ES2833599T3 - Anticuerpo que se une a ERBB-2 y ERBB-3 - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3, en el que el anticuerpo puede reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo que se une a ERBB-2 y ERBB-3
La invención se refiere al campo de los anticuerpos. En particular, se refiere al campo de los anticuerpos terapéuticos (humanos) para el tratamiento de enfermedades que involucran células aberrantes. Más en particular, se refiere a anticuerpos que se unen a ErbB-2 y ErbB-3 y su uso en la unión de células positivas para ErbB-2 y ErbB-3, particularmente células tumorales.
La familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico humano (HER, también denominada colectivamente red de señalización ErbB) es una familia de tirosina quinasas del receptor de transmembrana (RTK). La familia incluye el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), también conocido como ErbB-1 (o HER1), y los receptores homólogos ErbB-2 (HER2), ErbB-3 (HEr 3) y ErbB-4 (HER4). Los receptores (revisados en Yarden and Pines 2012) se expresan ampliamente sobre células epiteliales. La regulación en aumento de los receptores HER o sus ligandos, tales como la herregulina (HRG) o el factor de crecimiento epidérmico (EGF), es un evento frecuente en el cáncer humano (Wilson, Fridlyand et al. 2012). La sobreexpresión de ErbB-1 y ErbB-2 en particular ocurre en tumores epiteliales y se asocia con invasión tumoral, metástasis, resistencia a quimioterapia y mal pronóstico (Zhang, Berezov et al. 2007). En la mama normal, se ha demostrado que ErbB-3 es importante en el crecimiento y diferenciación del epitelio luminal. Por ejemplo, la pérdida/inhibición de ErbB-3 da como resultado una expansión selectiva del epitelio basal sobre el luminal (Balko, Miller et al. 2012). La unión del ligando al dominio extracelular de las RTK induce la dimerización del receptor, tanto entre los subtipos de receptor iguales (homodimerización) como diferentes (heterodimerización). La dimerización puede activar los dominios de tirosina quinasa intracelular, que se someten a autofosforilación y, a su vez, pueden activar una serie de rutas de señalización pro-proliferativas en dirección descendente, que incluyen aquellas mediadas por proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) y la ruta de prosupervivencia Akt (revisada en Yarden and Pines, 2012). No se ha identificado ningún ligando endógeno específico para ErbB-2, por lo tanto, se supone que normalmente se señaliza mediante heterodimerización (Sergina, Rausch et al. 2007). Se puede activar ErbB-3 mediante el acoplamiento de sus ligandos. Estos ligandos incluyen, pero no se limitan a, neurregulina (NRG) y herregulina (HRG).
Se han identificado varios modos de activación de la señalización de la familia de receptores ErbB. Entre estos se encuentran la activación de la señalización dependiente e independiente del ligando. ErbB-2 sobreexpresado es capaz de generar señalización oncogénica a través del heterodímero ErbB-2: ErbB-3 incluso en ausencia del ligando ErbB-3 (Junttila, Akita et al. 2009). La actividad de ErbB-2 se puede inhibir mediante anticuerpos específicos de ErbB-2. Se utilizan dichos anticuerpos específicos de ErbB-2, por ejemplo, en el tratamiento de tumores positivos a ErbB-2 (HER2+). Un problema con dichos tratamientos es que a menudo los tumores escapan al tratamiento específico de ErbB-2 y continúan creciendo incluso en presencia del anticuerpo inhibidor. Se ha observado que los tumores positivos a ErbB-2, tales como los tumores de mama, ovario, cuello uterino y gástrico, pueden escapar al tratamiento debido al crecimiento selectivo de una subpoblación de células tumorales que exhiben expresión de ErbB-3 regulada por aumento (Ocana, Vera-Badillo et al. 2013) y/o expresión del ligando ErbB-3 (Wilson, Fridlyand et al.2012). También se han identificado mutaciones activadoras en el receptor ErbB-3.
El anticuerpo monoclonal anti-ErbB-2 trastuzumab (Herceptina) y el cetuximab específico de ErbB-1 (Erbitux) se encuentran entre varios anticuerpos monoclonales aprobados para aplicación clínica. El trastuzumab tiene un beneficio de supervivencia comprobado en el cáncer de mama metastásico (Arteaga, Sliwkowski et al. 2011). El mecanismo de acción preciso de trastuzumab no se ha establecido de manera inequívoca. Los modos de acción sugeridos son la inhibición de la señalización de RTK y el reclutamiento de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Otros mecanismos de acción que se han descrito incluyen el bloqueo de la división proteolítica del dominio extracelular ErbB-2, la inhibición de factores angiogénicos y la potenciación de la endocitosis del receptor. Otros agentes que interfieren con la señalización de ErbB-2 han sido aprobados o están bajo desarrollo para el tratamiento del cáncer de mama y otros cánceres de sobreexpresión de ErbB-2. Por ejemplo, el compuesto químico lapatinib inhibe la actividad tirosina quinasa ErbB-1 y ErbB-2 y se utiliza en el primer tratamiento de primera línea del cáncer de mama amplificado con ErbB-2. En pacientes con cáncer de mama metastásico HER2+, la resistencia a trastuzumab, ya sea como agente único o en combinación con quimioterapia, se presenta comúnmente a los pocos meses de comenzar la terapia. Sólo una fracción de los pacientes con cáncer de mama metastásico HER2+ responde al trastuzumab como agente único, lo que sugiere mecanismos de novo de resistencia en cánceres avanzados. Estos mecanismos incluyen, entre otros, la señalización de otra familia de receptores HER y la señalización compensatoria de RTK fuera de la familia HER (Thery et al., Resistance to human epidermal growth factor receptor type 2-targeted therapies, Eur J Cancer (2014), Vol. 50, Edición 5, páginas 892-901 (ttp://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2014.01.003)). Por ejemplo, la sobreexpresión de HER3 o sus ligandos junto con HER2 conduce a la formación de heterodímeros HER-2/HER-3 y adquiere resistencia a trastuzumab. Por lo tanto, se considera que el anticuerpo trastuzumab es ineficaz para bloquear la señalización impulsada por ligandos ErbB-3 (Wehrman, Raab et al. 2006, Junttila, Akita et al. 2009, Thery et al. 2014).
Recientemente, el anticuerpo monoclonal pertuzumab fue aprobado para uso en combinación con trastuzumab sobre la base de un beneficio adicional de supervivencia libre de progresión de 5 meses (Baselga, Cortes et al. 2012). Pertuzumab también se une a ErbB-2 pero en una posición diferente que trastuzumab.
Otras estrategias para tratar tumores positivos a ErbB-2 se dirigen hacia ErbB-3. Los anticuerpos monoclonales de unión a ErbB-3 han demostrado actividad en estudios preclínicos (Schoeberl, Faber et al. 2010). Algunos anticuerpos monoclonales que se unen a ErbB-3 pueden inhibir la proliferación y el crecimiento de una variedad de cánceres.
Otra estrategia implica la unión del receptor ErbB-2 y ErbB-3. La molécula MM-111 es una molécula biológica artificial que contiene dos fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) que se unen a ErbB-2 y ErbB-3. Los dos scFv están asociados con una proteína de albúmina de suero humano (HSA) mutada para aumentar la vida media de la molécula. En pruebas preclínicas, se mostró que la molécula inhibe la señalización y proliferación de ErbB-3. Este efecto se midió predominantemente en estirpes celulares positivas para ErbB-3 que expresaban cantidades relativamente altas de ErbB-2. MM-111 se describe en la solicitud de patente internacional WO 2012/125864 (a nombre de Merrimack Pharmaceuticals, Inc).
Robinson et al., British Journal of Cancer 99:9, 1415-1425 (2008) describen un scFv biespecífico que se une a ErbB-2 y ErbB-3. Este scFv bs induce un nivel modesto de apoptosis de células ErbB-2 '+'/ErbB-3 '+' BT-474 y MDA-361/DYT2 in vitro. Se concluyó que este scFv bs provoca un efecto citostático en lugar de citotóxico sobre las células tumorales. La actividad antitumoral se debió casi en su totalidad a su brazo anti-ErbB-3. De acuerdo con la ausencia de una parte Fc, no se informó la actividad de ADCC.
Kang et al., MAbs 6: 2, 340-353 (2014) describen anticuerpos biespecíficos contra ErbB-2 y ErbB-3 que se basan en Ab6 (anti ErbB-3) y en trastuzumab o pertuzumab (anti ErbB-2). Estos anticuerpos se denominan Tab6 y Pab6. Cuando se utilizan solos, Tab6 y Pab6 no pueden inhibir la proliferación de las estirpes celulares de cáncer de mama humano SK-BR-3, HCC1419 y bT-474. Tab6 solo exhibe actividad antiproliferativa contra estas células en combinación con el inhibidor de molécula pequeña lapatinib.
Weidle et al., Cancer Genomics & Proteomics 10: 1-18 (2013) describen varios formatos de anticuerpos y usos de los mismos. También se describe en este documento la molécula de MM-111 mencionada anteriormente contra ErbB-2 y ErbB-3.
La solicitud de patente internacional WO 2014/060365 a nombre de Universitat Zurich Prorektorat MNW describe un anticuerpo biespecífico contra ErbB-2 que comprende un primer ligando de polipéptido que se une al dominio extracelular I de ErbB-2 y un segundo ligando polipeptídico que se une al dominio IV extracelular ErbB-2. ErbB-3 no está dirigido.
Schaefer et al., Cancer Cell 20, 472-486 (2011) describen un anticuerpo IgG dos en uno contra ErbB-3 y ErbB-1 que se denomina MEHD7945A. ErbB-2 no está dirigido.
Resumen de la invención
La invención proporciona un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3, y en el que el anticuerpo puede reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3. Dicho primer sitio de unión al antígeno preferiblemente está presente en un dominio variable que comprende una cadena VH con la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF2926; MF2973; MF3004; MF3958 (es MF2971 humanizada); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (es MF3004 humanizada); MF3031; o MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E. Dicho segundo sitio de unión al antígeno preferiblemente está presente en un dominio variable que comprende una cadena VH con la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. La cadena ligera de inmunoglobulina en el dominio variable preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de la Figura 16C.
Un anticuerpo de la invención es, a menos que se especifique lo contrario, preferiblemente un anticuerpo biespecífico.
La invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención.
Se proporciona adicionalmente un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende adicionalmente un marcador, preferiblemente un marcador para formación de imagen in vivo.
También se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3, en el que el anticuerpo biespecífico reduce o puede reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3.
Como se utiliza en este documento, el término “sitio de unión al antígeno” se refiere a un sitio derivado de y preferiblemente que está presente sobre un anticuerpo biespecífico que es capaz de unirse a antígeno. Un sitio de unión al antígeno no modificado normalmente se forma por y está presente en el dominio variable del anticuerpo. El dominio variable contiene dicho sitio de unión al antígeno. Un dominio variable que une un antígeno es un dominio variable que comprende un sitio de unión al antígeno que une el antígeno.
En una realización un anticuerpo dominio variable de la invención comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL). El sitio de unión al antígeno puede estar presente en el dominio variable VH/VL combinado, o en solo la región VH o solo la región VL. Cuando el sitio de unión al antígeno está presente en solo una de las dos regiones del dominio variable, la región variable de contraparte puede contribuir al plegamiento y/o estabilidad de la región variable de unión, pero no contribuye significativamente a la unión del antígeno en sí mismo.
Como se utiliza en este documento, unión a antígeno se refiere a la capacidad de unión típica de un anticuerpo a su antígeno. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-2, se une a ErbB-2 y, bajo condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces más bajo que los receptores homólogos ErbB-1 y ErbB-4 de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-3, se une a ErbB-3 y, bajo condiciones idénticas por lo demás, no a los receptores homólogos ErbB-1 y ErbB-4 de la misma especie. Teniendo en cuenta que la familia ErbB es una familia de receptores de superficie celular, la unión se evalúa normalmente sobre las células que expresan los receptores. La unión de un anticuerpo a un antígeno se puede evaluar de diversas formas. Una forma es incubar el anticuerpo con el antígeno (preferiblemente células que expresan el antígeno), eliminar el anticuerpo no unido (preferiblemente mediante una etapa de lavado) y detectar el anticuerpo unido por medio de un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo unido.
La unión de un antígeno por un anticuerpo está mediada normalmente a través de las regiones de complementariedad del anticuerpo y la estructura tridimensional específica tanto del antígeno como del dominio variable, lo que permite que estas dos estructuras se unan con precisión (una interacción similar a llave y cerradura), en contraposición a la adhesión aleatoria e inespecífica de anticuerpos. Como un anticuerpo reconoce normalmente un epítopo de un antígeno, y como dicho epítopo puede estar presente también en otros compuestos, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención que se unen a ErbB-2 y/o ErbB-3 también pueden reconocer otras proteínas, si dichos otros compuestos contienen el mismo epítopo. Por tanto, el término “unión” no excluye la unión de los anticuerpos a otra proteína o proteínas que contienen el mismo epítopo. Preferiblemente, dichas otras proteínas no son una proteína humana. Un sitio de unión al antígeno ErbB-2 y un sitio de unión al antígeno ErbB-3 como se define en la presente invención normalmente no se unen a otras proteínas de la membrana de las células en un humano postnatal, preferiblemente adulto. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención es normalmente capaz de unirse a ErbB-2 y ErbB-3 con una afinidad de unión de al menos 1x10e-6 M, como se describe con más detalle a continuación.
El término “ interfiere con la unión”, como se utiliza en el presente documento, significa que el anticuerpo está dirigido a un epítopo en ErbB-3 y el anticuerpo compite con el ligando para unirse a ErbB-3. El anticuerpo puede disminuir la unión del ligando, desplazar el ligando cuando este ya está unido a ErbB-3 o puede, por ejemplo, a través de un impedimento estérico, evitar al menos parcialmente que el ligando se pueda unir a ErbB-3.
El término “anticuerpo” como se utiliza en este documento significa una molécula proteica, preferiblemente perteneciente a la clase de proteínas de inmunoglobulina, que contiene uno o más dominios variables que se unen a un epítopo sobre un antígeno, donde dichos dominios se derivan de o comparten homología de secuencia con el dominio variable de un anticuerpo. Los anticuerpos para uso terapéutico son preferiblemente lo más cercanos posible a los anticuerpos naturales del sujeto a tratar (por ejemplo, anticuerpos humanos para sujetos humanos). La unión del anticuerpo se puede expresar en términos de especificidad y afinidad. La especificidad determina qué antígeno o epítopo del mismo se une específicamente al dominio de unión. La afinidad es una medida de la fuerza de unión a un antígeno o epítopo particular. La unión específica se define como la unión con afinidades (KD) de al menos 1x10e-6 M, más preferiblemente 1x10e-7 M, más preferiblemente superior a 1x10e-9 M. Normalmente, los anticuerpos para aplicaciones terapéuticas tienen afinidades de hasta 1x10e-10 M o superior. Los anticuerpos tales como los anticuerpos biespecíficos de la presente invención comprenden los dominios constantes (parte Fc) de un anticuerpo natural. Un anticuerpo de la invención es normalmente un anticuerpo biespecífico de longitud completa, preferiblemente de la subclase IgG humana. Preferiblemente, un anticuerpo de la presente invención es de la subclase IgG1 humana. Dichos anticuerpos de la invención tienen buenas propiedades de ADCC, tienen una vida media favorable tras la administración in vivo a humanos y existe tecnología de ingeniería de CH3 que puede proporcionar cadenas pesadas modificadas que forman preferentemente heterodímeros sobre homodímeros tras la coexpresión en células clonales.
Un anticuerpo de la invención es un anticuerpo de “longitud completa”. El término “ longitud completa” de acuerdo con la invención se define como que comprende un anticuerpo esencialmente completo, que sin embargo no tiene necesariamente todas las funciones de un anticuerpo intacto. Para evitar dudas, un anticuerpo de longitud completa contiene dos cadenas pesadas y dos ligeras. Cada cadena contiene regiones constantes (C) y variables (V), que se pueden romper en dominios designados CH1, CH2, CH3, VH y CL, VL. Un anticuerpo se une al antígeno a través de los dominios variables contenidos en la porción Fab y, después de la unión, puede interactuar con moléculas y células del sistema inmunitario a través de los dominios constantes, principalmente a través de la porción Fc. Los términos “dominio variable”, “par VH/VL”, “VH/VL” se utilizan aquí indistintamente. Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invención abarcan anticuerpos en los que pueden estar presentes mutaciones que proporcionan las características deseadas. Dichas mutaciones no deberían ser deleciones de porciones sustanciales de ninguna de las regiones. Sin embargo, los anticuerpos en los que se suprimen uno o varios residuos de aminoácidos, sin alterar esencialmente las características de unión del anticuerpo resultante, se incluyen dentro del término “anticuerpo de longitud completa”. Por ejemplo, un anticuerpo IgG puede tener inserciones, deleciones de residuos de aminoácidos de 1 a 20 o una combinación de los mismos en la región constante. Por ejemplo, la actividad ADCC de un anticuerpo se puede mejorar cuando el propio anticuerpo tiene una baja actividad ADCC, al modificar ligeramente la región constante del anticuerpo (Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). “Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer.” Cancer Research 70(11): 4481-4489)
Se prefieren los anticuerpos IgG de longitud completa debido a su vida media favorable y la necesidad de permanecer tan cerca de las moléculas completamente autólogas (humanas) por razones de inmunogenicidad. Un anticuerpo de la invención es preferiblemente un anticuerpo IgG biespecífico, preferiblemente un anticuerpo IgG1 biespecífico de longitud completa. La IgG1 se ve favorecida por su larga vida media circulatoria en el hombre. Para prevenir cualquier inmunogenicidad en humanos, se prefiere que el anticuerpo IgG biespecífico de acuerdo con la invención sea una IgG1 humana.
El término “biespecífico” (bs) significa que una parte del anticuerpo (como se definió anteriormente) se une a un epítopo sobre un antígeno mientras que una segunda parte se une a un epítopo diferente. El epítopo diferente está normalmente presente sobre un antígeno diferente. De acuerdo con la presente invención, dicho primer y segundo antígenos son de hecho dos proteínas diferentes. Un anticuerpo biespecífico preferido es un anticuerpo que comprende partes de dos anticuerpos monoclonales diferentes y, en consecuencia, se une a dos tipos diferentes de antígeno. Un brazo del anticuerpo biespecífico normalmente contiene el dominio variable de un anticuerpo y el otro brazo contiene el dominio variable de otro anticuerpo. Las regiones variables de cadena pesada del anticuerpo biespecífico de la invención son normalmente diferentes entre sí, mientras que las regiones variables de cadena ligera son preferiblemente las mismas en los anticuerpos biespecíficos de la invención. Un anticuerpo biespecífico en el que las diferentes regiones variables de cadena pesada se asocian con la misma cadena ligera o una común también se refiere como un anticuerpo biespecífico con una cadena ligera común. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en el que ambos brazos comprenden una cadena ligera común.
Los anticuerpos biespecíficos preferidos se pueden obtener mediante la coexpresión de dos cadenas pesadas diferentes y una cadena ligera común en una única célula. Cuando se utilizan dominios CH3 de tipo silvestre, la coexpresión de dos cadenas pesadas diferentes y una cadena ligera común dará como resultado tres especies diferentes, AA, AB y BB. Para aumentar el porcentaje del producto biespecífico deseado (AB) se puede emplear la ingeniería de CH3, o en otras palabras, se pueden utilizar cadenas pesadas con dominios de heterodimerización compatibles, como se define a continuación.
El término 'dominios de heterodimerización compatibles' como se utiliza en este documento se refiere a dominios de proteínas que se diseñan por ingeniería de tal manera que el dominio A' diseñado por ingeniería formará preferentemente heterodímeros con el dominio B' y viceversa, mientras que se disminuye la homodimerización entre A'-A' y B'-B'.
El término “cadena ligera común” de acuerdo con la invención se refiere a cadenas ligeras que pueden ser idénticas o tener algunas diferencias en la secuencia de aminoácidos, mientras que la especificidad de unión del anticuerpo de longitud completa no se ve afectada. Por ejemplo, es posible dentro del alcance de la definición de cadenas ligeras comunes como se utiliza en este documento, preparar o encontrar cadenas ligeras que no sean idénticas, pero aun funcionalmente equivalentes, por ejemplo, al introducir y al probar cambios conservadores de aminoácidos y/o cambios de aminoácidos en regiones que no contribuyen, o solo parcialmente, a la especificidad de unión cuando se emparejan con la cadena pesada. Los términos “cadena ligera común”, “VL común”, “cadena ligera simple”, “VL simple”, con o sin la adición del término “reordenado”, se utilizan todos de manera intercambiable. Es un aspecto de la presente invención utilizar como cadena ligera común una cadena ligera humana que se puede combinar con diferentes cadenas pesadas para formar anticuerpos con dominios de unión a antígenos funcionales (WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant et al.1998 and Nissim et al. al.1994). Preferiblemente, la cadena ligera común tiene una secuencia de línea germinal. Una secuencia de línea germinal preferida es una región variable de cadena ligera que se utiliza con frecuencia en el repertorio humano y tiene buena estabilidad termodinámica, rendimiento y solubilidad. Una cadena ligera de la línea germinal preferida es 012, preferiblemente la cadena ligera kappa humana de la línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01 o un fragmento o un equivalente funcional (es decir, el mismo segmento del gen IgVK1-39 pero diferente segmento del gen IGJK) del mismo (nomenclatura de acuerdo a la base de datos IMGT en la web mundial en imgt.org). Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en el que dicha cadena ligera común es una cadena ligera de la línea germinal, preferiblemente una cadena ligera kappa humana de la línea germinal reordenada que comprende el segmento del gen IgVKl-39, más preferiblemente la cadena ligera kappa humana de la línea germinal reordenada IgVK1- 39*01/IGJK1*01. Los términos cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01, IGKV1-39/IGKJ1, cadena ligera huVK1-39 o, en resumen, huVK1-39 se utilizan indistintamente en toda la solicitud. Obviamente, aquellos expertos en la técnica reconocerán que “común” también se refiere a equivalentes funcionales de la cadena ligera cuya secuencia de aminoácidos no es idéntica. Existen muchas variantes de dicha cadena ligera en las que están presentes mutaciones (deleciones, sustituciones, adiciones) que no influyen materialmente en la formación de regiones de unión funcionales. La cadena ligera de la presente invención también puede ser una cadena ligera como se especificó aquí anteriormente, que tiene inserciones, deleciones, sustituciones de 1-5 aminoácidos o una combinación de las mismas.
También se contemplan anticuerpos en los que un VH es capaz de reconocer específicamente un primer antígeno y el VL, emparejado con el VH en un dominio variable de inmunoglobulina, es capaz de reconocer específicamente un segundo antígeno. El par VH/VL resultante se unirá al antígeno 1 o al antígeno 2. Los denominados “anticuerpos dos en uno”, descritos, por ejemplo, en los documentos WO 2008/027236, WO 2010/108127 y Schaefer et al (Cancer Cell 20, 472 -486, octubre de 2011), son diferentes de los anticuerpos biespecíficos de la invención y se denominan además anticuerpos “dos en uno”. Dichos anticuerpos “dos en uno” tienen brazos idénticos y no son anticuerpos de la presente invención.
El término 'ErbB-2', como se utiliza en este documento, se refiere a la proteína que en humanos está codificada por el gen ERBB-2. Los nombres alternativos para el gen o proteína incluyen CD340; h Er -2; HER-2/neu; MLN 19; NEU; NGL; TKR1. El gen ERBB-2 se denomina frecuentemente HER2 (del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano). Cuando se hace aquí referencia a ErbB-2, la referencia se refiere a ErbB-2 humano. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-2, se une a ErbB-2 humano. El sitio de unión al antígeno ErbB-2 puede, debido a la similitud de secuencia y estructura terciaria entre ortólogos humanos y de otros mamíferos, también unirse a dicho ortólogo, pero no necesariamente. Los números de acceso a la base de datos para la proteína ErbB-2 humana y el gen que la codifica son (NP_001005862.1, NP_004439.2 NC_000017.10 NT_010783.15 NC_018928.2). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de ErbB-2 como un objetivo, la secuencia real de la proteína ErbB-2 unida al anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen de codificación, como las que ocurren en algunos cánceres. El sitio de unión del antígeno ErbB-2 se une a ErbB-2 y una variedad de variantes del mismo, tales como aquellas expresadas por algunas células tumorales positivas para ErbB-2.
El término 'ErbB-3' como se utiliza en este documento se refiere a la proteína que en humanos está codificada por el gen ERBB-3. Los nombres alternativos para el gen o la proteína son HER3; LCCS2; MDA-BF-1; c-ErbB-3; c-erbb-3; erbb-3-S; p180-Erbb-3; p45-sErbb-3; y p85-sErbb-3. Cuando se hace aquí referencia a ErbB-3, la referencia se refiere a ErbB-3 humano. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-3, se une a ErbB-3 humano. El sitio de unión al antígeno ErbB-3, debido a la similitud de secuencia y estructura terciaria entre ortólogos humanos y de otros mamíferos, también puede unirse a dicho ortólogo, pero no necesariamente. Los números de acceso a la base de datos para la proteína ErbB-3 humana y el gen que la codifica son (NP_001005915.1 NP_001973.2, NC_000012.11 NC_018923.2 NT_029419.12). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de ErbB-3 como objetivo, la secuencia real de la proteína ErbB-3 unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen de codificación como aquella que ocurre en algunos cánceres. El sitio de unión al antígeno ErbB-3 se une a ErbB-3 y una variedad de variantes del mismo, tal como aquellos expresados por algunas células tumorales positivas para ErbB-2.
Un anticuerpo biespecífico de la invención que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-3, puede reducir o reduce una función del receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3. En presencia de un exceso de ErbB-2, los heterodímeros ErbB-2/ErbB-3 pueden proporcionar una señal de crecimiento a la célula de expresión en ausencia de un ligando detectable para la cadena ErbB-3 en el heterodímero. Esta función del receptor ErbB-3 se denomina en el presente documento una función receptora independiente del ligando de ErbB-3. El heterodímero ErbB-2/ErbB-3 también proporciona una señal de crecimiento a la célula de expresión en presencia de un ligando ErbB-3. Esta función del receptor ErbB-3 se denomina en el presente documento como una función del receptor inducida por ligando de ErbB-3.
El término “ligando de ErbB-3”, como se utiliza aquí, se refiere a polipéptidos que se unen y activan ErbB-3. Los ejemplos de ligandos ErbB-3 incluyen, pero no se limitan a, neurregulina 1 (NRG) y neurregulina 2, betacelulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina y epirregulina. El término incluye fragmentos y/o variantes biológicamente activos de un polipéptido de origen natural.
En una realización preferida de la invención, la función receptora inducida por ligando de ErbB-3 es el crecimiento inducido por ligando ErbB-3 de una célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3. En una realización preferida dicha célula es una célula MCF-7 (ATCC® HTB-22™); una célula SKBR3 (ATCC® HTB-30™); una célula NCI-87 (ATCC® CRL-5822™); una célula BxPC-3-luc2 (Perkin Elmer 125058), una célula BT-474 (ATCC® HTB-20™) o una célula JIMT-1 (DSMZ no.: ACC 589).
En una realización preferida, la célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 comprende al menos 50.000 receptores de ErbB-2 sobre la superficie celular. En una realización preferida, al menos 100.000 receptores de ErbB-2. En una realización preferida, la célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 comprende al menos 1.000.000 receptores de ErbB-2 sobre la superficie celular. En otra realización preferida, la célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3 comprende no más de 1.000.000 receptores de ErbB-2 sobre la superficie celular. Las terapias actualmente utilizadas tal como trastuzumab (Herceptina) y pertuzumab solo se prescriben a pacientes con células positivas para ErbB-2 malignas que tienen más de 1.000.000 receptores de ErbB-2 sobre su superficie celular, con el fin de obtener una respuesta clínica. Los pacientes con células tumorales positivas para ErbB-2 con más de 1.000.000 receptores de ErbB-2 sobre su superficie celular se clasifican normalmente como ErbB-2 [+++]. Los pacientes se clasifican, por ejemplo, utilizando HercepTest™ y/o HER2 FISH (pharm Dx™), comercializados por Dako Denmark A/S, y/o utilizando un ensayo HERmark®, comercializado por Monogram Biosciences. Solo se prescriben trastuzumab y pertuzumab a pacientes ErbB-2 [+++] porque los pacientes con concentraciones más bajas de ErbB-2 generalmente no muestran una respuesta clínica suficiente cuando se tratan con trastuzumab y pertuzumab. Sin embargo, la invención proporciona anticuerpos biespecíficos que también tienen una afinidad de unión mejorada por células con una concentración de receptor ErbB-2 más baja, en comparación con trastuzumab. Como se muestra en los Ejemplos, la proliferación de dichas células con menor expresión de ErbB2 se contrarresta eficazmente con un anticuerpo de acuerdo con la invención. Dicha concentración más baja de receptor ErbB-2 está presente en células malignas de pacientes que se clasifican como ErbB-2 [++] o ErbB-2 [+]. También, los tumores positivos a ErbB-2 recidivantes a menudo tienen una concentración de receptor de ErbB-2 inferior a 1.000.000 receptores por célula. Por lo tanto, dichos pacientes ErbB-2 [++] o ErbB-2 [+], así como los pacientes con un tumor positivo para ErbB-2 recidivante, se tratan preferiblemente con un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3, en el que el anticuerpo puede reducir el crecimiento inducido por ligando de una célula positiva para ErbB2 y ErbB3 que tiene menos de 1.000.000 receptores de superficie celular ErbB-2. También se divulga un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 o en riesgo de tener dicho tumor, en el que dicho tumor tiene menos de 1.000.000 receptores de superficie celular ErbB-2 por célula, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo biespecífico o composición farmacéutica de acuerdo con la invención. También se proporciona aquí un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que dicho tumor tiene menos de 1.000.000 receptores de superficie celular ErbB-2 por célula. Dicho anticuerpo de acuerdo con la presente invención normalmente es capaz de reducir una función de receptor inducida por ligando, preferiblemente crecimiento inducido por ligando, de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3. En una realización preferida, la afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2, como se explica a continuación con más detalle. La afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. La afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2 es preferiblemente menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM.
En una realización preferida, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181.
En una realización preferida, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención preferiblemente comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste en R426 y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de 11.2 A de R426 en la proteína ErbB-3 nativa.
Para establecer si un tumor es positivo para ErbB-3, el experto en la técnica puede, por ejemplo, determinar la amplificación y/o tinción de ErbB-3 en inmunohistoquímica. Al menos el 10 % de las células tumorales en una biopsia deben ser positivas. La biopsia también puede contener 20 %, 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % o más células positivas.
Como se utiliza en este documento la función de receptor inducida por ligando se reduce en al menos 20 %, preferiblemente al menos 30, 40, 50 60, o al menos 70 %, en una realización particularmente preferida la función de receptor inducida por ligando se reduce al 80, más preferiblemente al 90 %. La reducción se determina preferiblemente al determinar una función de receptor inducida por ligando en presencia de un anticuerpo biespecífico de la invención, y compararla con la misma función en ausencia del anticuerpo, bajo condiciones por lo demás idénticas. Las condiciones comprenden al menos la presencia de un ligando ErbB-3. La cantidad de ligando presente es preferiblemente una cantidad que induce la mitad del crecimiento máximo de una estirpe celular positiva para ErbB-2 y ErbB-3. La estirpe celular positiva para ErbB-2 y ErbB-3 para esta prueba es preferiblemente la estirpe celular MCF-7 (ATCC® HTB-22™), las células de la estirpe celular SKBR3 (ATCC® HTB-30™), la estirpe celular JIMT-1 (DSMZ ACC 589) o la estirpe celular NCI-87 (ATCC® CRL-5822™). La prueba y/o el ligando para determinar la función del receptor inducida por ligando ErbB-3 es preferiblemente una prueba para la reducción del crecimiento inducido por ligando ErbB-3 como se especifica en los ejemplos.
La proteína ErbB-2 contiene varios dominios (véase como referencia la figura 1 de Landgraf, R Cáncer de mama Res.
2007; 9 (1): 202-). Los dominios extracelulares se denominan dominios I-IV. Se ha cartografiado el lugar de unión a los dominios respectivos de los sitios de unión al antígeno de los anticuerpos descritos en este documento (véanse los ejemplos). Un anticuerpo biespecífico de la invención con un sitio de unión al antígeno (primer sitio de unión al antígeno) que une el dominio I de ErbB-2 (primer sitio de unión al antígeno) comprende una región variable de cadena pesada que mantiene una especificidad y afinidad de unión significativas para ErbB- 2 cuando se combina con varias cadenas ligeras. Se encontraron anticuerpos biespecíficos con un sitio de unión al antígeno (primer sitio de unión al antígeno) que une el dominio I o dominio IV de ErbB-2 (primer sitio de unión al antígeno) y un sitio de unión al antígeno para ErbB-3 (segundo sitio de unión al antígeno) más efectivos en reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 cuando se compara con un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de unión al antígeno (primer sitio de unión al antígeno) que se une a otro dominio extracelular de ErbB-2. Se prefiere un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de unión al antígeno (primer sitio de unión al antígeno) que une ErbB- 2, en el que dicho sitio de unión al antígeno se une al dominio 1 de ErbB-2. Se encontró que un anticuerpo biespecífico con un sitio de unión al antígeno (primer sitio de unión al antígeno) que se une a ErbB-2, y que comprende adicionalmente ADCC es más efectivo que los otros anticuerpos de unión a ErbB-2 que no tenían una actividad ADCC significativa, particularmente in vivo. Por tanto, se prefiere un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que exhiba ADCC. Se encontró que los anticuerpos en los que dicho primer sitio de unión al antígeno se une al dominio IV de ErbB-2 tenían actividad ADCC intrínseca. Un anticuerpo de unión a ErbB-2 que se une al dominio I que tiene una baja actividad intrínseca de ADCC se puede diseñar por ingeniería para mejorar la actividad de ADCC. Las regiones Fc median la función de los anticuerpos al unirse a diferentes receptores en las células efectoras inmunitarias tales como macrófagos, linfocitos citolíticos naturales, células B y neutrófilos. Algunos de estos receptores, tales como CD16A (FcyRIIIA) y CD32A (FcyRIIA), activan las células para generar una respuesta contra los antígenos. Otros receptores, tales como el CD32B, inhiben la activación de las células inmunitarias. Mediante ingeniería de regiones Fc (mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos) que se unen a los receptores de activación con mayor selectividad, se pueden crear anticuerpos que tengan una mayor capacidad para mediar las actividades citotóxicas deseadas por un Mab anticanceroso.
Una técnica para mejorar la ADCC de un anticuerpo es la afucosilación. (Véase, por ejemplo, Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). “Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer.” Cancer Research 70(11): 4481-4489). Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, que está afucosilado. Alternativamente, o adicionalmente, se pueden utilizar muchas otras estrategias para lograr la mejora de ADCC, por ejemplo, que incluyen la glicoingeniería (Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt (Roche) y Eureka Therapeutics) y mutagénesis (Xencor and Macrogenics), todas las cuales buscan mejorar la unión de Fc a FcYRIIIa de activación de baja afinidad, y/o para reducir la unión al FcYRIIb inhibidor de baja afinidad.
Existen varios métodos in vitro para determinar la eficacia de anticuerpos o células efectoras para provocar ADCC. Entre estos se encuentran ensayos de liberación de cromo-51 [Cr51], ensayos de liberación de europio [Eu] y ensayos de liberación azufre-35 [S35]. Por lo general, una estirpe celular objetivo marcada que expresa un cierto antígeno expuesto en la superficie se incuba con un anticuerpo específico para ese antígeno. Después del lavado, las células efectoras que expresan el receptor de Fc CD16 se coincuban normalmente con las células objetivo marcadas con anticuerpos. Posteriormente, la lisis de las células objetivo se mide normalmente mediante la liberación del marcador intracelular, por ejemplo, mediante un contador de centelleo o espectrofotometría. Una prueba preferida se detalla en los Ejemplos.
Una ventaja de la presente invención es el hecho de que la unión de anticuerpos de acuerdo con la invención tales como, por ejemplo, PB4188 a células positivas para ErbB-2 y ErbB-3 da como resultado una internalización que es en el mismo grado en comparación con trastuzumab. Si se utiliza una combinación de trastuzumab y pertuzumab, se potencia la internalización de estos anticuerpos. Sin embargo, esta internalización mejorada, da como resultado una ADCC reducida. Por lo tanto, se prefiere un anticuerpo de acuerdo con la presente invención que da como resultado una internalización que está esencialmente en el mismo grado cuando se compara con el trastuzumab sobre una combinación de trastuzumab y pertuzumab porque con dicho anticuerpo se mantiene mejor la actividad ADCC.
Un anticuerpo de la invención que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, interfiere con la unión de un ligando ErbB-3 a ErbB-3. Dichos anticuerpos son más efectivos en reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una estirpe celular positiva para ErbB2 y ErbB3, particularmente en el contexto de un anticuerpo biespecífico que también comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2.
La invención actual proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno une el dominio I de ErbB-2. Como se muestra en los Ejemplos, los anticuerpos biespecíficos que tienen estas características son bien capaces de unir laS células positivas para ErbB2 y ErbB3 y contrarrestar su actividad (tal como la función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 y el crecimiento inducido por ligando de una célula positiva para ErbB-2 y ErbB3). Más aún, los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención que comprenden un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 son particularmente adecuados para uso en combinación con terapias anti-ErbB-2 existentes como trastuzumab y pertuzumab, porque el trastuzumab y pertuzumab se unen a dominios diferentes de ErbB-2. El Trastuzumab se une al dominio IV de ErbB-2 y pertuzumab se une al dominio II de ErbB-2. Por tanto, se prefieren los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención que se unen al dominio I de ErbB-2 porque no compiten con trastuzumab y pertuzumab por el mismo epítopo.
La invención proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho segundo sitio de unión al antígeno une el dominio III de ErbB-3. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la terapia de combinación con moléculas de unión anti-ErbB-3 actualmente utilizadas que no se unen al dominio III de ErbB-3, tal como MM-121 (Merrimack Pharmaceuticals; también denominado como # Ab6) y RG7116 (Roche) que se unen al dominio I de ErbB-3, porque entonces las diferentes moléculas de unión no compiten entre sí por el mismo epítopo.
Se proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno une el dominio I de ErbB-2 y dicho segundo sitio de unión al antígeno une el dominio III de ErbB-3. Dicho anticuerpo es particularmente adecuado para la terapia de combinación con moléculas de unión anti-ErbB-2 que no se unen al dominio I de ErbB-2, tal como trastuzumab y pertuzumab, y con moléculas de unión anti-ErbB-3 que no se unen al dominio III de ErbB-3, tal como MM-121 (# Ab6) y RG7116.
La invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno une el dominio I de ErbB-2 y dicho segundo sitio de unión al antígeno une el dominio III de ErbB-3 y en el que el anticuerpo puede reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3. Dicho anticuerpo preferiblemente puede reducir el crecimiento inducido por ligando de una célula positiva para ErbB2 y ErbB3.
Realizaciones de la invención de la invención proporcionan un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que la afinidad (KD) de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2. Contrariamente a los compuestos biespecíficos de la técnica anterior, tal como por ejemplo MM-111 de Merrimack Pharmaceuticals, que tienen una mayor afinidad para ErbB-2 que para ErbB-3, la presente invención proporciona anticuerpos biespecíficos que tienen un brazo específico de ErbB-3 con una afinidad para ErbB-3 sobre células que es mayor que la afinidad del brazo específico de ErbB-2 por ErbB-2 en células. Dichos anticuerpos biespecíficos son más capaces de unirse a ErbB-3, a pesar de la baja concentración de ErbB-3 sobre la superficie celular. Esto proporciona la ventaja de que la actividad funcional contra ErbB-3 se mejora en comparación con los compuestos de la técnica anterior, lo que significa que estos anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son más capaces de contrarrestar la actividad de ErbB-3 (tal como el crecimiento inducido por ligando).
Como se utiliza en este documento, el término “afinidad” se refiere al valor de KD.
La afinidad (KD) de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. En una realización preferida, la afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para ErbB- 3 sobre las células SK-BR-3 es menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 1.39-0.59 nM. En una realización preferida, la afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para ErbB-3 sobre células BT-474 es menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.0 nM, más preferiblemente menor que 0.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.31 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.23 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 0.31-0.15 nM. Las afinidades mencionadas anteriormente se miden preferiblemente utilizando medidas de afinidad celular en estado estacionario, en las que las células se incuban a 4 °C utilizando anticuerpos marcados radiactivamente, donde después se mide la radioactividad unida a las células, como se describe en los Ejemplos.
La afinidad (KD) de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2 es preferiblemente menor que o igual a 5.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.9 nM. En una realización preferida, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para ErbB-2 sobre células SK-BR-3 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.3 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 3.0-1.6 nM. En una realización preferida, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para ErbB-2 sobre células BT-474 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.9 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 4.5-3.3 nM. Las afinidades mencionadas anteriormente preferiblemente se miden preferiblemente utilizando medidas de afinidad celular en estado estacionario, en las que las células se incuban a 4 °C utilizando anticuerpo marcado radiactivamente, donde después se mide la radioactividad unida a las células, como se describe en los Ejemplos.
En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en el que la afinidad (KD) de dicho anticuerpo biespecífico para células BT-474 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.7 nM, preferiblemente menor que o igual a 3.2 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 3.7-2.7 nM. En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en el que la afinidad de dicho anticuerpo biespecífico para las células SK-BR-3 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 2.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 2.4-1.6 nM. De nuevo, las afinidades mencionadas anteriormente se miden preferiblemente utilizando mediciones de afinidad celular en estado estacionario, en las que las células se incuban a 4°C utilizando anticuerpo marcado radiactivamente, donde después se mide la radioactividad unida a las células, como se describe en los Ejemplos.
Realizaciones preferidas adicionales de la invención proporcionan un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que la afinidad (KD) de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2, y en el que el anticuerpo puede reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3. Dicho anticuerpo preferiblemente puede reducir crecimiento inducido por ligando de una célula positiva para ErbB2 y ErbB3.
Los anticuerpos mencionados anteriormente de acuerdo con la invención con una alta afinidad para ErbB-3 se unen al dominio I de ErbB2 y dominio III de ErbB-3. En una realización particularmente preferida se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3, en el que la afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2.
Dicho segundo sitio de unión al antígeno preferiblemente se une al dominio III de ErbB-3 y tiene una afinidad (KD) para una célula positiva para ErbB-3 que es menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. En una realización preferida, dicho segundo sitio de unión al antígeno une el dominio III de ErbB-3 y tiene una afinidad para ErbB-3 sobre células SK-BR-3 que es menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 1.39-0.59 nM. En una realización preferida, dicho segundo sitio de unión al antígeno une el dominio III de ErbB-3 y tiene una afinidad para ErbB-3 sobre células BT-474 que es menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.31 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.23 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 0.31-0.15 nM.
Dicho primer sitio de unión al antígeno preferiblemente se une al dominio I de ErbB-2 y tiene una afinidad (KD) para una célula positiva para ErbB-2 que es menor que o igual a 5.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.9 nM. En una realización preferida, dicho primer sitio de unión al antígeno une el dominio I de ErbB-2 y tiene una afinidad para ErbB-2 sobre células SK-BR-3 que es menor que o igual a 5.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.3 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 3.0-1.6 nM. La afinidad de dicho anticuerpo biespecífico para las células SK-BR-3 es preferiblemente menor que o igual a 5.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.4 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 2.4-1.6 nM.
En una realización preferida, dicho primer sitio de unión al antígeno une el dominio I de ErbB-2 y tiene una afinidad (KD) para ErbB-2 sobre células BT-474 que es menor que o igual a 5.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, preferiblemente menor que o igual a 3.9 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 4.5-3.3 nM. La afinidad de dicho anticuerpo biespecífico para células BT-474 es preferiblemente menor que o igual a 5.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.7 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.2 nM. En una realización, dicha afinidad está dentro del rango de 3.7-2.7 nM.
De nuevo, las afinidades mencionadas anteriormente se miden preferiblemente utilizando mediciones de afinidad celular en estado estacionario, en las que las células se incuban a 4 °C utilizando anticuerpo marcado radiactivamente, donde después se mide la radioactividad unida a las células, como se describe en los Ejemplos.
Otra realización preferida proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que el anticuerpo puede reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3, en el que dicho anticuerpo biespecífico no afecta significativamente la supervivencia de los cardiomiocitos. La cardiotoxicidad es un factor de riesgo conocido en las terapias dirigidas a ErbB-2 y la frecuencia de complicaciones aumenta cuando se utiliza trastuzumab junto con antraciclinas, lo que induce estrés cardíaco. Por ejemplo, la combinación de doxiciclina (DOX) con trastuzumab induce efectos secundarios cardíacos graves. Los estudios clínicos han estimado que entre el 5% y el 10% de los pacientes que reciben trastuzumab en el ámbito adyuvante del cáncer de mama desarrollan disfunción cardíaca (Guarneri et al., J Clin Oncol., 1985, 3: 818-26; Ewer MS et al., Nat Rev Cardiol 2010; 7: 564-75). Sin embargo, en un estudio retrospectivo, se demostró que el riesgo de desarrollar disfunción cardíaca asintomática es en realidad tan alto como alrededor del 25 % cuando se utiliza trastuzumab como ámbito de adyuvante con DOX (Wadhwa et al., Breast Cáncer Res Treat 2009;117:357-64). Como se muestra en los Ejemplos, la presente invención proporciona anticuerpos que se dirigen a ErbB-2 y que no, o en un grado significativamente menor en comparación con trastuzumab y pertuzumab, afectan la supervivencia de los cardiomiocitos. Esto proporciona una ventaja importante ya que se reduce la cardiotoxicidad. Esto ya es ventajoso para las personas que no padecen una función cardíaca deteriorada, y más aún para las personas que padecen una función cardíaca deteriorada, o que están en riesgo de sufrirla, tal como por ejemplo los sujetos que padecen insuficiencia cardíaca congestiva (CHF)), disfunción ventricular izquierda (LVD) y/o una fracción de eyección ventricular izquierda (LVEF) disminuida > 10 %, y/o sujetos que han tenido un infarto de miocardio. Por tanto, se prefieren los anticuerpos de acuerdo con la invención que no afecten significativamente a la supervivencia de los cardiomiocitos. Se mide la función in vitro de los cardiomiocitos, por ejemplo, al determinar la viabilidad de los cardiomiocitos, al determinarel BNP (péptido natriurético de tipo B, que es un biomarcador cardíaco), al determinar la prolongación del QT y/o al determinar el potencial de la membrana mitocondrial.
Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3. Una realización proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención que no afecta significativamente la supervivencia de cardiomiocitos, que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que la afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2. La afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. La afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2 es preferiblemente menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM.
En una realización preferida dicho anticuerpo que no afecta significativamente la supervivencia de cardiomiocitos comprende:
- al menos la secuencia CDR3, preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, o al menos la secuencia de región variable de cadena pesada, de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, de las secuencias mencionadas de la región variable de la cadena pesada; y/o - al menos la secuencia CDR3, preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, o al menos la secuencia de región variable de cadena pesada, de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, de las secuencias mencionadas de la región variable de la cadena pesada. En una realización preferida, dicho anticuerpo es PB4188.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención, que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un residuo de aminoácidos de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181. La numeración del residuo de aminoácidos es aquella de Banco de Datos de Proteína (PDB) ID #1S78. Como se muestra en los Ejemplos, los anticuerpos que se unen a esta región de dominio I de ErbB-2 exhiben particularmente buenas características de unión y son capaces de contrarrestar la actividad de células positivas para ErbB-2 (tal como función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3, y/o crecimiento inducido por ligando de dicha célula). Más aún, dichos anticuerpos son particularmente adecuados para la terapia de combinación con anticuerpos monoclonales anti-ErbB-2 actualmente conocidos como trastuzumab (que se une al dominio IV de ErbB-2) y pertuzumab (que se une al dominio II de ErbB-2) porque se unen a diferentes dominios de ErbB-2. Por tanto, estos anticuerpos se pueden utilizar simultáneamente sin competencia por el mismo epítopo. El término “residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181” se refiere a residuos de aminoácidos que están en la secuencia de aminoácidos principal ubicada dentro de aproximadamente los primeros cinco residuos de aminoácidos adyacentes a los residuos mencionados y que están al menos en parte expuestas al exterior de la proteína, de tal manera que pueden estar unidos por anticuerpos (véase por ejemplo Figura 21B). Preferiblemente, dicho residuo de aminoácidos se ubica dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181 se selecciona del grupo que consiste en L139, C140, Y141, Q142, D143, 1145, L146, W147, K148, D149, L159, T160, L161, 1162, D163, N165, S167, R168, A169, C170, H171, C173, S174, P175, M176, C177, K178, C182, W183, G184, E185 y S186. Preferiblemente, dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos 2 o al menos 3 residuos de aminoácidos de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181.
En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en el que dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos T144, R166 y R181 de dominio I de ErbB-2. Otra realización proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en el que dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos T144, R166, P172, G179 y R181 de dominio I de ErbB-2. Otra realización proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en el que dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181 de dominio I de ErbB-2.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste R426 y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de 11.2 A desde R426 en la proteína ErbB-3 nativa. La numeración del residuo de aminoácidos es aquella de Banco de Datos de Proteína (PDB) ID #4p59. Como se muestra en los Ejemplos, los anticuerpos que se unen a esta región de dominio III de ErbB-3 exhiben particularmente buenas características de unión y son capaces de contrarrestar la actividad de células positivas para ErbB-3 (tal como función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3, y/o crecimiento inducido por ligando de dicha célula). El término “residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de 11.2 A desde R426 en la proteína ErbB-3 nativa” se refiere a residuos de aminoácidos que están en la estructura terciaria de la proteína ErbB-3 posicionada espacialmente dentro de 11.2 A desde R426 y que están al menos en parte expuestos al exterior de la proteína, de tal manera que se pueden unir por anticuerpos. Preferiblemente, dichos residuos de aminoácidos que se ubican dentro de 11.2 A desde R426 en la proteína ErbB-3 nativa se seleccionan del grupo que consiste en L423, Y424, N425, G427, G452, R453, Y455, E480, R481, L482, D483 y K485 (véase por ejemplo Figura 21C y Tabla 15). En una realización preferida, se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en el que dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos R426 de dominio III de ErbB-3. Preferiblemente, dicho anticuerpo comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos R426 de dominio III de ErbB-3.
Un anticuerpo biespecífico de la invención preferiblemente se afucosila con el fin de mejorar la actividad de ADCC. Un anticuerpo biespecífico de la invención preferiblemente comprende una cantidad reducida de fucosilación de la estructura de carbohidratos ligada a N en la región Fc, cuando se compara con el mismo anticuerpo producido en una célula CHO normal.
Un anticuerpo biespecífico de la presente invención se utiliza preferiblemente en humanos. Con este fin, un anticuerpo biespecífico de la invención es preferiblemente un anticuerpo humano o humanizado.
La tolerancia de un humano a un polipéptido se rige por muchos aspectos diferentes. La inmunidad, ya sea mediada por células T, mediada por células B u otra, es una de las variables que se engloban en la tolerancia del humano a un polipéptido. La región constante de un anticuerpo biespecífico de la presente invención es preferiblemente una región constante humana. La región constante puede contener una o más, preferiblemente no más de 10, preferiblemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región constante de un anticuerpo humano de origen natural. Se prefiere que la parte constante se derive completamente de un anticuerpo humano de origen natural. Varios anticuerpos producidos en el presente documento se derivan de una biblioteca de dominio variable de anticuerpos humanos. Como tales, estos dominios variables son humanos. Las regiones CDR únicas se pueden derivar de humanos, ser sintéticas o derivadas de otro organismo. La región variable se considera una región variable humana cuando tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región variable de un anticuerpo humano de origen natural, pero para la región CDR. La región variable de un VH de unión a ErbB-2, un VH de unión a ErbB-3 o una cadena ligera en un anticuerpo de la invención puede contener una o más, preferiblemente no más de 10, preferiblemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región variable de un anticuerpo humano de origen natural, sin contar las posibles diferencias en la secuencia de aminoácidos de las regiones CDR. Dichas mutaciones ocurren también en la naturaleza en el contexto de la hipermutación somática.
Los anticuerpos se pueden derivar de diversas especies animales, al menos con respecto a la región variable de cadena pesada. Es una práctica común humanizar tales como, por ejemplo, regiones variables de cadena pesada de murino. Hay varias formas en las que esto se puede lograr, entre las que están el injerto de CDR en una región variable de cadena pesada humana con una estructura 3D que coincide con la estructura 3-D de la región variable de cadena pesada de murino; desinmunización de la región variable de cadena pesada de murino, preferiblemente realizada al eliminar epítopos de células T o B conocidos o sospechosos de la región variable de cadena pesada de murino. La eliminación se realiza normalmente al sustituir uno o más de los aminoácidos en el epítopo por otro aminoácido (normalmente conservador), de modo que la secuencia del epítopo se modifica de manera que ya no es un epítopo de célula T o B. Dichas regiones variables de cadena pesada de murino desinmunizadas son menos inmunogénicas en humanos que la región variable de cadena pesada de murino original. Preferiblemente, una región o dominio variable de la invención se humaniza adicionalmente, tal como, por ejemplo, recubierto. Al utilizar técnicas de recubrimiento, los residuos exteriores que el sistema inmunitario encuentra fácilmente se reemplazan selectivamente con residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende una superficie recubierta débilmente inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica. Un animal como se utiliza en la invención es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un primate, lo más preferiblemente un humano.
Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención comprende preferiblemente una región constante de un anticuerpo humano. De acuerdo con las diferencias en sus dominios constantes de cadena pesada, los anticuerpos se agrupan en cinco clases o isotipos: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Estas clases o isotipos comprenden al menos una de dichas cadenas pesadas que se nombra con una letra griega correspondiente. En una realización preferida, la invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención en el que dicha región constante se selecciona del grupo de regiones constantes de IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, más preferiblemente dicha región constante comprende una región constante de IgG, más preferiblemente una región constante de IgG1, preferiblemente una región constante de IgG1 mutada. En la naturaleza ocurre alguna variación en la región constante de IgG1, como por ejemplo los alotipos G1m1, 17 y G1m3, y/o se permite sin cambiar las propiedades inmunológicas del anticuerpo resultante. Normalmente, se permiten en la región constante entre aproximadamente 1-10 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas.
La invención en una realización proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable que se une a ErbB-2, en el que dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en uno más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de una VH seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E. Dicho anticuerpo preferiblemente comprende al menos la secuencia CDR3 de MF2971, MF3958, MF3004 o MF3991, aún más preferiblemente al menos la secuencia CDR3 de MF3958.
Dicho anticuerpo preferiblemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, m F3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16Ao Figura 16E, o secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en a lo sumo un aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, o MF3003. Dicho anticuerpo preferiblemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF2971, MF3958, MF3004 o MF3991, aún más preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3958.
La invención también proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable que se une a ErbB-3, en el que dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en uno más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de una VH seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. Dicho anticuerpo preferiblemente comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065, aún más preferiblemente al menos la secuencia CDR3 de MF3178.
Dicho anticuerpo preferiblemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en a lo sumo un aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074. Dicho anticuerpo preferiblemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065, aún más preferiblemente al menos la secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
La invención en una realización proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en uno más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de una VH seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, y en el que dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en uno más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de una VH seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. Dicho primer sitio de unión al antígeno preferiblemente comprende al menos la secuencia CDR3 de MF2971, MF3958, MF3004 o MF3991, aún más preferiblemente al menos la secuencia CDR3 de MF3958 y dicho segundo sitio de unión al antígeno preferiblemente comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o Mf6065, aún más preferiblemente al menos la secuencia CDR3 de MF3178.
Dicho primer sitio de unión al antígeno preferiblemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en a lo sumo un aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF2926,MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, o MF3003, y dicho segundo sitio de unión al antígeno preferiblemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en a lo sumo un aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. Dicho primer sitio de unión al antígeno preferiblemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF2971, MF3958, MF3004 o MF3991, aún más preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3958, y dicho segundo sitio de unión al antígeno preferiblemente comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, m F6061 o MF6065, aún más preferiblemente al menos la secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
Una realización preferida proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3958, o una secuencia CDR3 que difiere en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en uno más de un aminoácido de la secuencia CDR3 de MF3958, y en el que dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3178, o una secuencia c DR3 que difiere en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en uno más de un aminoácido de la secuencia CDR3 de MF3178.
La invención en una realización proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3958, o secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que difieren en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en a lo sumo un aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3958, y en el que dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia de CDR1, c Dr 2 y CDR3 de MF3178, o secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que difieren en a lo sumo tres, preferiblemente en a lo sumo dos, preferiblemente en a lo sumo un aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
La invención en una realización proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3958 y en el que dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3178.
La invención en una realización proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3958 y en el que dicho segundo sitio de unión al antígeno comprende al menos la secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
Por ejemplo, se varían las secuencias de CDR con fines de optimización, preferiblemente para mejorar la eficacia de unión o la estabilidad del anticuerpo. La optimización se realiza, por ejemplo, mediante procedimientos de mutagénesis en los que, después de que preferiblemente se prueban la estabilidad y/o la afinidad de unión de los anticuerpos resultantes, se selecciona preferiblemente una secuencia mejorada de CDR específica de ErbB-2 o ErbB-3. Un experto en la materia es capaz de generar variantes de anticuerpos que comprendan al menos una secuencia de CDR alterada de acuerdo con la invención. Por ejemplo, se aplica la sustitución conservadora de aminoácidos. Ejemplos de sustitución conservadora de aminoácidos incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrofóbico, y la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico para ácido aspártico o glutamina para asparagina.
La invención en una realización proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable que se une a ErbB-2, en el que la cadena VH de dicho dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF2926; MF2973; MF3004; MF3958 (es MF2971 humanizada); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (es MF3004 humanizada); MF3031;o MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E; o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF2926; MF2973; MF3004; MF3958 (es MF2971 humanizada); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (es MF3004 humanizada); MF3031; o MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH mencionada anteriormente de la Figura 16A o Figura 16E. La cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-2 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de:
- MF2971 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o
- MF3004 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3991;
Como se representa en la Figura 16A. En una realización, la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-2 comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF2971 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o MF3004 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3991, en la que las secuencias de VH mencionadas tienen a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia respectiva representada en la Figura 16A. En una realización preferida la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-2 comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958 representada en la Figura 16A que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH. El anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a ErbB-2 es un anticuerpo biespecífico que comprende adicionalmente un dominio variable que se une a ErbB-3. La cadena VH del dominio variable que se une a Erb-B3 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37; o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37 que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH de la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. La cadena VH del dominio variable que se une a Erb-B3 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065; o comprende la secuencia de aminoácidos de MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH respectiva de la Figura 16B o Figura 37. En una realización preferida la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende la secuencia de aminoácidos de MF3178; o comprende la secuencia de aminoácidos de MF3178 representada en la Figura 16B que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH. Preferiblemente, las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácido mencionadas anteriormente no están presentes en la región CDR3. Las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácido mencionadas anteriormente preferiblemente tampoco están presentes en las regiones CDR1 y CDR2. Las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácido mencionadas anteriormente preferiblemente tampoco están presentes en la región FR4.
La invención proporciona adicionalmente un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable que se une a ErbB-3, en el que la cadena VH de dicha región variable comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37 que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a dicha secuencia de cadena VH. La cadena VH del dominio variable que se une a ErbB3 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065; o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a dicha secuencia de cadena VH. En una realización preferida la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 representada en la Figura 16B; o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 representada en la Figura 16B que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH. El anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a ErbB-3, es un anticuerpo biespecífico que comprende adicionalmente un dominio variable que se une a ErbB-2. La cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-2 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de una cadena VH de la Figura 16A o Figura 16E. La cadena VH del dominio variable que se une a ErbB- 2 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF2971 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o MF3004 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3991 como se representa en la Figura 16A. En una realización, las secuencias de VH de unión a Erb-B2 mencionadas tienen a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia respectiva representada en la Figura 16A. En una realización preferida, dicha cadena VH de unión a ErbB-2 de la Figura 16A comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958 que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH. Preferiblemente, las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácido mencionadas anteriormente no están presentes en la región CDR3. Las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácido mencionadas anteriormente preferiblemente tampoco están presentes en las regiones CDR1 y CDR2. Las inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácido mencionadas anteriormente preferiblemente tampoco están presentes en la región FR4.
Se proporciona adicionalmente un anticuerpo de acuerdo con la invención, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15, preferiblemente en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, aminoácidos de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, o MF3003.
Se proporciona adicionalmente un anticuerpo de acuerdo con la invención, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15, preferiblemente en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, aminoácidos de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074.
También se divulga un anticuerpo que comprende dos sitios de unión al antígeno que se unen a ErbB-2, en los que al menos uno de dichos sitios de unión al antígeno se une al dominio I de ErbB-2. Preferiblemente, ambos sitios de unión al antígeno se unen al dominio I de ErbB-2. Dicho anticuerpo es particularmente adecuado para terapia de combinación con moléculas de unión anti-ErbB-2 utilizadas actualmente que no se unen al dominio I de ErbB-2, tal como trastuzumab que une el dominio IV de ErbB-2 y pertuzumab que une el dominio II de ErbB-2, porque entonces las diferentes moléculas de unión no compiten entre sí por el mismo epítopo.
Se divulga adicionalmente un anticuerpo que comprende dos sitios de unión al antígeno que se unen a ErbB-2, en los que al menos uno de dichos sitios de unión al antígeno se une al dominio I de ErbB-2 y en el que la afinidad (KD) de dicho al menos un sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.9 nM. Preferiblemente, ambos sitios de unión al antígeno se unen al dominio I de ErbB-2. Preferiblemente, la afinidad de dicho al menos un sitio de unión al antígeno para ErbB-2 sobre células SK-BR-3 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.3 nM. En un aspecto, dicha afinidad está dentro del rango de 3.0-1.6 nM. Preferiblemente, la afinidad de dicho al menos un sitio de unión al antígeno para ErbB-2 sobre células BT-474 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.9 nM. En un aspecto, dicha afinidad está dentro del rango de 4.5-3.3 nM.
Las afinidades mencionadas anteriormente se miden preferiblemente utilizando mediciones de afinidad celular en estado estacionario, en las que las células se incuban a 4 °C utilizando anticuerpos marcados radiactivamente, y después se mide la radioactividad unida a las células, como se describe en los Ejemplos.
Se divulga adicionalmente un anticuerpo que comprende dos dominios variables que se unen a ErbB-2, en el que una cadena VH de dichos dominios variables comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958 (es MF2971 humanizada); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (es MF3004 humanizada); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 o MF1898 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958 (es MF2971 humanizada); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991 (es MF3004 humanizada); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, m F3003 o cadenas VH MF1898 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1,2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia respectiva representada en la Figura 16A o Figura 16E. Dicha VH preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF1849; o MF2971 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o MF3004 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3991 como se representa en la Figura 16A; o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF1849; o MF2971 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o MF3004 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3991 como se representa en la Figura 16A que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia respectiva representada en la Figura 16A. Los dominios variables del anticuerpo preferiblemente comprenden cadenas VH idénticas, preferiblemente que tienen una secuencia como se representa en la Figura 16A o Figura 16E. Un anticuerpo con dominios variables con cadenas VH idénticas no es un anticuerpo biespecífico. Las cadenas VH son idénticas para la presente invención si comprenden la misma secuencia de cadena VH como se representa en la Figura 16A o Figura 16E o Figura 37, o la misma secuencia de cadena VH pero para 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia respectiva representada en la Figura 16A o Figura 16E o Figura 37.
Se divulga adicionalmente un anticuerpo que comprende dos sitios de unión al antígeno que se unen a ErbB-3, en el que al menos uno de dichos sitios de unión al antígeno se une al dominio III de ErbB-3. Preferiblemente, ambos sitios de unión al antígeno se unen al dominio III de ErbB- 3. Dicho anticuerpo es particularmente adecuado para terapia de combinación con moléculas de unión anti-ErbB-3 utilizadas actualmente que no se unen al dominio III de ErbB-3, tal como MM-121 (#Ab6) y RG7116 que se unen al dominio I de ErbB-3, porque entonces las diferentes moléculas de unión no compiten entre sí por el mismo epítopo.
Se divulga adicionalmente un anticuerpo que comprende dos sitios de unión al antígeno que se unen a ErbB-3, en el que al menos uno de dichos sitios de unión al antígeno se une al dominio III de ErbB-3 y en el que la afinidad (KD) de dicho al menos un sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es menor que o igual a 2.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. Preferiblemente, ambos sitios de unión al antígeno se unen al dominio III de ErbB-3. Preferiblemente, la afinidad de dicho al menos un sitio de unión al antígeno para ErbB-3 sobre células SK-BR-3 es menor que o igual a 2.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. En un aspecto, dicha afinidad está dentro del rango de 1.39-0.59 nM. Preferiblemente, la afinidad de dicho al menos un sitio de unión al antígeno para ErbB-3 sobre células BT-474 es menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.5 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.31 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.23 nM. En un aspecto, dicha afinidad está dentro del rango de 0.31-0.15 nM.
De nuevo, las afinidades mencionadas anteriormente se miden preferiblemente utilizando medidas de afinidad celular en estado estacionario, en las que las células se incuban a 4 °C utilizando anticuerpos marcados radiactivamente, y después se mide la radiactividad unida a las células, como se describe en los Ejemplos.
Se divulga adicionalmente un anticuerpo que comprende dos dominios variables que cada uno se une a en los que una VH de los dominios variables comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37; o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1,2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a cualquiera de dicha secuencia de cadenas VH. Dicha VH preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065; o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 o MF6065 que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a cualquiera de dicha secuencia de cadenas VH. Dicha VH preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 representada en la Figura 16B que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH MF3178. Los dominios variables del anticuerpo preferiblemente comprenden cadenas VH idénticas, preferiblemente que tienen una secuencia como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. Un anticuerpo con dominios variables con cadenas VH idénticas no es un anticuerpo biespecífico. Las cadenas VH son idénticas si comprenden la misma secuencia de cadena VH como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o la misma secuencia de cadena VH pero para 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH de la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37.
Los anticuerpos monoespecíficos que son específicos para ErbB-3 tienen la ventaja de que tienen una mejor actividad funcional contra ErbB-3, en comparación con compuestos de la técnica anterior tal como, por ejemplo, MM-121 (# Ab6), lo que significa que estos anticuerpos son mejor capaces de contrarrestar la actividad de ErbB-3 (tal como una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 y/o crecimiento inducido por ligando de una célula positiva para ErbB-2 y ErbB-3). Esto se muestra, por ejemplo, en la Tabla 7 y la Figura 38.
En una realización preferida la invención proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable que se une a ErbB-2, en el que la cadena VH de dicho dominio variable comprende
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF2971 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o MF3004 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3991, como se representa en la Figura 16A; o comprende
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF2971 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3958; o MF3004 o una versión humanizada de la misma, en la que dicha versión humanizada preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de MF3991, como se representa en la Figura 16A que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a dicha VH. Dicho anticuerpo biespecífico de acuerdo con esta realización comprende adicionalmente comprende un dominio variable que se une a ErbB-3. La cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o aún más preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a cualquiera de dichas secuencias de cadenas VH de la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. La cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 16B o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 representada en la Figura 16B que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH de la Figura 16B.
La invención preferiblemente proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable que se une a ErbB-2 y un dominio variable que se une a ErbB-3,
en el que la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-2 comprende
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3958 como se representa en la Figura 16A; o
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3958 como se representa en la Figura 16A que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a dicha VH; y
en las que la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 16B; o
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 representada en la Figura 16B que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH de la Figura 16B.
La invención preferiblemente proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un dominio variable que se une a ErbB-2 y un dominio variable que se une a ErbB-3,
en el que la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-2 comprende
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3991 como se representa en la Figura 16A; o
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3991 como se representa en la Figura 16A que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a dicha VH; y
en las que la cadena VH del dominio variable que se une a ErbB-3 comprende
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 como se representa en la Figura 16B; o
- la secuencia de aminoácidos de cadena VH MF3178 representada en la Figura 16B que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de cadena VH de la Figura 16B.
Cuando se compara con las secuencias en la Figura 16, el comportamiento de una cadena VH normalmente comienza a ser notablemente diferente cuando tiene más de 15 cambios de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de una cadena VH como se representa en la Figura 16. una cadena VH que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la cadena VH representada en la Figura 16, preferiblemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a la cadena VH representada en la Figura 16, preferiblemente 1, 2, 3 o 4 inserciones, deleciones, sustituciones o una combinación de las mismas, preferiblemente 1, 2 o 3 inserciones, deleciones, sustituciones o una combinación de las mismas, más preferiblemente 1 o 2 inserciones, deleciones, sustituciones o una combinación de las mismas, y preferiblemente 1 inserción, supresión, sustitución o una combinación de las mismas con respecto a la cadena VH representada en la Figura 16. La una o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas preferiblemente no están en la región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena VH. Preferiblemente tampoco están presentes en la región FR4. Una sustitución de aminoácido es preferiblemente una sustitución de aminoácido conservadora.
En una realización preferida la invención proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en la Figura 16D, o un anticuerpo biespecífico de la Figura 16D que tiene a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferiblemente a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5, inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas con respecto a las secuencias de la Figura 16D, en el que a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácido son preferiblemente sustituciones de aminoácido conservadoras. Las inserciones, deleciones, sustituciones o una combinación de las mismas preferiblemente no están en la región CDR3 de la cadena VH, preferiblemente no en la región CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena VH, y preferiblemente no en la región FR4.
Los métodos racionales han evolucionado hacia la minimización del contenido de residuos no humanos en el contexto humano. Hay varios métodos disponibles para injertar con éxito la propiedad de unión al antígeno de un anticuerpo biespecífico sobre otro anticuerpo. Las propiedades de unión de los anticuerpos descansan predominantemente en la secuencia exacta de la región CDR3, a menudo respaldada por la secuencia de las regiones c DR1 y CDR2 en el dominio variable combinada con la estructura apropiada del dominio variable en su conjunto. Actualmente están disponibles varios métodos para injertar regiones CDR en un dominio variable adecuado de otro anticuerpo. Algunos de estos métodos se revisan en J.C. Almagro1 y J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633. Por lo tanto, la invención proporciona adicionalmente un anticuerpo biespecífico humano o humanizado de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que el dominio variable que comprende el sitio de unión a ErbB-2 comprende una secuencia CDR3 VH como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, y en el que el dominio variable que comprende el sitio de unión a ErbB-3 comprende una región CDR3 VH como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. La región variable VH que comprende el sitio de unión a ErbB-2 preferiblemente comprende las secuencias de la región CDR1, región CDR2 y la región CDR3 de una cadena VH en la Figura 16A o Figura 16E. La región variable VH que comprende el sitio de unión a ErbB-3 preferiblemente comprende las secuencias de la región CDR1, región CDR2 y la región CDR3 de una cadena VH en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. El injerto de CDR también se puede utilizar para producir una cadena VH con las regiones CDR de una VH de la Figura 16 o Figura 37, pero que tiene un marco diferente. El marco diferente puede ser de otro VH humano o de un mamífero diferente.
Los mencionados a lo sumo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácido son preferiblemente sustituciones de aminoácido conservadoras. Las inserciones, deleciones, sustituciones o una combinación de las mismas preferiblemente no están en la región CDR3 de la cadena VH, preferiblemente no en la región CDR1, CDR2 o CDR3 de la cadena VH y preferiblemente no en la región FR4.
La cadena ligera de un dominio variable que comprende una secuencia de cadena pesada variable como se representa en la Figura 16 o Figura 37, es preferiblemente cadena ligera de la línea germinal 012, preferiblemente la cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01 o un fragmento o un derivado funcional del mismo (nomenclatura de acuerdo con la base de datos IMGT de la red global mundial en imgt.org). Se utilizan los términos cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01, IGKV1-39/IGKJ1, cadena ligera huVK1-39 o en resumen huVK1-39. La cadena ligera puede tener 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácido o una combinación de las mismas. Las 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácido mencionadas son preferiblemente sustituciones de aminoácido conservadoras, las inserciones, deleciones, sustituciones o una combinación de las mismas preferiblemente no están en la región CDR3 de la cadena VL, preferiblemente no en la región CDR1, CDR2 o CDR3 o región FR4 de la cadena VL.
Se encuentran disponibles varios métodos para producir anticuerpos biespecíficos. Un método implica la expresión de dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas ligeras diferentes en una célula y la recolección de anticuerpos producidos por la célula. El anticuerpo que se produce de esta manera contendrá normalmente una colección de anticuerpos con diferentes combinaciones de cadenas pesadas y ligeras, algunas de las cuales son el anticuerpo biespecífico deseado. El anticuerpo biespecífico se puede purificar posteriormente de la colección. La relación de anticuerpos biespecíficos con respecto a otros anticuerpos producidos por la célula puede aumentarse de diversas formas. En una realización preferida de la invención, la relación aumenta expresando no dos cadenas ligeras diferentes sino dos cadenas ligeras esencialmente idénticas en la célula. Este concepto también se denomina en la técnica método de “cadena ligera común”. Cuando las cadenas ligeras esencialmente idénticas trabajan junto con las dos cadenas pesadas diferentes, lo que permite la formación de dominios variables con diferentes sitios de unión al antígeno y diferentes propiedades de unión concomitantes, la relación de anticuerpo biespecífico a otro anticuerpo que se produce por la célula mejora significativamente con respecto a la expresión de dos cadenas ligeras diferentes. La relación del anticuerpo biespecífico que es producido por la célula se puede mejorar aún más al estimular el emparejamiento de dos cadenas pesadas diferentes entre sí sobre el emparejamiento de dos cadenas pesadas idénticas. La técnica describe varias formas en las que se puede lograr dicha heterodimerización de cadenas pesadas. Una forma es generar anticuerpos biespecíficos 'de botón en ojal'. Véase la solicitud de patente estadounidense 20030078385 (Arathoon et al. - Genentech). Otro método preferido se describe en la solicitud provisional de EE. UU. 61/635,935, que ha sido seguida por la solicitud regular de EE. UU. No. 13/866,747 (US 2013/0336981 A1) y la solicitud PCT No. PCT/NL2013/050294 (WO 2013/157954 A1). Se divulgan métodos y medios para producir anticuerpos biespecíficos a partir de una sola célula, mediante los cuales se proporcionan medios que favorecen la formación de anticuerpos biespecíficos sobre la formación de anticuerpos monoespecíficos. Estos métodos también se pueden emplear favorablemente en la presente invención. Por lo tanto, la invención divulga un método para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención (a partir de una sola célula), en el que dicho anticuerpo biespecífico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfaz, dicho método comprende proporcionar en dicha célula a) una primera molécula de ácido que codifica un 1er dominio CH3 que comprende una cadena pesada, b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un 2do dominio CH3 que comprende una cadena pesada, en el que dichas moléculas de ácido nucleico están provistas de medios para el emparejamiento preferencial de dicho 1er y 2do dominio CH3 que comprende cadenas pesadas, dicho método comprende adicionalmente la etapa de cultivar dicha célula anfitriona y permitir la expresión de dichas dos moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. Dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico pueden ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, vector o vehículo de administración de genes y pueden integrarse en el mismo sitio del genoma de la célula anfitriona. Alternativamente, dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico se proporcionan por separado a dicha célula.
Una realización preferida divulga un método para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención (a partir de una sola célula), en el que dicho anticuerpo biespecífico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfaz, dicho método comprende proporcionar:
- una célula que tiene a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-2 y que contiene un 1er dominio CH3, y b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-3 y que contiene un 2do dominio CH3, en el que dichas moléculas de ácido nucleico están provistas de medios para el emparejamiento preferencial de dichos 1er y 2do dominios CH3,
dicho método comprende adicionalmente la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de dichas dos moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo IgG biespecífico del cultivo. En una realización particularmente preferida, dicha célula también tiene una tercera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera común. Dicha primera, segunda y tercera molécula de ácido nucleico puede ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, vector o vehículo de suministro de genes y puede integrarse en el mismo sitio del genoma de la célula anfitriona. Alternativamente, dichas primera, segunda y tercera moléculas de ácido nucleico se proporcionan por separado a dicha célula. Una cadena ligera común preferida es 012, preferiblemente la cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVK1 39*01/IGJK1*01, como se describió anteriormente. Los medios para el emparejamiento preferencial de dicho 1er y 2do dominio CH3 son preferiblemente las mutaciones correspondientes en el dominio CH3 de las regiones codificantes de la cadena pesada. Las mutaciones preferidas para producir esencialmente sólo anticuerpos biespecíficos son las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K (numeración de acuerdo con Kabat) en el primer dominio CH3 y las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E en el segundo dominio CH3, o viceversa. Por tanto, se divulga adicionalmente un método de acuerdo con la divulgación para producir un anticuerpo biespecífico, en el que dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E, dicho método comprende además la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. También se divulga un método de acuerdo con la divulgación para producir un anticuerpo biespecífico, en el que dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E (numeración de acuerdo con Kabat) y en el que dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K, dicho método que comprende además la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. Los anticuerpos de acuerdo con la invención que se pueden producir mediante estos métodos también forman parte de la presente invención. Los dominios de heterodimerización de CH3 son preferiblemente dominios de heterodimerización de IgG1. Las regiones constantes de cadena pesada que comprenden los dominios de heterodimerización de CH3 son preferiblemente regiones constantes de IgG1.
En una realización, la invención divulga una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo de acuerdo con la invención. La molécula de ácido nucleico (normalmente un ácido nucleico in vitro, aislado o recombinante) codifica preferiblemente una región variable de cadena pesada como se representa en la Figura 16A o Figura 16B o Figura 37, o una región variable de cadena pesada como se representa en la Figura 16A o Figura 16B o Figura 37 que tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas. En un aspecto preferido, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia como se representa en la Figura 16 o Figura 37. En otro aspecto preferido, la molécula de ácido nucleico codifica la misma secuencia de aminoácidos que el ácido nucleico representado en la Figura 16 o Figura 37, pero tiene una diferente secuencia porque codifica uno o más codones diferentes. Por ejemplo, dicha molécula de ácido nucleico tiene codones optimizados para células productoras de anticuerpos, tal como por ejemplo células de Ovario de Hámster Chino (CHO), células NS0 o células PER-C6™. La invención divulga adicionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de la Figura 16D o la Figura 37.
Una molécula de ácido nucleico como se utiliza en la invención es normalmente, pero no exclusivamente, un ácido ribonucleico (ARN) o un ácido desoxirribonucleico (ADN). Los ácidos nucleicos alternativos están disponibles para un experto en la técnica. Un ácido nucleico de acuerdo con la invención está, por ejemplo, contenido en una célula. Cuando dicho ácido nucleico se expresa en dicha célula, dicha célula produce un anticuerpo de acuerdo con la invención. Por tanto, la invención en una realización divulga una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención y/o un ácido nucleico de acuerdo con la divulgación. Dicha célula es preferiblemente una célula animal, más preferiblemente una célula de mamífero, más preferiblemente una célula de primate, lo más preferiblemente una célula humana. Para los propósitos de la invención, una célula adecuada es cualquier célula capaz de comprender y preferiblemente de producir un anticuerpo de acuerdo con la invención y/o un ácido nucleico de acuerdo con la divulgación.
La invención divulga adicionalmente una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferiblemente, dicha célula (normalmente una célula in vitro, aislada o recombinante) produce dicho anticuerpo. En un aspecto preferido, dicha célula es una célula de hibridoma, una célula CHO, una célula NS0 o una célula PER-C6™. En un aspecto particularmente preferido, dicha célula es una célula CHO. Se divulga adicionalmente un cultivo celular que comprende una célula de acuerdo con la invención. Varias instituciones y empresas han desarrollado estirpes celulares para la producción a gran escala de anticuerpos, por ejemplo, para uso clínico. Los ejemplos no limitantes de dichas estirpes celulares son las células CHO, células n S0 o células PER.C6™. Estas células también se utilizan para otros fines, como la producción de proteínas. Las estirpes celulares desarrolladas para la producción a escala industrial de proteínas y anticuerpos se denominan en el presente documento estirpes celulares industriales. Por tanto, en un aspecto preferido, la invención divulga el uso de una estirpe celular desarrollada para la producción a gran escala de anticuerpos para la producción de un anticuerpo de la invención.
La invención divulga adicionalmente un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula de la divulgación y recolectar dicho anticuerpo de dicho cultivo. Preferiblemente, dicha célula se cultiva en un medio sin suero. Preferiblemente, dicha célula está adaptada para el crecimiento en suspensión. Se divulga adicionalmente un anticuerpo que se puede obtener mediante un método para producir un anticuerpo de acuerdo con la divulgación. Preferiblemente, el anticuerpo se purifica del medio del cultivo. Preferiblemente, dicho anticuerpo está purificado por afinidad.
Una célula de la divulgación es, por ejemplo, una estirpe celular de hibridoma, una célula CHO, una célula NS0 u otro tipo de célula conocido por su idoneidad para la producción de anticuerpos con fines clínicos. En un aspecto particularmente preferido, dicha célula es una célula humana. Preferiblemente una célula que se transforma mediante una región E1 de adenovirus o un equivalente funcional de la misma. Un ejemplo preferido de dicha estirpe celular es la estirpe celular PER.C6™ o equivalente de la misma. En un aspecto particularmente preferido, dicha célula es una célula CHO o una variante de la misma. Preferiblemente, una variante que hace uso de un sistema de vector de glutamina sintetasa (GS) para la expresión de un anticuerpo.
La invención proporciona adicionalmente una composición, preferiblemente una composición farmacéutica, que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica comprende preferiblemente un excipiente o portados (farmacéuticamente aceptable). En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende histidina 5-50 mM, trehalosa 100-300 mM, polisorbato 200.1-03 g/l o una combinación de los mismos. El pH se ajusta preferiblemente a pH = 5.5-6.5. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende histidina 25 mM, trehalosa 220 mM, polisorbato 200.2 g/l o una combinación de los mismos. El pH se ajusta preferiblemente a pH = 5.5-6.5, más preferiblemente a pH = 6.
Un anticuerpo de la invención preferiblemente comprende además un marcador, preferiblemente un marcador para la formación de imágenes in vivo. Normalmente, dicho marcador no es necesario para aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, en un entorno de diagnóstico, un marcador puede resultar útil. Por ejemplo, al visualizar células objetivo en el cuerpo. Son adecuados varios marcadores y muchos son bien conocidos en la técnica. En una realización preferida, el marcador es un marcador radiactivo para la detección. En otra realización preferida, el marcador es un marcador de infrarrojos. Preferiblemente, el marcador de infrarrojos es adecuado para la formación de imágenes in vivo. El experto en la materia dispone de varios marcadores de infrarrojos. Los marcadores de infrarrojos preferidas son, por ejemplo, IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; Fosforamidita IRDye 700; IRDye 800 fosforamidita (LI-COR utiliza; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska).
La invención divulga adicionalmente un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB- 3 o en riesgo de tener dicho tumor que comprende administrar al sujeto un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Antes del inicio de dicho tratamiento, el método preferiblemente comprende determinar si dicho sujeto tiene, o está en riesgo de tener, dicho tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3. En algunas realizaciones, el sujeto se clasifica como [+] o [++] para ErbB-2. En otra realización el sujeto se clasifica como [+++] para ErbB-2. La invención proporciona adicionalmente un anticuerpo de la invención para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3. Alternativamente, la invención formulada divulga un uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento o agente profiláctico para el tratamiento de un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3. Como se utiliza en este documento, el término tratamiento abarca profiláctico.
El tumor es preferiblemente un cáncer positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3. Preferiblemente dicho cáncer positivo es un cáncer de mama, tal como cáncer de mama en etapa temprana. Sin embargo, la invención se puede aplicar a un amplio rango de cánceres positivos a ErbB- 2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, como cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, y melanoma. Dicho anticuerpo de acuerdo con la presente invención normalmente es capaz de reducir una función de receptor inducida por ligando, preferiblemente crecimiento inducido por ligando, de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3. En una realización preferida, la afinidad (KD) de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, preferiblemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o melanoma, en el que la afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2. La afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. La afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2 es preferiblemente menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM. En una realización preferida, dicho anticuerpo es anticuerpo PB4188.
En una realización preferida, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181.
En una realización preferida, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención preferiblemente comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste R426 y residuos de aminoácidos expuestos a superficie que se ubican dentro de 11.2 A desde R426 en la proteína ErbB-3 nativa.
Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, preferiblemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o melanoma, en el que dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181,
y/o en el que dicho anticuerpo de acuerdo con la invención preferiblemente comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste en R426 y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de 11.2 Á desde r 426 en la proteína ErbB-3 nativa.
El sujeto es preferiblemente un sujeto humano. El sujeto es preferiblemente un sujeto elegible para la terapia con anticuerpos monoclonales utilizando un anticuerpo específico de ErbB-2 tal como trastuzumab. En una realización preferida, el sujeto comprende un tumor, preferiblemente un cáncer positivo para ErbB-2/ErbB-3, preferiblemente un tumor/cáncer con un fenotipo resistente a la terapia ErbB-2 y/o un fenotipo resistente a la herregulina, preferiblemente un fenotipo resistente a anticuerpos monoclonales. Un tumor que involucra dicho fenotipo puede escapar al tratamiento con un régimen anti-HER2 actual, tal como (pero no limitado a) la terapia con anticuerpos monoclonales contra ErbB-2.
La cantidad de anticuerpo de acuerdo con la invención que se administrará a un paciente está normalmente en la ventana terapéutica, lo que significa que se utiliza una cantidad suficiente para obtener un efecto terapéutico, mientras que la cantidad no excede un valor de umbral que conduce a un inaceptable alcance de los efectos secundarios. Cuanto menor sea la cantidad de anticuerpo necesaria para obtener un efecto terapéutico deseado, mayor será normalmente la ventana terapéutica. Por tanto, se prefiere un anticuerpo de acuerdo con la invención que ejerza suficientes efectos terapéuticos a dosificaciones bajas. La dosificación puede estar en el rango del régimen de dosificación de trastuzumab o menos.
La presente invención describe, entre otros, anticuerpos que se dirigen a los receptores de ErbB-2 y ErbB-3 y dan como resultado una potente inhibición de la proliferación de estirpes de células cancerosas in vitro e inhibición del crecimiento tumoral in vivo, incluso en presencia de un mecanismo de escape como, por ejemplo, regulación al alza de NRG1-p1. Se identificó un panel diverso de brazos de unión de Fab humanos y murinos específicos para ErbB-2 o ErbB-3. Estos se produjeron como anticuerpos biespecíficos al clonarlos en vectores de expresión complementarios que contienen mutaciones en la región CH3 que impulsa la heterodímerización de cadenas pesadas. Se produjeron más de 500 anticuerpos biespecíficos a pequeña escala y se probaron en ensayos funcionales y de unión sobre tres estirpes celulares de cáncer diferentes. Se seleccionaron y probaron varios anticuerpos biespecíficos en un modelo de xenoinjerto ortotópico utilizando la estirpe celular BxPC3. Esta estirpe celular expresa los receptores de ErbB-2 y ErbB-3 y depende parcialmente del ligando ErbB-3 para su crecimiento. Los modelos BxPC3 son un modelo de cribado robusto y estricto. Adicionalmente, se ha confirmado una fuerte actividad antitumoral in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto utilizando la estirpe celular JIMT-1. Las células JIMT-1 se derivan de una metástasis pleural de una paciente de 62 años con cáncer de mama que era clínicamente resistente al trastuzumab. Las células JIMT-1 crecen como una monocapa adherente y forman tumores de xenoinjerto en ratones sin pelo. Las células JIMT-1 tienen un oncogén HER-2 amplificado, que no mostró mutaciones identificables en su secuencia codificante. Las células JIMT-1 sobreexpresan el ARNm y la proteína de HER-2, y los niveles de ARNm y proteína de HER-1, HER-3 y HER-4 son similares a los de la estirpe celular SKBR-3 sensible a trastuzumab (Tanner et al, Mol Cancer Ther 2004).
Es importante destacar que se obtuvo un mejor efecto antitumoral utilizando un anticuerpo de acuerdo con la invención en comparación con los anticuerpos monoclonales utilizados actualmente trastuzumab y pertuzumab, así como con el compuesto químico lapatinib.
Los anticuerpos de la invención se pueden producir a niveles > 50 mg/L después de la transfección transitoria en células 293F en suspensión. Los anticuerpos biespecíficos se pueden purificar hasta una pureza superior al 98 % con rendimientos > 70 %. Los estudios de caracterización analítica muestran perfiles de anticuerpos lgG1 biespecíficos que son comparables a lgG1 monoespecífico bivalente. En términos de actividad funcional, un anticuerpo biespecífico de la invención puede demostrar una potencia superior en comparación con trastuzumab pertuzumab in vitro e in vivo.
Las realizaciones preferidas de la invención proporcionan una terapia de combinación. En una realización, un anticuerpo según la invención se combina con trastuzumab o pertuzumab, ya que estos anticuerpos se unen a diferentes epítopos de ErbB-2 de modo que no compiten por el mismo epítopo con un anticuerpo según la invención, como se muestra en los Ejemplos. En otra realización, se combina un anticuerpo según la invención con MM-121 (# Ab6) o RG7116 (Roche), ya que estos anticuerpos se unen a diferentes epítopos de ErbB-3 de modo que no compiten por el mismo epítopo con un anticuerpo según la invención, como se muestra en los Ejemplos.
En otra realización preferida, un compuesto de unión de acuerdo con la invención que es específico para ErbB-2 y ErbB-3 se combina con un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa y/ o con un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, tal como por ejemplo con un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR o un inhibidor de Src. En una realización un compuesto de unión de acuerdo con la invención que es específico para ErbB- 2 y ErbB-3 se combina con un fármaco disruptor de microtúbulos o con un inhibidor de una histona desacetilasa (HDAC). Sorprendentemente, los inventores han encontrado un efecto sinérgico cuando se utilizan estas combinaciones. Por lo tanto, se divulga adicionalmente un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 o en riesgo de tener dicho tumor, el método comprende administrar al sujeto:
- un compuesto de unión que es específico para ErbB-2 y ErbB-3, y
- uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MApK, un fármaco disruptor de microtúbulos, y un inhibidor de una histona desacetilasa (HDAC). Dicho inhibidor preferiblemente comprende un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR o un inhibidor de Src. Dicho inhibidor de tirosina quinasa son preferiblemente afatinib, lapatinib y/o neratinib. Dicho inhibidor de PI3Ka es preferiblemente BYL719. En un aspecto, dicho inhibidor de Akt es MK-2206. En un aspecto preferido, dicho inhibidor de mTOR es everolimus. En un aspecto preferido, dicho inhibidor de Src es saracatinib. En un aspecto preferido, dicho fármaco disruptor de microtúbulos es paclitaxel. En un aspecto preferido, dicho inhibidor de HDAc es vorinostat. En un aspecto preferido, dicho compuesto de unión que es específico para ErbB-2 y ErbB-3 es MM-111 (Merrimack Pharmaceuticals). En un aspecto preferido, dicho compuesto de unión que es específico para ErbB-2 y ErbB-3 es un anticuerpo biespecífico. En un aspecto preferido, dicho compuesto de unión que es específico para ErbB-2 y ErbB-3 es un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, se divulga adicionalmente un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB- 3 o en riesgo de tener dicho tumor, el método comprende administrar al sujeto:
- un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, y
- uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos, y un inhibidor de HDAC.
También se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para uso en el tratamiento de un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB- 2/ErbB-3, en el que dicho tratamiento comprende administrar dicho anticuerpo biespecífico y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos, y un inhibidor de HDAC a un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3. Preferiblemente, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que tiene un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3 se combina con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos, y un inhibidor de HDAC. Dicho inhibidor preferiblemente comprende un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR o un inhibidor de Src. Dicho inhibidor de tirosina quinasa son preferiblemente afatinib, lapatinib y/o neratinib. Dicho inhibidor de PI3Ka es preferiblemente BYL719. En una realización, dicho inhibidor de Akt es m K-2206. En una realización preferida, dicho inhibidor de mTOR es everolimus. En una realización preferida, dicho inhibidor de Src es saracatinib. En una realización preferida, dicho fármaco disruptor de microtúbulos es paclitaxel. En una realización preferida, dicho inhibidor de HDAC es vorinostat.
Dicho tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 es preferiblemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o melanoma. Aún más preferiblemente, dicho tumor es cáncer de mama. En una realización, dicho tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 tiene menos de 1.000.000 receptores de superficie celular ErbB-2 por célula tumoral.
En una realización, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención que se combina con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos y un inhibidor de HDAC, preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de Src, vorinostat y paclitaxel, más preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat y paclitaxel, normalmente es capaz de reducir una función de receptor inducida por ligando, preferiblemente crecimiento inducido por ligando, de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB- 2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3. En una realización preferida, la afinidad (KD) de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2. La afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. La afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2 es preferiblemente menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM.
En una realización preferida, un anticuerpo de acuerdo con la invención que se combina con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos y un inhibidor de HDAC, preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de Src, vorinostat y paclitaxel, más preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat y paclitaxel, comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180o R181.
En una realización preferida, un anticuerpo de acuerdo con la invención que se combina con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos y un inhibidor de HDAC, preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de Src, vorinostat y paclitaxel, más preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat y paclitaxel, comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste en R426 y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de 11.2 Á desde R426 en la proteína ErbB-3 nativa.
Preferiblemente, un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende al menos la secuencia CDR3, preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, y/o que comprende al menos la secuencia CDR3, preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37 se combina con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos y un inhibidor de HDAC, preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de Src, vorinostat y paclitaxel, más preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat y paclitaxel
En una realización preferida un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención comprende:
- una secuencia de la región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, o MF3003, y
- una secuencia de región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074, se combina con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos y un inhibidor de HDAC, preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de Src, vorinostat y paclitaxel, más preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat y paclitaxel. En una realización preferida, anticuerpo PB4188 se combina con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos y un inhibidor de HDAC, preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de Src, vorinostat y paclitaxel, más preferiblemente con al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat y paclitaxel.
Las realizaciones preferidas de la invención proporcionan anticuerpos de acuerdo con la invención para uso bajo condiciones de estrés por herregulina. La herregulina es un factor de crecimiento que participa en el crecimiento de células tumorales positivas para ErbB-3. Normalmente, cuando las células tumorales expresan altos niveles de herregulina (denominado estrés por herregulina), las terapias actualmente conocidas como trastuzumab, pertuzumab y lapatinib ya no son capaces de inhibir el crecimiento tumoral. Este fenómeno se llama resistencia a la herregulina. Sin embargo, sorprendentemente, un anticuerpo de acuerdo con la invención también es capaz de contrarrestar el crecimiento de células tumorales que expresan niveles elevados de herregulina. Como se utiliza en este documento, un nivel de expresión de herregulina se considera alto si una célula tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7. Los niveles de expresión de herregulinas por ejemplo se miden utilizando qPCR con ARN tumoral (tal como, por ejemplo, se describe en Shames et al. PLOS ONE, febrero de 2013, Vol.8, Emisión 2, pp 1-10 y en Yonesaka et al., Sci.transl.Med., Vol.3, Emisión 99 (2011); pp1-11), o utilizando métodos de detección de proteínas, como por ejemplo ELISA, preferiblemente utilizando muestras de sangre, plasma o suero (tal como por ejemplo se describe en Yonesaka et al., Sci.transl.Med., Vol.
3, Emisión 99 (2011); págs.1-11). Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que dichas células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2. También se divulga un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que las células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Un aspecto preferido proporciona un uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que las células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7. Dicho tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB- 2/ErbB-3 es preferiblemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o melanoma. Aún más preferiblemente, dicho tumor es cáncer de mama. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o melanoma, preferiblemente cáncer de mama, en el que las células de dicho cáncer tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2.
Los niveles altos de herregulina están normalmente presentes durante la formación de metástasis (es decir, migración, invasión, crecimiento y/o diferenciación de células tumorales o células iniciadoras de tumores). Normalmente, las células iniciadoras de tumores se identifican en base a marcadores de células madre como, por ejemplo, CD44, CD24, CD133 y/o ALDH1. Por lo tanto, estos procesos apenas se pueden contrarrestar con terapias actualmente conocidas como trastuzumab y pertuzumab. Dado que un anticuerpo de acuerdo con la invención es capaz de contrarrestar el crecimiento y/o la diferenciación de células tumorales o células iniciadoras de tumores que expresan niveles elevados de herregulina, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención también es particularmente adecuado para contrarrestar la formación de metástasis. Por lo tanto se divulga adicionalmente un método para contrarrestar la formación de una metástasis en un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que dicha célula de tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7, comprende administrar al sujeto un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB- 2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3. También se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para uso en el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en el que dicha célula de tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7. Se divulga adicionalmente un uso de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en el que dicha célula de tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7. Dicho tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 es preferiblemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o melanoma. Aún más preferiblemente, dicho tumor es cáncer de mama. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para uso en el tratamiento o prevención de la formación de metástasis de cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer de gastroesófago, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o células de melanoma, preferiblemente células de cáncer de mama, en el que dichas células tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7. Dicho anticuerpo de acuerdo con la presente invención normalmente es capaz de reducir una función de receptor inducida por ligando, preferiblemente crecimiento inducido por ligando, de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3. En una realización preferida, la afinidad (KD) de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2. La afinidad de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM. La afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2 es preferiblemente menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM.
En una realización preferida, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181.
En una realización preferida, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención preferiblemente comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste en R426 y residuos de aminoácidos expuestos a superficie que se ubican dentro de 11.2 A desde R426 en la proteína ErbB-3 nativa.
Una realización preferida proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 en el que las células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7, en el que dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3, preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, o al menos la secuencia de región variable de cadena pesada, de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E.
Una realización preferida proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso en un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 en el que las células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7, en el que dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3, preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, o al menos la secuencia de región variable de cadena pesada, de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37. Una realización proporciona anticuerpo PB4188 para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que las células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7.
Como ya se ha descrito, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuados para tratar células tumorales positivas para ErbB-2 con menos de 1.000.000 receptores de ErbB-2 sobre su superficie celular. Los pacientes con estos tumores, que normalmente se clasifican como ErbB-2 [++] o ErbB-2 [+], incluyen pacientes con tumores primarios, así como pacientes con tumores positivos a ErbB-2 recidivantes. Las terapias actualmente utilizadas, tales como trastuzumab (Herceptina) y pertuzumab, solo se prescriben a pacientes con células positivas para ErbB-2 malignas que tienen más de 1.000.000 receptores de ErbB-2 sobre su superficie celular, que se clasifican como ErbB-2.
[+++]. Por tanto, los pacientes clasificados como ErbB-2 [++] o ErbB-2 [+] se tratan preferiblemente con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo para uso de acuerdo con la invención, en el que dicho sujeto tiene un tumor positivo para ErbB-2 o ErbB-2/ErbB-3 que tiene menos de 1.000.000 receptores de superficie celular ErbB- 2 por célula tumoral. Una realización preferida proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para uso en el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en el que dicha célula de tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7, y en el que dicha célula de tumor tiene menos de 1.000.000 receptores de superficie celular ErbB-2.
En otra realización preferida, se utiliza un anticuerpo de acuerdo con la invención para contrarrestar un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 en un sujeto que tiene una función cardíaca deteriorada, o que está en riesgo de la misma. Con una función cardíaca deteriorada se entiende que el sujeto tiene una función cardíaca, tal como por ejemplo la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF), que es menor que el 90%, preferiblemente menor que el 85% o menor que el 80%, preferiblemente menor que el 75% o menor que el 70%, en comparación con una función cardíaca saludable. Dicha función cardíaca sana es, por ejemplo, la función cardíaca media (tal como por ejemplo la LVEF promedio) de la población sana. Alternativamente, dicha función cardíaca sana es la función (tal como la LVEF) medida en un paciente antes del inicio de la terapia antitumoral con un anticuerpo de acuerdo con la invención.
La función cardíaca se monitoriza, por ejemplo, mediante un examen físico del sujeto y mediante un examen de la LVEF, utilizando, por ejemplo, un ecocardiograma o una exploración MUGA.
ErbB-2 está implicado en el crecimiento, reparación y supervivencia de cardiomiocitos adultos como parte de una red de señalización que implica el complejo del receptor de herregulina HER2: HER4. Como se describió anteriormente en el presente documento, la cardiotoxicidad es un factor de riesgo conocido en las terapias dirigidas a ErbB-2 y la frecuencia de complicaciones aumenta cuando se utiliza trastuzumab junto con antraciclinas, lo que induce estrés cardíaco. Por ejemplo, la combinación de doxiciclina con trastuzumab induce efectos secundarios cardíacos graves. A pesar del creciente número de casos clínicos de disfunción cardíaca inducida por trastuzumab, se desconoce su mecanismo de acción. En vista de la cardiotoxicidad de las terapias actualmente conocidas contra tumores positivos a ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, es especialmente ventajoso utilizar un anticuerpo de acuerdo con la invención. Como se muestra en los Ejemplos, ahora se han proporcionado anticuerpos que no afectan, o en un grado significativamente menor en comparación con trastuzumab y pertuzumab, la supervivencia de los cardiomiocitos. Esto proporciona una ventaja importante ya que se reduce la cardiotoxicidad. Esto ya es ventajoso para las personas que no padecen una función cardíaca deteriorada, y más aún para las personas que padecen de una función cardíaca deteriorada, tal como, por ejemplo, los sujetos que padecen insuficiencia cardíaca congestiva (ICC), disfunción ventricular izquierda (LVD)) y/o una Fracción de Eyección Ventricular Izquierda (LVEF) disminuida y/o sujetos que han tenido un infarto de miocardio. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o Erb-2/ErbB-3, en el que dicho sujeto tiene una función cardíaca que es menor que 90 %, preferiblemente menor que 85 % o menor que 80 % o menor que 75 % o menor que 70 %, cuando se compara con una función cardíaca saludable. Dicha función cardíaca preferiblemente incluye la LVEF. Dicho tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 es preferiblemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o melanoma. Aún más preferiblemente, dicho tumor es cáncer de mama. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3. Una realización preferida proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para uso en un método de acuerdo con la invención para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 en el que el sujeto tiene una función cardíaca que es menor que 90 %, preferiblemente menor que 85 %, preferiblemente menor que 80 %, preferiblemente menor que 75 % o menor que 70 %, cuando se compara con una función cardíaca saludable, en el que dicho anticuerpo comprende:
- al menos la secuencia CDR3, preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, o al menos la secuencia de región variable de cadena pesada, de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2926, MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, de las secuencias mencionadas de la región variable de la cadena pesada; y/o - al menos la secuencia CDR3, preferiblemente al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, o al menos la secuencia de región variable de cadena pesada, de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos, más preferiblemente en a lo sumo 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, de las secuencias mencionadas de la región variable de la cadena pesada. En una realización preferida, dicho anticuerpo es PB4188.
En una realización, dicho anticuerpo biespecífico es para uso en el tratamiento de un sujeto bajo condiciones de estrés de herregulina, como se explica con más detalle en otra parte. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que dicho sujeto tiene una función cardíaca que es menor que 90 %, preferiblemente menor que 85 %, preferiblemente menor que 80 %, preferiblemente menor que 75 % o menor que 70 %, cuando se compara con una función cardíaca saludable, y en el que dichas células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7. Dicha función cardíaca preferiblemente incluye la LVEF. También se divulga un método para el tratamiento de un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que el sujeto tiene una función cardíaca que es menor que 90 %, preferiblemente menor que 85 %, preferiblemente menor que 80 %, preferiblemente menor que 75 %, preferiblemente menor que 70 %, cuando se compara con una función cardíaca saludable, y en la que las células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7, el método comprende administrar al sujeto un anticuerpo biespecífico o composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Un aspecto preferido divulga un uso de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 en un sujeto que tiene una función cardíaca, preferiblemente a LVEF, que es menor que 90 %, preferiblemente menor que 85 %, preferiblemente menor que 80 %, preferiblemente menor que 75 % o menor que 70 %, cuando se compara con una función cardíaca saludable, preferiblemente una LVEF saludable, en la que las células de dicho tumor tienen un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7.
También se proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 para uso en el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en la que dicho sujeto tiene una función cardíaca que es menor que 90 %, preferiblemente menor que 85 %, preferiblemente menor que 80 %, preferiblemente menor que 75 %, preferiblemente menor que 70 % cuando se compara con una función cardíaca saludable. Se divulga adicionalmente un uso de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la formación de metástasis, en el que dicho sujeto tiene una función cardíaca que es menor que 90 %, preferiblemente menor que 85 %, preferiblemente menor que 80 %, preferiblemente menor que 75 %, preferiblemente menor que 70 % cuando se compara con una función cardíaca saludable. Dicho tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 es preferiblemente cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colonrectal, cáncer de colon, cáncer gastroesofágico, cáncer de esófago, cáncer endometrial, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de célula no microcítica, sarcoma de células claras, cáncer de glándulas salivales, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de piel, o melanoma. Aún más preferiblemente, dicho tumor es cáncer de mama. Dicha función cardíaca preferiblemente incluye la LVEF. En una realización preferida, dicho anticuerpo es anticuerpo PB4188.
En otra realización, se hace uso anticuerpos de acuerdo con la invención para contrarrestar la fosforilación de diversos factores de la ruta de supervivencia Akt (también denominada ruta de la quinasa PI3) y la ruta de la quinasa MAP. Estas son rutas de señalización proproliferativas en dirección descendente de HER3. Sorprendentemente, los inventores han logrado inhibir significativamente la fosforilación de la proteína ribosómica Akt, ERK1/2 y S6 (S6-RP) con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, mientras que trastuzumab y pertuzumab no tienen estos fuertes efectos antifosforilación. Es ventajoso contrarrestar la fosforilación de factores de las rutas proproliferativas de PI3 quinasa y MAP quinasa, ya que esto contrarresta el crecimiento de una célula tumoral positiva para ErbB-3. Por lo tanto, se proporciona adicionalmente un uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para contrarrestar, preferiblemente inhibir, la fosforilación de Akt, ERK1/2 y/o S6-RP. Es importante destacar que la fosforilación de Akt se puede reducir significativamente o incluso bloquear completamente con un anticuerpo de la invención, tanto in vitro como in vivo, como se muestra en los Ejemplos. Por lo tanto, una realización preferida proporciona un uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para contrarrestar, preferiblemente inhibir, fosforilación de Akt. También se proporciona un uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para contrarrestar la formación de un complejo HER3-p85. Dado que la formación de un complejo HER3-p85 es la primera fase en la activación de Akt, es ventajoso contrarrestar la formación de dicho complejo HER3-p85. Dicho anticuerpo de acuerdo con la invención es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3. Dicho anticuerpo preferiblemente comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181. Adicionalmente, o alternativamente, dicho anticuerpo preferiblemente comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste en F409 y R426 y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de 11.2 A desde R426 en la proteína ErbB-3 nativa. En una realización, dicho anticuerpo comprende al menos una secuencia CDR1, CDR2 y CDR3, o al menos una secuencia VH, como se representa en la Figura 16 o Figura 37. En una realización, dicho anticuerpo es PB4188.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Titulación de antígeno sobre HER2 monomérico de un panel de brazos de HER2 que también están presentes en anticuerpos biespecíficos HER2xHER3 activos en combinación con un brazo de PG3178. Todos los monoclonales HER2 del panel He R2xHER3 excepto PG3025 se probaron sobre un ELISA de titulación de antígeno HER2.
Figura 2: Actividad funcional de anticuerpos biespecíficos HER2 x HER3 sobre células BxPC3 con o sin estimulación de ligando. Las líneas punteadas representan la actividad de trastuzumab, el anticuerpo de referencia en este ensayo, con o sin estimulación del ligando.
Figura 3: Curvas de titulación de anticuerpos monoclonales HER2 y HER3 (panel superior) y anticuerpos biespecíficos HER2 x HER3 de los mismos (panel inferior) en el ensayo MCF-7.
Figura 4: Efecto del tratamiento con anticuerpos sobre el tamaño del tumor BxPC3-luc2 el día 31 en un modelo de murino ortotópico. BLI, crecimiento tumoral medido por bioluminiscencia.
Figura 5: Efecto del tratamiento con anticuerpos sobre el tamaño del tumor BxPC3-luc2 en el día 31 en un modelo de murino ortotópico. BLI, crecimiento tumoral medido por bioluminiscencia.
Figura 6: Análisis FACS de un anticuerpo HER2xHER3 biespecífico y sus anticuerpos monoclonales parentales en células que expresan MCF-7 y BxPC3-luc2 h ER2. MFI, intensidad de fluorescencia media.
Figura 7: Caracterización analítica por HP-SEC y CIEX-HPLC. PB4188 (panel superior), anticuerpo monoclonal parental anti-HER2 (panel central), IgG de referencia monoclonal anti-RSV (panel inferior).
Figura 8: Inhibición de la proliferación de células JIMT-1 en agar blando mediante una titulación en serie de anticuerpos. Figura 9: Inhibición de la proliferación de células BT-474 (panel superior) y SKBR3 (panel inferior) en matrigel mediante una titulación en serie de anticuerpos.
Figura 10a: Proliferación y ramificación/invasión inducidas por HRG de células SKBR-3 en matrigel.
Figura 10b: Inhibición de la proliferación y ramificación/invasión inducidas por HRG de células SKBR-3 en matrigel por PB4188 en contraste con los anticuerpos monoclonales parentales.
Figura 10c: inhibición de la proliferación inducida por HRG y la ramificación/invasión de células SKBR-3 en matrigel por PB4188 en contraste con los anticuerpos monoclonales anti-HER3.
Figura 10d: Inhibición de la proliferación y ramificación/invasión inducidas por HRG de células SKBR-3 en matrigel por PB4188 en contraste con combinaciones de anticuerpos monoclonales anti-HER3 con trastuzumab.
Figura 10e: Inhibición de la proliferación y ramificación/invasión inducidas por HRG de células SKBR-3 en matrigel por PB4188 y la combinación PB4188 más trastuzumab.
Figura 11: Actividad inhibidora superior de PB4188 en células HER2+++ N87 en presencia de 100 ng/ml de HRG.
Figura 12: Actividad de ADCC de PB4188 y PB3448 en una titulación de dosis.
Figura 13: Actividad de ADCC aumentada del anticuerpo biespecífico en comparación con los anticuerpos parentales monoclonales o una combinación de los mismos.
Figura 14: Actividad de ADCC de PB4188 afucosilado en comparación con trastuzumab sobre células que expresan HER2 bajo (panel superior) y alto (panel inferior).
Figura 15: Actividad de ADCC de PB4188 afucosilado en células SKBR-3 HER2+++ en presencia de células informadoras que expresan una variante de FcyR alta o baja.
Figura 16: Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de cadenas VH, cadena ligera común y cadenas pesadas de anticuerpos de la invención. Cuando en esta figura se indica una secuencia líder, ésta no es parte de la cadena VH o del anticuerpo, pero normalmente se divide durante el procesamiento de la proteína en la célula que produce la proteína. Figura 17: Efecto del tratamiento con anticuerpos sobre el tamaño del tumor en un modelo de xenoinjerto murino JIMT-1. Crecimiento del tumor medido mediante la medición del calibre del volumen del tumor de los diferentes grupos de tratamiento. Arriba, crecimiento tumoral durante 60 días; inhibición del crecimiento del tumor inferior (TGI) al final del período de tratamiento (29 días).
Figura 18: Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de los diferentes grupos de tratamiento en el modelo de xenoinjerto de murino JIMT-1.
Figura 19: Inhibición del crecimiento impulsado por el ligando N87. La proliferación de N87 impulsada por HRG puede superarse en una amplia gama de HRG por PB4188 en contraste con el anticuerpo anti-HER3 parental. Los datos se muestran a una concentración de anticuerpos de 40 ng/ml.
Figura 20: Medidas de afinidad celular en estado estacionario de IgG HER2xHER3 (PB4188) marcado con 125I hacia células BT-474 (arriba; tres ensayos independientes) y células SK-BR-3 (abajo; tres ensayos independientes). La unión no específica se determinó utilizando un exceso de 100 veces de HER2xHER3 no marcado.
Figura 21A: Mapeo de epítopos HER2. Los residuos críticos identificados se representan como esferas negras sobre la estructura cristalina de HER2, los residuos críticos secundarios identificados se representan como esferas grises (PDB ID # 1S78).
Figura 21B
a) Estructura cristalina de HER2 (PDB # 1S78) que muestra residuos del epítopo PG3958 verificados como esferas de color gris claro y residuos circundantes (+/- cinco residuos de aminoácidos) como esferas de color gris oscuro. b) Superficie expuesta al solvente de la región del epítopo que muestra residuos de epítopo verificados en gris y residuos circundantes (+/- cinco residuos) en negro. c) Vista detallada de la región del epítopo con residuos de epítopo verificados en gris claro y residuos circundantes (+/- cinco residuos) en gris oscuro. d) Secuencia de aminoácidos primaria de la región del epítopo de HER2 PG3958 que indica restos epítopos verificados (subrayado en gris), restos circundantes (negro) y restos distantes (cursiva gris, no mostrados en a, b y c). Las figuras y los análisis se realizaron con Yasara (www.yasara.org).
Figura 21C:
a) Estructura cristalina de HER3 (PDB # 4P59) que muestra el residuo de epítopo Arg 426 en esferas grises y todos los residuos expuestos en la superficie dentro de un radio de 11.2 A de Arg 426 en esferas negras. b) Superficie expuesta al solvente de la región del epítopo con Arg 426 y residuos distantes mostrados en gris y todos los residuos expuestos a la superficie dentro de un radio de 11.2 A de Arg 426 mostrados en negro. c) Residuos en la región del epítopo Arg 426 en gris claro y residuos circundantes (todos marcados) en gris oscuro. Las figuras y los análisis se realizaron con Yasara (www.yasara.org).
Figura 22: Confirmación de residuos de unión críticos para el brazo 3958 de Fab a HER2. El trastuzumab se incluyó como anticuerpo de control. La unión se determinó en una titulación FACS y la unión se expresa como AUC en comparación con la unión de trastuzumab. D143Y no se considera parte del epítopo 3958 ya que la unión de Trastuzumab a este mutante también está bloqueada.
Figura 23: Residuos críticos para la unión de PG3178 representados en la estructura cristalina de HER3. Los residuos críticos identificados para la unión de PG3178 se representan como esferas negras sobre la estructura cristalina de HER3 (PDB ID # 4P59).
Figura 24: Confirmación de R426 como residuo de unión crítico para PG3175 a HER3. Se incluyeron dos anticuerpos anti-HER3 como anticuerpos de control. La unión se determinó en una titulación FACS y la unión se expresa como AUC en comparación con la unión a WT HER3.
Figura 25: Ausencia de toxicidad por PB4188 bajo estrés cardíaco in vitro. Incubación de cardiomiocitos con PB4188 o anticuerpos de referencia monoespecíficos en presencia de 3 pM de antraciclina doxorrubicina. La viabilidad de los cardiomiocitos se determinó mediante cuantificación de ATP y se expresó en unidades de luz relativas (RLU). T, trastuzumab; P, pertuzumab.
Figura 26: Unión de PB4188 en comparación con trastuzumab y un anticuerpo HER3 a células amplificadas con HER2. Las valoraciones FACS se realizaron sobre las estirpes celulares indicadas que expresan diferentes niveles de HER2. El área bajo la curva de la Mediana de los valores de la señal de PE se graficó por estirpe celular.
Figura 27: Unión de una titulación en serie de PB4188FITC a células SKBR-3 preincubadas con una concentración saturada de PB4188, trastuzumab o un anticuerpo de control negativo. PB4188FITC se une con la misma eficacia a SKBR-3 en presencia de trastuzumab o anticuerpo de control.
Figura 28: Inhibición de la proliferación celular bajo condiciones de estrés de HRG por anticuerpos biespecíficos de HER2xHER3 compuestos por el mismo brazo Fab de HER3 y diferentes brazos de HER2 que se dirigen contra los cuatro dominios HER2.
Figura 29: Combinación sinérgica de PB4188 con lapatinib sobre el crecimiento y morfología de las células SKBR-3. Izquierda, vistas microscópicas de células tratadas bajo diferentes condiciones; cambios morfológicos a la derecha representados gráficamente en relación con las condiciones de tratamiento.
Figura 30A+B: Inhibición de la fosforilación mediada por HRG de células N87 y SKBR-3 por PB4188 en un experimento de curso temporal. Se incluyeron como controles trastuzumab pertuzumab y HRG solos.
Figura 31: Inhibición de la fosforilación mediada por HRG de células N87 por PB4188 en un experimento de curso temporal. Se incluyeron como controles trastuzumab pertuzumab y lapatinib.
Figura 32: Se evaluaron los cambios en los niveles de Akt y la fosforilación de Akt 4 H después de una dosis de PB4188 de dos a cuatro semanas. Los niveles de fosforilación en lisados tumorales se evaluaron mediante ensayos Luminex. Los análisis se realizaron por duplicado y se analizaron cinco tumores por grupo.
Figura 33: Efecto mediado in vivo de PB4188 sobre la señalización mediada por HER2: HER3 según se analiza mediante análisis Vera Tag sobre material tumoral JIMT-1. Los tumores se analizaron 4 H después de la dosificación, los tumores derivados de animales tratados con PBS se incluyeron como controles.
Figura 34: PB4188 reduce la progresión del ciclo celular. Las células sembradas en el medio de ensayo se incubaron con titulación de anticuerpos en presencia de una concentración estándar (1 ng/ml) o alta (100 ng/ml) de HRG. 24 h más tarde (o 48 h para las células MCF-7), se analizó la distribución de las células en las diferentes fases del ciclo celular (fases G0/G1, S o G2/M). El índice de proliferación se calculó como la relación entre el porcentaje de células en las fases S y G2/M y el porcentaje de células en la fase G0/G1. P+T, pertuzumab trastruzumab.
Figura 35: Internalización de anticuerpos marcados con colorante sensible al pH en células cancerosas que sobreexpresan HER2. Se incubaron N87 (A, B) y SKBR-3 (C, D) sembrados en medio de ensayo suplementado con 1 ng/ml de HRG durante 24 horas con anticuerpos marcados con colorante sensibles al pH 100 nM. Después de la recolección, las células se tiñeron con anticuerpo secundario IgG antihumano marcado con APC para detectar anticuerpos unidos a la superficie celular. Las células se analizaron mediante FACS para determinar la fluorescencia en los canales PE (A, C) para determinar la internalización y los canales APC (B, D) para determinar la unión a la superficie de los anticuerpos.
Figura 36: Actividad de ADCC de Trastuzumab versus Trastuzumab Pertuzumab con células derivadas de dos donantes diferentes.
Figura 37: Alineamientos de aminoácidos y nucleótidos de las variantes de F3178. Se indican las regiones CDR.
Figura 38: Curvas de titulación de anticuerpos monoclonales HER3 en el ensayo N87 dependiente de HRG. PG6058, PG6061 y PG6065 son variantes de PG3178. PG1337 es un control negativo específico para el toxoide tetánico. Los datos se normalizaron a la proliferación basal con ligando presente sobre cada placa.
Figura 39: Perfiles CIEX-HPLC de anticuerpos monoclonales HER3. PG6058, PG6061 y PG6065 son variantes de PG3178. El punto isoeléctrico calculado (pI) de la región VH y el tiempo de retención (tR) del pico principal se dan para cada anticuerpo.
Figura 40: Isobologramas de combinación de fármacos in vitro con PB4188 en estirpes celulares amplificadas con HER2 a concentraciones de estrés de HRG (A) o cultivadas en matrigel (B).
Ejemplos
Métodos, materiales y cribado de anticuerpos:
Estirpes celulares
Las estirpes celulares BxPC-3-luc2 (Perkin Elmer 125058), N87 (ATCC® CRL-5822™), SK-BR-3 (ATCC® HTB-30™), BT-474 (ATCC® HTB-20™), JIMT-1 (DSMZACC 589), L929 (Sigma Aldrich 85011425), K562 (DSMZ ACC10), HEK293T (ATCC® -CRL-11268™), CHO-K1(DSMZ ACC110), MCF-7 (DSMZ ACC 115), MDA-MB-468 (#300279-513, Cell line services) SK-OV-3 (ATCC ® HTB-77™), MDA-MB-175 (ATCC-HTB-25), MDA-MB-453 (ATCC-HTB-131), MDA-MB-361(ATCC-HTB-27), ZR-75-1 (ATCC-CRL-1500) y MKN-45 (DSMZ ACC409) se adquirieron de ATCC, DSMZ o Sigma Aldrich y se mantuvieron rutinariamente en medio de crecimiento suplementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 10%. Se obtuvieron células HEK293F FreeStyle de Invitrogen y se mantuvieron de forma rutinaria en medio 293 FreeStyle.
Generación de vectores de dominio humano, de pollo, rata y de dominio intercambiado recombinante (clonación de HER) HER2 humano. Se amplificó HER2 humano de longitud completa mediante PCR a partir de ADNc derivado de ARN aislado de la estirpe celular de cáncer de mama JIMT-1. Los cebadores utilizados para la amplificación de HER2 humano fueron los siguientes. Cebador directo: AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTTGTGC Cebador inverso: AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG. El producto amplificado de longitud completa se digirió con Nhel y Xbal y posteriormente se clonó en los sitios correspondientes de pcDNA3.1 (Invitrogen).
La secuencia se verificó mediante comparación con la Secuencia de Referencia NCBI NM_004448.2. Para generar construcciones que expresan únicamente el dominio extracelular (ECD) de HER2 humano con fines de transfección e inmunización, el dominio transmembrana de HER2 y el ECD se amplificaron por PCR y se volvieron a clonar en pVax1. Para propósitos de transfección, se generó otra construcción en pDisplay al amplificar el dominio ECD de HER2, en esta construcción, el dominio ECD de HER2 se fusiona con el dominio transmembrana de PDGFR.
HER3 humano. El clon de ADNc humano de longitud completa de HER3 se obtuvo de Origene. Para generar construcciones que expresan únicamente el ECD de HER3 humano con fines de transfección e inmunización, el dominio transmembrana de HER3 y el ECD se amplificaron por PCR y se reclonaron en pVax1. Además, se generó otra construcción en pVax1 mediante la cual el dominio ECD de HER3 se fusionó con el dominio transmembrana de PDGFR. Todas las secuencias se verificaron mediante comparación con la Referencia NCBI NM_001982.3
El dominio extracelular de Cynomolgus HER2 se amplificó por PCR a partir de tejido de colon normal de mono) - ADNc de cynomolgus (Biochain). Los cebadores utilizados para la amplificación de cynomolgus HER2 fueron los siguientes: Cebador directo: AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGGCCTGGTAC Cebador inverso: AATAATTCTAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG. El producto amplificado de longitud completa se digirió con NheI-Xbal y posteriormente se clonó en los sitios correspondientes de pcDNA3.1. El clon se secuenció y se alineó con secuencias disponibles de monos rhesus (XM_002800451) para comprobar la corrección del clon ErbB-2.
El dominio extracelular de Cynomolgus HER3 se amplificó por PCR a partir de tejido de colon normal de mono) - ADNc de cynomolgus (Biochain). Los cebadores utilizados para la amplificación de cynomolgus HER3 fueron los siguientes: cebador directo: AAGCTGGCTAGCACCATGAGGGCGAACGGCGCTCTG, Cebador inverso: AATAATTCTAGATTACGTTCTCTGGGCATTAGC. El producto amplificado de longitud completa se digirió con NheI-Xbal y posteriormente se clonó en los sitios correspondientes de pcDNA3.1 El clon se secuenció y alineó con secuencias disponibles de monos rhesus (ENSMMUP00000027321) para comprobar la corrección del clon HER3.
La secuencia de HER2 de pollo se basó en la secuencia de referencia NM_001044661.1. Se generaron construcciones de dominios intercambiados quiméricos al intercambiar los dominios I a IV de la secuencia de HER2 de pollo por los dominios I humanos I a IV. Las secuencias que contienen una etiqueta myc se optimizaron para la expresión en células de mamíferos y se sintetizaron en Geneart.
La secuencia de HER3 de rata se basó en la secuencia de referencia NM_001044661.1. Se generaron construcciones de dominios intercambiados quiméricos al intercambiar los dominios I a IV de la secuencia de HER3 de rata por los dominios I humanos I a IV. Las secuencias que contienen una etiqueta myc se optimizaron para la expresión en células de mamíferos y se sintetizaron en Geneart.
Generación de estirpes celulares que sobreexpresan HER2 y HER3
Para generar estirpes celulares que expresan altos niveles de HER3 sobre la superficie celular, se generó un vector de expresión de mamífero al dividir el HER3 de longitud completa mediante digestión con NotI y KpnI. Posteriormente se clonó el fragmento en los sitios correspondientes del vector pcDNA3.1(-)/hygro. Se utilizó un vector de expresión de HER2 y HER3 de longitud completa que codifica un gen de resistencia a la neomicina para generar estirpes celulares que expresan altos niveles de HER2 sobre la superficie celular. Antes de la transfección, los plásmidos se linealizaron mediante digestión con SSpI y Fspl. Ambos vectores se transfectaron por separado en células K562 y se generaron conjuntos estables después de la selección de antibióticos. Las estirpes celulares resultantes (K562-HER2 y K562-HER3) expresaron altos niveles de HER2 y HER3 sobre su superficie celular.
Inmunizaciones
Inmunizaciones de HER2. Se aplicaron cuatro estrategias de inmunización diferentes. Para la cohorte #A, se inmunizaron seis ratones C57Bl/6 con 2 x 106 células L929 transfectadas transitoriamente con HER2 en 200 pl mediante inyección intraperitoneal. Posteriormente, los ratones se reforzaron con 20 pg de proteína Erbb-2-Fc (RND Systems) disueltos en 125 pl de Titermax Gold mediante inyección intraperitoneal el día 14, seguido de refuerzos con 2 x 106 células L929 transfectadas transitoriamente con HER2 en 200 pl en los días 28 y 42. Para la cohorte #C, se inmunizaron seis ratones C57Bl/6 con 2 x 106 células L929 transfectadas transitoriamente con HER2 mediante inyección intraperitoneal. Posteriormente, los ratones fueron reforzados con 2 x 106 células L929 transfectadas transitoriamente con HER2 en 200 pl mediante inyección intraperitoneal el día 14, seguido de un refuerzo proteico con 20 pg de proteína Erbb-2-Fc disueltos en 125 pl de Titermax Gold mediante inyección intraperitoneal el día 35 y un refuerzo final con 20 pg de proteína Erbb-2-Fc disueltos en 200 pl de PBS mediante inyección intraperitoneal el día 49. Para la cohorte #E, seis ratones C57Bl/6 se inmunizaron con 20 pg de proteína Erbb-2-Fc disueltos en 125 pl de Titermax Gold mediante inyección intraperitoneal. Posteriormente, se realizaron refuerzos proteicos con 20 pg de proteína Erbb-2-Fc disueltos en 125 pl de Titermax Gold mediante inyección intraperitoneal los días 14 y 28 y un refuerzo final con 20 pg de proteína Erbb-2-Fc disueltos en 200 pl de PBS mediante inyección intraperitoneal el día 42. Para la cohorte #G, se inmunizaron seis ratones C57Bl/6 mediante vacunación con ADN en Genovac (Freiburg, Alemania) de acuerdo con sus protocolos. Los vectores proporcionados libres de endotoxina utilizados para la vacunación con ADN codificaron la parte transmembrana y extracelular de HER2 clonado en pVax1. Posteriormente, se administraron refuerzos de ADN los días 14, 28 y 66.
Inmunizaciones HER3. Se aplicaron cuatro estrategias de inmunización diferentes. Para la cohorte #B, se inmunizaron seis ratones (C57Bl/6) con 2 x 106 células L929 transfectadas transitoriamente con HER3 en 200 pl mediante inyección intraperitoneal. Posteriormente, los ratones fueron reforzados con 2 x 106 células L929 transfectadas transitoriamente con HER3 en 200 pl los días 14, 28, 49 y 63. Para la cohorte #D, se inmunizaron seis ratones C57Bl/6 con 2 x 106 células L929 transfectadas transitoriamente con HER3 mediante inyección intraperitoneal los días 0, 14 y 28. Posteriormente, los ratones se reforzaron con 20 pg de proteína Erbb-3-Fc disueltos en 125 pl de Titermax Gold mediante inyección intraperitoneal el día 49 y un refuerzo final con 20 pg de proteína Erbb-3-Fc disueltos en 200 pl de PBS mediante inyección intraperitoneal el día 66. Para la cohorte #F, se inmunizaron seis ratones C57Bl/6 con 20 pg de proteína Erbb-3-Fc disueltos en 125 pl de Titermax Gold mediante inyección intraperitoneal. Posteriormente, los ratones se reforzaron con 20 pg de proteína Erbb-3-Fc disueltos en 125 pl de Titermax Gold mediante inyección intraperitoneal los días 14 y 28 y se dio un refuerzo final con 20 pg de proteína Erbb-3-Fc disueltos en 200 pl de PBS mediante inyección intraperitoneal el día 42. Para la cohorte # H, se inmunizaron seis ratones C57Bl/6 mediante vacunación con ADN en Genovac (Freiburg, Alemania) de acuerdo con sus protocolos. Los vectores proporcionados libres de endotoxina utilizados para la vacunación con ADN codificaron la transmembrana de PDGFR y la parte extracelular de HER3 clonada en pVax1. Posteriormente, se administraron refuerzos de ADN en los días 14, 28 y 66.
Determinación de los títulos de anticuerpos.
Los títulos de anti-HER2 en el suero de ratones C57Bl/6 inmunizados se determinaron mediante ELISA contra la proteína ECD-Erbb-2 (Bendermedsystems) y análisis FACS en el K562 negativo para HER2, la estirpe celular de baja expresión de HER2 MCF-7 y HER2 células Sk BR-3 y BT-474 amplificadas con He R2. Los títulos de anti-HER3 en el suero de ratones C57Bl/6 inmunizados se determinaron mediante ELISA contra la proteína Erbb-3-Fc y análisis FACS sobre el K562 negativo para HER3, la estirpe celular de baja expresión de HER2 m CF-7 y células SKBR-3 y BT-474 amplificadas con HER2.
Los títulos en suero contra HER2 y HER3 antes de sacrificar los animales se describen en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente. Los animales de todas las cohortes desarrollaron respuestas de anticuerpos contra HER2 o HER3.
Recuperación de tejido linfoide.
Se extrajeron el bazo y los ganglios linfáticos de drenaje de todos los ratones vacunados con ADN (cohortes #G y #H). Se generaron suspensiones de células individuales a partir de todos los tejidos y, posteriormente, los tejidos se lisaron en reactivo Trizol. A partir de las cohortes #A a #F se extrajeron los bazos de todos los ratones excepto un ratón de la cohorte #C que murió después del primer refuerzo. Se generaron suspensiones de células individuales a partir de todos los bazos y se aisló la fracción total de células B utilizando el procedimiento de separación MACS ya sea por enriquecimiento de CD19 (cohortes # A, E, F) o agotamiento de células no B (cohortes # B, C, D).
Generación de bibliotecas de presentación de fagos de ratones inmunizados
Se construyó una biblioteca de fagos para cada ratón. Con este fin, se utilizó el material de todos los ratones por grupo (5 o 6 ratones por grupo) para preparar bibliotecas de fagos utilizando el siguiente enfoque. De cada ratón individual se aisló ARN y se sintetizó ADNc y se realizaron PCR específicas de la familia VH. Posteriormente, se purificaron todos los productos de PCR de la familia VH por ratón y se determinó la concentración de ADN, se digirió y se ligó en un vector de presentación de fagos que contenía la cadena ligera común para generar una biblioteca de fagos quiméricos de ratón y humanos. Todas las bibliotecas de fagos contenían > 106 clones con una frecuencia de inserción de > 85 %.
Selección de fagos que portan fragmentos Fab que se unen específicamente a HER2 y HER3
Los fragmentos de anticuerpos se seleccionaron utilizando bibliotecas de presentación de fagos de anticuerpos. Para las selecciones se utilizaron bibliotecas inmunizadas y bibliotecas sintéticas (como se describe en de Kruif et al. Mol. Biol. (1995), 248, 97-105).
Selección y cribado del fago HER2
Se rescataron bibliotecas de fagos con el fago auxiliar VCS-M13 (Stratagene) y se seleccionaron para dos rondas en proteína recombinante recubierta con inmunotubos (Nunc). En la primera ronda, se recubrió con inmunotubos la proteína ECD-Erbb-2 (Bendermedsystems), mientras que en la segunda ronda se recubrió con los inmunotubos Erbb-2-Fc (RND Systems). Los inmunotubos se bloquearon con leche en polvo desnatada al 4% (ELK). Las bibliotecas de anticuerpos de fagos también se bloquearon con ELK al 4% antes de la adición de la biblioteca de fagos a los inmunotubos. La incubación con la biblioteca de fagos con la proteína recubierta en los tubos inmunitarios se realizó durante 2 horas a temperatura ambiente bajo condiciones de rotación. A continuación, se lavaron los inmunotubos de cinco a diez veces con Tween-20 al 0.05% en PBS seguido de 5 a 10 veces en PBS. Los fagos unidos se eluyeron utilizando glicina 50 mM (pH 2.2) y se agregaron a E. coli XL-1 Blue y se incubaron a 37 °C para infección por fagos. Posteriormente, las bacterias infectadas se sembraron en placas de agar que contenían ampicilina, tetraciclina y glucosa y se incubaron a 37 °C durante la noche. Después de la primera ronda, se rasparon las colonias de las placas y se combinaron y posteriormente se rescataron y amplificaron para preparar una biblioteca de primera ronda enriquecida. A continuación, la biblioteca enriquecida se seleccionó sobre Erbb-2-Fc (RND Systems) utilizando el protocolo descrito anteriormente. Después de la segunda ronda de selección, los clones individuales se recogieron y se rescataron para preparar una minipreparación monoclonal de fagos. Luego se identificaron los clones de fagos positivos que se unen a Erbb2 en FACS para unirse a la estirpe celular de cáncer de mama BT-474. Se secuenciaron los genes VH de todos los clones específicos de Erbb2. Los reordenamientos del gen VH se establecieron con el software VBASE2 para identificar clones únicos. A continuación, todos los clones únicos se probaron en formato de fagos para la unión en FACS a células HEK293T (control negativo), células HEK293T transfectadas transitoriamente con células ErbB-2 y BT-474.
Selección y cribado del fago HER3
Se rescataron bibliotecas de fagos con el fago auxiliar VCS-M13 (Stratagene) y se seleccionaron para dos rondas en inmunotubos (Nunc) recubiertos con proteína recombinante. En ambas rondas de selección, se recubrieron con Erbb-3-Fc (RND Systems) los inmunotubos. Para superar un sesgo de selección hacia la parte Fc de la proteína de fusión, se realizaron ambas rondas de selección sobre Erbb-3-Fc en presencia de 150 pg/ml de IgG humana. Los inmunotubos se bloquearon con ELK al 4%. Las bibliotecas de anticuerpos de fagos se bloquearon con ELK al 4% antes de la adición de la biblioteca de fagos a los inmunotubos. La incubación con la biblioteca de fagos se realizó durante 2 H bajo condiciones de rotación. A continuación, se lavaron los inmunotubos de cinco a diez veces con Tween-20 al 0.05% en PBS seguido de 5 a 10 veces en PBS. Los fagos unidos se eluyeron utilizando glicina 50 mM (pH 2.2) y se agregaron a E. coli XL-1 Blue y se incubaron para infección por fagos. Posteriormente, las bacterias infectadas se sembraron en placas de agar que contenían ampicilina, tetraciclina y glucosa y se incubaron a 37 °C durante la noche. Después de la primera ronda, se rasparon las colonias de las placas y se combinaron y los fagos se rescataron y amplificaron para preparar una biblioteca de primera ronda enriquecida. A continuación, se seleccionó la biblioteca enriquecida en Erbb-3-Fc (RND Systems) utilizando el protocolo descrito anteriormente. Después de la segunda ronda de selección, los clones individuales se recogieron y se rescataron para preparar una minipreparación monoclonal de fagos. Se identificaron clones de fagos positivos en FACS para unirse a la estirpe celular de cáncer de mama BT-474. Se secuenciaron los genes VH de todos los clones positivos. Los reordenamientos del gen VH se establecieron con el software VBASE2 para identificar clones únicos. Todos los clones únicos se probaron en formato de fagos para la unión en FACS a células K562 (control negativo), células K562-HER3 estables y células BT-474.
En total, se realizaron 36 selecciones en formatos de antígeno Erbb2 y Erbb3. Todos los procedimientos de cribado de selección dieron como resultado 89 clones Fab únicos dirigidos contra HER2 y 137 clones Fab únicos dirigidos contra HER3. Un Fab se consideró único en función de su secuencia HCDR3 única, una indicación de un evento de recombinación de VDJ único. En algunos casos se obtuvieron variantes clonales, con un HCDR3 idéntico, pero diferencias en el CDR1 y/o CDR2. A partir de las bibliotecas de ratones inmunizados se seleccionaron agrupaciones de variantes clonales que contenían sustituciones en el gen VH que reflejaban variantes de afinidad.
Selección/caracterización de anticuerpos
Generación de anticuerpos monoclonales
Se clonaron genes VH de anticuerpos únicos, a juzgar por la secuencia del gen VH y algunas variantes de secuencia de los mismos, derivados de las bibliotecas de fagos de ratón inmunizados en el vector IgG1 de estructura principal. Se utilizaron dos estirpes celulares de producción diferentes durante el proceso; células HEK293T y 293F Freestyle. Se cultivaron células HEK293T adherentes en placas de 6 pocillos hasta una confluencia del 80 %. Las células se transfectaron transitoriamente con la mezcla de ADN-FUGENE individual y se cultivaron adicionalmente. Siete días después de la transfección, se recogió el sobrenadante y se renovó el medio. Catorce días después de la transfección, se combinaron los sobrenadantes y se filtraron a través de 0.22 pM (Sartorius). El sobrenadante estéril se almacenó a 4 °C. Se cultivaron células 293F FreeStyle adaptadas a la suspensión en matraces T125 en una meseta de agitación hasta una densidad de 3.0 x 106 células/ml. Las células se sembraron a una densidad de 0.3-0.5 x 106 células viables/ml en cada pocillo de una placa de 24 pocillos de profundidad. Las células se transfectaron transitoriamente con la mezcla de ADN:PE1 estéril individual y se cultivaron adicionalmente. Siete días después de la transfección, se recogió el sobrenadante y se filtró a través de 0.22 pM (Sartorius). El sobrenadante estéril se almacenó a 4 °C.
Generación de anticuerpos biespecíficos
Se generaron anticuerpos biespecíficos utilizando la tecnología CH3 patentada para asegurar una heterodimerización eficaz y la formación de un anticuerpo biespecífico. La tecnología CH3 utiliza mutaciones puntuales basadas en carga en la región CH3 para permitir el emparejamiento eficiente de dos moléculas de cadena pesada diferentes como se describió anteriormente (PCT/NL2013/050294; publicado como WO 2013/157954 A1).
Purificación de IgG para cribado funcional
La purificación de IgG se realizó a pequeña escala (< 500 |jg), mediana (< 10 mg) y gran escala (> 10 mg) utilizando cromatografía de afinidad. Se realizaron purificaciones a pequeña escala en condiciones estériles en placas de filtro de 24 pocillos utilizando filtración al vacío. Primero se ajustó el pH del medio a pH 8.0 y posteriormente se incubaron las producciones a pequeña escala con perlas de proteína A Sepharose CL-4B (50 % v/v) (Pierce) durante 2 H a 25 °C en una plataforma de agitación a 600 rpm (agitador de placas Heidolph). A continuación, las perlas se recogieron mediante filtración al vacío. Las perlas se lavaron dos veces con PBS pH 7.4. La IgG se eluyó a pH 3.0 con tampón citrato 0.1 M y la fracción de IgG se neutralizó inmediatamente con Tris pH 8.0. El intercambio de tampón se realizó mediante centrifugación utilizando multiplatos 10 Ultracel multipantalla (Millipore). Las muestras terminaron en un tampón final de PBS pH 7.4.
Validación de IgG específicas de HER2/HER3
Se probaron los anticuerpos para unión en FACS a BT-474, HEK293T y HEK293T que sobreexpresan HER2 o HER3. Por lo tanto, las células se recolectaron utilizando tripsina y se diluyeron a 101234567células/ml en tampón FACS (PBS/BSA al 0. 5.%/EDTA 0.5 mM). Se agregaron 1-2 x 105 células a cada pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U. Las células se centrifugaron durante 2 minutos a 300 g a 4 °C. El sobrenadante se descartó al invertir las placas. Se agregaron 50 j l de cada muestra de IgG a una concentración de 10 jg/m l y se incubaron durante 1 H sobre hielo. Las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con tampón FACS. Se agregaron 50 j l de PE IgG anti-humana de ratón diluida 1:100 (Invitrogen) y se incubaron durante 30-60 minutos en hielo en la oscuridad. Después de agregar tampón FACS, las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con tampón FACS. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto en un entorno HTS. La unión de los anticuerpos a las células se evaluó mediante intensidad de fluorescencia media (MFI). Para probar la reactividad de unión no específica, se utilizaron ensayos ELISA. Se probaron los anticuerpos HER2 y HER3 para reactividad frente a los antígenos fibrinógeno, hemoglobulina y toxina tetánica. Para probar la unión específica a HER2 y HER3, los anticuerpos se probaron para unión a dominios extracelulares recombinantes purificados de EGFR, HER2, HER3 y HER4. Los antígenos se recubrieron durante la noche en placas de ELISA MAXISORP™. Los pocillos de las placas de ELISA se bloquearon con PBS (pH 7.2) que contenía BSA al 5 % durante 1 hora a 37 °C. Los anticuerpos seleccionados se probaron por duplicado a una concentración de 10 jg/m l diluidos en PBS-BSA al 2% y se dejaron unir durante 2 horas a 25 °C. Como control, el procedimiento se realizó simultáneamente con un anticuerpo específico para los antígenos recubiertos y un anticuerpo de control negativo. Las placas de ELISA se lavaron 5 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05 % v/v). Se detectó IgG unida con conjugado de HRP diluido 1:2000 (BD anti-ratón de cabra) y se dejó que se uniera durante 2 horas a 25 °C. Las placas de ELISA se lavaron 5 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05 %) y se detectó la IgG unida mediante medición de DO492nm.
Agrupación de epítopos de IgG específicas de HER2/HER3
El panel de anticuerpos anti-HER2 se agrupó en base a su reactividad con el ECD de HER2 derivado de otras especies (ratón, pollo) y en su unión a dominios específicos en la molécula de HER2, es decir, los dominios I, II, III y IV utilizando construcciones quiméricas.
El panel de anticuerpos anti-HER3 se agrupó en base a su reactividad con el ECD HER3 derivado de otras especies (cyno, rata) y en su unión a dominios específicos en la molécula de HER3, es decir, los dominios I, II, III y IV utilizando construcciones quiméricas.
Para este propósito, se transfectaron transitoriamente células CHO-K1 con las construcciones relevantes utilizando mezclas de lipofectamina/ADN. En la construcción de dominios intercambiados quiméricos, los dominios de HER2 de pollo o HER3 de rata se reemplazan por la contraparte humana. La unión de los anticuerpos específicos se midió mediante FACS. La expresión de las construcciones se confirmó utilizando un anticuerpo anti-myc. La tinción FACS con trastuzumab se incluyó como control para la unión específica al dominio IV. Los anticuerpos de cada grupo se podrían clasificar en base a la intensidad de la tinción (MFI). El panel HER2 de 65 anticuerpos se pudo mapear en siete datos en clase (Tabla 3).
1. Específico de dominio I (25)
2. Específico de dominio II (2)
3. Específico de dominio III (23)
4. Específico de dominio IV (7)
5. Específico de dominio IV y reactivo cruzado al ratón (2)
6. Reactivo a todas las construcciones (2)
7. Solo reactivo a HER2 humano (4)
Competencia con trastuzumab
Dos anticuerpos mapeados en el dominio IV de HER2 inhibieron la proliferación de células SKBR-3. Ambos anticuerpos compartían una CDR3 similar excepto por una diferencia de aminoácidos. Se investigó la capacidad de un anticuerpo, PG1849 para competir con trastuzumab en un ELISA de competencia. En este ELISA se recubrió Fc-HER2 y se incubó con una concentración de 15 jg/m l de anticuerpo IgG. Después de una incubación de 15 minutos, los fagos se dejaron incubar durante otra hora. Posteriormente, se detectaron fagos. La Tabla 4 demuestra que PG1849 y trastuzumab se podrían unir simultáneamente a HER2 ya que no apareció pérdida de señal durante el ELISA. Sólo se observó verdadera competencia cuando se combinaron el mismo fago y anticuerpo en el ensayo.
El panel HER3 de 124 anticuerpos se podría mapear en cinco datos en clase (Tabla 5):
1. Reactividad de alto dominio III, reactivo a rata y ratón y reactividad menor al dominio IV (8)
2. Reactividad de alto dominio III, reactivo a rata, humano y cyno, reactividad menor al dominio IV (8)
3. Solo reactividad a HER3 de rata, cyno y humano (43)
4. Solo reactivo a HER3 humano (32)
5. Reactivo a todas las construcciones (33)
Ensayos de proliferación de estirpes celulares
Se cultivaron células SK-BR-3 en DMEM-F/12 suplementado con L-glutamina y FBS inactivado por calor al 10 %. Se cultivaron células BxPC-3-luc2 en RPMI1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10 %. Se cultivaron células MCF-7 en RPMI1640 complementado con 100 pM de piruvato de sodio 1 mM NeAa , 4 pg/ml de insulina y FBS inactivado por calor al 10 %.
Para el ensayo de proliferación de células SK-BR-3, los cultivos de células subconfluentes se lavaron con PBS, se tripsinizaron y la tripsina se inactivó al agregar medio de cultivo. Las células se diluyeron a 6 x 104 células/ml en medio de cultivo. Los anticuerpos se diluyeron a concentraciones de 10 y 1 pg/ml y se agregaron en un volumen de 100 pl en placas de fondo negro de 96 pocillos (ABgene AB-0932). Las células se agregaron a una densidad de 6000 células/pocillo. Las células se cultivaron durante 3 días a 37 °C, CO al 5 %, en una humedad relativa del 95 %. Se agregó Alamar Blue™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubó durante 6 horas a 37 °C, CO al 5 %, en un 95 % de humedad relativa en la oscuridad. Se midió la fluorescencia a una excitación de 550 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. El grado de inhibición del crecimiento se comparó con el de la misma concentración de trastuzumab (Tabla 6).
Para el ensayo de proliferación de células MCF-7 y BxPC-3-luc2, los cultivos celulares subconfluentes se lavaron con PBS, se tripsinizaron y la tripsina se inactivó al agregar medio de cultivo. Las células se lavaron dos veces en grandes volúmenes de medio de ensayo (medio RPMI 1640 que contenía BSA al 0.05 % y 10 pg/ml de Holo Transferrina). Las células MCF-7 se diluyeron hasta 5 x 104 células/ml en medio de cultivo. Los anticuerpos se diluyeron a concentraciones de 10 y 1 pg/ml y se agregaron en un volumen de 100 pl en placas de fondo negro de 96 pocillos (ABgene AB-0932). Las células se agregaron a una densidad de 5000 células/pocillo en presencia de una concentración final de 1 ng/ml de Dominio EGF NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 humano recombinante; (396-HB-050 RND). El Dominio EGF NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 humano se denominará en lo sucesivo como HRG. Las células se cultivaron durante 5 días a 37 °C, CO al 5 %, en un 95 % de humedad relativa. Se agregó Alamar Blue™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubó durante 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa en la oscuridad. Se midió la fluorescencia a una excitación de 550 nm con una longitud de onda de emisión de 590 nm. El grado de inhibición del crecimiento se comparó con el de la misma concentración de # Ab6 (Tabla 7).
Se utilizaron ensayos de proliferación de BxPC-3-luc-2 para cribar los anticuerpos biespecíficos. Las células BxPC-3-luc-2 se diluyeron a 8 x 104 células/ml en medio de cultivo. Los anticuerpos se diluyeron a concentraciones de 10 y 1 pg/ml y se agregaron en un volumen de 100 pl en placas de fondo negro de 96 pocillos (ABgene AB-0932). Las células se agregaron a una densidad de 8000 células/pocillo en ausencia o presencia de 10 ng/ml de concentración final humana HRG. Las células se cultivaron durante 4 días a 37 °C, CO al 5 %, en una humedad relativa del 95 %. Se agregó Alamar Blue™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubó durante 4 horas a 37 °C, CO al 5 %, en un 95 % de humedad relativa en la oscuridad. Se midió la fluorescencia a una excitación de 550 nm con una longitud de onda de emisión de 590 nm.
Para minimizar los efectos de borde, los pocillos exteriores de las placas de 96 pocillos se llenaron completamente con PBS.
Clasificación de afinidad de IgG específicas de HER2
Utilizamos el método descrito por Devash (PNAS, 1990) para clasificar los anticuerpos en un ELISA de antígeno limitado. El uso de concentraciones de recubrimiento de antígeno disminuidas elimina las reacciones de reactividad cruzada observadas y se puede utilizar para detectar anticuerpos de alta afinidad/avidez. Por tanto, la concentración de antígeno sobre el soporte sólido se redujo gradualmente para investigar las inmunorreactividades débiles. Una titulación en serie de la proteína ECD-Erbb-2 comenzando desde 2.5 pg/ml hasta 0.019 pg/ml se recubrió durante la noche a las placas de ELISA MAXISORP™. Los pocillos de las placas de ELISA se bloquearon con PBS (pH 7.2) que contenía b Sa al 5 % durante 1 hora a 37 °C. Los anticuerpos seleccionados se probaron por duplicado a una concentración de 10 pg/ml diluidos en PBS-BSA al 2% y se dejaron unir durante 2 horas a 25 °C. Como control, el procedimiento se realizó simultáneamente con un anticuerpo específico para los antígenos recubiertos y un anticuerpo de control negativo. Las placas de ELISA se lavaron 5 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05 % v/v). La IgG unida se detectó con conjugado de HRP diluido 1:2000 (IgG anti-ratón de cabra, BD Biosciences) y se dejó que se uniera durante 2 horas a 25 °C. Las placas de ELISA se lavaron 5 veces con PBST (PBS-Tween 20 al 0.05 %) y se detectó la IgG unida por medio de medición de DO492nm. Se probaron PG1849, PG2916, PG2926, PG2930, PG2971, PG2973, PG3004 y PG3031 en un ELISA de titulación de antígeno HER2 (Fig. 1).
Unión de genes VH de HER2 con varias cadenas ligeras kappa
Para investigar la unión de HER2 VHs derivadas de diferentes bibliotecas de presentación de fagos, se clonó un panel de anticuerpos HER2 y se expresó en el contexto de otra cadena kappa de v K, es decir, el VL de MEHD7945A. Las IgG producidas se sometieron a análisis FACS sobre células K562 y células K562-HER2 estables. Los genes VH derivados de las bibliotecas combinatorias y las bibliotecas no combinatorias se enumeran en la Tabla 8. Las cadenas VH MF2971, MF3958, MF2916, MF2973, MF3004, MF3025, MF3031, todas podrían combinarse con la cadena ligera MEHD7945A sin perder una unión y especificidad antigénica significativa como se observa cuando se combina con la cadena ligera común IGKV1-39. La cadena VH MF1849 no fue capaz de combinarse con la cadena ligera kappa variante y retener la especificidad y unión del antígeno.
Otros anticuerpos HER2 y HER3
Los anticuerpos que inhiben la función de HER2 o HER3 son conocidos en la técnica. Se construyeron anticuerpos adicionales de acuerdo con la información publicada y se expresaron en células 293F Freestyle. Los anticuerpos anti-HER2 pertuzumab y trastuzumab se generaron en base a la información divulgada en el documento US2006/0212956 A1 (Genentech). El anticuerpo anti-HER3 # Ab6, se basó en la información divulgada en el documento WO 2008/100624 (Merrimack Pharmaceuticals, Inc.) y se reclonó en un vector de estructura principal de IgG1. La información de los anticuerpos anti-HER3 1-53 y U1-59 se obtuvo del documento US 7.705,103 B2 (U3 Pharma AG). La información del anticuerpo anti-HER3 LJM716 se obtuvo del documento US 2012/0107306. La información para la construcción del anticuerpo anti-EGFR anti-HER3 dos en uno MEHD7945A se obtuvo del documento WO2010/108127.
Cribado de anticuerpos biespecíficos HER2xHER3
Se reclonaron VH del panel de anticuerpos HER2 y HER3 en los vectores diseñados por ingeniería cargados de tal manera que tras la expresión de las cadenas pesadas del anticuerpo se fuerza la heterodimerización de las cadenas pesadas dando como resultado la generación de anticuerpos biespecíficos después de la transfección. Se utilizaron tres estrategias diferentes para combinar los brazos HER2 y HER3 en formato de IgG biespecífico:
1. HER2 (bloqueo del crecimiento independiente del ligando) xHER3 (bloqueo del crecimiento independiente del ligando) 2. HER2 (bloqueo del crecimiento independiente del ligando) xHER3 (bloqueo del crecimiento dependiente del ligando) 3. HER2 de diferentes datos en clase de epítopos x HER3 (bloqueo del crecimiento dependiente del ligando)
En algunas combinaciones biespecíficas, los anticuerpos generados en el grupo 2 y 3 se solaparon con el grupo 1. Se produjo un total de 495 anticuerpos biespecíficos en formato de 24 pocillos y se purificaron. Se probó la capacidad de todos los anticuerpos para inhibir la proliferación de la estirpe celular BxPC-3-luc-2 pancreática que expresa HER2 y HER3 (Caliper). La potencia de los anticuerpos se determinó en un entorno dependiente de HRG e independiente de HRG en un cribado en blanco y negro con anticuerpos presentes en una concentración de 10 y 1 pg/ml. Se incluyó trastuzumab como anticuerpo de referencia y como anticuerpo de control negativo a las mismas concentraciones. La actividad funcional de los 80 mejores biespecíficos de HER2xHER3 (en base a la inhibición combinada) a 1 pg/ml se muestra en la Figura 2. Se seleccionaron, reprodujeron y purificaron los anticuerpos (40 en total) que mostraron una mayor actividad inhibidora en comparación con el anticuerpo de control positivo en un formato de 24 pocillos y se probaron de nuevo en un cribado en blanco y negro BxPC-3-luc-2 a concentraciones de 10 y 1 pg/ml. Estos anticuerpos se titularon adicionalmente en el ensayo m CF-7 dependiente de HRG y se compararon contra la combinación de trastuzumab y pertuzumab (1:1) y un anticuerpo de control negativo. La Figura 3 muestra un ejemplo de curvas de titulación de tres anticuerpos biespecíficos en comparación con el anticuerpo HER3 parental y la combinación de trastuzumab pertuzumab. Los anticuerpos monoclonales parentales se muestran en el panel superior y los anticuerpos biespecíficos se muestran en el panel inferior. (Figura 3).
Se calculó la IC50 para los anticuerpos biespecíficos, monoclonales y anticuerpos comparadores utilizando un análisis de regresión no lineal con el software Prism. El software Graph Pad enumera los valores lC50de los anticuerpos biespecíficos en el ensayo MCF-7 y su actividad inhibidora en el ensayo BxPC3 para comparación. Un panel de 12 anticuerpos biespecíficos HER2xHER3 tuvo una actividad inhibidora más potente en comparación con trastuzumab pertuzumab. Además, los anticuerpos biespecíficos fueron igual o más potentes que el PG3178 monoclonal parental (Tabla 9).
Los anticuerpos biespecíficos que inhibían el crecimiento celular dependiente de ligando estaban compuestos por brazos de HER2 en combinación con los brazos de HER33178, 3163, 3099 y 3176. Tanto los brazos de HER2 como de HER3 de los biespecíficos más potentes eran como monoclonales bivalentes también capaces de inhibir la proliferación de SKBR-3 independiente de ligando (ambos brazos HER2 y HER3) (Tabla 6) o proliferación de MCF-7 dependiente de ligando (brazos HER3) (Tabla 7). La mayoría de los anticuerpos potentes estaba compuesta por un brazo de HER2 que reconoce el dominio I en combinación con el anticuerpo anti-HER33178.
Inhibición del crecimiento tumoral BxPC-3-luc2
Los anticuerpos descritos en la Tabla 9 se probaron en un modelo de xenoinjerto pancreático BxPC-3-luc2. La estirpe celular BxPC-3- luc2 expresa tanto HER2 como HER3 y se considera una estirpe celular de baja expresión de HER2. Se injertaron ortotópicamente ratones hembra CB17 SCID, de 8 a 10 semanas de edad al comienzo del estudio, en el páncreas con 1 x 106 células tumorales en 20 pl. Con este fin, los ratones fueron anestesiados y colocados sobre el lado derecho para exponer el lado izquierdo y se realizó una incisión de 0.5 cm en la región del flanco izquierdo. El páncreas y el bazo se exteriorizaron y se inyectaron 1 x 106 células tumorales en 20 pl en el espacio subcapsular de la cola del páncreas. Una semana después de la implantación, se generaron datos de bioluminiscencia (BLI). 15 minutos antes de la formación de imágenes, todos los ratones recibieron inyecciones ip de 150 mg/kg de luciferina (sal de potasio D-luciferina-EF, Cat. #E6552, Promega). La formación de imágenes BLI se realizó una o dos veces por semana utilizando la vista lateral izquierda. Los animales atípicos, en base a BLI/volumen tumoral, se eliminaron y los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 7 ratones cada uno. El día experimental 8 se inició el tratamiento. Los animales del grupo de tratamiento con anticuerpos se dosificaron semanalmente durante 3 semanas consecutivas (días 0, 7, 14 y 21) con 30 mg/kg de anticuerpo. El día 0 del tratamiento, los animales recibieron el doble de la dosis de carga, es decir, 60 mg/kg de anticuerpo. La formación de imagen final se llevó a cabo el día 31.
Se corrieron dos modelos de xenoinjerto BxPC-3-luc2 con un panel diferente de anticuerpos biespecíficos y anticuerpos parentales En el primer modelo de xenoinjerto BxPC-3-luc2 (Figura 4), un grupo recibió el anti-RSV de control negativo (Ctrl IgG), un grupo recibió el anticuerpo control trastuzumab y un grupo recibió el anticuerpo control positivo trastuzumab pertuzumab (1:1 v/v). Los siete grupos restantes recibieron uno de los anticuerpos monoclonales (PG) o biespecíficos (PB) PG3004, PG3178, PB3566, PB3710, PB3443, PB3448 y PB3441. Los detalles de la composición de los anticuerpos biespecíficos se representan en la Tabla 9.
Los cinco anticuerpos biespecíficos probados fueron capaces de inhibir el crecimiento tumoral. La masa tumoral media (BLI) de los animales tratados con anticuerpos HER2 x HER3 biespecíficos fue similar a la de los animales tratados con la combinación de trastuzumab pertuzumab. (Fig. 4).
En el segundo modelo de xenoinjerto BxPC-3-luc2 (Figura 5), un grupo recibió el anticuerpo anti-RSV de control negativo (Ctrl IgG) y un grupo recibió la combinación de anticuerpos de control positivo trastuzumab pertuzumab (1:1 v/v). Los cinco grupos restantes recibieron uno de los anticuerpos PG3163, PB3986, PB3990, PB4011 y PB3883. Para obtener detalles sobre los anticuerpos PB biespecíficos: Tabla 9. Estos anticuerpos biespecíficos contenían tres brazos de unión de HER3 diferentes combinados con el mismo brazo de HER2 MF2971 y un brazo de HER2 adicional combinado con el brazo de unión de HER3 MF3163. En este experimento, los tumores del grupo de control no mostraron el mismo nivel de crecimiento acelerado que en el primer experimento, lo que complica la interpretación de los resultados. No obstante, en comparación con trastuzumab pertuzumab, los biespecíficos PB3883 y PB3990 HER2xHER3 tenían actividades inhibidoras similares (Fig. 5).
En base a los datos in vivo e in vitro, se seleccionó un panel biespecífico de anticuerpos, de los cuales los brazos de HER2 estaban compuestos por MF2971, MF3004, MF1849 y el brazo de HER3 estaba compuesto por MF3178. Los brazos de MF2971 y MF3004 eran de origen de ratón y estaban humanizados.
Unión del anticuerpo HER2xHER3 biespecífico en comparación con los anticuerpos monoclonales parentales
La unión de anticuerpos biespecíficos HER2xHER3 en comparación con sus contrapartes parentales se determinó mediante análisis FACS. Se realizó una FACS sobre células BxPC-3-luc2 y células MCF-7 con una titulación en serie de anticuerpos que variaba entre 2.5 pg g/ml - 0.01 pg g/ml. El panel de anticuerpos probado estaba compuesto por el anticuerpo biespecífico PB3566 y sus anticuerpos parentales, el anticuerpo anti-HER3 PG3178 y el anticuerpo anti-HER2 PG3004. Se graficaron los datos de MFI y los gráficos en ambas estirpes celulares muestran que el PB3566 biespecífico se une más eficazmente a ambas estirpes de células tumorales en comparación con el anticuerpo anti-HER3 PG3178 y el anticuerpo anti-HER2 PG3004. (Fig. 6)
Humanización de MF2971 y MF3004
Se humanizaron MF2971 y MF3004 de acuerdo con la tecnología conocida en la técnica. Un total de siete secuencias variantes humanizadas/desinmunizadas de MF2971 se expresaron, validaron y caracterizaron in vitro como combinación de formato monoclonal y biespecífico con el anticuerpo específico de HER3 MF3178. Se hizo lo mismo para siete secuencias variantes de MF3004, que se crearon al reemplazar el HCDR3 de MF2971 en las siete variantes de MF2971 con el HCDR3 de MF3004. Se analizó la expresión, integridad, estabilidad térmica y actividad funcional de todas las variantes humanizadas. En base a la producción, integridad, estabilidad e integridad funcional, se eligió una variante de MF2971 (2971-var2) como la variante humanizada óptima de VH para ser utilizada en un formato biespecífico con MF3178. Esta 2971-var2 pasó a llamarse MF3958. La combinación biespecífica de HER2xHER3 MF3958xMF3178 dio como resultado PB4188.
Estudios analíticos, de purificación y producción a gran escala de PB4188
Se cultivaron células 293F Freestyle adaptadas a la suspensión en matraces Erlenmeyer en una meseta de agitación hasta una densidad de 3.0 x 106 células/ml. Las células se sembraron en matraces erlen de 4 L a una densidad de 0.3­ 0.5 x 106 células viables/ml. Las células se transfectaron transitoriamente con la mezcla de ADN:PE1 estéril individual y se cultivaron adicionalmente. Siete días después de la transfección, el medio acondicionado que contenía el anticuerpo biespecífico se recogió mediante centrifugación a baja velocidad, 5 minutos 1000 g, seguido de centrifugación a alta velocidad, 5 minutos a 4000 g. El medio acondicionado recolectado se concentró sobre un casete hydrosart Satorius de 5 kDa hasta aproximadamente 600 ml y posteriormente se diafiltró contra 4 L de PBS. Los anticuerpos se unieron en columna a ~35 ml de MabSelectSure XL (11 °C). Las proteínas unidas específicamente a se eliminaron al lavar la columna en modo de flujo inverso con 150 ml de PBS, 150 ml de PBS que contenía NaCl 1 M, 100 ml de PBS. Los anticuerpos unidos se eluyeron utilizando citrato 100 mM pH 3.0 en modo de flujo inverso y se recolectaron fracciones de 5 ml en tubos de 10 ml que contenían 4 ml de 1Tris pH 8.0 para neutralización. Los anticuerpos eluidos se purificaron adicionalmente mediante filtración en gel utilizando superdex 200 50/1000. El anticuerpo purificado se esterilizó por filtración utilizando un filtro de jeringa de 0.22 pm. La concentración de IgG se determinó mediante medición de DO280 y la concentración de proteína se calculó en base a la secuencia de aminoácidos. Se probó la proteína para agregación (HPSEC), pureza (s Ds -PAGE, nMS, IEX e IEF). Las muestras de proteína se almacenaron a -80 °C.
Purificación de IgG para estudios analíticos y de xenoinjertos.
Se realizaron purificaciones a mediana escala sobre un AKTA 100 Explorer utilizando columnas HiTrap MabSelect Sure y columnas de desalación HiTrap. Las muestras se cargaron a 5 ml/min. La columna se lavó con 2 volúmenes de columna de PBS. Se eluyó IgG a pH 3.0 con tampón citrato 0.1 M. A continuación, la muestra se desaló y terminó en un tampón final de PBS pH 7.4. Las IgG se filtraron a través de un filtro de 0.45 pM (Sartorius). La concentración de IgG se midió utilizando Octet con sensores de proteína A. Se probó la proteína para agregación (HPSEC), pureza (SDS-PAGE, nMS, IEX e IEF). Las muestras de proteína se almacenaron a -80 °C.
Características analíticas de PB4188
El PB4188 (MF3958xMF3178) se sometió a análisis por HP-SEC y CIEX-HPLC (columna TSK gel-STAT de 7 pm, 4.6 mm de D Ix10 cm de L). El perfil analítico de PB4188 fue en general consistente con el comportamiento de la IgG1 monoespecífica normal, tal como el brazo HER2 parental PG3958 y el anticuerpo de control monoclonal anti-RSV (Fig. 7).
Determinación de afinidad
La afinidad de unión monovalente de PB4188 y PB3448 para HER2 y HER3 recombinantes se determinó mediante SPR (Biacore T100). Se utilizó Biacore™ T100 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para realizar todos los experimentos descritos. La preparación de la superficie del sensor y los análisis de interacción se realizaron a 25 °C. El tampón y los reactivos Biacore se adquirieron de GE Healthcare. Se recubrió con ErbB2-Fc y ERbB3-Fc (RND) la superficie de un chip sensor CM5 en tampón de acetato de potasio (pH 5.5) al nivel de inmovilización objetivo de 500 RU. El tampón de migración fue HBS (solución salina tamponada con hepes): HEPES 10 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0.005 %; 0.2 pm) esterilizado con filtro. Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron a 100, 50, 20, 10, 1 y 0.1 nM en HBS y se corrieron a un caudal alto (30 pl/min) sobre la superficie acoplada al antígeno del chip sensor CM5. Con el software de evaluación BIA, un modelo de ajuste de curva para la interacción monovalente 1:1 permitió la determinación de las afinidades de los brazos de HER2 (interacción monovalente), se pudieron determinar las afinidades de los brazos de HER2. Debido a la baja tasa inactiva del brazo de HER3, no se pudo determinar la afinidad. Para determinar la afinidad del brazo de HER3, se recubrió PB4188 con un chip sensor CM5 al nivel de inmovilización objetivo de 500 RU. Los antígenos Her2-Fc y Her3-Fc se diluyeron a 100, 50, 20, 10, 1 y 0.1 nM en HBS y se corrieron a un caudal alto (40 pl/min) sobre la superficie de PB4188. Para determinar los valores de kactivo y kmactivo, se utilizó el software de evaluación BIA junto con un modelo que tiene en cuenta que se recubre una molécula monovalente en la superficie del chip sensor y que el antígeno ErbB3-Fc era una molécula bivalente. Las afinidades de PB4188 y PB3448 se muestran en la Tabla 10.
Determinación de la afinidad de PB4188 sobre células
Las afinidades de unión también se determinaron mediante mediciones de afinidad celular en estado estacionario utilizando células BT-474 y SK-BR-3. Se analizaron cuatro IgG: 1) PB4188 (HER2xHER3 biespecífico), que contiene anticuerpo anti-HER23958 y anticuerpo anti-HER3 3178; 2) PB9215 (HER3xTT biespecífico), que contiene el anticuerpo 3178 anti-HER3 y el anticuerpo 1337 anti-TT (toxoide tetánico); 3) PB9216 (HER2xTT biespecífico), que contiene anticuerpo anti-HER2 3958 y anticuerpo anti-TT 1337; 4) Herceptina (HER2 monoespecífico). Las IgG se marcaron radiactivamente con 125I utilizando tubos de yodación prerrecubiertos IODO-GEN® (Pierce) e instrucciones asociadas. Las IgG marcadas se diluyeron hasta una actividad de ~1-2 x 108 cpm/ml en Tris-HCl 25 mM, NaCl 0.4 M, BSA al 0.25 %, EDTA 5 mM, NaN3 al 0.05 %. Las concentraciones de proteínas se determinaron con el Kit de Ensayo de Proteína BCA (Pierce). El análisis de citometría de flujo de la IgG marcada y no marcada utilizando células BT-474 y SK-BR-3 no mostró signos de reducción en la unión o sólo fue menor después del marcado. Las mediciones de la afinidad celular en estado estacionario se realizaron como sigue. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 4 °C con diversas concentraciones de IgG marcada. Se eliminó la radiactividad no unida después de 4 horas y se midió la radiactividad unida a las células utilizando un contador de pocillos gamma. La unión no específica se midió al agregar una concentración de bloqueo del receptor (exceso de 100 veces) de anticuerpo no marcado. Cada condición se probó por triplicado y se realizaron tres experimentos independientes por anticuerpo. Los valores de Kd se calcularon en base a un modelo de regresión no lineal que compensa la unión no específica, utilizando Prism 6.0d (GraphPad Software). En la Figura 20 se proporcionan gráficos que incluyen curvas ajustadas para la unión de la IgG de HER2xHER3 (PB4188) a ambas estirpes celulares. Los datos de Kd para los 24 ensayos, que incluyen los valores medios, se dan en la Tabla 12.
En resumen, los valores de KD medios determinados utilizando células BT-474 y SK-BR-3 fueron 3.2 y 2.0 nM para HER2xHER3, 3.7 y 1.3 nM para Herceptina, 3.9 y 2.3 nM para HER2xTT y 0.23 y 0.99 nM para HER3xTT, respectivamente. Por tanto, PB4188 muestra una mayor afinidad por HER3 en comparación con HER2, lo que contrasta con la molécula biespecífica de HER2xHER3 MM-111 que se dirige a HER2 con una mayor afinidad en comparación con HER3.
Actividad antiproliferativa sobre células de cáncer de mama amplificadas con HER2
JIMT-1 en agar blando
Se probaron PB3448 y PB4188 para su potencia para inhibir el crecimiento de las células JIMT-1 resistentes a trastuzumab en agar blando. Con este fin, se prepararon placas de cultivo celular en suspensión de 96 pocillos. Se vertieron 100 pl de la capa inferior de agar blando (concentración final al 0.6 % en medio completo) y se dejó solidificar. Luego se agregaron 50 pl de la capa superior de agar blando (concentración final al 0.4 %) que contenía 10.000 células JIMT-1/pocillo, se solidificaron y dichas placas de 96 pocillos se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 10%. Al día siguiente, se agregó un anticuerpo de control negativo, pertuzumab trastuzumab (1:1 v/v), PB3448 y PB4188 en medio DMEM en una titulación semilogarítmica que varía de 10 a 0.003 pg/ml. Posteriormente, el ensayo se incubó en incubadoras de cultivo celular durante 8 días. Finalmente, las células se incubaron con Alamar Blue durante 3-5 h a 37 °C y se determinó la intensidad de la fluorescencia (excitación: 560 nm; emisión: 590 nm). Se muestra un ejemplo de inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de JIMT-1 por PB3448 y PB4188. (Figura 8).
BT-474 y SKBR-3 en matrigel
Se probaron PB3448 y PB4188 para su potencia para inhibir el crecimiento de células BT-474 y SKBR-3. Las células se probaron en la empresa Ocello con sede en Leiden, Países Bajos, que cultiva células en matrigel tridimensional y utiliza el análisis de componentes principales para distinguir las células no tratadas de las tratadas. Se sembraron 2000 células SK-BR-3 o 2250 BT474 en 15 pl de matrigel por pocillo de una placa de 384 pocillos (Greiner 781091). Al día siguiente se agregó una titulación semilogarítmica que varía de 10 a 0.003 pg/ml de anticuerpos en medio de cultivo en ausencia o presencia de 5 ng/ml de HRG. Los anticuerpos de prueba incluyeron un anticuerpo de control negativo, pertuzumab trastuzumab (1:1 v/v), PB3448, PB4188 y el anticuerpo dos en uno anti-EGFRxHER3 biespecífico MEHD7945A. Además, se incluyó una titulación dependiente de la dosis de HRG como control positivo. Cada dosis se probó por cuadriplicado. Las células se incubaron durante 7 días en una incubadora de cultivo celular a 37 °C, CO2 al 5 %. A continuación, las células se fijaron y el citoesqueleto de actina de las células se tiñó con faloidina y los núcleos se tiñeron con Hoechst. A continuación, se tomaron imágenes fluorescentes a diferentes niveles a través del gel (pila Z) y se superpusieron las imágenes. Se midió una amplia gama de características morfológicas (800 en total). Solo se seleccionaron para el análisis las características que difirieron entre los tratamientos medio y HRG. Las características que se asociaron con el crecimiento, el área media del esferoide y los núcleos por esferoide fueron más significativamente diferentes entre los tratamientos con medio y HRG. Se realizaron análisis multiparamétricos y de un solo parámetro. Para las mediciones de un solo parámetro, se realizaron pruebas t para comparar tratamientos (HRG o anticuerpo) con el medio. Se determinaron los valores p para cada punto. Se utilizó el análisis de componentes principales (PCA), un método para encontrar combinaciones de baja dimensión de datos de alta dimensión que capturan la mayor parte de la variabilidad en relación con la concentración de anticuerpos, para graficar los datos. La Figura 9 demuestra el efecto de pertuzumab trastuzumab (1:1 v/v), PB3448 y PB4188 en presencia de HRG. En ambas estirpes celulares de cáncer de mama amplificadas con HER2, PB4188 mostró una actividad superior en comparación con pertuzumab trastuzumab, PB3448 y el anticuerpo dos en uno MEHD7945A en presencia de HRG.
Actividad antiproliferativa superior de PB4188 en presencia de HRG sobre células de cáncer de mama amplificadas con HER2
La actividad de PB4188 en presencia de 10 ng/ml de HRG sobre SKBR-3 y BT-474 se comparó con un panel de anticuerpos HER2, HER3 y combinaciones de los mismos. El ensayo se realizó en matrigel, como se describió anteriormente, y se analizaron las características morfológicas. Los datos de PCA graficados en la Figura 10a muestran la proliferación inducida por HRG y la ramificación/invasión de células SKBR-3 en matrigel. La Figura 10b muestra que el anticuerpo PB4188 puede revertir completamente el fenotipo inducido por HRG, mientras que la combinación de los anticuerpos monoclonales parentales (PG3958 PG3178) no tiene ningún efecto. Más aún, PB4188 fue mucho más eficaz en comparación con todos los anticuerpos anti-HER3 probados (Figura 10c). Además, las combinaciones de los anticuerpos anti-HER3 individuales con trastuzumab (el estándar actual de atención en el cáncer de mama metastásico (mBC)) no pudieron revertir el fenotipo inducido por HRG (Figura 10d). La adición de trastuzumab a PB4188 en presencia de HRG redujo la proliferación y ramificación/invasión de células SK-BR-3 en comparación con PB4188 solo (Figura 10e).
Actividad antiproliferativa superior de PB4188 sobre células de cáncer gástrico amplificadas con HER2 en comparación con anticuerpos monoclonales HER2 y HER3.
La regulación por aumento de NRG1-p1 es un mecanismo de resistencia clave contra las terapias dirigidas a HER2 (Wilson, 2012). Para evaluar si la regulación por aumento de NRG1-p1 interferiría con la potencia antiproliferativa de PB4188, se probó un panel de anticuerpos a 100 ng/ml de HRG en la estirpe celular de cáncer gástrico N87 (HER2 amplificado). Se cultivaron células N87 en RPMI 1640 complementado con FBS inactivado por calor al 10%. Para el ensayo de proliferación, se lavaron cultivos celulares subconfluentes de células N87 con PBS tripsinizado y se inactivó tripsina al agregar medio de cultivo. Las células se lavaron dos veces en grandes volúmenes de medio de ensayo (medio RPMI 1640 que contenía BSA al 0.05 % y 10 pg/ml de Holo Transferrina). Los anticuerpos se diluyeron en una titulación semilogarítmica que varió entre 1 y 0.0001 pg/ml. Las células se agregaron a una densidad de 10000 células/pocillo en presencia de una concentración final de 100 ng/ml de HRG. Las células se cultivaron durante 3 días a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa. Se agregó Alamar Blue™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubó durante 6 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa en la oscuridad. Se midió la fluorescencia a una excitación de 550 nm con una longitud de onda de emisión de 590 nm. PB4188 mostró una actividad superior sobre los anticuerpos monoclonales anti-HER2 o anti-HER3 (Figura 11).
Los anticuerpos biespecíficos HER2XHER3 inducen ADCC
La actividad de ADCC es un importante mecanismo de acción antitumoral para los anticuerpos terapéuticos en el cáncer. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos a la familia de receptores HER como cetuximab y trastuzumab inducen la ADCC. La actividad de ADCC inicial y mejorada de PB4188 y PB3448 se determinó en ensayos ADCC in vitro validados. El trastuzumab y un anticuerpo de control negativo se incluyeron como anticuerpos de control en el experimento. Se obtuvieron fracciones de sangre completa y PBMC de donantes sanos. Cada anticuerpo se probó contra las células objetivo que expresan HER2 alto (SK-BR-3) y HER2 bajo (MCF-7). Las células objetivo se cargaron con 51Cr (Amersham) y se opsonizaron con las concentraciones indicadas de anticuerpo. Se utilizó sangre completa o fracción de PBMC como células efectoras en una reacción de 200 pl en RPMI 1640 f Cs inactivado por calor al 10 %. Las células se incubaron juntas durante 4 h, y la lisis se estimó al medir la radiactividad en el sobrenadante utilizando un centellador y. El porcentaje de lisis específica se calculó de la siguiente manera: (cpm experimental - cpm basal)/(cpm máximo - cpm basal)x 100, con la lisis máxima determinada en presencia de Triton X-100 al 5 % y lisis basal en ausencia de anticuerpo y efectores. Como se muestra en la Figura 12, el anticuerpo biespecífico PB3448 mostró una actividad de ADCC similar en comparación con la combinación pertuzumab trastuzumab. El anticuerpo biespecífico PB4188 fue eficaz a concentraciones elevadas de anticuerpo (10 pg/ml).
Los anticuerpos biespecíficos HER2XHER3 muestran una ADCC más alta en comparación con la combinación de anticuerpos parentales
En una configuración de ADCC diferente, se utilizó el Bioensayo Informador de ADCC (Promega). El bioensayo utiliza células Jurkat diseñadas por ingeniería que expresan de forma estable el receptor FcYRIIIa, variante V158 (alta afinidad) o F158 (baja afinidad), y un elemento de respuesta NFAT que impulsa la expresión de luciferasa de luciérnaga. El ensayo se validó al comparar los datos obtenidos con el Bioensayo Informador de ADCC con el ensayo clásico de liberación de 51Cr. Los ensayos de ADCC se realizaron utilizando el kit de Bioensayo Promega ADCC utilizando placas de 384 pocillos blancos. En esta configuración experimental, se sembraron células SKBR-3 a una densidad de 1000 células/pocillo en 30 pl de medio de ensayo (RPMI con suero de IgG bajo al 4%) 20-24 H antes del bioensayo. Al día siguiente, se retiró el medio de cultivo. A continuación, se generó una dilución en serie de los anticuerpos, PB4188 y su anti-HER2 PG3958 y anti-HER3 PG3178 parentales, así como la combinación de los mismos, en duplicado. Se agregaron a los pocillos diluciones de anticuerpo de 10 pl. La concentración inicial del anticuerpo fue de 10 pg/ml y se generó una dilución en serie semilogarítmica de 10 puntos para proporcionar una curva de dosis-respuesta completa. Finalmente, se agregaron 5 pl de células efectoras ADCC Bioensayo (15000 células/pocillo, V158). Las células se incubaron durante 6 horas a 37 °C. A continuación, se agregaron 15 pl de sustrato de luciferasa BIO-Glo y 5 minutos más tarde se detectó luminiscencia en un lector de placas. Los datos obtenidos se muestran en la Figura 13. Los anticuerpos anti-HER2xHER3 biespecíficos PB4188 mostraron una potencia ADCC más alta en comparación con los monoclonales HER2 y HER3 parentales o una combinación de los mismos.
Mejora de ADCC de PB4188
La actividad de ADCC se puede potenciar mediante diferentes técnicas, siendo una de ellas la eliminación de fucosa. La eliminación de fucosa ha dado lugar a un aumento de la actividad antitumoral en varios modelos in vivo. [Junttila, 2010]. Para maximizar la actividad de PB4188, se aplicó la tecnología de afucosilación (Cheng Liu and Andreia Lee. ADCC Enhancement Technologies for Next Generation Therapeutic Antibody. Antibody therapeutics -Trends in Bio/Pharmaceutical Industry 2009 [13-17]), evitando de esta manera la fucosilación de la estructura de carbohidratos unida a N en la región Fc. La potencia ADCC de PB4188 afucosilado en comparación con el PB4188 de tipo silvestre se determinó en un ensayo de liberación de ADCC 51Cr utilizando células de baja expresión de HER2 (MCF-7) y células amplificadas con HER2 (SK-BR-3). Ambos anticuerpos se aplicaron en una dilución en serie y en el ensayo se incluyeron un anticuerpo de control negativo y trastuzumab. La Figura 14 muestra el aumento en la potencia ADCC de PB4188 afucosilado en comparación con la versión de tipo silvestre y/o trastuzumab en células que expresan tanto HER2 alto como bajo.
PB4188 afucosilado muestra una actividad de ADCC superior con receptores FcyRIII de baja afinidad
La actividad de PB4188 afucosilada se probó sobre células indicadoras de ADCC que contenían la variante del receptor FcYRIIIa V158 (alta afinidad) o la variante del receptor FcYRIIIa F158 (baja afinidad). Se agregó una titulación en serie de anticuerpo, es decir, anticuerpo de control, trastuzumab y PB4188 afucosilado, en combinación con células indicadoras de ADCC que albergan las diferentes variantes de FcYRIIIa a células SK-BR-3 adherentes. La actividad de ADCC se midió al medir la actividad de luciferasa. El PB4188 afucosilado mostró la misma actividad en comparación con el trastuzumab en combinación con la variante del receptor V158 FcYRIIIa de alta afinidad. Por el contrario, el PB4188 afucosilado mostró una actividad de ADCC superior en comparación con el trastuzumab en combinación con la variante del receptor FcYRIIIa F158 de baja afinidad. (Figura 15)
Estudio de xenoinjerto JIMT-1
Se cultivaron células de carcinoma de mama humano JIMT-1 en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina G sódica, 100 pg/ml de sulfato de estreptomicina, 25 pg/ml de gentamicina y glutamina 2 mM hasta el momento de implantación. El día de la implantación, se recolectaron células de mama JIMT-1 durante el crecimiento en fase logarítmica y se resuspendieron en PBS frío. Los ratones hembra CB.17 SCID (Charles River) tenían 8 semanas de edad el día 1 del estudio y tenían un rango de peso corporal de 16.5 a 20.7 g. Cada ratón se inyectó por vía subcutánea en el flanco derecho con 5 x 106 células tumorales (0.2 ml de suspensión de células). Los tumores se midieron con un calibrador en dos dimensiones para controlar el tamaño como el volumen medio dos veces por semana. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 100-150 mm3 de tamaño, los animales se inscribieron en el estudio de eficacia. Los animales atípicos - volumen del tumor - se eliminaron y los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 10 ratones cada uno. Los ratones se inyectaron una vez a la semana (anticuerpos) o diariamente (lapatinib) durante un período de cuatro semanas. Los detalles de los grupos de tratamiento se muestran en la Tabla 11.
Los tamaños de los tumores se midieron semanalmente mediante medición con calibre. El estudio de eficacia reveló que PB4188 en ambos esquemas de dosificación fue igual de eficaz y más potente que el lapatinib o la combinación de pertuzumab y trastuzumab. Los datos se muestran en las Figuras 17 y 18.
PB4188 puede superar la resistencia mediada por HRG
La regulación por aumento de NRG1-p1 es un mecanismo de resistencia clave contra las terapias dirigidas a HER2 (Wilson, 2012). Se probó PB4188 en comparación con su anticuerpo monoclonal anti-HER3 parental PG3178 en una titulación en serie en presencia de una concentración creciente de h Rg (NRG1-p1 EGF). Con este objetivo, se cultivaron células N87 en RPMI 1640 complementado con FBS inactivado por calor al 10 %. Para el ensayo de proliferación, se lavaron cultivos celulares subconfluentes de células N87 con PBS tripsinizado y se inactivó tripsina al agregar medio de cultivo. Las células se lavaron dos veces en grandes volúmenes de medio de ensayo (medio RPMI 1640 que contenía BSA al 0.05 % y 10 pg/ml de Holo Transferrina). Los anticuerpos se diluyeron en una titulación semilogarítmica que variaba de 1 a 0.0001 pg/ml. Las células se agregaron a una densidad de 10000 células/pocillo en presencia de una concentración creciente de Hr G (0.04-39.5 nM). Las células se cultivaron durante 3 días a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa. Se agregó Alamar Blue™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubó durante 6 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa en la oscuridad. Se midió la fluorescencia a una excitación de 550 nm con una longitud de onda de emisión de 590 nm. PB4188 mostró una actividad superior en comparación con el anticuerpo monoclonal anti-HER3 parental (Figura 19).
Por tanto, en el caso de un mecanismo de escape, tal como por ejemplo la regulación por aumento de NRG1-p1, se prefiere un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención.
Mapeo de epítopos de IgG específicas de HER2/HER3
Experimentos de mutagénesis dirigida
Se utilizó mutagénesis de exploración con alanina para mapear los epítopos de PG3958 y PG3178 para HER2 y respectivamente HER3. En el ensayo de mutagénesis dirigida, se generan clones mediante los cuales cada residuo de aminoácido del dominio extracelular (ECD) de HER2/HER3 se sustituye por alanina. A continuación, se preparó una matriz de células mediante transfección inversa (patente US2011/0077163A1). Por lo tanto, el ADN de cada clon se mezcló con lipofectamina y la mezcla se colocó en un pocillo dedicado de una placa de 384 pocillos. Se agregaron células HEK293T a cada pocillo y se midió la expresión de proteína 24 H después. Posteriormente, se midió la reactividad de los anticuerpos mediante tinción inmunofluorescente que condujo a mapas de unión e identificación de residuos críticos para la unión de anticuerpos. Los niveles de expresión de las construcciones ECD de HER2 y HER3 se verificaron mediante análisis FACS utilizando anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente (mAb de R&D 1129 (HER2) y mAb de R&D 66223 (HER3)).
HER2
Se probó la unión de PG3958 Fab monovalente a mutantes de HER2 ECD a una concentración de 0.25 pg/ml en el ensayo y se utilizaron condiciones de lavado rigurosas (pH 9.0, NaCl 350 mM). Esto dio como resultado la identificación de tres residuos 'críticos' (T144, R166, R181) en HER2 que mostraban menos del 35% de unión residual del Fab PG3958 en comparación con WT HER2 mientras que conservaba la unión del mAb de control. Dos residuos (P172, G179) que se colocan cerca de los residuos críticos en la estructura de HER2 mostraron una pérdida de unión significativa, pero menos grave, y se denominaron residuos 'críticos secundarios' (Tabla 13 y Figura 21a ). Todos estos residuos expuestos a la superficie están ubicados en el dominio I de HER2 y juntos forman un parche discontinuo sobre la superficie de la molécula de HER2.
Experimentos de confirmación del epítopo de HER2
Las construcciones que codifican HER2 ECD de tipo silvestre (WT) y las variantes de HER2 ECD enumeradas en la Tabla 13 se expresaron en células CHO-K1. Se seleccionaron tres residuos del Dominio I que están expuestos en la superficie y estructuralmente cerca de los residuos críticos determinados para un análisis adicional. Se generaron mutaciones puntuales de T164, S180 y D143 a tirosina en la construcción HER2 ECD y las construcciones resultantes también se expresaron en CHO-K1. La variante L159A HER2 ECD se expresó en células CHO-K1 como muestra de control.
El anticuerpo biespecífico PG3958xTT se probó para unirse a las variantes de ECD en un experimento de titulación FACS. El anticuerpo anti-HER2 trastuzumab que se une al dominio IV de HER2 se utilizó para verificar la expresión de HER2 ECD sobre la superficie celular. Se graficaron los valores medios de MFI y para cada curva se calculó el AUC utilizando el software GraphPad Prism 5. Se utilizó la unión de WT HER2 para normalizar los datos. Los datos de FACS mostraron que además de T144A, R166A, R181A, P172A, G179A, las mutaciones T164Y y S180Y dieron como resultado una reducción significativa en la unión del anticuerpo PG3958xTT (Figura 22). La mutación D143Y resultó en una pérdida severa de expresión, como se demostró por la unión disminuida del mAb de control, por lo que no pudo determinarse su papel potencial en el epítopo PG3958.
HER3
El análisis de unión de PG3178 IgG a 0.25 pg/ml a mutantes de HER3 ECD en FACS dio como resultado la identificación de dos residuos denominados 'críticos' (F409, R426) para los que la mutación a alanina provocó una pérdida sustancial de unión en comparación con WT. HER3, mientras que se retuvo la unión del mAb de control (Tabla 14 y Figura 23). Ambos residuos están ubicados en el Dominio III de HER3 y espacialmente distantes. Más aún, F409 está enterrado en el núcleo hidrófobo de HER3, lo que hace que sea poco probable que forme parte del epítopo PG3178.
Experimentos de confirmación del epítopo de HER3
Se transfectaron células CHO-K1 con construcciones de mutación de HER3 ECD (enumeradas en la Tabla 14), WT HER3 ECD y dos construcciones de control (H407A e Y424A). La unión de PG3178 a las variantes de ECD de He R3 se probó en un experimento de titulación FACS. Se incluyeron dos anticuerpos de control, Dominio de unión I (MM-121) y Dominio III (MEHD7945A) de HER3 para verificar la expresión de ECD de HER3 sobre la superficie celular. Se graficaron los valores de MFI medios y para cada curva se calculó el AUC utilizando el software GraphPad Prism 5. Se utilizó la unión de WT HER3 para normalizar los datos. Se mostró que la mutación R426A era crítica para la unión de PG3178, mientras que la unión a F409A no se pudo confirmar debido a la pérdida de expresión sobre la superficie celular (Figura 24).
Actividad de PB4188 sobre cardiomiocitos in vitro
HER2 está implicado en el crecimiento, reparación y supervivencia de cardiomiocitos adultos como parte de una red de señalización que implica el complejo del receptor de herregulina HER2: HER4. La cardiotoxicidad es un factor de riesgo conocido en la objetivación de HER2 y la frecuencia de complicaciones aumenta cuando se utiliza trastuzumab junto con antraciclinas, lo que induce estrés cardíaco. Se utilizó un sistema modelo basado en cardiomiocitos derivados de células madre humanas para probar la toxicidad potencial de PB4188 y compararla con trastuzumab y la combinación de trastuzumab y pertuzumab en presencia de la antraciclina doxorrubicina. Se sembraron cardiomiocitos derivados de células madre humanas (Pluriomics BV) a una concentración de 20.000 pocillos en placas de ensayo blancas de fondo plano (corning 655098). El día 5 de cultivo, se reemplazó el medio por medio de cultivo libre de glucosa y galactosa suplementado con 10 ng/ml de HRG. El día 7 se agregaron anticuerpos de prueba en combinación con doxorrubicina (3 pM). La viabilidad celular se ensayó el día 9 utilizando el ensayo Glo de título de células Promega. Los anticuerpos monoespecíficos se probaron a concentraciones únicas de 68 nM, mientras que el PB4188 se probó a tres concentraciones en presencia de doxorrubicina 3 pM. La Figura 25 muestra que la viabilidad del cardiomiocito no se vio afectada por todas las concentraciones de PB4188 ensayadas. Por el contrario, trastuzumab y la combinación de trastuzumab y pertuzumab redujeron la viabilidad de las células de los cardiomiocitos.
Unión de PB4188 a células con diferentes niveles de HER2
La unión de PB4188 en comparación con trastuzumab y el anticuerpo HER3 U1-59 se analizó mediante FACS en estirpes celulares de cáncer de mama y gástrico que expresan diferentes niveles de HER2. Las células se consideraron HER2+++ si expresan millones de copias de HER2 y/o están amplificadas por el gen HER2. Se utilizaron las siguientes estirpes celulares: MCF-7 (HER 2 ); MDA-MB-468 (HER2 , MKN-45 (HER2 ), MDA-MB-175 (HER2+), MDA-MB-453 (HER2 +), MDA-MB-361(HER2 +), ZR-75-1(HER2 +), JIMT-1 (HER2+++), BT-474 (HER2+++), SKBR-3 (HER2+++), SK-OV-3 (HER2+++), N87 (HER2+++). Células de un cultivo de crecimiento exponencial se recolectaron con tripsina y se diluyeron a 106 células/ml en tampón FACS (PBS/BSA al 0.5 %/EDTA 0.5 mM). Se agregaron 1 a 2 105 células a cada pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en U. Las células se centrifugaron durante 2 minutos a 300 g a 4 °C. El sobrenadante se descartó al invertir las placas anteriores, seguido por deslizamiento una vez. Se agregaron 50 pl de cada muestra de IgG en una dilución en serie de 3.16 ng a 10 pg/ml y se incubó durante 1 H sobre hielo en la oscuridad. Las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con tampón FACS. Se agregaron 50 ml de IgG gamma PE antihumana de ratón diluida 1:100 (Invitrogen) y se incubaron durante 30-60 minutos sobre hielo en la oscuridad. Se centrifugaron una vez las células, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con tampón FACS. Las células se analizaron en un citómetro de Flujo FACSCanto en un entorno HTS. La cantidad de anticuerpo unido se evaluó mediante la mediana de fluorescencia. Se trazaron los datos y se determinó el área bajo la curva (AUC, una medida acumulativa de la intensidad de fluorescencia media) para cada anticuerpo por estirpe celular probada (Figura 26).
A partir de este experimento se concluye que PB4188 tenía una mayor afinidad de unión por las células HER2+++, las células HER + y las células HER+ en comparación con trastuzumab.
Unión simultánea con trastuzumab
PB4188 y trastuzumab no compiten por la unión a HER2
El PB4188 se une al dominio I de la proteína HER2 mientras que el epítopo de unión de trastuzumab se localiza en el dominio IV. Para demostrar que ambos anticuerpos no compiten por la unión de HER2, se realizó un ensayo de unión con células de mama SKBR-3 amplificadas con HER2. Se dejó que el primer anticuerpo no marcado se uniera a SKBR-3 a concentraciones saturadas. A continuación, se agregó PB4188 marcado con FITC en un rango de titulación y se midió la fluorescencia mediante FACS. La Figura 27 demuestra que PB4188FITC se unía con la misma eficacia a las células en presencia de trastuzumab o el control negativo. La preincubación de células SKBR-3 con PB4188 evitó que se uniera PB4188FITC. Por lo tanto, trastuzumab y PB4188 no compiten por unirse a HER2
Dominio I de dirección de HER2 por una molécula biespecífica de HER2xHER3 que puede superar la resistencia a la herregulina.
Para probar si la orientación de PB4188 sobre el dímero HER2xHER3 era preferida para inhibir la proliferación celular bajo condiciones de estrés de HRG, se generaron anticuerpos biespecíficos compuestos por el brazo HER3 3178 y los brazos HER2 dirigidos a los dominios I, II, III o IV. Se generaron dos anticuerpos biespecíficos HER2xHER3 para cada uno de los dominios I-IV de HER2. Los brazos de HER2 incluían: dominio I de dirección MF3958 y MF3003; Dominio II de dirección de MF2889 y MF2913; dominio III de dirección MF1847 y MF3001 y dominio IV de dirección de MF1849 y MF1898. Cada brazo de HER2 Fab se combinó con el brazo de 3178 HER3 Fab y se probó su potencia para inhibir la proliferación celular en presencia de altas concentraciones de herregulina. Las titulaciones de anticuerpos se realizaron sobre células MCF-7 de baja expresión de HER2 y células N87 y SK-BR-3 que sobreexpresan h ER2. Los cultivos celulares subconfluentes de células N87, SK-BR-3 y MCF-7 se lavaron con PBS tripsinizado y la tripsina se inactivó al agregar medio de cultivo. Las células se lavaron dos veces en grandes volúmenes de medio de ensayo (medio RPMI 1640 que contenía BSA al 0.05% y 10 pg/ml de Holo Transferrina). Los anticuerpos se diluyeron en una titulación semilogarítmica. Las células se agregaron a una densidad de 10000 células/pocillo (N87, SKB-BR-3) y 5000 células/pocillo de MCF-7 en presencia de la concentración de estrés definida experimentalmente de HRG (SK-BR-3 10 nM, N87 100 nM y MCF -7). Las células se cultivaron durante 3-4 días a 37 °C, CO2 al 5 %, en un 95 % de humedad relativa. Se agregó Alamar BlueTM (Invitrogen) para evaluar la proliferación. La absorbancia se midió a una excitación de 550 nm con una longitud de onda de emisión de 590 nm. En todos los ensayos probados, solo los anticuerpos biespecíficos que se dirigen al dominio I de HER2 fueron capaces inhibir la proliferación en presencia de una concentración alta de herregulina (Figura 28).
Combinaciones de fármacos con PB4188 in vitro.
Para investigar la posibilidad de combinar PB4188 con fármacos de molécula pequeña, PB4188 se combinó con fármacos que interfieren en diferentes niveles de la ruta de PI3K o MAPK. Más aún, se probó la combinación con fármacos quimioterapéuticos e inhibidores de ciclina. Las combinaciones se probaron sobre células que sobreexpresan HER2 que crecen en presencia de HRG en matrigel (SK-BR-3 y BT-474) o en presencia de concentraciones de estrés de HRG (N87 y SK-BR-3 como se describe en ensayos de proliferación). El efecto inhibidor de las combinaciones de fármacos se probó al formar imágenes o medir la proliferación utilizando Alamar Blue como se describió aquí anteriormente. Primero, se determinó el EC20 PB4188 y los fármacos probados. A continuación, se realizaron titulaciones en damero con PB4188 y los fármacos. Se observaron sinergias en todas las estirpes celulares probadas con inhibidores de tirosina quinasa (afatinib, lapatinib, neratinib), el inhibidor de PI3Ka BYL719, el inhibidor de Akt MK-2206, el inhibidor de mTOR everolimus, el inhibidor de Src saracatinib, el fármaco disruptor de microtúbulos paclitaxel y el Vorinostat inhibidor de HDAC (que está mal escrito en la Figura 40 como “voronistat”). La Figura 29 muestra un ejemplo de la combinación sinérgica de PB4188 con lapatinib sobre células SKBR-3 cultivadas en matrigel que da como resultado cambios morfológicos y reducción del crecimiento celular. Se calculó el grado de inhibición del crecimiento obtenido con cada combinación. El cambio de potencia se puede demostrar utilizando isobologramas (Greco et al 1995) que muestran cuánto menos fármaco se requiere en una combinación para lograr el nivel deseado en comparación con el agente único requerido para alcanzar ese efecto. Los valores de inhibición de los experimentos de combinación se utilizaron por el software CHALICE™ Analyzer para generar los isobologramas. Los isobologramas de las diferentes combinaciones de fármacos en células amplificadas con HER2 se muestran en la figura 40. El análisis de isobolograma indicó que PB4188 mostró combinaciones de fármacos sinérgicas con afatinib, lapatinib, neratinib, BYL719, MK-2206, everolimus, saracatinib, vorinostat y paclitaxel.
Estos datos demuestran que los fármacos que actúan sobre la ruta PI3K son particularmente eficaces en combinación con PB4188. Además, las combinaciones con inhibidores de tirosina quinasa son eficaces. Más aún, una combinación con el fármaco de crecimiento y migración/invasión saracatinib puede ser favorable en el contexto metastásico.
Inhibición de fosforilación in vitro de PB4188
Se recolectaron células de un cultivo de crecimiento exponencial y se sembraron en placas de 6 pocillos (3.75 x 106 células para N87 y 1.5 x 106 células para SKBR-3) en medio de inanición (células N87: RPMI-1640, BSA al 0.05 %, 10 |jg/ml de Holo-Transferrina; células SKBR-3: d Me M/F-12, L-glutamina 2 mM, BSA al 0.05%, 10 jg/m l de Holo-Transferrina) y se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa. Al día siguiente, se agregaron anticuerpos a una concentración final de 5 nM y las células se incubaron durante una hora a 37 °C, CO2 al 5 %, en una humedad relativa del 95 %. Luego se agregó HRG hasta una concentración final de 100 ng/ml. Después de 1, 3, 6 o 24 horas a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa, las placas se colocaron sobre hielo, las células se lavaron dos veces con PBS frío. Posteriormente se agregaron 0.3 ml de tampón de lisis enfriado con hielo (señalización celular RTK #9803 o IC #7018) y las células se lisaron durante un mínimo de 30 minutos sobre hielo. A continuación, se midieron las concentraciones de proteína utilizando BCA (Pierce # 23235). Las concentraciones de proteína se ajustaron a 2 mg/ml con tampón de lisis. A continuación, los lisados se aplicaron a Matrices de Anticuerpos de Señalización RTK PathScan (señalización Celular #7949) o Matrices de Anticuerpos de Señalización Intracelular PathScan. Todas las incubaciones se realizaron con pocillos sellados sobre un agitador orbital a temperatura ambiente. Los lisados (75 j l ) se diluyeron 2 veces a una concentración de 0.8 mg/ml con 75 j l de Tampón Diluyente de Matriz complementado con un cóctel inhibidor de proteasa y se mantuvieron sobre hielo. Los pocillos de la matriz se bloquearon con 100 j l de tampón de Bloqueo de Matriz durante 15 minutos. Se eliminó el tampón de bloqueo y se aplicaron lisados a los pocillos y se dejaron incubar durante 2 horas. Se aspiró el lisado y los pocillos se lavaron 4 veces con 100 j l de tampón de Lavado. A continuación, se agregaron 100 j l de cóctel de anticuerpos de detección por pocillo y se incubó durante 1 hora. Se aspiró el cóctel de anticuerpos y los pocillos se lavaron 4 veces con 100 j l de Tampón de Lavado. Se agregaron 75 j l de estreptavidina Dylight80™ a cada pocillo. Se aspiró estreptavidina Dylight80™ y los pocillos se lavaron 4 veces con 100 j l de tampón de Lavado. Se retiró la junta múltiple y se lavaron los portaobjetos durante 10 segundos en 10 ml en agua desionizada. Los portaobjetos se dejaron secar y se procesaron para la formación de imágenes sobre un Odysee®Clx. La intensidad de la fluorescencia puntual se calculó utilizando el software Image Studio.
En N87 y SKBR-3, PB4188 bloquea completamente la fosforilación de AKT durante las primeras 6H de incubación, en contraste con la combinación de trastuzumab pertuzumab. Además, se observa una fuerte inhibición en la fosforilación de ERK y S6 en contraste con la combinación de trastuzumab pertuzumab. PB4188 no inhibe la fosforilación de HER2 (Figura 30)
Análisis de transferencia Western
Para verificar la inhibición de la fosforilación observada en las matrices de RTK y Pathscan intracelular, se realizaron transferencias Western de células tratadas con PB4188, la combinación de pertuzumab y trastuzumab y un anticuerpo de control en presencia de concentraciones de estrés de HRG. Se recolectaron células de un cultivo de crecimiento exponencial y se sembraron en placas de 10 cm (20x106 células para N87 y 7x106 células para SKBR-3) en medio de inanición (células N87: RPMI-1640, BSA al 0.05%, 10 jg/m l de Holo-Transferrina; células SKBR-3: DMEM/F-12, L-glutamina 2 mM, BSA al 0.05%, 10 jg/m l de Holo-Transferrina). Al día siguiente, se agregaron anticuerpos a una concentración final de 5 nM y las células se incubaron durante una hora. Luego se agregó HRG hasta una concentración final de 100 ng/ml. Después de 1, 3, 6 o 24 horas, las placas se colocaron sobre hielo, las células se lavaron dos veces con PBS frío, se transfirieron a tubos Eppendorf y se lisaron con 250 j l de tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 20 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, Na2EDTA 1 mM, EGtA 1 mM, Np -40 al 1%, desoxicolato de sodio al 1%, SDS al 0.1%, pirofosfato de sodio 2.5 mM, beta-glicerofosfato 1 mM, Na3VO4 1 mM, leupeptina 1 jg/ml). Se dejó que la lisis procediera durante 30 minutos sobre hielo. Los lisados celulares se centrifugaron y los sobrenadantes se recolectaron en nuevos tubos Eppendorf. La concentración de proteínas se determinó mediante el método BCA (Pierce). Se separaron 30 jg del lisado sobre un gel Bis-Tris NuPage al 4-12% (Invitrogen) y las proteínas sobre el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante una hora con TBS-T que contenía un BSA al 5 % y se tiñeron con los anticuerpos indicados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cell Signaling Technology). A continuación, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP, se incubaron con sustrato ECL y se sometieron a autorradiografía utilizando películas de rayos X (Amersham). Todos los anticuerpos de detección fueron de Cell Signaling Technology: Phospho-Akt (ser 473) #4060, Total Akt #4691, Phospho-HER2 (Tyr 1221/1222) #2243, Total HER2 #2242, Phospho-HER3 (Tyr 1289) #4791, Total HER3 #4754, Phospho-ERK1/2 (Thr 202/Tyr 204) #4377, Total ERK1/2 #4695, Phospho-S6 RP (Ser 235/236) #2211, Total S6 RP #2217, Anti- conejo de cabra # 7074 ligado a HRP. Los resultados muestran que PB4188 muestra una inhibición prolongada de la fosforilación de HER3 que da como resultado la inhibición de la ruta de las quinasas MAPK y PI3 con un efecto profundo sobre la inhibición de la fosforilación de AKT (Figura 31).
Farmacodinamia in vivo de PB4188
Análisis de fosfoproteínas por Luminex
Los tumores (100 mm3) de ratones trasplantados con JIMT-1 tratados con 2 dosis de PB4188 y 4 dosis de PB4188 se eliminaron 24 H después de la dosificación. Los tumores se congelaron instantáneamente y se procesaron hasta convertirlos en polvo. Los lisados tumorales se prepararon a una concentración de 50 mg de tumor/ml utilizando Tampón de Lisis BioRad frío (suplementado con Factor 1 BioRad al 0.4 %, Factor 2 BioRad al 0.2 % y PMSF 2 mM) a las muestras de polvo congelado, incubadas a 4 °C sobre un balancín durante 60 minutos para asegurar una lisis completa. Las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos a 16000 xgy se dividieron en alícuotas. La proteína total se determinó utilizando los reactivos de ensayo de proteína Biorad DC de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ensayo Luminex: Las muestras de lisado tumoral JIMT-1 se procesaron y analizaron para: AKT (Ser473) Total y AKT (Thr308 utilizando kits Luminex disponibles comercialmente de Millipore (Cat # 48-618MAG (Lote No. 2532050), 46-645MAG (Lote No. 46645M-1K). Cada muestra se analizó por duplicado. Las diluciones se prepararon en diluyente de muestra para cargar un objetivo de aproximadamente 25 |jg de proteína por pocillo para todas las determinaciones de analito total y fosforilado. Los kits Millipore se utilizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Los tumores tratados con PB4188 mostraron un aumento en la expresión de Akt en comparación con los tumores no tratados. PB4188 inhibió completamente la fosforilación de AKT, tanto después de una dosis de dos semanas como después de una dosis de cuatro semanas (Figura 32).
Análisis de fosfoproteínas por ensayo VeraTag
Se extrajeron los tumores (100 mm3 o 400 mm3) de ratones trasplantados con JIMT-1 tratados con 1 o 2 dosis de PB4188 y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %. Los ratones que tenían tumores de 100 mm3 se sacrificaron 24 H después de una dosis única de PB4188 (25 mg/kg) mientras que los ratones que tenían tumores de 400 mm3 recibieron 2 dosis semanales de 25 mg/kg y se sacrificaron 4 H después de la dosificación. A continuación, las muestras se embebieron en parafina. Se cortaron secciones de 7 um de grosor con un micrótomo (LEICA) y se colocaron sobre portaobjetos de vidrio cargados positivamente (VWR) con el número de serie marcado. Los portaobjetos se secaron al aire durante 30 min y luego se hornearon en un horno calentado a 60 °C. Las siguientes muestras se procesaron para diferentes análisis VeraTag. Análisis de HER2 total (HT2) de acuerdo con la solicitud de patente de EE. UU. No.
12/340,436, análisis de HER3 total (H3T) de acuerdo con la patente de EE.UU. No. 8,349,574; Solicitud de patente de EE. UU. No. 2013/0071859 y finalmente heterodímero HER2-HER3 (H23D), HER3pY1289 (H3pY1289) y quinasa HER3-PI3 (H3PI3K) según la Solicitud de Patente Internacional. No. PCT/US2014/033208. En ambos regímenes de dosificación, se hizo evidente una reducción mediada por PB4188 significativa en los dímeros HER2: HER3 en comparación con los controles no tratados. No se observaron diferencias en el total de HER2, HER3 o HER3 fosforilado entre los tumores tratados con PB4188 y los controles. Los tumores que se analizaron 4 H después de la dosificación de PB4188 mostraron una reducción significativa en HER3-p85 (PI3K) en comparación con los controles no tratados.
PB4188 reduce la progresión del ciclo celular en células cancerosas estimuladas por HRG
Se investigó la capacidad de PB4188 para influir en la progresión del ciclo celular en estirpes de células cancerosas que expresan diversos niveles de proteína de HER2. Se sembraron células HER2 (MCF-7), HER2+++ (células JIMT-1, Sk -b R-3 y N87) en medio de ensayo (células MCF-7: RPMI-1640, BSA al 0.05 %, 10 jg/m l de Holo-Transferrina, piruvato de sodio 1 mM, MEM NEAA; JIMT-1: DMEM, BSA al 0.05 %, 10 jg/m l de Holo-Transferrina; células SK-BR-3: DMEM/F-12, L-glutamina 2 mM, BSA al 0.05 %, 10 jg/m l de Holo-Transferrina; células N87: RPMI-1640, BSA al 0.05 %, 10 jg/m l de Holo-Transferrina). Por pocillo de placa de 24 pocillos, 300.000 MCF-7, o 400.000 N87 o 150.000 SK-BR-3 o 150.000 JIMT-1 o células sembradas en 1 ml de medio de ensayo e incubadas durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % humedad relativa. Al día siguiente, se agregaron PB4188 o pertuzumab trastuzumab o PG3178 o PG1337 a las células en presencia de una concentración final de HRG de 1 o 100 ng/ml. Después de 24 hrs (para células JIMT-1, N87 o SK-BR-3) o 48 hrs (para células MCF-7) de incubación a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa, las células se complementaron con EdU (concentración final de 10 jM ) durante 2 horas antes de ser recolectadas y teñidas para la incorporación de EdU utilizando el kit Click-iT EdU AlexaFluor488 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Life Technologies, cat.no. C10425). Al menos 30 minutos antes de analizar las células mediante citometría de flujo sobre FACSCanto, las células se incubaron con colorante rojo lejano FxCycle 200 nM (Life Technologies, cat.no. F10348) y 100 jg/m l de ARNasa A (Life Technologies, cat.no. 12091-039). Los eventos se adquirieron en el canal AlexFluor488 (para la detección de EdU) y en el canal APC (para la tinción de ADN total con el colorante FxCycle). Los datos se analizaron al separar células individuales en un diagrama de dispersión de ancho FSC vs altura FSC, y subseparar las fases G0/G1, S y G2M del ciclo celular sobre un gráfico de dispersión APC vs AlexaFluor488, como poblaciones EdUnegAPClbajo, EdUpos y EdUnegAPCalto, respectivamente.
Los datos se representan como el índice de proliferación calculado al dividir el porcentaje de células en las fases S y G2/M por el porcentaje de células en la fase G0/G1. La Figura 34 muestra que PB4188 es consistentemente más potente que PG3178 o pertuzumab trastuzumab para inhibir la proliferación inducida por una concentración estándar (1 ng/ml) o alta (100 ng/ml) de HRG. A altas concentraciones de HRG, PB4188 todavía inhibe la progresión del ciclo celular.
PB4188 induce la internalización del receptor
Se midió el patrón de internalización de los anticuerpos utilizando tintes sensibles al pH. Esto se ha descrito en la técnica en el documento WO2013134686 A1 donde dichos tintes, cuando se acoplan a un anticuerpo, muestran una señal de fluorescencia aumentada cuando se exponen a un pH más bajo. Esto ocurre cuando los anticuerpos acoplados a colorante se internalizan desde la superficie de las células objetivo en endosomas ligeramente ácidos (pH 6-6.5) a lisosomas ácidos (pH inferior a 5.5). Para investigar si PB4188 se internaliza en las células cancerosas, el anticuerpo se acopló al colorante del sensor de pH con un grupo reactivo de éster succinimidílico (Promega, cat.no. CS1783A01) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como comparadores, se incluyeron anticuerpos marcados con colorante anti-HER2 (trastuzumab, pertuzumab, PG3958), anti-HER3 (PG3178, # Ab6) y control negativo (anti-toxina tetánica, PG1337). Se recolectaron células cancerosas SKBR-3 y N87 que sobreexpresan HER2 de un cultivo desarrollado exponencialmente y se sembraron en placas de 96 pocillos (15x103 células por pocillo) en 100 pl de medio de ensayo (células N87: RPMI-1640, BSA al 0.05 %, 10 pg/ml de Holo-Transferrina; células SKBR-3: DMEM/F-12, L-glutamina 2 mM, BSA al 0.05 %, 10 pg/ml de Holo-Transferrina) que contiene 1 ng/ml de HRG y se incuban durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %, en 95 % de humedad relativa. Al día siguiente, se agregaron 20 ml de anticuerpos marcados con colorante sensibles al pH para alcanzar una concentración final de 100 nM y las células se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %, en una humedad relativa del 95 %. Al día siguiente, las células se recogieron al recolectar células no adherentes y tripsinizando las células adherentes. Después de lavar las células con tampón FACS (PBS BSA al 0.5 % azida de sodio 0.1 %), las células se tiñeron con anti-IgG humana marcada con APC (Jackson Immunoresearch, cat.no. 109-136-098, dilución 1:100). Las células se analizaron mediante citometría de flujo en FACSCanto (BD Biosciences) midiendo las intensidades de fluorescencia media (MFI) de los canales de PE y APC para determinar la internalización y la unión superficial residual de los anticuerpos, respectivamente. Los datos que se muestran en la Figura 35 muestran que el PB4188 se internaliza en la misma medida que el trastuzumab, mientras que la combinación de trastuzumab pertuzumab conduce a una mayor internalización. La combinación de trastuzumab pertuzumab reduce la ADCC en comparación con trastuzumab solo (Figura 36). Por lo tanto, se prevé que el nivel de internalización de PB4188 no afecta la potencia de ADCC.
Generación y caracterización de variantes 3178 del anticuerpo anti-HER3
Se diseñaron variantes del anticuerpo anti-HER3 MF3178 con el objetivo de mejorar las propiedades del anticuerpo. Se introdujeron mutaciones en la región 1 del marco del gen VH (FR1), la región determinante de complementariedad 1 (CDR1), FR2, CDR2 y/o FR3, mientras que CDR3 y FR4 no se modificaron. El diseño incluyó, pero no se limitó a, mutaciones que se introdujeron para eliminar motivos de modificación postraduccional (PTM) (por ejemplo, al cambiar el motivo de desamidación NS a NQ), para reducir la hidrofobicidad de la superficie (por ejemplo, al cambiar I a T) o para aumentar el punto isoeléctrico (pl; por ejemplo, al cambiar Q por K). Las 20 variantes (Ver Figura 37) se expresaron como anticuerpo biespecífico combinado con un brazo de Toxoide Tetánico (TT) y se probaron en el ensayo funcional MCF-7 y las 20 variantes tenían una potencia similar a la del anticuerpo MF3178 en este formato. Las 20 variantes también se probaron en este formato en FACS en una titulación para la unión a MCF-7 y todas las variantes tenían perfiles de unión muy similares, lo que sugiere que las afinidades de todas las variantes son similares. Se seleccionaron tres variantes principales MF6058, MF6061 y MF6065 para experimentos adicionales que contenían diez, tres y siete mutaciones de aminoácidos, respectivamente (véanse las secuencias en la Figura 16E y la Figura 37). Las IgG1 PG6058, PG6061 y PG6065 monoespecíficas correspondientes se produjeron y purificaron a gran escala. Como se muestra en la Figura 38, la actividad inhibidora de las tres variantes en el ensayo de proliferación de la estirpe celular N87 dependiente de HRG es similar a la de PG3178. El perfil CIEX-HPLC de las tres variantes fue similar al de PG3178 con respecto a la heterogeneidad de carga, así como el ancho y la simetría del pico, como se muestra en la Figura 39. El tiempo de retención (tR) del pico principal se correlacionó aproximadamente con el pI de los anticuerpos, es decir, pI más alto, dieron como resultado un tiempo de retención más largo. En el diseño de anticuerpos biespecíficos o mezclas de anticuerpos, la selección de variantes de anticuerpos con tR óptimo es valiosa, ya que se puede facilitar la purificación de los componentes de anticuerpos deseados utilizando CIEX.
Títulos séricos de las diferentes cohortes de ratones inmunizados determinados por FACS. D = día de la determinación del título de anticuerpos. Tabla 1: respuesta frente a HER2. Tabla 2: respuesta frente a HER3. Se indican las estirpes celulares utilizadas (MCF7, SKBR3, BT474). Los diferentes ratones están en las columnas.
Tabla 1 res uesta anti-HER2
77 295 453 447 383 388 38
48 37 15 37 55 35 07
54 171 126 124 120 10
48 88 27 32 67 59
77 197 268 262 194 139 22
30 65 63 32 78 68 16
27 261 167 146 157 19
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69 57 26 33 83 13
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Tabla 2 res uesta anti-HER3
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Tabla 3
Unión de anticuerpos HER2 que depende de su reactividad con quimera de HER2 humano- pollo y reactividad a HER2 r n. El 'n m r ' in i l n m r ni r ni n r
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Tabla 4
ELISA de competencia utilizando anticuerpos de IgG y de fago. Se utilizan cuatro anticuerpos en el ensayo de competencia: dos anticuerpos HER2 que reconocen el dominio IV (trastuzumab) y PG1849); un anticuerpo que reconoce dominio II (PG2971) y un anticuerpo anti-RSV de control negativo. Se observa la pérdida de señal cuando el fago y anticuerpo codificado por los mismos genes de región variable están compitiendo; es decir MF1849 y PG1849 y MF2971 y PG2971
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Tabla 5
Unión de anticuerpos HER3 que dependen de su reactividad con quimera de HER2 humano-rata y reactividad a HER3 y HER r i . El 'n m r ' in i l n m r ni r ni n r
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Tabla 6
Actividad funcional de los monoclonales HER2 más potentes a 1 pg/ml de IgG. El porcentaje de actividad se compara con los anticuerpos de referencia, es decir trastuzumab en SKBR-3 y #Ab6 en MCF-7. Para los anticuerpos HER2 los dominios de todos los anticuer os exce to PG2926 se ma earon a dominios I III o IV.
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Tabla 7
Actividad funcional de los monoclonales HER3 más potentes a 1 |jg/ml de IgG en un ensayo MCF-7 dependiente de HRG. El r n ivi m r n l ni r r f r n i A
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Tabla 8
Las tinciones con FACS de anticuerpos HER2 mediante los cuales el HER2 VH se combina con una cadena ligera diferente de la cadena ligera común indicada en la figura 16. La MFI, indica Intensidad de Fluorescencia Media en FACS. El número HER2 MF es indicado entre paréntesis, los clones de unión HER2 en el contexto de la cadena ligera diferente se indican en gris.
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Tabla 9
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Tabla 10
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Tabla 11
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Tabla 12
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Tabla 13. Las reactividades (y rangos) de proteínas de unión medias se enumeran para todos los residuos críticos identificados. Los residuos críticos implicados en la unión de PG3958Fab se identificaron como aquellos mutados en clones que eran negativos para la unión de PG3958Fab (< 35 % WT) pero positivos para unión de mAb 1129 de control (> 80 % WT). Se identificaron dos residuos críticos adicionales que no cumplían con las pautas de umbral, pero cuya
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Tabla 14. Se enumeran las reactividades (y rangos) de la proteína de unión media para ambos residuos críticos. Los residuos críticos implicados en la unión de PG3178 se identificaron como aquellos mutados en clones que eran negativos para unión del mAb PG3178 (< 20 % WT) pero positivos para unión del mAb de control 66223 (> 70 % Wt ). La numeración de residuos es a uella de PDB ID # 4P59. ________________________________________________ ________________
PG3178 Unión mAb de control
peso de datos en % de peso de datos en clase Designación (rango (rango)
(8) 79.63 (0) Crítico
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5)
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93.08 (36)
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Crítico
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Tabla 15. Lista de residuos ex uestos dentro de un radio de 112 A de Ar 426 en HER3:
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Claims (38)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio 1 de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3, en el que el anticuerpo puede reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3.
2. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo puede reducir el crecimiento inducido por ligando de una célula positiva para ErbB2 y ErbB3.
3. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo puede reducir el crecimiento inducido por ligando de una célula positiva para ErbB2 y ErbB3, en el que dicha célula tiene al menos 100.000 receptores de superficie celular ErbB-2 por célula.
4. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha célula es una célula MCF-7, una célula SKBR-3, célula NCIN87, una célula BxPC-3, una célula BT-474 o una célula JIMT-1.
5. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el segundo sitio de unión al antígeno interfiere con la unión de un ligando ErbB-3 a ErbB-3.
6. Un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, en el que dicho primer sitio de unión al antígeno une el dominio I de ErbB-2 y dicho segundo sitio de unión al antígeno une el dominio III de ErbB-3.
7. Un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3, en el que la afinidad (KD) de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es igual a, o mayor que, la afinidad de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2.
8. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo puede reducir una función de receptor inducida por ligando de ErbB-3 sobre una célula positiva para ErbB2 y ErbB3.
9. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el anticuerpo puede reducir el crecimiento inducido por ligando de una célula positiva para ErbB2 y ErbB3.
10. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la afinidad (KD) de dicho segundo sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-3 es menor que o igual a 2.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 1.39 nM, más preferiblemente menor que o igual a 0.99 nM.
11. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la afinidad (KD) de dicho primer sitio de unión al antígeno para una célula positiva para ErbB-2 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.5 nM preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM.
12. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la afinidad (KD) de dicho anticuerpo biespecífico para las células BT-474 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 4.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 3.2 nM, y/o en el que la afinidad de dicho anticuerpo biespecífico para las células SK-BR-3 es menor que o igual a 5.0 nM, preferiblemente menor que o igual a 3.0 nM, más preferiblemente menor que o igual a 2.0 nM.
13. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicha célula positiva para ErbB-3 y/o dicha célula positiva para ErbB-2 es una célula BT-474 o una célula SK-BR-3.
14. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio I de ErbB-2 seleccionado del grupo que consiste en T144, T164, R166, P172, G179, S180 y R181, y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de aproximadamente 5 posiciones de aminoácido de T144, T164, R166, P172, G179, S180 o R181.
15. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende un sitio de unión al antígeno que une al menos un aminoácido de dominio III de ErbB-3 seleccionado del grupo que consiste y R426 y residuos de aminoácidos expuestos a la superficie que se ubican dentro de 11.2 A de R426 en la proteína ErbB-3 nativa.
16. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E.
17. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3 de la región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 de MF3958 como se representa en la Figura 16A.
18. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37.
19. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que dicho anticuerpo comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 de MF3178 como se representa en la Figura 16B.
20. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que dicho anticuerpo comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o en el que dicho anticuerpo comprende secuencias de CDR que difieren en a lo sumo 3 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 2 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1 aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031 o MF3003.
21. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1- 20, en el que dicho anticuerpo comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 de MF3958 como se representa en la Figura 16A, o en el que dicho anticuerpo comprende secuencias de CDR que difieren en a lo sumo 3 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 2 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1 aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3958.
22. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en el que dicho anticuerpo comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3178; MF3176; MF3163; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o en el que dicho anticuerpo comprende secuencias de CDR que difieren en a lo sumo 3 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 2 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1 aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178; MF3176; MF3163; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074.
23. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en el que dicho anticuerpo comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 de MF3178 como se representa en la Figura 16B, o en el que dicho anticuerpo comprende secuencias de CDR que difieren en a lo sumo 3 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 2 aminoácidos, preferiblemente en a lo sumo 1 aminoácido de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de MF3178.
24. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, y MF3003 como se representa en la Figura 16A o Figura 16E, o en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031 o MF3003.
25. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-24, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada específica de ErbB-2 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3958 como se representa en la Figura 16A, o en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3958.
26. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 y MF6074 como se representa en la Figura 16B o Figura 16E o Figura 37, o en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3178; MF3176; MF3163; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 o MF6074.
27. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3178 como se representa en la Figura 16B, o en el que dicho anticuerpo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que difiere en a lo sumo 15 aminoácidos de las secuencias de la región variable de la cadena pesada de MF3178.
28. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-27, que se afucosila para mejorar el ADCC.
29. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-28, que comprende dos diferentes cadenas pesadas de inmunoglobulinas con dominios de heterodimerización compatibles.
30. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 29, en el que dichos dominios de heterodimerización compatibles son dominios de heterodimerización de CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina compatibles.
31. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-30, en el que ambos brazos comprenden una cadena ligera común.
32. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 31, en el que dicha cadena ligera común es una cadena ligera de la línea germinal, preferiblemente una cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada que comprende el segmento del gen IgVKl-39, aún más preferiblemente la cadena ligera kappa humana de línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01.
33. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-32.
34. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-32, para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3.
35. Un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3 para uso en el tratamiento de un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en el que dicho tratamiento comprende administrar dicho anticuerpo biespecífico y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de un componente de la ruta PI3quinasa, un inhibidor de un componente de la ruta MAPK, un fármaco disruptor de microtúbulos y un inhibidor de HDAC, preferiblemente administrar dicho anticuerpo biespecífico y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de PI3Ka, un inhibidor de Akt, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de Src, vorinostat y paclitaxel, a un sujeto que tiene un tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3.
36. Un anticuerpo biespecífico de longitud completa que comprende un primer sitio de unión al antígeno que une el dominio I de ErbB-2 y un segundo sitio de unión al antígeno que une el dominio III de ErbB-3 para uso en el tratamiento o prevención de la formación de una metástasis de una célula de tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3, en la que dicha célula de tumor positivo para ErbB-2, ErbB-3 o ErbB-2/ErbB-3 tiene un nivel de expresión de herregulina que es al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 % o 95 % del nivel de expresión de herregulina de células de BXPC3 o MCF7.
37. Un anticuerpo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 34-36, en el que dicho sujeto tiene un tumor positivo para ErbB-2 o ErbB-2/ErbB-3 que tiene menos de 1.000.000 receptores de superficie celular ErbB-2 por célula.
38. Un uso in vitro de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-32 para contrarrestar, preferiblemente inhibir, la fosforilación de Akt, ERKy/o proteína ribosómica S6.
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