JP2022071071A - ErbB-2およびErbB-3に結合する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
ErbB-2陽性腫瘍を処置するための他の戦略は、ErbB-3を対象とする。ErbB-3結合モノクローナル抗体は、前臨床研究においてその活性が実証されている(S choeberl、Faberら、2010)。一部のErbB-3結合モノクローナル抗体は、種々の癌の増殖および成長を阻害できる。
、ErbB-2のドメインIVに結合する。ErbB-2に結合し、ADCCをさらに 含む抗原結合部位(第1の抗原結合部位)を有する二重特異性抗体は、特にin vivoで顕著なADCC活性を有さなかった他のErbB-2結合抗体よりも、有効 であることが見出された。従って、ADCCを示す本発明に従う二重特異性抗体が好ましい。第1の抗原結合部位がErbB-2のドメインIVに結合する抗体は、固有のADCC活性を有することが見出された。低い固有のADCC活性を有する、ドメインI 結合性のErbB-2結合抗体は、ADCC活性を増強するために操作され得る。Fc領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、マクロファージ、ナチュラル・キラー細胞、B細胞および好中球上の異なる受容体に結合することによって、抗体機能を媒介する。これらの受容体の一部、例えば、CD16A(FcγRIIIA)およびCD32A(FcγRIIA)は、細胞を活性化して、抗原に対する応答を構築させる。他の受容体、例えばCD32Bは、免疫細胞の活性化を阻害する。(アミノ酸置換を導入することによって)より高い選択性で活性化受容体に結合するFc領域を操作することによって、抗癌Mabによる所望の細胞傷害活性を媒介するより高い能力を有する抗体が創出され得る。
・図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF184 9;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2 916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、M F3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域の、少なくともCDR3配列、好ましくは、少なくともCDR1、CD R2およびCDR3配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列;ならびに/あるいは
・図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF317 6;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6 057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;M F6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF 6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域の、少なくともCD R3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列。好ましい一実施形態では、この抗体は、PB4188である。
・MF1849;または
・MF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;または
・MF3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3991のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、以下のアミノ酸配列を含む:VH鎖MF1849;またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;またはMF3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3991のアミノ酸配列を含み、ここで、列挙されたVH配列は、図16A に示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9または10、より好ましくは多くて1、2、3、4または5アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有する。好ましい一実施形態では、ErbB-2 に結合する可変ドメインのVH鎖は、MF3958のアミノ酸配列を含み、またはこのV H鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに示されるMF3958のアミノ酸配列を含む。ErbB-2に結合する可変ドメインを含む抗体は、好ましくは、ErbB-3 に結合する可変ドメインを好ましくはさらに含む二重特異性抗体である。Erb-B3に 結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF33 07;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF 6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065; MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF607 1;MF6072;MF6073もしくはMF6074のアミノ酸配列を含み、または図16Bもしくは図16Eもしくは図37のVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16 Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF 3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057; MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF606 3;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6 069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もしくはMF607 4のアミノ酸配列を含む。Erb-B3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061もしくはM F6065のアミノ酸配列を含み、または図16Bもしくは図37のそれぞれのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、MF3178、MF3176、MF3163、MF605 8、MF6061もしくはMF6065のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、MF3178のアミノ酸配列を含み、またはこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに示されるMF3178のアミノ酸配列を含む。好ましくは、上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、CDR3 領域中には存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、CDR1およびCDR2領域中にも存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、FR4領域中にも存在しない。
・VH鎖MF1849;またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;またはM F3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、図16Aに示されるMF3991のアミノ酸配列を含む;あるいは
・VH鎖MF1849またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;またはMF 3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに示されるMF3991のアミノ酸配列を含む。この実施形態に従うかかる二重特異性抗体は、さらに好ましくは、ErbB-3 に結合する可変ドメインを含む。ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF 3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056; MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF606 2;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6 068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もしくはMF6074のアミノ酸配列を含み、または最も好ましくは、図16Bもしくは図1 6Eもしくは図37のVH鎖配列のいずれかに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF60 58;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF 6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069; MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もしくはMF6074のアミノ酸配列を含む。ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16 Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含み、または図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含む。
ErbB-2に結合する可変ドメインのVH鎖は、
・図16Aに示されるVH鎖MF3958のアミノ酸配列、または
・このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9 もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに示されるVH鎖MF3958のアミノ酸配列を含み、ならびに
ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、
・図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列;または
・図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに示されるVH鎖MF 3178のアミノ酸配列を含む。
・図16Aに示されるVH鎖MF3991のアミノ酸配列、または
・このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9 もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに示されるVH鎖MF3991のアミノ酸配列を含み;ならびに
ErbB-3に結合する可変ドメインのVH鎖は、
・図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列、または
・図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに示されるVH鎖MF 3178のアミノ酸配列を含む。
・a)ErbB-2に結合し、第1のCH3ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第1の核酸分子、およびb)ErbB-3に結合し、第2のCH3ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第2の核酸分子を有する細胞を用意するステップを含み、これらの核酸分子には、これら第1および第2のCH3ドメインの優先的ペアリングのための手段が提供され、この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれら2つの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性IgG抗体を回収するステップをさらに含む。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、共通の軽鎖をコードする第3の核酸分子もまた有する。この第1、第2および第3の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクターまたは遺伝子導入ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得る。あるいは、この第1、第2および第3の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。好ましい共通の軽鎖は、上記のように、O12、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖IgVκ1 39*01/IGJκ1*01である。この第1および第2のCH3ドメインの優先的ペアリングのための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のCH 3ドメイン中の、対応する変異である。本質的に二重特異性抗体のみを産生するための好ましい変異は、第1のCH3ドメイン中のアミノ酸置換L351KおよびT366K(K abatに従う番号付け)、ならびに第2のCH3ドメイン中のアミノ酸置換L351D およびL368Eであり、または逆もまた然りである。従って、二重特異性抗体を産生するための本発明に従う方法がさらに提供され、上記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351KおよびT366K(Kabatに従う番号付け)を含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351DおよびL368Eを含み、この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれらの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。二重特異性抗体を産生するための本発明に従う方法もまた提供され、上記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351DおよびL368E(Kabatに従う番号付け)を含み、第2のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351KおよびT366Kを含み、この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれらの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。これらの方法によって産生され得る抗体もまた、本発明の一部である。これらのCH3ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、IgG1ヘテロ二量体化ドメインである。これらのCH3ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域は、好ましくは、IgG1定常領域である。
・図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF29 16、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF 3001、MF3003およびMF1898の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域配列、またはMF2926、MF2930、MF18 49;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF 2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003もしくはMF1898の重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なるErbB-2特異的重鎖可変領域配列を含み、ならびに
・図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF60 57;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF 6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068; MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF6 074の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域配列、またはMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307; MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF606 0;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6 066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;M F6072;MF6073もしくはMF6074の重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なるErbB-3特異的重鎖可変領域配列を含む、本発明に従う二重特異性抗体は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される1または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka 阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる。好ましい一実施形態では、抗体PB4188は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC 阻害剤からなる群から選択される1または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる。
・図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF29 16、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF 3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含み、ならびに/あるいは
・図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF60 57;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF 6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068; MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF6 074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3 配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む。好ましい一実施形態では、この抗体は、PB4188である。
方法、材料および抗体についてのスクリーニング細胞株:
BxPC-3-luc2(Perkin Elmer 125058)、N87(AT CC(登録商標)CRL-5822(商標))、SK-BR-3(ATCC(登録商標) HTB-30(商標))、BT-474(ATCC(登録商標)HTB-20(商標))、JIMT-1(DSMZ ACC 589)、L929(Sigma Aldrich 85011425)、K562(DSMZ ACC10)、HEK293T(ATCC(登録商標)-CRL-11268(商標))、CHO-K1(DSMZ ACC110)、MCF-7(DSMZ ACC 115)、MDA-MB-468(#300279-513、Cell line services)SK-OV-3(ATCC(登録商標)HTB-77(商標))、MDA-MB-175(ATCC-HTB-25)、MD A-MB-453(ATCC-HTB-131)、MDA-MB-361(ATCC-HTB-27)、ZR-75-1(ATCC-CRL-1500)およびMKN-45(D SMZ ACC409)細胞株を、ATCC、DSMZまたはSigma Aldric hから購入し、10%熱不活化胎仔ウシ血清(FBS)を補充した成長培地中で慣用的に維持した。HEK293F Freestyle細胞を、Invitrogenから取得し、293 FreeStyle培地中で慣用的に維持した。
フォワード・プライマー:AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGG CCTGGTAC、リバースド・プライマー:AATAATTCTAGACTGGCAC GTCCAGACCCAGG。全長増幅産物を、NheI-XbaIで消化し、引き続いて、pcDNA3.1の対応する部位中にクローニングした。このクローンを配列決定し、アカゲザルの利用可能な配列(XM_002800451)とアラインして、ErbB-2クローンの正確さをチェックした。
フォワード・プライマー:AAGCTGGCTAGCACCATGAGGGCGAACG GCGCTCTG、リバースド・プライマー:AATAATTCTAGATTACGTT CTCTGGGCATTAGC。全長増幅産物を、NheI-XbaIで消化し、引き続いて、pcDNA3.1の対応する部位中にクローニングした。このクローンを配列決定し、アカゲザルの利用可能な配列(ENSMMUP00000027321)とアラインして、HER3クローンの正確さをチェックした。
細胞表面上に高レベルのHER3を発現する細胞株を作製するために、哺乳動物発現ベクターを、NotIおよびKpnI消化によって全長HER3を切り出すことによって作製した。引き続いて、この断片を、pcDNA3.1(-)/hygroベクターの対応する部位中にクローニングした。ネオマイシン耐性遺伝子をコードする全長HER2およびHER3発現ベクターを使用して、細胞表面上に高レベルのHER2を発現する細胞株を作製した。トランスフェクション前に、プラスミドを、SSpIおよびFspI消化によって線状化した。両方のベクターを、K562細胞中に別々にトランスフェクトし、安定なプールを、抗生物質選択後に作製した。得られた細胞株(K562-HER2およびK562-HER3)は、それらの細胞表面上に高レベルのHER2およびHER3を発現した。
(HER2免疫化。)4つの異なる免疫化戦略を適用した。コホート#Aについて、6匹のC57Bl/6マウスを、腹腔内注射によって、200μl中2×106の、HER2 を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、1 4日目に腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-2-Fc(RND systems)タンパク質で追加免疫し、その後、28日目および42日目に、200μl中2×106の、HER2を一過的にト ランスフェクトしたL929細胞で追加免疫した。コホート#Cについて、6匹のC57B l/6マウスを、腹腔内注射によって、2×106の、HER2を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、14日目に腹腔内注射によって、200μl中2×106の、HER2を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で追加免疫し、その後、35日目に腹腔内注射によって、125μlのTiterma x Gold中に溶解させた20μgのErbb-2-Fcタンパク質でタンパク質追加免疫し、49日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶 解させた20μgの Erbb-2-Fcタンパク質で最終追加免疫した。コホート#Eについて、6匹のC5 7Bl/6マウスを、腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのErbb-2-Fcタンパク質で免疫化した。引き続いて、腹腔内注射を介した、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのE rbb-2-Fcタンパク質によるタンパク質追加免疫を、14日目および28日目に実施し、42日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgのE rbb-2-Fcタンパク質で最終追加免疫した。コホート#Gについて、6匹のC57 Bl/6マウスを、そのプロトコールに従って、Genovac(Freiburg、G ermany)においてDNAワクチン接種によって免疫化した。DNAワクチン接種に使用した、エンドトキシン・フリーの提供されたベクターは、pVax1中にクローニングされたHER2の膜貫通部分および細胞外部分をコードしていた。引き続いて、DNA追加免疫を、14日目、28日目および66日目に与えた。
免疫化されたC57Bl/6マウス由来の血清中の抗HER2力価を、ECD-Erb b-2タンパク質(Bendermedsystems)に対するELISA、ならびにHER2陰性K562、HER2低発現性細胞株MCF-7ならびにHER2増幅されたSKBR-3およびBT-474細胞に対するFACS分析によって、決定した。免疫 化されたC57Bl/6マウス由来の血清中の抗HER3力価を、Erbb-3-Fc タンパク質に対するELISA、ならびにHER3陰性K562、HER2低発現性細胞 株M CF-7ならびにHER2増幅されたSKBR-3およびBT-474細胞に対するFA CS分析によって、決定した。
脾臓および流入領域リンパ節を、DNAでワクチン接種した全てのマウス(コホート# Gおよび#H)から取り出した。単一細胞浮遊液を、全ての組織から作製し、引き続いて、組織を、Trizol試薬中で溶解した。コホート#Aから#Fまで、脾臓を、最初の追加免疫後に死亡したコホート#Cの1匹のマウスを除く全てのマウスから取り出した。単一細胞浮遊液を、全ての脾臓から作製し、総B細胞画分を、CD19富化(コホート# A、E、F)または非B細胞の枯渇(コホート#B、C、D)のいずれかによって、MA CS分離手順を使用して単離した。
1つのファージ・ライブラリーを、各マウスについて構築した。この目的のために、1群ごとの全てのマウス(1群につき5または6匹のマウス)からの材料を使用して、以下のアプローチを使用してファージ・ライブラリーを調製した。各個々のマウスから、RN Aを単離し、cDNAを合成し、VHファミリー特異的PCRを実施した。引き続いて、マウス1匹当たりの全てのVHファミリーPCR産物を精製し、DNA濃度を決定し、消化し、共通の軽鎖を含むファージ・ディスプレイ・ベクター中にライゲーションして、マウス-ヒト・キメラ・ファージ・ライブラリーを作製した。全てのファージ・ライブラリーは、85%超の挿入頻度で、106超のクローンを含んだ。
抗体断片を、抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを使用して選択した。免疫化ライブラリーおよび合成ライブラリー(de Kruifら、Mol.Biol.(19 95)、248、97~105に記載される通り)を、選択に使用した。
ファージ・ライブラリーを、VCS-M13ヘルパー・ファージ(Stratagen e)を用いてレスキューし、組換えタンパク質でコートされたイムノチューブ(Nunc)中で、2ラウンドにわたって選択した。第1ラウンドでは、ECD-Erbb-2タ ンパク質(Bendermedsystems)を、イムノチューブ上にコートし、第2 ラウンドでは、Erbb-2-Fc(RND systems)を、イムノチューブ上にコートした。これらのイムノチューブを、4%脱脂粉乳(ELK)中でブロッキングした。ファージ抗体ライブラリーもまた、4%ELKでブロッキングし、その後、イムノチューブにファージ・ライブラリーを添加した。免疫チューブ中での、ファージ・ライブラリーとコートされたタンパク質とのインキュベーションを、回転条件下、室温で2時間実施した。次いで、イムノチューブを、PBS中0.05%のTween-20で5~10回洗浄し、その後、PBS中で5~10回洗浄した。結合したファージを、50mMのグリシン(pH2.2)を使用して溶出し、E.coli XL-1 Blueに添加し、ファージ感染のために37℃でインキュベートした。引き続いて、感染した細菌を、アンピシリン、テトラサイクリンおよびグルコースを含む寒天プレート上にプレートし、37℃で終夜インキュベートした。第1ラウンドの後、コロニーをプレートから掻き取り、合わせ、その後、レスキューし、増幅して、富化された第1ラウンド・ライブラリーを調製した。次いで、富化されたライブラリーを、上記プロトコールを使用して、Erbb-2-F c(RND systems)に対して選択した。第2ラウンドの選択後、個々のクローンを取り、レスキューして、ファージ・モノクローナル・ミニプレップを調製した。次いで、Erbb2と結合している陽性ファージ・クローンを、乳癌細胞株BT-474への結合についてFACSにおいて同定した。全てのErbb2特異的クローンのVH遺伝子を配列決定した。VH遺伝子再編成を、VBASE2ソフトウェアを用いて確立して、ユニーククローンを同定した。次いで、全てのユニーククローンを、HEK293T細胞( 陰性コントロール)、ErbB-2で一過的にトランスフェクトされたHEK293T細胞、およびBT-474細胞への結合について、FACSにおいてファージ形式で試験した。
ファージ・ライブラリーを、VCS-M13ヘルパー・ファージ(Stratagen e)でレスキューし、組換えタンパク質でコートされたイムノチューブ(Nunc)中で、2ラウンドにわたって選択した。両方の選択ラウンドで、Erbb-3-Fc(RND systems)を、イムノチューブ上にコートした。融合タンパク質のFc部分に向 かう選択バイアスを克服するために、Erbb-3-Fcに対する両方の選択ラウンドを、150μg/mlのヒトIgGの存在下で実施した。これらのイムノチューブを、4% ELKでブロッキングした。ファージ抗体ライブラリーを、4%ELKでブロッキングし、その後、イムノチューブにファージ・ライブラリーを添加した。ファージ・ライブラリーとのインキュベーションを、回転条件下、2時間実施した。次いで、イムノチューブを、PBS中0.05%のTween-20で5~10回洗浄し、その後、PBS中で5~ 10回洗浄した。結合したファージを、50mMのグリシン(pH2.2)を使用して溶出し、E.coli XL-1 Blueに添加し、ファージ感染のためにインキュベートした。引き続いて、感染した細菌を、アンピシリン、テトラサイクリンおよびグルコースを含む寒天プレート上にプレートし、37℃で終夜インキュベートした。第1ラウンドの後、コロニーをプレートから掻き取り、合わせ、ファージをレスキューし、増幅して、富化された第1ラウンド・ライブラリーを調製した。次いで、富化されたライブラリーを、上記プロトコールを使用して、Erbb-3-Fc(RND systems)に対して選択した。第2ラウンドの選択後、個々のクローンを取り、レスキューして、ファージ・モノクローナル・ミニプレップを調製した。陽性ファージ・クローンを、乳癌細胞株B T-474への結合についてFACSにおいて同定した。全ての陽性クローンのVH遺伝子を配列決定した。VH遺伝子再編成を、VBASE2ソフトウェアを用いて確立して、ユニーククローンを同定した。全てのユニーククローンを、K562細胞(陰性コントロール)、安定なK562-HER3細胞およびBT-474細胞への結合について、FA CSにおいてファージ形式で試験した。
モノクローナル抗体の作製
免疫化マウス・ファージ・ライブラリー由来の、VH遺伝子配列およびそのいくつかの配列バリアントによって判断される、ユニーク抗体のVH遺伝子を、骨格IgG1ベクター中にクローニングした。2つの異なる産生細胞株を、プロセスの間に使用した;HEK 293Tおよび293F Freestyle細胞。接着性HEK293T細胞を、6ウェル・プレート中で、80%のコンフルエンシーまで培養した。これらの細胞を、個々のDNA-FUGENE混合物で一過的にトランスフェクトし、さらに培養した。トランスフェクションの7日後、上清を回収し、培地をリフレッシュした。トランスフェクションの14日後、上清を合わせ、0.22μM(Sartorius)を通じて濾過した。無菌上清を4℃で貯蔵した。
二重特異性抗体を、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化および形成を確実にするために、所有のCH3テクノロジーを使用して作製した。このCH3テクノロジーは、2 つの異なる重鎖分子の効率的ペアリングを可能にするために、上に記載されたように(P CT/NL2013/050294;WO2013/157954A1として公開)、C H3領域中の荷電ベースの点変異を使用する。
IgGの精製を、アフィニティ・クロマトグラフィーを使用して、小規模(<500μg)、中規模(<10mg)および大規模(>10mg)で実施した。小規模精製を、減圧濾過を使用して、24ウェル・フィルター・プレートにおいて無菌条件下で実施した。最初に、培地のpHを、pH8.0に調整し、引き続いて、小規模産生物を、600rp mの振盪プラットフォーム(Heidolphプレート・シェーカー)上で25℃で2時間、プロテインA Sepharose CL-4Bビーズ(50% v/v)(Pie rce)と共にインキュベートした。次に、ビーズを、減圧濾過によって回収した。ビーズを、PBS pH7.4で2回洗浄した。IgGを、0.1Mクエン酸塩緩衝液を用いてpH3.0において溶出し、IgG画分を、Tris pH8.0で即座に中和した。緩衝液交換を、マルチスクリーンUltracel 10マルチプレート(Millip ore)を使用する遠心分離によって実施した。これらのサンプルは、PBS pH7. 4の最終緩衝液中で終わった。
抗体を、BT-474、HEK293T、およびHER2またはHER3を過剰発現するHEK293Tへの結合について、FACSにおいて試験した。従って、細胞を、トリプシンを使用して回収し、FACS緩衝液(PBS/0.5%BSA/0.5mM ED TA)中106細胞/mlに希釈した。1~2×105細胞を、U底96ウェル・プレート中の各ウェルに添加した。細胞を、4℃で300gで2分間遠心分離した。上清を、プレート(複数可)を反転させることによって廃棄した。50μlの各IgGサンプルを、10μg/mlの濃度で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:100希釈したマウス抗ヒトIgG PE(Invitrogen)を添加し、暗中で氷上で30~60分間インキュベートした。FACS緩衝液を添加した後、細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、HTS設定のFAC SCantoフロー・サイトメーターで分析した。細胞への抗体の結合を、平均蛍光強度(MFI)によって評価した。
抗HER2抗体のパネルを、キメラ構築物を使用して、他の種(マウス、ニワトリ)由来のHER2 ECDに対するそれらの反応性、ならびにHER2分子中の特定のドメイン、即ち、ドメインI、II、IIIおよびIVへのそれらの結合に基づいて、ビニングした。
1.ドメインI特異的(25)
2.ドメインII特異的(2)
3.ドメインIII特異的(23)
4.ドメインIV特異的(7)
5.ドメインIV特異的およびマウスと交差反応性(2)
6.全ての構築物と反応性(2)
7.ヒトHER2とだけ反応性(4)
HER2ドメインIVにマッピングされた2つの抗体は、SKBR-3細胞の増殖を阻害した。両方の抗体が、1アミノ酸の差異を除き、類似のCDR3を共有していた。1つの抗体PG1849を、競合ELISAにおいてトラスツズマブと競合するその能力について調査した。このELISAでは、Fc-HER2をコートし、15μg/mlの濃度のIgG抗体と共にインキュベートした。15分間のインキュベーション後、ファージを、もう1時間インキュベートした。その後、ファージを検出した。表4は、PG1849 およびトラスツズマブが、HER2に同時に結合できたことを実証しているが、それは、ELISAの間にシグナルの喪失が現れなかったからである。真の競合は、同じファージおよび抗体をこのアッセイにおいて組み合わせた時にだけ観察された。
1.高いドメインIII反応性、ラットおよびマウス反応性、ならびにドメインIVへの軽微な反応性(8)
2.高いドメインIII反応性、ラット、ヒトおよびカニクイザル反応性、ドメインIVへの軽微な反応性(8)
3.ラット、カニクイザルおよびヒトHER3とだけ反応性(43)
4.ヒトHER3とだけ反応性(32)
5.全ての構築物と反応性(33)
SK-BR-3細胞を、L-グルタミンおよび10%熱不活化FBSを補充したDMEM-F/12中で培養した。BxPC-3-luc2細胞を、10%熱不活化FBSを補 充したRPMI1640中で培養した。MCF-7細胞を、100μM、NEAA 1m Mのピルビン酸ナトリウム、4μg/mlのインスリンおよび10%の熱不活化FBSを補充したRPMI1640中で培養した。
本発明者らは、Devash(PNAS、1990)によって記載される方法を使用して、限定抗原-ELISAにおいて抗体をランク付けした。減少した抗原コーティング濃度の使用は、観察された交差反応性反応を排除し、高親和性/結合力の抗体を検出するために使用され得る。従って、固体支持体上の抗原濃度を徐々に減少させて、弱い免疫反応性を調査した。2.5μg/mlから開始して0.019μg/mlまでのECD-Er bb-2タンパク質の連続滴定を、MAXISORP(商標)ELISAプレートに終夜コートした。ELISAプレートのウェルを、5%BSAを含むPBS(pH7.2)中で37℃で1時間ブロッキングした。選択された抗体を、PBS-2%BSA中に希釈した10μg/mlの濃度で2連で試験し、25℃で2時間結合させた。コントロールとして、この手順を、コートされた抗原に特異的な抗体および陰性コントロール抗体を用いて、同時に実施した。ELISAプレートを、PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween 20)で5回洗浄した。結合したIgGを、1:2000希釈したHRPコンジュゲート(ヤギ抗マウスIgG、BD Biosciences)を用いて検出し、25℃で2時間結合させた。ELISAプレートを、PBS-T(PBS-0.05% Tween 20)で5回洗浄し、結合したIgGを、OD492nm測定によって検出した。PG1849、PG2916、PG2926、PG2930、PG2971、PG 2973、PG3004およびPG3031を、HER2抗原滴定ELISAにおいて試験した(図1)。
異なるファージ・ディスプレイ・ライブラリー由来のHER2 VHの結合を調査するために、HER2抗体のパネルを、クローニングし、別のVKカッパ鎖、即ち、MEHD 7945AのVLの背景で発現させた。産生されたIgGを、K562細胞および安定なK562-HER2細胞に対するFACS分析に供した。コンビナトリアル・ライブラリーおよび非コンビナトリアル・ライブラリー由来のVH遺伝子を、表8に列挙する。VH 鎖MF2971、MF3958、MF2916、MF2973、MF3004、MF30 25、MF3031は全て、共通の軽鎖IGKV1-39と組み合わせた場合に観察されたように顕著な抗原特異性および結合を喪失することなくMEHD7945A軽鎖と組み合わせることができた。VH鎖MF1849は、バリアント・カッパ軽鎖と組み合わせることはできず、抗原特異性および結合を保持できなかった。
HER2またはHER3の機能を阻害する抗体は、当技術分野で公知である。さらなる抗体を、公開された情報に従って構築し、293F Freestyle細胞において発現させた。抗HER2抗体ペルツズマブおよびトラスツズマブを、米国特許出願公開第2 006/0212956号A1(Genentech)に開示された情報に基づいて作製した。抗HER3抗体#Ab6は、WO2008/100624(Merrimack Pharmaceuticals,Inc.)に開示された情報に基づき、IgG1骨格ベクター中に再クローニングした。1-53およびU1-59抗HER3抗体の情報は 、米国特許第7,705,103号B2(U3 Pharma AG)から得た。抗HER3 LJM716抗体の情報は、米国特許出願公開第2012/0107306号から得た。ツー・イン・ワン抗EGFR抗HER3抗体MEHD7945Aの構築のための情報は、WO2010/108127から得た。
HER2およびHER3抗体パネル由来のVHを、荷電した操作されたベクター中に再クローニングし、その結果、抗体重鎖の発現の際に、重鎖のヘテロ二量体化が強制され、トランスフェクション後に二重特異性抗体を生じる。3つの異なる戦略を、二重特異性I gG形式でHER2およびHER3アームを組み合わせる際に使用した:
1.HER2(リガンド非依存的成長を遮断する)×HER3(リガンド非依存的成長を遮断する)
2.HER2(リガンド非依存的成長を遮断する)×HER3(リガンド依存的成長を遮断する)
3.異なるエピトープ・ビン由来のHER2×HER3(リガンド依存的成長を遮断する)
表9に記載される抗体を、BxPC-3-luc2膵臓異種移植モデルにおいて試験した。BxPC-3-luc2細胞株は、HER2およびHER3の両方を発現し、 HER 2低発現性細胞株とみなされる。研究の開始時に8~10週齢のCB17 SCID雌性マウスに、20μl中1×106の腫瘍細胞を、膵臓中に同所性に移植した。この目的のために、マウスを麻酔し、右側を下にして寝かせて左側を露出させ、0.5cmの切開を左側腹領域に作製した。膵臓および脾臓を剥き出しにし、20μl中1×106の腫瘍細胞を、膵尾部の嚢下(sub-capsulary)空間中に注射 した。移植の1週間後、バイオルミネセンス(BLI)データを生成した。画像化の15分前に、全てのマウスが、150mg/kgのルシフェリン(D-ルシフェリン-EFカリウム塩、カタログ 番号E6552、Promega)の腹腔内注射を受けた。BLI画像化を、左側面からの表示を使用して、1週間に1回または2回実施した。異常値動物-BLI/腫瘍体積 に基づく-を除去し、マウスを、各々7匹のマウスの群中にランダムに分配した。実験8 日目に、処置を開始した。抗体処置群中の動物に、3連続週にわたって毎週(0日目、7日目、14日目および21日目)、30mg/kgの抗体を投薬した。処置の0日目に、これらの動物は、2回分の負荷量、即ち、60mg/kgの抗体を投与された。最終画像化を、31日目に実施した。
それらの親対応物と比較した、HER2×HER3二重特異性抗体の結合を、FACS 分析によって決定した。FACSを、BxPC-3-luc2細胞およびMCF-7細胞 に対して実施し、抗体の連続滴定は、2,5μg g/ml~0,01μg g/mlの範囲であった。試験した抗体パネルは、二重特異性抗体PB3566ならびにその親抗体、抗HER3抗体PG3178および抗HER2抗体PG3004から構成された。MF Iデータをプロットしたところ、両方の細胞株についてのグラフは、二重特異性PB35 66が、抗HER3抗体PG3178および抗HER2抗体PG3004と比較して、両方の腫瘍細胞株により効率的に結合することを示す(図6)。
MF2971およびMF3004を、当技術分野で公知のテクノロジーに従ってヒト化した。MF2971の合計7つのヒト化/脱免疫化バリアント配列を発現させ、検証し、in vitroでモノクローナルとして、HER3特異的抗体MF3178と二重特異性形式で組み合わせて特徴付けた。7つのMF2971バリアント中のMF2971のH CDR3をMF3004のHCDR3で置き換えることによって創出したMF3004の7つのバリアント配列について、同じことを行った。全てのヒト化バリアントの発現、完全性、熱安定性および機能的活性を分析した。産生、完全性、安定性および機能性完全性に基づいて、MF2971のバリアント(2971-var2)を、MF3178と二重特異性形式で使用されるVHの最適なヒト化バリアントとして選択した。この2971- var2を、MF3958と改名した。二重特異性HER2×HER3組み合わせMF3 958×MF3178は、PB4188を生じた。
懸濁適応させた293F Freestyle細胞を、エルレンマイヤー・フラスコ中で、3.0×106細胞/mlの密度まで、シェーカー・プラトーで培養した。細胞を、4Lエルレン・フラスコ中に、0.3~0.5×106生存細胞/mlの密度で播種した。これらの細胞を、個々の無菌DNA:PEl混合物で一過的にトランスフェクトし、さらに培養した。トランスフェクションの7日後、二重特異性抗体を含む馴化培地を、低速遠心分離、5分間1000gによって、その後、高速遠心分離、4000gで5分間によって回収した。収集された馴化培地を、5kDa Satorius hydrosar tカセットで約600mlに濃縮し、引き続いて、4LのPBSに対して透析濾過した。抗体を、約35mlのMabSelectSure XL(11℃)に対して、カラム上に結合させた。非特異的(A-specifically)に結合したタンパク質を、1 50ml PBS、1M NaCl含有150ml PBS、100ml PBSを用いて逆流様式でカラムを洗浄することによって除去した。結合した抗体を、100mMクエン酸塩pH3.0を使用して逆流様式で溶出させ、5mlの画分を、中和のために、4m lの1Tris pH8.0を含む10mlチューブ中に収集した。溶出した抗体を、s uperdex 200 50/1000を使用するゲル濾過によって、さらに精製した。この精製された抗体を、0.22μmシリンジ・フィルターを使用してフィルター滅菌した。IgG濃度を、OD280測定によって決定し、タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算した。タンパク質を、凝集(HPSEC)、純度(SDS-PAGE、rtMS、IEXおよびIEF)について試験した。タンパク質サンプルを-80℃で貯蔵した。
中規模精製を、HiTrap MabSelect SureカラムおよびHiTra p脱塩カラムを使用して、AKTA 100 Explorerで実施した。サンプルを、5ml/分でロードした。カラムを、2カラム体積のPBSで洗浄した。IgGを、0.1Mクエン酸塩緩衝液を用いてpH3.0で溶出した。次に、サンプルを脱塩し、PB S pH7.4の最終緩衝液中で終えた。IgGを、0.45μMフィルター(Sart orius)を通して濾過した。IgG濃度を、プロテインAセンサーを用いてOcte tを使用して測定した。タンパク質を、凝集(HPSEC)、純度(SDS-PAGE、nMS、IEXおよびIEF)について試験した。タンパク質サンプルを-80℃で貯蔵した。
PB4188(MF3958×MF3178)を、HP-SECおよびCIEX-HP LC(TSKゲル-STAT 7μmカラム、4.6mm ID×10cm L)による分析に供した。PB4188の分析プロファイルは、通常の単一特異性IgG1、例えば、親HER2アームPG3958および抗RSVモノクローナル・コントロール抗体の挙動と、概して一致していた(図7)。
組換えHER2およびHER3に対するPB4188およびPB3448の一価結合親和性を、SPR(Biacore T100)によって決定した。Biacore(商標)T100(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を使用して、記載された全ての実験を実施した。センサー表面準備および相互作用分析を、25℃で実施した。緩衝液およびBiacore試薬は、GE Healthcareから購入した。ErbB2-FcおよびERbB3-Fc(RND)を、500RUの標的固定化 レベルで、酢酸カリウム緩衝液(pH5.5)中でCM5センサー・チップの表面にコートした。ランニング緩衝液は、フィルター滅菌したHBS(hepes緩衝食塩水):10 mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005% Tween-2 0;0.2μm)であった。これらの二重特異性抗体を、HBS中100、50、20、 10、1および0.1nMに希釈し、CM5センサー・チップの抗原カップリングした表面上に高い(30μl/分)流速で実行した。BIA評価ソフトウェアを用いて、1:1の一価相互作用についての曲線適合モデルは、HER2アームの親和性(一価相互作用)の決定を可能にし、HER2アームの親和性が決定できた。HER3アームの低オフ・レートに起因して、その親和性は決定できなかった。HER3 アームの親和性を決定するために、PB4188を、500RUの標的固定化レベルでCM5センサー・チップにコートした。Her2-FcおよびHer3-Fc抗原を、HBS中100、50、20、1 0、1および0.1nMに希釈し、PB4188表面上に高い流速(40μl/分)で実行した。kオンおよびkオフ値を決定するために、BIA評価ソフトウェアを、一価分子をセンサー・チップ表面にコートしたことおよびErbB3-Fc抗原が二価分子であることを考慮に入れるモデルと併せて使用した。PB4188およびPB3448の親和性を、表10に示す。
結合親和性もまた、BT-474およびSK-BR-3細胞を使用し、定常状態細胞 親和性測定によって決定した。4つのIgGを分析した:1)抗HER2抗体3958および抗HER3抗体3178を含む、PB4188(二重特異性HER2×HER3);2)抗HER3抗体3178および抗TT(破傷風トキソイド)抗体1337を含む、PB9215(二重特異性HER3×TT);3)抗HER2抗体3958および抗TT抗体1337を含む、PB9216(二重特異性HER2×TT);4)ハーセプチン(単一特異性HER2)。IgGを、IODO-GEN(登録商標)Precoated Io donation Tubes(Pierce)および付随の指示書を使用して、125 Iで放射活性標識した。標識されたIgGを、25mM Tris-HCl、0.4M NaCl、0.25% BSA、5mM EDTA、0.05% NaN3中で、約1~ 2×108cpm/mlの活性に希釈した。タンパク質濃度を、BCA Protein Assay Kit(Pierce)を用いて決定した。BT-474およびSK-B R-3細胞を使用した、標識されたIgGおよび非標識IgGのフロー・サイトメトリー分析は、標識化後に、結合における低減の徴候を示さなかったか、または軽微な徴候のみを示した。定常状態細胞親和性測定を、以下のように実施した。細胞を、96ウェル・プレート中に播種し、種々の濃度の標識されたIgGと共に4℃でインキュベートした。未結合の放射活性を、4時間後に除去し、細胞結合した放射活性を、ガンマ・ウェル・カウンターを使用して測定した。非特異的結合を、受容体遮断濃度(100倍過剰)の未標識の抗体を添加することによって測定した。各条件を、3連で試験し、抗体1つにつき3つの独立した実験を実施した。KD値を、Prism6.0d(GraphPad Sof tware)を使用して、非特異的結合について補償する非線形回帰モデルに基づいて計算した。適合された曲線を含むグラフを、両方の細胞株へのHER2×HER3 IgG(PB4188)の結合について、図20に示す。平均値を含む24全てのアッセイについてのKDデータを、表12に示す。まとめると、BT-474およびSK-BR-3細 胞を使用して決定した平均KD値は、それぞれ、HER2×HER3について3.2および2.0nM、ハーセプチンについて3.7および1.3nM、HER2×TTについて3.9および2.3nM、ならびにHER3×TTについて0.23および0.99nM であった。従って、PB4188は、HER3と比較してより高い親和性でHER2を標的化するHER2×HER3二重特異性分子MM-111とは対照的に、HER2と比較してHER3に対してより高い親和性を示す。
PB3448およびPB4188を、軟寒天におけるトラスツズマブ耐性JIMT-1 細胞の成長を阻害する強度について試験した。この目的のために、96ウェル懸濁細胞培養物プレートを準備した。100μLの軟寒天下層(完全培地中0,6%の最終濃度)を注ぎ、凝固させた。次いで、10.000のJIMT-1細胞/ウェルを含む50μLの軟寒天上層(0,4%の最終濃度)を、上に添加し、凝固させ、かかる96ウェル・プレートを、37℃、10%CO2で終夜インキュベートした。次の日、陰性コントロール抗体、ペルツズマブ+トラスツズマブ(1:1 v/v)、PB3448およびPB418 8を、10~0,003μg/mlの範囲の片対数滴定で、DMEM培地中に添加した。引き続いて、アッセイを、細胞培養インキュベーター中で8日間インキュベートした。最後に、細胞を、37℃でAlamar Blueと共に3~5時間インキュベートし、蛍光強度を決定した(励起:560nm;発光:590nm)。PB3448およびPB4 188によるJIMT-1増殖の用量依存的阻害の一例が示される(図8)。
PB3448およびPB4188を、BT-474およびSKBR-3細胞の成長を阻害する強度について試験した。3次元マトリゲルにおいて細胞を増殖させ、処置された細胞と非処置の細胞を識別するために主成分分析を使用する、Leiden、Nether landsを本拠とするOcello社で、細胞を試験した。2000のSK-BR-3 細胞または2250のBT474細胞を、384ウェル・プレート(Greiner 7 81091)のウェル1つ当たり15μlのマトリゲル中に播種した。次の日、10~0.003μg/mlの範囲の抗体の片対数滴定を、5ng/mlのHRGの非存在下または存在下で培養培地中に添加した。試験抗体は、陰性コントロール抗体、ペルツズマブ+ トラスツズマブ(1:1 v/v)、PB3448、PB4188および二重特異性抗E GFR×HER3ツー・イン・ワン抗体MEHD7945Aを含んだ。さらに、HRGの用量依存的滴定を、陽性コントロールとして含めた。各用量を、4連で試験した。細胞を、37℃、5%CO2で細胞培養インキュベーター中において7日間インキュベートした。次に、細胞を固定し、細胞のアクチン細胞骨格をファロイジンで染色し、核をヘキストで染色した。次に、蛍光画像を、ゲル(Z-スタック)を通じて異なるレベルで撮影し、画像を重ねた。広い範囲の形態学的特徴を測定した(合計で800)。培地処置とHRG 処置との間で異なった特徴だけを、分析のために選択した。成長と関連した特徴、平均球状体面積および球状体当たりの核は、培地処置とHRG処置との間で、最も顕著に異なっていた。マルチパラメーター分析および単一パラメーター分析の両方を行った。単一パラメーター測定のために、t検定を実施して、培地に対して処置(HRGまたは抗体)を比較した。各点についてのP値を決定した。変動性のほとんどを捕捉する、高次元データの低次元組み合わせを見出すための方法である主成分分析(PCA)を、抗体濃度との関連で使用して、データをプロットした。図9は、HRGの存在下での、ペルツズマブ+トラスツズマブ(1:1 v/v)、PB3448およびPB4188の効果を実証している。両方のHER2増幅された乳癌細胞株において、PB4188は、HRGの存在下で、ペルツズマブ+トラスツズマブ、PB3448およびツー・イン・ワン抗体MEHD79 45Aと比較して、優れた活性を示した。
SKBR-3およびBT-474に対する、10ng/mlのHRGの存在下でのPB 4188の活性を、HER2、HER3抗体およびそれらの組み合わせのパネルと比較した。アッセイを、上記のようにマトリゲルにおいて実施し、形態学的特徴を分析した。図10a中にプロットしたPCAデータは、マトリゲルにおけるSKBR-3細胞のHRG 誘導性の増殖および分岐/浸潤を示している。図10bは、抗体PB4188が、HRG 誘導性表現型を完全に復帰させることができるが、親モノクローナル抗体の組み合わせ( PG3958+PG3178)は効果を有さないことを示している。さらに、PB418 8は、試験した全ての抗HER3抗体と比較して、はるかに効果的であった(図10c)。さらに、個々の抗HER3抗体とトラスツズマブとの組み合わせ(転移性乳癌(mBC
)の治療における現在の標準)は、HRG誘導性表現型を復帰させることができなかった(図10d)。HRGの存在下でPB4188にトラスツズマブを追加することで、PB 4188単独と比較して、SK-BR-3細胞の増殖および分岐/浸潤は低減された(図 10e)。
NRG1-β1の上方調節は、HER2標的化治療に対する重要な耐性機構である(Wilson、2012)。NRG1-β1の上方調節がPB4188による抗増殖の強度を妨害するかどうかを評価するために、抗体のパネルを、N87(HER2増幅された) 胃癌細胞株に対して、100ng/mlのHRGで試験した。N87細胞を、10%熱不活化FBSを補充したRPMI1640中で培養した。増殖アッセイのために、N87細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSAおよび10μg/mlのホロ・トランスフェリンを含むRPMI1 640培地)中で2回洗浄した。抗体を、1~0,0001μg/mlで変動する片対数滴定で希釈した。細胞を、100ng/mlの最終濃度のHRGの存在下で10000細胞/ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%C O2で3日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen)を、製造者の指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。蛍光を、550nmの励起波長および590nmの発光波長で測定した。PB4188は、抗HER2または抗HER3モノクローナル抗体よりも優れた活性を示した(図11)。
ADCC活性は、異なる技術によって増強され得、そのうちの1つは、フコースの除去である。フコースの除去は、いくつかのin vivoモデルにおいて、増加した抗腫瘍活性を生じている[Junttila、2010]。PB4188の活性を最大化するために、非フコシル化テクノロジーを適用し(Cheng LiuおよびAndreia Lee.ADCC Enhancement Technologies for Ne xt Generation Therapeutic Antibody.Antib ody therapeutics-Trends in Bio/Pharmaceu tical Industry 2009[13~17])、それによって、Fc領域中のN結合型炭水化物構造のフコシル化を防止する。野生型PB4188と比較した、非フコシル化されたPB4188のADCC強度を、HER2低発現性細胞(MCF-7)およびHER2増幅された細胞(SK-BR-3)を使用して、ADCC51Cr放出アッ セイにおいて決定した。両方の抗体を、連続希釈で適用し、陰性コントロール抗体およびトラスツズマブを、このアッセイ中に含めた。図14は、高HER2発現性細胞および低HER2発現性細胞の両方における、野生型バージョンおよび/またはトラスツズマブと比較した、非フコシル化されたPB4188のADCC強度における増加を示している。
非フコシル化されたPB4188の活性を、V158(高親和性)FcγRIIIa受容体バリアントまたはF158(低親和性)FcγRIIIa受容体バリアントのいずれかを含むADCCレポーター細胞に対して試験した。抗体、即ち、コントロール抗体、トラスツズマブおよび非フコシル化されたPB4188の連続滴定を、接着性SK-BR- 3細胞に、異なるFcγRIIIaバリアントを保有するADCCレポーター細胞と組み合わせて添加した。ADCC活性を、ルシフェラーゼ活性を測定することによって測定した。非フコシル化されたPB4188は、高親和性V158 FcγRIIIa受容体バリアントと組み合わせると、トラスツズマブと比較して、等しい活性を示した。対照的に、非フコシル化されたPB4188は、低親和性F158 FcγRIIIa受容体バリアントと組み合わせると、トラスツズマブと比較して、優れたADCC活性を示した(図15)。
JIMT-1ヒト乳癌腫細胞を、移植の時まで、10%胎仔ウシ血清、100単位/m LペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、25μg/mL ゲンタマイシンおよび2mMグルタミンを含むDMEM中で成長させた。移植当日、JI MT-1乳房細胞を、対数期成長の間に回収し、冷PBS中に再懸濁した。雌性CB.17 SCIDマウス(Charles River)は、研究1日目に8週齢であり、1 6.5~20.7gの体重範囲を有していた。各マウスに、5×106の腫瘍細胞(0. 2mL細胞懸濁物)を右側腹に皮下注射した。これらの腫瘍を、2次元でノギスによって測定して、サイズをその平均体積として1週間に2回モニタリングした。腫瘍がおよそ1 00~150mm3のサイズに達したところで、動物を、効力研究へと進めたた。異常値動物-腫瘍体積-を除去し、マウスを、各々10匹のマウスの群中にランダムに分配した。マウスに、4週間の期間にわたって、1週間に1回(抗体)または1日1回(ラパチニブ)注射した。処置群の詳細を表11に示す。
NRG1-β1の上方調節は、HER2標的化治療に対する重要な耐性機構である(W ilson、2012)。PB4188を、漸増する濃度のHRG(NRG1-β1 EGF)の存在下で、連続滴定でその親抗HER3モノクローナル抗体PG3178と比較して試験した。この目的のために、N87細胞を、10%熱不活化FBSを補充したRP MI1640中で培養した。増殖アッセイのために、N87細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSAおよび10μg/mlのホロ・トランスフェリンを含むRPMI1640培地)中で2回洗浄した。抗体を、1から0.0001μg/mlまでの範囲の片対数滴定で希釈した。細胞を、漸増する濃度のHRG(0.04~39,5nM)の存在下で10000細胞/ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で3 日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen)を、製造者の指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。蛍光を、550nmの励起波長および590nmの発光波長で測定した。PB4188は、親抗HER3モノクローナル抗体と比較して優れた活性を示した(図1 9)。
アラニン・スキャニング変異誘発を使用して、それぞれHER2およびHER3について、PG3958およびPG3178のエピトープをマッピングした。ショットガン変異誘発アッセイでは、クローンを作製するが、ここでHER2/HER3細胞外ドメイン( ECD)の各アミノ酸残基を、アラニンに置換する。次に、細胞アレイを、リバーストランスフェクションによって調製した(米国特許出願公開第2011/0077163号A 1)。従って、各クローンのDNAを、リポフェクタミンと混合し、この混合物を、38 4ウェル・プレートの特化したウェル中に配置した。HEK293T細胞を、各ウェルに添加し、タンパク質の発現を、24時間後に測定した。引き続いて、抗体の反応性を、免疫蛍光染色によって測定し、結合マップおよび抗体結合のための重要残基の同定をもたらした。HER2およびHER3 ECD構築物の発現レベルを、市販のモノクローナル抗体(R&D mAb 1129(HER2)およびR&D mAb 66223(HER 3))を使用してFACS分析によって検証した。
HER2 ECD変異体への一価PG3958 Fabの結合を、このアッセイにおいて0.25μg/mlの濃度で試験し、ストリンジェントな洗浄条件を使用した(pH9.0、350mM NaCl)。これにより、コントロールmAbの結合を保持しつつ、WT HER2と比較して、PG3958 Fabの35%未満の残留結合を示した、H ER2における3つの「重要」残基(T144、R166、R181)が同定された。H ER2構造中の重要残基近傍に位置する2つの残基(P172、G179)は、顕著ではあるが、より重度ではない結合の喪失を示し、これらを「二次重要」残基と称した(表1 3および図21A)。これら全ての、表面に露出した残基は、HER2のドメインI中に位置し、これらは、一緒になって、HER2分子の表面上に非連続的パッチを形成する。
野生型(WT)HER2 ECDおよび表13に列挙されるHER2 ECDバリアントをコードする構築物を、CHO-K1細胞において発現させた。表面に露出しており、決定された重要残基に対し構造的に近傍にある3つのドメインI残基を、さらなる分析に選択した。チロシンへのT164、S180およびD143の点変異を、HER2 EC D構築物において作製し、得られた構築物もまた、CHO-K1において発現させた。L159A HER2 ECDバリアントを、コントロール・サンプルとして、CHO-K 1細胞において発現させた。
FACSにおける、HER3 ECD変異体への、0.25μg/mlのPG3178 IgGの結合分析により、コントロールmAbの結合が保持されつつ、アラニンへの変 異がWT HER3と比較して結合の実質的な喪失を引き起こした、2つのいわゆる「重要」残基(F409、R426)が同定された(表14および図23)。両方の残基は、HER3のドメインIII中に位置し、空間的に遠位である。さらに、F409は、HE R3疎水性コア中に埋められ、PG3178エピトープの一部である可能性は低くなっている。
CHO-K1細胞に、HER3 ECD変異構築物(表14中に列挙した)、WT H ER3 ECDおよび2つのコントロール構築物(H407AおよびY424A)をトランスフェクトした。HER3 ECDバリアントへのPG3178結合を、FACS滴定実験において試験した。HER3のドメインI(MM-121)およびドメインIII( MEHD7945A)に結合する2つのコントロール抗体を、細胞表面上のHER3 E CD発現を検証するために含めた。平均MFI値をプロットし、各曲線について、AUC を、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して計算した。WT HER 3結合を使用して、データを標準化した。R426A変異は、PG3178結合に重要であることが示されたが、F409Aへの結合は、細胞表面での発現の喪失に起因して確認できなかった(図24)。
HER2は、ヘレグリン受容体複合体HER2:HER4が関与するシグナル伝達ネットワークの一部として、成体心筋細胞の成長、修復および生存に関与する。心臓毒性は、HER2標的化における公知の危険因子であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用される場合に増加し、それによって、心臓負荷を誘導する。ヒト幹細胞由来の心筋細胞に基づくモデル系を使用して、PB4188の潜在的毒性を試験し、アントラサイクリン・ドキソルビシンの存在下で、トラスツズマブならびにトラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせに対して、その潜在的毒性を評価した。ヒト幹細胞由来の心筋細胞(Pluriomics BV)を、白色平底アッセイ・プレート( corning 655098)中に、20.000ウェルの濃度で播種した。培養の5 日目に、培地を、10ng/mlのHRGを補充したグルコースおよびガラクトース・フリーの培養培地に置き換えた。7日目に、試験抗体を、ドキソルビシン(3μM)と組み合わせて添加した。細胞生存度を、Promega Cell力価Gloアッセイを使用して、9日目にアッセイした。単一特異性抗体は、68nMの単一濃度で試験したが、P B4188は、3μMのドキソルビシンの存在下で3つの濃度で試験した。図25は、心筋細胞の生存度が、試験した全てのPB4188濃度によって影響を受けなかったことを示している。対照的に、トラスツズマブならびにトラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせの両方が、心筋細胞の細胞生存度を低減させた。
トラスツズマブおよびHER3抗体U1-59と比較した、PB4188の結合を、異なるレベルのHER2を発現する乳癌細胞株および胃癌細胞株に対するFACSによって分析した。細胞を、それらが数百万のHER2コピーを発現する場合、および/またはH ER2遺伝子増幅されている場合、HER2+++とみなした。以下の細胞株を使用した:MCF-7(HER2+);MDA-MB-468(HER2+、MKN-45(HE R2+)、MDA-MB-175(HER2+)、MDA-MB-453(HER2++)、MDA-MB-361(HER2++)、ZR-75-1(HER2++)、JIM T-1(HER2+++)、BT-474(HER2+++)、SKBR-3(HER2+++)、SK-OV-3(HER2+++)、N87(HER2+++)。指数関数 的に成長した培養物の細胞を、トリプシンによって回収し、FACS緩衝液(PBS/0. 5% BSA/0.5mM EDTA)中106細胞/mlに希釈した。1~2×105細胞を、U底96ウェル・プレート中の各ウェルに添加した。細胞を、4℃で300gで 2分間遠心分離した。上清を、上記のプレート(複数可)を反転させ、その後1回はじくことによって廃棄した。50μlの各IgGサンプルを、3.16ng~10μg/mlの連続希釈で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:100希釈したマウス抗ヒトIgGガンマPE(Invitrogen) を添加し、暗中で氷上で30~60分間インキュベートした。細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、HTS設定のFACSCantoフロー・サイトメーターで分析した。結合した抗体の量を、中央値蛍光によって評価した。データをプロットし、曲線下面積(AUC、中央値蛍光強度の累積測定値)を、試験した細胞株当たりで、各抗体について決定した(図26)。
PB4188およびトラスツズマブは、HER2への結合について競合しないPB4188は、HER2タンパク質のドメインIに結合するが、トラスツズマブの結合エピトープは、ドメインIV中に局在する。両方の抗体がHER2結合について競合しないことを実証するために、HER2増幅されたSKBR-3乳房細胞を用いた結合アッセイを実施した。最初に、未標識の抗体を、飽和濃度でSKBR-3に結合させた。次に、FITC標識されたPB4188を、滴定範囲内で添加し、蛍光をFACSによって測定した。図27は、PB4188FITCが、トラスツズマブまたは陰性コントロールの 存在下で細胞に効率的に結合したことを実証している。SKBR-3細胞とPB4188 とのプレインキュベーションは、PB4188FITCが結合することを防止した。従っ て、トラスツズマブおよびPB4188は、HER2への結合について競合しない。
HER2×HER3二量体上でのPB4188の配向が、HRGストレス条件下での細胞増殖を阻害するのに好ましいかどうかを試験するために、3178のHER3アーム、およびドメインI、II、IIIまたはIVのいずれかを標的化するHER2アームから構成される二重特異性抗体を作製した。2つのHER2×HER3二重特異性抗体を、HER2ドメインI~IVの各々のために作製した。HER2アームは以下を含んだ:ドメインIを標的化するMF3958およびMF3003;ドメインIIを標的化するMF2 889およびMF2913;ドメインIIIを標的化するMF1847およびMF300 1、ならびにドメインIVを標的化するMF1849およびMF1898。各HER2 Fabアームを、3178のHER3 Fabアームと組み合わせ、高濃度のヘレグリンの存在下での細胞増殖を阻害するそれらの強度について試験した。抗体滴定を、HER2 低発現性MCF-7細胞ならびに、HER2過剰発現性のN87およびSK-BR-3細胞に対して実施した。N87、SK-BR-3およびMCF-7細胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSAおよび10μg/mlのホロ・トランスフェリンを含むRPMI1640培地)中で2回洗浄した。抗体を、片対数滴定で希釈した。細胞を、実験的に規定されたストレス濃度のH RG(SK-BR-3は10nM、N87およびMCF-7は100nM)の存在下で、 10000細胞/ウェル(N87、SKB-BR-3)および5000細胞/ウェルMC F-7の密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で3~4日間培養 した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen)を添加して、増殖を評価した。吸光度を、590nmの発光波長を用いて550nmの励起波長で測定した。試験した全てのアッセイにおいて、HER2のドメインIを標的化する二重特異性抗体のみが、高いヘレグリン濃度の存在下で増殖を阻害することができた(図2 8)。
PB4188を小分子薬物と組み合わせる可能性を調査するために、PB4188を、PI3KまたはMAPK経路の異なるレベルにおいて妨害する薬物と組み合わせた。さらに、化学療法薬物およびサイクリン阻害剤との組み合わせを試験した。組み合わせを、マトリゲルにおいてHRGの存在下で(SK-BR-3およびBT-474)、またはHR Gストレス濃度の存在下で(増殖アッセイに記載したように、N87およびSK-BR- 3)成長しているHER2過剰発現性細胞に対して試験した。薬物組み合わせの阻害効果を、画像化によって、またはAlamar Blueを本明細書で上に記載したように使用して増殖を測定することによって、試験した。最初に、EC20 PB4188および試験する薬物を決定した。次に、交差力価測定を、PB4188および薬物を用いて実施した。相乗作用が、チロシン・キナーゼ阻害剤(アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ)、PI3Ka阻害剤BYL719、Akt阻害剤MK-2206、mTOR阻害剤エベロリムス、Src阻害剤サラカチニブ、微小管破壊薬物パクリタキセルおよびHDAC阻害剤ボリノスタット(図40中で「ボロニスタット(voronistat)」とスペルミスされている)を用いて試験した全ての細胞株において観察された。図29は、形態学的変化および細胞成長の低減を結果的に生じる、マトリゲルにおいて増殖したSKBR- 3細胞に対する、PB4188とラパチニブとの相乗的組み合わせの一例を示す。各組み合わせで得られた成長阻害の程度を計算した。強度のシフトは、その効果に到達するために必要とされる単剤と比較した場合に、所望のレベルを達成するために組み合わせにおいて必要とされる薬物の量がどれだけ少ないかを示すアイソボログラム(Grecoら、1 995)を使用して示され得る。CHALICE(商標)Analyzerソフトウェアが組み合わせ実験の阻害値を使用して、アイソボログラムを生成した。HER2増幅された細胞に対する異なる薬物組み合わせのアイソボログラムを、図40に示す。アイソボログラム分析により、PB4188が、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL7 19、MK-2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルとの相乗的な薬物組み合わせを示したことが示された。
指数関数的に成長した培養物の細胞を回収し、飢餓培地(N87細胞:RPMI-16 40、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン;SKBR-3細胞:DMEM/F-12、2mM L-グルタミン、0.05% BSA、10μg/m l ホロ・トランスフェリン)中で6ウェル・プレート中に播種し(N87について3. 75×106細胞およびSKBR-3について1.5×106細胞)、95%の相対湿度 中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、抗体を、5nMの最終濃度になるように添加し、細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。次いで、HRGを、100ng/mlの最終濃度になるように添加した。95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で1、3、6または24時間の後、プレートを氷上に配置し、細胞を冷PBSで2回洗浄した。引き続いて、0.3mlの氷冷溶解緩衝液を添加し(Cell signaling RTK #9803またはIC # 7018)、細胞を、氷上で最低30分間溶解させた。次に、タンパク質濃度を、BCA(Pierce #23235)を使用して測定した。タンパク質濃度を、溶解緩衝液を用いて2mg/mlに調整した。次に、溶解物を、PathScan RTK Sign aling Antibody Arrays(Cell signaling #79 49)またはPathScan Intracellular Signaling A ntibody Arraysに適用した。全てのインキュベーションを、オービタル・シェーカー上の密封ウェルを用いて室温で実施した。溶解物(75μl)を、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを補充した75μlのアレイ希釈剤緩衝液で0.8mg/mlの濃度まで2回希釈し、氷上で維持した。アレイ・ウェルを、100μlのアレイブロック緩衝液で15分間ブロッキングした。ブロック緩衝液を除去し、溶解物をウェルに適用し、2 時間インキュベートした。溶解物を吸引し、ウェルを、100μlの洗浄緩衝液で4回洗浄した。次に、1ウェル当たり100μlの検出抗体のカクテルを適用し、1時間インキュベートした。抗体のカクテルを吸引し、ウェルを、100μlの洗浄緩衝液で4回洗浄した。75μlのDylight80(商標)ストレプトアビジンを、各ウェルに添加した。Dylight80(商標)ストレプトアビジンを吸引し、ウェルを、100μlの洗浄緩衝液で4回洗浄した。マルチ-ガスケット(multi-gasket)を除去し、スライドを、脱イオン水中10mlで10秒間洗浄した。スライドを乾燥させ、Ody see(登録商標)Clxでの画像化のために処理した。スポット蛍光強度を、Imag e Studioソフトウェアを使用して計算した。
RTKおよび細胞内Pathscanアレイにおいて観察されたリン酸化阻害を検証するために、ウエスタン・ブロットを、HRGストレス濃度の存在下で、PB4188、ペルツズマブおよびトラスツズマブの組合せ、ならびにコントロール抗体で処置した細胞に対して実施した。指数関数的に成長した培養物の細胞を回収し、飢餓培地(N87細胞: RPMI-1640、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン; SKBR-3細胞:DMEM/F-12、2mM L-グルタミン、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン)中で、10cmディッシュ中に播種した( N87について20×106細胞およびSKBR-3について7×106細胞)。次の日、抗体を、5nMの最終濃度になるように添加し、細胞を1時間インキュベートした。次いで、HRGを、100ng/mlの最終濃度になるように添加した。1、3、6または24時間後、ディッシュを氷上に配置し、細胞を、冷PBSで2回洗浄し、エッペンドルフチューブに移し、250μlのRIPA溶解緩衝液(20mM Tris-HCl p H7.5、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1% NP-40、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、2.5mM ピロリン酸ナトリウム、1mM ベータ-グリセロホスフェート、1mM Na3VO4、1 μg/ml ロイペプチン)で溶解した。溶解を、氷上で30分間進行させた。細胞溶解物を遠心分離し、上清を、新しいエッペンドルフチューブ中に収集した。タンパク質濃度を、BCA法(Pierce)を使用して決定した。30μgの溶解物を、4~12%のBis-Tris NuPageゲル(Invitrogen)上で分離し、ゲル上のタンパク質を、ニトロセルロースのメンブレンに移した。メンブレンを、5% BSAを含むTBS-Tで1時間ブロッキングし、製造者の指示(Cell Signaling Technology)に従って、示された抗体で染色した。次いで、メンブレンを、H RPコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートし、ECL基質と共にインキュベートし、X線フィルム(Amersham)を使用するオートラジオグラフィーに供した。全ての検出抗体は、Cell Signaling Technologyからであった:ホスホ(Phospho)-Akt(ser 473)#4060、総(Total) Akt #4691、ホスホPhospho-HER2(Tyr 1221/1222)#2243、総 HER2 #2242、ホスホ-HER3(Tyr 1289)#4 791、総HER3 #4754、ホスホ-ERK1/2(Thr 202/Tyr 2 04)#4377、総ERK1/2 #4695、ホスホ-S6 RP(Ser 235
/236)#2211、総S6 RP #2217、ヤギ抗ウサギHRP-linked#7074。
2用量のPB4188および4用量のPB4188で処置したJIMT-1移植マウスの腫瘍(100mm3)を、投薬の24時間後に取り出した。腫瘍を、瞬間凍結し、粉末に加工した。腫瘍溶解物を、凍結粉末サンプルへの冷BioRad溶解緩衝液(0.4% BioRad Factor 1、0.2% BioRad Factor 2および2mM PMSFを補充した)の使用により、50mg腫瘍/mLの濃度に調製し、ロッカー上で4℃で60分間インキュベートして、完全な溶解を確実にした。これらのサンプルを、16000×gで4℃で10分間遠心分離し、アリコート化した。総タンパク質を、製造業者の指示に従ってBiorad DC Protein Assay試薬を使用して決定した。Luminexアッセイ:JIMT-1腫瘍溶解物サンプルを処理し、M illiporeからの市販のLuminexキット(カタログ番号48-618MAG(ロット番号2532050)、46-645MAG(ロット番号46645M-1K) を使用して、総AKT、AKT(Ser473)およびAKT(Thr308)について分析した。各サンプルを、2連で試験した。希釈物を、全ての総分析物およびリン酸化分析物の決定のために、1ウェル当たりおよそ25μgタンパク質の標的をロードするよう、サンプル希釈剤中に調製した。製造業者の仕様書に従って、Milliporeキットを使用した。
1または2用量のPB4188で処置したJIMT-1移植マウスの腫瘍(100mm3または400mm3)を取り出し、10%中性緩衝ホルマリン中で固定した。100mm3腫瘍を保有するマウスは、単一PB4188用量(25mg/kg)の24時間後に屠殺したが、400mm3腫瘍を保有するマウスは、25mg/kgの2回の週1回の用量を投与され、投薬の4時間後に屠殺した。次に、サンプルをパラフィン包埋した。厚さ7umの切片を、ミクロトーム(LEICA)を用いてスライスし、通し番号で標識した、正に荷電したガラス・スライド(VWR)上に配置した。スライドを、30分間風乾し、次いで、60℃に設定した加熱オーブン中で焼いた。次のサンプルを、異なるVera Tag分析のために処理した。米国特許出願第12/340,436号に従う総HER2 分析(HT2)、米国特許第8,349,574号と米国特許出願公開第2013/00 71859号に従う総HER3分析(H3T)、ならびに最後に、国際特許出願PCT/ US2014/033208に従うHER2-HER3ヘテロ二量体(H23D)、HE R3pY1289(H3pY1289)およびHER3-PI3キナーゼ(H3PI3K)。両方の投薬レジメンにおいて、未処置のコントロールと比較して、HER2:HER 3二量体における顕著なPB4188媒介性の低減が、明らかになった。PB4188処置した腫瘍とコントロールとの間で、総HER2、HER3またはリン酸化HER3における差異は観察されなかった。PB4188投薬の4時間後に分析した腫瘍は、未処置のコントロールと比較して、HER3-p85(PI3K)における顕著な低減を示した。
抗体の内部移行パターンを、pH感受性色素を使用して測定した。これは、WO201 3134686 A1において当技術分野で記載されており、ここで、かかる色素は、抗体とカップリングされた場合、より低いpHに曝露されたときに増加した蛍光シグナルを示す。これは、色素カップリングした抗体が、標的細胞の表面から、穏やかに酸性のエンドソーム(pH6~6.5)や酸性のリソソーム(5.5より低いpH)中に内部移行する場合に生じる。PB4188が癌細胞において内部移行するかどうかを調査するために、抗体を、製造者の指示に従って、スクシンイミジル・エステル反応性基を有するpHセンサー色素(Promega、カタログ番号CS1783A01)にカップリングさせた。コンパレーターとして、抗HER2(トラスツズマブ、ペルツズマブ、PG3958)、抗HER3(PG3178、#Ab6)および陰性コントロール(抗破傷風毒素、PG 1337)の色素標識された抗体を含めた。指数関数的に成長した培養物のHER2過剰発現性SKBR-3およびN87癌細胞を回収し、1ng/mlのHRGを含む100μ lのアッセイ培地(N87細胞については、RPMI-1640、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン。SKBR-3細胞については、DMEM/F-12、2mM L-グルタミン、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン)中で96ウェル・プレート上に播種し(1ウェル当たり15×103細胞 )、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、20 μlのpH感受性色素標識した抗体を添加して、100nMの最終濃度に到達させ、細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、非接着性細胞を収集し、接着性細胞をトリプシン処理することによって、細胞を回収した。FACS緩衝液(PBS 0.5% BSA 0.1% アジ化ナトリウム)で細胞を洗浄した後、細胞を、APC標識した抗ヒトIgG(Jackson Immunores earch、カタログ番号109-136-098、1:100希釈)で染色した。細 胞を、PEおよびAPCチャネルの中央値蛍光強度(MFI)を測定するFACSCant o(BD Biosciences)でのフロー・サイトメトリーによって分析して、それぞれ、抗体の内部移行および残留表面結合を決定した。図35に示されるデータは、P B4188がトラスツズマブと同じ程度まで内部移行するが、組み合わせトラスツズマブ+ペルツズマブは、増強された内部移行をもたらすことを示している。トラスツズマブ+ ペルツズマブの組み合わせは、トラスツズマブ単独と比較して、ADCCを低減する(図36)。従って、PB4188内部移行のレベルは、ADCC強度に影響を与えないと理解される。
抗HER3抗体MF3178のバリアントを、抗体特性を改善することを目的として設計した。変異を、VH遺伝子フレームワーク領域1(FR1)、相補性決定領域1(CD R1)、FR2、CDR2および/またはFR3中に導入したが、CDR3およびFR4 は改変しなかった。この設計は、翻訳後修飾(PTM)モチーフを除去するため(例えば、脱アミド・モチーフNSをNQに変化させることによる)、表面疎水性を低減するため(例えば、IをTに変化させることによる)または等電点を増加させるため(pI;例えば、QをKに変化させることによる)に導入された変異を含むが、それらに限定されない。20全てのバリアント(図37を参照のこと)を、破傷風トキソイド(TT)アームと組み合わせた二重特異性抗体として発現させ、MCF-7機能的アッセイにおいて試験したところ、20全てのバリアントが、この形式でMF3178抗体と類似の強度を有していた。20全てのバリアントを、MCF-7への結合について滴定でFACSにおいてもこの形式で試験したところ、全てのバリアントが、非常に類似の結合プロファイルを有し、これは、全てのバリアントの親和性が類似していることを示唆している。それぞれ、1 0、3および7つのアミノ酸変異を含む3つのリード・バリアントMF6058、MF6 061およびMF6065を、さらなる実験のために選択した(図16Eおよび図37の配列を参照のこと)。対応する単一特異性IgG1 PG6058、PG6061およびPG6065を大規模で産生し、精製した。図38に示されるように、HRG依存的N8 7細胞株増殖アッセイにおける3つのバリアントの阻害活性は、PG3178のものと類似である。3つのバリアントのCIEX-HPLCプロファイルは、図39に示されるように、電荷不均一性ならびにピーク幅および対称性に関して、PG3178のものと類似であった。主要ピークの保持時間(tR)は、抗体のpIと大まかに相関した。即ち、p Iが高いほど、より長い保持時間を生じた。二重特異性抗体または抗体の混合物の設計において、最適なtRを有する抗体バリアントを選択することは有用であるが、それは、C IEXを使用した所望の抗体成分の精製が促進され得るからである。
Claims (57)
- ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
ErbB-2およびErbB-3陽性細胞上の、ErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる、二重特異性抗体。 - 請求項1に記載の二重特異性抗体において、
前記抗体は、ErbB-2およびErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる、二重特異性抗体。 - 請求項2に記載の二重特異性抗体において、
前記抗体が、ErbB-2およびErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減でき、該細胞が、細胞1つ当たり少なくとも100.000の細胞表面のErbB-2受容体を有する、二重特異性抗体。 - 請求項1から3までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記細胞が、MCF-7細胞、SKBR-3細胞、NCI-N87細胞、BxPC-3 細胞、BT-474細胞またはJIMT-1細胞である、二重特異性抗体。 - 請求項1から4までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記第1の抗原結合部位が、ErbB-2のドメインIまたはドメインIVに結合する、二重特異性抗体。 - 請求項1から5までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記第2の抗原結合部位が、ErbB-3へのErbB-3リガンドの結合を妨害する、二重特異性抗体。 - ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
前記第1の抗原結合部位が、ErbB-2のドメインIに結合し、前記第2の抗原結合部位が、ErbB-3のドメインIIIに結合する、二重特異性抗体。 - ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
ErbB-3陽性細胞に対する前記第2の抗原結合部位の親和性(KD)が、ErbB-2陽性細胞に対する前記第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い、二重特異性抗体。 - 請求項1から8までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記抗体は、ErbB-2およびErbB-3陽性細胞上のErbB-3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる、二重特異性抗体。 - 請求項1から9までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ErbB-2およびErbB-3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる、二重特異性抗体。 - 請求項1から10までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ErbB-3陽性細胞に対する前記第2の抗原結合部位の親和性(KD)が、2.0nM以下、好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である、二重特異性抗体。 - 請求項1から11までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ErbB-2陽性細胞に対する前記第1の抗原結合部位の親和性(KD)が、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である、二重特異性抗体。 - 請求項1から12までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
BT-474細胞に対する前記二重特異性抗体の親和性(KD)が、5.0nM以下、好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.2nM以下であり、および/またはSK-BR-3細胞に対する前記二重特異性抗体の親和性が、5.0nM以下、好ましくは3.0nM以下、より好ましくは2.0nM以下である、二重特異性抗体。 - ErbB-2に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体であって、前記抗原結合部位のうち少なくとも一方が、ErbB-2のドメインIに結合する、抗体。
- 請求項14に記載の二重特異性抗体において、
ErbB-2陽性細胞に対する前記抗原結合部位のうち少なくとも一方の親和性(KD)が、5.0nM以下、好ましくは4.0nM以下、より好ましくは4.0nM以下である、抗体。 - ErbB-3に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体であって、前記抗原結合部位のうち少なくとも一方が、ErbB-3のドメインIIIに結合する、抗体。
- 請求項16に記載の抗体において、
ErbB-3陽性細胞に対する前記抗原結合部位のうち少なくとも一方の親和性(KD)が、2.0nM以下、好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である、抗体。 - 請求項1から17までのいずれか一項に記載の抗体において、
前記ErbB-3陽性細胞および/または前記ErbB-2陽性細胞が、BT-474 細胞またはSK-BR-3細胞である、抗体。 - 請求項1から18までのいずれか一項に記載の抗体において、
T144、T164、R166、P172、G179、S180およびR181、ならびにT144、T164、R166、P172、G179、S180またはR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB-2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む、抗体。 - 請求項1から19までのいずれか一項に記載の抗体において、
R426およびネイティブErbB-3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、Er bB-3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む、抗体。 - 請求項1から20までのいずれか一項に記載の抗体において、
図16Aまたは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849、MF 2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域のCDR3配列を少なくとも含む、抗体。 - 請求項1から21のいずれか一項に記載の抗体において、
図16Bまたは図16Eまたは図37に示されるMF3178、MF3176、MF3 163、MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057、M F6058、MF6059、MF6060、MF6061、MF6062、MF6063、MF6064、MF6065、MF6066、MF6067、MF6068、MF60 69、MF6070、MF6071、MF6072、MF6073およびMF6074からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域のCDR3配列を少なくとも含む、抗体。 - 請求項1から22までのいずれか一項に記載の抗体において、
図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849、M F2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF30 01、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB-2特異的重鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3配列を少なくとも含む、またはMF29 26、MF2930、MF1849、MF2973、MF3004、MF3958、MF 2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003もしくはMF1898のCD R1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3アミノ酸、好ましくは多くて2アミノ酸、好ましくは多くて1アミノ酸が異なるCDR配列を含む、抗体。 - 請求項1から23までのいずれか一項に記載の抗体において、
図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178、MF3176、M F3163、MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057、MF6058、MF6059、MF6060、MF6061、MF6062、MF60 63、MF6064、MF6065、MF6066、MF6067、MF6068、MF 6069、MF6070、MF6071、MF6072、MF6073およびMF607 4からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3配列を少なくとも含む、またはMF3178、MF3176、MF3163、MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057、MF605 8、MF6059、MF6060、MF6061、MF6062、MF6063、MF6 064、MF6065、MF6066、MF6067、MF6068、MF6069、M F6070、MF6071、MF6072、MF6073もしくはMF6074のCDR 1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3アミノ酸、好ましくは多くて2アミノ酸、好ましくは多くて1アミノ酸が異なるCDR配列を含む、抗体。 - 請求項1から24のいずれか一項に記載の抗体において、
図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849、M F2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF30 01、MF3003およびMF1898の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるE rbB-2特異的重鎖可変領域配列を含む、またはMF2926、MF2930、MF1 849、MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、M F2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003もしくはMF1898の重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む、抗体。 - 請求項1から25までのいずれか一項に記載の抗体において、
図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178、MF3176、M F3163、MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057、MF6058、MF6059、MF6060、MF6061、MF6062、MF60 63、MF6064、MF6065、MF6066、MF6067、MF6068、MF 6069、MF6070、MF6071、MF6072、MF6073およびMF607 4の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB-3特異的重鎖可変領域配列を含む、またはMF3178、MF3176、MF3163、MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057、MF6058、MF6059、MF60 60、MF6061、MF6062、MF6063、MF6064、MF6065、MF 6066、MF6067、MF6068、MF6069、MF6070、MF6071、MF6072、MF6073もしくはMF6074の重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む、抗体。 - 請求項1から26までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)を示す、二重特異性抗体。
- 請求項1から27までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、ADCCを増強するために非フコシル化されている、二重特異性抗体。
- 請求項1から28までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、ヒトまたはヒト化抗体である、二重特異性抗体。
- 請求項1から29までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
適合的なヘテロ二量体化ドメインを有する2つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む、二重特異性抗体。 - 請求項30に記載の二重特異性抗体において、
前記適合的なヘテロ二量体化ドメインが、適合的な免疫グロブリン重鎖CH3ヘテロ二量体化ドメインである、二重特異性抗体。 - 請求項1から31までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、両方のアームが共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。
- 請求項32に記載の二重特異性抗体において、
前記共通の軽鎖が、生殖系列軽鎖、好ましくは、IgVKl-39遺伝子セグメントを含む再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖、最も好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖IgVKl-39*01/IGJKl*01である、二重特異性抗体。 - 請求項1から33までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
標識、好ましくは、in vivo画像化のための標識をさらに含む、二重特異性抗体。 - 請求項1から34までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
- ErbB-2、ErbB-3もしくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、または前記腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、
請求項1から35までのいずれか一項に記載の抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む方法。 - 請求項1から34までのいずれか一項に記載の抗体において、
ErbB-2、ErbB-3もしくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、または有するリスクがある対象の処置における使用のための抗体。 - 請求項37に記載の、使用のための抗体において、
前記二重特異性抗体は、心筋細胞の生存に顕著に影響を与えない、使用のための抗体。 - 請求項37または38に記載の、使用のための抗体において、
前記二重特異性抗体は、健康な心機能と比較して90%未満の心機能を有する対象への使用のための抗体。 - ErbB-2、ErbB-3もしくはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、または前記腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、
・ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB-3に結合する第 2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体、ならびに
・PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される1または複数の化合物、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Sr c阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される1または複数の化合物、を対象に投与することを含む方法。 - ErbB-2、ErbB-3またはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍の処置における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB-3に結 合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
前記処置が、ErbB-2、ErbB-3またはErbB-2/ErbB-3陽性腫 瘍を有する対象に、前記二重特異性抗体、ならびに、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を投与すること、好ましくは、前記二重特異性抗体、ならびに、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、 Src阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物を投与することを含む、二重特異性抗体。 - 請求項40または41に記載の使用のための方法または抗体において、
前記チロシン・キナーゼ阻害剤は、アファチニブ、ラパチニブおよび/またはネラチニブを含む、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から42までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記PI3K阻害剤がBYL719である、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から43までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記Akt阻害剤はMK-2206である、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から44までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記mTOR阻害剤がエベロリムスである、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から45までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記Src阻害剤はサラカチニブである、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から46までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記微小管標的化薬物はパクリタキセルである、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から47までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記HDAC阻害剤がボリノスタットである、使用のための方法または抗体。 - ErbB-2、ErbB-3またはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する対象において転移の形成に対抗するための方法であって、
前記ErbB-2、ErbB-3またはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞は 、 BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現レベルを有し、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を対象に投与することを含む方法。 - ErbB-2、ErbB-3またはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞の転移の形成の処置または予防における使用のための、ErbB-2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB-3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
前記ErbB-2、ErbB-3またはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍細胞が 、 BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現レベルを有する、二重特異性抗体。 - 請求項36から50までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記対象が、細胞1つ当たり1.000.000未満の細胞表面にあるErbB-2受容体を有するErbB-2またはErbB-2/ErbB-3陽性腫瘍を有する、使用の ための方法または抗体。 - 請求項36から51までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記抗体は、請求項1から34までのいずれか一項に記載の抗体である、使用のための方法または抗体。 - 請求項36から52までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記腫瘍細胞が、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫の細胞である、使用のための方法または抗体。 - 請求項36から53までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記対象が、健康な心機能と比較して90%未満の心機能を有する、使用のための方法または抗体。 - 請求項39または54に記載の使用のための方法または抗体において、
前記心機能が、左室駆出分画(LVEF)を含む、使用のための方法または抗体。 - 請求項39、54または55のいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において、
前記対象は、うっ血性心不全(CHF)、左室機能不全(LVD)および/もしくは1 0%以上減少した左室駆出分画(LVEF)に罹患している、ならびに/または前記対象は、心筋梗塞を有している、使用のための方法または抗体。 - Akt、ERKおよび/またはS6リボソーム・タンパク質のリン酸化に対抗する、好ましくは阻害する、請求項1~34のいずれか一項に記載の抗体の使用。
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