KR20160145560A - ErbB-2와 ErbB-3에 결합하는 항체 - Google Patents

ErbB-2와 ErbB-3에 결합하는 항체 Download PDF

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세실리아 안나 윌헬미나 게위젠
코르네리스 아드리안 드 크루이프
마크 스로스비
톤 로그텐베르그
알렉산더 베르쏠드 헨드릭 바커
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메뤼스 엔.페.
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Abstract

본 발명은 특히 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 전형적으로 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포에 대한 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있다. 또한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/3 양성 종양을 가진 대상을 치료하기 위한 방법과 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/3 양성 종양을 가진 대상의 촬영 및 치료에 있어서 상기 항체의 용도가 기재되어 있다.

Description

ErbB-2와 ErbB-3에 결합하는 항체{ANTIBODY THAT BINDS ERBB-2 AND ERBB-3}
본 발명은 항체 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 이상 세포를 포함한 질병을 치료하기 위한 치료용 (인간) 항체 분야에 관한 것이다. 보다 특별하게는 본 발명은 ErbB-2와 ErbB-3에 결합하는 항체 및 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포, 특히 종양 세포의 결합에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.
인간 상피 성장 인자 수용체 계열(HER, 포괄적으로 ErbB 신호전달망이라고도 함)은 막관통 수용체 티로신 키나아제(RTK) 계열이다. 상기 계열은 ErbB-1(또는 HERI)이라고도 알려져 있는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)와 유사 수용체인 ErbB-2(HER2), ErbB-3(HER3)과 ErbB-4(HER4)를 포함한다. 상기 수용체(Yarden and Pines 2012에서 논의됨)는 상피세포에서 광범위하게 발현된다. 헤레귤린(HRG) 또는 상피 성장 인자(EGF)와 같은 HER 수용체 또는 이들의 리간드의 상향 조절은 인간의 암에서 흔한 현상이다(Wilson Fridlyand et al. 2012). ErbB-1과 ErbB-2의 과발현은 특히 상피 종양에서 일어나고 종양 침윤, 전이, 화학요법에 대한 내성과 나쁜 예후와 관련이 있다(Zhang, Berezov et al. 2007). 정상적인 유방에서는 ErbB-3은 내강 상피의 성장과 분화에 있어 중요한 것으로 밝혀졌다. 예를 들면 ErbB-3의 손실/저해로 인해 내강 상피에 비해 기저 상피가 선택적으로 팽창된다(Balko, Miller et al, 2012). RTK의 세포외 도메인에 리간드가 결합하면 동일한 수용체 서브타입(동종 다이머화)과 서로 다른 수용체 서브 타입(이종 다이머화) 사이 모두에서 수용체 다이머화가 유도된다. 다이머화는 자가 인산화를 거치는 세포내 티로신 키나아제 도메인을 활성화할 수 있고 또한 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK)와 생존 촉진 경로 Akt에 의해 매개되는 것을 포함한 다수의 후속 증식 촉진 신호전달경로를 활성화할 수 있다(Yarden and Pines, 2012에 논의되어 있음). ErbB-2에 대해 특이적인 내생 리간드는 전혀 동정되어 있지 않으므로 이종 다이머화를 통해 정상적으로 신호전달하는 것으로 추정된다(Sergina, Rausch et al. 2007). ErbB-3은 그의 리간드의 개입에 의해 활성화될 수 있다. 이들 리간드로는 뉴레귤린(NRG)과 헤레귤린(HRG)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
ErbB 수용체 계열의 다양한 신호전달의 활성화 방식이 확인되었다. 이들 중에는 리간드 의존적 및 리간드 독립적인 신호전달 활성화가 있다. 과발현된 ErbB-2는 ErbB-3 리간드가 없는 상태에서도 ErbB-2:ErbB-3 헤테로다이머를 통해 종양형성 신호전달을 발생시킬 수 있다(Junttila, Akita et al. 2009). ErbB-2 활성은 ErbB-2 특이적 항체에 의해 저해될 수 있다. 이러한 ErbB-2 특이적 항체는 예를 들면 ErbB-2 양성(HER2+) 종양 치료에 사용되고 있다. 이러한 치료에 따른 문제점은 종종 종양이 ErbB-2 특이적 치료를 벗어나 저해 항체가 존재하는 상태에서도 계속 성장한다는 점이다. 유방, 난소, 자궁과 위 종양과 같은 ErbB-2 양성 종양은 상향 조절된 ErbB-3 발현(Ocana, Vera-Badillo et al. 2013) 및/또는 ErbB-3 리간드 발현(Wilson, Fridlyand et al. 2012)을 나타내는 종양 세포 아집단의 선택적 신장에 의해 치료를 벗어날 수 있음이 관찰되었다. 또한 ErbB-3 수용체에서 활성화하는 변이가 확인되었다.
항-ErbB-2 단일클론 항체 트라스투주맙(trastuzumab, 헤르셉틴)과 ErbB-1 특이적 세툭시맙(에르비툭스)은 임상용으로 승인된 몇 개의 단일클론 항체들이다. 트라스투주맙의 이점은 전이성 유방암에서 증명된 생존율이다(Arteaga, Sliwkowski et al. 2011). 트라스투주맙의 정확한 작용 기전은 명백하게 정립되지 않았다. 제시된 작용 방식은 RTK 신화전달 저해와 항체 의존적 세포독성(ADCC)의 동원(recruitment)이다. 기술된 다른 작용 기전은 ErbB-2 세포외 도메인의 단백질 가수분해성 분해(cleavage), 혈관형성 인자의 저해 및 수용체 세포내 이입의 증강을 포함한다. ErbB-2 신호전달을 방해하는 다른 물질들은 승인되었거나 유방암과 그 외 다른 ErbB-2 과발현 암의 치료용으로 개발 중에 있다. 예를 들면 화합물 라파티닙(lapatinib)은 ErbB-1과 ErbB-2 티로신 키나아제 활성을 저해하고 ErbB-2가 증폭된 유방암의 제1 선택 치료에 사용되고 있다.
HER2+ 전이성 유방암 환자에서 단일 물질로서 또는 화학요법과 조합한 트라스투주맙에 대한 내성은 보통 치료를 시작한 지 수개월 내 발생한다. HER2+ 전이성 유방암 환자의 일부만이 트라스투주맙 단일 물질에 반응하는데, 이는 진행 암에서 새로운(de novo) 내성 기전을 암시한다. 이들 기전은 특히 수용체의 다른 HER 계열로부터 신호전달과 HER 계열 이외의 RTK로부터 보상 신호전달(compensatory signaling)을 포함한다(Thery et al., Resistance to human epidermal growth factor receptor type 2-targeted therapies, Eur J Cancer (2014), Vol. 50, Issue 5, pages 892-901 (ttp://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.01.003)). 예를 들어 HER2와 함께 HER3 또는 그의 리간드의 과발현으로 인해 HER-2/HER-3 헤테로다이머의 형성과 트라스투주맙에 대한 획득 내성이 나타난다. 이에 따라 항체 트라스투주맙은 ErbB-3 리간드에 의해 주도되는 신호전달 차단에 효과가 없는 것으로 생각된다(Wehrman, Raab et al. 2006, Junttila, Akita et al. 2009, Thery et al. 2014).
최근에 단일클론 항체 페르투주맙(pertuzumab)은 진행 없이 5개월간 더 생존을 가능하게 하는 장점이 있어 트라스투주맙과 조합하여 사용하는 것이 승인되었다(Baselga, Cortes et al. 2012). 페르투주맙은 또한 ErbB-2에는 결합하지만 트라스투주맙과는 다른 위치에서 결합한다.
ErbB-2 양성 종양을 치료하기 위한 다른 전략들은 ErbB-3에 집중되고 있다. ErbB-3 결합 단일클론 항체는 전임상 연구에서 활성이 입증되었다(Schoeberl, Faber et al. 2010). 일부 ErbB-3 결합 단일클론 항체는 다양한 암의 증식과 성장을 저해할 수 있다.
또 다른 전략은 ErbB-2와 ErbB-3 수용체 모두의 결합을 수반한다. 분자 MM- 111은 ErbB-2와 ErbB-3에 결합하는 2개의 단일쇄 Fv(scFv) 단편을 함유한 생물학적 인공분자이다. 상기 2개의 scFv는 분자의 반감기를 증가시키는 변이된 인간 혈청 알부민(HSA) 단백질과 관련이 있다. 상기 분자는 전임상 시험에서 ErbB-3 신호전달과 증식을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 이 효과는 주로 상대적으로 많은 양의 ErbB-2를 발현한 ErbB-3 양성 세포주에 대해 측정되었다.
본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성(bispecific) 항체로서 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있는 항체를 제공한다. 상기 제1 항원 결합 부위는 바람직하게는 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 VH쇄 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(인간화 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(인간화 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001; MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열을 가진 VH쇄를 포함하는 가변 도메인에 존재한다. 상기 제2 항원 결합 부위는 바람직하게는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 가진 VH쇄를 포함하는 가변 도메인에 존재한다. 상기 가변 도메인 내 면역글로불린 경쇄는 바람직하게는 도 16C의 아미노산 서열을 포함한다.
달리 구체적으로 특정하지 않는 한, 본 발명의 항체는 바람직하게는 이중 특이성 항체이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 표지, 바람직하게는 생체내 촬영을 위한 표지를 더 포함하는 항체가 또한 제공된다.
본 발명은 또한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 방법으로서 상기 대상에 본 발명에 따른 이중 특이성 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에 사용하기 위한 이중 특이성 항체가 또한 제공된다.
본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시키거나 감소시킬 수 있는 항체를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항원 결합 부위"는 항원에 결합할 수 있는 이중 특이성 항체로부터 유도되고 바람직하게는 상기 이중 특이성 항체 상에 존재하는 부위를 말한다. 미변성 항원 결합 부위는 전형적으로 상기 항체의 가변 도메인에 의해 형성되고 상기 가변 도메인 내 존재한다. 상기 가변 도메인은 상기 항원 결합 부위를 함유한다. 항원에 결합하는 가변 도메인은 상기 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인이다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 가변 도메인은 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 상기 항원 결합 부위는 조합된 VH/VL 가변 도메인 또는 VH 영역에만 또는 VL 영역에만 존재할 수 있다. 상기 항원 결합 부위가 가변 도메인의 2개의 영역 중 하나의 영역에만 존재할 때, 다른 하나의 가변 영역은 결합 가변 영역의 접힘(folding) 및/또는 안정성에 기여할 수 있지만 항원 자체의 결합에는 그다지 기여하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 항원 결합이란 항체가 그의 항원에 결합하는 전형적인 능력을 의미한다. ErbB-2에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체는 ErbB-2에 결합하고 그 외 동일한 조건에서 동일 종의 동종 수용체인 ErbB-1과 ErbB-4에는 적어도 100배 더 낮게 결합한다. ErbB-3에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체는 ErbB-3에 결합하고 그 외 동일한 조건에서 동일 종의 동종 수용체인 ErbB-1과 ErbB-4에는 결합하지 않는다. ErbB 계열은 세포 표면 수용체 계열임을 고려하여 결합은 전형적으로 수용체(들)를 발현하는 세포에 대해 평가된다. 항원에 대한 항체의 결합은 다양한 방법으로 평가할 수 있다. 하나의 방법은 항체를 항원(바람직하게는 항원을 발현하는 세포)과 함께 배양하고 미결합 항체를 (바람직하게는 세척 단계에 의해) 제거하고 결합된 항체를 결합된 항체에 결합하는 표지된 항체에 의해 검출하는 것이다.
항체에 의한 항원 결합은 전형적으로 상기 항체의 상보성 영역과 상기 항원과 가변 도메인 모두의 특이적 3차원 구조를 통해 매개되어 이들 2개의 구조가 항체의 불규칙한 비특이적 고착과 달리 정밀하게(열쇠와 자물쇠와 비슷한 상호 작용) 서로 결합되도록 한다. 항원의 에피토프를 인식하는 항체와 이러한 에피토프는 다른 화합물에도 존재할 수 있기 때문에 ErbB-2 및/또는 ErbB-3에 결합하는 본 발명에 따른 항체는 이러한 다른 화합물이 동일한 에피토프를 함유하고 있는 경우에는 다른 단백질도 인식할 수 있다. 그러므로 용어 "결합"은 동일한 에피토프를 함유하는 또 다른 단백질 또는 단백질(들)에 항체가 결합하는 것을 배제하는 것은 아니다. 이러한 다른 단백질(들)은 인간 단백질이 아닌 것이 바람직하다. ErbB-2 항원 결합 부위와 ErbB-3 항원 결합 부위는 본 발명에서 정의한 바와 같이 전형적으로 생후, 바람직하게는 성인 인간에 있는 세포막 상의 다른 단백질에는 결합하지 않는다. 본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 전형적으로 적어도 lxl0e-6 M의 결합 친화도를 가진 ErbB-2와 ErbB-3에 결합할 수 있는바, 아래에서 더 자세하게 설명하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결합을 방해하는"은 항체가 ErbB-3 상의 에피토프를 지향하고 ErbB-3에 결합하기 위해 리간드와 경쟁하는 것을 의미한다. 항체는 리간드 결합을 약화시키고, ErbB-3에 리간드가 이미 결합되어 있을 때에는 리간드의 위치를 이동시키거나 예를 들면 입체 장애를 통해 적어도 부분적으로 리간드가 ErbB-3에 결합하지 못하게 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 항원 상의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 함유하는, 바람직하게는 단백질의 면역글로불린류에 속하는 단백질성 분자를 의미하는 것으로 이러한 도메인은 항체의 가변 도메인으로부터 유도되거나 상기 가변 도메인과 서열 상동성을 공유한다. 치료용 항체는 치료할 대상의 천연 항체(예를 들면 인간 대상의 경우에는 인간 항체)에 가급적 가까운 것이 바람직하다. 항체 결합은 특이성과 친화성 관점에서 나타낼 수 있다. 특이성은 어느 항원 또는 이의 에피토프가 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는지를 결정한다. 친화성은 특정 항원 또는 에피토프에 결합하는 강도에 대한 척도이다. 특이적 결합은 적어도 lx10e-6 M, 더 바람직하게는 lx10e-7 M, 더 바람직하게는 lx10e-9 M보다 높은 친화도(KD)를 가진 결합으로서 정의된다. 전형적으로 치료용 항체는 lx10e-10 M 이상의 친화도를 갖는다. 본 발명의 이중 특이성 항체와 같은 항체는 천연 항체의 불변 도메인(Fc 부분)을 포함한다. 본 발명의 항체는 전형적으로 바람직하게는 인간 IgG 하위 분류의 이중 특이성 전장(full length) 항체이다. 바람직하게는 본 발명의 항체는 인간 IgG1 하위 분류를 갖는다. 본 발명의 이러한 항체는 양호한 ADCC 특성을 갖고, 인간 생체내 투여시 바람직한 반감기를 가지며, 클론 세포에서 공발현시 호모다이머에 비해 우선적으로 헤테로다이머를 형성하는 변형 중쇄를 제공할 수 있는 CH3 조작 기술이 존재한다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 "전장" 항체이다. 본 발명에 따르면 용어 '전장'은 실질적으로 완전한 항체를 포함하는 것으로 정의되지만 온전한 항체의 모든 기능을 반드시 가질 필요는 없다. 의심의 여지를 없애기 위해서 전장 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 함유한다. 각각의 사슬은 불변(C) 영역과 CH1, CH2, CH3, VH와 CL, VL로 표시되는 도메인으로 분해될 수 있는 가변(V) 영역을 함유한다. 항체는 Fab 부분에 함유되어 있는 가변 도메인을 통해 항원에 결합하고 결합 후 불변 도메인, 주로 Fc 부분을 통해 면역계의 분자와 세포와 상호 작용할 수 있다. 본 명세서에서 용어 '가변 도메인', 'VH/VL 쌍', 'VH/VL'은 호환하여 사용된다. 본 발명에 따른 전장 항체는 바람직한 특성을 제공하는 변이가 존재할 수 있는 항체를 포함한다. 이러한 변이는 상기 영역 중 어느 한 영역의 실질적인 부분의 결실은 아니어야 한다. 그러나 하나 또는 여러 아미노산 잔기가 결실되어 있는 항체는 그 결과 얻어지는 항체의 결합 특성을 실질적으로 변경하지 않는다면 용어 "전장 항체"에 포함된다. 예를 들면 IgG 항체는 불변 영역에 1-20개의 아미노산 잔기 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 예를 들면 항체 자체가 낮은 ADCC 활성을 가질 때 항체의 ADCC 활성은 항체의 불변 영역을 약간 변형시킴으로써 개선될 수 있다(Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489).
전장 IgG 항체는 바람직한 반감기 및 면역원성을 이유로 완전히 자가 (인간) 분자에 가까워야 할 필요성 때문에 바람직하다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 이중 특이성 IgG 항체, 바람직하게는 이중 특이성 전장 IgG1 항체이다. IgGl은 인간에서 순환 반감기가 길기 때문에 바람직하다. 인간에서 면역원성을 예방하기 위해 본 발명에 따른 이중 특이성 IgG 항체는 인간 IgG1인 것이 바람직하다.
용어 '이중 특이성'(bs)은 항체(위에서 정의한)의 한 부분이 항원의 하나의 에피토프에 결합하는 반면에 제2 부분은 다른 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 다른 에피토프는 전형적으로 다른 항원 상에 존재한다. 본 발명에 따르면, 상기 제1 및 제2 항원은 사실상 서로 다른 2개의 단백질이다. 바람직한 이중 특이성 항체는 서로 다른 2개의 단일클론 항체의 부분들을 포함하고 결국 서로 다른 2개의 유형의 항원에 결합하는 항체이다. 상기 이중 특이성 항체의 하나의 아암(arm)은 전형적으로 하나의 항체의 가변 도메인을 함유하고 다른 아암은 또 다른 항체의 가변 도메인을 함유한다. 본 발명의 이중 특이성 항체의 중쇄 가변 영역은 전형적으로 서로 다른 반면에, 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 본 발명의 이중 특이성 항체에서 동일하다. 서로 다른 중쇄 가변 영역이 동일하거나 또는 공통의 경쇄와 관련이 있는 이중 특이성 항체는 공통 경쇄를 가진 이중 특이성 항체라고도 한다. 따라서 본 발명에 따르면 2개의 아암이 공통 경쇄를 포함하는 이중 특이성 항체가 또한 제공된다.
바람직한 이중 특이성 항체는 단일 세포 내 서로 다른 2개의 중쇄와 공통 경쇄의 공발현에 의해 얻어질 수 있다. 야생형 CH3 도메인을 사용할 때, 서로 다른 2개의 중쇄와 공통 경쇄의 공발현 결과 서로 다른 3개의 종인 AA, AB와 BB가 얻어질 것이다. 원하는 이중 특이성 산물(AB)의 비율을 증가시키기 위해서 CH3 조작을 이용하거나 환언하면 아래에 정의된 바와 같이 양립 가능한 헤테로다이머화 도메인을 가진 중쇄를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '양립 가능한 헤테로다이머화 영역'이란 조작된 도메인 A'가 조작된 도메인 B'와, 또한 그 반대로 헤테로다이머를 우선적으로 형성하는 반면에 A'-A'와 B'-B' 사이의 호모다이머화는 줄어들도록 조작되는 단백질 도메인을 의미한다.
본 발명에 따르면 용어 '공통 경쇄'는 전장 항체의 결합 특이성이 영향을 받지 않으면서 동일하거나 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있는 경쇄를 의미한다. 예를 들면 보존성 아미노산 변화를 도입 및 시험하고 중쇄와 쌍을 이룰 때 결합 특이성에 기여하지 않거나 부분적으로만 기여하는 영역에서 아미노산의 변화 등에 의해 동일하지 않지만 기능적으로는 여전히 동등한 경쇄를 제조하거나 찾는 것은 본 명세서에서 사용되는 공통 경쇄의 정의의 범위 내에 있을 수 있다. 용어 '재배열된'이 추가 또는 추가되지 않은 용어 '공통 경쇄', '공통 VL', '단일 경쇄', '단일 VL'은 모두 본 명세서에서는 호환하여 사용된다. 본 발명의 일 요지는 서로 다른 중쇄와 조합하여 기능성 항원 결합 도메인을 가진 항체를 형성할 수 있는 인간 경쇄를 공통 경쇄로서 사용하는 것이다(WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant et al. 1998 and Nissim et al. 1994). 바람직하게는 상기 공통 경쇄는 생식선 서열을 갖는다. 바람직한 생식선 서열은 인간 레퍼토리(repertoire)에서 흔히 사용되고 있고 양호한 열역학적 안정성, 수율과 용해도를 가진 경쇄 가변 영역이다. 바람직한 생식선 경쇄는 O12, 바람직하게는 재배열된 생식선 인간 카파 경쇄 IgVκl-39*01/IGJκl*01 또는 이의 단편 또는 기능적 동등물이다(즉, 동일한 IgVκl-39 유전자 조각(segment)이지만 다른 IGJκ 유전자 조각)(월드와이드웹 imgt.org의 IMGT 데이터베이스에 따른 명명법 참조). 따라서 본 발명에 따르면, 상기 공통 경쇄가 생식선 경쇄, 바람직하게는 IgVKl-39 유전자 조각을 포함하는 재배열된 생식선 인간 카파 경쇄, 가장 바람직하게는 재배열된 생식선 인간 카파 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01인 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 용어 재배열 생식선 인간 카파 경쇄 IgVκl-39*01/IGJκl*01, IGKV1-39/1GKJ1, huVκl-39 경쇄 또는 간단히 huVκ1-39는 본원 전체에 걸쳐 혼용하여 사용된다. 명백하게도 당업자라면 "공통"은 또한 아미노산 서열이 동일하지 않은 경쇄의 기능적 동등물을 의미한다는 것을 알 것이다. 기능적 결합 영역의 형성에 실질적으로 영향을 주지 않는 변이(결실, 치환, 부가)가 존재하는 상기 경쇄의 많은 변이체들이 존재한다. 본 명세서에서 위에 명시한 대로, 본 발명의 경쇄는 1-5개 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 경쇄일 수도 있다.
VH가 제1 항원을 특이적으로 인식할 수 있고 상기 VH와 면역글로불린 가변 도메인 내 VH와 쌍을 이루는 VL이 제2 항원을 특이적으로 인식할 수 있는 항체가 또한 고려된다. 얻어진 VH/VL 쌍은 항원 1 또는 항원 2에 결합할 것이다. 이러한 소위 "투-인-원(two-in-one) 항체"는 예를 들면 WO 2008/027236, WO 2010/108127과 Schaefer et al(Cancer Cell 20, 472-486, October 2011)에 기재되어 있고 본 발명의 이중 특이성 항체와는 다르며 "투-인-원" 항체라고도 한다. 이러한 "투-인-원" 항체는 동일한 아암을 가지며 본 발명의 항체는 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 'ErbB-2'는 인간에서 ErbB-2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말한다. 상기 유전자 또는 단백질에 대한 다른 명칭들로는 CD340; HER-2; HER-2/neu; MEN 19; NEU; NGL; TKR1을 포함한다. 상기 ERBB-2 유전자는 흔히 HER2(인간 상피 성장 인자 수용체 2로부터)라고 명명한다. 본 명세서에서 ErbB-2라고 언급하는 것은 인간 ErbB-2를 말한다. ErbB-2에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체는 인간 ErbB-2에 결합한다. 상기 ErbB-2 항원 결합 부위는 인간과 다른 포유류 오솔로그(ortholog) 간 서열과 3차 구조 유사성으로 인해 이러한 오솔로그에 또한 결합하지만 반드시 그런 것은 아니다. 인간 ErbB-2 단백질과 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 비밀번호는 (NP_001005862.1, NP_004439.2 NC_000017.10 NT_010783.15 NC_018928.2)이다. 상기 비밀번호는 일차적으로 표적으로서 ErbB-2를 동정하는 또 다른 방법을 제공하기 위해 주어지고, 상기 항체에 결합한 ErbB-2 단백질의 실제 서열은 예를 들면 몇몇 암 등에서 일어나는 것들과 같이 코딩 유전자에서의 변이 때문에 변할 수 있다. 상기 ErbB-2 항원 결합 부위는 ErbB-2와 몇몇 ErbB-2 양성 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 같은 ErbB-2의 다양한 변이체에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 'ErbB-3'은 인간에서 ERBB-3 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 말한다. 상기 유전자 또는 단백질에 대한 다른 명칭들로는 HER3; LCCS2; MDA-BF-1; c-ErbB-3; c-erbb-3; erbb-3-S; pl80-Erbb-3; p45-sErbb-3; 및 p85-sErbb-3이 있다. 본 명세서에서 ErbB-3이라고 언급하는 것은 인간 ErbB-3을 말한다. ErbB-3에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체는 인간 ErbB-3에 결합한다. 상기 ErbB-3 항원 결합 부위는 인간과 다른 포유류 오솔로그 간 서열과 3차 구조 유사성으로 인해 이러한 오솔로그에 또한 결합하지만 반드시 그런 것은 아니다. 인간 ErbB-3 단백질과 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 데이터베이스 비밀번호는 (NP_001005915.1 NP_001973.2, NC_000012.11 NC_018923.2 NT_029419.12)이다. 상기 비밀번호는 일차적으로 표적으로서 ErbB-3을 동정하는 또 다른 방법을 제공하기 위해 주어지고, 항체에 의해 결합되는 ErbB-3 단백질의 실제 서열은 예를 들면 몇몇 암 등에서 일어나는 것들과 같이 코딩 유전자에서의 변이 때문에 변할 수 있다. 상기 ErbB-3 항원 결합 부위는 ErbB-3과 몇몇 ErbB-2 양성 종양 세포에 의해 발현되는 것들과 같은 ErbB-3의 다양한 변이체에 결합한다.
ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 본 발명의 이중 특이성 항체는 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있거나 감소시킨다. 과량의 ErbB-2가 존재하는 상태에서 ErbB-2/ErbB-3 헤테로다이머는 상기 헤테로다이머 내 ErbB-3 쇄에 대해 검출 가능한 리간드가 없는 상태에서 발현하는 세포에 성장 신호를 제공할 수 있다. 이러한 ErbB-3 수용체 기능은 본 명세서에서 ErbB-3의 리간드 독립적인 수용체 기능이라고 한다. 상기 ErbB-2/ErbB-3 헤테로다이머는 또한 ErbB-3 리간드가 존재하는 상태에서 발현하는 세포에 성장 신호를 제공한다. 이러한 ErbB-3 수용체 기능은 본 명세서에서 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능이라고 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "ErbB-3 리간드"란 ErbB-3에 결합하여 활성화하는 폴리펩티드를 말한다. ErbB-3 리간드의 예는 뉴레귤린 1(NRG)와 뉴레귤린 2, 베타셀루린, 헤파린 결합 상피 성장 인자와 에피레귤린을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 용어는 생물학적으로 활성인 단편 및/또는 천연 폴리펩티드의 변이체를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능은 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 ErbB-3 리간드 유도 성장이다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 세포는 MCF-7 세포(ATCC® HTB-22™); SKBR3(ATCC® HTB-30™) 세포; NCI-87(ATCC® CRL-5822™) 세포; BxPC-3-luc2 세포(Perkin Elmer 125058), BT-474 세포(ATCC® HTB-20™) 또는 JIMT-1 세포(DSMZ no.: ACC 589)이다.
바람직한 구현예에 있어서, 상기 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포는 세포 표면에 적어도 50,000개의 ErbB-2 수용체를 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 적어도 100,000개의 ErbB-2 수용체를 포함한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포는 세포 표면에 적어도 1,000,000개의 ErbB-2 수용체를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포는 세포 표면에 단지 1,000,000개의 ErbB-2 수용체만을 포함한다. 트라스투주맙(헤르셉틴)과 페르투주맙과 같이 현재 이용 가능한 치료법은 임상 반응을 얻기 위해서 이들의 세포 표면에 1,000,000개가 넘는 ErbB-2 수용체를 가진 악성 ErbB-2 양성 세포를 가진 환자에게만 처방되고 있을 뿐이다. 1,000,000개가 넘는 ErbB-2 수용체가 세포 표면에 있는 ErbB-2 양성 종양 세포를 가진 환자는 전형적으로 ErbB-2[+++]로서 분류된다. 환자들은 예를 들면 Dako Denmark A/S에 의해 모두 판매되고 있는 HercepTest™ 및/또는 HER2 FISH(pharm Dx™)를 이용하고/또는 Monogram Biosciences에 의해 판매되고 있는 HERmark® 분석시료를 이용하여 분류된다. ErbB-2 농도가 더 낮은 환자는 전형적으로 트라스투주맙과 페르투주맙으로 치료시 충분한 임상적 반응을 보이지 않기 때문에 트라스투주맙과 페르투주맙은 ErbB-2[+++]환자에게만 처방되고 있다. 그러나 본 발명은 트라스투주맙에 비해 ErbB-2 수용체 농도가 더 낮은 세포에 대해 향상된 결합 친화도를 갖기도 하는 이중 특이성 항체를 제공한다. 실시예에 나타나 있는 바와 같이 ErbB2 발현이 더 낮은 이러한 세포의 증식은 본 발명에 따른 항체에 의해 효과적으로 저지된다. 이렇게 더 낮은 ErbB-2 수용체 농도는 ErbB-2[++] 또는 ErbB-2[+]로서 분류되는 환자의 악성 세포에 존재한다. 또한 악화된 ErbB-2 양성 종양은 대부분 세포 당 수용체가 1,000,000개 미만인 ErbB-2 수용체 농도를 갖고 있다. 따라서 이러한 ErbB-2[++] 또는 ErbB-2[+] 환자뿐 아니라 ErbB-2 양성 종양이 있는 환자는 바람직하게는 본 발명에 따른 이중 특이성 항체로 치료된다. 따라서 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있는 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 또한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상의 치료를 위한 방법으로서 상기 종양이 세포 당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 갖고 상기 방법은 본 발명에 따른 이중 특이성 항체 또는 약제학적 조성물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명에 따르면, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에 사용하기 위한 이중 특이성 항체로서 상기 종양이 세포 당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 갖는 항체가 또한 제공된다. 본 발명에 따른 상기 항체는 전형적으로 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능, 바람직하게는 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도는 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화성과 동등하거나 이보다 더 높은데, 본 명세서에서 더 자세하게 후술하기로 한다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 바람직하게는 4.0 nM 이하이다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 항체는 R426로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
종양이 ErbB-3에 양성인지 규명하기 위하여 당업자라면 예를 들어 ErbB-3 증폭 및/또는 면역조직화학에서 염색을 판단할 수 있다. 바이옵트(biopt)에서 적어도 10% 종양 세포는 양성이어야 한다. 상기 바이옵트는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 이상의 양성 세포를 함유할 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 리간드 유도 수용체 기능은 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30, 40, 50 60 또는 적어도 70%만큼 감소되고, 특히 바람직한 구현예에 있어서는 리간드 유도 수용체 기능은 80%, 더 바람직하게는 90%만큼 감소된다. 상기 감소는 바람직하게는 본 발명의 이중 특이성 항체가 존재하는 상태에서 리간드 유도 수용체 기능을 결정하고 이를 항체가 없는 것을 제외하고는 동일한 조건에서 동일한 기능과 비교함으로써 결정된다. 상기 조건은 적어도 ErbB-3 리간드의 존재를 포함한다. 존재하는 리간드의 양은 바람직하게는 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포주의 최대 성장의 절반을 유도하는 양이다. 이 시험을 위한 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포주는 바람직하게는 MCF-7 세포주(ATCC® HTB-22™), SKBR3 세포주(ATCC® HTB-30™) 세포, JIMT-1 세포주(DSMZ ACC 589) 또는 NCI-87 세포주(ATCC® CRL-5822™)이다. ErbB-3 리간드 유도 수용체 기능을 결정하기 위한 상기 시험 및/또는 리간드는 바람직하게는 실시예에 명시되어 있는 바와 같이 ErbB-3 리간드 유도 성장 감소에 대한 시험이다.
상기 ErbB-2 단백질은 여러 개의 도메인을 함유한다(참고로 Landgraf, R Breast Cancer Res. 2007; 9(1): 202-의 그림 1 참조). 세포외 도메인은 도메인 I-IV로서 언급된다. 본 명세서에서 기재되어 있는 항체의 항원 결합 부위의 도메인 각각에 대한 결합 위치를 매핑하였다(실시예 참조). ErbB-2(제1 항원 결합 부위)의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 항원 결합 부위(제1 항원 결합 부위)를 가진 본 발명의 이중 특이성 항체는 다양한 경쇄와 조합시 ErbB-2에 대해 상당한 결합 특이성과 친화성을 유지하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. ErbB-2(제1 항원 결합 부위)의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 항원 결합 부위(제1 항원 결합 부위)와 ErbB-3에 대한 항원 결합 부위(제2 항원 결합 부위)를 가진 이중 특이성 항체는 ErbB-2의 또 다른 세포외 도메인에 결합하는 항원 결합 부위(제1 항원 결합 부위)를 포함하는 이중 특이성 항체에 비해 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시키는데 매우 효과적이라는 것이 밝혀졌다. ErbB-2에 결합하는 항원 결합 부위(제1 항원 결합 부위)를 포함하는 이중 특이성 항체에서 상기 항원 결합 부위가 ErbB-2의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 항원 결합 부위는 ErbB-2의 도메인 IV에 결합한다. ErbB-2에 결합하고 ADCC를 더 포함하는 항원 결합 부위(제1 항원 결합 부위)를 가진 이중 특이성 항체는 특히 생체내 현저한 ADCC 활성을 갖지 않은 다른 ErbB-2 결합 항체보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서 ADCC를 나타내는 본 발명에 따른 이중 특이성 항체가 바람직하다. 상기 제1 항원 결합 부위가 ErbB-2의 도메인 IV에 결합하는 항체는 내재 ADCC 활성을 가진 것으로 밝혀졌다. 낮은 내재 ADCC 활성을 가진 도메인 I 결합 ErbB-2 결합 항체는 ADCC 활성을 증강시키기 위해서 조작될 수 있고 Fc 영역은 대식세포, 자연 살해 세포, B-세포와 호중구와 같은 면역 주효 세포 상의 서로 다른 수용체에 결합함으로써 항체 기능을 매개한다. CD16A(FcγRIILA)와 CD32A(FcγRIIA)와 같은 이들 수용체 중 일부는 세포를 활성화하여 항원에 대한 반응을 구축한다. CD32B와 같은 다른 수용체들은 면역세포의 활성을 저해한다. 선택성이 더 큰 활성화 수용체에 결합하는 Fc 영역을 조작함으로써(아미노산 치환체 도입을 통해) 항암 Mab에 의해 원하는 세포독성 활성을 매개하는 능력이 더 큰 항체를 생성할 수 있다.
항체의 ADCC를 증강시키기 위한 기술은 비푸코실화(afucosylation)이다(예를 들어 Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489 참조). 따라서 본 발명에 따르면 비푸코실화된 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 선택적으로 또는 추가로 예를 들면 당공학(glycoengineering)(Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt (Roche) and Eureka Therapeutics)과 돌연변이생성(Xencor and Macrogenics)을 포함한 여러 다른 전략을 이용하여 ADCC를 증강시킬 수 있는바, 이들 전략은 모두 저친화도 활성화 FcγRIIIa에 대한 Fc 결합 개선 및/또는 저친화도 저해 FcγRIIb에 대한 결합 감소를 추구하는 것이다.
ADCC를 유발하는데 있어 항체 또는 주효 세포의 효능을 결정하기 위한 여러 체외 방법이 있다. 이들 중에는 크롬-51[Cr51] 방출 분석법, 유로퓸[Eu] 방출 분석법, 황-35[S35] 방출 분석법이 있다. 보통 임의의 표면 노출된 항원을 발현하는 표지된 표적 세포주를 상기 항원에 특이적인 항체와 함께 배양한다. 세척 후, 전형적으로 Fc 수용체 CD16을 발현하는 주효 세포를 항체 표지된 표적 세포와 함께 공배양한다. 이어서 전형적으로 표적 세포 용해를 세포내 표지 방출, 예를 들면 신틸레이션 계수기 또는 분광광도법에 의해 측정한다. 바람직한 시험이 실시예에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 하나의 장점은 예를 들어 PB4188 내지 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포와 같은 본 발명에 따른 항체의 결합에 의해 트라스투주맙과 비교하여 동일한 정도로 내재화가 얻어진다는 사실이다. 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합을 사용하면 이들 항체의 내재화가 증진된다. 그러나 이렇게 증진된 내재화의 결과 ADCC가 감소한다. 따라서 트라스투주맙과 비교하여 실질적으로 동일한 정도로 내재화를 나타내는 본 발명에 따른 항체는 이러한 항체에 의해 ADCC 활성이 더 잘 유지되기 때문에 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합에 비해 바람직하다.
ErbB-3에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 본 발명의 항체는 ErbB-3 리간드가 ErbB-3에 결합하는 것을 방해한다. 이러한 항체는 특히 ErbB-2에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체와 관련하여 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포주 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시키는데 보다 효과적이다.
본 발명의 바람직한 구현예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 제1 항원 결합 부위가 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 이중 특이성 항체를 제공한다. 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 이들 특성을 가진 이중 특이성 항체는 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포에 잘 결합할 수 있고 이들의 활성(ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능과 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 리간드 유도 성장과 같은)을 저지할 수 있다.
게다가 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위를 포함하는 본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 트라스투주맙과 페르투주맙과 같은 기존의 항-ErbB-2 치료법과 조합 사용하기에 특히 적합한바, 이는 트라스투주맙과 페르투주맙이 ErbB-2의 서로 다른 도메인에 결합하기 때문이다. 트라스투주맙은 ErbB-2의 도메인 IV에 결합하고 페르투주맙은 ErbB-2의 도메인 II에 결합한다. 따라서 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 이들이 동일한 에피토프에 대해 트라스투주맙과 페르투주맙과 경쟁하지 않기 때문에 바람직하다.
또 다른 바람직한 구현예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 제2 항원 결합 부위가 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 이중 특이성 항체를 제공한다. 본 발명에 따른 이러한 항체는 ErbB-3의 도메인 I에 결합하는 MM-121(Merrimack Pharmaceuticals; #Ab6라고도 함)과 RG7116(Roche)과 같은 ErbB-3의 도메인 III에 결합하지 않는 현재 사용되고 있는 항-ErbB-3 결합 분자와의 조합 치료에 특히 적합한바, 이 경우 상기 서로 다른 결합 분자가 동일한 에피토프에 대해 서로 경쟁하지 않기 때문이다.
바람직하게는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 제1 항원 결합 부위가 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 상기 제2 항원 결합 부위가 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 이중 특이성 항체가 제공된다. 이러한 항체는 트라스투주맙과 페르투주맙과 같이 ErbB-2의 도메인 I에 결합하지 않는 항-ErbB-2 결합 분자와 MM-121(#Ab6)과 RG7116과 같은 ErbB-3의 도메인 III에 결합하지 않는 항-ErbB-3 결합 분자와의 조합 치료에 특히 적합하다.
바람직한 일 구현예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서 상기 제1 항원 결합 부위가 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 상기 제2 항원 결합 부위가 ErbB-3의 도메인 III에 결합하며 상기 항체가 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있는 항체를 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)가 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 더 높은 이중 특이성 항체를 제공한다. 예를 들어 ErbB-3보다 ErbB-2에 대한 친화도가 더 높은 Merrimack Pharmaceuticals사의 MM-111과 같은 종래의 이중 특이성 화합물과 대조적으로 본 발명은 세포 상의 ErbB-2에 대한 ErbB-2-특이적 아암의 친화도보다 더 높은 세포 상의 ErbB-3에 대한 친화도를 가진 ErbB-3-특이적 아암을 가진 이중 특이성 항체를 제공한다. 이러한 이중 특이성 항체는 ErbB-3의 낮은 세포 표면 농도에도 불구하고 ErbB-3에 더 잘 결합할 수 있다. 이는 ErbB-3에 대한 기능적 활성이 종래 화합물에 비해 증강되는 장점을 제공하는바, 본 발명에 따른 이들 이중 특이성 항체가 ErbB-3 활성(리간드 유도 성장과 같은)을 더 잘 저지할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "친화도"는 KD 값을 의미한다.
ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)는 바람직하게는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.5 nM 이하, 보다 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-3에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.5 nM 이하, 더 바람직하게는 1.39 nM, 바람직하게는 0.99 nM이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 1.39-0.59 nM의 범위 내에 있다. 바람직한 일 구현예에 있어서, BT-474 세포 상의 ErbB-3에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.5 nM 이하, 더 바람직하게는 1.0 nM 이하, 더 바람직하게는 0.5 nM 이하, 더 바람직하게는 0.31 nM 이하, 더 바람직하게는 0.23 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 0.31-0.15 nM의 범위 내에 있다. 위에서 언급한 친화도는 바람직하게는 정상 상태 세포 친화도 측정법을 이용하여 측정한 것으로, 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 방사성 표지된 항체를 이용하여 세포를 4℃에서 배양한 후 세포 결합된 방사성을 측정한다.
ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도(KD)는 바람직하게는 5.0 nM 이하, 더 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.9 nM 이하이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-2에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도는 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 3.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.0 nM 이하, 더 바람직하게는 2.3 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 3.0-1.6 nM의 범위 내에 있다. 바람직한 일 구현예에 있어서, BT-474 세포 상의 ErbB-2에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도는 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.9 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 4.5-3.3 nM의 범위 내에 있다. 위에서 언급한 친화도는 바람직하게는 정상 상태 세포 친화도 측정법을 이용하여 측정한 것으로, 이때 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 방사성 표지된 항체를 이용하여 세포를 4℃에서 배양한 후 세포 결합된 방사성을 측정한다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따르면 BT-474 세포에 대한 친화도(KD)가 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 3.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.7 nM 이하, 더 바람직하게는 3.2 nM 이하인 이중 특이성 항체가 제공된다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 3.7-2.7 nM의 범위 내이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따르면 SK-BR-3 세포에 대한 친화도가 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 3.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.0 nM 이하, 바람직하게는 2.5 nM 이하, 더 바람직하게는 2.0 nM 이하인 이중 특이성 항체가 제공된다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 2.4-1.6 nM의 범위 내이다. 또한 위에서 언급한 친화도는 바람직하게는 정상 상태 세포 친화도 측정법을 이용하여 측정한 것으로, 이때 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 방사성 표지된 항체를 이용하여 세포를 4℃에서 배양한 후 세포 결합된 방사성을 측정한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서 ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)가 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도 이하이고 상기 항체가 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있는 이중 특이성 항체를 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있다.
위에서 언급한 ErbB-3에 대한 높은 친화도를 가진 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 ErbB2의 도메인 I 및/또는 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 따라서 본 발명에 따르면 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)가 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 더 높은 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 본 발명에 따르면 ErbB2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도가 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 더 높은 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따르면 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도가 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 더 높은 이중 특이성 항체가 제공된다.
상기 제2 항원 결합 부위는 바람직하게는 ErbB-3의 도메인 III에 결합하고 ErbB-3 양성 세포에 대한 친화도(KD)가 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.5 nM 이하, 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 제2 항원 결합 부위는 ErbB-3의 도메인 III에 결합하고 SK-BR-3 세포 상의 ErbB-3에 대한 친화도가 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.5 nM 이하, 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 1.39-0.59 nM의 범위 내에 있다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 제2 항원 결합 부위는 ErbB-3의 도메인 III에 결합하고 BT-474 세포 상의 ErbB-3에 대한 친화도가 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.5 nM 이하, 더 바람직하게는 1.0 nM 이하, 더 바람직하게는 0.5 nM 이하, 더 바람직하게는 0.31 nM 이하, 더 바람직하게는 0.23 nM이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 0.31-0.15 nM의 범위 내에 있다.
상기 제1 항원 결합 부위는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 ErbB-2 양성 세포에 대한 친화도(KD)가 5.0 nM 이하, 더 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.9 nM 이하이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 SK-BR-3 세포 상의 ErbB-2에 대한 친화도가 5.0 nM 이하, 더 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 3.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.0 nM 이하, 더 바람직하게는2.5 nM 이하, 더 바람직하게는 2.3 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 3.0-1.6 nM의 범위 내에 있다. SK-BR-3 세포에 대한 상기 이중 특이성 항체의 친화도는 바람직하게는 5.0 nM 이하, 더 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 3.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.0 nM 이하, 더 바람직하게는 2.5 nM 이하, 더 바람직하게는 2.4 nM 이하, 더 바람직하게는 2.0 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 2.4-1.6 nM의 범위 내에 있다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 BT-474 세포 상의 ErbB-2에 대한 친화도(KD)가 5.0 nM 이하, 더 바람직하게는 4.5 nM 이하, 바람직하게는 3.9 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 4.5-3.3 nM의 범위 내에 있다. BT-474 세포에 대한 상기 이중 특이성 항체의 친화도는 바람직하게는 5.0 nM 이하, 더 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 3.7 nM 이하, 더 바람직하게는 3.2 nM 이하이다. 상기 친화도는 3.7-2.7 nM의 범위 내에 있다.
또한 위에서 언급한 친화도는 바람직하게는 정상 상태 세포 친화도 측정법을 이용하여 측정한 것으로, 이때 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 방사성 표지된 항체를 이용하여 세포를 4℃에서 배양한 후 세포 결합된 방사성을 측정한다.
본 발명에 따르면 또 다른 바람직한 구현예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있고 심근 세포의 생존에 크게 영향을 주지 않는 이중 특이성 항체를 제공한다. 심장 독성은 ErbB-2를 표적으로 하는 치료법에서 공지의 위험 인자이고 트라스투주맙을 안트라사이클린과 조합하여 사용할 때 합병증 빈도가 증가하여 심장 스트레스를 야기한다. 예를 들면 트라스투주맙과 독시사이클린(DOX)의 조합은 심각한 심장 부작용을 유발한다. 임상 연구를 통해 유방암의 보조 요법에서 트라스투주맙을 투여한 환자의 5% 내지 10%는 심장 기능장애가 발병한 것으로 추정되었다(Guarneri et al., J Clin Oncol., 1985, 3:818-26; Ewer MS et al., Nat Rev Cardiol 2010;7:564-75). 그러나 자극증상이 없는 심장 기능장애가 발병할 위험은 트라스투주맙을 DOX와 보조 요법에서 사용할 때 실제로 약 25% 만큼 높다는 것이 후향적 연구에서 입증되었다(Wadhwa et al., Breast Cancer Res Treat 2009; 117:357-64). 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명은 ErbB-2를 표적으로 하고 트라스투주맙과 페르투주맙에 비해 심근 세포의 생존에 영향을 주지 않거나 상당히 적은 정도로 영향을 주는 항체를 제공한다. 이는 심장 독성이 감소하기 때문에 중요한 장점을 제공한다. 이는 심장 기능이 손상되지 않은 사람들에게는 이미 유리하고 심지어 심장 기능이 손상된 사람들 또는 손상될 위험이 있는 사람들, 예를 들면 울혈성 심부전(CHF), 좌심실 기능부전(LVD) 및/또는 좌심실 박출율(LVEF)이 ≥10% 감소된 대상 및/또는 심근경색이 있었던 대상에게도 더욱 유리하다. 따라서 심근 세포의 생존에 크게 영향을 주지 않는 본 발명에 따른 항체가 바람직하다. 체외에서 심근 세포의 기능은 예를 들면 심근 세포의 생존율을 결정하고, BNP(심장 생물 표지자인 B형 나트륨 이뇨 펩티드)를 결정하고, QT 연장을 결정하고/또는 미토콘드리아 막 전위를 결정함으로써 측정된다.
본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 본 발명에 따르면 일 구현예는 심근 세포의 생존에 크게 영향을 주지 않고 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도가 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 높은 항체를 제공한다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 5.0 nM 이하, 더 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하이다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 심근 세포의 생존에 크게 영향을 주지 않는 상기 항체는:
- 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDR1, CDR2와 CDR3 서열 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열, 또는 상기 나열된 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개의 아미노산, 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산에서 상이한 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는
- 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDR1, CDR2와 CDR3 서열 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열, 또는 상기 나열된 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개의 아미노산, 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산에서 상이한 중쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 PB4188이다.
본 발명의 또 다른 요지는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산 잔기에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함하는 본 발명에 따른 항체를 제공한다. 상기 아미노산 잔기 번호는 단백질 정보은행(PDB) ID #1S78에 따라 부여된 것이다. 실시예에 나타나 있는 바와 같이, ErbB-2의 도메인 I의 상기 영역에 결합하는 항체는 특히 양호한 결합 특성을 나타내고 이들은 ErbB-2 양성 세포의 활성(ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능 및/또는 이러한 세포의 리간드 유도 성장과 같은)을 저지할 수 있다. 게다가 이러한 항체는 이들이 ErbB-2의 서로 다른 도메인에 결합하기 때문에 트라스투주맙(ErbB-2의 도메인 IV에 결합)와 페르투주맙(ErbB-2의 도메인 II에 결합)과 같이 현재 알려져 있는 항-ErbB-2 단일클론 항체와의 조합 치료에 특히 적합하다. 그러므로 이들 항체는 동일한 에피토프에 대해 경쟁하지 않고 동시에 사용할 수 있다. 용어 "T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기"란 상기 나열된 잔기에 인접한 첫 번째 약 5개의 아미노산 잔기 이내에 위치해 있는 1차 아미노산 서열에 있고 상기 단백질 외부에 적어도 부분적으로 노출되어 항체에 의해 결합될 수 있는 아미노산 잔기를 말한다(예를 들면 도 21B 참고). 바람직하게는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 상기 아미노산 잔기는 L139, C140, Y141, Q142, D143, 1145, L146, W147, K148, D149, L159, T160, L161, 1162, D163, N165, S167, R168, A169, C170, H171, C173, S174, P175, M176, C177, K178, C182, W183, G184, E185와 S186로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산 잔기에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따르면 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 T144, R166과 R181에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체가 제공된다. 또 다른 구현예는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 T144, R166, P172, G179와 R181에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다. 또 다른 구현예는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 요지는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 R426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함하는 항체를 제공한다. 상기 아미노산 잔기 번호는 단백질 정보은행(PDB) ID #4P59에 따라 부여된 것이다. 실시예에 나타나 있는 바와 같이, ErbB-3의 도메인 III의 상기 영역에 결합하는 항체는 특히 양호한 결합 특성을 나타내고 이들은 ErbB-3 양성 세포의 활성(ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능 및/또는 이러한 세포의 리간드 유도 성장과 같은)을 저지할 수 있다. 용어 "천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기"란 R426으로부터 11.2 Å 내 공간 위치해 있는 ErbB-3 단백질의 3차 구조 내에 있고 상기 단백질 외부에 적어도 부분적으로 노출되어 이들이 항체에 의해 결합될 수 있는 아미노산 잔기를 말한다. 바람직하게는, 상기 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 상기 아미노산 잔기는 L423, Y424, N425, G427, G452, R453, Y455, E480, R481, L482, D483과 K485로 이루어진 군으로부터 선택된다(예를 들어 도 21C와 표 15를 참고). 바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따르면 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 R426에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체가 제공된다. 바람직하게는 상기 항체는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 R426에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 바람직하게는 ADCC 활성을 증강시키기 위해서 비푸코실화된다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 바람직하게는 정상 CHO 세포에서 생산되는 동일한 항체에 비해 Fc 영역 내 N-연결 탄수화물 구조의 소량의 푸코실화를 포함한다.
본 발명의 이중 특이성 항체는 바람직하게는 인간에서 사용된다. 이를 위해, 본 발명의 이중 특이성 항체는 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다.
폴리펩티드에 대한 인간의 내성은 다수의 상이한 양상들에 의해 좌우된다.
T-세포 매개, B-세포 매개 면역 등은 폴리펩티드에 대한 인간의 내성에 포함되는 변수들 중 하나이다. 본 발명의 이중 특이성 항체의 불변 영역은 바람직하게는 인간 불변 영역이다. 상기 불변 영역은 바람직하게는 천연 인간 항체의 불변 영역과 하나 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 상기 불변 부분은 전적으로 천연 인간 항체로부터 유도되는 것이 바람직하다. 여기에서 생산되는 다양한 항체는 인간 항체 가변 도메인 라이브러리로부터 유도된다. 이와 같은 이들 가변 도메인은 인간이다. 상기 고유(unique) CDR 영역은 인간으로부터 유래되거나 합성 영역이거나 또 다른 생명체로부터 유래될 수 있다. 상기 가변 영역은 CDR 영역을 제외한 천연 인간 항체의 가변 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가질 때 인간 가변 영역으로 간주된다. 본 발명의 항체 내 ErbB-2 결합 VH, ErbB-3 결합 VH 또는 경쇄의 가변 영역은 천연 인간 항체의 가변 영역과 하나 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 함유할 수 있는데, 이때 CDR 영역의 아미노산 서열 내 있을 수 있는 차이는 헤아리지 않았다. 이러한 변이는 체세포 초변이와 관련하여 자연에서 일어나기도 한다.
항체는 적어도 중쇄 가변 영역과 관련하여 다양한 동물종으로부터 유래될 수 있다. 이러한 예를 들면 쥐의 중쇄 가변 영역을 인간화하는 것이 통례이다. 이를 달성할 수 있는 다양한 방법 중에는 쥐의 중쇄 가변 영역의 3D 구조에 일치하는 3D 구조를 가진 인간 중쇄 가변 영역에 CDR 이식; 바람직하게는 쥐의 중쇄 가변 영역으로부터 알려져 있거나 의심되는 T- 또는 B-세포 에피토프를 제거함으로써 수행되는 쥐과 중쇄 가변 영역의 역면역화가 있다. 상기 제거는 전형적으로 또 다른(전형적으로 보존성) 아미노산에 대해 에피토프 내 아미노산 중 하나 이상을 치환하여 에피토프의 서열을 변형시킴으로써 더 이상 T- 또는 B-세포 에피토프가 안되도록 함으로써 이루어진다.
이러한 역면역화된 쥐의 중쇄 가변 영역은 쥐의 원래 중쇄 가변 영역보다 인간에서는 덜 면역원성이다. 바람직하게는 본 발명의 가변 영역 또는 도메인은 더 인간화, 예를 들면 베니어(veneer)된다. 베니어링 기술을 이용함으로써 면역계에 의해 쉽게 접하는 외부 잔기는 선택적으로 인간 잔기로 대체되어 약하게 면역원성이거나 실질적으로 비면역원성인 베니어된 표면을 포함하는 혼성 분자를 제공한다. 본 발명에서 사용되는 동물은 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 영장류, 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 바람직하게는 인간 항체의 불변 영역을 포함한다. 이들의 중쇄 불변 도메인의 차이점에 따르면, 항체는 다음과 같은 5개의 분류 또는 동형으로 나뉜다: IgG, IgA, IgM, IgD와 IgE. 이들 분류 또는 동형은 해당 그리스 문자로 명명되어 있는 상기 중쇄 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서 본 발명에 따르면 상기 불변 영역이 IgG, IgA, IgM, IgD와 IgE 불변 영역의 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 상기 불변 영역이 IgG 불변 영역, 더 바람직하게는 IgG1 불변 영역, 바람직하게는 변이된 IgG1 불변 영역을 포함하는 항체를 제공한다. IgG1의 불변 영역에서 일부 변이는 예를 들면 동종이형 Glml, 17과 Glm3과 같이 자연계에서 일어나고/또는 얻어지는 항체의 면역학적 특성 변화 없이 이루어진다. 전형적으로 약 1-10개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합이 불변 영역에서 이루어진다.
일 구현예에 있어서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하되 도 16A와 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열을 포함하거나 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 단 1개의 아미노산에서 상이한 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 적어도 CDR3 서열, 가장 바람직하게는 적어도 MF3958의 CDR3 서열을 포함한다.
상기 항체는 바람직하게는 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR1, CDR2와 CDR3 서열 또는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 CDR1, CDR2와 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산에서 상이한 중쇄 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게는 적어도 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열, 가장 바람직하게는 적어도 MF3958의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하되 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열을 포함하거나 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 단 1개의 아미노산에서 상이한 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 적어도 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 CDR3 서열, 가장 바람직하게는 적어도 MF3178의 CDR3 서열을 포함한다.
상기 항체는 바람직하게는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDRl, CDR2과 CDR3 서열 또는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산에서 상이한 중쇄 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게는 적어도 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열, 가장 바람직하게는 적어도 MF3178의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함한다.
일 구현예에 있어서 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 제1 항원 결합 부위는 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열 또는 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 단 1개의 아미노산에서 상이한 중쇄 CDR3 서열을 포함하고 상기 제2 항원 결합 부위는 도 16B 또는 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열 또는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 단 1개의 아미노산에서 상이한 중쇄 CDR3 서열을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다. 상기 제1 항원 결합 부위는 바람직하게는 적어도 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 CDR3 서열, 가장 바람직하게는 적어도 MF3958의 CDR3 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 부위는 바람직하게는 적어도 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 CDR3 서열, 가장 바람직하게는 적어도 MF3178의 CDR3 서열을 포함한다.
상기 제1 항원 결합 부위는 바람직하게는 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 또는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산에서 상이한 중쇄 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하고 상기 제2 항원 결합 부위는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 또는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산에서 상이한 중쇄 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함한다. 상기 제1 항원 결합 부위는 바람직하게는 적어도 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열, 가장 바람직하게는 적어도 MF3958의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하고 상기 제2 항원 결합 부위는 바람직하게는 적어도 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열, 가장 바람직하게는 적어도 MF3178의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함한다.
바람직한 일 구현예는 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 제1 항원 결합 부위가 적어도 MF3958의 CDR3 서열 또는 MF3958의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 단 1개의 아미노산에서 상이한 CDR3 서열을 포함하고 상기 제2 항원 결합 부위는 적어도 MF3178의 CDR3 서열 또는 MF3178의 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 단 1개의 아미노산에서 상이한 CDR3 서열을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
일 구현예에 있어서 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 제1 항원 결합 부위가 적어도 MF3958의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 또는 MF3958의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산에서 상이한 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하고 상기 제2 항원 결합 부위가 적어도 MF3178의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 또는 MF3178의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열과 최대 3개, 바람직하게는 최대 2개, 바람직하게는 최대 1개의 아미노산에서 상이한 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
일 구현예에 있어서 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 제1 항원 결합 부위가 적어도 MF3958의 CDR3 서열을 포함하고 상기 제2 항원 결합 부위가 적어도 MF3178의 CDR3 서열을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
일 구현예에 있어서 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 제1 항원 결합 부위가 적어도 MF3958의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하고 상기 제2 항원 결합 부위가 적어도 MF3178의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
CDR 서열은 바람직하게는 항체의 결합 효능 또는 안정성을 향상시키기 위해서 예를 들면 최적화를 목적으로 다양화된다. 최적화는 예를 들면 얻어진 항체의 안정성 및/또는 결합 친화성을 바람직하게 시험한 후 향상된 ErbB-2 또는 ErbB-3 특이적 CDR 서열을 바람직하게 선택하는 돌연변이생성 과정에 의해 수행된다. 당업자라면 본 발명에 따른 적어도 하나의 변경된 CDR 서열을 포함하는 항체 변이체를 잘 만들 수 있다. 예를 들면 보존성 아미노산 치환이 적용된다. 보존성 아미노산 치환의 예는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 또 다른 소수성 잔기에 대해 치환하는 것과 라이신에 대한 아르기닌, 아스파르트산에 대한 글루탐산 또는 아스파라긴에 대한 글루타민의 치환과 같이 하나의 극성 잔기를 또 다른 극성 잔기에 대해 치환하는 것을 포함한다.
일 구현예에 있어서 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하되 상기 가변 도메인의 VH쇄가 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 VH쇄 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(인간화 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(인간화 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열을 포함하거나; 도 16A 또는 도 16E의 위에서 언급한 VH쇄 서열에 대하여 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 VH쇄 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(인간화 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(인간화 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다. ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 바람직하게는 도 16A에 나타낸
- MF1849; 또는
- MF2971 또는 이의 인간화 변형형태로서 바람직하게는 MF3958의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 변형형태; 또는
- MF3004 또는 이의 인간화 변형형태로서 바람직하게는 MF3991의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 변형형태의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에 있어서, ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 VH쇄 MF1849; 또는 MF2971 또는 이의 인간화 변형형태로서 바람직하게는 MF3958의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 변형형태; 또는 MF3004 또는 이의 인간화 변형형태로서 바람직하게는 MF3991의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 변형형태의 아미노산 서열을 포함하되, 상기 나열된 VH 서열은 도 16A에 나타낸 각각의 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는다. 바람직한 일 구현예에 있어서, ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 MF3958의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A에 나타낸 MF3958의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체는 바람직하게는 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 더 포함하는 이중 특이성 항체이다. 상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 바람직하게는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하거나; 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37의 VH쇄에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 바람직하게는 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함하거나; 도 16B 또는 도 37의 각각의 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 MF3178의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B에 나타낸 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는 위에 언급한 아미노산 삽입, 결실과 치환은 CDR3 영역에는 존재하지 않는다. 위에 언급한 아미노산 삽입, 결실과 치환은 또한 바람직하게는 CDRl과 CDR2 영역에 존재하지 않는다. 위에 언급한 아미노산 삽입, 결실과 치환은 또한 바람직하게는 FR4 영역에 존재하지 않는다.
본 발명은 또한 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하되 상기 가변 영역의 VH쇄가 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 ErbB3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 바람직하게는 VH쇄 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 VH쇄 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 항체는 바람직하게는 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 더 포함하는 이중 특이성 항체인 것이 바람직하다. 상기 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 바람직하게는 도 16A 또는 도 16E의 VH쇄의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 바람직하게는 MF1849; 또는 MF2971 또는 이의 인간화 변형형태의 아미노산 서열을 포함하되 상기 인간화 변형형태(바람직하게는 도 16A에 나타낸 MF3991의 아미노산 서열을 포함함)는 바람직하게는 MF3958; 또는 MF3004 또는 이의 인간화 변형형태의 아미노산 서열을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 상기 나열된 Erb-B2 결합 VH 서열은 도 16A에 나타낸 각각의 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 도 16A의 ErbB-2 결합 VH쇄는 MF3958의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 MF3958의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는 위에 언급한 아미노산 삽입, 결실과 치환은 바람직하게는 CDR3 영역에는 존재하지 않는다. 위에 언급한 아미노산 삽입, 결실과 치환은 또한 바람직하게는 CDRl과 CDR2 영역에 존재하지 않는다. 위에 언급한 아미노산 삽입, 결실과 치환은 또한 바람직하게는 FR4 영역에 존재하지 않는다.
본 발명에 따르면, 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역을 포함하거나 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산에서 상이한 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체가 또한 제공된다.
본 발명에 따르면, 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역을 포함하거나 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산에서 상이한 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체가 또한 제공된다.
일 구현예에 있어서 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하되 상기 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는 2개의 항원 결합 부위는 모두 ErbB-2의 도메인 I에 결합한다. 본 발명에 따른 이러한 항체는 ErbB-2의 도메인 IV에 결합하는 트라스투주맙과 ErbB-2의 도메인 II에 결합하는 페르투주맙과 같이 ErbB-2의 도메인 I에 결합하지 않는 현재 사용되고 있는 항-ErbB-2 결합 분자와의 조합 치료에 특히 적합한바, 이 경우 상기 서로 다른 분자들은 동일한 에피토프에 대해 서로 경쟁하지 않기 때문이다.
또한 ErbB-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하되 상기 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 적어도 하나의 항원 결합 부위의 친화도(KD)가 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.9 nM 이하인 항체가 제공된다. 바람직하게는 상기 2개의 항원 결합 부위는 모두 ErbB-2의 도메인 I에 결합한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-2에 대한 상기 적어도 하나의 항원 결합 부위의 친화도는 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 3.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.0 nM 이하, 더 바람직하게는 2.3 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 3.0-1.6 nM의 범위 내에 있다. 바람직한 일 구현예에 있어서, BT-474 세포 상의 ErbB-2에 대한 상기 적어도 하나의 항원 결합 부위의 친화도는 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 더 바람직하게는 3.9 nM 이하이다, 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 4.5-3.3 nM의 범위 내에 있다.
위에서 언급한 친화도는 바람직하게는 정상 상태 세포 친화도 측정법을 이용하여 측정한 것으로, 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 방사성 표지된 항체를 이용하여 세포를 4℃에서 배양한 후 세포 결합된 방사성을 측정한다.
본 발명은 또한 ErbB-2에 결합하는 2개의 가변 도메인을 포함하되 상기 가변 도메인의 VH쇄가 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 VH쇄 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(인간화 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(인간화 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 아미노산 서열; 또는 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 각각의 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 VH쇄 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(인간화 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(인간화 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898 VH쇄의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 VH는 바람직하게는 VH쇄 MF1849; 또는 MF2971 또는 이의 인간화 변형형태의 아미노산 서열을 포함하되 상기 인간화 변형형태는 바람직하게는 MF3958; 또는 MF3004 또는 이의 인간화 변형형태(바람직하게는 도 16A에 나타낸 MF3991의 아미노산 서열을 포함함)의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 MF1849; 또는 MF2971 또는 이의 인간화 변형형태의 아미노산 서열을 포함하되 상기 인간화 변형형태는 바람직하게는 MF3958; 또는 MF3004 또는 이의 인간화 변형형태(바람직하게는 도 16A에 나타낸 각각의 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A에 나타낸 MF3991의 아미노산 서열을 포함함)의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체의 가변 도메인은 바람직하게는 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 서열을 가진 동일한 VH쇄를 포함한다. VH쇄가 동일한 가변 도메인을 가진 항체는 이중 특이성 항체가 아니다. 본 발명의 경우에 VH쇄는 도 16A 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 동일한 VH쇄 서열을 포함하거나 도 16A 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 각각의 서열에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합 이외에 동일한 VH쇄 서열을 포함하는 경우에 동일하다.
일 구현예에 있어서 본 발명은 ErbB-3에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하되 상기 항원 결합 부위 중 적어도 하나가 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는 2개의 항원 결합 부위는 모두 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 본 발명에 따른 이러한 항체는 특히 ErbB-3의 도메인 I에 결합하는 MM-121(#Ab6)과 RG7116과 같이 ErbB-3의 도메인 III에 결합하지 않는 현재 사용되고 있는 항-ErbB-3 결합 분자와의 조합 치료에 특히 적합한바, 이 경우 서로 다른 결합 분자들이 동일한 에피토프에 대해 서로 경쟁하지 않기 때문이다.
또한 ErbB-3에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하되 상기 항원 결합 부위 중 적어도 하나가 ErbB-3의 도메인 III에 결합하고 ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 적어도 하나의 항원 결합 부위의 친화도(KD)가 2.0 nM 이하, 바람직하게는 1.5 nM 이하, 더 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하인 항체가 제공된다. 바람직하게는 2개의 항원 결합 부위는 모두 ErbB-3의 도메인 III에 결합한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-3에 대한 상기 적어도 하나의 항원 결합 부위의 친화도는 2.0 nM 이하, 바람직하게는 1.5 nM 이하, 더 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 1.39-0.59 nM의 범위 내에 있다. 바람직한 일 구현예에 있어서, BT-474 세포 상의 ErbB-3에 대한 상기 적어도 하나의 항원 결합 부위의 친화도는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.5 nM 이하, 더 바람직하게는 1.0 nM 이하, 더 바람직하게는 0.5 nM 이하, 더 바람직하게는 0.31 nM 이하, 더 바람직하게는 0.23 nM 이하이다. 일 구현예에 있어서, 상기 친화도는 0.31-0.15 nM의 범위 내에 있다.
또한 위에서 언급한 친화도는 바람직하게는 정상 상태 세포 친화도 측정법을 이용하여 측정한 것으로, 실시예에 기재되어 있는 바와 같이 방사성 표지된 항체를 이용하여 세포를 4℃에서 배양한 후 세포 결합된 방사성을 측정한다.
본 발명은 또한 ErbB3에 각각 결합하는 2개의 가변 도메인을 포함하되 상기 가변 도메인의 VH가 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 VH쇄 서열 중 어느 것에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 상기 VH는 바람직하게는 VH쇄 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함하거나; 상기 VH쇄 서열 중 어느 것에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 VH쇄 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 VH는 바람직하게는 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함하거나; MF3178 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 항체의 가변 도메인은 바람직하게는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 서열을 가진 동일한 VH쇄를 포함한다. VH쇄가 동일한 가변 도메인을 가진 항체는 이중 특이성 항체가 아니다. 상기 VH쇄는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 동일한 VH쇄 서열을 포함하거나 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 각각의 서열에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합 이외에 동일한 VH쇄 서열을 포함하는 경우에 동일하다.
ErbB-3에 특이적인 본 발명에 따른 단일 특이성 항체는 이들이 예를 들면 MM-121(#Ab6)과 같은 종래 화합물에 비해 ErbB-3에 대해 더 좋은 기능적 활성을 갖는 장점이 갖는바, 이는 본 발명에 따른 이들 항체가 ErbB-3 활성(ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능 및/또는 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 리간드 유도 성장과 같은)을 더 잘 저지할 수 있음을 의미한다. 이는 예를 들면 표 7과 도 38에 나타나 있다.
바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하되 상기 가변 도메인의 VH쇄가
- VH쇄 MF1849; 또는 MF2971 또는 이의 인간화 변형형태로서 바람직하게는 MF3958; 또는 MF3004 또는 이의 인간화 변형형태(바람직하게는 도 16A에 나타낸 MF3991의 아미노산 서열을 포함함)의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 변형형태의 아미노산 서열을 포함하거나;
- VH쇄 MF1849 또는 MF2971 또는 이의 인간화 변형형태로서 바람직하게는 MF3958; 또는 MF3004 또는 이의 인간화 변형형태(바람직하게는 상기 VH에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이의 조합을 가진 도 16A에 나타낸 MF3991의 아미노산 서열을 포함함)의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 변형형태의 아미노산 서열을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다. 본 구현예에 따른 이러한 이중 특이성 항체는 바람직하게는 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 더 포함한다. 상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 바람직하게는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함하거나 가장 바람직하게는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37의 상기 VH쇄 서열 중 어느 것에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH쇄 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄는 바람직하게는 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함하거나 도 16B의 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 바람직하게는 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인과 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하되, 상기 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄가
- 도 16A에 나타낸 VH쇄 MF3958의 아미노산 서열; 또는
- 상기 VH에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A에 나타낸 VH쇄 MF3958의 아미노산 서열을 포함하고;
상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄가
- 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열; 또는
- 도 16B의 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
본 발명은 바람직하게는 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인과 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인을 포함하되 상기 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄가
- 도 16A에 나타낸 VH쇄 MF3991의 아미노산 서열; 또는
- 상기 VH에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A에 나타낸 VH쇄 MF3991의 아미노산 서열을 포함하고;
상기 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH쇄가
- 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열; 또는
- 도 16B의 VH쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16B에 나타낸 VH쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함하는 이중 특이성 항체를 제공한다.
도 16에 있는 서열과 비교시 VH쇄의 거동은 전형적으로 도 16에 나타낸 VH쇄의 아미노산 서열에 대해 15개가 넘는 아미노산이 변할 때 뚜렷하게 달라지게 시작한다. 도 16에 나타낸 VH쇄에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 VH쇄는 바람직하게는 도 16에 나타낸 VH쇄에 대해 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합, 바람직하게는 도 16에 나타낸 VH쇄에 대해 1, 2, 3 또는 4개의 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합, 더 바람직하게는 1 또는 2개의 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합, 바람직하게는 1개의 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖는다. 상기 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VH쇄의 CDRl, CDR2와 CDR3 영역에 있지 않다. 이들은 또한 바람직하게는 FR4 영역에 있지 않다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존성 아미노산 치환이다.
바람직한 구현예에 있어서 본 발명은 도 16D에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 이중 특이성 항체 또는 도 16D의 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 갖되 상기 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환이 보존성 아미노산 치환인 도 16D의 이중 특이성 항체를 제공한다. 상기 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VH쇄의 CDR3 영역에 있지 않고, 바람직하게는 VH쇄의 CDRl, CDR2와 CDR3 영역에 있지 않으며, 바람직하게는 FR4 영역에 있지 않다.
인간 범위(human context) 내 비인간 잔기의 함량을 최소화하려는 방향으로 합리적인 방법이 발전하여 왔다. 이중 특이성 항체의 항원 결합성을 또 다른 항체에 성공적으로 이식하기 위하여 다양한 방법을 이용할 수 있다. 항체의 결합성은 주로 가변 도메인의 전체적으로 적절한 구조와 조합되는 가변 도메인 내 CDRl과 CDR2 영역의 서열에 의해 종종 보조되는 CDR3 영역의 정확한 서열에 달려 있다. CDR 영역을 또 다른 항체의 적합한 가변 도메인에 이식하기 위한 다양한 방법이 현재 이용 가능하다. 이들 방법 중 일부는 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 J.C. Almagrol and J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633에 검토되어 있다. 따라서 본 발명은 또한 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 ErbB-2 결합 부위를 포함하는 가변 도메인이 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 VH CDR3 서열을 포함하고 상기 ErbB-3 결합 부위를 포함하는 가변 도메인이 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 VH CDR3 영역을 포함하는 인간 또는 인간화 이중 특이성 항체를 제공한다. 상기 ErbB-2 결합 부위를 포함하는 VH 가변 영역은 바람직하게는 도 16A 또는 도 16E에 있는 VH쇄의 CDRl 영역, CDR2 영역과 CDR3 영역의 서열을 포함한다. 상기 ErbB-3 결합 부위를 포함하는 VH 가변 영역은 바람직하게는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 있는 VH쇄의 CDRl 영역, CDR2 영역과 CDR3 영역의 서열을 포함한다. CDR 이식은 다른 뼈대(framework)를 갖는 것을 제외하고는 도 16 또는 도 37의 VH의 CDR 영역을 가진 VH쇄를 제조하기 위해 사용할 수도 있다. 상기 다른 뼈대는 또 다른 인간 VH 또는 다른 포유류의 뼈대일 수 있다.
위에 언급한 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 치환은 바람직하게는 보존성 아미노산 치환이다. 상기 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VH쇄의 CDR3 영역에 있지 않고, 바람직하게는 VH쇄의 CDRl, CDR2 또는 CDR3 영역에 있지 않으며, 바람직하게는 FR4 영역에 있지 않다.
도 16 또는 도 37에 나타낸 가변 중쇄 서열을 포함하는 가변 도메인의 경쇄는 바람직하게는 생식선 경쇄 O12, 바람직하게는 재배열된 생식선 인간 카파 경쇄 IgVκl-39*01/IGJκ1*01 또는 이의 단편 또는 기능적 유도체이다(월드와이드웹 imgt.org의 IMGT 데이터베이스에 따른 명명법). 용어 재배열된 생식선 인간 카파 경쇄 IgVκl-39*01/IGJκl*01, 1GKV1-39/IGKJ1, huVκl-39 경쇄 또는 간단히 huVκ1-39가 사용된다. 상기 경쇄는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 상기 언급한 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존성 아미노산 치환이고, 상기 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VL쇄의 CDR3 영역에 있지 않고, 바람직하게는 VL쇄의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 영역이나 FR4 영역에 있지 않다.
이중 특이성 항체를 생산하기 위해 다양한 방법이 이용 가능하다. 하나의 방법은 2개의 서로 다른 중쇄와 2개의 서로 다른 경쇄를 세포 내 발현시키고 상기 세포에 의해 생산되는 항체를 회수하는 것을 포함한다. 이 방법으로 생산된 항체는 전형적으로 중쇄와 경쇄의 서로 다른 조합을 가진 항체들의 집합을 함유할 것이고, 이들 중 일부는 원하는 이중 특이성 항체이다. 이어서 상기 이중 특이성 항체를 집합으로부터 정제할 수 있다. 세포에 의해 생산되는 이중 특이성 항체 대 다른 항체들의 비는 다양한 방법으로 증가될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 비는 2개의 서로 다른 경쇄가 아닌 실질적으로 동일한 2개의 경쇄를 세포 내 발현시킴으로써 증가된다. 이 개념은 종래기술에서는 "공통 경쇄"법이라고도 한다. 상기 실질적으로 동일한 경쇄가 서로 다른 항원 결합 부위와 부수적으로 서로 다른 결합성을 가진 가변 도메인의 형성을 가능하게 하는 서로 다른 2개의 중쇄와 함께 작용할 때 세포에 의해 생산되는 이중 특이성 항체 대 다른 항체의 비는 서로 다른 2개의 경쇄의 발현에 비해 크게 개선된다. 세포에 의해 생산되는 이중 특이성 항체의 비는 서로 다른 2개의 중쇄가 서로 쌍을 형성하는 것을 동일한 2개의 중쇄가 쌍을 형성하는 것보다 빠르게 함으로써 더욱 개선될 수 있다. 종래기술은 이러한 중쇄의 헤테로다이머화를 달성할 수 있는 다양한 방법을 기재하고 있다. 하나의 방법은 '노브 인투 홀(knob into hole)' 이중 특이성 항체를 만드는 것이다. 미국특허출원 20030078385(Arathoon et al. - Genentech)를 참조할 것. 또 다른 바람직한 방법은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되는 US 정규출원번호 13/866,747과 PCT 출원번호 PCT/NL2013/050294(WO 2013/157954 Al)의 선출원인 US 가출원 61/635,935에 기재되어 있다. 단일 세포로부터 이중 특이성 항체를 생산하기 위한 방법과 수단이 개시되어 있으며, 단일 특이성 항체의 형성에 비해 이중 특이성 항체를 더 잘 형성하는 수단이 제공되어 있다. 이들 방법은 본 발명에서 바람직하게 채용될 수도 있다. 이에 따라 본 발명은 계면을 형성할 수 있는 2개의 CH3 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 이중 특이성 항체를 (단일 세포로부터) 생산하기 위한 방법으로서, 상기 세포에 a) 중쇄를 포함하는 제1 CH3 도메인을 코딩하는 제1 핵산분자, b) 중쇄를 포함하는 제2 CH3 도메인을 코딩하는 제2 핵산분자를 제공하되 상기 핵산분자들에는 중쇄를 포함하는 상기 제1 및 제2 CH3 도메인이 우선적으로 쌍을 이루기 위한 수단을 제공하는 것을 포함하고, 상기 숙주 세포를 배양하고 상기 2개의 핵산분자를 발현시키며 상기 이중 특이성 항체를 배양물로부터 수거하는 단계를 더 포함하는 방법을 제공한다. 상기 제1 및 제2 핵산분자는 동일한 핵산분자, 벡터 또는 유전자 전달매체의 일부일 수 있고 숙주 세포의 게놈의 동일 부위에서 통합될 수 있다. 이와 달리, 상기 제1 및 제2 핵산분자는 상기 세포에 분리 제공된다.
바람직한 구현예는 이중 특이성 항체가 계면을 형성할 수 있는 2개의 CH3 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 이중 특이성 항체를 (단일 세포로부터) 생산하기 위한 방법으로서:
- a) ErbB-2에 결합하고 제1 CH3 도메인을 함유하는 항원 결합 부위를 포함하는 중쇄를 코딩하는 제1 핵산분자와 b) ErbB-3에 결합하고 제2 CH3 도메인을 함유하는 항원 결합 부위를 포함하는 중쇄를 코딩하는 제2 핵산분자를 갖는 세포를 제공하되 상기 핵산분자들에 상기 제1 및 제2 CH3 도메인이 우선적으로 쌍을 이루기 위한 수단을 제공하는 세포를 제공하는 것을 포함하고,
상기 세포를 배양하고 상기 2개의 핵산분자를 발현시키며 상기 이중 특이성 IgG 항체를 배양물로부터 수거하는 단계를 더 포함하는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 세포는 또한 공통 경쇄를 코딩하는 제3 핵산분자를 갖는다. 상기 제1, 제2 및 제3 핵산분자는 동일한 핵산분자, 벡터 또는 유전자 전달매체의 일부일 수 있고 숙주 세포의 게놈의 동일한 위치에서 통합될 수 있다. 이와 달리, 상기 제1, 제2 및 제3 핵산분자는 상기 세포에 분리 제공된다. 바람직한 공통 경쇄는 위에 기재한 바와 같이 O12, 바람직하게는 재배열된 생식선 인간 카파 경쇄 IgVκl 39*01/IGJκ1*01이다. 상기 제1 및 제2 CH3 도메인의 쌍을 우선적으로 이루기 위한 수단은 바람직하게는 중쇄 코딩 영역의 CH3 도메인 내 적절한 변이이다. 실질적으로 이중 특이성 항체만을 생산하는 바람직한 변이는 제1 CH3 도메인에서 아미노산 치환 L351K와 T366K(Kabat에 따른 번호 부여)와 제2 CH3 도메인에서 아미노산 치환 L351D와 L368E이거나 그 반대가 될 수 있다. 따라서 본 발명에 따르면 이중 특이성 항체를 생산하기 위한 방법으로서 상기 제1 CH3 도메인이 아미노산 치환 L351K와 T366K(Kabat에 따른 번호 부여)를 포함하고 제2 CH3 도메인이 아미노산 치환 L351D와 L368E를 포함하고 상기 방법이 상기 세포를 배양하고 상기 핵산분자를 발현시키며 상기 이중 특이성 항체를 배양물로부터 수거하는 단계를 더 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 이중 특이성 항체를 생산하기 위한 방법으로서 상기 제1 CH3 도메인이 아미노산 치환 L351D와 L368E(Kabat에 따른 번호 부여)를 포함하고 제2 CH3 도메인이 아미노산 치환 L351K와 T366K를 포함하고 상기 방법이 상기 세포를 배양하고 상기 핵산분자를 발현시키며 상기 이중 특이성 항체를 배양물로부터 수거하는 단계를 더 포함하는 방법이 또한 제공된다. 이들 방법에 의해 생산될 수 있는 항체들 또한 본 발명의 일부이다. 상기 CH3 헤테로다이머화 도메인은 바람직하게는 IgG1 헤테로다이머화 도메인이다. 상기 CH3 헤테로다이머화 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역은 바람직하게는 IgG1 불변 영역이다.
일 구현예에 있어서 본 발명은 본 발명에 따른 항체 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산분자를 제공한다. 상기 핵산분자(전형적으로 체외 분리된 또는 재조합 핵산)는 바람직하게는 도 16A 또는 도 16B 또는 도 37에 나타낸 중쇄 가변 영역 또는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 가진 도 16A 또는 도 16B 또는 도 37에 나타낸 중쇄 가변 영역을 코딩한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 핵산분자는 도 16 또는 도 37에 나타낸 서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 핵산분자는 도 16 또는 도 37에 나타낸 핵산과 동일한 아미노산 서열을 코딩하지만 하나 이상의 서로 다른 코돈을 코딩하기 때문에 다른 서열을 갖는다. 예를 들어 이러한 핵산분자는 예를 들면 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO 세포 또는 PER-C6™ 세포와 같이 항체 생산자 세포에 최적화되어 있는 코돈이다. 본 발명은 도 16D 또는 도 37의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 핵산분자는 전형적으로 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)이지만 전적으로 이들에 한정되는 것은 아니다. 당업자라면 이와 다른 핵산들도 이용할 수 있다. 예를 들면 본 발명에 따른 핵산은 세포 내 포함된다. 상기 핵산이 상기 세포에서 발현될 때 상기 세포는 본 발명에 따른 항체를 생산한다. 따라서 일 구현예에 있어서 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 포함하는 세포 및/또는 본 발명에 따른 핵산을 제공한다. 상기 세포는 바람직하게는 동물 세포, 더 바람직하게는 포유류 세포, 더 바람직하게는 영장류 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 본 발명의 목적에 적합한 세포는 본 발명에 따른 항체 및/또는 본 발명에 따른 핵산을 포함하고 바람직하게는 생산할 수 있는 모든 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 포함하는 세포를 제공한다. 바람직하게는 상기 세포(전형적으로 체외 분리된 또는 재조합 세포)는 상기 항체를 생산한다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 세포는 하이브리도마(hybridoma) 세포, CHO 세포, NSO 세포 또는 PER-C6™ 세포이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포이다. 본 발명에 따른 세포를 포함하는 세포 배양물이 또한 제공된다. 다양한 기관과 회사들은 예를 들면 임상용 항체의 양산을 위한 세포주를 개발하였다. 이러한 세포주의 비제한적인 예로는 CHO 세포, NSO 세포 또는 PER.C6™ 세포가 있다. 이들 세포는 단백질 생산과 같은 다른 목적으로도 사용된다. 단백질과 항체를 산업적 규모로 생산하기 위해 개발된 세포주들은 본 명세서에서 산업용 세포주라고 한다. 이에 따라 바람직한 구현예에 있어서 본 발명은 본 발명의 항체를 생산하기 위한 항체 양산용으로 개발된 세포주의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 세포를 배양하고 상기 항체를 상기 배양물로부터 수거하는 것을 포함하는 항체 생산 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 세포는 무혈청 배지에서 배양한다. 바람직하게는 상기 세포는 현탁 성장에 적합하다. 본 발명에 따른 항체 생산 방법에 의해 얻을 수 있는 항체가 또한 제공된다. 상기 항체는 바람직하게는 배양물의 배지로부터 정제된다. 바람직하게는 상기 항체는 친화성 정제된다. 본 발명의 세포로는 예를 들면 하이드로마 세포주, CHO 세포, NSO 세포 또는 임상용 항체 생산을 위한 적합성이 알려진 또 다른 세포 유형이 있다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 세포는 인간 세포이다. 바람직하게는 아데노바이러스 El 영역 또는 이의 기능적 동등물에 의해 형질전환되는 세포이다. 이러한 세포주의 바람직한 일례는 PER.C6™ 세포주 또는 이의 동등물이다. 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포 또는 이의 변이체이다. 바람직하게는 항체 발현을 위해 글루타민 합성효소(GS) 벡터 시스템을 이용하는 변이체이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 바람직하게는 (약제학적으로 허용되는) 부형제 또는 담체를 포함한다. 바람직한 구현예에 있어서 상기 약제학적 조성물은 5-50 mM 히스티딘, 100-300 mM 트레할로오스, 0.1-03 g/L PolySorbate20 또는 이들의 조합물을 포함한다. pH는 바람직하게는 pH = 5.5-6.5으로 설정된다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 25 mM 히스티딘, 220 mM 트레할로오스, 0.2 g/L PolySorbate20 또는 이의 조합물을 포함한다. pH는 바람직하게는 pH = 5.5-6.5, 가장 바람직하게는 pH = 6으로 설정된다.
본 발명의 항체는 바람직하게는 표지, 바람직하게는 생체내 촬영을 위한 표지를 더 포함한다. 이러한 표지는 전형적으로 치료를 위해 반드시 필요한 것은 아니다. 예를 들어 진단 세팅에서 표지는 유익할 수 있다. 예를 들면 체내 표적 세포를 가시화하는데 유익할 수 있다. 다양한 표지들이 적합하며 종래기술에 다수가 잘 알려져 있다. 바람직한 구현예에 있어서, 상기 표지는 검출용 방사성 표지이다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 표지는 적외선 표지이다. 바람직하게는 상기 적외선 표지는 생체내 촬영에 적합하다. 본 기술분야의 당업자라면 다양한 적외선 표지를 이용할 수 있다. 바람직한 적외선 표지는 예를 들면 IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700 포스포라미다이트; IRDye 800 포스포라미다이트(LI-COR USA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska)이다.
본 발명은 또한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 대상에 본 발명에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 상기 치료를 시작하기 전에 상기 방법은 상기 대상이 이러한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 가질 위험이 있는지 판단하는 것을 포함한다. 몇몇 구현예에 있어서, 상기 대상은 ErbB-2에 대해 [+] 또는 [++]로서 분류된다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 대상은 ErbB-2에 대해 [+++]로서 분류된다. 본 발명은 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 이와 달리 제형화하는 경우에 본 발명은 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 치료하기 위한 약제 또는 예방제의 용도를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 치료는 예방을 포함한다.
상기 종양은 바람직하게는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 암이다. 바람직하게는 상기 양성 암은 초기 유방암과 같은 유방암이다. 그러나 본 발명은 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 흑색종 등과 같은 광범위한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 암에 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 전형적으로 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능, 바람직하게는 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)는 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 더 높다. 따라서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양, 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료용으로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체로서 ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도가 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 치환도와 동등하거나 이보다 더 높은 항체가 또한 제공된다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 바람직하게는 4.0 nM 이하이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 항체 PB4188이다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 R426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
따라서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양, 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료용으로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 항체로서 본 발명에 따른 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함하고/또는 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 R426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함하는 항체가 또한 제공된다.
상기 대상은 바람직하게는 인간 대상이다. 상기 대상은 바람직하게는 트라스투주맙과 같은 ErbB-2 특이적 항체를 이용한 단일클론 항체 치료에 적격인 대상이다. 바람직한 구현예에 있어서 상기 대상은 ErbB-2 치료에 내성이 있는 표현형 및/또는 헤레귤린 내성 표현형, 바람직하게는 단일클론 항체 내성 표현형을 가진 종양, ErbB-2/ErbB-3 양성 암, 바람직하게는 종양/암을 포함한다. 이러한 표현형을 포함하는 종양은 ErbB-2에 대한 단일클론 항체 치료와 같은(그러나 이에 한정되는 것은 아님) 현재의 항-HER2 요법에 의한 치료로부터 벗어날 수 있다.
환자에 투여될 본 발명에 따른 항체의 양은 전형적으로 치료농도 범위 내에 있는바, 이는 치료 효과를 얻기 위한 충분한 양으로 사용되지만 그 양은 임계치를 초과하여 부작용이 허용할 수 없는 정도로 나타나서는 안 된다는 것을 의미한다. 원하는 치료효과를 얻기 위해 필요한 항체의 양이 적을수록 치료농도 범위는 전형적으로 클 것이다. 따라서 낮은 투여량으로 충분한 치료효과를 발휘하는 본 발명에 따른 항체가 바람직하다. 투여량은 트라스투주맙에 대한 투여용량의 범위 내 또는 이하일 수 있다.
본 발명은 특히 ErbB-2와 ErbB-3 수용체를 표적으로 하고 체외에서 암 세포주의 강력한 증식을 저해하고 예를 들면 NRGl-β1의 상향조절과 같은 회피 기전이 있는 상태에서도 생체내 종양 성장을 저해하는 항체를 기재한다. ErbB-2 또는 ErbB-3에 특이적인 일단의 다양한 인간과 쥐의 Fab 결합 아암을 동정하였다. 이들은 중쇄를 헤테로다이머화하는 CH3 영역 내 변이를 함유하는 상보적 발현 벡터로 이들을 클로닝함으로써 이중 특이성 항체로서 생산하였다. 500개가 넘는 이중 특이성 항체를 소규모로 생산하여 서로 다른 3개의 암 세포주에 대해 결합 및 기능 분석법으로 시험하였다. 다양한 이중 특이성 항체를 선택하여 BxPC3 세포주를 이용하여 동소 이종 이식 모델에서 시험하였다. 이 세포주는 ErbB-2와 ErbB-3 수용체 모두를 발현하고 성장에 대해서 ErbB-3 리간드에 부분적으로 의존한다. BxPC3 모델은 확실하고 엄격한 선별 모델이다.
나아가 JIMT-1 세포주를 이용한 이종 이식 모델을 이용하여 생체내 강력한 항종양 활성을 확인하였다. JIMT-1 세포는 트라스투주맙에 대해 임상적으로 내성이 있는 62세 유방암 환자의 늑막 전이로부터 유래된 것이다. JIMT-1 세포는 부착성 단일층으로서 성장하고 누드 마우스에서 이종 이식 종양을 형성한다. JIMT-1 세포는 증폭된 HER-2 종양 유전자를 갖고 있고 상기 종양 유전자는 그의 코딩 서열에서 동정할 수 있는 어떠한 변이도 보이지 않았다. JIMT-1 세포는 HER-2 mRNA와 단백질을 과발현하고 HER-1, HER-3과 HER-4 mRNA 및 단백질의 수준은 트라스투주맙에 감응하는 세포주 SKBR-3과 유사하다(Tanner et al, Mol Cancer Ther 2004).
현재 사용되고 있는 단일클론 항체인 트라스투주맙과 페르투주맙 뿐 아니라 화합물 라파티닙에 비해 본 발명에 따른 항체를 이용하면 더 좋은 항종양 효과가 얻어졌다는 점이 중요하다.
본 발명의 항체는 현탁 293F 세포에 일시 형질주입 후 >50 mg/L 수준으로 생산할 수 있다. 상기 이중 특이성 항체를 수율 >70%와 함께 98%가 넘는 순도로 정제할 수 있다. 분석적 특성규명 연구를 통해 이중 특이성 lgGl 항체 프로파일이 2가 단일 특이성 lgGl와 비슷함을 알 수 있다. 본 발명의 이중 특이성 항체는 체외 및 생체내에서 트라스투주맙 + 페르투주맙에 비해 기능적 활성 측면에서 우수한 효능을 실증할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 조합 치료를 제공한다. 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항체는 트라스투주맙 또는 페르투주맙과 조합되는데, 실시예에 나타나 있는 바와 같이 이들 항체가 서로 다른 ErbB-2 에피토프에 결합하여 본 발명에 따른 항체와 동일한 에피토프에 대해 경쟁하지 않기 때문이다. 또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항체는 MM-121(#Ab6) 또는 RG7116(Roche)과 조합되는데, 실시예에 나타나 있는 바와 같이 이들 항체가 서로 다른 ErbB-3 에피토프에 결합하여 본 발명에 따른 항체와 동일한 에피토프에 대해 경쟁하지 않기 때문이다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, ErbB-2와 ErbB-3에 특이적인 결합 화합물은 PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제 및/또는 예를 들면 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제 또는 Src 저해제와 같은 MAPK 경로의 일 성분의 저해제와 조합된다. 일 구현예에 있어서, ErbB-2와 ErbB-3에 특이적인 결합 화합물은 미세소관 분열 약물(microtubuli disrupting drug) 또는 히스톤 데아세틸라아제(HDAC)의 저해제와 조합된다. 놀랍게도 본 발명자들은 이들 조합물을 사용할 때 상승효과를 발견하였다. 따라서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이
- ErbB-2와 ErbB-3에 특이적인 결합 화합물과
- PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 상기 저해제는 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제 또는 Src 저해제를 포함한다. 상기 티로신 키나아제 저해제는 바람직하게는 아파티닙(afatinib), 라파티닙 및/또는 네라티닙(neratinib)이다. 상기 PI3Ka 저해제는 바람직하게는 BYL719이다. 일 구현예에 있어서, 상기 Akt 저해제는 MK-2206이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 mTOR 저해제는 에베로리무스(everolimus)이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 Src 저해제는 사라카티닙(saracatinib)이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 미세소관 분열 약물은 파클리탁셀(paclitaxel)이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 보리노스타트(vorinostat)이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, ErbB-2와 ErbB-3에 특이적인 상기 결합 화합물은 MM-111(Merrimack Pharmaceuticals)이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 ErbB-2와 ErbB-3에 특이적인 결합 화합물은 이중 특이성 항체이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 ErbB-2와 ErbB-3에 특이적인 결합 화합물은 본 발명에 따른 이중 특이성 항체이다.
따라서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이:
- ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체와
- PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 제공된다.
ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양의 치료용으로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 치료는 상기 이중 특이성 항체 및 PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상에 투여하는 것을 포함하는 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 가진 본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물과 조합된다. 상기 저해제는 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제 또는 Src 저해제를 포함한다. 상기 티로신 키나아제 저해제는 바람직하게는 아파티닙, 라파티닙 및/또는 네라티닙이다. 상기 PI3Ka 저해제는 바람직하게는 BYL719이다. 일 구현예에 있어서, 상기 Akt 저해제는 MK-2206이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 mTOR 저해제는 에베로리무스이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 Src 저해제는 사라카티닙이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 미세소관 분열 약물은 파클리탁셀이다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 보리노스타트이다.
상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게는 상기 종양은 유방암이다. 일 구현예에 있어서, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 종양 세포당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포 표면 수용체를 갖는다.
일 구현예에 있어서, PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제, Src 저해제, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게는 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베로리무스, 사라카티닙, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물과 조합되는 본 발명에 따른 항체는 전형적으로 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능, 바람직하게는 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)는 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 더 높다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 바람직하게는 4.0 nM 이하이다.
바람직한 일 구현예에 있어서, PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제, Src 저해제, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게는 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베로리무스, 사라카티닙, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물과 조합되는 본 발명에 따른 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 일 구현예에 있어서, PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제, Src 저해제, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게는 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베로리무스, 사라카티닙, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물과 조합되는 본 발명에 따른 항체는 R426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직하게는 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 및/또는 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 이중 특이성 항체는 PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제, Src 저해제, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게는 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베로리무스, 사라카티닙, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물과 조합된다.
바람직한 일 구현예에 있어서,
- 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898의 중쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역 서열 또는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개의 아미노산, 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산에서 상이한 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역 서열 및
- 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역 서열 또는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개의 아미노산, 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산에서 상이한 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 본 발명에 따른 이중 특이성 항체는 PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제, Src 저해제, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게는 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베로리무스, 사라카티닙, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물과 조합된다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 항체 PB4188은 PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제, Src 저해제, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, 더 바람직하게는 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베로리무스, 사라카티닙, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물과 조합된다.
본 발명의 바람직한 구현예는 헤레귤린 스트레스 조건에서 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다. 헤레귤린은 ErbB-3 양성 종양 세포의 성장에 관여하는 성장 인자이다. 전형적으로 종양 세포가 다량의 헤레귤린을 발현할 때(헤레귤린 스트레스라고 함), 트라스투주맙, 페르투주맙과 라파티닙과 같이 현재 알려진 치료법은 더 이상 종양 성장을 저해할 수 없다. 이 현상을 헤레귤린 내성이라고 부른다. 그러나 놀랍게도 본 발명에 따른 항체는 다량의 헤레귤린을 발현하는 종양 세포의 성장을 저지할 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 헤레귤린의 발현량은 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 경우에 높은 것으로 간주된다. 헤레귤린 발현량은 예를 들면 종양 RNA를 사용한 qPCR를 이용하거나(예를 들어 Shames et al. PLOS ONE, February 2013, Vol.8, Issue 2, pp 1-10 and in Yonesaka et al., Sci.transl.Med., Vol.3, Issue 99 (2011); ppl-11에 기재된 바와 같이) 예를 들어 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청 샘플을 사용한 ELISA와 같은 단백질 검출법을 이용하여(예를 들어 Yonesaka et al., Sci.transl.Med., Vol.3, Issue 99 (2011); ppl-11에 기재된 바와 같이) 측정한다. 따라서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체로서 상기 종양의 상기 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 항체가 또한 제공된다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위를 포함한다. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상을 치료하기 위한 방법으로서 상기 종양의 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖고 상기 방법이 본 발명에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 바람직한 일 구현예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도로서 상기 종양의 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 용도를 제공한다. 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게는 상기 종양은 유방암이다. 따라서 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종, 바람직하게는 유방암을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체로서 상기 암의 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 항체가 또한 제공된다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위를 포함한다.
다량의 헤레귤린은 전형적으로 전이의 형성(즉, 종양 세포 또는 종양 개시 세포의 이동, 침윤, 성장 및/또는 분화) 중에 존재한다. 전형적으로 종양 개시 세포는 예를 들면 CD44, CD24, CD133 및/또는 ALDH1과 같은 줄기세포 표지자를 기반으로 동정된다. 따라서 이들 과정은 트라스투주맙과 페르투주맙과 같은 현재 공지된 치료법으로 겨우 저지될 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 다량의 헤레귤린을 발현하는 종양 세포 또는 종양 개시 세포의 성장 및/또는 분화를 저지할 수 있기 때문에 본 발명에 따른 이러한 항체는 또한 전이의 형성을 저지하기에 특히 적합하다. 따라서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상에서 전이의 형성을 저지하기 위한 방법으로서 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖고 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 전이 형성의 치료 또는 예방용으로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 전이의 형성을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 이중 특이성 항체의 용도로서 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 용도가 또한 제공된다. 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게는 상기 종양은 유방암이다. 따라서 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종 세포, 바람직하게는 유방암 세포의 전이 형성의 치료 또는 예방용도로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하되 상기 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 본 발명에 따른 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 본 발명에 따른 상기 항체는 전형적으로 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능, 바람직하게는 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)는 ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 더 높다. ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도는 2.0 nM 이하, 더 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도는 바람직하게는 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 바람직하게는 4.0 nM 이하이다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 항체는 R426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다.
바람직한 일 구현예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상을 치료하기 위한 본 발명에 따른 방법으로서 상기 종양의 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 가진 방법 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체로서 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 또는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체를 제공한다.
바람직한 일 구현예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상을 치료하기 위한 방법으로서 상기 종양의 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 방법 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체로서 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 또는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일 구현예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상의 치료에 사용하기 위한 항체 PB4188로서 상기 종양의 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 가진 항체 PB4188을 제공한다.
이미 기재한바 같이, 본 발명에 따른 항체는 세포 표면에 1,000,000개 미만의 ErbB-2 수용체를 가진 ErbB-2 양성 종양 세포를 치료하기에 특히 적합하다. 전형적으로 ErbB-2[++] 또는 ErbB-2[+]로서 분류되는 이러한 종양 환자로는 1차 종양을 가진 환자뿐 아니라 악화된 ErbB-2 양성 종양을 가진 환자도 포함한다. 트라스투주맙(헤르셉틴)과 페르투주맙과 같이 현재 사용되고 있는 치료법은 세포 표면에 1,000,000개가 넘는 ErbB-2 수용체를 가진 악성 ErbB-2 양성 세포를 갖고 ErbB-2[+++]로서 분류되는 환자에게만 처방되고 있다.
따라서 ErbB-2[++] 또는 ErbB-2[+]로서 분류되는 환자는 바람직하게는 본 발명에 따른 항체로 치료된다. 따라서 종양 세포당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포 표면 수용체를 가진 ErbB-2 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양이 있는 대상에서 본 발명에 따라 사용하기 위한 방법과 항체가 또한 제공된다. 본 발명에 따르면 바람직한 일 구현예는 전이 형성을 치료 또는 예방하는 용도로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖고 상기 종양 세포가 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포 표면 수용체를 가진 이중 특이성 항체를 제공한다.
또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항체는 손상된 심장 기능을 갖고 있거나 심장 기능이 손상될 위험이 있는 대상에서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 저지하기 위해 사용된다. 손상된 심장 기능이란 대상이 예를 들면 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만, 바람직하게는 85% 미만 또는 80% 미만, 바람직하게는 75% 미만 또는 70% 미만인 좌심실 박출율(LVEF)과 같은 심장 기능을 갖고 있음을 의미한다. 상기 건강한 심장 기능은 예를 들면 건강한 모집단의 평균 심장 기능(예를 들면 평균 LVEF와 같은)이다. 이와 달리, 상기 건강한 심장 기능은 본 발명에 따른 항체로 항암 치료를 시작하기 전에 측정한 환자의 기능(LVEF와 같은)이다.
심장 기능은 예를 들면 초음파 심장진단도 또는 MUGA 스캔을 이용한 대상의 신체검사와 LVEF 검사에 의해 모니터링된다.
ErbB-2는 헤레귤린 수용체 복합체 HER2:HER4를 포함하는 신호전달망의 일부로서 성인의 심근 세포의 성장, 복구 및 생존에 관여한다. 본 명세서에서 전술한 바와 같이, 심장 독성은 ErbB-2 표적 치료법에서 공지의 위험 인자이고 트라스투주맙을 안트라사이클린과 조합하여 사용할 합병증 빈도가 증가하여 심장 스트레스를 야기한다. 예를 들면 트라스투주맙과 독시사이클린의 조합은 심각한 심장 부작용을 유발한다. 트라스투주맙 유발 심장 기능장애의 임상 사례의 수가 증가하고 있지만 그의 작용 기전은 알려져 있지 않다. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양에 대해 현재 알려진 치료법의 심장 독성을 감안하면 본 발명에 따른 항체를 사용하는 것은 특별한 장점이 있다. 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 트라스투주맙과 페르투주맙에 비해 심근 세포의 생존에 영향을 주지 않거나 상당히 적은 정도로 영향을 주는 항체들이 현재까지 제공되었다. 이것은 심장 독성이 감소되기 때문에 중요한 장점을 제공한다. 이는 심장 기능이 손상되지 않은 사람들에게는 이미 유리하고 심지어 심장 기능이 손상된 사람들, 예를 들면 울혈성 심부전(CHF), 좌심실 기능부전(LVD) 및/또는 감소된 좌심실 박출율(LVEF)을 가진 대상 및/또는 심근경색이 있었던 대상에게도 더욱 유리하다. 따라서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중 특이성 항체로서 상기 대상이 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만, 바람직하게는 85% 미만, 80% 미만 또는 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능을 갖는 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 상기 심장 기능은 바람직하게는 LVEF를 포함한다. 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게는 상기 종양은 유방암이다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다. 바람직한 일 구현예는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상을 치료하기 위한 본 발명에 따른 방법으로서 상기 대상이 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만, 바람직하게는 85% 미만, 바람직하게는 80% 미만, 바람직하게는 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능을 갖는 방법 또는 이러한 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체로서:
- 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 또는 적어도 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 중쇄 가변 영역 서열 또는 상기 나열된 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개의 아미노산, 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산에서 상이한 중쇄 가변 영역 서열; 및/또는
- 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열 또는 적어도 중쇄 가변 영역 서열 또는 상기 나열된 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개의 아미노산, 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산, 더 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산에서 상이한 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 PB4188이다.
일 구현예에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 다른 곳에 더 상세히 설명되어 있는 바와 같이 헤레귤린 스트레스 조건에 있는 대상을 치료하기 위해 사용하는 것이다. 따라서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중 특이성 항체로서 상기 대상이 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만, 바람직하게는 85% 미만, 바람직하게는 80% 미만, 바람직하게는 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능을 갖고 상기 종양의 상기 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 가진 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 상기 심장 기능은 바람직하게는 LVEF를 포함한다. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상을 치료하기 위한 방법으로서 상기 대상이 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만, 바람직하게는 85% 미만, 바람직하게는 80% 미만, 바람직하게는 75% 미만, 바람직하게는 70% 미만인 심장 기능을 갖고 상기 종양의 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 가지며 상기 방법이 본 발명에 따른 이중 특이성 항체 또는 약제학적 조성물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 바람직한 일 구현예는 건강한 심장 기능, 바람직하게는 건강한 LVEF에 비해 90% 미만, 바람직하게는 85% 미만, 바람직하게는 80% 미만, 바람직하게는 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능, 바람직하게는 LVEF를 가진 대상에서 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 이중 특이성 항체의 용도로서 상기 종양의 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 가진 용도를 제공한다.
전이 형성의 치료 또는 예방용으로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서 상기 대상이 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만, 바람직하게는 85% 미만, 바람직하게는 80% 미만, 바람직하게는 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능을 가진 이중 특이성 항체가 또한 제공된다. 전이 형성을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 이중 특이성 항체의 용도로서 상기 대상이 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만, 바람직하게는 85% 미만, 바람직하게는 80% 미만, 바람직하게는 75% 미만 또는 70% 미만인 심장 기능을 갖는 용도가 또한 제공된다. 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 바람직하게는 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종이다. 가장 바람직하게는 상기 종양은 유방암이다. 상기 심장 기능은 바람직하게는 LVEF를 포함한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 항체 PB4188이다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명에 따른 항체는 전생존 경로 Akt(PI3 키나아제 경로라고도 함)와 MAP 키나아제 경로의 다양한 인자의 인산화를 저지하기 위해 사용된다. 이들은 HER3의 하류 친증식(downstream pro-proliferative) 신호전달 경로이다. 놀랍게도 본 발명자들은 본 발명에 따른 항체로 Akt, ERK1/2와 S6 리보솜 단백질(S6-RP)의 인산화를 크게 저해하는데 성공한 반면에 트라스투주맙과 페르투주맙은 이러한 강력한 항인산화 효과를 갖고 있지 않다. 친증식 PI3 키나아제와 MAP 키나아제 경로의 인자의 인산화를 저지하면 ErbB-3 양성 종양 세포의 성장을 저지하기 때문에 유리하다. 따라서 Akt, ERK1/2 및/또는 S6-RP의 인산화를 저지, 바람직하게는 저해하기 위한 항체의 용도가 또한 제공된다. 중요한 것은 Akt의 인산화가 실시예에 나타나 있는 바와 같이 본 발명의 항체에 의해 체외 및 생체내 모두에서 크게 감소 또는 나아가 완전 차단될 수 있다는 점이다. 따라서 바람직한 구현예는 Akt의 인산화를 저지, 바람직하게는 저해하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 제공한다. HER3-p85 복합체의 형성을 저지하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도가 또한 제공된다. HER3-p85 복합체의 형성은 Akt 활성화에 있어서 첫 단계이므로 상기 HER3-p85 복합체의 형성을 저지하는 것이 유리하다. 본 발명에 따른 상기 항체는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체이다. 상기 항체는 바람직하게는 T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, PI 72, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 추가로 또는 선택적으로 상기 항체는 바람직하게는 F409와 R426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 적어도 하나의 CDR1, CDR2와 CDR3 또는 도 16 또는 도 37에 나타낸 적어도 하나의 VH 서열을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 상기 항체는 PB4188이다.
명료성과 간결한 기재를 위해서 본 명세서에서는 특징들을 동일하거나 별도의 구현예의 일부로서 기재하고 있지만, 본 발명의 범위는 기재된 특징 모두 또는 일부의 조합을 갖는 구현예들을 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
도 1: PG3178의 하나의 아암과 함께 활성 HER2xHER3 이중 특이성 항체 내 또한 존재하는 일단의 HER2 아암의 단량체 HER2에 대한 항원 적정. PG3025를 제외한 일단의 HER2xHER3의 모든 HER2 단일클론 항체들은 HER2 항원 적정 ELISA를 이용하여 시험하였다.
도 2: 리간드 자극 유무에 따라 BxPC3 세포에 대한 HER2 x HER3 이중 특이성 항체의 기능적 활성. 파선은 상기 분석에서 리간드 자극 유무에 따른 대조 항체 트라스투주맙의 활성을 나타낸다.
도 3: MCF-7 분석에서 HER2와 HER3 단일클론 항체(상부 패널)와 이의 HER2 x HER3 이중 특이성 항체(하부 패널)의 적정 곡선.
도 4: 동소 쥐과 모델에서 31일째에 BxPC3-luc2 종양 크기에 대한 항체 처리 효과. BLI은 생체발광에 의해 측정한 종양 크기임.
도 5: 동소 쥐과 모델에서 31일째에 BxPC3-luc2 종양 크기에 대한 항체 처리 효과. BLI은 생체발광에 의해 측정한 종양 크기임.
도 6: MCF-7과 BxPC3-luc2 HER2를 발현하는 세포에 대한 이중 특이성 HER2xHER3 항체와 이의 모(parental) 단일클론 항체의 FACS 분석. MFI는 평균 형광 세기임.
도 7: HP-SEC와 CIEX-HPLC에 의한 분석 특성 규명. PB4188(상부 패널), 항-HER2 모 단일클론 항체(중간 패널), 항-RSV 단일클론 대조 IgG(하부 패널).
도 8: 연한천에서 항체의 연쇄 적정에 의한 JIMT-1 세포 증식의 저해.
도 9: 마트리겔에서 항체의 연쇄 적정에 의한 BT-474(상부 패널)와 SKBR3(하부 패널) 세포 증식의 저해.
도 10a: 마트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식과 분지/침윤.
도 10b: 모 단일클론 항체 대비 마트리겔에서 PB4188에 의한 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식과 분지/침윤의 저해.
도 10c: 항-HER3 단일클론 항체 대비 마트리겔에서 PB4188에 의한 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식과 분지/침윤의 저해.
도 10d: 트라스투주맙과 항-HER3 단일클론 항체의 조합물 대비 마트리겔에서 PB4188에 의한 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식과 분지/침윤의 저해.
도 10e: 마트리겔에서 PB4188 및 PB4188 + 트라스투주맙 조합물에 의한 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식과 분지/침윤의 저해.
도 11: 100 ng/ml HRG의 존재하 HER2+++ N87 세포에서 PB4188의 우수한 저해 활성.
도 12: 투여량 적정에서 PB4188과 PB3448의 ADCC 활성.
도 13: 단일클론 모 항체들 또는 이의 조합물 대비 이중 특이성 항체의 증가된 ADCC 활성.
도 14: HER2 저발현(상부 패널) 및 고발현(하부 패널) 세포에 대한 트라스투주맙 대비 비푸코실화 PB4188의 ADCC 활성.
도 15: FCγR 변이체를 고발현 또는 저발현하는 리포터 세포가 존재하는 상태에서 SKBR-3 HER2+++ 세포에 대한 비푸코실화 PB4188의 ADCC 활성.
도 16: 본 발명의 항체의 VH쇄, 공통 경쇄와 중쇄의 핵산과 아미노산 서열. 도면에서 나타난 리더 서열은 VH쇄 또는 항체의 일부는 아니지만 전형적으로 단백질을 생산하는 세포에서 단백질 처리 중 분해된다.
도 17: JIMT-1 쥐과 이종 이식 모델에서 종양 크기에 대한 항체 처리 효과. 서로 다른 처리군의 종양 체적 캘리퍼스 측정에 의해 측정한 종양 성장. 상부, 60일 동안의 종양 성장; 하부, 처리 기간(29일) 종료시 종양 성장 저해(TGI).
도 18: JIMT-1 쥐과 이종 이식 모델에서 서로 다른 처리군의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선.
도 19: N87 리간드 주도 성장의 저해. 모 항-HER3 항체 대비 PB4188에 의해 광범위한 HRG에 대해 N87의 HRG 주도 증식이 극복될 수 있다. 항체 농도 40 ng/ml에서 나타난 데이터.
도 20: BT-474 세포(상부; 3개의 독립적인 분석)과 SK-BR-3 세포(하부: 3개의 독립적인 분석)에 대해 125I-표지 IgG HER2xHER3(PB4188)의 정상 상태 세포 친화도 측정. 비특이적 결합은 100배 과량의 미표지 HER2xHER3을 이용하여 측정하였다.
도 21A: 에피토프 매핑 HER2. 동정된 핵심 잔기는 HER2 결정 구조상에 검정색 구로서 표시되어 있고 동정된 2차 핵심 잔기는 회색 구로서 표시되어 있다(PDB ID #1S78).
도 21B
a) 확인된 PG3958 에피토프 잔기를 옅은 회색 구체로서 보여주고 주변 잔기(+/- 5개의 아미노산 잔기)를 암회색 구체로서 보여주고 있는 HER2 결정 구조(PDB #1S78), b) 확인된 에피토프 잔기를 회색으로 보여주고 주변 잔기(+/- 5개의 잔기)를 검정색으로 보여주고 있는 에피토프 영역의 용매 노출된 표면, c) 옅은 회색의 확인된 에피토프 잔기와 암회색의 주변 잔기(+/- 5개의 잔기)를 가진 에피토프 영역의 상세도, d) 확인된 에피토프 잔기(회색 밑줄), 주변 잔기(검정색)와 떨어져 있는 잔기(회색 이탤릭체, a, b와 c에는 나타나 있지 않음)를 보여주고 있는 HER2 PG3958 에피토프 영역의 1차 아미노산 서열. 도면 작성과 분석은 Yasara(www.yasara.org)을 이용하였다.
도 21C:
a) 에피토프 잔기 Arg 426을 회색 구체로 보여주고 Arg 426으로부터 반경 11.2 Å 이내 모든 표면 노출된 잔기를 검정색 구체로 보여주고 있는 HER3 결정구조(PDB #4P59), b) Arg 426과 떨어진 잔기를 가진 에피토프 영역의 용매 노출된 표면은 회색으로 나타내고 Arg 426으로부터 반경 11.2 Å 이내 모든 표면 노출된 잔기는 검정색으로 나타나 있음, c) 옅은 회색의 에피토프 영역 Arg 426 내 잔기와 짙은 회색의 주변 잔기(모두 표지됨). 도면 작성과 분석은 Yasara(www.yasara.org)을 이용하였다.
도 22: Fab 아암 3958 내지 HER2에 대한 핵심 결합 잔기의 확인. 트라스투주맙은 대조군 항체로서 포함되었다. FACS 적정으로 결합을 측정하고 트라스투주맙 결합 대비 AUC로서 결합을 표시하였다. 이 변이체에 대한 트라스투주맙의 결합이 또한 차단될 때 D143Y는 3958 에피토프의 일부로 간주되지 않는다.
도 23: HER3 결정구조 내 표시되어 있는 PG3178 결합에 대한 핵심 잔기. PG3178 결합에 대해 동정된 핵심 잔기는 HER3 결정구조상에서 검정색 구체로서 표시되어 있다(PDB ID # 4P59).
도 24: PG3175 내지 HER3에 대한 핵심 결합 잔기로서 R426의 확인. 2개의 항-HER3 항체는 대조군 항체로 포함되었다. FACS 적정으로 결합을 측정하고 WT HER3에 대한 결합 대비 AUC로서 결합을 표시하였다.
도 25: 체외 심장 스트레스에 의한 PB4188 독성의 부재. 3 μΜ의 안트라사이클린 독소루비신이 존재하는 상태에서 PB4188 또는 단일 특이성 기준 항체와 함께 심근 세포의 배양. 심근 세포의 생존율을 ATP의 정량화에 의해 측정하였고 상대적 발광 단위(RLU)로 표시하였다. T, 트라스투주맙; P, 페르투주맙.
도 26: 트라스투주맙과 HER3 대비 PB4188의 HER2 증폭된 세포에 대한 결합. 서로 다른 양의 HER2를 발현하는 제시된 세포주에 대해 FACS 적정을 수행하였다. 각각의 세포주에 대해 중앙 PE 신호값의 곡선 아래의 면적을 그래프를 작성하였다.
도 27: 포화농도의 PB4188, 트라스투주맙 또는 음성 대조군 항체와 함께 전배양한 SKBR-3 세포에 대한 PB4188FITC의 연쇄 적정의 결합. PB4188FITC는 트라스투주맙 또는 대조군 항체가 있는 상태에서 SKBR-3에 효과적으로 결합한다.
도 28: 4개의 HER2 도메인에 대해 지향적인 동일한 HER3 Fab 아암과 서로 다른 HER2 아암으로 구성된 HER2xHER3 이중 특이성 항체에 의한 HRG 스트레스 조건하 세포 증식 저해.
도 29: SKBR-3 세포의 성장과 형태에 대한 라파티닙과 PB4188의 상승적 조합. 좌측, 서로 다른 조건에서 처리한 세포의 현미경 사진; 우측, 처리 조건에 대해 형태 변화를 나타낸 그래프.
도 30A+B: 경시 실험에서 PB4188에 의한 N87과 SKBR-3 세포의 HRG 매개 인산화의 저해. 트라스투주맙 + 페르투주맙 및 HRG 단독을 대조군으로서 포함하였다.
도 31: 경시 실험에서 PB4188에 의한 N87 세포의 HRG 매개 인산화의 저해. 트라스투주맙 + 페르투주맙 및 라파티닙을 대조군으로서 포함하였다.
도 32: PB4188를 주 2회 및 4회 투여 4시간 후에 Akt 수준과 Akt 인산화 변화를 평가하였다. 종양 용해물 내 인산화 수준은 루미넥스 분석법으로 평가하였다. 분석은 2회 반복하여 수행하고 군 당 5개의 종양을 분석하였다.
도 33: JIMT-1 종양 물질에 대한 Vera Tag 분석에 의한 분석시 HER2:HER3 매개 신호전달에 대한 PB4188의 생체내 매개 효과. 투여 4시간 후 종양을 분석하였고, PBS 처리한 동물 유래 종양을 대조군으로서 포함하였다.
도 34: PB4188은 세포 주기 진행을 감소시킨다. 분석 배지에 접종한 세포를 표준농도(1 ng/ml) 또는 고농도(100 ng/ml)의 HRG가 있는 상태에서 항체를 적정하면서 배양하였다. 24시간(또는 MCF-7 세포의 경우에는 48시간) 후에 상이한 세포 주기 단계(G0/G1, S 또는 G2/M 단계)에서 세포 분포를 분석하였다. 증식 지수는 S와 G2/M 단계에 있는 세포의 비율과 G0/G1 상에 있는 세포의 비율 간 비로서 계산하였다. P+T, 페르투주맙 + 트라스투주맙.
도 35: HER2를 과발현하는 암세포에서 pH 감응 염료로 표지한 항체의 내재화. 1 ng/ml HRG가 첨가된 분석 배지에 접종한 N87(A, B)과 SKBR-3(C, D)를 100 nM pH 감응 염료를 표지한 항체와 함께 24시간 동안 배양하였다. 수거 후 세포를 APC 표지한 항-인간 IgG 2차 항체로 염색하여 세포 표면에 결합된 항체를 검출하였다. PE(A, C) 및 APC(B, D) 채널 내 형광에 대해 FACS에 의해 세포 분석하여 각각 내재화와 항체의 표면 결합을 결정하였다.
도 36: 2명의 서로 다른 기증자 유래 세포를 이용한 트라스투주맙 대 트라스투주맙 + 페르투주맙의 ADCC 활성.
도 37: F3178 변이체의 아미노산과 뉴클레오티드 정렬, CDR 영역이 나타나 있다.
도 38: HRG 의존 N87 분석에서 HER3 단일클론 항체의 적정 곡선. PG6058, PG6061과 PG6065는 PG3178의 변이체이다. PG1337은 파상풍 톡소이드에 특이적인 음성 대조군이다. 데이터는 각 플레이트 상에 존재하는 리간드로 기저 증식에 대해 정규화하였다.
도 39: HER3 단일클론 항체의 CIEX-HPLC 분석 결과. PG6058, PG6061과 PG6065은 PG3178의 변이체이다. 각각의 항체에 대해 VH 영역의 계산된 등전점(pI)과 주 피크의 유지시간(tR)이 주어져 있다.
도 40: HRG 스트레스 농도(A)에서 HER2 증폭된 세포주 또는 마트리겔에서 성장한(B) HER2 증폭된 세포주에 대한 PB4188과의 체외 약물 조합 아이소볼로그램(isobologram).
실시예
방법, 재료 및 항체 선별
세포주:
BxPC-3-luc2(Perkin Elmer 125058), N87(ATCC® CRL-5822™), SK-BR-3(ATCC® HTB-30™), BT-474(ATCC® HTB-20™), JIMT-1(DSMZ ACC 589), L929(Sigma Aldrich 85011425), K562(DSMZ ACC10), HEK293T(ATCC® -CRL-11268™), CH0-K1(DSMZ ACC110), MCF-7(DSMZ ACC 115), MDA-MB-468(#300279-513, Cell line services) SK-OV-3(ATCC® HTB-77™), MDA-MB-175(ATCC-HTB-25), MDA-MB-453(ATCC-HTB-131), MDA-MB-361(ATCC-HTB-27), ZR-75-1(ATCC-CRL-1500)과 MKN-45(DSMZ ACC409) 세포주를 ATCC, DSMZ 또는 Sigma Aldrich로부터 구입하였고 10% 열 불활성화 우태아혈청(FBS)이 첨가된 성장 배지에서 통상적으로 유지하였다. HEK293F Freestyle 세포를 Invitrogen로부터 얻어 259 FreeStyle 배지에서 통상적으로 유지하였다.
재조합 인간, 치킨, 래트 및 스와핑한 도메인 벡터의 생성(HER의 클로닝 )
인간 HER2 . 전장 인간 HER2를 유방암 세포주 JIMT-1로부터 분리한 RNA 유래 cDNA로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 인간 HER2의 증폭을 위해 사용한 프라이머는 다음과 같았다. 정방향 프라이머: AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTTGTGC 역방향 프라이머: AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG. 전장 증폭 산물을 Nhel과 XbaI를 이용하여 분해하고 이어서 pcDNA3.1(Invitrogen)의 해당 부위에서 클로닝하였다.
NCBI 참조 서열 NM_004448.2과 비교하여 서열을 확인하였다. 형질주입과 면역화를 위해 단독으로 인간 HER2 세포외 도메인(ECD)을 발현하는 구성체(construct)를 제작하기 위해서 HER2 막관통 도메인과 ECD를 PCR 증폭하고 pVax1에 재클로닝하였다. 형질주입을 위해서 HER2 ECD 도메인을 증폭시켜 pDisplay에서 또 다른 구성체를 제작하였고 이 구성체에서는 HER2 ECD 도메인이 PDGFR 막관통 도메인에 접합되어 있다.
인간 HER3. HER3의 전장 인간 cDNA 클론을 Origene으로부터 얻었다. 형질주입과 면역화를 위해 단독으로 인간 HER3 ECD를 발현하는 구성체를 제작하기 위해서 HER3 막관통 도메인과 ECD를 PCR 증폭하고 pVax1에 재클로닝하였다. 또한 HER3 ECD 도메인이 PDGFR 막관통 도메인에 접합된 또 다른 구성체를 pVax1에서 제작하였다. NCBI 참조 NM_001982.3과 비교하여 모든 서열을 확인하였다.
시노몰구스 ( Cynomolgus ) HER2 세포외 도메인을 시노몰구스 cDNA - 원숭이) 정상 클론 조직(Biochain)으로부터 PCR 증폭하였다. 시노몰구스 HER2의 증폭을 위해 사용한 프라이머는 다음과 같았다:
정방향 프라이머: AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTGGTAC 역방향 프라이머: AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG. 전장 증폭 산물을 Nhel-XbaI를 이용하여 분해하고 이어서 pcDNA3.1의 해당 부위에서 클로닝하였다. 클론의 서열을 확인하고 붉은털 원숭이의 이용 가능한 서열(XM_002800451)과 맞춰 ErbB-2 클론을 대조 확인하였다.
시노몰구스 HER3 세포외 도메인을 시노몰구스 cDNA - 원숭이) 정상 클론 조직(Biochain)으로부터 PCR 증폭하였다. 시노몰구스 HER3의 증폭을 위해 사용한 프라이머는 다음과 같았다:
정방향 프라이머: AAGCTGGCTAGCACCATGAGGGCGAACGGCGCTCTG, 역방향 프라이머: AATAATTCTAGATTACGTTCTCTGGGCATTAGC. 전장 증폭 산물을 Nhel-XbaI를 이용하여 분해하고 이어서 pcDNA3.1의 해당 부위에서 클로닝하였다. 클론의 서열을 확인하고 붉은털 원숭이의 이용 가능한 서열(ENSMMUP00000027321)과 맞춰 ErbB-3 클론을 대조 확인하였다.
치킨 HER2 서열은 참조 서열 NM_001044661.1을 참고하였다. 인간 I 도메인 I 내지 IV에 대해 치킨 HER2 서열의 도메인 I 내지 IV를 스와핑하여 키메라 스와핑된 도메인 구성체를 제작하였다. 포유류 세포에서 발현을 위해 myc 표지를 함유한 서열을 최적화하였고 Geneart에서 합성하였다.
래트 HER3 서열은 참조 서열 NM_001044661.1을 참고하였다. 인간 I 도메인 I 내지 IV에 대해 래트 HER3 서열의 도메인 I 내지 IV를 스와핑하여 키메라 스와핑된 도메인 구성체를 제작하였다. 포유류 세포에서 발현을 위해 myc 표지를 함유한 서열을 최적화하였고 Geneart에서 합성하였다.
HER2와 HER3 과발현 세포주의 생성
세포 표면에서 다량의 HER3을 발현하는 세포주를 만들기 위해서 NotI과 KpnI 분해에 의해 전장 HER3을 절제하여 포유류 발현 벡터를 제작하였다. 이어서 단편을 pcDNA3.1(-)/hygro 벡터의 해당 부위에서 클로닝하였다. 네오마이신 내성 유전자를 코딩하는 전장 HER2와 HER3 발현 벡터를 사용하여 세포 표면에서 다량의 HER2를 발현하는 세포주를 만들었다. 형질주입 전에 플라스미드를 SSpI와 FspI 분해에 의해 선형화하였다. 2개의 벡터를 K562 세포에 별도로 형질주입하고 항체 선택 후 안정한 풀(pool)을 만들었다. 얻어진 세포주(K562-HER2와 K562-HER3)는 이들의 세포 표면에서 다량의 HER2와 HER3을 발현하였다.
면역화
HER2 면역화. 서로 다른 4개의 면역 전략을 적용하였다. 집단 #A의 경우에 C57B1/6 마우스 6마리를 복강내 주사를 통해 HER-2 200 ㎕로 일시 형질주입한 2 x 106개의 L929 세포로 면역화하였다. 이어서 14일째에 마우스를 125 ㎕ Titermax Gold에 녹인 20 ㎍ Erbb-2-Fc(RND systems) 단백질로 복강내 주사를 통해 추가 접종(boosting)한 후, 28일과 42일째에 HER2 200 ㎕로 일시 형질주입한 2 x 106개의 L929 세포로 추가 접종하였다. 집단 #C의 경우에는 C57B1/6 마우스 6마리를 복강내 주사를 통해 HER2에 의해 일시적으로 형질주입한 2 x 106개의 L929 세포로 면역화하였다. 이어서 14일째에 마우스를 HER2 200 ㎕로 일시 형질주입한 2 x 106개의 L929 세포로 추가 접종하고 35일째에 125 ㎕ Titermax Gold에 녹인 20 ㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 단백질 추가 접종하고 49일째에 200 ㎕ PBS에 녹인 20 ㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 최종 추가 접종하였다. 집단 #E의 경우에는 C57B1/6 마우스 6마리를 125 ㎕ Titermax Gold에 녹인 20 ㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 면역화하였다. 이어서, 14일과 28일째에 125 ㎕ Titermax Gold에 녹인 20 ㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 단백질 추가 접종하고 42일째에 200 ㎕ PBS에 녹인 20 ㎍ Erbb-2-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 최종 추가 접종하였다. 집단 #G의 경우에는 C57B1/6 마우스 6마리를 Genovac(프라이부르크, 독일)에서 이들의 프로토콜에 따라 DNA 백신접종에 의해 면역화하였다. 상기 DNA 백신접종을 위해 사용한 내독소 없이 제공된 벡터는 pVaxl에서 클로닝된 HER2의 막관통 및 세포외 부분을 코딩하였다. 이어서 14, 28과 66일째에 DNA 추가 접종을 하였다.
HER3 면역화. 서로 다른 4개의 면역화 전략을 적용하였다. 집단 #B의 경우에 (C57B1/6) 마우스 6마리를 복강내 주사를 통해 HER3 200 ㎕로 일시 형질주입한 2 x 106개의 L929 세포로 면역화하였다. 이어서 14, 28, 49와 63일째에 마우스를 HER3 200 ㎕로 일시 형질주입한 2 x 106개의 L929 세포로 추가 접종하였다. 집단 #D의 경우에는 0, 14와 28일째에 C57B1/6 마우스 6마리를 복강내 주사를 통해 HER3에 의해 일시적으로 형질주입한 2 x 106개의 L929 세포로 면역화하였다. 이어서 49일째에 마우스를 125 ㎕ Titermax Gold에 녹인 20 ㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 추가 접종하고 66일째에 200 ㎕ PBS에 녹인 20 ㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 최종 추가 접종하였다. 집단 #F의 경우에는 C57B1/6 마우스 6마리를 125 ㎕ Titermax Gold에 녹인 20 ㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 면역화하였다. 이어서, 14일과 28일째에 125 ㎕ Titermax Gold에 녹인 20 ㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 추가 접종하고 42일째에 200 ㎕ PBS에 녹인 20 ㎍ Erbb-3-Fc 단백질로 복강내 주사를 통해 최종 추가 접종하였다. 집단 #H의 경우에는 C57B1/6 마우스 6마리를 Genovac(프라이부르크, 독일)에서 이들의 프로토콜에 따라 DNA 백신접종에 의해 면역화하였다. 상기 DNA 백신접종을 위해 사용한 내독소 없이 제공된 벡터는 pVaxl에서 클로닝된 HER3의 PDGFR의 막관통과 세포외 부분을 코딩하였다. 이어서 14, 28과 66일째에 DNA 추가 접종을 하였다.
항체 역가 측정
면역화된 C57B1/6 마우스의 혈청 내 항-HER2 역가를 ECD-Erbb-2 단백질(Bendermedsystems)에 대한 ELISA와 HER2 음성 K562, HER2를 저발현하는 세포주 MCF-7과 HER2가 증폭된 SKBR-3과 BT-474 세포에 대한 FACS 분석에 의해 측정하였다. 면역화된 C57B1/6 마우스의 혈청 내 항-HER3 역가를 Erbb-3-Fc 단백질에 대한 ELISA와 HER3 음성 K562, HER2를 저발현하는 세포주 MCF-7과 HER2가 증폭된 SKBR-3과 BT-474 세포에 대한 FACS 분석에 의해 측정하였다. 동물들을 희생시키기 전 HER2와 HER3에 대한 혈청 역가가 각각 표 1과 표 2에 기재되어 있다. 모든 집단 내 동물들은 HER2 또는 HER3에 대한 항체 반응이 발생하였다.
림프 조직의 회수
DNA 백신 접종한 모든 동물들(집단 #G와 #H)로부터 비장과 배수 림프절을 제거하였다. 모든 조직으로부터 단일 세포 현탁액을 제조하고 이어서 조직을 트리졸 시약에 용해시켰다. 첫 번째 추가 접종 후 죽은 집단 #C의 마우스 1마리를 제외한 집단 #A 내지 #F의 모든 마우스들로부터 비장을 제거하였다. 모든 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 제조하고 CD19 농축(집단 #A, E, F) 또는 비-B 세포의 제거(집단 #B, C, D)에 의해 MACS 분리 과정을 이용하여 총 B 세포 분획물을 분리하였다.
면역화된 마우스로부터 파아지 디스플레이 라이브러리의 제작
각각의 마우스에 대해 하나의 파아지 라이브러리를 제작하였다. 이를 위해, 군 당 모든 마우스(군 당 5 또는 6마리의 마우스) 유래의 물질을 사용하여 다음과 같은 기법을 이용하여 파아지 라이브러리를 제작하였다. 각각의 개별 마우스로부터 RNA를 분리하고 cDNA를 합성하며 VH 계열에 특이적인 PCR을 수행하였다. 이어서 마우스당 모든 VH 계열 PCR 산물을 정제하였고 DNA 농도를 측정하였으며 공통 경쇄를 함유한 파아지 디스플레이 벡터에서 분해 및 접합하여 마우스-인간 키메라 파아지 라이브러리를 제작하였다. 모든 파아지 라이브러리는 >85%의 삽입 빈도로 >106개의 클론을 함유하였다.
HER2와 HER3에 특이적으로 결합하는 Fab 단편을 보유한 파아지의 선택
항체 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 항체 단편을 선택하였다.
선택을 위하여 면역화된 라이브러리와 합성 라이브러리(de Kruif et al. Mol. Biol. (1995), 248, 97- 105에 기재되어 있음)를 이용하였다.
HER2 파아지 선택 및 선별
파아지 라이브러리를 VCS-M13 헬퍼 파아지(Stratagene)로 구조(rescue)하고 재조합 단백질로 코팅한 면역 시험관(Nunc)에서 두 차례 라운드하기 위해 선택하였다. 첫 번째 라운드에서는 ECD-Erbb-2 단백질(Bendermedsystems)을 면역 시험관에 코팅하는 한편, 두 번째 라운드에서는 Erbb-2-Fc(RND systems)를 면역 시험관에 코팅하였다. 면역 시험관을 4% 탈지분유(ELK)로 차단하였다. 파아지 항체 라이브러리 또한 면역 시험관에 파아지 라이브러리를 첨가하기 전에 4% ELK로 차단하였다. 단백질이 코팅된 면역 시험관에서 파아지 라이브러리와 함께 회전 조건에서 2시간 동안 상온 배양하였다. 다음, 면역 시험관을 PBS 중 0.05% Tween-20으로 5 내지 10회 세척한 후 PBS에서 5 내지 10회 세척하였다. 50 mM 글리신(pH 2.2)을 이용하여 결합 파아지를 용출하여 대장균 XL-1 블루에 첨가하고 파아지 감염을 위해 37℃에서 배양하였다. 이어서, 감염된 박테리아를 암피실린, 테트라사이클린과 글루코오스를 함유한 한천 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 첫 번째 라운드 후에 콜로니를 플레이트로부터 긁어 내어 모으고 구조 및 증폭하여 농축된 제1 라운드 라이브러리를 제조하였다. 다음, 농축된 라이브러리를 상술한 프로토콜을 이용하여 Erbb-2-Fc(RND systems)에 대해 선택하였다. 두 번째 라운드 선택 후에 개개의 클론을 골라 구조하여 파아지 단일클론 미니프랩(miniprep)을 제조하였다. 다음, 유방암 세포주 BT-474에 결합에 대해 FACS로 ErbB-2에 결합하는 양성 파아지 클론을 동정하였다. 모든 Erbb2 특이적 클론의 VH 유전자의 서열을 확인하였다. VBASE2 소프트웨어로 VH 유전자 재배열을 규명하여 고유(unique) 클론을 동정하였다. 다음, 모든 고유 클론을 HEK293T 세포(음성 대조군), ErbB-2로 일시 형질주입한 HEK293T 세포와 BT-474 세포에 결합에 대해 FACS에서 파아지 포맷으로 시험하였다.
HER3 파아지 선택 및 선별
파아지 라이브러리를 VCS-M13 헬퍼 파아지(Stratagene)로 구조하고 재조합 단백질로 코팅한 면역 시험관(Nunc)에서 두 차례 라운드하기 위해 선택하였다. 2개의 선택 라운드에서 라운드 Erbb-3-Fc(RND systems)를 면역 시험관에 코팅하였다. 융합 단백질의 Fc 부분에 대한 선택 편향을 극복하기 위해서 Erbb-3-Fc에 대한 2개의 선택 라운드를 150 ㎍/ml 인간 IgG가 있는 상태에서 수행하였다. 면역 시험관을 4% ELK로 차단하였다. 면역 시험관을 4% ELK로 차단하였다. 파아지 항체 라이브러리 또한 면역 시험관에 파아지 라이브러리를 첨가하기 전에 4% ELK로 차단하였다. 파아지 라이브러리와 함께 회전 조건에서 2시간 동안 배양하였다. 다음, 면역 시험관을 PBS 중 0.05% Tween-20으로 5 내지 10회 세척한 후 PBS에서 5 내지 10회 세척하였다. 50 mM 글리신(pH 2.2)을 이용하여 결합 파아지를 용출하여 대장균 XL-1 블루에 첨가하고 파아지 감염을 위해 배양하였다. 이어서, 감염된 박테리아를 암피실린, 테트라사이클린과 글루코오스를 함유한 한천 플레이트에 도말하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 첫 번째 라운드 후에 콜로니를 플레이트로부터 긁어 내어 모으고 구조 및 증폭하여 농축된 제1 라운드 라이브러리를 제조하였다. 다음, 농축된 라이브러리를 상술한 프로토콜을 이용하여 Erbb-3-Fc(RND systems)에 대해 선택하였다. 두 번째 라운드 선택 후에 개개의 클론을 골라 구조하여 파아지 단일클론 미니프랩을 제조하였다. 유방암 세포주 BT-474에 결합에 대해 FACS로 양성 파아지 클론을 동정하였다. 모든 양성 클론의 VH 유전자의 서열을 확인하였다. VBASE2 소프트웨어로 VH 유전자 재배열을 규명하여 고유 클론을 동정하였다. 모든 고유 클론을 K562 세포(음성 대조군), 안정한 K562-HER3 세포와 BT-474 세포에 결합에 대해 FACS에서 파아지 포맷으로 시험하였다.
Erbb2와 Erbb3 항원 포맷에 대해 총 36개를 선택하였다. 모든 선택 선별 과정을 통해 HER2에 대해 지향적인 89개의 고유 Fab 클론과 HER3에 대해 지향적인 137개의 고유 Fab 클론을 얻었다. Fab은 그의 고유 HCDR3 서열로 인해 고유한 것으로 간주된바, 고유 VDJ 재조합 현상(event)을 의미한다. 몇몇의 경우에, CDRl 및/또는 CDR2에서 차이를 제외하고는 동일한 HCDR3을 이용하여 클론 변이체를 얻었다. 면역화된 마우스 라이브러리로부터 친화성 변이체를 반영하는 VH 유전자에서의 치환을 함유한 클론 변이체의 클러스터를 선택하였다.
항체 선택/특성 규명
단일클론 항체의 생성
VH 유전자 서열과 이의 일부 서열 변이체에 의해 판단한 면역화된 마우스 파아지 라이브러리 유래 고유 항체의 VH 유전자를 백본(backbone) IgG1 벡터에서 클로닝하였다. 이 과정에서 서로 다른 2개의 생산 세포주 HEK293T와 293F Freestyle 세포를 사용하였다. 부착성 HEK293T 세포를 6웰 플레이트에서 80%의 밀집도(confluency)로 배양하였다. 세포를 개별 DNA-FUGENE 혼합물로 일시 형질주입하고 더 배양하였다. 형질주입 7일 후에 상청액을 수거하고 새로운 배지로 바꿔주었다. 형질주입 14일 후에 상청액을 모아 0.22 μΜ(Sartorius)을 통해 여과하였다. 멸균 상청액을 4℃에서 보관하였다. 현탁 적응된 293F Freestyle 세포를 진탕기 위 T125 플라스크에서 밀도 3.0 x 106 세포/ml가 될 때까지 배양하였다. 세포를 24-딥 웰 플레이트의 각 웰에 0.3-0.5 x 106 생존 세포/ml의 밀도로 접종하였다. 세포를 개개의 멸균 DNA: PE1 혼합물로 일시 형질주입하고 더 배양하였다. 형질주입 7일 후에 상청액을 수거하고 0.22 μΜ(Sartorius)를 통해 여과하였다. 멸균 상청액을 4℃에서 보관하였다.
이중 특이성 항체의 생성
효율적인 헤테로다이머화와 이중 특이성 항체 생성을 가능하게 하기 위해서 자체 보유 CH3 기술을 이용하여 이중 특이성 항체를 생성하였다. 상기 CH3 기술은 이미 기재한 바대로(PCT/NL2013/050294; WO 2013/157954 Al로서 공개됨)) CH3 영역의 전하 기반의 점 변이(charge-based point mutation)를 이용하여 서로 다른 2개의 중쇄 분자가 효율적으로 쌍을 이루도록 하는 기술이다.
기능적 선별을 위한 IgG 정제
친화성 크로마토그래피를 이용하여 IgG를 소규모(< 500 ㎍), 중규모(<10 mg)와 대규모(>10 mg)로 정제하였다. 소규모 정제는 진공 여과를 이용하여 24 웰 필터 플레이트에서 멸균 조건으로 수행하였다. 먼저, 배지의 pH를 pH 8.0으로 조정하고 이어서 소규모 생산을 위해 단백질 A 세파로오스 CL-4B 비드(50% v/v)(Pierce)와 함께 600 rpm의 진탕 플랫폼상에서 2시간 동안 25℃에서 배양하였다. 다음, 비드를 진공 여과에 의해 수거하였다. 비드를 pH 7.4의 PBS로 2회 세척하였다. IgG를 pH 3.0에서 0.1 M 시트레이트 완충액으로 용출하고 IgG 분획물을 즉시 pH 8.0의 Tris에 의해 중성화하였다. 멀티스크린 Ultracel 10 멀티플레이트(Millipore)를 이용한 원심분리에 의해 완충액을 교체하였다. 시료를 pH 7.4의 최종 완충액 PBS 안에 위치시켰다.
HER2 / HER3 특이적 IgG의 입증
HER2 또는 HER3을 과발현하는 BT-474, HEK293T와 HEK293T에 결합에 대해 항체를 FACS로 시험하였다. 따라서 트립신을 이용하여 세포를 수거하여 FACS 완충액(PBS/0.5%BSA/0.5mM EDTA)에 106 세포/ml로 희석하였다. 1-2 x 105개의 세포를 바닥이 U자형인 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 4℃에서 300 g으로 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트(들)를 뒤집어 상청액을 버렸다. 각각의 IgG 시료 50 ㎕를 10 ㎍/ml의 농도로 첨가하고 1시간 동안 얼음 위에서 배양하였다. 세포를 1회 원심분리하였고 상청액을 제거하였으며 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 50 ㎕의 희석한 1: 100 마우스 항 인간 IgG PE(Invitrogen)를 첨가하고 암소에서 30-60분 동안 얼음 위에서 배양하였다. FACS 완충액을 첨가한 후, 세포를 1회 원심분리하였고 상청액을 제거하였으며 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. HTS 세팅에서 FACSCanto 유세포 분석기를 이용하여 세포를 분석하였다. 세포에 대한 항체의 결합을 평균 형광 세기(MFI)에 의해 평가하였다.
ELISA 분석을 이용하여 비특이적 결합 반응성에 대해 시험하였다. 항원인 피브리노겐, 헤모글로빈과 파상풍 독소에 대한 HER2와 HER3 항체의 반응성을 시험하였다. HER2와 HER3에 대한 특이적 결합을 시험하기 위해서 EGFR, HER2, HER3과 HER4의 정제된 재조합 세포외 도메인에 대한 항체의 결합을 시험하였다. 항원을 MAXISORP™ ELISA 플레이트에 밤새 코팅하였다. ELISA 플레이트의 웰을 1시간 동안 37℃에서 BSA를 함유한 PBS(pH 7.2)로 차단하였다. 선택된 항체를 PBS-2% BSA에 희석한 농도 10 ㎍/ml에서 2회 반복하여 시험하고 25℃에서 2시간 동안 결합이 이루어지도록 하였다. 대조군으로서 코팅된 항원에 특이적인 항체와 음성 대조군 항체를 이용하여 상기 과정을 동시에 수행하였다. ELISA 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween 20)로 5회 세척하였다. 결합된 IgG를 1:2000 희석 HRP-접합체(염소 항-마우스 BD)로 검출하였고 25℃에서 2시간 동안 결합이 이루어지도록 하였다. ELISA 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% Tween 20)로 5회 세척하고 결합된 IgG를 OD492nm 측정에 의해 검출하였다.
HER2 / HER3 특이적 IgG의 에피토프 그룹화
일단의 항-HER2 항체를 다른 종(마우스, 치킨)으로부터 유래된 HER2 ECD에 대한 이들의 반응성과 HER2 분자 내 특이적 도메인, 즉 도메인 I, II, III과 IV에 대한 이들의 결합을 토대로 키메라 구성체를 이용하여 비닝(binning)하였다.
일단의 항-HER3 항체를 다른 종(시노몰구스, 래트)으로부터 유래된 HER3 ECD에 대한 이들의 반응성과 HER3 분자 내 특이적 도메인, 즉 도메인 I, II, III과 IV에 대한 이들의 결합을 토대로 키메라 구성체를 이용하여 비닝하였다.
이를 위해 리포펙타민/DNA 혼합물을 이용하여 CHO-K1 세포를 관련 구성체로 일시 형질주입하였다. 키메라 스와핑된 도메인 구성체에서 치킨 HER2 또는 래트 HER3의 도메인은 대응되는 인간 도메인으로 바뀐다. 특이적 항체의 결합은 FACS에 의해 측정하였다. 구성체의 발현은 항-myc 항체를 이용하여 확인하였다. 트라스투주맙에 의한 FACS 염색은 도메인 IV에 대한 특이적 결합에 대한 대조군으로서 포함되었다.
각 군의 항체는 염색 세기(MFI)에 따라 등급화하였다. 65개 항체의 일단의 HER2를 7개의 빈(bin)으로 매핑할 수 있었다(표 3).
1. 도메인 I 특이성(25)
2. 도메인 II 특이성(2)
3. 도메인 III 특이성(23)
4. 도메인 IV 특이성(7)
5. 도메인 IV 특이성 및 마우스에 대한 교차 반응성(2)
6. 모든 구성체에 대해 반응성(2)
7. 인간 HER2에 대해서만 반응성(4)
트라스투주맙과 경쟁
HER2 도메인 IV에 매핑된 2개의 항체는 SKBR-3 세포의 증식을 저해하였다. 2개의 항체는 하나의 아미노산이 다른 것을 제외하고는 비슷한 CDR3을 공유하였다. 경쟁 ELISA에서 트라스투주맙과 경쟁하는 하나의 항체 PG1849의 능력을 조사하였다. 이 ELISA에서 Fc-HER2를 코팅하고 15 ㎍/ml 농도의 IgG 항체와 함께 배양하였다. 15분 배양 후, 파아지를 1시간 더 배양하였다. 이후, 파아지가 검출되었다. 표 4는 ELISA 중에 신호 손실이 나타나지 않았기 때문에 PG1849와 트라스투주맙이 HER2에 동시에 결합할 수 있음을 입증하고 있다. 상기 분석에서 동일한 파아지와 항체가 조합되었을 때 진정한 경쟁만이 관찰되었다.
124개 항체의 일단의 HER3을 5개의 빈으로 매핑할 수 있었다(표 5):
1. 높은 도메인 III 반응성, 래트와 마우스에 대해 반응성 및 도메인 IV에 대해 작은 반응성(8)
2. 높은 도메인 III 반응성, 래트, 인간과 시노몰구스에 대해 반응성 및 도메인 IV에 대해 작은 반응성(8)
3. 래트, 시노몰구스와 인간 HER3에 대해서만 반응성(43)
4. 인간 HER3에 대해서만 반응성(32)
5. 모든 구성체에 대해 반응성(33)
세포주 증식 분석
K-BR-3 세포를 L-글루타민과 10% 열 불활성화 FBS가 첨가된 DMEM-F/12에서 배양하였다. BxPC-3-luc2 세포를 10% 열 불활성화 FBS가 첨가된 RPMI1640에서 배양하였다. MCF-7 세포는 100 μΜ NEAA, 1 mM 피루브산 나트륨, 4 ㎍/ml 인슐린과 10% 열 불활성화 FBS가 첨가된 RPMI1640에서 배양하였다.
SK-BR-3 세포의 증식 분석을 위해서 완전 밀집되지 않은(subconfluent) 세포 배양물을 PBS로 세척하고 트립신화한 후 배양 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 세포를 배양 배지에서 6xl04 세포/ml로 희석하였다. 항체를 10과 1 ㎍/ml의 농도로 희석하여 96웰 검정 바닥 플레이트(ABgene AB-0932)에 100 ㎕의 부피로 첨가하였다. 세포를 6000 세포/웰의 밀도로 첨가하였다. 세포를 암소에서 3일 동안 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 배양하였다. Alamar Blue™(Invitrogen)를 제조사 지침에 따라 첨가하고 암소에서 6시간 동안 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 배양하였다. 550 nm 여기 파장과 590 nm 발광 파장에서 형광을 측정하였다. 성장 저해도를 동일 농도의 트라스투주맙의 성장 저해도와 비교하였다(표 6).
MCF-7과 BxPC-3-luc2 세포의 증식 분석을 위해서 완전 밀집되지 않은 세포 배양물을 PBS로 세척하고 트립신화한 후 배양 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화시켰다. 세포를 큰 부피의 분석 배지(0.05% BSA와 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린을 함유한 RPMI 1640 배지)에서 2회 세척하였다. MCF-7 세포를 배양 배지에서 5x104 세포/ml로 희석하였다. 항체를 10과 1 ㎍/ml의 농도로 희석하여 96웰 검정 바닥 플레이트(ABgene AB-0932)에 100 ㎕의 부피로 첨가하였다. 세포를 최종 농도 1 ng/ml의 인간 재조합 인간 NRGl-베타 1/HRGl-베타 1 EGF 도메인; (396-HB-050 RND)가 존재하는 상태에서 5000 세포/웰의 밀도로 첨가하였다. 이하, 인간 NRGl-베타 1/HRGl-베타 1 EGF 도메인을 HRG라고 한다. 세포를 암소에서 5일 동안 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 배양하였다. Alamar Blue™(Invitrogen)를 제조사 지침에 따라 첨가하고 암소에서 24시간 동안 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 배양하였다. 550 nm 여기 파장과 590 nm 발광 파장에서 형광을 측정하였다. 성장 저해도를 동일 농도의 #Ab6의 성장 저해도와 비교하였다(표 7).
BxPC-3-luc-2 증식 분석을 이용하여 이중 특이성 항체를 선별하였다. BxPC-3-luc-2 세포를 배양 배지에서 8xl04 세포/ml로 희석하였다. 항체를 10과 1 ㎍/ml의 농도로 희석하여 96웰 검정 바닥 플레이트(ABgene AB-0932)에 100 ㎕의 부피로 첨가하였다. 세포를 최종 농도 10 ng/ml의 인간 HRG이 부재 또는 존재하는 상태에서 8000 세포/웰의 밀도로 첨가하였다. 세포를 4일 동안 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 배양하였다. Alamar Blue™(Invitrogen)를 제조사 지침에 따라 첨가하고 암소에서 4시간 동안 37℃, 5% CO, 95% 상대습도에서 배양하였다. 550 nm 여기 파장과 590 nm 발광 파장에서 형광을 측정하였다.
주변효과를 최소화하기 위해서 PBS로 96웰 플레이트의 바깥쪽 웰을 완전히 채웠다.
HER2 특이적 IgG의 친화도 등급화
본 발명자들은 Devash(PNAS, 1990)에 의해 기재된 방법을 이용하여 제한된 항원-ELISA로 항체들을 등급화하였다. 감소된 항원 코팅 농도를 이용하면 관찰된 교차 반응성 반응이 없어지고 고친화도/결합활성(avidity) 항체를 검출하기 위해 이용할 수 있다. 따라서 고체 지지체 상의 항원 농도를 점차 감소시켜 약한 면역반응성을 조사하였다. 연쇄 적정을 위해 2.5 ㎍/ml로부터 시작하여 0.019 ㎍/ml까지 ECD-Erbb-2 단백질을 MAXISORP™ ELISA 플레이트에 밤새 코팅하였다. 5% BSA를 함유한 PBS(pH 7.2)로 ELISA 플레이트의 웰을 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 선택된 항체를 2% BSA로 희석한 PBS 10 ㎍/ml의 농도에서 2회 반복 시험하였고 25℃에서 2시간 동안 결합이 이루어지도록 하였다. 대조군으로서 코팅된 항원에 특이적인 항체와 음성 대조군 항체를 이용하여 상기 과정을 동시에 수행하였다. ELISA 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% v/v Tween 20)로 5회 세척하였다. 결합된 IgG를 1:2000 희석 HRP-접합체(염소 항-마우스 BD)로 검출하였고 25℃에서 2시간 동안 결합이 이루어지도록 하였다. ELISA 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05% Tween 20)로 5회 세척하고 결합된 IgG를 OD492nm 측정에 의해 검출하였다. PG1849, PG2916, PG2926, PG2930, PG2971, PG2973, PG3004와 PG3031을 HER2 항원 적정 ELISA로 시험하였다(도 1).
다양한 카파 경쇄와 HER2 VH 유전자의 결합
서로 다른 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 HER2 VH의 결합을 조사하기 위해서 일단의 HER2 항체를 또 다른 VK 카파쇄, 즉 MEHD7945A VL의 범위(context)에서 클로닝 및 발현시켰다. 생산된 IgG를 K562 세포와 안정한 K562-HER2 세포에서 FACS 분석 처리하였다. 조합적 라이브러리와 비조합적 라이브러리로부터 유래된 VH 유전자가 표 8에 나열되어 있다. VH쇄 MF2971, MF3958, MF2916, MF2973, MF3004, MF3025, MF3031은 모두 공통 경쇄 IGKV1-39와 조합시 관찰되는 항원 특이성과 결합의 큰 손실 없이 MEHD7945A 경쇄와 조합할 수 있었다. VH쇄 MF1849는 변이체 카파 경쇄와 조합할 수 없었고 항원 특이성과 결합을 유지할 수 없었다.
기타 HER2와 HER3 항체
HER2 또는 HER3의 기능을 저해하는 항체는 본 기술분야에 공지되어 있다.
공개된 정보에 따라 다른 항체들을 제작하고 293F Freestyle 세포에서 발현시켰다. US2006/0212956 Al (Genentech)에 개시되어 있는 정보를 토대로 항-HER2 항체인 페르투주맙과 트라스투주맙을 만들었다. 항-HER3 항체 #Ab6은 WO 2008/100624 (Merrimack Pharmaceuticals, Inc.)에 개시되어 있는 정보를 토대로 만들어 IgG1 백본 벡터에 재클로닝하였다. 1-53과 Ul-59 항-HER3 항체의 정보는 US 7,705,103 B2(U3 Pharma AG)로부터 얻었다. 항-HER3 LJM716 항체의 정보는 US 2012/0107306으로부터 얻었다. 투-인-원 항-EGFR 항-HER3 항체인 MEHD7945A의 구성에 대한 정보는 WO2010/108127로부터 얻었다.
HER2xHER3 이중 특이성 항체의 선별
일단의 HER2와 HER3 항체의 VH를 전하를 띤 조작 벡터로 재클로닝하여 항체 중쇄의 발현시 중쇄의 헤테로다이머화가 이루어지게 하여 형질주입 후 이중 특이성 항체가 생성되도록 하였다. HER2와 HER3 아암을 이중 특이성 IgG 포맷으로 조합하는데 서로 다른 3개의 전략을 이용하였다:
1. HER2(리간드 독립적 성장 차단) xHER3 (리간드 독립적 성장 차단)
2. HER2(리간드 독립적 성장 차단) xHER3 (리간드 의존적 성장 차단)
3. 서로 다른 에피토프 빈 유래의 HER2 x HER3(리간드 의존적 성장 차단)
몇몇 이중 특이적 조합에 있어서, 군 2와 3에 생성된 항체를 군 1과 중복시켰다.
총 495개의 이중 특이성 항체를 24웰 포맷에서 생산하여 정제하였다. 모든 항체의 HER2- 및 HER3-발현 췌장 BxPC-3-luc-2 세포주(Caliper) 증식 저해능을 시험하였다. 항체의 효능은 10과 1 ㎍/ml의 농도로 존재하는 항체와 흑백 선별로 HRG-의존 및 HRG-독립 세팅에서 결정하였다. 대조 항체뿐 아니라 음성 대조군 항체로서 동일 농도의 트라스투주맙을 포함하였다. 1 ㎍/ml에서 상위 80개의 HER2xHER3 이중 특이성 항체(조합한 저해율 기준으로)의 기능적 활성을 도 2에 나타내었다.
양성 대조군 항체에 비해 더 높은 저해 활성을 보인 항체(총 40개)를 선택하여 24웰 포맷에서 복제 및 정제하였고 10과 1 ㎍/ml 농도에서 흑백 BxPC-3-luc-2 스크린에서 다시 시험하였다. 이들 항체를 HRG-의존적 MCF-7 분석에서 더 적정하고 트라스투주맙과 페르투주맙(1:1)의 조합과 음성 대조군 항체와 비교하였다. 도 3은 모 HER3 항체와 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합 대비 3개의 이중 특이성 항체의 적정 곡선의 일례를 보여주고 있다. 모 단일클론 항체들은 상부 패널에, 이중 특이성 항체는 하부 패널에 나타나 있다(도 3).
상기 이중 특이성 항체, 단일클론 항체와 비교 항체에 대한 IC50을 Prism 소프트웨어를 사용한 비선형 회귀 분석을 이용하여 계산하였다. 그래프 패드 소프트웨어에는 MCF-7 분석에서 이중 특이성 항체의 IC50 값과 비교용 BxPC3 분석에서 이들의 저해 활성이 목록화되어 있다. 일단의 12개 HER2xHER3 이중 특이성 항체는 트라스투주맙 + 페르투주맙에 비해 더 강력한 저해 활성을 가졌다. 또한 상기 이중 특이성 항체는 모 단일클론 PG3178과 동등하거나 이보다 더 강력하였다(표 9).
리간드 의존적 세포 성장을 저해한 이중 특이성 항체는 HER3 아암 3178, 3163, 3099와 3176과 함께 HER2 아암으로 구성되었다. 가장 강력한 이중 특이성 항체의 2개의 HER2와 HER3 아암은 모두 2가 단일클론 항체로서 리간드 독립적 SKBR-3 증식(2개의 HER2와 HER3 아암 모두)(표 6) 또는 리간드 의존적 MCF-7 증식(HER3 아암)을 저해할 수도 있었다(표 7). 상기 강력한 항체 대부분은 항-HER3 항체 3178과 함께 HER2 아암 인식 도메인 I로 구성되었다.
BxPC -3- luc2 종양 성장 저해
표 9에 기재되어 있는 항체를 BxPC-3-luc2 췌장 이종 이식 모델에서 시험하였다. BxPC-3-luc2 세포주는 HER2와 HER3 모두를 발현하고 HER2 저발현 세포주로 간주된다. 연구 초기에 8-10주령인 CB17 SCID 자성 마우스의 췌장에 l×lO6개의 종양 세포를 20 ㎕로 동소 이식하였다. 이를 위해 마우스를 마취시키고 우측으로 눕혀 좌측을 노출시키고 좌측 옆구리 영역을 0.5 cm 절개하였다. 췌장과 비장을 적출하고 20 ㎕ 내 l×l06개의 종양 세포를 췌장 미부의 피막하 공간에 투여하였다. 이식 1주 후 생체발광(BLI) 데이터가 생성되었다. 촬영 15분 전에 모든 마우스에 150 mg/kg 루시페린(D-루시페린-EF 칼륨염, Cat. #E6552, Promega)을 복강내 주사하였다. 좌측면도를 이용하여 매주 1 또는 2회 BLI 촬영하였다. -BLI/종양 체적을 기준으로- 기준외 동물들은 제외하고 마우스를 군당 7마리씩 무작위로 배분하였다. 실험 8일째에 치료를 시작하였다. 항체 처리군의 동물에게는 3주 연속 매주(0. 7, 14와 21일) 30 mg/kg의 항체를 투여하였다. 치료 0일째에 동물들에게 부하 용량을 2회, 즉 항체 60 mg/kg을 투여하였다. 31일째에 마지막 촬영을 하였다.
또 다른 일단의 이중 특이성 항체와 모 항체들과 함께 2개의 BxPC-3-luc2 이종 이식 모델로 실험을 진행하였다. 첫 번째 BxPC-3-luc2 이종 이식 모델에서(도 4), 하나의 군에는 음성 대조군 항-RSV 항체(Ctrl IgG)를 투여하고, 하나의 군에는 대조군 항체 트라스투주맙을 투여하고, 하나의 군에는 양성 대조군 항체 트라스투주맙+페르투주맙(1:1 v/v)을 투여하였다. 나머지 7개의 군에는 단일클론(PG) 또는 이중 특이성(PB) 항체 PG3004, PG3178, PB3566, PB3710, PB3443, PB3448과 PB3441 중 하나를 투여하였다. 이중 특이성 항체의 조성에 대한 상세한 내용을 표 9에 나타내었다.
시험한 5개의 모든 이중 특이성 항체들은 종양 성장을 저해할 수 있었다. 이중 특이성 HER2 x HER3 항체로 처리한 동물의 평균 종양 질량(BLI)은 트라스투주맙+페르투주맙의 조합으로 처리한 동물과 유사하였다.
두 번째 BxPC-3-luc2 이종 이식 모델에서(도 5), 하나의 군에는 음성 대조군 항-RSV 항체(Ctrl IgG)를 투여하고, 하나의 군에는 양성 대조군 항체 조합 트라스투주맙+페르투주맙(1:1 v/v)를 투여하였다. 나머지 5개의 군에는 항체 PG3163, PB3986, PB3990, PB4011과 PB3883 중 하나를 투여하였다. 이중 특이성 PB 항체에 대한 상세한 내용을 표 9에 나타내었다. 이들 이중 특이성 항체는 동일한 HER2 아암 MF2971과 조합한 서로 다른 3개의 HER3 결합 아암과 HER3 결합 아암 MF3163과 조합한 추가 HER2 아암을 함유하였다. 본 실험에서 대조군의 종양은 첫 번째 실험에서와 동일한 수준의 성장 촉진을 보이지 않아 결과 해석을 복잡하게 하였다. 그럼에도 트라스투주맙 + 페르투주맙에 비해 PB3883과 PB3990 HER2xHER3 이중 특이성 항체는 비슷한 저해 활성을 가졌다(도 5).
생체내 및 체외 데이터를 토대로 HER2 아암이 MF2971, MF3004, MF1849로 구성되고 HER3 아암이 MF3178로 구성된 일단의 이중 특이성 항체를 선택하였다. MF2971과 MF3004 아암은 마우스 기원으로 인간화하였다.
모 단일클론 항체 대비 이중 특이성 HER2xHER3 항체의 결합
HER2xHER3 이중 특이성 항체와 이들의 모 대응 항체의 결합을 FACS 분석에 의해 측정하여 비교하였다. 2.5 ㎍ g/ml-0.01 ㎍ g/ml 범위에서 항체의 연쇄 적정으로 BxPC-3-luc2 세포와 MCF-7 세포에 대해 FACS를 수행하였다. 시험한 일단의 항체들은 이중 특이성 항체 PB3566로 구성되었고 이들의 모 항체는 항-HER3 항체 PG3178과 항-HER2 항체 PG3004로 구성되었다. MFI 데이터를 그래프로 작성하였고 2개의 세포주에 대한 그래프를 통해 이중 특이성 항체 PB3566이 항-HER3 항체 PG3178과 항-HER2 항체 PG3004에 비해 2개의 종양 세포주에 더 효과적으로 결합함을 알 수 있다(도 6).
MF2971과 MF3004의 인간화
종래기술에 알려진 기술에 따라 MF2971과 MF3004를 인간화하였다. MF2971의 총 7개의 인간화/탈면역화 변이체 서열을 발현시켜 확인하였고 그 특성은 단일클론으로서 또한 HER3-특이적 항체 MF3178과 이중 특이성 포맷 조합으로 분석되었다. 7개의 MF2971 변이체에서 MF2971의 HCDR3을 MF3004의 HCDR3으로 대체하여 생성한 MF3004의 7개의 변이체 서열에 대해서 동일하게 수행하였다. 모든 인간화 변이체의 발현, 완전성(integrity), 열 안정성과 기능적 활성을 분석하였다. 생산, 완전성, 안정성과 기능 완전성을 토대로 MF2971의 변이체(2971-var2)를 MF3178과 이중 특이성 포맷으로 사용할 VH의 최적 인간화 변이체로서 선택하였다. 이 2971-var2는 MF3958로 개칭하였다. 이중 특이성 HER2xHER3 조합인 MF3958xMF3178은 결과적으로 PB4188이었다.
PB4188의 대규모 생산, 정제 및 분석 연구
현탁 적응된 293F Freestyle 세포를 밀도 3.0 x 106 세포/ml가 될 때까지 진탕기 위 삼각 플라스크에서 배양하였다. 세포를 0.3-0.5 x 106 생존 세포/ml의 밀도로 4 L 삼각 플라스크에 접종하였다. 세포를 각각의 멸균 DNA: PE1 혼합물로 일시 형질주입하고 추가 배양하였다. 형질주입 7일 후, 이중 특이성 항체를 함유한 순화 배지를 5분간 1000 g에서 저속 원심분리에 의해 수거한 후 5분간 4000g에서 고속 원심분리하였다. 회수한 순화 배지를 5 kDa Satorius hydrosart 카세트 상에서 약 600 ml까지 농축하고 이어서 4 L PBS에 대하여 투석하였다. 항체를 칼럼 상에서 35 ml MabSelectSure XL(11℃)에 결합시켰다. 칼럼을 150 ml PBS, 1 M NaCl를 함유한 150 ml PBS, 100 ml PBS를 이용하여 역류 방식으로 세척함으로써 항체에 특이적으로 결합한 단백질을 제거하였다. 결합된 항체는 역류 방식으로 pH 3.0의 100 mM 시트레이트를 이용하여 용출시키고 5 ml 분획물은 pH 8.0의 4 ml lTris를 함유한 10 ml 튜브에 회수하여 중화시켰다. 용출된 항체는 superdex 200 50/1000를 이용한 겔 여과법에 의해 더 정제하였다. 정제한 항체를 0.22 ㎛ 시린지 필터를 이용하여 여과 멸균하였다. IgG 농도는 OD280 측정에 의해 결정하고 단백질 농도는 아미노산 서열을 토대로 계산하였다. 단백질의 응집(HPSEC), 순도(SDS-PAGE, nMS, IEX와 IEF)를 시험하였다. 단백질 시료를 -80℃에서 보관하였다.
분석 및 이종 이식 연구를 위한 IgG 정제
HiTrap MabSelect Sure 칼럼과 HiTrap 탈염 칼럼을 사용하는 AKTA 100 Explorer 이용하여 중규모 정제를 수행하였다. 시료를 5 ml/분으로 로딩하였다. 칼럼 체적의 2배의 PBS로 칼럼을 세척하였다. 0.1 M 시트레이트 완충액으로 pH 3.0에서 IgG를 용출하였다. 다음, 시료를 탈염하고 pH 7.4의 최종 완충액 PBS 안에 위치시켰다. IgG를 0.45 μΜ 필터(Sartorius)를 통해 여과하였다. 단백질 A 센서를 구비한 Octet를 이용하여 IgG 농도를 측정하였다. 단백질의 응집(HPSEC), 순도(SDS-PAGE, nMS, IEX와 IEF)를 시험하였다. 단백질 시료를 -80℃에서 보관하였다.
PB4188의 분석 특성
PB4188(MF3958xMF3178)을 HP-SEC와 CIEX-HPLC(TSK 겔-STAT 7 ㎛ 칼럼, 4.6 mm ID x10 cm L)에 의해 분석 처리하였다. PB4188의 분석 프로파일은 일반적으로 친 HER2 아암 PG3958과 항-RSV 단일클론 대조군 항체와 같은 통상적인 단일클론 IgG1의 거동과 일치하였다(도 7).
친화도 측정
재조합 HER2와 HER3에 대한 PB4188과 PB3448의 1가 결합 친화도를 SPR(Biacore T100)에 의해 측정하였다. Biacore™ T100(GE Healthcare, 웁살라, 스웨덴)을 이용하여 기재된 모든 실험을 수행하였다. 25℃에서 센서 표면 제조와 상호작용 분석을 수행하였다. 완충액과 Biacore 시약은 GE Healthcare로부터 구입하였다. ErbB2-Fc와 ERbB3-Fc(RND)를 아세트산 칼륨 완충액(pH 5.5)에서 표적 고정화 수준 500 RU로 CM5 센서 칩의 표면에 코팅하였다. 전개 완충액은 HBS(hepes-완충 식염수): 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% Tween-20; 0.2 ㎛) 여과-멸균하였다. 이중 특이성 항체를 HBS에서 100, 50, 20, 10, 1과 0.1 nM로 희석하고 CM5 센서 칩의 항원 결합 표면상에서 높은 유속(30 ㎕/분)으로 전개시켰다. HER2 아암 친화도(1가 상호작용)의 측정을 가능하게 하는 1:1 1가 상호작용에 대한 곡선 피팅 모델인 BIA 평가 소프트웨어를 이용하여 HER2 아암의 친화도를 측정할 수 있었다. HER3 아암의 낮은 오프 속도(off rate)로 인해 친화도를 측정할 수 없었다. HER3 아암의 친화도를 측정하기 위해서 PB4188을 CM5 센서 칩에 500 RU의 표적 고정화 수준으로 코팅하였다. Her2-Fc와 Her3-Fc 항원을 PBS에 100, 50, 20, 10, 1과 0 nM으로 희석하고 PB4188 표면상에서 높은 유속(40 ㎕/분)으로 전개시켰다. kon와 k0ff 값을 결정하기 위해서 BIA 평가 소프트웨어를 1가 분자가 센서 칩 표면에 코팅되고 ErbB3-Fc 항원이 2가 분자임을 감안한 모델과 함께 이용하였다. PB4188과 PB3448의 친화도를 표 10에 나타내었다.
세포 상에서 PB4188 친화도 측정
또한 BT-474와 SK-BR-3 세포를 이용한 정상 상태 세포 친화도 측정을 통해 결합 친화도를 측정하였다. 다음 4개의 IgG를 분석하였다: 1) 항-HER2 항체 3958과 항-HER3 항체 3178을 함유한 PB4188(이중 특이성 HER2xHER3); 2) 항-HER3 항체 3178과 항-TT(파상풍 톡소이드) 항체 1337을 함유한 PB9215(이중 특이성 HER3xTT); 3) 항-HER2 항체 3958과 항-TT 항체 1337을 함유한 PB9216(이중 특이성 HER2xTT); 4) 헤르셉틴(단일클론 HER2). IgG를 IODO-GEN® Precoated Iodonation Tubes(Pierce)와 관련 지침을 이용하여 125I으로 방사선 표지하였다. 표지된 IgG를 25 mM Tris-HCl, 0.4 M NaCl, 0.25% BSA, 5 mM EDTA, 0.05% NaN3 중 활성도 ~1-2 x 108 cpm/ml까지 희석하였다. BCA 단백질 분석 키트(Pierce)로 단백질 농도를 측정하였다. BT-474와 SK-BR-3 세포를 이용한 표지 및 비표지 IgG의 유세포 분석을 통해 표지 후에 결합이 전혀 감소하지 않거나 미미하게만 감소한 징후를 보였음을 알 수 있었다. 정상 상태 세포 친화도 측정을 다음과 같이 수행하였다. 세포를 96웰 플레이트에 접종하고 4℃에서 다양한 농도의 표지된 IgG와 함께 배양하였다. 4시간 후에 미결합 방사성을 제거하고 감마 우물형 계수기를 이용하여 세포 결합 방사성을 측정하였다. 비표지 항체를 수용체 차단 농도(100배 과량)로 첨가하여 비특이적 결합을 측정하였다. 각각의 조건을 3회 중복 시험하고 항체당 독립적인 실험을 3회 수행하였다. KD 값은 Prism 6.0d(GraphPad Software)를 이용하여 비특이적 결합을 보상하는 비선형 회귀 모델을 토대로 계산하였다. 2개의 세포주에 HER2xHER3 IgG (PB4188)의 결합에 대해 피팅한 곡선을 포함한 그래프를 도 20에 나타내었다. 평균값을 포함한 24개 모든 분석에 대한 KD 데이터가 표 12에 주어져 있다. 요컨대, BT-474와 SK-BR-3 세포를 이용하여 측정하였을 때 평균 KD 값은 각각 HER2xHER3에 대해 3.2와 2.0 nM이었고 헤르셉틴에 대해 각각 3.7과 1.3 nM이었고, HER2xTT에 대해 각각 3.9와 2.3 nM이었고, HER3xTT에 대해 각각 0.23과 0.99 nM이었다. 이에 따라 PB4188는 HER2에 비해 HER3에 대한 더 높은 친화도를 보이는데, 이는 HER3에 비해 더 높은 친화도를 가진 HER2를 표적으로 하는 HER2xHER3 이중 특이성 분자 MM-111과 대조적이다.
HER2 증폭된 유방암 세포 상에서 항증식 활성
연한천에서 JIMT -1
연한천에서 트라스투주맙 내성 JIMT-1의 성장을 저해하는 PB3448과 PB4188의 효능을 시험하였다. 이를 위해 96웰 현탁 세포 배양 플레이트를 준비하였다. 연한천 바닥층 100 μL(완전 배지에서 0.6% 최종 농도)를 붓고 고화되도록 하였다. 다음, 10,000 JIMT-1 세포/웰을 함유한 연한천 상부층 50 μL(0.4% 최종 농도)를 상부에 첨가하여 고화시켰고 이러한 96웰 플레이트를 밤새 37℃ 10% CO2에서 배양하였다. 다음날, 음성 대조군 항체, 페르투주맙 + 트라스투주맙(1:1 v/v), PB3448과 PB4188을 10-0.003 ㎍/ml 범위에서 반대수(semi-log) 적정으로 DMEM 배지에 첨가하였다. 이어서, 분석 시료를 8일간 세포 배양기에서 배양하였다. 마지막으로, 세포를 Alamar Blue와 3-5시간 동안 37℃에서 배양하고 형광 세기를 측정하였다(여기: 560 nm; 발광: 590 nm). PB3448과 PB4188에 의한 JIMT-1 증식의 투여량 의존적 저해의 일례를 도 8에 나타내었다.
마트리겔에서 BT-474와 SKBR -3
BT-474와 SKBR-3 세포의 성장을 저해하는 PB3448과 PB4188의 효능을 시험하였다. 세포를 시험하기 위해서 네덜란드 라이덴 소재 오셀로 사에서 세포를 3차원 마트리겔에서 성장시키고 주성분 분석을 이용하여 처리 세포로부터 미처리 세포를 구별하였다. 384웰 플레이트(Greiner 781091)의 웰당 2000개의 SKBR-3 또는 2250 BT474 세포를 15 ㎕ 마트리겔에 접종하였다. 다음날, 항체 10 내지 0.003 ㎍/ml 범위의 반대수 적정액을 5 ng/ml HRG의 부재 또는 존재 상태에서 배양 배지에 첨가하였다. 시험 항체는 음성 대조군 항체, 페르투주맙 + 트라스투주맙(1:1 v/v), PB3448, PB4188과 이중 특이성 항-EGFRxHER3 투-인-원 항체 MEHD7945A를 포함하였다. 또한 HRG의 투여량-의존 적정을 양성 대조군으로서 포함시켰다. 각각의 투여량을 4회 반복 시험하였다. 세포를 7일 동안 37℃, 5% CO2의 세포 배양기에서 배양하였다. 다음, 세포를 고정하고 세포의 액틴 세포 골격을 팔로이딘으로 염색하고 핵은 훽스트로 염색하였다. 다음, 겔을 통한(Z-스택) 형광 이미지를 서로 다른 높이에서 촬영하고 이미지를 겹쳤다. 광범위한 형태학적 특징들을 측정하였다(총 800개). 배지와 HRG 처리군 사이에 서로 다른 특징들만을 선택하여 분석하였다. 성장, 평균 구상체 면적과 구상체당 핵과 관련한 특징은 배지와 HRG 처리군 사이에서 가장 크게 달랐다. 다중 파라미터와 단일 파라미터 분석 모두 수행하였다. 단일 파라미터 측정을 위해서 t-검정을 수행하여 배지 대비 처리군(HRG 또는 항체)을 비교하였다. 각 지점에서 P 값을 결정하였다. 대부분의 가변성을 담고 있는 고차원 데이터의 저차원 조합을 찾기 위한 방법인 주성분 분석(PCA)을 이용하여 항체 농도 대비 데이터를 그래프로 작성하였다. 도 9는 HRG가 있는 상태에서 페르투주맙 + 트라스투주맙(1:1 v/v), PB3448과 PB4188의 효과를 입증하고 있다. 2개의 HER2 증폭 유방암 세포주 모두에서 PB4188은 HRG가 있는 상태에서 페르투주맙 + 트라스투주맙, PB3448과 투-인-원 항체 MEHD7945A에 비해 우수한 활성을 보였다.
HER2가 증폭된 유방암 세포 상에서 HRG 존재하 PB4188의 우수한 항증식 활성
SKBR-3과 BT-474 상에서 10 ng/ml HRG 존재하 PB4188의 활성을 일단의 HER2, HER3 항체와 이들의 조합체와 비교하였다. 상술한 바와 같이 마트리겔에서 분석을 수행하고 형태학적 특징을 분석하였다. 도 10a에 그래프로 작성한 PCA 데이터는 마트리겔에서 SKBR-3 세포의 HRG 유도 증식과 분지/침윤을 보여주고 있다. 도 10b는 항체 PB4188이 HRG 유도 표현형을 완전히 되돌릴 수 있지만 모 단일클론 항체의 조합(PG3958 + PG3178)은 효과가 없음을 보여주고 있다. 게다가 PB4188은 시험한 모든 항-HER3 항체에 비해 훨씬 더 효과적이었다(도 10c). 또한 트라스투주맙(전이성 유방암(mBC)에서 현재 치료 기준임)과 개별 항-HER3 항체의 조합은 HRG 유도 표현형을 되돌릴 수 없었다(도 10d). HRG가 존재하는 상태에서 PB4188에 트라스투주맙을 첨가하면 PB4188 단독에 비해 SK-BR-3의 증식과 분지/침윤을 감소시켰다(도 10e).
HER2와 HER3 단일클론 항체 대비 HER2 증폭된 위암 세포에서 PB4188의 우수한 항증식 활성
NRGl-β1의 상향 조절은 HER2를 표적으로 하는 치료법에 대한 핵심 내성 기전이다(Wilson, 2012). NRGl-β1의 상향 조절이 PB4188의 항증식 효능을 방해할 것인지 여부를 평가하기 위해서 N87(HER2 증폭된) 위암 세포주에 대해 일단의 항체를 100 ng/ml HRG에서 시험하였다. N87 세포를 10% 열 불활성화 FBS가 첨가된 RPMI 1640에서 배양하였다. 증식 분석을 위해서 완전 밀집되지 않은 N87 세포 배양물을 PBS로 세척하고 트립신화한 후 배양 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화하였다. 세포를 큰 부피의 분석 배지(0.05% BSA와 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린을 함유한 RPMI 1640 배지)에서 2회 세척하였다. 1-0.0001 ㎍/ml의 다양한 항체를 반대수 적정으로 희석하였다. 최종 농도 100 ng/ml HRG가 존재하는 상태에서 세포를 밀도 10000 세포/웰로 첨가하였다. 세포를 3일간 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 배양하였다. Alamar Blue™(Invitrogen)를 제조사 지침에 따라 첨가하고 암소에서 6시간 동안 37℃, 5% CO2, 상대습도 95%에서 배양하였다. 590 nm 발광 파장과 함께 550 nm 여기 파장에서 형광을 측정하였다. PB4188은 항-HER2 또는 항-HER3 단일클론 항체에 비해 우수한 활성을 보였다(도 11).
HER2XHER3 이중 특이성 항체는 ADCC를 유발한다
ADCC 활성은 암에서 치료용 항체에 대한 중요한 항종양 작용 기전이다. 세툭시맙과 트라스투주맙과 같은 HER 계열의 수용체에 지향적인 인간 단일클론 항체는 ADCC를 유도한다. PB4188과 PB3448의 기저선과 증강된 ADCC 활성을 입증된 체외 ADCC 분석법으로 측정하였다. 본 실험에서 트라스투주맙과 음성 대조군 항체를 대조군 항체로서 포함시켰다. 건강한 기증자로부터 전혈과 PBMC 분획물을 얻었다. HER2 고발현(SK-BR-3) 및 HER2 저발현(MCF-7) 표적 세포에 대해 각각의 항체를 시험하였다. 표적 세포에 51Cr(Amersham)을 로딩하고 소정 농도의 항체로 옵소닌화하였다. 전혈 또는 PBMC 분획물을 RPMI 1640 + 10% 열 불활성화 FCS 중 200 μL 반응에서 주효 세포로서 사용하였다. 세포를 함께 4시간 동안 배양하고 γ-신틸레이터를 이용하여 상청액 중 방사선을 측정함으로써 용해를 추정하였다. 특이적 용해의 비율을 다음과 같이 계산하였다: (실험 cpm - 기저 cpm)/(최대 cpm - 기저 cpm) × 100, 이때 최대 용해는 5% Triton X-100이 존재하는 상태에서 측정하였고 기저 용해는 항체와 주효 세포가 없는 상태에서 측정하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 이중 특이성 항체인 PB3448은 페르투주맙 + 트라스투주맙 조합과 유사한 ADCC 활성을 보였다. 이중 특이성 항체 PB4188은 높은 항체 농도(10 ㎍/ml)에서 효과적이었다.
HER2XHER3 이중 특이성 항체는 모 항체의 조합에 비해 더 높은 ADCC를 보인다
또 다른 ADCC 장치에서 ADCC 리포터 생체 분석법(Promega)을 이용하였다. 상기 생체 분석법은 FcγRIIIa 수용체를 안정하게 발현하는 조작된 Jurkat 세포, V158(고친화도) 또는 F158(저친화도) 변이체 및 반딧불이 루시페라아제를 발현하게 하는 NFAT 응답 요소를 이용한다. 상기 분석법은 ADCC 리포터 생체 분석법에 의해 얻은 데이터를 전통적인 51Cr 방출 분석법과 비교하여 입증하였다. 384개의 화이트 웰 플레이트를 이용하는 Promega ADCC 생체분석 키트를 이용하여 ADCC 분석법을 수행하였다. 본 실험 장치에서는 생체 분석법 전 20-24시간 전에 SKBR-3 세포를 30 ㎕ 분석 배지(4%의 낮은 IgG 혈청을 가진 RPMI)에 1000 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 다음날, 배양 배지를 제거하였다. 다음, 항체 PB4188과 이의 모 항-HER2 PG3958과 항-HER3 PG3178뿐 아니라 이의 조합체를 2회 반복하여 연쇄 희석하였다. 10 ㎕ 항체 희석액을 웰에 첨가하였다. 항체의 출발 농도는 10 ㎍/ml이었고 10점 반대수(10 points semi-log) 배수로 연쇄 희석하여 완전한 투여량-응답 곡선을 제공하였다. 마지막으로 5 ㎕의 ADCC 생체 분석 주효 세포(15000 세포/웰, V158)를 첨가하였다. 세포를 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 다음, 15 ㎕ BIO-Glo 루시페라아제 기질을 첨가하고 5분 후에 플레이트 리더로 발광을 검출하였다. 얻어진 데이터를 도 13에 나타내었다. PB4188 이중 특이성 항-HER2xHER3 항체는 모 HER2와 HER3 단일클론 항체 또는 이의 조합체에 비해 더 높은 ADCC 효능을 보였다.
PB4188의 ADCC 증강
서로 다른 기술에 의해 ADCC 활성을 증강될 수 있는바, 이들 중 하나는 푸코오스를 제거하는 것이다. 푸코오스를 제거하였더니 여러 생체내 모델에서 항종양 활성이 증가하였다[Junttila, 2010]. PB4188 활성을 극대화하기 위해서 비푸코실화 기술을 적용하여(Cheng Liu and Andreia Lee. ADCC Enhancement Technologies for Next Generation Therapeutic Antibody. Antibody therapeutics - Trends in Bio/Pharmaceutical Industry 2009 [13-17]) Fc 영역에서 N-결합 탄수화물 구조의 푸코실화를 막았다. 야생형 PB4188 대비 비푸코실화된 PB4188의 ADCC 효능을 HER2 저발현 세포(MCF-7)와 HER2 증폭 세포(SK-BR-3)를 이용한 ADCC 51Cr 방출 분석법으로 결정하였다. 상기 2개의 항체를 연쇄 희석법에 적용하고 상기 분석에 음성 대조군 항체와 트라스투주맙을 포함시켰다. 도 14는 고발현 및 저발현 HER2 세포 모두에서 야생형 변형형태 및/또는 트라스투주맙에 비해 비푸코실화 PB4188의 ADCC 효능이 증가함을 보여주고 있다.
비푸코실화 PB4188은 저친화도 FcγRIII 수용체에 의해 우수한 ADCC활성을 보인다
VI58(고친화도) FcγRIIIa 수용체 변이체 또는 F158(저친화도) FcγRIIIa 수용체 변이체를 함유한 ADCC 리포터 세포에 대해 비푸코실화 PB4188 활성을 시험하였다. 항체, 즉 대조군 항체, 트라스투주맙과 비푸코실화 PB4188의 연쇄 적정을 서로 다른 FcγRIIIa 변이체를 부착성 SK-BR-3 세포에 고착하는 ADCC 리포터 세포와 함께 추가하였다. 루시페라아제 활성을 측정함으로써 ADCC 활성을 측정하였다. 비푸코실화 PB4188은 고친화도 V158 FcγRIIIa 수용체 변이체와 조합한 트라스투주맙 대비 동등한 활성을 보였다. 대조적으로 비푸코실화 PB4188은 저친화도 F158 FcγRIIIa 수용체 변이체와 조합한 트라스투주맙 대비 우수한 ADCC 활성을 나타내었다(도 15).
JIMT -1 이종 이식 연구
JIMT-1 인간 유방 암종 세포를 10% 우태아혈청, 100 단위/mL 페니실린 G 나트륨, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 설페이트, 25 ㎍/mL 겐타마이신과 2 mM 글루타민을 함유한 DMEM에서 이식시까지 성장시켰다. 이식 당일, JIMT-1 유방 세포를 대수 성장기 중에 수거하여 저온 PBS에 다시 현탁시켰다. 자성 CB.17 SCID 마우스(Charles River)는 연구 1일째에 8주령이었고 16.5 내지 20.7g의 체중 범위를 가졌다. 마우스 각각의 우측 옆구리에 5x106개의 종양 세포(0.2 mL 세포 현탁액)를 피하주사하였다. 캘리퍼스로 종양을 2차원으로 측정하여 주당 2회 평균 체적으로서 크기를 모니터링하였다. 종양 크기가 약 100-150 mm3에 이르면 동물을 효능 연구에 등록하였다. -종양 체적을 기준으로- 기준외 동물들은 빼고 마우스를 군당 10마리씩 무작위로 배분하였다. 4주 기간 동안 매주(항체) 또는 매일(라파티닙) 1회 마우스에 주사하였다. 처리군에 대한 상세한 내용을 표 11에 나타내었다.
종양 크기는 매주 캘리퍼스 측정에 의해 측정하였다. 효능 연구를 통해 PB4188이 2개의 투여 스케줄에서 동등하게 효과적이고 라파티닙 또는 페르투주맙과 트라스투주맙 조합체보다 더 강력하였음을 알 수 있었다. 데이터를 도 17과 18에 나타내었다.
PB4188은 HRG 매개 내성을 극복할 수 있다
NRGl-β1의 상향 조절은 HER2를 표적으로 하는 치료법에 대한 핵심 내성 기전이다(Wilson, 2012). PB4188을 그의 모 항-HER3 단일클론 항체 PG3178과 비교하여 HRG(NRGl-β1 EGF)의 농도를 증가시키면서 연쇄 적정으로 시험하였다. 이를 위해 N87 세포를 10% 열 불활성화 FBS가 첨가된 RPMI 1640에서 배양하였다. 증식 분석을 위해서 완전 밀집되지 않은 N87 세포 배양물을 PBS로 세척하고 트립신화한 후 배양 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화하였다. 세포를 큰 부피의 분석 배지(0.05% BSA와 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린를 함유한 RPMI 1640 배지)에서 2회 세척하였다. 1 내지 0.0001 ㎍/ml 범위의 항체를 반대수 적정으로 희석하였다. HRG의 농도를 증가시키면서(0.04-39.5 nM) 세포를 10000 세포/웰의 밀도로 첨가하였다. 상기 세포를 3일 동안 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 배양하였다. Alamar Blue™ (Invitrogen)를 제조사 지침에 따라 첨가하고 암소에서 6시간 동안 37℃, 5% CO2, 상대습도 95%에서 배양하였다. 590 nm 발광 파장과 함께 550 nm 여기 파장에서 형광을 측정하였다. PB4188은 모 항-HER3 단일클론 항체 대비 우수한 활성을 보였다(도 11). 따라서 예를 들면 NRGl-β1의 상향 조절과 같은 회피 기전의 경우에 본 발명에 따른 이중 특이성 항체가 바람직하다.
HER2 / HER3 특이적 IgG의 에피토프 매핑
샷건(Shotgun) 변이생성 실험
알라닌 스캐닝 변이생성을 이용하여 HER2과 HER3에 대해 각각 PG3958과 PG3178의 에피토프를 매핑하였다. 샷건 변이생성 분석에서는 HER2 HER3 세포외 도메인(ECD)의 아미노산 잔기가 각각 알라닌에 대해 치환되어 있는 클론을 발생시킨다. 다음, 리버스 형질주입에 의해 세포 어레이를 준비하였다(특허 US2011/0077163A1). 이후, 클론 각각의 DNA를 리포펙타민과 혼합하고 이 혼합물을 384 웰 플레이트의 전용 웰에 넣었다. HEK293T 세포를 각각의 웰에 첨가하고 24시간 후에 단백질의 발현을 측정하였다. 이어서, 항체의 반응성을 면역형광 염색에 의해 측정하여 맵을 결합시키고 항체 결합을 위한 핵심 잔기를 동정하였다. HER2와 HER3 ECD 구성체의 발현량을 시판 단일클론 항체(R&D mAb 1129(HER2)와 R&D mAb 66223(HER3))를 사용하는 FACS 분석에 의해 확인하였다.
HER2
본 분석에서는 HER2ECD 변이체에 1가 PG3958 Fab의 결합을 0.25 ㎍/ml의 농도에서 시험하였고 엄격한 세척 조건을 이용하였다(pH 9.0, 350 mM NaCl). 그 결과, 대조군 mAb 결합을 유지하면서 WT HER2에 비해 35% 미만의 PG3958 Fab의 잔류 결합을 보인 HER2 내 3개의 '핵심' 잔기(T144, R166, R181)를 동정하였다.
HER2 구조 내 핵심 잔기 가까이 위치해 있는 2개의 잔기(P172, G179)는 결합 손실이 의미는 있지만 그다지 심각하지 않았고 '2차 핵심' 잔기로 지정하였다(표 13과 도 21A). 이들 모든 표면 노출된 잔기는 ErbB-2의 도메인 I에 위치해 있고 이들은 함께 HER2 분자 표면에 불연속 패치를 형성한다.
HER2 에피토프의 확인 실험
표 13에 나열한 야생형(WT) HER2ECD와 HER2 ECD 변이체를 코딩하는 구성체를 CHO-K1 세포에서 발현시켰다. 추가 분석을 위해 표면 노출되어 있고 결정된 핵심 잔기에 구조적으로 가까이에 있는 3개의 도메인 I 잔기를 선택하였다. HER2 ECD 구성체에서는 T164, S180과 D143이 티로신으로 점 변이되었고 그 결과 얻어진 구성체 또한 CHO-K1에서 발현되었다. L159A HER2 ECD 변이체는 대조군 시료로서 CHO-K1 세포에서 발현되었다.
ECD 변이체에 대한 이중 특이성 PG3958xTT 항체의 결합을 FACS 적정 실험으로 시험하였다. HER2의 도메인 IV에 결합하는 항-HER2 항체인 트라스투주맙을 사용하여 세포 표면에서 HER2 ECD 발현을 확인하였다. 평균 MFI 값을 그래프로 작성하고 각각의 곡선에 대해 AUC를 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. WT HER2 결합을 이용하여 데이터를 정규화하였다. FACS 데이터를 통해 T144A, R166A, R181A, P172A, G179A 이외에 변이체 T164Y와 S180Y에 의해 PG3958xTT 항체의 결합이 크게 감소하였음을 알 수 있었다(도 22). D143Y 변이는 대조군 mAb의 결합 감소에 의해 입증된 바와 같이 심각한 발현 손실을 초래하여 PG3958 에피토프에서 그의 잠재적인 역할을 결정할 수 없었다.
HER3
FACS로 HER3 ECD 변이체에 대한 PG3178 IgG의 결합을 0.25 ㎍/ml에서 분석한 결과 2개의 소위 '핵심' 잔기(F409, R426)가 동정되었는데, 이 경우 알라닌으로 변이가 일어나 WT HER3에 비해 실질적인 결합 손실을 초래한 반면에 대조군 mAb의 결합은 유지되었다(표 14와 도 23). 상기 2개의 잔기는 HER3의 도메인 III에 공간적으로 떨어져 위치해 있다. 게다가 F409는 HER3 소수성 코어(core)에 매립되어 있어 PG3178 에피토프의 일부가 될 수 없게 한다.
HER3 에피토프의 확인 실험
CHO-K1 세포를 HER3 ECD 변이 구성체(표 14에 열거됨), WT HER3 ECD와 2개의 대조군 구성체(H407A와 Y424A)로 형질주입하였다. HER3 ECD 변이체에 대한 PG3178 결합을 FACS 적정 실험으로 시험하였다. 2개의 대조군 항체, 결합 도메인 I(MM-121)과 HER3의 도메인 III(MEHD7945A)을 포함시켜 세포 표면에서 HER3 ECD 발현을 확인하였다. 평균 MFI 값을 그래프로 작성하고 각각의 곡선에 대한 AUC를 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. WT HER3 결합을 이용하여 데이터를 정규화하였다. R426A 변이는 PG3178 결합에 대해 핵심인 것으로 밝혀진 반면에 F409A에 대한 결합은 세포 표면 발현의 손실로 인해 확인할 수 없었다(도 24).
심근 세포에 대한 PB4188 체외 활성
HER2는 헤레귤린 수용체 복합체 HER2:HER4를 포함하는 신호전달망의 일부로서 성인 심근 세포의 성장, 복구와 생존에 관여한다. 심장 독성은 HER2 표적화에 있어서 공지의 위험 인자이고 트라스투주맙을 안트라사이클린과 조합하여 사용할 때 합병증 빈도가 증가하여 심장 스트레스를 야기한다. 인간 줄기세포 유도 심근 세포를 기반으로 하는 모델 시스템을 이용하여 PB4188의 잠재적 독성을 시험하고 이를 트라사이클린 독소루비신이 존재하는 상태에서 트라스투주맙 및 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합체에 대한 기준으로 하였다. 인간 줄기세포 유도 심근 세포(Pluriomics BV)를 20,000웰의 농도로 백색의 바닥이 평평한 분석 플레이트(corning 655098)에 접종하였다. 배양 5일째에 배지를 l0 ng/ml HRG이 첨가된 글루코오스와 갈락토오스가 없는 배양 배지로 대체하였다. 7일째에 시험 항체를 독소루비신(3 μΜ)과 함께 첨가하였다. 9일째에 세포 생존율을 Promega Cell titer Glo 분석법을 이용하여 분석하였다. 단일클론 항체는 단일 농도 68 nM로 시험한 반면에 PB4188는 3 μΜ 독소루비신이 존재하는 상태에서 3개의 농도로 시험하였다. 도 25는 시험한 모든 PB4188 농도에 의해 심근 세포의 생존율이 영향을 받지 않았음을 보여주고 있다. 이에 비해 트라스투주맙 및 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합체는 모두 심근 세포의 세포 생존율을 감소시켰다.
서로 다른 HER2 수준을 가진 세포에 대한 PB4188 결합
트라스투주맙과 HER3 항체 Ul-59 대비 PB4188의 결합을 서로 다른 양의 HER2를 발현하는 유방암과 위암 세포주에서 FACS에 의해 분석하였다. 세포가 수백만 HER2 카피를 발현하고/또는 증폭된 HER2 유전자인 경우에는 HER2+++로 간주하였다. 다음과 같은 세포주를 사용하였다: MCF-7(HER 2+); MDA-MB-468(HER2+, MKN-45(HER2+), MDA-MB-175(HER2+), MDA-MB-453(HER2++), MDA-MB-361(HER2++), ZR-75-l(HER2++), JIMT-1(HER2+++), BT-474(HER2+++), SKBR-3(HER2+++), SK-OV-3(HER2+++), N87(HER2+++). 기하급수적으로 성장한 배양물의 세포를 트립신에 의해 수거하고 FACS 완충액(PBS/0.5%BSA/0.5mM EDTA)에 106 세포/ml로 희석하였다. 1-2 x 105개의 세포를 바닥이 U자형인 96웰 플레이트 내 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 4℃에서 300 g으로 2분 동안 원심분리하였다. 플레이트(들)를 뒤집어 상청액을 버린 후 1회 털어냈다. 각각의 IgG 시료 50 ㎕를 3.16 ng으로부터 10 ㎍/ml까지 연쇄 희석으로 첨가하였고 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 1회 원심분리하였고, 상청액을 제거하였으며, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 50 ㎕의 희석 1:100 마우스 항 인간 IgG 감마 PE(Invitrogen)를 첨가하고 암소에서 30-60분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 세포를 1회 원심분리하였고, 상청액을 제거하였으며, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 HIS 세팅에서 FACSCanto 유세포 분석기로 분석하였다. 항체의 결합량을 중앙 형광에 의해 평가하였다. 데이터를 그래프로 작성하고 시험 세포주당 각각의 항체에 대해 곡선 아래의 면적(AUC, 중앙 형광 세기의 누적 측정량)을 측정하였다.
본 실험으로부터 PB4188이 트라스투주맙에 비해 HER2+++ 세포, HER++ 세포와 HER+ 세포에 대한 더 높은 결합 친화도를 갖고 있다는 결론이 얻어졌다.
트라스투주맙과 동시 결합
PB4188와 트라스투주맙은 HER2에 대한 결합을 위해 경쟁하지 않는다.
PB4188은 HER2 단백질의 도메인 I에 결합하는 반면에 트라스투주맙의 결합 에피토프는 도메인 IV에 국재화된다. 2개의 항체가 HER2 결합을 위해 경쟁하지 않는다는 것을 입증하기 위해서 HER2가 증폭된 SKBR-3 유방 세포를 이용한 결합 분석을 수행하였다. 먼저, 미표지 항체를 SKBR-3과 포화농도에서 결합하도록 하였다. 다음, FITC-표지 PB4188을 적정 범위에서 첨가하고 FACS에 의해 형광을 측정하였다. 도 27은 PB4188FITC가 트라스투주맙 또는 음성 대조군이 존재하는 상태에서 세포에 효과적으로 결합되었음을 입증하고 있다. PB4188과 함께 SKBR-3 세포를 전배양하였더니 PB4188FITC가 결합하지 못하였다. 따라서 트라스투주맙과 PB4188은 HER2에 대한 결합을 위해 경쟁하지 않는다.
HER2xHER3 이중 특이성 분자에 의한 HER2의 도메인 I 표적화는 헤레귤린 내성을 극복할 수 있다.
HER2xHER3 다이머 상에서 PB4188의 배향이 HRG 스트레스 조건에서 세포 증식을 저해하기 위해 바람직한 것인지 시험하기 위해서 도메인 I, II, III 또는 IV를 표적으로 하는 3178 HER3 아암과 HER2 아암으로 구성된 이중 특이성 항체를 만들었다. HER2 도메인 I-IV 각각에 대해 2개의 HER2xHER3 이중 특이성 항체를 만들었다. 상기 HER2 아암은: 도메인 I를 표적으로 하는 MF3958과 MF3003; 도메인 II를 표적으로 하는 MF2889와 MF2913; 도메인 III을 표적으로 하는 MF1847과 MF3001 및 도메인 IV를 표적으로 하는 MF1849와 MF1898을 포함하였다. 각각의 HER2 Fab 아암을 3178 HER3 Fab 아암과 조합하여 고농도의 헤레귤린이 존재하는 상태에서 이들의 세포 증식능에 대해 시험하였다. HER2를 저발현하는 MCF-7 세포와 HER2를 과발현하는 N87과 SK-BR-3 세포에 대해 항체 적정을 수행하였다. N87, SK-BR-3과 MCF-7 세포의 완전 밀집되지 않은 세포 배양물을 PBS로 세척하고 트립신화한 후 배양 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화하였다. 세포를 큰 부피의 분석 배지(0.05% BSA와 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린을 함유한 RPMI 1640 배지)에서 2회 세척하였다. 항체를 반대수 적정으로 희석하였다. 실험적으로 정의한 스트레스 농도의 HRG(10 nM SK-BR-3, 100 nM N87과 MCF-7)가 존재하는 상태에서 10000 세포/웰(N87, SKB-BR-3)과 5000 세포/웰 MCF-7의 밀도로 세포를 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 3-4일 동안 배양하였다. Alamar BlueTM(Invitrogen)을 첨가하여 증식을 평가하였다. 흡광도는 590 nm 발광 파장과 함께 550 nm 여기 파장에서 측정하였다. 모든 시험한 분석 시료에서, HER2의 도메인 I을 표적으로 하는 이중 특이성 항체만이 고농도의 헤레귤린이 존재하는 상태에서 증식을 저해할 수 있었다(도 28).
PB4188과 체외 약물 조합
소분자 약물과 PB4188의 조합 가능성을 조사하기 위해서 PB4188를 PI3K 또는 MAPK 경로의 서로 다른 수준에서 방해하는 약물과 조합하였다. 또한 화학치료약물과 사이클린 저해제와의 조합을 시험하였다. 조합물을 마트리겔 중 HRG가 존재하는 상태(SK-BR-3과 BT-474) 또는 HRG가 스트레스 농도로 존재하는 상태(증식 분석에서 기재한 N87과 SK-BR-3)에서 성장하는 HER2 과발현 세포에 대해 시험하였다. 약물 조합의 저해 효과는 본 명세서에서 전술한 바와 같이 영상화 또는 Alamar Blue를 이용한 증식 측정에 의해 시험하였다. 먼저, EC20 PB4188과 시험 약물을 결정하였다. 다음, PB4188과 약물을 이용하여 체커보드 적정(checkerboard titration)을 수행하였다. 티로신 키나아제 저해제(아파티닙, 라파티닙, 네라티닙), PI3Ka 저해제 BYL719, Akt 저해제 MK-2206, mTOR 저해제 에베로리무스, Src 저해제 사라카티닙, 미세소관 분열 약물 파클리탁셀과 HDAC 저해제 보리노스타트(도 40에는 "voronistat"로 잘못 표기되어 있음)로 시험한 모든 세포주에서 상승효과가 관찰되었다. 도 29는 마트리겔에서 성장한 SKBR-3 세포에서 상승효과가 있는 라파티닙과 PB4188의 조합물로서 형태 변화와 세포 성장 감소가 나타나는 일례를 보여주고 있다. 각 조합물에 의해 얻은 성장 저해도를 계산하였다. 효능 변화는 조합물에서 원하는 수준을 달성하기 위한 약물이 상기 효과에 도달하기 위해 필요한 단일 물질에 비해 얼마나 적게 필요한지를 보여주는 아이소볼로그램을 이용하여 나타낼 수 있다(Greco et al 1995). CHALICE™ 분석기 소프트웨어는 상기 조합 실험의 저해값을 이용하여 아이소볼로그램을 만들었다. HER2 증폭된 세포에 대한 서로 다른 약물 조합물의 아이소볼로그램을 도 40에 나타내었다. 아이소볼로그램 분석을 통해 PB4188은 아파티닙, 라파티닙, 네라티닙, BYL719, MK-2206, 에베로리무스, 사라카티닙, 보리노스타트와 파클리탁셀과의 상승효과가 있는 약물 조합을 나타내었음을 알 수 있었다.
이들 데이터는 PI3K 경로에 작용하는 약물이 PB4188과 조합시 특히 유효함을 입증하고 있다. 또한 티로신 키나아제 저해제와의 조합이 효과적이다. 게다가 성장 및 이동/침윤 약물인 사라카티닙과의 조합이 전이성 세팅에서 바람직할 수 있다.
PB4188의 체외 인산화 저해
기하급수적으로 성장한 배양물의 세포를 수거하고 기아 배지(N87 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트란스페린; SKBR-3 세포: DMEM/F-12, 2 mM L-글루타민, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린) 내 6웰 플레이트에 접종하고(N87의 경우 3.75x106개의 세포, SKBR-3의 경우에 1.5xl06개의 세포) 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 밤새 배양하였다. 다음날, 항체를 최종 농도 5 nM로 첨가하고 세포를 1시간 동안 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 배양하였다. 다음, HRG를 최종 농도 100 ng/ml로 첨가하였다. 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 1, 3, 6 또는 24시간 후에 플레이트를 얼음 위에 놓고 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 이어서 0.3 ml 빙냉 용해 완충액을 첨가하고(Cell signaling RTK # 9803 또는 IC # 7018) 얼음 위에서 최소 30분 동안 세포를 용해시켰다. 다음, BCA(Pierce #23235)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 용해 완충액으로 단백질 농도를 2 mg/ml로 조정하였다. 다음, 용해물을 PathScan RTK 신호전달 항체 어레이(Cell signaling #7949) 또는 PathScan 세포내 신호전달 항체 어레이에 도포하였다. 모든 배양을 상온의 오비탈 진탕기 상에서 밀봉 웰을 이용하여 수행하였다. 용해물(75 ㎕)을 프로테아제 저해제 칵테일이 첨가된 75 ㎕ 어레이 희석 완충액으로 0.8 mg/ml 농도까지 2배 희석하고 얼음 위에 두었다. 어레이 웰을 15분 동안 100 ㎕ 어레이 차단 완충액으로 차단하였다. 차단 완충액을 제거하고 용해액을 웰에 도포하여 2시간 동안 배양하였다. 용해액을 감압 여과하고 웰을 100 ㎕ 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 다음, 웰당 100 ㎕ 검출 항체 칵테일을 첨가하고 1시간 배양하였다.
항체 칵테일을 감압 여과하고 웰을 100 ㎕ 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 75 ㎕ Dylight80™ 스트렙타비딘을 각 웰에 첨가하였다. Dylight80™ 스트렙타비딘을 감압 여과하고 웰을 100 ㎕ 세척 완충액으로 4회 세척하였다. 멀티-가스켓을 제거하고 슬라이드를 10 ml 탈이온수에서 10초 동안 세척하였다. 슬라이드를 건조시키고 Odysee®Clx 상에서 영상화를 위해 처리하였다. Image Studio 소프트웨어를 이용하여 스팟 형광 세기를 계산하였다.
N87과 SKBR-3에서, PB4188은 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합과 달리 배양 첫 6시간 동안 AKT 인산화를 완전 차단한다. 또한 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합과 달리 ERK와 S6 인산화의 강력한 저해가 관찰된다. PB4188은 HER2의 인산화를 저해하지는 않는다(도 30).
웨스턴 블롯 분석
RTK와 세포내 Pathscan 어레이에서 관찰된 인산화 저해를 확인하기 위해서 PB4188, 페르투주맙과 트라스투주맙 조합물 및 대조군 항체로 처리한 세포에 대해 HRG가 스트레스 농도로 존재하는 상태에서 웨스턴 블롯을 수행하였다. 기하급수적으로 성장한 배양물의 세포를 수거하고 기아 배지(N87 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트란스페린; SKBR-3 세포: DMEM/F-12, 2 mM L-글루타민, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린) 내 10 cm 디시에 접종하였다(N87의 경우 20x106개의 세포, SKBR-3의 경우에 7xl06개의 세포). 다음날, 항체를 최종 농도 5 nM로 첨가하고 세포를 1시간 동안 배양하였다. 다음, HRG를 최종 농도 100 ng/ml로 첨가하였다. 1, 3, 6 또는 24시간 후에 디시를 얼음 위에 놓았고 세포를 차가운 PBS로 2회 세척였으며, 에펜도르프 관으로 옮겨 250 ㎕의 RIPA 용해 완충액(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% 데옥시콜산 나트륨, 0.1% SDS, 2.5 mM 피로인산 나트륨, 1 mM 베타-글리세로포스페이트, 1 mM Na3V04, 1 ㎍/ml 류펩틴)으로 용해하였다. 용해는 얼음 위에서 30분 동안 진행하였다. 세포 용해물을 원심분리하고 상청액은 새로운 에펜도르프관에 회수하였다. BCA법(Pierce)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 4-12% Bis-Tris NuPage 겔(Invitrogen) 상에서 30 ㎍의 용해물을 분리하고 겔상의 단백질을 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다. 막을 5% BSA 함유 TBS-T로 1시간 동안 차단하고 제조사 지침에 따라(Cell Signaling Technology) 소정의 항체로 염색하였다. 다음, 막을 HRP-접합 이차 항체와 함께 배양하였고, ECL 기질과 함께 배양하였으며, X선 필름(Amersham)을 이용하여 방사능 사진을 촬영하였다. 모든 검출 항체는 Cell Signaling Technology로부터 구입하였다: Phospho-Akt(ser 473) #4060, Total Akt #4691, Phospho-HER2(Tyr 1221/1222) #2243, Total HER2 #2242, Phospho-HER3(Tyr 1289) #4791, Total HER3 #4754, Phospho-ERKl/2(Thr 202/Tyr 204) #4377, Total ERK1/2 #4695, Phospho-S6 RP(Ser 235/236) #2211, Total S6 RP #2217, Goat anti-rabbit HRP-linked #7074. 그 결과, PB4188이 HER3 인산화의 장시간 저해를 나타내 AKT 인산화 저해에 대한 엄청난 효과와 함께 MAPK와 PI3 키나아제 경로 모두를 저해한다는 것을 알 수 있다(도 31).
PB4188 생체내 약역학
루미넥스에 의한 인단백질 분석
PB4188의 2 투여량과 PB4188의 4 투여량으로 처리한 JIMT-1 이식 마우스의 종양(100 mm3)을 투여 24시간 후에 제거하였다. 종양을 급속 냉동하고 분말 처리하였다. 동결 분말 시료에 차가운 BioRad 용해 완충액(0.4% BioRad Factor 1, 0.2% BioRad Factor 2와 2 mM PMSF이 첨가된)을 이용하여 50 mg 종양/mL의 농도로 종양 용해액을 준비하고, 로커 상에서 60분 동안 4℃에서 배양하여 완전 용해시켰다. 시료를 10분 동안 4℃에서 16000 x g로 원심분리하고 분획하였다. Biorad DC 단백질 분석 시약을 제조사 지침에 따라 이용하여 총 단백질을 측정하였다. 루미넥스 분석: Millipore사의 시판 루미넥스 키트(Cat # 48-618MAG(Lot No. 2532050), 46-645MAG(Lot No. 46645M-1K)를 이용한 Total AKT AKT(Ser473) 및 AKT(Thr308)를 위해 JIMT-1 종양 용해물 시료를 처리 및 분석하였다. 각 시료를 2회 반복 시험하였다. 총 분석물과 인산화된 분석물 모두를 측정하기 위해서 시료 희석제로 희석액을 제조하여 웰당 약 25 ㎍ 단백질의 표적을 로딩하였다. Millipore 키트는 제조사 규정에 따라 이용하였다.
PB4188로 처리한 종양은 미처리 종양에 비해 Akt 발현 증가를 보였다. AKT의 인산화는 매주 2회 투여 후와 매주 4회 투여 후 모두 PB4188에 의해 완전하게 저해되었다(도 32).
VeraTag 분석법에 의한 인산화 분석
PB4188의 1 또는 2 투여량으로 처리한 JIMT-1 이식 마우스의 종양(100 mm3 또는 400 mm3)을 제거하고 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하였다. PB4188의 단일 투여(25 mg/kg)한지 24시간 후에 100 mm3 종양을 가진 마우스를 희생시킨 반면에 400 mm3 종양을 가진 마우스에는 25 mg/kg을 매주 2회 투여하였고 투여 4시간 후에 희생시켰다. 다음, 시료를 파라핀으로 포매하였다.
7 ㎛ 두께의 절편을 마이크로톰(LEICA)으로 얇게 잘라 양전하를 띠고 일련 번호가 표지된 유리 슬라이드(VWR) 위에 놓았다. 슬라이드를 30분 동안 공기 건조한 다음 60℃로 설정한 가열된 오븐에서 베이킹하였다. 다음, 시료를 다른 VeraTag 분석: 미국특허출원번호 12/340,436에 따른 총 HER2 분석(HT2), 미국특허번호 8,349,574; 미국특허출원번호 2013/0071859에 따른 총 HER3 분석(H3T), 최종적으로 국제특허출원번호 PCT/US2014/033208에 따른 HER2-HER3 헤테로다이머(H23D), HER3pY1289(H3pY1289)와 HER3-PI3 키나아제(H3PI3K) 분석을 처리하였다. 미처리 대조군에 비해 상기 2가지 투여 방법 모두에서 HER2:HER3 다이머의 유의미한 PB4188 매개 감소가 명백해졌다. PB4188 처리 종양과 대조군 사이에서 총 HER2, HER3 또는 인산화 HER3의 차이는 관찰되지 않았다. PB4188 투여 4시간 후에 분석한 종양은 미처리 대조군에 비해 유의미한 HER3-p85(PI3K) 감소를 보였다.
PB4188은 HRG -자극 암세포에서 세포 주기 진행을 감소시킨다
HER2의 다양한 양의 단백질을 발현하는 암 세포주에서 세포 주기 진행에 대한 PB4188의 영향력을 조사하였다. HER2+(MCF-7), HER2+++(JIMT-1, SK-BR-3과 N87 세포) 세포를 분석 배지(MCF-7 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린, 1 mM 피루브산 나트륨, MEM NEAA; JIMT-1: DMEM, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린; SK-BR-3 세포: DMEM/F-12, 2 mM L-글루타민, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린; N87 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린)에 접종하였다. 24웰 플레이트의 웰당 300,000개의 MCF-7 또는 400,000개의 N87 또는 150,000개의 SK-BR-3 또는 150,000개의 JIMT-1 세포를 1 ml 분석 배지에 접종하고 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 밤새 배양하였다. 다음날, PB4188 또는 페르투주맙 + 트라스투주맙 또는 PG3178 또는 PG1337을 HRG가 최종 농도 1 또는 100 ng/ml로 존재하는 상태에서 세포에 첨가하였다. 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 24시간(JIMT-1, N87 또는 SK-BR-3 세포의 경우) 또는 48시간(MCF-7 세포의 경우) 배양한 후, 수거 및 제조사 지침(LifeTechnologies, cat.no. C10425)에 따른 Click-iT EdU AlexaFluor488 키트를 이용하여 EdU 혼입을 위한 염색 전 2시간 동안 EdU(10 μΜ 최종 농도)를 세포에 첨가하였다. FACSCanto를 이용한 유세포 분석법에 의해 세포를 분석하기 적어도 30분 전에 세포를 200 nM FxCycle 원적색 염료(LifeTechnologies, cat. no. F10348)와 100 ㎍/ml RNAse A(LifeTechnologies, cat.no. 12091-039)와 함께 배양하였다. AlexFluor488 채널(EdU 검출의 경우)과 APC 채널(FxCycle 염료로 총 DNA 염색의 경우)에서 사례(event)를 획득하였다. FSC-폭 대 FSC-높이 산포도에서 단일 세포를 게이팅(gating)하고 APC 대 AlexaFluor488 산포도에서 세포 주기의 G0/G1, S와 G2M 단계를 각각 EdUnegAPClow, EdUPpos와 EdUnegAPChigh 모집단(population)으로서 서브게이팅(subgating)하여 데이터를 분석하였다.
데이터를 S와 G2/M 단계에 있는 세포의 비율을 G0/G1 단계에 있는 세포의 비율로 나눠 계산한 증식 지수로서 나타내었다. 도 34는 PB4188이 PG3178 또는 페르투주맙 + 트라스투주맙보다 HRG의 표준농도(1 ng/ml) 또는 고농도(100 ng/ml)에 의해 유도된 증식 저해에 있어서 일관적으로 더 강력함을 보여주고 있다. 고농도의 HRG에서 PB4188은 여전히 세포 주기 진행을 저해한다.
PB4188은 수용체 내재화를 유도한다
항체의 내재화 패턴을 pH 감응 염료를 이용하여 측정하였다. 이는 종래기술인 WO2013134686 Al에서 이러한 염료가 항체에 결합할 때 낮은 pH에 노출시 형광신호 증가를 나타내는 것으로 기재되었다. 이는 염료에 결합된 항체가 표적 세포의 표면으로부터 약산성인 엔도솜(pH 6-6.5)과 산성인 리소좀(pH 5.5 미만)으로 내재화될 때 일어난다. PB4188이 암세포에 내재화되는지 조사하기 위해서 항체를 석시니미딜 에스테르 반응기를 가진 pH 센서 염료(Promega, cat.no. CS1783A01)에 제조사 지침에 따라 결합시켰다. 비교 항체로서 항-HER2(트라스투주맙, 페르투주맙, PG3958), 항-HER3(PG3178, #Ab6)과 음성 대조군(항-파상풍 독소, PG1337) 염료가 표지된 항체를 포함시켰다. 기하급수적으로 성장한 배양물의 HER2-과발현 SKBR-3과 N87 암세포를 수거하였고 1 ng/ml HRG를 함유한 100 ㎕ 분석 배지(N87 세포: RPMI-1640, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린; SKBR-3 세포: DMEM/F-12, 2 mM L-글루타민, 0.05% BSA, 10 ㎍/ml 홀로트랜스페린) 내 96웰 플레이트에 접종하였고(웰당 15xl03개의 세포) 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 밤새 배양하였다. 다음날, 20 ㎕ pH-감응 세포-표지 항체를 최종 농도 100 nM에 이르도록 첨가하고 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 상대습도에서 밤새 배양하였다. 다음날, 비부착성 세포를 회수하고 부착성 세포를 트립신화하여 세포를 수거하였다. 세포를 FACS 완충액(PBS 0.5% BSA 0.1% 아지드화 나트륨)으로 세척한 후, 세포를 APC-표지 항-인간 IgG(Jackson Immunoresearch, cat.no. 109-136-098, 1:100 희석)로 염색하였다. PE와 APC 채널의 중앙 형광 세기(MFI)를 측정하는 FACSCanto(BD Biosciences)를 이용하는 유세포 분석법에 의해 세포를 분석하여 각각 항체의 내재화와 잔류 표면 결합을 결정하였다. 도 35에 나타낸 데이터는 PB4188이 트라스투주맙과 동일한 정도로 내재화하는 반면에 트라스투주맙 + 페르투주맙 조합물은 내재화가 증진됨을 보여주고 있다. 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합은 트라스투주맙 단독에 비해 ADCC를 감소시킨다(도 36). 따라서 ADCC 효능은 PB4188 내재화 수준에 의해 영향을 받지 않는 것으로 예상된다.
항- HER3 항체 3178 변이체의 생성 및 특성규명
항체 특성을 향상시킬 목적으로 항-HER3 항체 MF3178의 변이체를 디자인하였다. VH 유전자 구조형성(framework) 영역 1(FR1), 상보성 결정 영역 1(CDR1), FR2, CDR2 및/또는 FR3에 변이를 도입하였지만 CDR3과 FR4는 변형하지 않았다. 이 디자인에는 (예를 들면 탈아미드화 모티프 NS를 NQ로 변화시킴으로써) 번역후 변형(PTM) 모티프를 제거하거나 (예를 들면 I를 T로 변화시킴으로써) 표면 소수성을 감소시키거나 (예를 들면 Q를 K로 변화시킴으로써) 등전점(pi)을 증가시키기 위해 도입한 변이들을 포함시켰지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 20개의 변이체 모두(도 37 참고)를 파상풍 톡소이드(TT) 아암과 조합한 이중 특이성 항체로서 표시하였고 MCF-7 기능 분석법으로 시험하였으며 이러한 포맷으로 20개의 변이체는 모두 MF3178 항체와 유사한 효능을 가졌다. 또한 이러한 포맷으로 20개의 변이체 모두를 MCF-7에 결합을 위한 FACS 적정으로 시험하였고 모든 변이체들은 이들의 친화도가 유사함을 시사하는 매우 유사한 결합 프로파일을 가졌다. 추가 실험을 위해 각각 10개, 3개, 7개의 아미노산 변이를 함유하고 있는 3개의 대표 변이체 MF6058, MF6061과 MF6065를 선택하였다(도 16E와 도 37의 서열 참조). 해당 단일 특이성 IgGl PG6058, PG6061과 PG6065를 대규모로 생산 및 정제하였다. 도 38에 나타낸 바와 같이 HRG-의존 N87 세포주 증식 분석법에서 상기 3개의 변이체의 저해 활성은 PG3178과 유사하다. 상기 3개의 변이체의 CIEX-HPLC 프로파일은 도 39에 나타낸 바와 같이 전하 불균질성뿐 아니라 피크 폭과 대칭성과 관련하여 PG3178과 유사하였다. 주 피크의 유지시간(tR)은 거의 항체의 pI와 상관관계가 있는바, 즉 pI가 높을수록 유지시간은 더 길어졌다. 이중 특이성 항체 또는 항체의 혼합물을 디자인할 때 최적의 tR을 가진 항체 변이체를 선택하는 것은 CIES를 이용한 원하는 항체 성분의 정제를 용이하게 할 수 있으므로 유용하다.
FACS에 의해 측정한 서로 다른 면역화 마우스 집단의 혈청 역가 . D = 항체 역가 측정일. 표 1: HER2에 대한 응답. 표 2: HER3에 대한 응답. 사용 세포주가 제시되어 있다(MCF7, SKBR3, BT474). 같은 열에 있는 마우스는 서로 다르다.
표 1, 항- HER2 응답
Figure pct00001
표 2, 항- HER3 응답
Figure pct00002
표 3
치킨-인간-HER2 키메라와의 반응성과 마우스 HER2에 대한 반응성에 따른 HER2 항체의 비닝. '숫자'는 각 군에서 고유 항체의 수를 의미한다.
Figure pct00003
표 4
IgG와 파아지 항체를 이용한 경쟁 ELISA. 경쟁 분석법에서 4개의 IgG 항체를 사용함: 도메인 IV를 인식하는 2개의 HER2항체(트라스투주맙과 PG1849); 도메인 II(PG2971)를 인식하는 하나의 항체 및 하나의 음성 대조군 항-RSV 항체. 동일한 가변 영역 유전자에 의해 코딩된 파아지와 항체가 경쟁할 때 신호손실이 관찰됨; 즉 RMF1849와 PG1849 및 MF2971과 PG2971.
Figure pct00004
표 5
래트-인간-HER2 키메라와의 반응성과 다른 종의 HER3에 대한 반응성에 따른 HER3 항체의 비닝. '숫자'는 각 군에서 고유 항체의 수를 의미한다.
Figure pct00005
표 6
1 ㎍/ml IgG에서 가장 강력한 HER2 단일클론 항체의 기능적 활성. 대조 항체, 즉 SKBR-3에서 트라스투주맙과 MCF-7에서 #Ab6 대비 활성 비율. HER2 항체의 경우에 PG2926을 제외한 모든 항체의 도메인을 도메인 I, III 또는 IV에 매핑하였다.
Figure pct00006
표 7
HRG 의존적 MCF-7 분석법에 있어서 1 ㎍/ml IgG에서 가장 강력한 HER3 단일클론 항체의 기능적 활성. 대조 항체 #Ab6 대비 활성 비율.
Figure pct00007
표 8
HER2 VH가 도 16에 나타낸 공통 경쇄와 다른 경쇄와 조합되어 있는 HER2 항체의 FACS 염색. MFI는 FACS에서 평균 형광 세기를 나타낸다. HER2 MF 번호는 괄호 사이에 표시되어 있고 다른 경쇄의 범위에 있는 HER2 결합 클론은 회색으로 표시되어 있다.
Figure pct00008
표 9
HRG 의존적 MCF-7과 BxPC3 분석법에서 비교 항체 대비 대표 HER2 x HER3 이중 특이성 항체(표에 나타낸 바대로 앞에 PB를 붙여 표시함; 각각의 PB는 HER2 아암과 HER3 아암을 포함함)의 기능적 활성. 키메라 구성체를 이용한 결합 프로파일을 토대로 HER2와 HER3 항체는 다른 빈에 대해 분리할 수 있었다. HER2 항체의 경우에 PG2926을 제외한 모든 항체의 도메인을 도메인 I, III 또는 IV에 매핑할 수 있었다.
Figure pct00009
표 10
Biacore로 측정한 HER2와 HER3에 대한 PB4188과 PB3448의 1가 결합 친화도. 2개의 이중 특이성 항체는 모두 동일한 HER3 아암을 공유하고 있다. ND, 미실시.
Figure pct00010
표 11
JIMT-1 이종 이식 연구 처리군
Figure pct00011
표 12
BT-474 세포와 SK-BR-3 세포를 이용한 정상 상태 세포 친화도 측정에 의해 측정한 125I-표지 IgG HER2xHER3 IgG(PB4188), HER3xTT(PB9215), HER2xTT(PB9216)와 헤르셉틴(HER2에 대해 단일 특이적)의 친화도. 3개의 독립적인 실험으로부터 데이터를 얻었다.
Figure pct00012
표 13. 동정된 모든 핵심 잔기에 대한 평균 결합 단백질 반응성 (및 범위)을 나타냄. PG3958Fab 결합에 관여하는 핵심 잔기는 PG3958Fab 결합에 대해 음성(<35% WT)이었지만 대조군 mAb 1129 결합에 대해서는 양성(>80% WT)인 클론에서 변이된 잔기로서 동정되었다. 임계 기준을 충족하지는 않았지만 그의 변이가 항체 결합을 약간 정도 감소시킨 2개의 추가 핵심 잔기가 동정되었다.
Figure pct00013
표 14. 2개의 핵심 잔기에 대한 평균 결합 단백질 반응성(및 범위)을 나타냄. PG3178 결합에 관여하는 핵심 잔기는 PG3178 mAb 결합에 대해 음성(<20% WT)이었지만 대조군 mAb 66223 결합에 대해서는 양성(>70% WT)인 클론에서 변이된 잔기로서 동정되었다. 잔기 번호는 PDB ID #4P59에 따라 부여함.
Figure pct00014
표 15. HER3에서 Arg 426의 11.2 Å 반경 내에 있는 노출 잔기 목록:
Figure pct00015
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Claims (57)

  1. ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서, 상기 항체가 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있는 이중 특이성 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있는 이중 특이성 항체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체가 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있되 상기 세포가 세포당 적어도 100,000개의 세포 표면 수용체를 갖는 이중 특이성 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 MCF-7 세포, SKBR-3 세포, NCI-N87 세포, BxPC-3 세포, BT-474 세포 또는 JIMT-l 세포인 이중 특이성 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위가 ErbB-2의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 이중 특이성 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원 결합 부위가 ErbB-3에 대한 ErbB-3 리간드의 결합을 방해하는 이중 특이성 항체.
  7. ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서, 상기 제1 항원 결합 부위가 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고 상기 제2 항원 결합 부위가 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 이중 특이성 항체.
  8. ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)가 ErbB-2 양성 세포에 대한 제1 항원 결합 부위의 친화도와 동등하거나 이보다 더 높은 이중 특이성 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드 유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있는 이중 특이성 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 ErbB-2와 ErbB-3 양성 세포의 리간드 유도 성장을 감소시킬 수 있는 이중 특이성 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 제2 항원 결합 부위의 친화도(KD)가 2.0 nM 이하, 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하인 이중 특이성 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 제1 항원 결합 부위의 친화도(KD)가 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.5 nM 이하, 바람직하게는 4.0 nM 이하인 이중 특이성 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, BT-474 세포에 대한 상기 이중 특이성 항체의 친화도(KD)가 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 3.2 nM 이하이고/또는 SK-BR-3 세포에 대한 상기 이중 특이성 항체의 친화도가 5.0 nM 이하, 바람직하게는 3.0 nM 이하, 더 바람직하게는 2.0 nM 이하인 이중 특이성 항체.
  14. ErbB-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 항체로서, 상기 항원 결합 부위 중 적어도 하나가 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 항체.
  15. 제14항에 있어서, ErbB-2 양성 세포에 대한 상기 항원 결합 부위 중 적어도 하나의 친화도(KD)가 5.0 nM 이하, 바람직하게는 4.0 nM 이하, 더 바람직하게는 4.0 nM 이하인 항체.
  16. ErbB-3에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 항체로서, 상기 항원 결합 부위 중 적어도 하나가 ErbB-3의 도메인 III에 결합하는 항체.
  17. 제16항에 있어서, ErbB-3 양성 세포에 대한 상기 항원 결합 부위 중 적어도 하나의 친화도(KD)가 2.0 nM 이하, 바람직하게는 1.39 nM 이하, 더 바람직하게는 0.99 nM 이하인 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ErbB-3 양성 세포 및/또는 ErbB-2 양성 세포가 BT-474 세포 또는 SK-BR-3 세포인 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, T144, T164, R166, P172, G179, S180과 R181로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개의 아미노산 위치 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함하는 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, R426으로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 III의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 항원 결합 부위와 천연 ErbB-3 단백질에서 R426으로부터 11.2 Å 이내에 위치해 있는 표면 노출된 아미노산 잔기를 포함하는 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열을 포함하는 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDR3 서열을 포함하는 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하거나 상기 항체가 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열과 최대 3개의 아미노산, 바람직하게는 최대 2개의 아미노산, 최대 1개의 아미노산에서 상이한 CDR 서열을 포함하는 항체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역의 적어도 CDRl, CDR2와 CDR3 서열을 포함하거나 상기 항체가 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 CDRl, CDR2와 CDR3 서열과 최대 3개의 아미노산, 바람직하게는 최대 2개 아미노산, 바람직하게는 최대 1개 아미노산에서 상이한 CDR 서열을 포함하는 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 도 16A 또는 도 16E에 나타낸 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003과 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변 영역 서열을 포함하거나 상기 항체가 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 중쇄 가변 영역 서열과 최대 15개 아미노산에서 상이한 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 도 16B 또는 도 16E 또는 도 37에 나타낸 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073과 MF6074의 중쇄 가변 영역 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변 영역 서열을 포함하거나 상기 항체가 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074와 최대 15개 아미노산에서 상이한 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
  27. 제1항 내지 제26항에 있어서, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 나타내는 이중 특이성 항체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, ADCC를 증강시키기 위해서 비푸코실화되는 이중 특이성 항체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 항체인 이중 특이성 항체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 양립 가능한 헤테로다이머화 도메인을 가진 서로 다른 2개의 면역글로불린 중쇄를 포함하는 이중 특이성 항체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 양립 가능한 헤테로다이머화 도메인이 양립 가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 헤테로다이머화 도메인인 이중 특이성 항체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 아암이 공통 경쇄를 포함하는 이중 특이성 항체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 공통 경쇄가 생식선 경쇄, 바람직하게는 IgVKl-39 유전자 조각을 포함하는 재배열된 생식선 인간 카파 경쇄, 가장 바람직하게는 재배열된 생식선 인간 카파 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01인 이중 특이성 항체.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 표지, 바람직하게는 생체내 촬영을 위한 표지를 더 포함하는 이중 특이성 항체.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  36. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 약제학적 조성물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  37. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 가질 위험이 있는 대상의 치료에 사용하기 위한 항체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 이중 특이성 항체가 심근 세포의 생존에 크게 영향을 주지 않는 항체.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 이중 특이성 항체가 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만인 심장 기능을 가진 대상에 대해 사용하기 위한 항체.
  40. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 갖거나 상기 종양을 가질 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 방법으로서,
    - ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체와
    - PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 바람직하게는 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제, Src 저해제, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  41. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양의 치료용으로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서, 상기 치료가 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상에 상기 이중 특이성 항체와 PI3키나아제 경로의 일 성분의 저해제, MAPK 경로의 일 성분의 저해제, 미세소관 분열 약물과 HDAC 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물, 바람직하게는 상기 이중 특이성 항체와 티로신 키나아제 저해제, PI3Ka 저해제, Akt 저해제, mTOR 저해제, Src 저해제, 보리노스타트와 파클리탁셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 이중 특이성 항체.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 티로신 키나아제 저해제가 아파티닙, 라파티닙 및/또는 네라티닙을 포함하는 방법 또는 항체.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PI3K 저해제가 BYL719인 방법 또는 항체.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Akt 저해제가 MK-2206인 방법 또는 항체.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 저해제가 에베로리무스인 방법 또는 항체.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Src 저해제가 사라카티닙인 방법 또는 항체.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세소관 표적 약물이 파클리탁셀인 방법 또는 항체.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDAC 저해제가 보리노스타트인 방법 또는 항체.
  49. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 대상에서 전이의 형성을 저지하기 위해 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 방법으로서, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 방법.
  50. ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포의 전이 형성을 치료 또는 예방용으로 ErbB-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위와 ErbB-3에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체로서, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양 세포가 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레귤린 발현량의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%인 헤레귤린 발현량을 갖는 이중 특이성 항체.
  51. 제36항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 세포당 1,000,000개 미만의 ErbB-2 세포 표면 수용체를 갖는 ErbB-2 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 가진 방법 또는 항체.
  52. 제36항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 항체인 방법 또는 항체.
  53. 제36항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포가 유방암, 위암, 결장암, 대장암, 위식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 간암, 비소 세포 폐암을 포함한 폐암, 투명세포 육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암 또는 흑색종 세포인 방법 또는 항체.
  54. 제36항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상이 건강한 심장 기능에 비해 90% 미만의 심장 기능을 가진 방법 또는 항체.
  55. 제39항 또는 제54항에 있어서, 상기 심장 기능이 좌심실 박출율(LVEF)을 포함하는 방법 또는 항체.
  56. 제39항, 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 대상이 울혈성 심부전(CHF), 좌심실 기능부전(LVD) 및/또는 ≥10% 감소된 좌심실 박출율(LVEF)을 갖고/또는 상기 대상이 심근경색이 있었던 방법 또는 항체.
  57. Akt, ERK 및/또는 S6 리보솜 단백질의 인산화를 저지, 바람직하게는 저해하기 위한 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
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