋白質樣品儲存在4℃下。
為確定純化IgG之量，使用蛋白A生物感測器(Forte-Bio，根據供應商建議)，使用全人類IgG (Sigma Aldrich，目錄號I4506)作為標準品藉助於Octet分析確定抗體濃度。
以下雙特異性抗體適用於此實例且適用於本發明之方法：MF3370×MF5790、MF3370×5803、MF3370×5805、MF3370×5808、MF3370×5809、MF3370×5814、MF3370×5816、MF3370×5817、MF3370×5818、MF3755×MF5790、MF3755×5803、MF3755×5805、MF3755×5808、MF3755×5809、MF3755×5814、MF3755×5816、MF3755×5817、MF3755×5818、MF4280×MF5790、MF4280×5803、MF4280×5805、MF4280×5808、MF4280×5809、MF4280×5814、MF4280×5816、MF4280×5817、MF4280×5818、MF4289×MF5790、MF4289×5803、MF4289×5805、MF4289×5808、MF4289×5809、MF4289×5814、MF4289×5816、MF4289×5817及MF4289×5818。各雙特異性抗體包含二個分別能夠結合EGFR及LGR5之由MF編號指定的VH，進一步包含具有分別如由SEQ ID NO: 136 (圖5d)及SEQ ID NO: 138 (圖5e)指示之KK/DE CH3異二聚化區域的Fc尾，如由SEQ ID NO: 134 (圖5c)指示之CH2區域以及如由SEQ ID NO:131 (圖5a)指示之CH1區域，如由SEQ ID NO: 121 (圖4)指示之共同輕鏈。實例1 ： 抗EGFR× 抗LGR5 候選物針對各種癌症之評估 ： 小鼠模型選擇
Crown Biosciences Inc.已開發一系列衍生自以手術方式切除之人類原發性腫瘤的患者源異種移植物(PDX)模型(Crown Bioscience資料庫，http://hubase.crownbio.com)。PDX模型經臨床及分子標註且如實代表各別腫瘤之臨床流行病學。此等模型可皮下注射於免疫缺乏小鼠之側腹中。測試不同癌症模型之EGFR及LGR5表現，如藉由RNA定序(RNAseq)進行分析(參見表 1
)。選擇發現展現高EGFR及LGR5表現位準的一組食道癌及胃癌PDX模型，以測試MF3755×MF5816雙特異性抗體之功效。對於食道癌，選擇4種PDX模型，且對於胃癌，選擇8種PDX模型。PDX模型之詳細資訊，包括癌症次型、已知驅動突變、EGFR/LGR5表現及達至隨機化之時間描述於(表 1
)中。表 1
源自食道癌及胃癌患者之PDX
模型的特徵。
藉由RNA定序(RNAseq)確定LGR5及EGFR表現。藉由基因體分析確定致癌驅動子之突變狀態。亦提及達至隨機化(平均腫瘤達到大致100-150 mm3
時)之時間，以及腫瘤之生長特徵。ESCC=食道鱗狀細胞癌；EAC=食道腺癌；ADC=腺癌；N/A=不可用或不適用。
方法
| 模型 | 次型 | 已知突變 | EGFR表現 | LGR5表現 | 達至隨機化之時間 | 生長特徵 |
| 癌症類型：食道癌 | ||||||
| ES0042 | ESCC | TP53 - R196T | 6.3346 | 3.6394 | 約14-24天 | 潰瘍 |
| ES0199 | ESCC | TP53 - R342T； MLH1 - V384D | 7.0919 | 2.5491 | 約18-40天 | |
| ES0201 | ESCC | PIK3CA - E545K | 5.7606 | 1.8863 | 約18-46天 | |
| ES2356 | ESCC | TP53 - R248Q； PIK3CA- H1047R； CDKN2A-W110T； UGT1A1 - G71R； UGT1A8- G71R | 7.0124 | 3.2865 | 約62天 | |
| ES11065 | ESCC | ATM - W57T | 4.5 | 4.2 | ||
| 癌症類型：胃癌 | ||||||
| GA0429 | ADC | 4.3486 | 4.4366 | 約22天 | 惡病質 | |
| GA2434 | ADC | BRAF - V600E； PTEN - R130Ter | 3.4811 | 5.1645 | 約30天 | |
| GA6212 | ADC | KRAS - G12C； UGT1A1 - G71R； UGT1A8- G71R | 4.9772 | 3.3944 | 約29天 | 潰瘍 |
| GA6822 | ADC | UGT1A1 - G71R； UGT1A8- G71R | 3.9165 | 3.9266 | 約22天 | |
| GA6833 | ADC | PIK3CA - E545K； UGT1A1 - G71R； UGT1A8- G71R | 4.1009 | 5.4768 | 約25-45天 | |
| GA6864 | N/A | 9.2291 | 3.5282 | 約25-45天 | 潰瘍 | |
| GA6891 | ADC | UGT1A1 - G71R； UGT1A8- G71R | 3.8613 | 6.1634 | 約30天 | |
| GA3236 | ADC | UGT1A1 - G71R； UGT1A8- G71R | 4.047 | 6.027 | 約10-14天 |
自帶有已建立之原發性人類腫瘤的小鼠收集用於接種之新鮮腫瘤組織。視模型而定，將腫瘤碎片(直徑2-3 mm)皮下接種於6-8週齡雌性BALB/c裸鼠或NOD/SCID小鼠之右上背側。當腫瘤達到100-150 mm3
大小時，將小鼠隨機分組。每個模型登記總共6隻小鼠，3隻對照小鼠及3隻經MF3755×MF5816雙特異性抗體治療之小鼠。持續6週，小鼠以200 µl注射體積腹膜內接受0.5 mg雙特異性抗體/週(大約25 mg/kg/週)，不管其體重如何。對照小鼠接受PBS (200 µl)。在6週治療期之後，再監測腫瘤生長3週。若小鼠達到人道終點，則將其早於63天處死。結果：
在所測試之8種胃PDX模型中，MF3755×MF5816雙特異性抗體治療顯著減少6種模型中之腫瘤生長(圖6a)。在此等8種模型中，3種模型(GA0429、GA6833及GA6891)在觀測期結束時顯示比治療開始時更低的腫瘤體積，表明雙特異性抗體在胃癌中之強腫瘤抑制作用。模型GA2434給出某些反應。關於食道PDX模型，所有四種測試模型對雙特異性抗體治療起反應，模型ES2356反應最強(圖6b)。在模型ES11065之情況下獲得利用此實例之MF3755×MF5816雙特異性抗體得到的顯示統計顯著(p ＜0.0001)治療功效的結果。實例2 ： 針對患有EAC 、GAC 及GEJAC 之患者的抗EGFR× 抗LGR5 抗體之劑量擴增及功效 ： 晚期實體腫瘤中之 1 期劑量遞增研究
研究設計
進行1期開放標記多中心研究，其具有初始劑量遞增部分以確定抗EGFR×抗LGR5雙特異性抗體針對mCRC患者中之實體腫瘤的建議2期劑量(RP2D)，起始劑量為5 mg固定劑量。一旦建立RP2D，則在研究之擴增部分中，包括在診斷患有EAC、GAC及GEJAC之患者中進一步評估抗體。在所有患者中對抗體之安全性、PK、免疫原性及初步抗腫瘤活性進行表徵，且進行生物標記物分析，包括EGFR及LGR5狀態。
劑量遞增
在劑量遞增部分中，治療患有轉移性大腸直腸癌(mCRC)腺癌之患者，該等患者先前在轉移性背景下用標準經批准療法治療，該療法包括奧沙利鉑(oxaliplatin)、伊立替康及氟嘧啶(5-FU及/或卡培他濱(capecitabine))，伴隨或不伴隨抗血管新生劑及針對KRAS及NRAS野生型RASwt的抗EGFR。
基於來自初步及GLP食蟹獼猴毒理學研究之可用雙特異性抗體血清濃度資料，產生PK模型。在異速增長模型推算(allometric scaling)之後，使用此模型來預測人類中之抗體暴露。抗體起始劑量為每2週5 mg (固定劑量) IV，具有4週週期。將研究高達11種劑量位準：5、20、50、90、150、225、335、500、750、1100及1500 mg (固定劑量)。各患者及各組之投與劑量、劑量增量及給藥頻率基於患者安全性、PK及PD資料經受變化，然而，劑量將不會超過每週期4500 mg。
劑量限制性毒性(DLT)
在第一週期(28天)期間發生且被研究者視為與抗體治療相關的以下臨床毒性及/或實驗室異常中之任一者將視為DLT：
• 血液學毒性：
- 4級嗜中性白血球減少症(絕對嗜中性白血球計數[ANC] ＜0.5×109個細胞/公升)，持續≥7天
- 3-4級發熱性嗜中性白血球減少症
- 4級血小板減少症
- 與出血發作相關之3級血小板減少症
- 其他4級血液學毒性
• 3-4級非血液學AE及實驗室毒性，以下除外：
- 3-4級輸注相關反應
- 在最佳治療之情況下在2週內恢復至≤2級的3級皮膚毒性
- 在最佳治療之情況下在3天內恢復至≤1級或基線的3級腹瀉、噁心及/或嘔吐
- 在最佳治療之情況下在48小時內消退的3級電解質異常
- 持續≤48小時的3-4級肝臟異常
• 符合海氏法則(Hy's law)定義之任何肝功能異常。
• 阻止接下來二次投與之持續≥15天的任何藥物相關毒性。
劑量擴增
在擴增部分中，將在患有EAC、GAC或GEJAC之患者中與RP2D投與雙特異性抗體。一旦已確定RP2D，則將用此劑量及排程治療額外患者，以進一步表徵抗體之安全性、耐受性、PK及免疫原性，且進行抗腫瘤活性及生物標記物評估之初步評定。所治療之惡性疾病將已知共表現二種目標(亦即LGR5及EGFR)，且可具有對EGFR抑制之敏感性的先前跡象。
將探索患有EAC、GAC或GEJAC之患者中的抗體治療，例如各適應症10至20名患者，以初步抗腫瘤活性之徵象為條件，可能擴增至40名患者)。在研究之擴增部分期間，將由安全監測委員會(Safety Monitoring Committee)持續評估RP2D之安全性。若對於任何組，DLT發生率超過預定義臨限值33%，則將暫停此組之登記且將由SMC進行對安全性、PK及生物標記物的全面審查，以便判定在該組中繼續累積是否安全。屆時亦將詢問藥物之整體安全性。
研究性療法及方案
抗EGFR×抗LGR5雙特異性抗體調配為用於IV輸注之透明溶液。使用標準輸注程序每2週進行IV輸注，起始劑量為5 mg (固定劑量)，且建議2期劑量為1500 mg (固定劑量)。一旦達到RP2D，則中止劑量遞增。在第1週期期間，必須歷時最小4小時投與輸注。在研究者判斷下且在不存在IRR之情況下，第1週期之後的後續輸注可縮短至2小時。
週期視為4週。對於各患者，在初始抗體輸注之輸注開始之後實施6小時觀測期，第二輸注實施4小時觀測期，且所有後續投與最小2小時觀測期，對應於至少輸注持續時間。每2週以2至4小時IV輸注投與抗體，週期為4週。後續週期之第1天在第29天，或在自與前一週期相關之任何不良效應恢復之後。
治療持續時間
投與研究治療直至確認進行性疾病(按照RECIST 1.1)、不可接受之毒性、撤回同意、患者不順應、研究者決定(例如臨床惡化)或抗體中斷＞連續6週。在最後一次抗體輸注之後，針對安全性隨訪患者至少30天且直至所有相關毒性恢復或穩定為止，且針對疾病進展及存活狀態隨訪患者12個月。
功效評定
在治療開始後每8週，腫瘤評定基於CT/MRI根據RECIST 1.1對比(Eisenhauer等人, 2009 Eur J Cancer 45:228-247)。客觀反應必須在首次觀測之後至少4週確認。如臨床指示對基線時患有骨轉移或研究中具有疑似病變之患者進行骨掃描。在篩選時及各週期之第1天評估循環血液腫瘤標記物，包括癌胚抗原(CEA)。
無
圖1人類LGR5序列；序列ID NO: 1。
圖2人類EGFR序列；序列ID NO: 2。
圖3a-3c (a)重鏈可變區之胺基酸序列(序列ID No: 3-15)，其與共同輕鏈可變區(諸如人類κ輕鏈IgVκ1 39*01/IGJκ1*01)一起形成結合LGR5及EGFR之可變區域。CDR及構架區在圖3b中指示。各別DNA序列在圖3c中指示。
圖4a-4e a)共同輕鏈胺基酸序列之胺基酸序列。b)共同輕鏈可變區DNA序列及轉譯(IGKV1-39/jk1)。c)輕鏈恆定區DNA序列及轉譯。d) V區IGKV1-39A；e)根據IMGT編號，共同輕鏈之CDR1、CDR2及CDR3。
圖5a-5e用於產生-雙特異性分子之IgG重鏈。a) CH1區DNA序列及轉譯。b)鉸鏈區DNA序列及轉譯。c) CH2區DNA序列及轉譯。d)含有變異L351K及T366K (KK)DNA序列之CH3區域及轉譯。e)含有變異L351D及L368E (DE)DNA序列之CH3區域及轉譯。殘基位置係根據EU編號。
圖6a-6b資料顯示a)胃PDX模型及b)食道PDX模型中之平均腫瘤大小，誤差杠為SEM。使用二因子變異數分析(Two-way ANOVA)檢定來計算給定時間點處之統計顯著性。ADC=腺癌。SCC=鱗狀細胞癌。灰色區表示治療期。
(無)
Claims (30)
- 一種抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其包含結合EGFR之一胞外部分的一可變區域及結合LGR5之一胞外部分的一可變區域，供使用於治療一個體之癌症，其中該使用包含向該個體提供具1500 mg該抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之一固定劑量。
- 一種抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其包含結合EGFR之一胞外部分的一可變區域及結合LGR5之一胞外部分的一可變區域，供使用於治療一個體之胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。
- 一種抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其包含結合EGFR之一胞外部分的一可變區域及結合LGR5之一胞外部分的一可變區域，供使用於治療一Her2陰性個體之胃癌、食道癌或胃-食道接合部癌。
- 如請求項2或3之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該使用包含向該個體提供具1500 mg該抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之一固定劑量。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物經靜脈內提供。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症在一或多種選自以下之基因中具有一突變：TP53、MLH1、PIK3CA、CDKN2A、UGT1A、UGT1A8、BRAF、PTEN及KRAS，較佳其中該癌症在一或多種選自以下之基因中具有一突變：TP53、MLH1、CDKN2A、UGT1A、UGT1A8、BRAF及PTEN。
- 如請求項6之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症具有一或多種選自以下之突變：TP53 R196T；TP53 R342T；TP53 R248Q；MLH1 V384D；PIK3CA H1047R；CDKN2A W110T；UGT1A1 G71R；UGT1A8 G71R；及KRAS G12C。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之投與為每週一次、每二週一次或每月一次。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物之投與為每2週一次。
- 如請求項6之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症在編碼TP53之基因中具有一突變，較佳其中該突變為R196T。
- 如請求項6之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症在編碼TP53之基因中具有一突變，較佳其中該突變為R342T，且該癌症在編碼MLH1之基因中具有一突變，較佳其中該突變為V384D。
- 如請求項6之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症在編碼TP53之基因中具有一突變，較佳其中該突變為R248Q；該癌症在編碼PIK3CA之基因中具有一突變，較佳其中該突變為H1047R；該癌症在編碼CDKN2A之基因中具有一突變，較佳其中該突變為W110T；該癌症在編碼UGT1A1之基因中具有一突變，較佳其中該突變為G71R；且該癌症在編碼UGT1A8之基因中具有一突變，較佳其中該突變為G71R。
- 如請求項1至12中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症為食道癌，較佳食道鱗狀細胞癌(ESCC)。
- 如請求項6之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症為在選自UGT1A1、UGT1A8及/或PIK3CA之一基因中具有一突變之一胃癌。
- 如請求項6之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症在編碼KRAS之基因中具有一突變，較佳其中該突變為G12C；該癌症在編碼UGT1A1之基因中具有一突變，較佳其中該突變為G71R；且該癌症在編碼UGT1A8之基因中具有一突變，較佳其中該突變為G71R。
- 如請求項2之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症在編碼UGT1A1之基因中具有一突變，較佳其中該突變為G71R，且該癌症在編碼UGT1A8之基因中具有一突變，較佳其中該突變為G71R。
- 如請求項10之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症進一步在PIK3CA中具有一突變，較佳其中該突變為E545K。
- 如請求項1至17中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該癌症為胃癌。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中結合EGFR之該可變區域之一VH鏈包含如圖3中所描繪之VH鏈MF3755的胺基酸序列；或在如圖3中所描繪之VH鏈MF3755中相對於該VH具有至多15個，較佳不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個且較佳具有不超過5、4、3、2或1個包括插入、缺失、取代或其一組合之胺基酸修飾的胺基酸序列；且其中結合LGR5之該可變區域之一VH鏈包含如圖3中所描繪之VH鏈MF5816的胺基酸序列；或在如圖3中所描繪之VH鏈MF5816中相對於該VH具有至多15個，較佳不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個且較佳具有不超過5、4、3、2或1個包括插入、缺失、取代或其一組合之胺基酸修飾的胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中結合LGR5之該可變區域結合位於圖1中所描繪之人類LGR5序列之胺基酸殘基21-118內的一抗原決定基。
- 如請求項20之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中人類LGR5之位置43、44、46、67、90及91處之胺基酸殘基參與LGR5結合可變區域與LGR5之結合。
- 如請求項20或21之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該LGR5結合可變區域與包含選自43A、44A、46A、67A、90A及91A之胺基酸殘基變異中之一或多者之一LGR5蛋白的結合較弱。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中結合EGFR之該可變區域結合位於圖2中所描繪之人類EGFR序列之胺基酸殘基420-480內的一抗原決定基。
- 如請求項23之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中人類EGFR之位置I462、G465、K489、I491、N493及C499處之胺基酸殘基參與EGFR結合可變區域與EGFR之結合。
- 如請求項23或24之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該EGFR結合可變區域與包含選自I462A、G465A、K489A、I491A、N493A及C499A之胺基酸殘基取代中之一或多者之一EGFR蛋白的結合較弱。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該抗體經ADCC增強。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中該抗體經去岩藻醣基化(afucosylated)。
- 食道或胃-食道接合部之方法，其包含向有需要之一個體投與包含結合EGFR之一胞外部分的一可變區域及結合LGR5之一胞外部分的一可變區域的一抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物。
- 如前述請求項中任一項之供使用的抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物或方法，其中使用該抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物治療之前為診斷該個體之Her2狀態的一步驟。
- 如請求項29之抗體或其功能性部分、衍生物及/或類似物，其中診斷係藉由ISH或IHC測試Her2狀態。
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