JP2020097590A - 医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
ための治療的(ヒト)抗体の分野に関する。より詳細には、本発明は、ErbB−2およ
びErbB−3に結合する抗体、ならびにErbB−2およびErbB−3陽性細胞、特
に腫瘍細胞との結合におけるそれらの使用に関する。
ワークとも呼ばれる)は、膜貫通受容体チロシン・キナーゼ(RTK)のファミリーであ
る。このファミリーは、ErbB−1(またはHERl)としても公知の上皮増殖因子受
容体(EGFR)、ならびに相同受容体ErbB−2(HER2)、ErbB−3(HE
R3)およびErbB−4(HER4)を含む。これらの受容体(YardenおよびP
ines、2012において概説される)は、上皮細胞上で広く発現される。HER受容
体またはそれらのリガンド、例えばヘレグリン(HRG)もしくは上皮増殖因子(EGF
)の上方調節は、ヒト癌において頻繁な事象である(Wilson、Fridlyand
ら、2012)。特に、ErbB−1およびErbB−2の過剰発現は、上皮腫瘍におい
て生じ、腫瘍浸潤、転移、化学療法に対する耐性、および予後不良と関連する(Zhan
g、Berezovら、2007)。正常乳房では、ErbB−3は、管腔上皮の成長お
よび分化において重要であることが示されている。例えば、ErbB−3の欠失/阻害は
、管腔上皮よりも基底側の選択的増大を生じる(Balko、Millerら、2012
)。RTKの細胞外ドメインへのリガンドの結合は、同じ(ホモ二量体化)受容体サブタ
イプ間および異なる(ヘテロ二量体化)受容体サブタイプ間の両方で、受容体二量体化を
誘導する。二量体化は、自己リン酸化を受ける細胞内チロシン・キナーゼ・ドメインを活
性化でき、次に、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)および生存促進性
経路Aktによって媒介されるものを含むいくつもの下流の増殖促進性シグナル伝達経路
を活性化できる(YardenおよびPines、2012に概説される)。特異的内因
性リガンドは、ErbB−2については同定されておらず、従って、これは通常、ヘテロ
二量体化を介してシグナル伝達すると仮定される(Sergina、Rauschら、2
007)。ErbB−3は、そのリガンドの会合によって活性化され得る。これらのリガ
ンドには、ニューレグリン(NRG)およびヘレグリン(HRG)が含まれるがこれらに
限定されない。
れらには、シグナル伝達のリガンド依存的およびリガンド非依存的な活性化がある。過剰
発現されたErbB−2は、ErbB−3リガンドの非存在下であっても、ErbB−2
:ErbB−3ヘテロ二量体を介した発癌性シグナル伝達を生成することができる(Ju
nttila、Akitaら、2009)。ErbB−2活性は、ErbB−2特異的抗
体によって阻害され得る。かかるErbB−2特異的抗体は、例えば、ErbB−2陽性
(HER2+)腫瘍の処置において使用される。かかる処置に伴う問題は、腫瘍がしばし
ばErbB−2特異的処置を逃避し、阻害抗体の存在下であっても成長し続けることであ
る。ErbB−2陽性腫瘍、例えば、乳房、卵巣、子宮頸部および胃の腫瘍は、上方調節
されたErbB−3発現(Ocana、Vera−Badilloら、2013)および
/またはErbB−3リガンド発現(Wilson、Fridlyandら、2012)
を示す腫瘍細胞の部位集団が選択的により早く成長することによって、処置を逃避し得る
ことが観察されている。また、ErbB−3受容体における活性化変異が同定されている
。
ノクローナル抗体トラスツズマブ(ハーセプチン)およびErbB−1特異的セツキシマ
ブ(アービタックス)がある。トラスツズマブは、転移性乳癌において証明された延命効
果を有する(Arteaga、Sliwkowskiら、2011)。トラスツズマブの
正確な作用機構は、はっきりとは確立されていない。作用の示唆された様式は、RTKシ
グナル伝達の阻害および抗体依存性細胞傷害(ADCC)の動員である。記載されてきた
他の作用機構には、ErbB−2細胞外ドメインのタンパク質分解性切断を遮断すること
、血管新生因子の阻害、および受容体エンドサイトーシスの増強が含まれる。ErbB−
2シグナル伝達を妨害する他の薬剤は、乳房および他のErbB−2過剰発現癌の処置の
ために承認されているか、または開発中である。例えば、化学化合物ラパチニブは、Er
bB−1およびErbB−2の両方のチロシン・キナーゼ活性を阻害し、ErbB−2増
幅された乳癌の第1選択の処置において使用される。
トラスツズマブに対する耐性が、通常治療を開始して数カ月以内に生じる。HER2+転
移性乳癌を有する患者のごく一部だけが、単剤トラスツズマブに応答し、進行癌における
耐性のde novo機構を示唆している。これらの機構には、とりわけ、他のHERフ
ァミリーの受容体からのシグナル伝達、およびHERファミリーではないRTKからの代
償的シグナル伝達が含まれる(Theryら、Resistance to human
epidermal growth factor receptor type 2
−targeted therapies、Eur J Cancer(2014)、第
50巻、第5号、892〜901頁(ttp://dx.doi.org/10.101
6/j.ejca.2014.01.003))。例えば、HER2と併せたHER3ま
たはそのリガンドの過剰発現は、HER−2/HER−3ヘテロ二量体の形成、およびト
ラスツズマブに対する耐性の獲得をもたらす。従って、抗体トラスツズマブは、ErbB
−3リガンドによって駆動されるシグナル伝達を遮断することにおいては無効であると考
えられる(Wehrman、Raabら、2006、Junttila、Akitaら、
2009、Theryら、2014)。
ことに基づいて、トラスツズマブと組み合わせた使用について承認された(Baselg
a、Cortesら、2012)。ペルツズマブもまた、トラスツズマブとは異なる位置
においてであるが、ErbB−2に結合する。
bB−3結合モノクローナル抗体は、前臨床研究においてその活性が実証されている(S
choeberl、Faberら、2010)。一部のErbB−3結合モノクローナル
抗体は、種々の癌の増殖および成長を阻害できる。
MM−111は、ErbB−2およびErbB−3に結合する2つの単鎖Fv(scFv
)断片を含む人工の生物学的分子である。2つのscFvは、分子の半減期を増加させる
ために、変異したヒト血清アルブミン(HSA)タンパク質と会合される。予備試験にお
いて、この分子は、ErbB−3シグナル伝達および増殖を阻害することが示された。こ
の効果は、比較的高い量のErbB−2を発現したErbB−3陽性細胞株において主に
測定された。
第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この抗体は、ErbB−2およびE
rbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。上記第
1の抗原結合部位は、好ましくは、図16Aまたは図16Eに示されるVH鎖MF292
6;MF2930;MF1849;MF2973;MF3004;MF3958(ヒト化
MF2971である);MF2971;MF3025;MF2916;MF3991(ヒ
ト化MF3004である);MF3031;MF2889;MF2913;MF1847
;MF3001;MF3003またはMF1898のアミノ酸配列を有するVH鎖を含む
可変ドメイン中に存在する。上記第2の抗原結合部位は、好ましくは、図16Bまたは図
16Eまたは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF
3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;
MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF606
4;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6
070;MF6071;MF6072;MF6073またはMF6074のアミノ酸配列
を有するVH鎖を含む可変ドメイン中に存在する。可変ドメイン中の免疫グロブリン軽鎖
は、好ましくは、図16Cのアミノ酸配列を含む。
体がさらに提供される。
を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法もまた提供し、
この方法は、本発明に従う二重特異性抗体を対象に投与することを含む。ErbB−2、
ErbB−3もしくはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、または有するリス
クがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体もまた提供され
る。
第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この二重特異性抗体は、ErbB−
2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘導性受容体機能を低減する
、または低減できる。
二重特異性抗体に由来する部位、好ましくはかかる二重特異性抗体上に存在する部位を指
す。未改変の抗原結合部位は、典型的には、抗体の可変ドメインによって形成され、かか
る抗体の可変ドメイン中に存在する。可変ドメインは、上記抗原結合部位を含む。抗原に
結合する可変ドメインは、抗原に結合する抗原結合部位を含む可変ドメインである。
領域(VL)を含む。抗原結合部位は、組み合わされたVH/VL可変ドメイン中に、ま
たはVH領域中にだけ、もしくはVL領域中にだけ、存在し得る。抗原結合部位が、可変
ドメインの2つの領域のうち一方中にだけ存在する場合、対応物の可変領域は、結合性可
変領域のフォールディングおよび/または安定性に寄与し得るが、抗原の結合自体には顕
著には寄与しない。
ErbB−2に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ErbB−2に結合し、他の点は同
一の条件下で、同じ種の相同受容体ErbB−1およびErbB−4に、少なくとも10
0分の1低く結合する。ErbB−3に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ErbB−
3に結合し、他の点は同一の条件下で、同じ種の相同受容体ErbB−1およびErbB
−4には結合しない。ErbBファミリーが細胞表面受容体のファミリーであることを考
慮すると、結合は、典型的には、受容体(複数可)を発現する細胞に関して評価される。
抗原への抗体の結合は、種々の方法で評価され得る。1つの方法は、抗体を抗原(好まし
くは、抗原を発現する細胞)と共にインキュベートし、未結合の抗体を除去し(好ましく
は、洗浄工程によって)、結合した抗体に結合する標識された抗体によって、結合した抗
体を検出することである。
れら2つの構造を正確に一緒に結合させる、抗体の相補性領域ならびに抗原および可変ド
メインの両方の特異的三次元構造を介して媒介される(錠および鍵と類似の相互作用)。
抗体は、典型的には、抗原のエピトープを認識し、かかるエピトープは、他の化合物中に
も同様に存在し得るので、ErbB−2および/またはErbB−3に結合する本発明に
従う抗体は、かかる他の化合物が同じエピトープを含む場合、他のタンパク質も同様に認
識し得る。従って、用語「結合」は、別のタンパク質または同じエピトープを含むタンパ
ク質(複数可)への抗体の結合を排除しない。かかる他のタンパク質(複数可)は、好ま
しくは、ヒト・タンパク質ではない。本発明において定義されるErbB−2抗原結合部
位およびErbB−3抗原結合部位は、典型的には、出生後の、好ましくは成人のヒトで
は、細胞の膜上の他のタンパク質に結合しない。本発明に従う二重特異性抗体は、典型的
には、以下により詳細に概説されるように、少なくとも1×10e−6Mの結合親和性で
、ErbB−2およびErbB−3に結合することが可能である。
ピトープに対するものであり、抗体が、ErbB−3への結合についてリガンドと競合す
ることを意味する。抗体は、リガンド結合を減退させ得、リガンドがErbB−3に既に
結合している場合にはこれを置き換え得、または、例えば立体障害を介して、リガンドが
ErbB−3に結合する可能性を少なくとも部分的に防止し得る。
のエピトープに結合する1または複数の可変ドメインを含む免疫グロブリン・クラスのタ
ンパク質に属するものを意味し、ここで、かかるドメインは、抗体の可変ドメイン由来で
あるか、またはかかる可変ドメインと配列相同性を共有する。治療的使用のための抗体は
、好ましくは、処置される対象の天然抗体に可能な限り近い(例えば、ヒト対象に対して
ヒト抗体)。抗体結合は、特異性および親和性に関して表現され得る。特異性は、どの抗
原またはそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されるかを決定する。親和
性は、特定の抗原またはエピトープへの結合の強さについての尺度である。特異的結合は
、少なくとも1×10e−6Mの、より好ましくは1×10e−7Mの、より好ましくは
1×10e−9Mよりも高い親和性(KD)での結合として定義される。典型的には、治
療的適用のための抗体は、最大で1×10e−10Mまたはそれより高い親和性を有する
。本発明の二重特異性抗体などの抗体は、天然抗体の定常ドメイン(Fc部分)を含む。
本発明の抗体は、典型的には、好ましくはヒトIgGサブクラスの、二重特異性全長抗体
である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトIgG1サブクラスの抗体である。本発明の
かかる抗体は、良好なADCC特性を有し、ヒトへのin vivo投与の際に好ましい
半減期を有し、クローナル細胞における共発現の際にホモ二量体よりもヘテロ二量体を優
先的に形成する改変された重鎖を提供できるCH3操作テクノロジーが存在する。
質的に完全な抗体を含むと定義されるが、かかる抗体は、インタクトな抗体の全ての機能
を有する必要はない。誤解を避けるために、全長抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖を
含む。各鎖は、定常(C)領域および可変(V)領域を含み、これらは、CH1、CH2
、CH3、VH、およびCL、VLと称されるドメインへと解体され得る。抗体は、Fa
b部分中に含まれる可変ドメインを介して抗原に結合し、結合後、定常ドメインを介して
、主にFc部分を介して、免疫系の分子および細胞と相互作用できる。用語「可変ドメイ
ン」、「VH/VL対」、「VH/VL」は、本明細書で相互交換可能に使用される。本
発明に従う全長抗体は、所望の特徴を提供する変異が存在し得る抗体を包含する。かかる
変異は、これらの領域のいずれかの多くの部分の欠失であるべきではない。しかし、得ら
れた抗体の結合特徴を本質的に変更することなしに1またはいくつかのアミノ酸残基が欠
失されている抗体は、用語「全長抗体」内に包含される。例えば、IgG抗体は、定常領
域中に、1〜20アミノ酸残基の挿入、欠失またはそれらの組み合わせを有し得る。例え
ば、抗体自体が低いADCC活性を有する場合、抗体の定常領域を僅かに改変することに
よって、抗体のADCC活性は改善され得る(Junttila,T.T.、K.Par
sonsら(2010)、「Superior In vivo Efficacy o
f Afucosylated Trastuzumab in the Treatm
ent of HER2−Amplified Breast Cancer」、Can
cer Research 70(11):4481〜4489)。
の(ヒト)分子に近いものである必要性に起因して、好ましい。本発明の抗体は、好まし
くは、二重特異性IgG抗体、好ましくは、二重特異性全長IgG1抗体である。IgG
1は、ヒトにおけるその長い循環半減期に基づいて好ましい。ヒトにおけるいずれの免疫
原性をも防止するために、本発明に従う二重特異性IgG抗体は、ヒトIgG1であるこ
とが好ましい。
つのエピトープに結合する一方で、第2の部分が異なるエピトープに結合することを意味
する。この異なるエピトープは、典型的には、異なる抗原上に存在する。本発明によれば
、この第1および第2の抗原は、事実上、2つの異なるタンパク質である。好ましい二重
特異性抗体は、2つの異なるモノクローナル抗体の部分を含む抗体であり、結果として、
2つの異なる型の抗原に結合する。二重特異性抗体の一方のアームは、典型的には、1つ
の抗体の可変ドメインを含み、他方のアームは、別の抗体の可変ドメインを含む。本発明
の二重特異性抗体の重鎖可変領域は、典型的には互いに異なるが、軽鎖可変領域は、好ま
しくは、本発明の二重特異性抗体において同じである。異なる重鎖可変領域が同じまたは
共通の軽鎖と結び付けられている二重特異性抗体は、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体
とも呼ばれる。従って、両方のアームが共通の軽鎖を含む、本発明に従う二重特異性抗体
が、さらに提供される。
鎖の共発現によって得ることができる。野生型CH3ドメインが使用される場合、2つの
異なる重鎖および1つの共通の軽鎖の共発現は、3つの異なる種、AA、ABおよびBB
を生じる。所望の二重特異性産物(AB)の百分率を増加させるために、CH3操作が使
用でき、または言い換えれば、本明細書の以下に定義されるような、適合的な(comp
atible)ヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用できる。
ドメインA’が、操作されたドメインB’とのヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた
然りであるが、A’−A’間およびB’−B’間のホモ二量体化は減退されるように操作
されている、タンパク質ドメインを指す。
配列差異を有し得る軽鎖を指すが、全長抗体の結合特異性は影響されないものを指す。例
えば、本明細書で使用する場合、共通の軽鎖の定義の範囲内で、例えば、保存的アミノ酸
変化、重鎖とペアリングした場合に結合特異性に寄与しないまたは部分的にのみ寄与する
領域中のアミノ酸の変化を導入および試験することなどによって、同一ではないがなおも
機能的に等価物である軽鎖を調製および見出すことが可能である。用語「共通の軽鎖」、
「共通のVL」、「単一軽鎖」、「単一VL」は、全て、用語「再編成された」の付加あ
りまたはなしで、本明細書で相互交換可能に使用される。機能的抗原結合ドメインを有す
る抗体を形成するために異なる重鎖と結びつき得るヒト軽鎖を共通の軽鎖として使用する
ことは、本発明の一態様である(WO2004/009618、WO2009/1577
71、Merchantら、1998およびNissimら、1994)。好ましくは、
共通の軽鎖は、生殖系列配列を有する。好ましい生殖系列配列は、ヒト・レパートリーに
おいて頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収量および溶解度を有する軽鎖可変領域
である。好ましい生殖系列軽鎖は、O12、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カ
ッパ軽鎖IgVκ1−39*01/IGJκ1*01またはその断片もしくは機能的等価
物(即ち、同じIgVκ1−39遺伝子セグメントであるが、異なるIGJκ遺伝子セグ
メント)である(imgt.orgにおけるIMGTデータベース・ワールドワイド・ウ
ェブに従う命名法)。従って、共通の軽鎖が、生殖系列軽鎖、好ましくは、IgVKl−
39遺伝子セグメントを含む再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖、最も好ましくは、
再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖IgVKl−39*01/IGJKl*01であ
る、本発明に従う二重特異性抗体が、さらに提供される。用語、再編成された生殖系列ヒ
ト・カッパ軽鎖IgVκ1−39*01/IGJκ1*01、IGKV1−39/IGK
J1、huVκ1−39軽鎖、または短くhuVκ1−39は、本出願を通じて相互交換
可能に使用される。明らかに、当業者は、「共通の」が、そのアミノ酸配列が同一でない
軽鎖の機能的等価物もまた指すことを認識する。機能的結合領域の形成に実質的に影響し
ない変異(欠失、置換、付加)が存在する、上記軽鎖の多くのバリアントが存在する。本
発明の軽鎖はまた、1〜5アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有す
る、本明細書の上で特定した軽鎖であり得る。
ン中のVHとペアリングしたVLが、第2の抗原を特異的に認識することが可能である抗
体もまた、企図される。得られたVH/VL対は、抗原1または抗原2のいずれかに結合
する。例えばWO2008/027236、WO2010/108127およびScha
eferら(Cancer Cell 20、472〜486、2011年10月)に記
載される、かかるいわゆる「ツー・イン・ワン抗体」は、本発明の二重特異性抗体とは異
なるが、さらに「ツー・イン・ワン」抗体と呼ぶ。かかる「ツー・イン・ワン」抗体は、
同一のアームを有し、本発明の抗体ではない。
伝子によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子またはタンパク質の代替名には
、CD340;HER−2;HER−2/neu;MLN 19;NEU;NGL;TK
R1が含まれる。このERBB−2遺伝子は、しばしばHER2と呼ばれる(ヒト上皮増
殖因子受容体2から)。本明細書でErbB−2に対する言及がなされる場合、この言及
は、ヒトErbB−2を指す。ErbB−2に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒト
ErbB−2に結合する。ErbB−2抗原結合部位は、ヒト・オルソログと他の哺乳動
物オルソログとの間の配列および三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結
合し得るが、必ずしも結合しなくともよい。ヒトErbB−2タンパク質およびそれをコ
ードする遺伝子についてのデータベース登録番号は、(NP_001005862.1、
NP_004439.2 NC_000017.10 NT_010783.15 NC
_018928.2)である。これらの登録番号は、標的としてのErbB−2の同定の
さらなる方法を提供するために主に与えられ、抗体によって結合されるErbB−2タン
パク質の実際の配列は、例えば、一部の癌において生じるものなどの、コード遺伝子中の
変異などに起因して、変動し得る。ErbB−2抗原結合部位は、ErbB−2およびそ
れらの種々のバリアント、例えば、一部のErbB−2陽性腫瘍細胞によって発現される
ものに結合する。
伝子によってコードされるタンパク質を指す。この遺伝子またはタンパク質の代替名は、
HER3;LCCS2;MDA−BF−1;c−ErbB−3;c−erbb−3;er
bb−3−S;p180−Erbb−3;p45−sErbb−3;およびp85−sE
rbb−3である。本明細書でErbB−3に対する言及がなされる場合、この言及は、
ヒトErbB−3を指す。ErbB−3に結合する抗原結合部位を含む抗体は、ヒトEr
bB−3に結合する。ErbB−3抗原結合部位は、ヒト・オルソログと他の哺乳動物オ
ルソログとの間の配列および三次構造の類似性に起因して、かかるオルソログにも結合し
得るが、必ず結合するわけではない。ヒトErbB−3タンパク質およびそれをコードす
る遺伝子についてのデータベース登録番号は、(NP_001005915.1 NP_
001973.2、NC_000012.11 NC_018923.2 NT_029
419.12)である。これらの登録番号は、標的としてのErbB−3の同定のさらな
る方法を提供するために主に与えられ、抗体によって結合されるErbB−3タンパク質
の実際の配列は、例えば、一部の癌において生じるものなどの、コード遺伝子中の変異な
どに起因して、変動し得る。ErbB−3抗原結合部位は、ErbB−3およびそれらの
種々のバリアント、例えば、一部のErbB−2陽性腫瘍細胞によって発現されるものに
結合する。
結合部位を含む本発明の二重特異性抗体は、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上
のErbB−3のリガンド誘導性受容体機能を低減できるまたは低減する。過剰なErb
B−2の存在下では、ErbB−2/ErbB−3ヘテロ二量体は、ヘテロ二量体中のE
rbB−3鎖に対する検出可能なリガンドの非存在下で、発現細胞に成長シグナルを提供
し得る。このErbB−3受容体機能は、本明細書で、ErbB−3のリガンド非依存的
受容体機能と呼ばれる。このErbB−2/ErbB−3ヘテロ二量体は、ErbB−3
リガンドの存在下でも、発現細胞に成長シグナルを提供する。このErbB−3受容体機
能は、本明細書で、ErbB−3のリガンド誘導性受容体機能と呼ばれる。
よび活性化するポリペプチドを指す。ErbB−3リガンドの例には、ニューレグリン1
(NRG)およびニューレグリン2、ベータセルリン、ヘパリン結合性上皮増殖因子なら
びにエピレグリンが含まれるがこれらに限定されない。この用語は、天然に存在するポリ
ペプチドの生物学的に活性のある断片および/またはバリアントを含む。
bB−2およびErbB−3陽性細胞のErbB−3リガンド誘導性成長である。好まし
い一実施形態では、この細胞は、MCF−7細胞(ATCC(登録商標)HTB−22(
商標));SKBR3(ATCC(登録商標)HTB−30(商標))細胞;NCI−8
7(ATCC(登録商標)CRL−5822(商標))細胞;BxPC−3−luc2細
胞(Perkin Elmer 125058)、BT−474細胞(ATCC(登録商
標)HTB−20(商標))またはJIMT−1細胞(DSMZ番号:ACC 589)
である。
上に、少なくとも50.000のErbB−2受容体を含む。好ましい一実施形態では、
少なくとも100.000のErbB−2受容体。好ましい一実施形態では、このErb
B−2およびErbB−3陽性細胞は、細胞表面上に、少なくとも1.000.000の
ErbB−2受容体を含む。別の好ましい一実施形態では、このErbB−2およびEr
bB−3陽性細胞は、細胞表面上に、1.000.000以下のErbB−2受容体を含
む。現在使用されている治療、例えば、トラスツズマブ(ハーセプチン)およびペルツズ
マブは、臨床応答を得るために、その細胞表面上に1.000.000超のErbB−2
受容体を有する悪性ErbB−2陽性細胞を有する患者のみに処方される。その細胞表面
上に1.000.000超のErbB−2受容体を有するErbB−2陽性腫瘍細胞を有
する患者は、典型的には、ErbB−2[+++]と分類される。患者は、例えば、共に
Dako Denmark A/Sによって市販されるHercepTest(商標)お
よび/もしくはHER2 FISH(pharm Dx(商標))を使用して、ならびに
/またはMonogram Biosciencesによって市販されるHERmark
(登録商標)アッセイを使用して、分類される。トラスツズマブおよびペルツズマブは、
ErbB−2[+++]患者のみに処方されるが、それは、より低いErbB−2濃度を
有する患者は、典型的には、トラスツズマブおよびペルツズマブで処置した場合に十分な
臨床応答を示さないからである。しかし、本発明は、トラスツズマブと比較して、より低
いErbB−2受容体濃度を有する細胞に対する改善された結合親和性もまた有する二重
特異性抗体を提供する。実施例に示されるように、より低いErbB2発現を有するかか
る細胞の増殖は、本発明に従う抗体により効率的に対抗される。かかるより低いErbB
−2受容体濃度は、ErbB−2[++]またはErbB−2[+]と分類された患者の
悪性細胞上に存在する。また、再発したErbB−2陽性腫瘍は、細胞1つ当たり1.0
00.000未満の受容体のErbB−2受容体濃度を有する場合が多い。従って、かか
るErbB−2[++]またはErbB−2[+]患者、ならびに再発したErbB−2
陽性腫瘍を有する患者は、好ましくは、本発明に従う二重特異性抗体で処置される。従っ
て、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗
原結合部位を含む二重特異性抗体がさらに提供され、この抗体は、1.000.000未
満のErbB−2細胞表面受容体を有するErbB−2およびErbB−3陽性細胞のリ
ガンド誘導性成長を低減できる。ErbB−2、ErbB−3もしくはErbB−2/E
rbB−3陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための
方法もまた提供され、この腫瘍は、細胞1つ当たり1.000.000未満のErbB−
2細胞表面受容体を有し、この方法は、本発明に従う二重特異性抗体または医薬組成物を
対象に投与することを含む。ErbB−2、ErbB−3もしくはErbB−2/Erb
B−3陽性腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のた
めの、本発明に従う二重特異性抗体もまた、本明細書で提供され、この腫瘍は、細胞1つ
当たり1.000.000未満のErbB−2細胞表面受容体を有する。本発明に従う抗
体は、典型的には、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガン
ド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発
明に従う抗体は、好ましくは、ErbB−2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位
およびErbB−3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましい一
実施形態では、ErbB−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、本明細書
で以下により詳細に説明するように、ErbB−2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位
の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。ErbB−3陽性細胞に対する第2の抗原
結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.39nM以下、よ
り好ましくは0.99nM以下である。ErbB−2陽性細胞に対する第1の抗原結合部
位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.
0nM以下である。
72、G179、S180およびR181、ならびにT144、T164、R166、P
172、G179、S180またはR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面
に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−2のドメインIの少なく
とも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
ブErbB−3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内に位置する、
表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−3のドメインIII
の少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
bB−3増幅および/または免疫組織化学における染色を行うことできる。生検中に少な
くとも10%の腫瘍細胞がある場合、陽性とすべきである。生検はまた、20%、30%
40% 50% 60% 70%またはそれ超の陽性細胞を含み得る。
は少なくとも30、40、50 60または少なくとも70%低減され、特に好ましい一
実施形態では、このリガンド誘導性受容体機能は、80%、より好ましくは90%低減さ
れる。この低減は、好ましくは、本発明の二重特異性抗体の存在下でリガンド誘導性受容
体機能を決定し、それを、他の点では同一の条件下で当該抗体の非存在下での同じ機能と
比較することによって、決定される。これらの条件は、ErbB−3リガンドの存在を少
なくとも含む。存在するリガンドの量は、好ましくは、ErbB−2およびErbB−3
陽性細胞株の最大成長の半分を誘導する量である。この試験のためのErbB−2および
ErbB−3陽性細胞株は、好ましくは、MCF−7細胞株(ATCC(登録商標)HT
B−22(商標))、SKBR3細胞株(ATCC(登録商標)HTB−30(商標))
細胞、JIMT−1細胞株(DSMZ ACC 589)またはNCI−87細胞株(A
TCC(登録商標)CRL−5822(商標))である。ErbB−3リガンド誘導性受
容体機能を決定するための試験および/またはリガンドは、好ましくは、実施例に特定さ
れるような、ErbB−3リガンド誘導性成長低減についての試験である。
east Cancer Res.2007;9(1):202〜の図1を、参考のため
に参照のこと)。これらの細胞外ドメインは、ドメインI〜IVと呼ばれる。本明細書に
記載される抗体の抗原結合部位のそれぞれのドメインへの結合の場所は、マッピングされ
ている(実施例を参照のこと)。ErbB−2のドメインIまたはドメインIVに結合す
る抗原結合部位(第1の抗原結合部位)(第1の抗原結合部位)を有する本発明の二重特
異性抗体は、種々の軽鎖と組み合わせた場合に、ErbB−2に対する顕著な結合特異性
および親和性を維持する重鎖可変領域を含む。ErbB−2のドメインIまたはドメイン
IVに結合する抗原結合部位(第1の抗原結合部位)(第1の抗原結合部位)およびEr
bB−3に対する抗原結合部位(第2の抗原結合部位)を有する二重特異性抗体は、Er
bB−2の別の細胞外ドメインに結合する抗原結合部位(第1の抗原結合部位)を含む二
重特異性抗体と比較した場合、ErbB−3のリガンド誘導性受容体機能を低減させるの
により有効であることが見出された。ErbB−2に結合する抗原結合部位(第1の抗原
結合部位)を含む二重特異性抗体であって、この抗原結合部位が、ErbB−2のドメイ
ンIまたはドメインIVに結合する抗体が、好ましい。好ましくは、この抗原結合部位は
、ErbB−2のドメインIVに結合する。ErbB−2に結合し、ADCCをさらに含
む抗原結合部位(第1の抗原結合部位)を有する二重特異性抗体は、特にin vivo
で顕著なADCC活性を有さなかった他のErbB−2結合抗体よりも、有効であること
が見出された。従って、ADCCを示す本発明に従う二重特異性抗体が好ましい。第1の
抗原結合部位がErbB−2のドメインIVに結合する抗体は、固有のADCC活性を有
することが見出された。低い固有のADCC活性を有する、ドメインI結合性のErbB
−2結合抗体は、ADCC活性を増強するために操作され得る。Fc領域は、免疫エフェ
クター細胞、例えば、マクロファージ、ナチュラル・キラー細胞、B細胞および好中球上
の異なる受容体に結合することによって、抗体機能を媒介する。これらの受容体の一部、
例えば、CD16A(FcγRIIIA)およびCD32A(FcγRIIA)は、細胞
を活性化して、抗原に対する応答を構築させる。他の受容体、例えばCD32Bは、免疫
細胞の活性化を阻害する。(アミノ酸置換を導入することによって)より高い選択性で活
性化受容体に結合するFc領域を操作することによって、抗癌Mabによる所望の細胞傷
害活性を媒介するより高い能力を有する抗体が創出され得る。
ttila,T.T.、K.Parsonsら(2010)、「Superior In
vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzum
ab in the Treatment of HER2−Amplified Br
east Cancer」、Cancer Research 70(11):4481
〜4489を参照のこと)。従って、非フコシル化されている、本発明に従う二重特異性
抗体が、さらに提供される。あるいは、またはさらに、例えば糖鎖工学(Kyowa H
akko/Biowa、GlycArt(Roche)およびEureka Thera
peutics)および変異誘発(XencorおよびMacrogenics)を含む
複数の他の戦略が、ADCC増強を達成するために使用され得、これらの戦略は全て、低
親和性活性化FcγRIIIaへのFc結合を改善し、および/または低親和性阻害性F
cγRIIbへの結合を低減させようとするものである。
、いくつかのin vitro方法が存在する。これらには、クロム−51[Cr51]
放出アッセイ、ユーロピウム[Eu]放出アッセイおよび硫黄−35[S35]放出アッ
セイがある。通常、表面に露出した特定の抗原を発現する標識された標的細胞株は、その
抗原に特異的な抗体と共にインキュベートされる。洗浄後、Fc受容体CD16を発現す
るエフェクター細胞は、典型的には、抗体標識された標的細胞と共に共インキュベートさ
れる。標的細胞溶解は、引き続いて、典型的には、例えば、シンチレーション・カウンタ
ーまたは分光光度法によって、細胞内標識の放出によって測定される。好ましい試験は、
実施例中に詳述される。
188などの本発明に従う抗体の結合が、トラスツズマブと比較して同じ程度までの内部
移行を生じるという事実である。トラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせが使用
される場合、これらの抗体の内部移行が増強される。しかし、この増強された内部移行は
、低減されたADCCを生じる。従って、トラスツズマブと比較して本質的に同じ程度ま
での内部移行を生じる本発明に従う抗体は、トラスツズマブおよびペルツズマブの組み合
わせよりも好ましいが、それは、かかる抗体を用いると、ADCC活性がより良く維持さ
れるからである。
B−3リガンドの結合を妨害する。かかる抗体は、特に、ErbB−2に結合する抗原結
合部位も含む二重特異性抗体において、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞株上の
ErbB−3のリガンド誘導性受容体機能を低減させるのに、より有効である。
bB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原
結合部位は、ErbB−2のドメインIに結合する。実施例に示されるように、これらの
特徴を有する二重特異性抗体は、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞に結合し、そ
れらの活性(例えば、ErbB−3のリガンド誘導性受容体機能ならびにErbB−2お
よびErbB3陽性細胞のリガンド誘導性成長)に対抗することが十分に可能である。さ
らに、ErbB−2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位を含む本発明に従う二重
特異性抗体は、トラスツズマブおよびペルツズマブなどの既存の抗ErbB−2治療と組
み合わせた使用のために特に適切であるが、それは、トラスツズマブおよびペルツズマブ
が、ErbB−2の異なるドメインに結合するからである。トラスツズマブは、ErbB
−2のドメインIVに結合し、ペルツズマブは、ErbB−2のドメインIIに結合する
。従って、ErbB−2のドメインIに結合する本発明に従う二重特異性抗体が好ましい
が、それは、これらが、同じエピトープについてトラスツズマブおよびペルツズマブと競
合しないからである。
B−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第2の抗原結
合部位は、ErbB−3のドメインIIIに結合する。本発明に従うかかる抗体は、Er
bB−3のドメインIIIに結合しない現在使用されている抗ErbB−3結合分子、例
えば、ErbB−3のドメインIに結合するMM−121(Merrimack Pha
rmaceuticals;#Ab6とも呼ばれる)およびRG7116(Roche)
との組み合わせ治療に特に適切であるが、それは、これらの異なる結合分子が、同じエピ
トープについて互いと競合しないからである。
る第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体が提供され、この第1の抗原結合部位は、E
rbB−2のドメインIに結合し、第2の抗原結合部位は、ErbB−3のドメインII
Iに結合する。かかる抗体は、ErbB−2のドメインIに結合しない抗ErbB−2結
合分子、例えば、トラスツズマブおよびペルツズマブとの、ならびにErbB−3のドメ
インIIIに結合しない抗ErbB−3結合分子、例えば、MM−121(#Ab6)お
よびRG7116との組み合わせ治療に特に適切である。
3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部
位は、ErbB−2のドメインIに結合し、第2の抗原結合部位は、ErbB−3のドメ
インIIIに結合し、この抗体は、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErb
B−3のリガンド誘導性受容体機能を低減できる。この抗体は、好ましくは、ErbB−
2およびErbB−3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる。
bB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、ErbB−3陽
性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB−2陽性細胞に対する
第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。例えば、ErbB−3
に対してよりもErbB−2に対してより高い親和性を有する、Merrimack P
harmaceuticalsのMM−111などの先行技術の二重特異性化合物とは対
照的に、本発明は、細胞上のErbB−2に対するErbB−2特異的アームの親和性よ
りも高い、細胞上のErbB−3に対する親和性を有するErbB−3特異的アームを有
する二重特異性抗体を提供する。かかる二重特異性抗体は、ErbB−3の低い細胞表面
濃度にもかかわらず、ErbB−3をより良く結合することが可能である。これは、Er
bB−3に対する機能的活性が、先行技術の化合物と比較して増強されるという利点を提
供し、これは、本発明に従うこれらの二重特異性抗体が、ErbB−3活性(例えば、リ
ガンド誘導性成長)により良く対抗することが可能であることを意味する。
は2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.39nM以下、
より好ましくは0.99nM以下である。好ましい一実施形態では、SK−BR−3細胞
上のErbB−3に対するこの第2の抗原結合部位の親和性は、2.0nM以下、より好
ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.39nM以下、好ましくは0.99nM以
下である。一実施形態では、この親和性は、1.39〜0.59nMの範囲内である。好
ましい一実施形態では、BT−474細胞上のErbB−3に対するこの第2の抗原結合
部位の親和性は、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.
0nM以下、より好ましくは0.5nM未満、より好ましくは0.31nM以下、より好
ましくは0.23nM以下である。一実施形態では、この親和性は、0.31〜0.15
nMの範囲内である。上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して
測定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用
して4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
は5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下、より好ましくは3.9nM以下であ
る。好ましい一実施形態では、SK−BR−3細胞上のErbB−2に対するこの第1の
抗原結合部位の親和性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは
4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましくは3.0nM以下、より
好ましくは2.3nM以下である。一実施形態では、この親和性は、3.0〜1.6nM
の範囲内である。好ましい一実施形態では、BT−474細胞上のErbB−2に対する
この第1の抗原結合部位の親和性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より
好ましくは3.9nM以下である。一実施形態では、この親和性は、4.5〜3.3nM
の範囲内である。上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測定
され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して
4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
に対するこの二重特異性抗体の親和性(KD)は、5.0nM以下、好ましくは4.5n
M以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましく
は3.7nM以下、好ましくは3.2nM以下である。一実施形態では、この親和性は、
3.7〜2.7nMの範囲内である。好ましい一実施形態では、本発明に従う二重特異性
抗体が提供され、SK−BR−3細胞に対するこの二重特異性抗体の親和性は、5.0n
M以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3
.5nM以下、より好ましくは3.0nM以下、好ましくは2.5nM以下、より好まし
くは2.0nM以下である。一実施形態では、この親和性は、2.4〜1.6nMの範囲
内である。重ねて、上述の親和性は、好ましくは、定常状態細胞親和性測定を使用して測
定され、ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用し
て4℃でインキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
びErbB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、ErbB
−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB−2陽性細胞に
対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高く、この抗体は、E
rbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘導性受容体機能を
低減できる。この抗体は、好ましくは、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞のリガ
ンド誘導性成長を低減できる。
ErbB2のドメインIおよび/またはErbB−3のドメインIIIに結合する。従っ
て、ErbB−2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合
する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供され、Erb
B−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB−2陽性細胞
に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。ErbB−2
に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3のドメインIIIに結合する第2の抗
原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体もまた提供され、ErbB−3陽性細胞
に対する第2の抗原結合部位の親和性は、ErbB−2陽性細胞に対する第1の抗原結合
部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。特に好ましい一実施形態では、Erb
B−2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3のドメインIII
に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体が提供され、Erb
B−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、ErbB−2陽性細胞に対する
第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。
.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、好ましくは1.39nM以下、より好ま
しくは0.99nM以下である、ErbB−3陽性細胞に対する親和性(KD)を有する
。好ましい一実施形態では、この第2の抗原結合部位は、ErbB−3のドメインIII
に結合し、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、好ましくは1.39nM以
下、より好ましくは0.99nM以下である、SK−BR−3細胞上のErbB−3に対
する親和性を有する。一実施形態では、この親和性は、1.39〜0.59nMの範囲内
である。好ましい一実施形態では、この第2の抗原結合部位は、ErbB−3のドメイン
IIIに結合し、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.
0nM以下、より好ましくは0.5nM以下、より好ましくは0.31nM以下、より好
ましくは0.23nM以下である、BT−474細胞上のErbB−3に対する親和性を
有する。一実施形態では、この親和性は、0.31〜0.15nMの範囲内である。
nM以下、より好ましくは4.5nM以下、より好ましくは3.9nM以下である、Er
bB−2陽性細胞に対する親和性(KD)を有する。好ましい一実施形態では、この第1
の抗原結合部位は、ErbB−2のドメインIに結合し、5.0nM以下、より好ましく
は4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、よ
り好ましくは3.0nM以下、より好ましくは2.5nM以下、より好ましくは2.3n
M以下である、SK−BR−3細胞上のErbB−2に対する親和性を有する。一実施形
態では、この親和性は、3.0〜1.6nMの範囲内である。SK−BR−3細胞に対す
るこの二重特異性抗体の親和性は、好ましくは5.0nM以下、より好ましくは4.5n
M以下、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.5nM以下、より好ましく
は3.0nM以下、より好ましくは2.5nM以下、より好ましくは2.4nM以下、よ
り好ましくは2.0nM以下である。一実施形態では、この親和性は、2.4〜1.6n
Mの範囲内である。
合し、5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下、好ましくは3.9nM以下であ
る、BT−474細胞上のErbB−2に対する親和性(KD)を有する。一実施形態で
は、この親和性は、4.5〜3.3nMの範囲内である。BT−474細胞に対するこの
二重特異性抗体の親和性は、好ましくは5.0nM以下、より好ましくは4.5nM以下
、より好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.7nM以下、より好ましくは3.
2nM以下である。一実施形態では、この親和性は、3.7〜2.7nMの範囲内である
。
ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃で
インキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
B−3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、こ
の抗体は、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘導性
受容体機能を低減でき、この二重特異性抗体は、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えな
い。心臓毒性は、ErbB−2標的化治療における公知の危険因子であり、合併症の頻度
は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用され、それによって、心臓負荷を
誘導する場合に、増加する。例えば、ドキシサイクリン(DOX)とトラスツズマブとの
組み合わせは、重症の心臓副作用を誘導する。臨床研究により、乳癌のアジュバント設定
においてトラスツズマブを投与される患者の5%〜10%が、心機能不全を発症すると推
定されている(Guarneriら、J Clin Oncol.、1985、3:81
8〜26;Ewer MSら、Nat Rev Cardiol 2010;7:564
〜75)。しかし、レトロスペクティブ研究において、無症候性心機能不全を発症するリ
スクが、実際には、トラスツズマブがDOXと共にアジュバント設定において使用される
場合、約25%もの高さであることが実証された(Wadhwaら、Breast Ca
ncer Res Treat 2009;117:357〜64)。実施例に示される
ように、本発明は、ErbB−2を標的化し、心筋細胞の生存に影響を与えない、または
トラスツズマブおよびペルツズマブと比較して、顕著に低い程度までしか影響を与えない
、抗体を提供する。心臓毒性が低減されるので、これは、重要な利点を提供する。これは
、障害された心機能に罹患していない人々にとって既に有利であり、障害された心機能に
罹患している人々またはそのリスクがある人々、例えば、うっ血性心不全(CHF)、左
室機能不全(LVD)および/もしくは10%以上減少した左室駆出分画(LVEF)に
罹患している対象、ならびに/または心筋梗塞を有している対象などにとっては、さらに
いっそう有利である。従って、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない本発明に従う抗
体が、好ましい。in vitroでは、心筋細胞の機能は、例えば、心筋細胞の生存度
を決定することによって、BNP(B型ナトリウム利尿ペプチド、心バイオマーカーであ
る)を決定することによって、QT延長を決定することによって、および/またはミトコ
ンドリア膜電位を決定することによって、測定される。
合部位およびErbB−3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。一実
施形態は、心筋細胞の生存に顕著には影響を与えない、ErbB−2に結合する第1の抗
原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う抗体
を提供し、ErbB−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、ErbB−2
陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。Er
bB−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下、
より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB−
2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好まし
くは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。
む:
− 図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF184
9;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2
916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、M
F3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB−2特
異的重鎖可変領域の、少なくともCDR3配列、好ましくは、少なくともCDR1、CD
R2およびCDR3配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖
可変領域配列と多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8
、9もしくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が
異なる重鎖可変領域配列;ならびに/あるいは
− 図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF317
6;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6
057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;M
F6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068
;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF
6074からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域の、少なくともCD
R3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配列、もしくは少な
くとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸、好
ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より好まし
くは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列。好ましい一実
施形態では、この抗体は、PB4188である。
3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、T1
44、T164、R166、P172、G179、S180およびR181、ならびにT
144、T164、R166、P172、G179、S180またはR181から約5ア
ミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、E
rbB−2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む
。アミノ酸残基番号付けは、Protein Data Bank(PDB)ID #1
S78のものである。実施例に示されるように、ErbB−2のドメインIのこの領域に
結合する抗体は、特に良好な結合特徴を示し、これらは、ErbB−2陽性細胞の活性(
例えば、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘導性受
容体機能ならびに/またはかかる細胞のリガンド誘導性成長)に対抗することが可能であ
る。さらに、かかる抗体は、トラスツズマブ(ErbB−2のドメインIVに結合する)
およびペルツズマブ(ErbB−2のドメインIIに結合する)などの現在公知の抗Er
bB−2モノクローナル抗体との組み合わせ治療に特に適切であるが、それは、これらが
、ErbB−2の異なるドメインに結合するからである。従って、これらの抗体は、同じ
エピトープについての競合なしに、同時に使用できる。用語「T144、T164、R1
66、P172、G179、S180またはR181から約5アミノ酸位置以内に位置す
る、表面に露出したアミノ酸残基」とは、列挙された残基に隣接する最初の約5つのアミ
ノ酸残基以内に位置する一次アミノ酸配列中にあり、タンパク質の外側に少なくとも一部
露出しており、その結果、抗体によって結合され得る、アミノ酸残基を指す(例えば図2
1Bを参照のこと)。好ましくは、T144、T164、R166、P172、G179
、S180またはR181から約5アミノ酸位置以内に位置するアミノ酸残基は、L13
9、C140、Y141、Q142、D143、I145、L146、W147、K14
8、D149、L159、T160、L161、I162、D163、N165、S16
7、R168、A169、C170、H171、C173、S174、P175、M17
6、C177、K178、C182、W183、G184、E185およびS186から
なる群から選択される。好ましくは、この抗体は、T144、T164、R166、P1
72、G179、S180およびR181、ならびにT144、T164、R166、P
172、G179、S180またはR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面
に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−2のドメインIの少なく
とも2つまたは少なくとも3つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む。
bB−2のドメインIのT144、R166およびR181を少なくとも結合する抗原結
合部位を含む。別の一実施形態は、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、この抗体は、
ErbB−2のドメインIのT144、R166、P172、G179およびR181を
少なくとも結合する抗原結合部位を含む。別の一実施形態は、本発明に従う二重特異性抗
体を提供し、この抗体は、ErbB−2のドメインIのT144、T164、R166、
P172、G179、S180およびR181を少なくとも結合する抗原結合部位を含む
。
3に結合する第2の抗原結合部位を含む抗体を提供し、この抗体は、R426およびネイ
ティブErbB−3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内に位置す
る、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−3のドメインI
IIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。アミノ酸残基番号付け
は、Protein Data Bank(PDB)ID #4P59のものである。実
施例に示されるように、ErbB−3のドメインIIIのこの領域に結合する抗体は、特
に良好な結合特徴を示し、これらは、ErbB−3陽性細胞の活性(例えば、ErbB−
2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘導性受容体機能ならびに/
またはかかる細胞のリガンド誘導性成長)に対抗することが可能である。用語「ネイティ
ブErbB−3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内に位置する、
表面に露出したアミノ酸残基」とは、R426から11.2Å以内に空間的に位置するE
rbB−3タンパク質の三次構造中にあり、タンパク質の外側に少なくとも一部露出して
おり、その結果、抗体によって結合され得る、アミノ酸残基を指す。好ましくは、ネイテ
ィブErbB−3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内に位置する
アミノ酸残基は、L423、Y424、N425、G427、G452、R453、Y4
55、E480、R481、L482、D483およびK485からなる群から選択され
る(例えば、図21Cおよび表15を参照のこと)。好ましい一実施形態では、本発明に
従う二重特異性抗体が提供され、この抗体は、ErbB−3のドメインIIIのR426
と少なくとも結合する抗原結合部位を含む。好ましくは、この抗体は、ErbB−3のド
メインIIIのR426と少なくとも結合する抗原結合部位を含む。
されている。本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、正常CHO細胞中で産生される同
じ抗体と比較した場合、Fc領域中に、N結合型炭水化物構造の、低減された量のフコシ
ル化を含む。
、本発明の二重特異性抗体は、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。
介性、B細胞媒介性などである免疫は、ポリペプチドに対するヒトの寛容に包含される変
数の1つである。本発明の二重特異性抗体の定常領域は、好ましくは、ヒト定常領域であ
る。この定常領域は、天然に存在するヒト抗体の定常領域と、1または複数の、好ましく
は10以下の、好ましくは5アミノ酸以下の差異を含み得る。定常部分が、天然に存在す
るヒト抗体に完全に由来することが好ましい。本明細書で産生される種々の抗体は、ヒト
抗体可変ドメイン・ライブラリーに由来する。かかるこれらの可変ドメインは、ヒトのも
のである。ユニークなCDR領域は、ヒト由来、合成、または別の生物由来であり得る。
可変領域は、CDR領域を別にして、天然に存在するヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列
と同一であるアミノ酸配列を有する場合、ヒト可変領域とみなされる。本発明の抗体中の
ErbB−2に結合するVH、ErbB−3に結合するVHまたは軽鎖の可変領域は、C
DR領域のアミノ酸配列中の潜在的差異を数に入れずに、天然に存在するヒト抗体の可変
領域と、1または複数の、好ましくは10以下の、好ましくは5アミノ酸以下の差異を含
み得る。かかる変異は、体細胞超変異に関しても天然に存在する。
マウス重鎖可変領域などをヒト化することは、一般的実務である。マウス重鎖可変領域の
3D構造とマッチする3D構造を有するヒト重鎖可変領域中へのCDR移植;マウス重鎖
可変領域から既知のまたは疑わしいT細胞エピトープまたはB細胞エピトープを除去する
ことによって好ましくは実施される、マウス重鎖可変領域の脱免疫化がその中にある、こ
れが達成され得る種々の方法が存在する。この除去は、典型的には、エピトープ中のアミ
ノ酸のうちの1または複数を、別の(典型的には保存的)アミノ酸に置換することによる
ものであり、その結果、エピトープの配列は、もはやT細胞エピトープでもB細胞エピト
ープでもないように、改変される。
おいて免疫原性が低い。好ましくは、本発明の可変領域またはドメインは、さらにヒト化
、例えば、ベニヤ化(veneered)などされる。ベニヤ化技術を使用することによ
って、免疫系が容易に遭遇する外面残基は、弱い免疫原性のベニヤ化表面または実質的に
非免疫原性のベニヤ化表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供するために、ヒト残
基で選択的に置き換えられる。本発明において使用される動物は、好ましくは哺乳動物、
より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。
メインにおける差異に従って、抗体は、5つのクラスまたはアイソタイプにグループ分け
される:IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgE。これらのクラスまたはアイソタ
イプは、対応するギリシャ文字を用いて名付けられた、上記重鎖のうち少なくとも1つを
含む。好ましい一実施形態では、本発明は、本発明に従う抗体を提供し、その定常領域は
、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEの定常領域の群から選択され、より好ま
しくは、この定常領域は、IgG定常領域、より好ましくはIgG1定常領域、好ましく
は変異したIgG1定常領域を含む。例えば、アロタイプG1m1、17およびG1m3
などの、IgG1の定常領域におけるいくつかのバリエーションが、天然に存在し、なら
びに/または得られた抗体の免疫学的特性を変化させることなしに許容される。典型的に
は、約1〜10のアミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせが、定常領域に
おいて許容される。
、この抗体は、図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF
1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、
MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF184
7、MF3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB
−2特異的重鎖可変領域のCDR3配列を少なくとも含み、またはこの抗体は、図16A
もしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;MF2973
、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF39
91、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF
3003およびMF1898からなる群から選択されるVHのCDR3配列と、多くて3
つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR3配列を
含む。この抗体は、好ましくは、MF1849、MF2971、MF3958、MF30
04またはMF3991の少なくともCDR3配列を含み、最も好ましくはMF3958
の少なくともCDR3配列を含む。
930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、M
F3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913
、MF1847、MF3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択さ
れるErbB−2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配
列、またはMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、
MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF303
1、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003もしくは
MF1898のCDR1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多く
て2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なる、重鎖CDR1、CDR2およびCD
R3配列を含む。この抗体は、好ましくは、MF1849、MF2971、MF3958
、MF3004またはMF3991の少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配列
を含み、最も好ましくはMF3958の少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配
列を含む。
、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF3176;M
F3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057
;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF60
63;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF
6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF607
4からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域のCDR3配列を少なくと
も含み、またはこの抗体は、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3
178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;M
F6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061
;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF60
67;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF
6073およびMF6074からなる群から選択されるVHのCDR3配列と、多くて3
つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR3配列を
含む。この抗体は、好ましくは、MF3178、MF3176、MF3163、MF60
58、MF6061またはMF6065の少なくともCDR3配列を含み、最も好ましく
はMF3178の少なくともCDR3配列を含む。
178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;M
F6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061
;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF60
67;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF
6073およびMF6074からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域
のCDR1、CDR2およびCDR3配列、またはMF3178;MF3176;MF3
163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;M
F6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063
;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF60
69;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もしくはMF6074
のCDR1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ま
しくは多くて1つのアミノ酸が異なる、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を、
少なくとも含む。この抗体は、好ましくは、MF3178、MF3176、MF3163
、MF6058、MF6061またはMF6065の少なくともCDR1、CDR2およ
びCDR3配列を含み、最も好ましくは、MF3178の少なくともCDR1、CDR2
およびCDR3配列を含む。
B−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結
合部位は、図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF18
49;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF
2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、
MF3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB−2
特異的重鎖可変領域のCDR3配列、または図16Aもしくは図16Eに示されるMF2
926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、M
F2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889
、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003およびMF1898からな
る群から選択されるVHのCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好まし
くは1つ以下のアミノ酸が異なる、重鎖CDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合
部位は、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF317
6;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6
057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;M
F6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068
;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF
6074からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域のCDR3配列、ま
たは図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF3176;
MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF605
7;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6
063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;M
F6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF60
74からなる群から選択されるVHのCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2
つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なる重鎖CDR3配列を少なくとも含む。この第
1の抗原結合部位は、好ましくは、MF1849、MF2971、MF3958、MF3
004またはMF3991の少なくともCDR3配列、最も好ましくは、MF3958の
少なくともCDR3配列を含み、第2の抗原結合部位は、好ましくは、MF3178、M
F3176、MF3163、MF6058、MF6061またはMF6065の少なくと
もCDR3配列、最も好ましくは、MF3178の少なくともCDR3配列を含む。
926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF3958、M
F2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889
、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003およびMF1898からな
る群から選択されるErbB−2特異的重鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR
3配列、またはMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF300
4、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3
031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003もし
くはMF1898のCDR1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは
多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なる、重鎖CDR1、CDR2および
CDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合部位は、好ましくは、図16Bもしくは
図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3
099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;M
F6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064
;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF60
70;MF6071;MF6072;MF6073およびMF6074からなる群から選
択されるErbB−3特異的重鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3配列、ま
たは図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF3176;
MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF605
7;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6
063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;M
F6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もしくはMF6
074のCDR1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ
、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なる、重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配
列を少なくとも含む。この第1の抗原結合部位は、好ましくは、MF1849、MF29
71、MF3958、MF3004またはMF3991の少なくともCDR1、CDR2
およびCDR3配列、最も好ましくは、MF3958の少なくともCDR1、CDR2お
よびCDR3配列を含み、第2の抗原結合部位は、好ましくは、MF3178、MF31
76、MF3163、MF6058、MF6061またはMF6065の少なくともCD
R1、CDR2およびCDR3配列、最も好ましくは、MF3178の少なくともCDR
1、CDR2およびCDR3配列を含む。
3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結合部
位は、MF3958のCDR3配列、またはMF3958のCDR3配列と、多くて3つ
、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が異なるCDR3配列を少なく
とも含み、第2の抗原結合部位は、MF3178のCDR3配列、またはMF3178の
CDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ましくは1つ以下のアミノ酸が
異なるCDR3配列を少なくとも含む。
B−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結
合部位は、MF3958のCDR1、CDR2およびCDR3配列、またはMF3958
のCDR1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3つ、好ましくは多くて2つ、好ま
しくは多くて1つのアミノ酸が異なるCDR1、CDR2およびCDR3配列を少なくと
も含み、第2の抗原結合部位は、MF3178のCDR1、CDR2およびCDR3配列
、またはMF3178のCDR1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3つ、好まし
くは多くて2つ、好ましくは多くて1つのアミノ酸が異なるCDR1、CDR2およびC
DR3配列を少なくとも含む。
B−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結
合部位は、MF3958のCDR3配列を少なくとも含み、第2の抗原結合部位は、MF
3178のCDR3配列を少なくとも含む。
B−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を提供し、この第1の抗原結
合部位は、MF3958のCDR1、CDR2およびCDR3配列を少なくとも含み、第
2の抗原結合部位は、MF3178のCDR1、CDR2およびCDR3配列を少なくと
も含む。
最適化目的のために変化させられる。最適化は、例えば変異誘発手順によって実施され、
その後、得られた抗体の安定性および/または結合親和性が好ましくは試験され、改善さ
れたErbB−2またはErbB−3特異的CDR配列が好ましくは選択される。当業者
は、本発明に従う少なくとも1つの変更されたCDR配列を含む抗体バリアントを作製す
ることが十分に可能である。例えば、保存的アミノ酸置換が適用される。保存的アミノ酸
置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの1つの疎水性残
基の、別の疎水性残基への置換、および1つの極性残基の別の極性残基への置換、例えば
、アルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、またはグルタ
ミンのアスパラギンへの置換が含まれる。
、この可変ドメインのVH鎖は、図16Aもしくは図16Eに示されるVH鎖MF292
6;MF2930;MF1849;MF2973;MF3004;MF3958(ヒト化
MF2971である);MF2971;MF3025;MF2916;MF3991(ヒ
ト化MF3004である);MF3031;MF2889;MF2913;MF1847
;MF3001、MF3003もしくはMF1898のアミノ酸配列を含み、または図1
6Aもしくは図16Eの上述のVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3
、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは
5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aもしくは
図16Eに示されるVH鎖MF2926;MF2930;MF1849;MF2973;
MF3004;MF3958(ヒト化MF2971である);MF2971;MF302
5;MF2916;MF3991(ヒト化MF3004である);MF3031;MF2
889;MF2913;MF1847;MF3001、MF3003もしくはMF189
8のアミノ酸配列を含む。ErbB−2に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは
、図16Aに示されるように、以下のアミノ酸配列を含む:
− MF1849;または
− MF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、
好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;または
− MF3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、
好ましくは、MF3991のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ErbB−2に結合する可変ドメインのVH鎖は、以下のアミノ酸配
列を含む:VH鎖MF1849;またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン、こ
こで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;また
はMF3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ま
しくは、MF3991のアミノ酸配列を含み、ここで、列挙されたVH配列は、図16A
に示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、
7、8、9または10、より好ましくは多くて1、2、3、4または5アミノ酸の挿入、
欠失、置換またはそれらの組み合わせを有する。好ましい一実施形態では、ErbB−2
に結合する可変ドメインのVH鎖は、MF3958のアミノ酸配列を含み、またはこのV
H鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしく
は10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換も
しくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに示されるMF3958のアミノ酸配列を
含む。ErbB−2に結合する可変ドメインを含む抗体は、好ましくは、ErbB−3に
結合する可変ドメインを好ましくはさらに含む二重特異性抗体である。Erb−B3に結
合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16Bもしくは図16Eもしくは図37
に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF33
07;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF
6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;
MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF607
1;MF6072;MF6073もしくはMF6074のアミノ酸配列を含み、または図
16Bもしくは図16Eもしくは図37のVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは
1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、
4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16
Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF
3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;
MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF606
3;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6
069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もしくはMF607
4のアミノ酸配列を含む。Erb−B3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは
、MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061もしくはM
F6065のアミノ酸配列を含み、または図16Bもしくは図37のそれぞれのVH鎖配
列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10
、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくは
それらの組み合わせを有する、MF3178、MF3176、MF3163、MF605
8、MF6061もしくはMF6065のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では
、ErbB−3に結合する可変ドメインのVH鎖は、MF3178のアミノ酸配列を含み
、またはこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7
、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入
、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに示されるMF3178の
アミノ酸配列を含む。好ましくは、上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、CDR3
領域中には存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、CDR
1およびCDR2領域中にも存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好
ましくは、FR4領域中にも存在しない。
領域のVH鎖は、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF317
8;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6
056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;M
F6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067
;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF60
73もしくはMF6074のアミノ酸配列を含み、またはこのVH鎖配列に関して、多く
て15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは
多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わ
せを有する、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF3178;
MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF605
6;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6
062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;M
F6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073
もしくはMF6074のアミノ酸配列を含む。ErbB3に結合する可変ドメインのVH
鎖は、好ましくは、VH鎖MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、
MF6061もしくはMF6065のアミノ酸配列を含み、またはこのVH鎖配列に関し
て、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好
ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの
組み合わせを有する、VH鎖MF3178、MF3176、MF3163、MF6058
、MF6061もしくはMF6065のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、
ErbB−3に結合する可変ドメインのVH鎖は、図16Bに示されるVH鎖MF317
8のアミノ酸配列を含み、またはこのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、
2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4も
しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに
示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含む。ErbB−3に結合する可変ドメイ
ンを含む抗体は、好ましくは、ErbB−2に結合する可変ドメインを好ましくはさらに
含む二重特異性抗体である。ErbB−2に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましく
は、図16Aもしくは図16EのVH鎖のアミノ酸配列を含む。ErbB−2に結合する
可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16Aに示されるように、以下のアミノ酸配列
を含む:MF1849;またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで、こ
のヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;またはMF3
004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、
MF3991のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、列挙されたErb−B2結合VH
配列は、図16Aに示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、
3、4、5、6、7、8、9または10、より好ましくは多くて1、2、3、4または5
アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせを有する。好ましい一実施形態で
は、図16AのErbB−2結合VH鎖は、MF3958のアミノ酸配列を含み、または
このVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9
もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、
置換もしくはそれらの組み合わせを有する、MF3958のアミノ酸配列を含む。好まし
くは、上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、CDR3領域中には存在しない。上述
のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、CDR1およびCDR2領域中にも
存在しない。上述のアミノ酸の挿入、欠失および置換は、好ましくは、FR4領域中にも
存在しない。
るMF2926、MF2930、MF1849;MF2973、MF3004、MF39
58、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF
2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003およびMF189
8の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB−2特異的重鎖可変領域配列を
含み、またはこの抗体は、MF2926、MF2930、MF1849;MF2973、
MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF399
1、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3
003もしくはMF1898の重鎖可変領域配列と、多くて15、好ましくは1、2、3
、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは
5アミノ酸が異なる、重鎖可変領域配列を含む。
図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF33
07;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF
6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;
MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF607
1;MF6072;MF6073およびMF6074の重鎖可変領域配列からなる群から
選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域配列を含み、またはこの抗体は、MF317
8;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6
056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;M
F6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067
;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF60
73もしくはMF6074の重鎖可変領域配列と、多くて15、好ましくは1、2、3、
4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5
アミノ酸が異なる、重鎖可変領域配列を含む。
提供し、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ErbB−2のドメインIに結
合する。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ErbB−2のドメインIに結合する。本
発明に従うかかる抗体は、ErbB−2のドメインIに結合しない現在使用されている抗
ErbB−2結合分子、例えば、ErbB−2のドメインIVに結合するトラスツズマブ
およびErbB−2のドメインIIに結合するペルツズマブとの組み合わせ治療に特に適
切であるが、それは、これらの異なる結合分子が、同じエピトープについて互いと競合し
ないからである。
原結合部位のうち少なくとも一方は、ErbB−2のドメインIに結合し、ErbB−2
陽性細胞に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性(KD)は、5.0nM以
下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは3.9nM以下である。好ましくは、両
方の抗原結合部位が、ErbB−2のドメインIに結合する。好ましい一実施形態では、
SK−BR−3細胞上のErbB−2に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和
性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましくは4.0nM以下、よ
り好ましくは3.5nM以下、より好ましくは3.0nM以下、より好ましくは2.3n
M以下である。一実施形態では、この親和性は、3.0〜1.6nMの範囲内である。好
ましい一実施形態では、BT−474細胞上のErbB−2に対するこの少なくとも一方
の抗原結合部位の親和性は、5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、より好ましく
は3.9nM以下である。一実施形態では、この親和性は、4.5〜3.3nMの範囲内
である。
実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃でインキュ
ベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
れらの可変ドメインのVH鎖は、図16Aもしくは図16Eに示されるVH鎖MF292
6;MF2930;MF1849;MF2973;MF3004;MF3958(ヒト化
MF2971である);MF2971;MF3025;MF2916;MF3991(ヒ
ト化MF3004である);MF3031;MF2889;MF2913;MF1847
;MF3001、MF3003もしくはMF1898のアミノ酸配列、または図16Aも
しくは図16Eに示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3
、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは
5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aもしくは
図16Eに示されるVH鎖MF2926;MF2930;MF1849;MF2973;
MF3004;MF3958(ヒト化MF2971である);MF2971;MF302
5;MF2916;MF3991(ヒト化MF3004である);MF3031;MF2
889;MF2913;MF1847;MF3001、MF3003もしくはMF189
8のアミノ酸配列を含む。このVHは、好ましくは、以下のアミノ酸配列を含む:VH鎖
MF1849;またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化
バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;またはMF3004も
しくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、図16A
に示されるMF3991のアミノ酸配列を含む、;あるいは、このVHは、以下のアミノ
酸配列を含む:VH鎖MF1849;またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン
、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;
またはMF3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、
好ましくは、図16Aに示されるそれぞれの配列に関して、多くて15、好ましくは1、
2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4も
しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに
示されるMF3991のアミノ酸配列を含む。抗体のこれらの可変ドメインは、好ましく
は、図16Aまたは図16Eに示される配列を好ましくは有する、同一のVH鎖を含む。
同一のVH鎖を有する可変ドメインを有する抗体は、二重特異性抗体ではない。VH鎖は
、図16Aもしくは図16Eもしくは図37に示されるのと同じVH鎖配列、または図1
6Aもしくは図16Eもしくは図37に示されるそれぞれの配列に関して、1、2、3、
4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを別にして同じV
H鎖配列を含む場合、本発明にとって同一である。
提供し、これらの抗原結合部位のうち少なくとも一方は、ErbB−3のドメインIII
に結合する。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ErbB−3のドメインIIIに結合
する。本発明に従うかかる抗体は、ErbB−3のドメインIIIに結合しない現在使用
されている抗ErbB−3結合分子、例えば、ErbB−3のドメインIに結合するMM
−121(#Ab6)およびRG7116との組み合わせ治療に特に適切であるが、それ
は、これらの異なる結合分子が、同じエピトープについて互いと競合しないからである。
原結合部位のうち少なくとも一方は、ErbB−3のドメインIIIに結合し、ErbB
−3陽性細胞に対するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性(KD)は、2.0n
M以下、好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは
0.99nM以下である。好ましくは、両方の抗原結合部位が、ErbB−3のドメイン
IIIに結合する。好ましい一実施形態では、SK−BR−3細胞上のErbB−3に対
するこの少なくとも一方の抗原結合部位の親和性は、2.0nM以下、好ましくは1.5
nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。
一実施形態では、この親和性は、1.39〜0.59nMの範囲内である。好ましい一実
施形態では、BT−474細胞上のErbB−3に対するこの少なくとも一方の抗原結合
部位の親和性は、2.0nM以下、より好ましくは1.5nM以下、より好ましくは1.
0nM以下、より好ましくは0.5nM以下、より好ましくは0.31nM以下、より好
ましくは0.23nM以下である。一実施形態では、この親和性は、0.31〜0.15
nMの範囲内である。
ここで、実施例に記載されるように、細胞は、放射活性標識された抗体を使用して4℃で
インキュベートされ、その後、細胞に結合した放射活性が測定される。
、これらの可変ドメインのVHは、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示される
VH鎖MF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF
6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;
MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF606
6;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6
072;MF6073もしくはMF6074のアミノ酸配列を含み、またはこれらのVH
鎖配列のいずれかに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、
9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失
、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、VH鎖MF3178;MF3176;MF
3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;
MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF606
3;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6
069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もしくはMF607
4のアミノ酸配列を含む。このVHは、好ましくは、VH鎖MF3178、MF3176
、MF3163、MF6058、MF6061もしくはMF6065のアミノ酸配列を含
み、またはこれらのVH鎖配列のいずれかに関して、多くて15、好ましくは1、2、3
、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは
5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、VH鎖MF317
8、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061もしくはMF6065の
アミノ酸配列を含む。このVHは、好ましくは、VH鎖MF3178のアミノ酸配列を含
み、またはMF3178のVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4
、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5ア
ミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに示されるV
H鎖MF3178のアミノ酸配列を含む。抗体のこれらの可変ドメインは、好ましくは、
図16Bまたは図16Eまたは図37に示される配列を好ましくは有する、同一のVH鎖
を含む。同一のVH鎖を有する可変ドメインを有する抗体は、二重特異性抗体ではない。
VH鎖は、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるのと同じVH鎖配列、ま
たは図16Bもしくは図16Eもしくは図37のVH鎖配列に関して、1、2、3、4も
しくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを別にして同じVH鎖
配列を含む場合、同一とする。
b6)などの先行技術の化合物と比較して、ErbB−3に対してより優れた機能的活性
を有するという利点を有し、これは、本発明に従うこれらの抗体が、ErbB−3活性(
例えば、ErbB−3のリガンド誘導性受容体機能ならびに/またはErbB−2および
ErbB−3陽性細胞のリガンド誘導性成長)により良く対抗することが可能であること
を意味する。これは、例えば、表7および図38に示される。
特異性抗体を提供し、この可変ドメインのVH鎖は、以下のアミノ酸配列を含む:
− VH鎖MF1849;またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで
、このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;またはM
F3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましく
は、図16Aに示されるMF3991のアミノ酸配列を含む;あるいは
− VH鎖MF1849またはMF2971もしくはそのヒト化バージョン、ここで、
このヒト化バージョンは、好ましくは、MF3958のアミノ酸配列を含む;またはMF
3004もしくはそのヒト化バージョン、ここで、このヒト化バージョンは、好ましくは
、このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もし
くは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換
もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに示されるMF3991のアミノ酸配列
を含む。この実施形態に従うかかる二重特異性抗体は、さらに好ましくは、ErbB−3
に結合する可変ドメインを含む。ErbB−3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ま
しくは、図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF
3176;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;
MF6057;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF606
2;MF6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6
068;MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もし
くはMF6074のアミノ酸配列を含み、または最も好ましくは、図16Bもしくは図1
6Eもしくは図37のVH鎖配列のいずれかに関して、多くて15、好ましくは1、2、
3、4、5、6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしく
は5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bもしく
は図16Eもしくは図37に示されるVH鎖MF3178;MF3176;MF3163
;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057;MF60
58;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF
6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;
MF6070;MF6071;MF6072;MF6073もしくはMF6074のアミ
ノ酸配列を含む。ErbB−3に結合する可変ドメインのVH鎖は、好ましくは、図16
Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含み、または図16BのVH鎖配列に
関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10、よ
り好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれ
らの組み合わせを有する、図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列を含む
。
合する可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、
ErbB−2に結合する可変ドメインのVH鎖は、
− 図16Aに示されるVH鎖MF3958のアミノ酸配列、または
− このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9
もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、
置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに示されるVH鎖MF3958のア
ミノ酸配列を含み、ならびに
ErbB−3に結合する可変ドメインのVH鎖は、
− 図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列;または
− 図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6
、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の
挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに示されるVH鎖MF
3178のアミノ酸配列を含む。
合する可変ドメインを含む二重特異性抗体を提供し、
ErbB−2に結合する可変ドメインのVH鎖は、
− 図16Aに示されるVH鎖MF3991のアミノ酸配列、または
− このVHに関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9
もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、
置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Aに示されるVH鎖MF3991のア
ミノ酸配列を含み;ならびに
ErbB−3に結合する可変ドメインのVH鎖は、
− 図16Bに示されるVH鎖MF3178のアミノ酸配列、または
− 図16BのVH鎖配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6
、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸の
挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Bに示されるVH鎖MF
3178のアミノ酸配列を含む。
に示されるVH鎖のアミノ酸配列に関して、15アミノ酸超の変化を有する場合、著しく
異なり始める。図16に示されるVH鎖に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、
4、5、6、7、8、9または10アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わ
せを有するVH鎖は、図16に示されるVH鎖に関して、1、2、3、4または5アミノ
酸の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、図16に示されるVH鎖に関して、好
ましくは1、2、3または4の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、好ましくは
1、2または3の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、より好ましくは1または
2の挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ、好ましくは1の挿入、欠失、置換また
はそれらの組み合わせを、好ましくは有する。この1または複数のアミノ酸の挿入、欠失
、置換またはそれらの組み合わせは、好ましくは、VH鎖のCDR1、CDR2およびC
DR3領域中には存在しない。これらは、好ましくは、FR4領域中にも存在しない。ア
ミノ酸置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。
性抗体、または図16Dの配列に関して、多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、
6、7、8、9もしくは10、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸
の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを有する、図16Dの二重特異性抗体を
提供し、この多くて15、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10
アミノ酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。この挿入、欠失、置換また
はそれらの組み合わせは、好ましくは、VH鎖のCDR3領域中には存在せず、好ましく
は、VH鎖のCDR1、CDR2およびCDR3領域中には存在せず、好ましくは、FR
4領域中には存在しない。
る。種々の方法が、二重特異性抗体の抗原結合特性を別の抗体に首尾よく移植するために
利用可能である。抗体の結合特性は、圧倒的に、まさにCDR3領域の配列にあり、これ
は、全体としての可変ドメインの適切な構造と組み合わせた、可変ドメイン中のCDR1
およびCDR2領域の配列によってしばしば支持される。種々の方法が、CDR領域を別
の抗体の適切な可変ドメインに移植するために、現在利用可能である。これらの方法の一
部は、本明細書に参照により含まれる、J.C.Almagro1およびJ.Frans
son(2008)Frontiers in Bioscience 13、1619
〜1633において概説されている。従って、本発明は、ErbB−2に結合する第1の
抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗原結合部位を含むヒトまたはヒト化
二重特異性抗体をさらに提供し、ErbB−2結合部位を含む可変ドメインは、図16A
または図16Eに示されるVH CDR3配列を含み、ErbB−3結合部位を含む可変
ドメインは、図16Bまたは図16Eまたは図37に示されるVH CDR3領域を含む
。ErbB−2結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは、図16Aまたは図16E中
のVH鎖のCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域の配列を含む。ErbB−3
結合部位を含むVH可変領域は、好ましくは、図16Bまたは図16Eまたは図37中の
VH鎖のCDR1領域、CDR2領域およびCDR3領域の配列を含む。CDR移植は、
図16または図37のVHのCDR領域を有するが、異なるフレームワークを有する、V
H鎖を産生するためにも使用され得る。異なるフレームワークは、別のヒトVHまたは異
なる哺乳動物のものであり得る。
酸の置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。挿入、欠失、置換またはそれらの
組み合わせは、好ましくは、VH鎖のCDR3領域中には存在せず、好ましくは、VH鎖
のCDR1、CDR2またはCDR3領域中には存在せず、好ましくは、FR4領域中に
は存在しない。
、生殖系列軽鎖O12、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖IgVκ1
−39*01/IGJκ1*01またはその断片もしくは機能的誘導体である(imgt
.orgにおけるIMGTデータベース・ワールドワイド・ウェブに従う命名法)。用語
、再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖IgVκ1−39*01/IGJκ1*01、
IGKV1−39/IGKJ1、huVκ1−39軽鎖または短くhuVκ1−39が使
用される。この軽鎖は、1、2、3、4または5アミノ酸の挿入、欠失、置換またはそれ
らの組み合わせを有し得る。上述の1、2、3、4または5アミノ酸の置換は、好ましく
は、保存的アミノ酸置換であり、挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせは、好まし
くは、VL鎖のCDR3領域中には存在せず、好ましくは、VL鎖のCDR1、CDR2
もしくはCDR3領域またはFR4領域中には存在しない。
つの細胞における2つの異なる重鎖および2つの異なる軽鎖の発現、ならびに細胞によっ
て産生される抗体を収集することを伴う。この方法で産生された抗体は、典型的には、重
鎖および軽鎖の異なる組み合わせを有する一群の抗体を含み、その一部は、所望の二重特
異性抗体である。この二重特異性抗体は、引き続いて、この一群の抗体から精製され得る
。細胞によって産生される他の抗体に対する二重特異性抗体の比率は、種々の方法で増加
され得る。本発明の好ましい一実施形態では、この比率は、細胞において、2つの異なる
軽鎖を発現させず、2つの本質的に同一の軽鎖を発現させることによって、増加される。
この概念は、当技術分野で、「共通の軽鎖」方法とも呼ばれる。本質的に同一な軽鎖が、
2つの異なる重鎖と一緒に機能して、異なる抗原結合部位および付随する異なる結合特性
を有する可変ドメインの形成を可能にする場合、その細胞によって産生される他の抗体に
対する二重特異性抗体の比率は、2つの異なる軽鎖の発現よりも顕著に改善される。細胞
によって産生される二重特異性抗体の比率は、2つの同一の重鎖のペアリングよりも、2
つの異なる重鎖の互いとのペアリングを刺激することによって、さらに改善され得る。当
技術分野は、重鎖のかかるヘテロ二量体化が達成され得る種々の方法を記載している。1
つの方法は、「ノブ・イントゥー・ホール(knob into hole)」二重特異
性抗体を作製することである。米国特許出願公開第20030078385号(Arat
hoonら、−Genentech)を参照のこと。別の好ましい方法は、参照によって
本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第61/635,935号とそれに続く米国特
許出願第13/866,747およびPCT出願PCT/NL2013/050294(
WO2013/157954A1)に記載されている。単一細胞から二重特異性抗体を産
生するための方法および手段は、開示されており、それによって、単一特異性抗体の形成
よりも、二重特異性抗体の形成が優先される手段が提供される。これらの方法は、本発明
においても好ましく使用され得る。従って、本発明は、(単一細胞から)本発明に従う二
重特異性抗体を産生するための方法を提供し、この二重特異性抗体は、接触面を形成する
ことが可能な2つのCH3ドメインを含み、この方法は、この細胞に、a)第1のCH3
ドメイン含有重鎖をコードする第1の核酸分子、b)第2のCH3ドメイン含有重鎖をコ
ードする第2の核酸分子を用意することを含み、これらの核酸分子には、第1および第2
のCH3ドメイン含有重鎖の優先的ペアリングのための手段が提供され、この方法は、宿
主細胞を培養するステップ、およびこれら2つの核酸分子の発現を可能にするステップ、
および培養物から二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。この第1および第2
の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクターまたは遺伝子導入ビヒクルの一部であり得、宿主
細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得る。あるいは、この第1および第2の核酸
分子は、上記細胞に別々に提供される。
の方法を提供し、この二重特異性抗体は、接触面を形成することが可能な2つのCH3ド
メインを含み、この方法は、
− a)ErbB−2に結合し、第1のCH3ドメインを含む抗原結合部位を含む重鎖
をコードする第1の核酸分子、およびb)ErbB−3に結合し、第2のCH3ドメイン
を含む抗原結合部位を含む重鎖をコードする第2の核酸分子を有する細胞を用意するステ
ップを含み、これらの核酸分子には、これら第1および第2のCH3ドメインの優先的ペ
アリングのための手段が提供され、
この方法は、上記細胞を培養するステップ、およびこれら2つの核酸分子の発現を可能
にするステップ、および培養物から二重特異性IgG抗体を回収するステップをさらに含
む。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、共通の軽鎖をコードする第3の核酸分子
もまた有する。この第1、第2および第3の核酸分子は、同じ核酸分子、ベクターまたは
遺伝子導入ビヒクルの一部であり得、宿主細胞のゲノムの同じ部位において組み込まれ得
る。あるいは、この第1、第2および第3の核酸分子は、上記細胞に別々に提供される。
好ましい共通の軽鎖は、上記のように、O12、好ましくは、再編成された生殖系列ヒト
・カッパ軽鎖IgVκ1 39*01/IGJκ1*01である。この第1および第2の
CH3ドメインの優先的ペアリングのための手段は、好ましくは、重鎖コード領域のCH
3ドメイン中の、対応する変異である。本質的に二重特異性抗体のみを産生するための好
ましい変異は、第1のCH3ドメイン中のアミノ酸置換L351KおよびT366K(K
abatに従う番号付け)、ならびに第2のCH3ドメイン中のアミノ酸置換L351D
およびL368Eであり、または逆もまた然りである。従って、二重特異性抗体を産生す
るための本発明に従う方法がさらに提供され、上記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置
換L351KおよびT366K(Kabatに従う番号付け)を含み、第2のCH3ドメ
インは、アミノ酸置換L351DおよびL368Eを含み、この方法は、上記細胞を培養
するステップ、およびこれらの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から
二重特異性抗体を回収するステップをさらに含む。二重特異性抗体を産生するための本発
明に従う方法もまた提供され、上記第1のCH3ドメインは、アミノ酸置換L351Dお
よびL368E(Kabatに従う番号付け)を含み、第2のCH3ドメインは、アミノ
酸置換L351KおよびT366Kを含み、この方法は、上記細胞を培養するステップ、
およびこれらの核酸分子の発現を可能にするステップ、および培養物から二重特異性抗体
を回収するステップをさらに含む。これらの方法によって産生され得る抗体もまた、本発
明の一部である。これらのCH3ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、IgG1ヘテ
ロ二量体化ドメインである。これらのCH3ヘテロ二量体化ドメインを含む重鎖定常領域
は、好ましくは、IgG1定常領域である。
供する。核酸分子(典型的には、in vitroの、単離されたまたは組換え核酸)は
、好ましくは、図16Aもしくは図16Bもしくは図37に示される重鎖可変領域、また
は1、2、3、4もしくは5アミノ酸の挿入、欠失、置換もしくはそれらの組み合わせを
有する、図16Aもしくは図16Bもしくは図37に示される重鎖可変領域をコードする
。好ましい一実施形態では、この核酸分子は、図16または図37に示される配列を含む
。別の好ましい一実施形態では、この核酸分子は、図16または図37に示される核酸と
同じアミノ酸配列をコードするが、1または複数の異なるコドンをコードするので、異な
る配列を有する。例えば、かかる核酸分子は、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣(C
HO)細胞、NS0細胞またはPER−C6(商標)細胞などの抗体産生細胞のためにコ
ドン最適化される。本発明は、図16Dまたは図37の重鎖をコードする核酸配列をさら
に提供する。
たはデオキシリボ核酸(DNA)である。代替的な核酸は、当業者に入手可能である。本
発明に従う核酸は、例えば、細胞中に含まれる。この核酸が細胞において発現される場合
、この細胞は、本発明に従う抗体を産生する。従って、本発明は、一実施形態では、本発
明に従う抗体および/または本発明に従う核酸を含む細胞を提供する。この細胞は、好ま
しくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくは霊長類細胞、最も好まし
くはヒト細胞である。本発明の目的のために、適切な細胞は、本発明に従う抗体および/
または本発明に従う核酸を含むことが可能な、好ましくはそれを産生することが可能な、
任意の細胞である。
型的には、in vitroの、単離されたまたは組換え細胞)は、この抗体を産生する
。好ましい一実施形態では、この細胞は、ハイブリドーマ細胞、CHO細胞、NS0細胞
またはPER−C6(商標)細胞である。特に好ましい一実施形態では、この細胞は、C
HO細胞である。本発明に従う細胞を含む細胞培養物がさらに提供される。種々の機関お
よび会社が、例えば臨床使用のために、抗体の大規模産生のための細胞株を開発している
。かかる細胞株の非限定的な例は、CHO細胞、NS0細胞またはPER.C6(商標)
細胞である。これらの細胞は、タンパク質の産生などの他の目的のためにも使用される。
タンパク質および抗体の産業規模産生のために開発された細胞株は、本明細書で、産業的
細胞株とさらに呼ばれる。従って、好ましい一実施形態では、本発明は、本発明の抗体の
産生のための、抗体の大規模産生のために開発された細胞株の使用を提供する。
含む、抗体の生産方法をさらに提供する。好ましくは、この細胞は、無血清培地中で培養
される。好ましくは、この細胞は、浮遊成長(suspension growth)に
適応される。本発明に従う抗体の生産方法によって得ることができる抗体が、さらに提供
される。この抗体は、好ましくは、培養の培地から精製される。好ましくは、この抗体は
、アフィニティ精製される。
床目的のための抗体産生についてのその適切性が既知の別の細胞型である。特に好ましい
一実施形態では、この細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、アデノウイルスE1領域ま
たはその機能的等価物によって形質転換された細胞。かかる細胞株の好ましい例は、PE
R.C6(商標)細胞株またはその等価物である。特に好ましい一実施形態では、この細
胞は、CHO細胞またはそのバリアントである。好ましくは、抗体の発現のためにグルタ
ミン・シンテターゼ(GS)ベクター系を使用するバリアント。
。この医薬組成物は、好ましくは、(医薬的に許容される)賦形剤または担体を含む。好
ましい一実施形態では、この医薬組成物は、5〜50mMのヒスチジン、100〜300
mMのトレハロース、0.1〜03g/Lのポリソルベート20またはそれらの組み合わ
せを含む。pHは、好ましくは、pH=5.5〜6.5に設定される。好ましい一実施形
態では、この医薬組成物は、25mMのヒスチジン、220mMのトレハロース、0.2
g/Lのポリソルベート20またはそれらの組み合わせを含む。pHは、好ましくはpH
=5.5〜6.5、最も好ましくはpH=6に設定される。
をさらに含む。かかる標識は、典型的には、治療的適用には必要でない。例えば診断設定
では、例えば、身体中の標的細胞を可視化する際に、標識は有用であり得る。種々の標識
が適しており、多くが当技術分野で周知である。好ましい一実施形態では、この標識は、
検出のための放射活性標識である。別の好ましい一実施形態では、この標識は、赤外標識
である。好ましくは、この赤外標識は、in vivo画像化に適している。種々の赤外
標識が、当業者に入手可能である。好ましい赤外標識は、例えば、IRDye 800;
IRDye 680RD;IRDye 680LT;IRDye 750;IRDye
700DX;IRDye 800RS IRDye 650;IRDye 700ホスホ
ロアミダイト(phosphoramidite);IRDye 800ホスホロアミダ
イト(LI−COR USA;4647 Superior Street;Linco
ln、Nebraska)である。
を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、本発
明に従う抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。この
処置の開始前に、この方法は、好ましくは、対象が、かかるErbB−2、ErbB−3
もしくはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有するかどうか、またはそのリスクがあ
るかどうかを決定することを含む。一部の実施形態では、この対象は、ErbB−2につ
いて[+]または[++]と分類される。別の一実施形態では、この対象は、ErbB−
2について[+++]と分類される。本発明は、ErbB−2、ErbB−3もしくはE
rbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処
置における使用のための、本発明の抗体をさらに提供する。代替的に考案すると、本発明
は、ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍の処置のた
めの医薬または予防剤の製造のための、本発明に従う抗体の使用を提供する。本明細書で
使用する場合、用語、処置は、予防を包含する。
−3陽性癌である。好ましくは、この陽性癌は、乳癌、例えば、早期乳癌である。しかし
、本発明は、広範なErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性
癌、例えば、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、
非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、
前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌、黒色腫などに適用され得る。本発明に従う抗体は、典型的に
は、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘導性受容体
機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。本発明に従う抗体は
、好ましくは、ErbB−2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位およびErbB
−3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態では、
ErbB−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB−2陽
性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。従って
、ErbB−2、ErbB−3もしくはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍、好ましく
は、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非
小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前
立腺癌、腎臓癌、皮膚癌もしくは黒色腫を有する、またはそれを有するリスクがある対象
の処置における使用のための、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErb
B−3に結合する第2の抗原結合部位を含む抗体がさらに提供され、ErbB−3陽性細
胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、ErbB−2陽性細胞に対する第1の抗原結
合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。このErbB−3陽性細胞に対する
第2の抗原結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.39n
M以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB−2陽性細胞に対する第1の
抗原結合部位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ま
しくは4.0nM以下である。好ましい一実施形態では、この抗体は、抗体PB4188
である。
72、G179、S180およびR181、ならびにT144、T164、R166、P
172、G179、S180またはR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面
に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−2のドメインIの少なく
とも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
ブErbB−3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内に位置する、
表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−3のドメインIII
の少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝
臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵
臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌もしくは黒色腫を有する、またはそれを有するリスクが
ある対象の処置における使用のための、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およ
びErbB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む抗体がさらに提供され、本発明に従
うこの抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S180およびR
181、ならびにT144、T164、R166、P172、G179、S180もしく
はR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる
群から選択される、ErbB−2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗
原結合部位を含み、ならびに/または本発明に従うこの抗体は、好ましくは、R426お
よびネイティブErbB−3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内
に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−3のド
メインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
どのErbB−2特異的抗体を使用したモノクローナル抗体治療に適格な対象である。好
ましい一実施形態では、この対象は、腫瘍、好ましくはErbB−2/ErbB−3陽性
癌、好ましくはErbB−2治療耐性表現型および/またはヘレグリン耐性表現型、好ま
しくはモノクローナル抗体耐性表現型を有する腫瘍/癌を含む。かかる表現型を伴う腫瘍
は、現在の抗HER2レジメン、例えば(それらに限定されないが)ErbB−2に対す
るモノクローナル抗体治療を用いた処置を逃避し得る。
、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容できない程度の副作用
をもたらす閾値を超えないことを意味する。所望の治療効果を得るために必要とされる抗
体の量が低くなるほど、治療濃度域は典型的には大きくなる。従って、低い投薬量で十分
な治療効果を発揮する本発明に従う抗体が好ましい。投薬量は、トラスツズマブについて
の投薬レジームの範囲中にあり得るか、またはより低くてよい。
ても、ErbB−2受容体およびErbB−3受容体を標的化し、癌細胞株のin vi
troでの強力な増殖阻害およびin vivoでの腫瘍成長阻害を生じる抗体を記載す
る。ErbB−2またはErbB−3のいずれかに特異的なヒトおよびマウスFab結合
アームの多様なパネルが同定された。これらは、重鎖のヘテロ二量体化を駆動するCH3
領域中の変異を含む相補的発現ベクター中にそれらをクローニングすることによって、二
重特異性抗体として産生された。500超の二重特異性抗体を、小規模で産生し、3つの
異なる癌細胞株に対する結合アッセイおよび機能的アッセイにおいて試験した。種々の二
重特異性抗体を選択し、BxPC3細胞株を使用する同所性異種移植モデルにおいて試験
した。この細胞株は、ErbB−2受容体およびErbB−3受容体の両方を発現し、成
長についてErbB−3リガンドに部分的に依存する。BxPC3モデルは、堅固でスト
リンジェントなスクリーニング・モデルである。さらに、in vivoでの強い抗腫瘍
活性は、JIMT−1細胞株を使用する異種移植モデルを使用して確認されている。JI
MT−1細胞は、トラスツズマブに対して臨床的に耐性であった、乳癌を有する62歳の
患者の胸膜転移に由来する。JIMT−1細胞は、接着性単層として成長し、ヌード・マ
ウスにおいて異種移植腫瘍を形成する。JIMT−1細胞は、そのコード配列中に同定可
能な変異を示さなかった、増幅されたHER−2癌遺伝子を有する。JIMT−1細胞は
、HER−2のmRNAおよびタンパク質を過剰発現し、HER−1、HER−3および
HER−4のmRNAおよびタンパク質のレベルは、トラスツズマブ感受性細胞株SKB
R−3と類似である(Tannerら、Mol Cancer Ther 2004)。
マブ、ならびに化学化合物ラパチニブと比較して、より良い抗腫瘍効果が、本発明に従う
抗体を使用して得られた。
フェクション後に、>50mg/Lの水準で産生され得る。これらの二重特異性抗体は、
70%超の収率で、98%よりも高い純度に精製され得る。分析的特徴付け研究は、二価
単一特異性lgG1と匹敵する、二重特異性lgGl抗体プロファイルを示している。機
能的活性に関して、本発明の二重特異性抗体は、トラスツズマブ+ペルツズマブと比較し
て、in vitroおよびin vivoで優れた強度(potency)を実証でき
る。
従う抗体は、トラスツズマブまたはペルツズマブと組み合わされるが、それは、これらの
抗体が、異なるErbB−2エピトープに結合し、その結果、実施例に示されるように、
同じエピトープについて本発明に従う抗体と競合しないからである。別の一実施形態では
、本発明に従う抗体は、MM−121(#Ab6)またはRG7116(Roche)と
組み合わされるが、それは、これらの抗体が、異なるErbB−3エピトープに結合し、
その結果、実施例に示されるように、同じエピトープについて本発明に従う抗体と競合し
ないからである。
は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤および/またはMAPK経路の成分の阻害剤、例
えば、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤ま
たはSrc阻害剤などと組み合わされる。一実施形態では、ErbB−2およびErbB
−3に特異的な結合化合物は、微小管破壊薬物、またはヒストン・デアセチラーゼ(HD
AC)の阻害剤と組み合わされる。驚くべきことに、本発明者らは、これらの組み合わせ
が使用される場合に、相乗効果を見出した。従って、ErbB−2、ErbB−3もしく
はErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある
対象の処置のための方法がさらに提供され、この方法は、
− ErbB−2およびErbB−3に特異的な結合化合物、ならびに
− PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬
物、およびヒストン・デアセチラーゼ(HDAC)の阻害剤からなる群から選択される1
または複数の化合物を対象に投与することを含む。この阻害剤は、好ましくは、チロシン
・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤またはSrc阻害
剤を含む。このチロシン・キナーゼ阻害剤は、好ましくは、アファチニブ、ラパチニブお
よび/またはネラチニブである。このPI3Ka阻害剤は、好ましくはBYL719であ
る。一実施形態では、このAkt阻害剤は、MK−2206である。好ましい一実施形態
では、このmTOR阻害剤は、エベロリムスである。好ましい一実施形態では、このSr
c阻害剤は、サラカチニブである。好ましい一実施形態では、この微小管破壊薬物は、パ
クリタキセルである。好ましい一実施形態では、このHDAC阻害剤は、ボリノスタット
である。好ましい一実施形態では、ErbB−2およびErbB−3に特異的な結合化合
物は、MM−111(Merrimack Pharmaceuticals)である。
好ましい一実施形態では、ErbB−2およびErbB−3に特異的な結合化合物は、二
重特異性抗体である。好ましい一実施形態では、ErbB−2およびErbB−3に特異
的な結合化合物は、本発明に従う二重特異性抗体である。
有する、またはこの腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法がさらに提供され
、この方法は、
− ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2の
抗原結合部位を含む二重特異性抗体、ならびに
− PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬
物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される1または複数の化合物を対象に投与す
ることを含む。
る使用のための、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合
する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、この処置は、この二重特
異性抗体、ならびにPI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、
微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される少なくとも1つの化合物
を、ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する対
象に投与することを含む。好ましくは、ErbB−2のドメインIに結合する第1の抗原
結合部位およびErbB−3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を有する本
発明に従う二重特異性抗体は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分
の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される1または複数
の化合物と組み合わされる。この阻害剤は、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、P
I3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤またはSrc阻害剤を含む。このチロシ
ン・キナーゼ阻害剤は、好ましくは、アファチニブ、ラパチニブおよび/またはネラチニ
ブである。このPI3Ka阻害剤は、好ましくはBYL719である。一実施形態では、
このAkt阻害剤は、MK−2206である。好ましい一実施形態では、このmTOR阻
害剤は、エベロリムスである。好ましい一実施形態では、このSrc阻害剤は、サラカチ
ニブである。好ましい一実施形態では、この微小管破壊薬物は、パクリタキセルである。
好ましい一実施形態では、このHDAC阻害剤は、ボリノスタットである。
しくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌
、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌
、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫瘍は、乳癌で
ある。一実施形態では、このErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB
−3陽性腫瘍は、腫瘍細胞1つ当たり1.000.000未満のErbB−2細胞表面受
容体を有する。
微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される1または複数の化合物と
、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR
阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される
少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、
BYL719、MK−2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパ
クリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる、本発
明に従う抗体は、典型的には、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−
3のリガンド誘導性受容体機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能で
ある。この本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB−2のドメインIに結合する第1
の抗原結合部位およびErbB−3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含
む。好ましい一実施形態では、ErbB−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和
性(KD)は、ErbB−2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、
またはそれよりも高い。ErbB−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、
好ましくは2.0nM以下、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99
nM以下である。ErbB−2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性は、好まし
くは5.0nM以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。
阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される1または複数の
化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、
mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選
択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラ
チニブ、BYL719、MK−2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット
およびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされ
る、本発明に従う抗体は、T144、T164、R166、P172、G179、S18
0およびR181、ならびにT144、T164、R166、P172、G179、S1
80またはR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基
からなる群から選択される、ErbB−2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結
合する抗原結合部位を含む。
阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される1または複数の
化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、
mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選
択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラ
チニブ、BYL719、MK−2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタット
およびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と組み合わされ
る、本発明に従う抗体は、R426およびネイティブErbB−3タンパク質中のR42
6から11.2オングストローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる
群から選択される、ErbB−3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合す
る抗原結合部位を含む。
1849;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、
MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF184
7、MF3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB
−2特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、C
DR2およびCDR3配列を含む、ならびに/または図16Bもしくは図16Eもしくは
図37に示されるMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF33
07;MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF
6060;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;
MF6066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF607
1;MF6072;MF6073およびMF6074からなる群から選択されるErbB
−3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、C
DR2およびCDR3配列を含む、本発明に従う二重特異性抗体は、PI3キナーゼ経路
の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤か
らなる群から選択される1または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害
剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタット
およびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好まし
くは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK−2206、エベロ
リムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される
少なくとも1つの化合物と組み合わされる。
− 図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849
;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF29
16、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF
3001、MF3003およびMF1898の重鎖可変領域配列からなる群から選択され
るErbB−2特異的重鎖可変領域配列、またはMF2926、MF2930、MF18
49;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF
2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、
MF3001、MF3003もしくはMF1898の重鎖可変領域配列と多くて15アミ
ノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、よ
り好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なるErbB−2特異的重鎖
可変領域配列を含み、ならびに
− 図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF3176
;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF60
57;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF
6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;
MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF6
074の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域配
列、またはMF3178;MF3176;MF3163;MF3099;MF3307;
MF6055;MF6056;MF6057;MF6058;MF6059;MF606
0;MF6061;MF6062;MF6063;MF6064;MF6065;MF6
066;MF6067;MF6068;MF6069;MF6070;MF6071;M
F6072;MF6073もしくはMF6074の重鎖可変領域配列と多くて15アミノ
酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より
好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なるErbB−3特異的重鎖可
変領域配列を含む、本発明に従う二重特異性抗体は、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤
、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選
択される1または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka
阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタ
キセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、より好ましくは、アファチ
ニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK−2206、エベロリムス、サラカ
チニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つ
の化合物と組み合わされる。好ましい一実施形態では、抗体PB4188は、PI3キナ
ーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC
阻害剤からなる群から選択される1または複数の化合物と、好ましくは、チロシン・キナ
ーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Src阻害剤、ボリノ
スタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、よ
り好ましくは、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL719、MK−2206
、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選
択される少なくとも1つの化合物と組み合わされる。
使用を提供する。ヘレグリンは、ErbB−3陽性腫瘍細胞の成長に関与する増殖因子で
ある。典型的には、腫瘍細胞が高レベルのヘレグリン(ヘレグリン・ストレスと呼ばれる
)を発現する場合、トラスツズマブ、ペルツズマブおよびラパチニブなどの現在公知の治
療は、腫瘍成長を阻害することがもはや可能ではない。この現象は、ヘレグリン耐性と呼
ばれる。しかし、驚くべきことに、本発明に従う抗体は、高レベルのヘレグリンを発現す
る腫瘍細胞の成長に対抗することも可能である。本明細書で使用する場合、ヘレグリンの
発現レベルは、細胞が、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの、少な
くとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好
ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグ
リン発現レベルを有する場合、高いとみなされる。ヘレグリン発現レベルは、例えば、腫
瘍RNAを用いたqPCRを使用して(例えば、Shamesら、PLOS ONE、2
013年2月、第8巻、第2号、1〜10頁およびYonesakaら、Sci.tra
nsl.Med.、第3巻、第99号(2011);1〜11頁などに記載されている)
、または血液、血漿もしくは血清サンプルを好ましくは使用する、例えばELISAなど
のタンパク質検出方法を使用して(例えば、Yonesakaら、Sci.transl
.Med.、第3巻、第99号(2011);1〜11頁などに記載されている)、測定
される。従って、ErbB−2、ErbB−3もしくはErbB−2/ErbB−3陽性
腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発
明に従う抗体がさらに提供され、この腫瘍の細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘ
レグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは
少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%
または95%であるヘレグリン発現レベルを有する。この本発明に従う抗体は、好ましく
は、ErbB−2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位を含む。ErbB−2、E
rbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する対象の処置のための方法
もまた提供され、この腫瘍の細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レ
ベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80
%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%で
あるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、本発明に従う抗体または医薬組成物を対
象に投与することを含む。好ましい一実施形態は、ErbB−2、ErbB−3またはE
rbB−2/ErbB−3陽性腫瘍の処置のための医薬の調製のための本発明に従う抗体
の使用を提供し、この腫瘍の細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レ
ベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80
%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%で
あるヘレグリン発現レベルを有する。このErbB−2、ErbB−3またはErbB−
2/ErbB−3陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食
道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、
頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最
も好ましくは、この腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道
癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液
腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌もしくは黒色腫、
好ましくは乳癌、を有するまたは有するリスクがある対象の処置における使用のための、
本発明に従う抗体がさらに提供され、この癌の細胞は、BXPC3またはMCF7細胞の
ヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましく
は少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90
%または95%であるヘレグリン発現レベルを有する。本発明に従う抗体は、好ましくは
、ErbB−2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位を含む。
細胞の遊走、浸潤、成長および/または分化)の間に存在する。典型的には、腫瘍開始細
胞は、例えばCD44、CD24、CD133および/またはALDH1などの幹細胞マ
ーカーに基づいて同定される。従って、これらのプロセスは、トラスツズマブおよびペル
ツズマブなどの現在公知の治療によって、ほとんど対抗されない。本発明に従う抗体は、
高レベルのヘレグリンを発現する腫瘍細胞または腫瘍開始細胞の成長および/または分化
に対抗することが可能であるので、本発明に従うかかる抗体は、転移の形成に対抗するの
にも特に適切である。従って、ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/Erb
B−3陽性腫瘍を有する対象における転移の形成に対抗するための方法が、さらに提供さ
れ、このErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍細胞は
、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましく
は少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85
%、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現レベルを有し、
この方法は、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合する
第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体を対象に投与することを含む。転移の形成の処
置または予防における使用のための、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位および
ErbB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もまた提供され、この
ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍細胞は、BXP
C3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なく
とも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より
好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現レベルを有する。転移の
形成の処置または予防のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用
がさらに提供され、このErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3
陽性腫瘍細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも6
0%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは
少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現
レベルを有する。このErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽
性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、
卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、
膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この
腫瘍は、乳癌である。従って、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内
膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳
腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫の細胞、好ましくは乳癌
細胞の転移の形成の処置または予防における使用のための、ErbB−2に結合する第1
の抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う
二重特異性抗体がさらに提供され、これらの細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘ
レグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは
少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%
または95%であるヘレグリン発現レベルを有する。この本発明に従う抗体は、典型的に
は、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘導性受容体
機能、好ましくはリガンド誘導性成長を低減することが可能である。この本発明に従う抗
体は、好ましくは、ErbB−2のドメインIに結合する第1の抗原結合部位およびEr
bB−3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合部位を含む。好ましい一実施形態で
は、ErbB−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性(KD)は、ErbB−
2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高い。E
rbB−3陽性細胞に対する第2の抗原結合部位の親和性は、好ましくは2.0nM以下
、より好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である。ErbB
−2陽性細胞に対する第1の抗原結合部位の親和性は、好ましくは5.0nM以下、好ま
しくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である。
72、G179、S180およびR181、ならびにT144、T164、R166、P
172、G179、S180またはR181から約5アミノ酸位置以内に位置する、表面
に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−2のドメインIの少なく
とも1つのアミノ酸残基に結合する抗原結合部位を含む。
ブErbB−3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内に位置する、
表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−3のドメインIII
の少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。
3陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この腫瘍の細胞は
、BXPC3もしくはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好まし
くは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも8
5%、より好ましくは少なくとも90%もしくは95%であるヘレグリン発現レベルを有
する、方法、またはかかる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗
体は、図16Aまたは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849;
MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF291
6、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3
001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB−2特異的
重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2およ
びCDR3配列、または少なくとも重鎖可変領域配列を含む。
3陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この腫瘍の細胞は
、BXPC3もしくはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好まし
くは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも8
5%、より好ましくは少なくとも90%もしくは95%であるヘレグリン発現レベルを有
する、方法、またはかかる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗
体は、図16Bまたは図16Eまたは図37に示されるMF3178;MF3176;M
F3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF6057
;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF60
63;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;MF
6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF607
4からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列
、好ましくは少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配列、または少なくとも重鎖
可変領域配列を含む。一実施形態は、ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/
ErbB−3陽性腫瘍を有する対象の処置における使用のための、抗体PB4188を提
供し、この腫瘍の細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少な
くとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好
ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグ
リン発現レベルを有する。
のErbB−2受容体を有するErbB−2陽性腫瘍細胞を処置するために、特に適切で
ある。典型的にはErbB−2[++]またはErbB−2[+]と分類される、かかる
腫瘍を有する患者には、原発性腫瘍を有する患者ならびに再発したErbB−2陽性腫瘍
を有する患者が含まれる。トラスツズマブ(ハーセプチン)およびペルツズマブなどの現
在使用されている治療は、ErbB−2[+++]と分類される、その細胞表面上に1.
000.000超のErbB−2受容体を有する悪性ErbB−2陽性細胞を有する患者
のみに処方される。従って、ErbB−2[++]またはErbB−2[+]と分類され
る患者は、好ましくは、本発明に従う抗体で処置される。従って、本発明に従う使用のた
めの方法または抗体がさらに提供され、その対象は、腫瘍細胞1つ当たり1.000.0
00未満のErbB−2細胞表面受容体を有するErbB−2またはErbB−2/Er
bB−3陽性腫瘍を有する。好ましい一実施形態は、転移の形成の処置または予防におけ
る使用のための、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合
する第2の抗原結合部位を含む、本発明に従う二重特異性抗体を提供し、このErbB−
2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍細胞は、BXPC3または
MCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%
、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは
少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現レベルを有し、この腫瘍細胞は、1
.000.000未満のErbB−2細胞表面受容体を有する。
はそのリスクがある対象において、ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/E
rbB−3陽性腫瘍に対抗するために使用される。障害された心機能とは、その対象が、
健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満または80%未満、好まし
くは75%未満または70%未満である、例えば左室駆出分画(LVEF)などの心機能
を有することを意味する。この健康な心機能は、例えば、健康な集団の平均心機能(例え
ば、平均LVEFなど)である。あるいは、この健康な心機能は、本発明に従う抗体を用
いた抗腫瘍治療の開始前に患者において測定される機能(例えば、LVEF)である。
使用したLVEFの試験によってモニタリングされる。
ネットワークの一部として、成体の心筋細胞の成長、修復および生存に関与する。本明細
書で上に記載したように、心臓毒性は、ErbB−2標的化治療における公知の危険因子
であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアントラサイクリンと併せて使用される場合
に増加し、それによって、心臓負荷を誘導する。例えば、ドキシサイクリンとトラスツズ
マブとの組み合わせは、重症の心臓副作用を誘導する。トラスツズマブ誘導性心機能不全
の臨床症例の漸増する数にもかかわらず、その作用機構は未知である。ErbB−2、E
rbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍に対する現在公知の治療の心臓毒
性の観点から、本発明に従う抗体を使用することが特に有利である。実施例に示されるよ
うに、心筋細胞の生存に影響を与えないか、またはトラスツズマブおよびペルツズマブと
比較して、顕著に低い程度までしか影響を与えない抗体が、ここで提供されている。心臓
毒性が低減されるので、これは、重要な利点を提供する。これは、障害された心機能に罹
患していない人々にとって既に有利であり、障害された心機能に罹患している人々、例え
ば、うっ血性心不全(CHF)、左室機能不全(LVD)および/もしくは減少した左室
駆出分画(LVEF)に罹患している対象、ならびに/または心筋梗塞を有している対象
などにとっては、さらにいっそう有利である。従って、ErbB−2、ErbB−3もし
くはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、またはそれを有するリスクがある対
象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異性抗体がさらに提供され、この対
象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満または80%未満ま
たは75%未満または70%未満である心機能を有する。この心機能は、好ましくは、L
VEFを含む。このErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性
腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵
巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀
胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ましくは、この腫
瘍は、乳癌である。本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB−2のドメインIに結合
する第1の抗原結合部位およびErbB−3のドメインIIIに結合する第2の抗原結合
部位を含む。好ましい一実施形態は、ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/
ErbB−3陽性腫瘍を有する対象の処置のための、本発明に従う方法であって、この対
象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満、好ましくは80%
未満、好ましくは75%未満もしくは70%未満である心機能を有する、方法、またはか
かる処置における使用のための本発明に従う抗体を提供し、この抗体は、
− 図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849
;MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF29
16、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF
3001、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB−2特異
的重鎖可変領域の少なくともCDR3配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2お
よびCDR3配列、もしくは少なくとも重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領
域配列と多くて15アミノ酸、好ましくは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9も
しくは10アミノ酸、より好ましくは多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なる
重鎖可変領域配列を含み、ならびに/あるいは
− 図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178;MF3176
;MF3163;MF3099;MF3307;MF6055;MF6056;MF60
57;MF6058;MF6059;MF6060;MF6061;MF6062;MF
6063;MF6064;MF6065;MF6066;MF6067;MF6068;
MF6069;MF6070;MF6071;MF6072;MF6073およびMF6
074からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域の少なくともCDR3
配列、好ましくは少なくともCDR1、CDR2およびCDR3配列、もしくは少なくと
も重鎖可変領域配列、または列挙された重鎖可変領域配列と多くて15アミノ酸、好まし
くは多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10アミノ酸、より好ましくは
多くて1、2、3、4もしくは5アミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む。好ましい一
実施形態では、この抗体は、PB4188である。
ヘレグリン・ストレス条件下での対象の処置における使用のためのものである。従って、
ErbB−2、ErbB−3もしくはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、ま
たはそれを有するリスクがある対象の処置における使用のための、本発明に従う二重特異
性抗体がさらに提供され、この対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましく
は85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満または70%未満である心
機能を有し、この腫瘍の細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベル
の少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、
より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%である
ヘレグリン発現レベルを有する。この心機能は、好ましくは、LVEFを含む。ErbB
−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する対象の処置のた
めの方法もまた提供され、この対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましく
は85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満、好ましくは70%未満で
ある心機能を有し、この腫瘍の細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現
レベルの少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも8
0%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%
であるヘレグリン発現レベルを有し、この方法は、本発明に従う二重特異性抗体または医
薬組成物を対象に投与することを含む。好ましい一実施形態は、健康な心機能、好ましく
は健康なLVEFと比較して、90%未満、好ましくは85%未満、好ましくは80%未
満、好ましくは75%未満または70%未満である心機能、好ましくはLVEFを有する
対象における、ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍
の処置のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特異性抗体の使用を提供し、この
腫瘍の細胞は、BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60
%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少
なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現レ
ベルを有する。
原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体もま
た提供され、その対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、好ましくは85%未満
、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満、好ましくは70%未満である心機能を
有する。転移の形成の処置または予防のための医薬の調製のための、本発明に従う二重特
異性抗体の使用がさらに提供され、その対象は、健康な心機能と比較して、90%未満、
好ましくは85%未満、好ましくは80%未満、好ましくは75%未満、好ましくは70
%未満である心機能を有する。このErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/E
rbB−3陽性腫瘍は、好ましくは、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、
子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部
癌、脳腫瘍、膀胱癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫である。最も好ま
しくは、この腫瘍は、乳癌である。この心機能は、好ましくは、LVEFを含む。好まし
い一実施形態では、この抗体は、抗体PB4188である。
MAPキナーゼ経路の種々の因子のリン酸化に対抗するための本発明に従う抗体の使用が
行われる。これらは、HER3の下流の増殖促進性シグナル伝達経路である。驚くべきこ
とに、本発明者らは、本発明に従う抗体を用いて、Akt、ERK1/2およびS6リボ
ソーム・タンパク質(S6−RP)のリン酸化を顕著に阻害することに成功したが、トラ
スツズマブおよびペルツズマブは、これらの強い抗リン酸化効果を有さない。増殖促進P
I3キナーゼおよびMAPキナーゼ経路の因子のリン酸化に対抗することは有利であるが
、それは、これが、ErbB−3陽性腫瘍細胞の成長に対抗するからである。従って、A
kt、ERK1/2および/またはS6−RPのリン酸化に対抗する、好ましくはそれを
阻害するための、本発明に従う抗体の使用がさらに提供される。重要なことに、Aktの
リン酸化は、実施例に示されるように、in vitroおよびin vivoの両方で
、本発明の抗体によって顕著に低減され得、またはさらには完全に遮断され得る。従って
、好ましい一実施形態は、Aktのリン酸化に対抗する、好ましくはそれを阻害するため
の、本発明に従う抗体の使用を提供する。HER3−p85複合体の形成に対抗するため
の、本発明に従う抗体の使用もまた提供される。HER3−p85複合体の形成は、Ak
t活性化における第1段階であるので、このHER3−p85複合体の形成に対抗するこ
とが有利である。この本発明に従う抗体は、好ましくは、ErbB−2のドメインIに結
合する第1の抗原結合部位およびErbB−3のドメインIIIに結合する第2の抗原結
合部位を含む二重特異性抗体である。この抗体は、好ましくは、T144、T164、R
166、P172、G179、S180およびR181、ならびにT144、T164、
R166、P172、G179、S180またはR181から約5アミノ酸位置以内に位
置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−2のドメイ
ンIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。さらに、または代替的
に、この抗体は、好ましくは、F409およびR426、ならびにネイティブErbB−
3タンパク質中のR426から11.2オングストローム以内に位置する、表面に露出し
たアミノ酸残基からなる群から選択される、ErbB−3のドメインIIIの少なくとも
1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む。一実施形態では、この抗体は、図16ま
たは図37に示される、少なくとも1つのCDR1、CDR2およびCDR3配列、また
は少なくとも1つのVH配列を含む。一実施形態では、この抗体は、PB4188である
。
て本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載された特徴の全てまたは一部の組み合
わせを有する実施形態を含み得ることが理解される。
方法、材料および抗体についてのスクリーニング
細胞株:
BxPC−3−luc2(Perkin Elmer 125058)、N87(AT
CC(登録商標)CRL−5822(商標))、SK−BR−3(ATCC(登録商標)
HTB−30(商標))、BT−474(ATCC(登録商標)HTB−20(商標))
、JIMT−1(DSMZ ACC 589)、L929(Sigma Aldrich
85011425)、K562(DSMZ ACC10)、HEK293T(ATCC
(登録商標)−CRL−11268(商標))、CHO−K1(DSMZ ACC110
)、MCF−7(DSMZ ACC 115)、MDA−MB−468(#300279
−513、Cell line services)SK−OV−3(ATCC(登録商
標)HTB−77(商標))、MDA−MB−175(ATCC−HTB−25)、MD
A−MB−453(ATCC−HTB−131)、MDA−MB−361(ATCC−H
TB−27)、ZR−75−1(ATCC−CRL−1500)およびMKN−45(D
SMZ ACC409)細胞株を、ATCC、DSMZまたはSigma Aldric
hから購入し、10%熱不活化胎仔ウシ血清(FBS)を補充した成長培地中で慣用的に
維持した。HEK293F Freestyle細胞を、Invitrogenから取得
し、293 FreeStyle培地中で慣用的に維持した。
製(HERのクローニング)
(ヒトHER2。)全長ヒトHER2を、乳癌細胞株JIMT−1から単離したRNA由
来のcDNAからPCRによって増幅した。ヒトHER2の増幅に使用したプライマーは
、以下の通りであった。フォワード・プライマー:AAGCTGGCTAGCACCAT
GGAGCTGGCGGCCTTGTGC、リバースド・プライマー:AATAATTC
TAGACTGGCACGTCCAGACCCAGG。全長増幅産物を、NheIおよび
XbaIで消化し、引き続いて、pcDNA3.1(Invitrogen)の対応する
部位中にクローニングした。
スフェクションおよび免疫化の目的のためにヒトHER2細胞外ドメイン(ECD)をも
っぱら発現する構築物を作製するために、HER2の膜貫通ドメインおよびECDを、P
CR増幅し、pVax1中に再クローニングした。トランスフェクション目的のために、
別の構築物を、HER2 ECDドメインを増幅することによってpDisplayにお
いて作製し、この構築物中では、HER2 ECDドメインは、PDGFR膜貫通ドメイ
ンと融合される。
た。トランスフェクションおよび免疫化の目的のためにヒトHER3 ECDをもっぱら
発現する構築物を作製するために、HER3の膜貫通ドメインおよびECDを、PCR増
幅し、pVax1中に再クローニングした。さらに、別の構築物を、pVax1において
作製し、ここで、HER3 ECDドメインを、PDGFR膜貫通ドメインに融合させた
。全ての配列を、NCBI参照NM_001982.3との比較によって検証した。
rmal Colon Tissue(Biochain)からPCR増幅した。カニク
イザルHER2の増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった:
フォワード・プライマー:AAGCTGGCTAGCACCATGGAGCTGGCGG
CCTGGTAC、リバースド・プライマー:AATAATTCTAGACTGGCAC
GTCCAGACCCAGG。全長増幅産物を、NheI−XbaIで消化し、引き続い
て、pcDNA3.1の対応する部位中にクローニングした。このクローンを配列決定し
、アカゲザルの利用可能な配列(XM_002800451)とアラインして、ErbB
−2クローンの正確さをチェックした。
rmal Colon Tissue(Biochain)からPCR増幅した。カニク
イザルHER3の増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった:
フォワード・プライマー:AAGCTGGCTAGCACCATGAGGGCGAACG
GCGCTCTG、リバースド・プライマー:AATAATTCTAGATTACGTT
CTCTGGGCATTAGC。全長増幅産物を、NheI−XbaIで消化し、引き続
いて、pcDNA3.1の対応する部位中にクローニングした。このクローンを配列決定
し、アカゲザルの利用可能な配列(ENSMMUP00000027321)とアライン
して、HER3クローンの正確さをチェックした。
交換ドメイン構築物を、ニワトリHER2配列のドメインIからIVを、ヒトIのドメイ
ンIからIVに交換することによって作製した。mycタグを含む配列を、哺乳動物細胞
における発現のために最適化し、Geneartにおいて合成した。
換ドメイン構築物を、ラットHER3配列のドメインIからIVを、ヒトIのドメインI
からIVに交換することによって作製した。mycタグを含む配列を、哺乳動物細胞にお
ける発現のために最適化し、Geneartにおいて合成した。
細胞表面上に高レベルのHER3を発現する細胞株を作製するために、哺乳動物発現ベ
クターを、NotIおよびKpnI消化によって全長HER3を切り出すことによって作
製した。引き続いて、この断片を、pcDNA3.1(−)/hygroベクターの対応
する部位中にクローニングした。ネオマイシン耐性遺伝子をコードする全長HER2およ
びHER3発現ベクターを使用して、細胞表面上に高レベルのHER2を発現する細胞株
を作製した。トランスフェクション前に、プラスミドを、SSpIおよびFspI消化に
よって線状化した。両方のベクターを、K562細胞中に別々にトランスフェクトし、安
定なプールを、抗生物質選択後に作製した。得られた細胞株(K562−HER2および
K562−HER3)は、それらの細胞表面上に高レベルのHER2およびHER3を発
現した。
(HER2免疫化。)4つの異なる免疫化戦略を適用した。コホート#Aについて、6匹
のC57Bl/6マウスを、腹腔内注射によって、200μl中2×106の、HER2
を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、1
4日目に腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解させた
20μgのErbb−2−Fc(RND systems)タンパク質で追加免疫し、そ
の後、28日目および42日目に、200μl中2×106の、HER2を一過的にトラ
ンスフェクトしたL929細胞で追加免疫した。コホート#Cについて、6匹のC57B
l/6マウスを、腹腔内注射によって、2×106の、HER2を一過的にトランスフェ
クトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを、14日目に腹腔内注射によ
って、200μl中2×106の、HER2を一過的にトランスフェクトしたL929細
胞で追加免疫し、その後、35日目に腹腔内注射によって、125μlのTiterma
x Gold中に溶解させた20μgのErbb−2−Fcタンパク質でタンパク質追加
免疫し、49日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgの
Erbb−2−Fcタンパク質で最終追加免疫した。コホート#Eについて、6匹のC5
7Bl/6マウスを、腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中
に溶解させた20μgのErbb−2−Fcタンパク質で免疫化した。引き続いて、腹腔
内注射を介した、125μlのTitermax Gold中に溶解させた20μgのE
rbb−2−Fcタンパク質によるタンパク質追加免疫を、14日目および28日目に実
施し、42日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgのE
rbb−2−Fcタンパク質で最終追加免疫した。コホート#Gについて、6匹のC57
Bl/6マウスを、そのプロトコールに従って、Genovac(Freiburg、G
ermany)においてDNAワクチン接種によって免疫化した。DNAワクチン接種に
使用した、エンドトキシン・フリーの提供されたベクターは、pVax1中にクローニン
グされたHER2の膜貫通部分および細胞外部分をコードしていた。引き続いて、DNA
追加免疫を、14日目、28日目および66日目に与えた。
の(C57Bl/6)マウスを、腹腔内注射によって、200μl中2×106の、HE
R3を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化した。引き続いて、マウスを
、14日目、28日目、49日目および63日目に、200μl中2×106の、HER
3で一過的にトランスフェクトされたL929細胞で追加免疫した。コホート#Dについ
て、6匹のC57Bl/6マウスを、0日目、14日目および28日目に腹腔内注射によ
って、2×106の、HER3を一過的にトランスフェクトしたL929細胞で免疫化し
た。引き続いて、マウスを、49日目に腹腔内注射によって、125μlのTiterm
ax Gold中に溶解させた20μgのErbb−3−Fcタンパク質で追加免疫し、
66日目に腹腔内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgのErbb
−3−Fcタンパク質で最終追加免疫した。コホート#Fについて、6匹のC57Bl/
6マウスを、腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold中に溶解さ
せた20μgのErbb−3−Fcタンパク質で免疫化した。引き続いて、マウスを、1
4日目および28日目に腹腔内注射によって、125μlのTitermax Gold
中に溶解させた20μgのErbb−3−Fcタンパク質で追加免疫し、42日目に腹腔
内注射によって、200μlのPBS中に溶解させた20μgのErbb−3−Fcタン
パク質による最終追加免疫を与えた。コホート#Hについて、6匹のC57Bl/6マウ
スを、そのプロトコールに従って、Genovac(Freiburg、Germany
)においてDNAワクチン接種によって免疫化した。DNAワクチン接種に使用した、エ
ンドトキシン・フリーの提供されたベクターは、pVax1中にクローニングされたPD
GFRの膜貫通部分およびHER3の細胞外部分をコードしていた。引き続いて、DNA
追加免疫を、14日目、28日目および66日目に与えた。
免疫化されたC57Bl/6マウス由来の血清中の抗HER2力価を、ECD−Erb
b−2タンパク質(Bendermedsystems)に対するELISA、ならびに
HER2陰性K562、HER2低発現性細胞株MCF−7ならびにHER2増幅された
SKBR−3およびBT−474細胞に対するFACS分析によって、決定した。免疫化
されたC57Bl/6マウス由来の血清中の抗HER3力価を、Erbb−3−Fcタン
パク質に対するELISA、ならびにHER3陰性K562、HER2低発現性細胞株M
CF−7ならびにHER2増幅されたSKBR−3およびBT−474細胞に対するFA
CS分析によって、決定した。
び表2に記載されている。全てのコホート中の動物は、HER2またはHER3に対する
抗体応答を発達させた。
脾臓および流入領域リンパ節を、DNAでワクチン接種した全てのマウス(コホート#
Gおよび#H)から取り出した。単一細胞浮遊液を、全ての組織から作製し、引き続いて
、組織を、Trizol試薬中で溶解した。コホート#Aから#Fまで、脾臓を、最初の
追加免疫後に死亡したコホート#Cの1匹のマウスを除く全てのマウスから取り出した。
単一細胞浮遊液を、全ての脾臓から作製し、総B細胞画分を、CD19富化(コホート#
A、E、F)または非B細胞の枯渇(コホート#B、C、D)のいずれかによって、MA
CS分離手順を使用して単離した。
1つのファージ・ライブラリーを、各マウスについて構築した。この目的のために、1
群ごとの全てのマウス(1群につき5または6匹のマウス)からの材料を使用して、以下
のアプローチを使用してファージ・ライブラリーを調製した。各個々のマウスから、RN
Aを単離し、cDNAを合成し、VHファミリー特異的PCRを実施した。引き続いて、
マウス1匹当たりの全てのVHファミリーPCR産物を精製し、DNA濃度を決定し、消
化し、共通の軽鎖を含むファージ・ディスプレイ・ベクター中にライゲーションして、マ
ウス−ヒト・キメラ・ファージ・ライブラリーを作製した。全てのファージ・ライブラリ
ーは、85%超の挿入頻度で、106超のクローンを含んだ。
抗体断片を、抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリーを使用して選択した。免疫化
ライブラリーおよび合成ライブラリー(de Kruifら、Mol.Biol.(19
95)、248、97〜105に記載される通り)を、選択に使用した。
ファージ・ライブラリーを、VCS−M13ヘルパー・ファージ(Stratagen
e)を用いてレスキューし、組換えタンパク質でコートされたイムノチューブ(Nunc
)中で、2ラウンドにわたって選択した。第1ラウンドでは、ECD−Erbb−2タン
パク質(Bendermedsystems)を、イムノチューブ上にコートし、第2ラ
ウンドでは、Erbb−2−Fc(RND systems)を、イムノチューブ上にコ
ートした。これらのイムノチューブを、4%脱脂粉乳(ELK)中でブロッキングした。
ファージ抗体ライブラリーもまた、4%ELKでブロッキングし、その後、イムノチュー
ブにファージ・ライブラリーを添加した。免疫チューブ中での、ファージ・ライブラリー
とコートされたタンパク質とのインキュベーションを、回転条件下、室温で2時間実施し
た。次いで、イムノチューブを、PBS中0.05%のTween−20で5〜10回洗
浄し、その後、PBS中で5〜10回洗浄した。結合したファージを、50mMのグリシ
ン(pH2.2)を使用して溶出し、E.coli XL−1 Blueに添加し、ファ
ージ感染のために37℃でインキュベートした。引き続いて、感染した細菌を、アンピシ
リン、テトラサイクリンおよびグルコースを含む寒天プレート上にプレートし、37℃で
終夜インキュベートした。第1ラウンドの後、コロニーをプレートから掻き取り、合わせ
、その後、レスキューし、増幅して、富化された第1ラウンド・ライブラリーを調製した
。次いで、富化されたライブラリーを、上記プロトコールを使用して、Erbb−2−F
c(RND systems)に対して選択した。第2ラウンドの選択後、個々のクロー
ンを取り、レスキューして、ファージ・モノクローナル・ミニプレップを調製した。次い
で、Erbb2と結合している陽性ファージ・クローンを、乳癌細胞株BT−474への
結合についてFACSにおいて同定した。全てのErbb2特異的クローンのVH遺伝子
を配列決定した。VH遺伝子再編成を、VBASE2ソフトウェアを用いて確立して、ユ
ニーククローンを同定した。次いで、全てのユニーククローンを、HEK293T細胞(
陰性コントロール)、ErbB−2で一過的にトランスフェクトされたHEK293T細
胞、およびBT−474細胞への結合について、FACSにおいてファージ形式で試験し
た。
ファージ・ライブラリーを、VCS−M13ヘルパー・ファージ(Stratagen
e)でレスキューし、組換えタンパク質でコートされたイムノチューブ(Nunc)中で
、2ラウンドにわたって選択した。両方の選択ラウンドで、Erbb−3−Fc(RND
systems)を、イムノチューブ上にコートした。融合タンパク質のFc部分に向
かう選択バイアスを克服するために、Erbb−3−Fcに対する両方の選択ラウンドを
、150μg/mlのヒトIgGの存在下で実施した。これらのイムノチューブを、4%
ELKでブロッキングした。ファージ抗体ライブラリーを、4%ELKでブロッキングし
、その後、イムノチューブにファージ・ライブラリーを添加した。ファージ・ライブラリ
ーとのインキュベーションを、回転条件下、2時間実施した。次いで、イムノチューブを
、PBS中0.05%のTween−20で5〜10回洗浄し、その後、PBS中で5〜
10回洗浄した。結合したファージを、50mMのグリシン(pH2.2)を使用して溶
出し、E.coli XL−1 Blueに添加し、ファージ感染のためにインキュベー
トした。引き続いて、感染した細菌を、アンピシリン、テトラサイクリンおよびグルコー
スを含む寒天プレート上にプレートし、37℃で終夜インキュベートした。第1ラウンド
の後、コロニーをプレートから掻き取り、合わせ、ファージをレスキューし、増幅して、
富化された第1ラウンド・ライブラリーを調製した。次いで、富化されたライブラリーを
、上記プロトコールを使用して、Erbb−3−Fc(RND systems)に対し
て選択した。第2ラウンドの選択後、個々のクローンを取り、レスキューして、ファージ
・モノクローナル・ミニプレップを調製した。陽性ファージ・クローンを、乳癌細胞株B
T−474への結合についてFACSにおいて同定した。全ての陽性クローンのVH遺伝
子を配列決定した。VH遺伝子再編成を、VBASE2ソフトウェアを用いて確立して、
ユニーククローンを同定した。全てのユニーククローンを、K562細胞(陰性コントロ
ール)、安定なK562−HER3細胞およびBT−474細胞への結合について、FA
CSにおいてファージ形式で試験した。
クリーニング手順は、HER2に対する89のユニークFabクローンおよびHER3に
対する137のユニークFabクローンを生じた。Fabを、ユニークVDJ組換え事象
を示すそのユニークHCDR3配列に基づいて、ユニークであるとみなした。一部の場合
には、同一のHCDR3を有するが、CDR1および/またはCDR2中に差異を有する
、クローナル・バリアントが得られた。免疫化マウス・ライブラリーから、親和性バリア
ントを反映するVH遺伝子中の置換を含むクローナル・バリアントのクラスターを選択し
た。
モノクローナル抗体の作製
免疫化マウス・ファージ・ライブラリー由来の、VH遺伝子配列およびそのいくつかの
配列バリアントによって判断される、ユニーク抗体のVH遺伝子を、骨格IgG1ベクタ
ー中にクローニングした。2つの異なる産生細胞株を、プロセスの間に使用した;HEK
293Tおよび293F Freestyle細胞。接着性HEK293T細胞を、6ウ
ェル・プレート中で、80%のコンフルエンシーまで培養した。これらの細胞を、個々の
DNA−FUGENE混合物で一過的にトランスフェクトし、さらに培養した。トランス
フェクションの7日後、上清を回収し、培地をリフレッシュした。トランスフェクション
の14日後、上清を合わせ、0.22μM(Sartorius)を通じて濾過した。無
菌上清を4℃で貯蔵した。
×106細胞/mlの密度まで、シェーカー・プラトーで培養した。細胞を、24深ウェ
ル・プレートの各ウェル中に、0.3〜0.5×106の生存細胞/mlの密度で播種し
た。これらの細胞を、個々の無菌DNA:PEl混合物で一過的にトランスフェクトし、
さらに培養した。トランスフェクションの7日後、上清を回収し、0.22μM(Sar
torius)を通じて濾過した。無菌上清を4℃で貯蔵した。
二重特異性抗体を、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化および形成を確実にする
ために、所有のCH3テクノロジーを使用して作製した。このCH3テクノロジーは、2
つの異なる重鎖分子の効率的ペアリングを可能にするために、上に記載されたように(P
CT/NL2013/050294;WO2013/157954A1として公開)、C
H3領域中の荷電ベースの点変異を使用する。
IgGの精製を、アフィニティ・クロマトグラフィーを使用して、小規模(<500μ
g)、中規模(<10mg)および大規模(>10mg)で実施した。小規模精製を、減
圧濾過を使用して、24ウェル・フィルター・プレートにおいて無菌条件下で実施した。
最初に、培地のpHを、pH8.0に調整し、引き続いて、小規模産生物を、600rp
mの振盪プラットフォーム(Heidolphプレート・シェーカー)上で25℃で2時
間、プロテインA Sepharose CL−4Bビーズ(50% v/v)(Pie
rce)と共にインキュベートした。次に、ビーズを、減圧濾過によって回収した。ビー
ズを、PBS pH7.4で2回洗浄した。IgGを、0.1Mクエン酸塩緩衝液を用い
てpH3.0において溶出し、IgG画分を、Tris pH8.0で即座に中和した。
緩衝液交換を、マルチスクリーンUltracel 10マルチプレート(Millip
ore)を使用する遠心分離によって実施した。これらのサンプルは、PBS pH7.
4の最終緩衝液中で終わった。
抗体を、BT−474、HEK293T、およびHER2またはHER3を過剰発現す
るHEK293Tへの結合について、FACSにおいて試験した。従って、細胞を、トリ
プシンを使用して回収し、FACS緩衝液(PBS/0.5%BSA/0.5mM ED
TA)中106細胞/mlに希釈した。1〜2×105細胞を、U底96ウェル・プレー
ト中の各ウェルに添加した。細胞を、4℃で300gで2分間遠心分離した。上清を、プ
レート(複数可)を反転させることによって廃棄した。50μlの各IgGサンプルを、
10μg/mlの濃度で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を、1回遠心分
離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:100希
釈したマウス抗ヒトIgG PE(Invitrogen)を添加し、暗中で氷上で30
〜60分間インキュベートした。FACS緩衝液を添加した後、細胞を、1回遠心分離し
、上清を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。細胞を、HTS設定のFAC
SCantoフロー・サイトメーターで分析した。細胞への抗体の結合を、平均蛍光強度
(MFI)によって評価した。
2抗体およびHER3抗体を、抗原フィブリノーゲン、ヘモグロビンおよび破傷風毒素に
対する反応性について試験した。HER2およびHER3への特異的結合を試験するため
に、これらの抗体を、EGFR、HER2、HER3およびHER4の精製された組換え
細胞外ドメインへの結合について試験した。抗原を、MAXISORP(商標)ELIS
Aプレートに終夜コートした。ELISAプレートのウェルを、5%BSAを含むPBS
(pH7.2)で37℃で1時間ブロッキングした。選択された抗体を、PBS−2%B
SA中に希釈した10μg/mlの濃度で2連で試験し、25℃で2時間結合させた。コ
ントロールとして、この手順を、コートされた抗原に特異的な抗体および陰性コントロー
ル抗体を用いて、同時に実施した。ELISAプレートを、PBS−T(PBS−0.0
5% v/v Tween 20)で5回洗浄した。結合したIgGを、1:2000希
釈したHRPコンジュゲート(ヤギ抗マウスBD)を用いて検出し、25℃で2時間結合
させた。ELISAプレートを、PBS−T(PBS−0.05% Tween 20)
で5回洗浄し、結合したIgGを、OD492nm測定によって検出した。
抗HER2抗体のパネルを、キメラ構築物を使用して、他の種(マウス、ニワトリ)由
来のHER2 ECDに対するそれらの反応性、ならびにHER2分子中の特定のドメイ
ン、即ち、ドメインI、II、IIIおよびIVへのそれらの結合に基づいて、ビニング
した。
)由来のHER3 ECDに対するそれらの反応性、ならびにHER3分子中の特定のド
メイン、即ち、ドメインI、II、IIIおよびIVへのそれらの結合に基づいて、ビニ
ングした。
て、適切な構築物で一過的にトランスフェクトした。キメラ交換ドメイン構築物において
、ニワトリHER2またはラットHER3のドメインを、ヒト対応物によって置き換える
。特異的抗体の結合を、FACSによって測定した。構築物の発現を、抗myc抗体を使
用して確認した。トラスツズマブによるFACS染色を、ドメインIVへの特異的結合に
ついてのコントロールとして含めた。各群中の抗体を、染色の強度(MFI)に基づいて
ランク付けできた。
1.ドメインI特異的(25)
2.ドメインII特異的(2)
3.ドメインIII特異的(23)
4.ドメインIV特異的(7)
5.ドメインIV特異的およびマウスと交差反応性(2)
6.全ての構築物と反応性(2)
7.ヒトHER2とだけ反応性(4)
HER2ドメインIVにマッピングされた2つの抗体は、SKBR−3細胞の増殖を阻
害した。両方の抗体が、1アミノ酸の差異を除き、類似のCDR3を共有していた。1つ
の抗体PG1849を、競合ELISAにおいてトラスツズマブと競合するその能力につ
いて調査した。このELISAでは、Fc−HER2をコートし、15μg/mlの濃度
のIgG抗体と共にインキュベートした。15分間のインキュベーション後、ファージを
、もう1時間インキュベートした。その後、ファージを検出した。表4は、PG1849
およびトラスツズマブが、HER2に同時に結合できたことを実証しているが、それは、
ELISAの間にシグナルの喪失が現れなかったからである。真の競合は、同じファージ
および抗体をこのアッセイにおいて組み合わせた時にだけ観察された。
1.高いドメインIII反応性、ラットおよびマウス反応性、ならびにドメインIVへ
の軽微な反応性(8)
2.高いドメインIII反応性、ラット、ヒトおよびカニクイザル反応性、ドメインI
Vへの軽微な反応性(8)
3.ラット、カニクイザルおよびヒトHER3とだけ反応性(43)
4.ヒトHER3とだけ反応性(32)
5.全ての構築物と反応性(33)
SK−BR−3細胞を、L−グルタミンおよび10%熱不活化FBSを補充したDME
M−F/12中で培養した。BxPC−3−luc2細胞を、10%熱不活化FBSを補
充したRPMI1640中で培養した。MCF−7細胞を、100μM、NEAA 1m
Mのピルビン酸ナトリウム、4μg/mlのインスリンおよび10%の熱不活化FBSを
補充したRPMI1640中で培養した。
BSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加することによって不活
化した。細胞を、培養培地中6×104細胞/mlに希釈した。抗体を、10μg/ml
および1μg/mlの濃度に希釈し、96ウェル黒底プレート(ABgene AB−0
932)中に100μlの体積で添加した。細胞を、6000細胞/ウェルの密度で添加
した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%COで3日間培養した。A
lamar Blue(商標)(Invitrogen)を、製造者の指示に従って添加
し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%COで6時間インキュベートした。蛍光
を、550nmの励起波長および590nmの発光波長で測定した。成長阻害の程度を、
同じ濃度のトラスツズマブのものと比較した(表6)。
ト未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を
添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% B
SAおよび10μg/mlのホロ・トランスフェリンを含むRPMI1640培地)で2
回洗浄した。
mlおよび1μg/mlの濃度に希釈し、96ウェル黒底プレート(ABgene AB
−0932)中に100μlの体積で添加した。細胞を、1ng/mlの最終濃度のヒト
組換えヒトNRG1−ベータ1/HRG1−ベータ1 EGFドメイン(396−HB−
050 RND)の存在下で、5000細胞/ウェルの密度で添加した。ヒトNRG1−
ベータ1/HRG1−ベータ1 EGFドメインを、本明細書で以下、HRGと呼ぶ。こ
れらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%COで5日間培養した。Alama
r Blue(商標)(Invitrogen)を、製造者の指示に従って添加し、暗中
で95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。蛍光を、
550nmの励起波長および590nmの発光波長で測定した。成長阻害の程度を、同じ
濃度の#Ab6のものと比較した(表7)。
した。BxPC−3−luc−2細胞を、培養培地中8×104細胞/mlに希釈した。
抗体を、10μg/mlおよび1μg/mlの濃度に希釈し、96ウェル黒底プレート(
ABgene AB−0932)中に100μlの体積で添加した。細胞を、10ng/
mlの最終濃度のヒトHRGの非存在下または存在下で、8000細胞/ウェルの密度で
添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%COで4日間培養した
。Alamar Blue(商標)(Invitrogen)を、製造者の指示に従って
添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%COで4時間インキュベートした。
蛍光を、550nmの励起波長および590nmの発光波長で測定した。
に満たした。
本発明者らは、Devash(PNAS、1990)によって記載される方法を使用し
て、限定抗原−ELISAにおいて抗体をランク付けした。減少した抗原コーティング濃
度の使用は、観察された交差反応性反応を排除し、高親和性/結合力の抗体を検出するた
めに使用され得る。従って、固体支持体上の抗原濃度を徐々に減少させて、弱い免疫反応
性を調査した。2.5μg/mlから開始して0.019μg/mlまでのECD−Er
bb−2タンパク質の連続滴定を、MAXISORP(商標)ELISAプレートに終夜
コートした。ELISAプレートのウェルを、5%BSAを含むPBS(pH7.2)中
で37℃で1時間ブロッキングした。選択された抗体を、PBS−2%BSA中に希釈し
た10μg/mlの濃度で2連で試験し、25℃で2時間結合させた。コントロールとし
て、この手順を、コートされた抗原に特異的な抗体および陰性コントロール抗体を用いて
、同時に実施した。ELISAプレートを、PBS−T(PBS−0.05% v/v
Tween 20)で5回洗浄した。結合したIgGを、1:2000希釈したHRPコ
ンジュゲート(ヤギ抗マウスIgG、BD Biosciences)を用いて検出し、
25℃で2時間結合させた。ELISAプレートを、PBS−T(PBS−0.05%
Tween 20)で5回洗浄し、結合したIgGを、OD492nm測定によって検出
した。PG1849、PG2916、PG2926、PG2930、PG2971、PG
2973、PG3004およびPG3031を、HER2抗原滴定ELISAにおいて試
験した(図1)。
異なるファージ・ディスプレイ・ライブラリー由来のHER2 VHの結合を調査する
ために、HER2抗体のパネルを、クローニングし、別のVKカッパ鎖、即ち、MEHD
7945AのVLの背景で発現させた。産生されたIgGを、K562細胞および安定な
K562−HER2細胞に対するFACS分析に供した。コンビナトリアル・ライブラリ
ーおよび非コンビナトリアル・ライブラリー由来のVH遺伝子を、表8に列挙する。VH
鎖MF2971、MF3958、MF2916、MF2973、MF3004、MF30
25、MF3031は全て、共通の軽鎖IGKV1−39と組み合わせた場合に観察され
たように顕著な抗原特異性および結合を喪失することなくMEHD7945A軽鎖と組み
合わせることができた。VH鎖MF1849は、バリアント・カッパ軽鎖と組み合わせる
ことはできず、抗原特異性および結合を保持できなかった。
HER2またはHER3の機能を阻害する抗体は、当技術分野で公知である。さらなる
抗体を、公開された情報に従って構築し、293F Freestyle細胞において発
現させた。抗HER2抗体ペルツズマブおよびトラスツズマブを、米国特許出願公開第2
006/0212956号A1(Genentech)に開示された情報に基づいて作製
した。抗HER3抗体#Ab6は、WO2008/100624(Merrimack
Pharmaceuticals,Inc.)に開示された情報に基づき、IgG1骨格
ベクター中に再クローニングした。1−53およびU1−59抗HER3抗体の情報は、
米国特許第7,705,103号B2(U3 Pharma AG)から得た。抗HER
3 LJM716抗体の情報は、米国特許出願公開第2012/0107306号から得
た。ツー・イン・ワン抗EGFR抗HER3抗体MEHD7945Aの構築のための情報
は、WO2010/108127から得た。
HER2およびHER3抗体パネル由来のVHを、荷電した操作されたベクター中に再
クローニングし、その結果、抗体重鎖の発現の際に、重鎖のヘテロ二量体化が強制され、
トランスフェクション後に二重特異性抗体を生じる。3つの異なる戦略を、二重特異性I
gG形式でHER2およびHER3アームを組み合わせる際に使用した:
1.HER2(リガンド非依存的成長を遮断する)×HER3(リガンド非依存的成長
を遮断する)
2.HER2(リガンド非依存的成長を遮断する)×HER3(リガンド依存的成長を
遮断する)
3.異なるエピトープ・ビン由来のHER2×HER3(リガンド依存的成長を遮断す
る)
した。
HER2発現性およびHER3発現性膵臓BxPC−3−luc−2細胞株(Calip
er)の増殖を阻害する能力について試験した。抗体の強度を、10μg/mlおよび1
μg/mlの濃度で存在する抗体を用いた黒色および白色スクリーニングにおいて、HR
G依存的およびHRG非依存的設定で決定した。トラスツズマブを、同じ濃度で参照抗体
および陰性コントロール抗体として含めた。1μg/mlにおける上位80のHER2×
HER3二重特異性(組み合わされた阻害に基づく)の機能的活性を、図2に示す。
ェル形式で選択、再産生および精製し、10μg/mlおよび1μg/mlの濃度で黒色
および白色BxPC−3−luc−2スクリーニングにおいて再度試験した。これらの抗
体を、HRG依存的MCF−7アッセイにおいてさらに滴定し、トラスツズマブおよびペ
ルツズマブの組み合わせ(1:1)ならびに陰性コントロール抗体に対して比較した。図
3は、親HER3抗体およびトラスツズマブ+ペルツズマブの組み合わせと比較した、3
つの二重特異性抗体の滴定曲線の一例を示す。親モノクローナル抗体は、上のパネルに示
され、二重特異性抗体は、下のパネルに示される(図3)。
rismソフトウェアを用いた非線形回帰分析を使用して計算した。Graph pad
ソフトウェアは、MCF−7アッセイにおける二重特異性抗体のIC50値、およびBx
PC3アッセイにおけるそれらの阻害活性を、比較のために列挙する。12のHER2×
HER3二重特異性抗体のパネルは、トラスツズマブ+ペルツズマブと比較して、より強
力な阻害活性を有していた。さらに、これらの二重特異性抗体は、親モノクローナルPG
3178と等しく強力またはより強力であった(表9)。
63、3099および3176と組み合わせたHER2アームから構成された。最も強力
な二重特異性のHER2アームおよびHER3アームの両方は、二価モノクローナルとし
て、リガンド非依存的SKBR−3増殖(HER2アームおよびHER3アームの両方)
(表6)またはリガンド依存的MCF−7増殖(HER3アーム)(表7)を阻害するこ
とも可能であった。強力な抗体の大部分は、抗HER3抗体3178と組み合わせた、ド
メインIを認識するHER2アームから構成された。
表9に記載される抗体を、BxPC−3−luc2膵臓異種移植モデルにおいて試験し
た。BxPC−3−luc2細胞株は、HER2およびHER3の両方を発現し、HER
2低発現性細胞株とみなされる。研究の開始時に8〜10週齢のCB17 SCID雌性
マウスに、20μl中1×106の腫瘍細胞を、膵臓中に同所性に移植した。この目的の
ために、マウスを麻酔し、右側を下にして寝かせて左側を露出させ、0.5cmの切開を
左側腹領域に作製した。膵臓および脾臓を剥き出しにし、20μl中1×106の腫瘍細
胞を、膵尾部の嚢下(sub−capsulary)空間中に注射した。移植の1週間後
、バイオルミネセンス(BLI)データを生成した。画像化の15分前に、全てのマウス
が、150mg/kgのルシフェリン(D−ルシフェリン−EFカリウム塩、カタログ番
号E6552、Promega)の腹腔内注射を受けた。BLI画像化を、左側面からの
表示を使用して、1週間に1回または2回実施した。異常値動物−BLI/腫瘍体積に基
づく−を除去し、マウスを、各々7匹のマウスの群中にランダムに分配した。実験8日目
に、処置を開始した。抗体処置群中の動物に、3連続週にわたって毎週(0日目、7日目
、14日目および21日目)、30mg/kgの抗体を投薬した。処置の0日目に、これ
らの動物は、2回分の負荷量、即ち、60mg/kgの抗体を投与された。最終画像化を
、31日目に実施した。
るパネルを用いて実行した。第1のBxPC−3−luc2異種移植モデル(図4)では
、1つの群が陰性コントロール抗RSV抗体(コントロールIgG)を投与され、1つの
群がコントロール抗体トラスツズマブを投与され、1つの群が陽性コントロール抗体トラ
スツズマブ+ペルツズマブ(1:1 v/v)を投与された。残り7つの群は、モノクロ
ーナル(PG)または二重特異性(PB)抗体PG3004、PG3178、PB356
6、PB3710、PB3443、PB3448およびPB3441のうちの1つを投与
された。二重特異性抗体の組成の詳細は、表9に示される。
HER2×HER3抗体処置した動物の平均腫瘍量(BLI)は、トラスツズマブ+ペル
ツズマブの組み合わせで処置した動物のものと類似であった(図4)。
ール抗RSV抗体(コントロールIgG)を投与され、1つの群が陽性コントロール抗体
の組み合わせトラスツズマブ+ペルツズマブ(1:1 v/v)を投与された。残り5つ
の群は、抗体PG3163、PB3986、PB3990、PB4011およびPB38
83のうちの1つを投与された。二重特異性PB抗体の詳細について:表9。これらの二
重特異性抗体は、同じHER2アームMF2971と組み合わされた3つの異なるHER
3結合アーム、およびHER3結合アームMF3163と組み合わされたさらなるHER
2アームを含んだ。この実験では、コントロール群中の腫瘍は、第1の実験と同じレベル
の加速された成長を示さず、結果の解釈を複雑化した。それにもかかわらず、トラスツズ
マブ+ペルツズマブと比較して、PB3883およびPB3990 HER2×HER3
二重特異性は、類似の阻害活性を有していた(図5)。
F2971、MF3004、MF1849から構成され、HER3アームがMF3178
から構成される、二重特異性パネルの抗体を選択した。MF2971およびMF3004
アームは、マウス起源のものであり、それらをヒト化した。
それらの親対応物と比較した、HER2×HER3二重特異性抗体の結合を、FACS
分析によって決定した。FACSを、BxPC−3−luc2細胞およびMCF−7細胞
に対して実施し、抗体の連続滴定は、2,5μg g/ml〜0,01μg g/mlの
範囲であった。試験した抗体パネルは、二重特異性抗体PB3566ならびにその親抗体
、抗HER3抗体PG3178および抗HER2抗体PG3004から構成された。MF
Iデータをプロットしたところ、両方の細胞株についてのグラフは、二重特異性PB35
66が、抗HER3抗体PG3178および抗HER2抗体PG3004と比較して、両
方の腫瘍細胞株により効率的に結合することを示す(図6)。
MF2971およびMF3004を、当技術分野で公知のテクノロジーに従ってヒト化
した。MF2971の合計7つのヒト化/脱免疫化バリアント配列を発現させ、検証し、
in vitroでモノクローナルとして、HER3特異的抗体MF3178と二重特異
性形式で組み合わせて特徴付けた。7つのMF2971バリアント中のMF2971のH
CDR3をMF3004のHCDR3で置き換えることによって創出したMF3004の
7つのバリアント配列について、同じことを行った。全てのヒト化バリアントの発現、完
全性、熱安定性および機能的活性を分析した。産生、完全性、安定性および機能性完全性
に基づいて、MF2971のバリアント(2971−var2)を、MF3178と二重
特異性形式で使用されるVHの最適なヒト化バリアントとして選択した。この2971−
var2を、MF3958と改名した。二重特異性HER2×HER3組み合わせMF3
958×MF3178は、PB4188を生じた。
懸濁適応させた293F Freestyle細胞を、エルレンマイヤー・フラスコ中
で、3.0×106細胞/mlの密度まで、シェーカー・プラトーで培養した。細胞を、
4Lエルレン・フラスコ中に、0.3〜0.5×106生存細胞/mlの密度で播種した
。これらの細胞を、個々の無菌DNA:PEl混合物で一過的にトランスフェクトし、さ
らに培養した。トランスフェクションの7日後、二重特異性抗体を含む馴化培地を、低速
遠心分離、5分間1000gによって、その後、高速遠心分離、4000gで5分間によ
って回収した。収集された馴化培地を、5kDa Satorius hydrosar
tカセットで約600mlに濃縮し、引き続いて、4LのPBSに対して透析濾過した。
抗体を、約35mlのMabSelectSure XL(11℃)に対して、カラム上
に結合させた。非特異的(A−specifically)に結合したタンパク質を、1
50ml PBS、1M NaCl含有150ml PBS、100ml PBSを用い
て逆流様式でカラムを洗浄することによって除去した。結合した抗体を、100mMクエ
ン酸塩pH3.0を使用して逆流様式で溶出させ、5mlの画分を、中和のために、4m
lの1Tris pH8.0を含む10mlチューブ中に収集した。溶出した抗体を、s
uperdex 200 50/1000を使用するゲル濾過によって、さらに精製した
。この精製された抗体を、0.22μmシリンジ・フィルターを使用してフィルター滅菌
した。IgG濃度を、OD280測定によって決定し、タンパク質濃度を、アミノ酸配列
に基づいて計算した。タンパク質を、凝集(HPSEC)、純度(SDS−PAGE、n
MS、IEXおよびIEF)について試験した。タンパク質サンプルを−80℃で貯蔵し
た。
中規模精製を、HiTrap MabSelect SureカラムおよびHiTra
p脱塩カラムを使用して、AKTA 100 Explorerで実施した。サンプルを
、5ml/分でロードした。カラムを、2カラム体積のPBSで洗浄した。IgGを、0
.1Mクエン酸塩緩衝液を用いてpH3.0で溶出した。次に、サンプルを脱塩し、PB
S pH7.4の最終緩衝液中で終えた。IgGを、0.45μMフィルター(Sart
orius)を通して濾過した。IgG濃度を、プロテインAセンサーを用いてOcte
tを使用して測定した。タンパク質を、凝集(HPSEC)、純度(SDS−PAGE、
nMS、IEXおよびIEF)について試験した。タンパク質サンプルを−80℃で貯蔵
した。
PB4188(MF3958×MF3178)を、HP−SECおよびCIEX−HP
LC(TSKゲル−STAT 7μmカラム、4.6mm ID×10cm L)による
分析に供した。PB4188の分析プロファイルは、通常の単一特異性IgG1、例えば
、親HER2アームPG3958および抗RSVモノクローナル・コントロール抗体の挙
動と、概して一致していた(図7)。
組換えHER2およびHER3に対するPB4188およびPB3448の一価結合親
和性を、SPR(Biacore T100)によって決定した。Biacore(商標
)T100(GE Healthcare、Uppsala、Sweden)を使用して
、記載された全ての実験を実施した。センサー表面準備および相互作用分析を、25℃で
実施した。緩衝液およびBiacore試薬は、GE Healthcareから購入し
た。ErbB2−FcおよびERbB3−Fc(RND)を、500RUの標的固定化レ
ベルで、酢酸カリウム緩衝液(pH5.5)中でCM5センサー・チップの表面にコート
した。ランニング緩衝液は、フィルター滅菌したHBS(hepes緩衝食塩水):10
mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005% Tween−2
0;0.2μm)であった。これらの二重特異性抗体を、HBS中100、50、20、
10、1および0.1nMに希釈し、CM5センサー・チップの抗原カップリングした表
面上に高い(30μl/分)流速で実行した。BIA評価ソフトウェアを用いて、1:1
の一価相互作用についての曲線適合モデルは、HER2アームの親和性(一価相互作用)
の決定を可能にし、HER2アームの親和性が決定できた。HER3アームの低オフ・レ
ートに起因して、その親和性は決定できなかった。HER3アームの親和性を決定するた
めに、PB4188を、500RUの標的固定化レベルでCM5センサー・チップにコー
トした。Her2−FcおよびHer3−Fc抗原を、HBS中100、50、20、1
0、1および0.1nMに希釈し、PB4188表面上に高い流速(40μl/分)で実
行した。kオンおよびkオフ値を決定するために、BIA評価ソフトウェアを、一価分子
をセンサー・チップ表面にコートしたことおよびErbB3−Fc抗原が二価分子である
ことを考慮に入れるモデルと併せて使用した。PB4188およびPB3448の親和性
を、表10に示す。
結合親和性もまた、BT−474およびSK−BR−3細胞を使用し、定常状態細胞親
和性測定によって決定した。4つのIgGを分析した:1)抗HER2抗体3958およ
び抗HER3抗体3178を含む、PB4188(二重特異性HER2×HER3);2
)抗HER3抗体3178および抗TT(破傷風トキソイド)抗体1337を含む、PB
9215(二重特異性HER3×TT);3)抗HER2抗体3958および抗TT抗体
1337を含む、PB9216(二重特異性HER2×TT);4)ハーセプチン(単一
特異性HER2)。IgGを、IODO−GEN(登録商標)Precoated Io
donation Tubes(Pierce)および付随の指示書を使用して、125
Iで放射活性標識した。標識されたIgGを、25mM Tris−HCl、0.4M
NaCl、0.25% BSA、5mM EDTA、0.05% NaN3中で、約1〜
2×108cpm/mlの活性に希釈した。タンパク質濃度を、BCA Protein
Assay Kit(Pierce)を用いて決定した。BT−474およびSK−B
R−3細胞を使用した、標識されたIgGおよび非標識IgGのフロー・サイトメトリー
分析は、標識化後に、結合における低減の徴候を示さなかったか、または軽微な徴候のみ
を示した。定常状態細胞親和性測定を、以下のように実施した。細胞を、96ウェル・プ
レート中に播種し、種々の濃度の標識されたIgGと共に4℃でインキュベートした。未
結合の放射活性を、4時間後に除去し、細胞結合した放射活性を、ガンマ・ウェル・カウ
ンターを使用して測定した。非特異的結合を、受容体遮断濃度(100倍過剰)の未標識
の抗体を添加することによって測定した。各条件を、3連で試験し、抗体1つにつき3つ
の独立した実験を実施した。KD値を、Prism6.0d(GraphPad Sof
tware)を使用して、非特異的結合について補償する非線形回帰モデルに基づいて計
算した。適合された曲線を含むグラフを、両方の細胞株へのHER2×HER3 IgG
(PB4188)の結合について、図20に示す。平均値を含む24全てのアッセイにつ
いてのKDデータを、表12に示す。まとめると、BT−474およびSK−BR−3細
胞を使用して決定した平均KD値は、それぞれ、HER2×HER3について3.2およ
び2.0nM、ハーセプチンについて3.7および1.3nM、HER2×TTについて
3.9および2.3nM、ならびにHER3×TTについて0.23および0.99nM
であった。従って、PB4188は、HER3と比較してより高い親和性でHER2を標
的化するHER2×HER3二重特異性分子MM−111とは対照的に、HER2と比較
してHER3に対してより高い親和性を示す。
軟寒天におけるJIMT−1
PB3448およびPB4188を、軟寒天におけるトラスツズマブ耐性JIMT−1
細胞の成長を阻害する強度について試験した。この目的のために、96ウェル懸濁細胞培
養物プレートを準備した。100μLの軟寒天下層(完全培地中0,6%の最終濃度)を
注ぎ、凝固させた。次いで、10.000のJIMT−1細胞/ウェルを含む50μLの
軟寒天上層(0,4%の最終濃度)を、上に添加し、凝固させ、かかる96ウェル・プレ
ートを、37℃、10%CO2で終夜インキュベートした。次の日、陰性コントロール抗
体、ペルツズマブ+トラスツズマブ(1:1 v/v)、PB3448およびPB418
8を、10〜0,003μg/mlの範囲の片対数滴定で、DMEM培地中に添加した。
引き続いて、アッセイを、細胞培養インキュベーター中で8日間インキュベートした。最
後に、細胞を、37℃でAlamar Blueと共に3〜5時間インキュベートし、蛍
光強度を決定した(励起:560nm;発光:590nm)。PB3448およびPB4
188によるJIMT−1増殖の用量依存的阻害の一例が示される(図8)。
PB3448およびPB4188を、BT−474およびSKBR−3細胞の成長を阻
害する強度について試験した。3次元マトリゲルにおいて細胞を増殖させ、処置された細
胞と非処置の細胞を識別するために主成分分析を使用する、Leiden、Nether
landsを本拠とするOcello社で、細胞を試験した。2000のSK−BR−3
細胞または2250のBT474細胞を、384ウェル・プレート(Greiner 7
81091)のウェル1つ当たり15μlのマトリゲル中に播種した。次の日、10〜0
.003μg/mlの範囲の抗体の片対数滴定を、5ng/mlのHRGの非存在下また
は存在下で培養培地中に添加した。試験抗体は、陰性コントロール抗体、ペルツズマブ+
トラスツズマブ(1:1 v/v)、PB3448、PB4188および二重特異性抗E
GFR×HER3ツー・イン・ワン抗体MEHD7945Aを含んだ。さらに、HRGの
用量依存的滴定を、陽性コントロールとして含めた。各用量を、4連で試験した。細胞を
、37℃、5%CO2で細胞培養インキュベーター中において7日間インキュベートした
。次に、細胞を固定し、細胞のアクチン細胞骨格をファロイジンで染色し、核をヘキスト
で染色した。次に、蛍光画像を、ゲル(Z−スタック)を通じて異なるレベルで撮影し、
画像を重ねた。広い範囲の形態学的特徴を測定した(合計で800)。培地処置とHRG
処置との間で異なった特徴だけを、分析のために選択した。成長と関連した特徴、平均球
状体面積および球状体当たりの核は、培地処置とHRG処置との間で、最も顕著に異なっ
ていた。マルチパラメーター分析および単一パラメーター分析の両方を行った。単一パラ
メーター測定のために、t検定を実施して、培地に対して処置(HRGまたは抗体)を比
較した。各点についてのP値を決定した。変動性のほとんどを捕捉する、高次元データの
低次元組み合わせを見出すための方法である主成分分析(PCA)を、抗体濃度との関連
で使用して、データをプロットした。図9は、HRGの存在下での、ペルツズマブ+トラ
スツズマブ(1:1 v/v)、PB3448およびPB4188の効果を実証している
。両方のHER2増幅された乳癌細胞株において、PB4188は、HRGの存在下で、
ペルツズマブ+トラスツズマブ、PB3448およびツー・イン・ワン抗体MEHD79
45Aと比較して、優れた活性を示した。
殖活性
SKBR−3およびBT−474に対する、10ng/mlのHRGの存在下でのPB
4188の活性を、HER2、HER3抗体およびそれらの組み合わせのパネルと比較し
た。アッセイを、上記のようにマトリゲルにおいて実施し、形態学的特徴を分析した。図
10a中にプロットしたPCAデータは、マトリゲルにおけるSKBR−3細胞のHRG
誘導性の増殖および分岐/浸潤を示している。図10bは、抗体PB4188が、HRG
誘導性表現型を完全に復帰させることができるが、親モノクローナル抗体の組み合わせ(
PG3958+PG3178)は効果を有さないことを示している。さらに、PB418
8は、試験した全ての抗HER3抗体と比較して、はるかに効果的であった(図10c)
。さらに、個々の抗HER3抗体とトラスツズマブとの組み合わせ(転移性乳癌(mBC
)の治療における現在の標準)は、HRG誘導性表現型を復帰させることができなかった
(図10d)。HRGの存在下でPB4188にトラスツズマブを追加することで、PB
4188単独と比較して、SK−BR−3細胞の増殖および分岐/浸潤は低減された(図
10e)。
に対するPB4188の優れた抗増殖活性。
NRG1−β1の上方調節は、HER2標的化治療に対する重要な耐性機構である(W
ilson、2012)。NRG1−β1の上方調節がPB4188による抗増殖の強度
を妨害するかどうかを評価するために、抗体のパネルを、N87(HER2増幅された)
胃癌細胞株に対して、100ng/mlのHRGで試験した。N87細胞を、10%熱不
活化FBSを補充したRPMI1640中で培養した。増殖アッセイのために、N87細
胞のコンフルエント未満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシ
ンを、培養培地を添加することによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地
(0.05% BSAおよび10μg/mlのホロ・トランスフェリンを含むRPMI1
640培地)中で2回洗浄した。抗体を、1〜0,0001μg/mlで変動する片対数
滴定で希釈した。細胞を、100ng/mlの最終濃度のHRGの存在下で10000細
胞/ウェルの密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%C
O2で3日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen)を、
製造者の指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で6時
間インキュベートした。蛍光を、550nmの励起波長および590nmの発光波長で測
定した。PB4188は、抗HER2または抗HER3モノクローナル抗体よりも優れた
活性を示した(図11)。
ADCC活性は、癌における、治療的抗体にとって重要な抗腫瘍作用機構である。セツ
キシマブおよびトラスツズマブなどの、HERファミリーの受容体に対するヒト・モノク
ローナル抗体は、ADCCを誘導する。PB4188およびPB3448のベースライン
および増強されたADCC活性を、検証されたin vitro ADCCアッセイにお
いて決定した。トラスツズマブおよび陰性コントロール抗体を、実験中にコントロール抗
体として含めた。全血およびPBMC画分を、健康なドナーから取得した。各抗体を、H
ER2高(SK−BR−3)およびHER2低(MCF−7)発現性の標的細胞に対して
試験した。標的細胞に、51Cr(Amersham)をロードし、示された濃度の抗体
でオプソニン化した。全血またはPBMC画分を、RPMI1640+10%熱不活化F
CS中200μLの反応において、エフェクター細胞として使用した。細胞を、4時間一
緒にインキュベートし、溶解を、γ−シンチレーターを使用して上清中の放射活性を測定
することによって推定した。特異的溶解の百分率を、以下のように計算し:(実験的cp
m−基底cpm)/(最大cpm−基底cpm)×100、ここで、最大溶解を、抗体お
よびエフェクターの非存在下で5% Triton X−100および基底溶解の存在下
で決定した。図12に示されるように、二重特異性抗体PB3448は、組み合わせペル
ツズマブ+トラスツズマブと比較して、類似のADCC活性を示した。二重特異性抗体P
B4188は、高い抗体濃度(10μg/ml)で有効であった。
CCを示す
異なるADCC設定では、ADCC Reporter Bioassay(Prom
ega)を使用した。このバイオアッセイは、FcγRIIIa受容体、V158(高親
和性)またはF158(低親和性)バリアント、およびホタル・ルシフェラーゼの発現を
駆動するNFAT応答エレメントを安定に発現する操作されたJurkat細胞を使用す
る。このアッセイは、古典的51Cr放出アッセイに対して、ADCC Reporte
r Bioassayを用いて得られたデータを比較することによって検証された。これ
らのADCCアッセイを、384白色ウェル・プレートを使用した、Promega A
DCC Bioassayキットを使用して実施した。この実験設定では、SKBR−3
細胞を、バイオアッセイの20〜24時間前に、30μlのアッセイ培地(4%の低Ig
G血清を含むRPMI)中、1000細胞/ウェルの密度でプレートした。次の日、培養
培地を除去した。次に、抗体PB4188、ならびにその親抗HER2 PG3958お
よび抗HER3 PG3178ならびにそれらの組み合わせの連続希釈を、2連で作製し
た。10μl抗体希釈を、ウェルに添加した。抗体の出発濃度は10μg/mlであり、
10点の片対数倍連続希釈を作製して、完全な用量応答曲線を提供した。最後に、5μl
のADCC Bioassayエフェクター細胞(15000細胞/ウェル、V158)
を添加した。これらの細胞を、37℃で6時間インキュベートした。次に、15μlのB
IO−Gloルシフェラーゼ基質を添加し、5分後、ルミネセンスを、プレート・リーダ
ーで検出した。得られたデータを図13に示す。PB4188二重特異性抗HER2×H
ER3抗体は、親HER2およびHER3モノクローナルまたはそれらの組み合わせと比
較して、より高いADCC強度を示した。
ADCC活性は、異なる技術によって増強され得、そのうちの1つは、フコースの除去
である。フコースの除去は、いくつかのin vivoモデルにおいて、増加した抗腫瘍
活性を生じている[Junttila、2010]。PB4188の活性を最大化するた
めに、非フコシル化テクノロジーを適用し(Cheng LiuおよびAndreia
Lee.ADCC Enhancement Technologies for Ne
xt Generation Therapeutic Antibody.Antib
ody therapeutics−Trends in Bio/Pharmaceu
tical Industry 2009[13〜17])、それによって、Fc領域中
のN結合型炭水化物構造のフコシル化を防止する。野生型PB4188と比較した、非フ
コシル化されたPB4188のADCC強度を、HER2低発現性細胞(MCF−7)お
よびHER2増幅された細胞(SK−BR−3)を使用して、ADCC51Cr放出アッ
セイにおいて決定した。両方の抗体を、連続希釈で適用し、陰性コントロール抗体および
トラスツズマブを、このアッセイ中に含めた。図14は、高HER2発現性細胞および低
HER2発現性細胞の両方における、野生型バージョンおよび/またはトラスツズマブと
比較した、非フコシル化されたPB4188のADCC強度における増加を示している。
CC活性を示す
非フコシル化されたPB4188の活性を、V158(高親和性)FcγRIIIa受
容体バリアントまたはF158(低親和性)FcγRIIIa受容体バリアントのいずれ
かを含むADCCレポーター細胞に対して試験した。抗体、即ち、コントロール抗体、ト
ラスツズマブおよび非フコシル化されたPB4188の連続滴定を、接着性SK−BR−
3細胞に、異なるFcγRIIIaバリアントを保有するADCCレポーター細胞と組み
合わせて添加した。ADCC活性を、ルシフェラーゼ活性を測定することによって測定し
た。非フコシル化されたPB4188は、高親和性V158 FcγRIIIa受容体バ
リアントと組み合わせると、トラスツズマブと比較して、等しい活性を示した。対照的に
、非フコシル化されたPB4188は、低親和性F158 FcγRIIIa受容体バリ
アントと組み合わせると、トラスツズマブと比較して、優れたADCC活性を示した(図
15)。
JIMT−1ヒト乳癌腫細胞を、移植の時まで、10%胎仔ウシ血清、100単位/m
LペニシリンGナトリウム、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン、25μg/mL
ゲンタマイシンおよび2mMグルタミンを含むDMEM中で成長させた。移植当日、JI
MT−1乳房細胞を、対数期成長の間に回収し、冷PBS中に再懸濁した。雌性CB.1
7 SCIDマウス(Charles River)は、研究1日目に8週齢であり、1
6.5〜20.7gの体重範囲を有していた。各マウスに、5×106の腫瘍細胞(0.
2mL細胞懸濁物)を右側腹に皮下注射した。これらの腫瘍を、2次元でノギスによって
測定して、サイズをその平均体積として1週間に2回モニタリングした。腫瘍がおよそ1
00〜150mm3のサイズに達したところで、動物を、効力研究へと進めたた。異常値
動物−腫瘍体積−を除去し、マウスを、各々10匹のマウスの群中にランダムに分配した
。マウスに、4週間の期間にわたって、1週間に1回(抗体)または1日1回(ラパチニ
ブ)注射した。処置群の詳細を表11に示す。
ケジュールにおけるPB4188が等しく有効であり、ラパチニブまたはペルツズマブお
よびトラスツズマブの組合せよりも強力であったことが明らかになった。データを図17
および18に示す。
NRG1−β1の上方調節は、HER2標的化治療に対する重要な耐性機構である(W
ilson、2012)。PB4188を、漸増する濃度のHRG(NRG1−β1 E
GF)の存在下で、連続滴定でその親抗HER3モノクローナル抗体PG3178と比較
して試験した。この目的のために、N87細胞を、10%熱不活化FBSを補充したRP
MI1640中で培養した。増殖アッセイのために、N87細胞のコンフルエント未満の
細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを、培養培地を添加する
ことによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSAおよ
び10μg/mlのホロ・トランスフェリンを含むRPMI1640培地)中で2回洗浄
した。抗体を、1から0.0001μg/mlまでの範囲の片対数滴定で希釈した。細胞
を、漸増する濃度のHRG(0.04〜39,5nM)の存在下で10000細胞/ウェ
ルの密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で3
日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen)を、製造者の
指示に従って添加し、暗中で95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で6時間インキ
ュベートした。蛍光を、550nmの励起波長および590nmの発光波長で測定した。
PB4188は、親抗HER3モノクローナル抗体と比較して優れた活性を示した(図1
9)。
異性抗体が好ましい。
ショットガン変異誘発実験
アラニン・スキャニング変異誘発を使用して、それぞれHER2およびHER3につい
て、PG3958およびPG3178のエピトープをマッピングした。ショットガン変異
誘発アッセイでは、クローンを作製するが、ここでHER2/HER3細胞外ドメイン(
ECD)の各アミノ酸残基を、アラニンに置換する。次に、細胞アレイを、リバーストラ
ンスフェクションによって調製した(米国特許出願公開第2011/0077163号A
1)。従って、各クローンのDNAを、リポフェクタミンと混合し、この混合物を、38
4ウェル・プレートの特化したウェル中に配置した。HEK293T細胞を、各ウェルに
添加し、タンパク質の発現を、24時間後に測定した。引き続いて、抗体の反応性を、免
疫蛍光染色によって測定し、結合マップおよび抗体結合のための重要残基の同定をもたら
した。HER2およびHER3 ECD構築物の発現レベルを、市販のモノクローナル抗
体(R&D mAb 1129(HER2)およびR&D mAb 66223(HER
3))を使用してFACS分析によって検証した。
HER2 ECD変異体への一価PG3958 Fabの結合を、このアッセイにおい
て0.25μg/mlの濃度で試験し、ストリンジェントな洗浄条件を使用した(pH9
.0、350mM NaCl)。これにより、コントロールmAbの結合を保持しつつ、
WT HER2と比較して、PG3958 Fabの35%未満の残留結合を示した、H
ER2における3つの「重要」残基(T144、R166、R181)が同定された。H
ER2構造中の重要残基近傍に位置する2つの残基(P172、G179)は、顕著では
あるが、より重度ではない結合の喪失を示し、これらを「二次重要」残基と称した(表1
3および図21A)。これら全ての、表面に露出した残基は、HER2のドメインI中に
位置し、これらは、一緒になって、HER2分子の表面上に非連続的パッチを形成する。
野生型(WT)HER2 ECDおよび表13に列挙されるHER2 ECDバリアン
トをコードする構築物を、CHO−K1細胞において発現させた。表面に露出しており、
決定された重要残基に対し構造的に近傍にある3つのドメインI残基を、さらなる分析に
選択した。チロシンへのT164、S180およびD143の点変異を、HER2 EC
D構築物において作製し、得られた構築物もまた、CHO−K1において発現させた。L
159A HER2 ECDバリアントを、コントロール・サンプルとして、CHO−K
1細胞において発現させた。
3958×TT抗体。HER2のドメインIVに結合する抗HER2抗体トラスツズマブ
を使用して、細胞表面におけるHER2 ECD発現を検証した。平均MFI値をプロッ
トし、各曲線について、AUCを、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使
用して計算した。WT HER2結合を使用して、データを標準化した。このFACSデ
ータは、T144A、R166A、R181A、P172A、G179Aに加えて、変異
T164YおよびS180Yが、PG3958×TT抗体の結合において顕著な低減を生
じたことを示した(図22)。D143Y変異は、コントロールmAbの減少した結合に
よって実証されるように発現の重度の喪失を生じ、従って、PG3958エピトープにお
けるその潜在的な役割は決定できなかった。
FACSにおける、HER3 ECD変異体への、0.25μg/mlのPG3178
IgGの結合分析により、コントロールmAbの結合が保持されつつ、アラニンへの変
異がWT HER3と比較して結合の実質的な喪失を引き起こした、2つのいわゆる「重
要」残基(F409、R426)が同定された(表14および図23)。両方の残基は、
HER3のドメインIII中に位置し、空間的に遠位である。さらに、F409は、HE
R3疎水性コア中に埋められ、PG3178エピトープの一部である可能性は低くなって
いる。
CHO−K1細胞に、HER3 ECD変異構築物(表14中に列挙した)、WT H
ER3 ECDおよび2つのコントロール構築物(H407AおよびY424A)をトラ
ンスフェクトした。HER3 ECDバリアントへのPG3178結合を、FACS滴定
実験において試験した。HER3のドメインI(MM−121)およびドメインIII(
MEHD7945A)に結合する2つのコントロール抗体を、細胞表面上のHER3 E
CD発現を検証するために含めた。平均MFI値をプロットし、各曲線について、AUC
を、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して計算した。WT HER
3結合を使用して、データを標準化した。R426A変異は、PG3178結合に重要で
あることが示されたが、F409Aへの結合は、細胞表面での発現の喪失に起因して確認
できなかった(図24)。
HER2は、ヘレグリン受容体複合体HER2:HER4が関与するシグナル伝達ネッ
トワークの一部として、成体心筋細胞の成長、修復および生存に関与する。心臓毒性は、
HER2標的化における公知の危険因子であり、合併症の頻度は、トラスツズマブがアン
トラサイクリンと併せて使用される場合に増加し、それによって、心臓負荷を誘導する。
ヒト幹細胞由来の心筋細胞に基づくモデル系を使用して、PB4188の潜在的毒性を試
験し、アントラサイクリン・ドキソルビシンの存在下で、トラスツズマブならびにトラス
ツズマブおよびペルツズマブの組み合わせに対して、その潜在的毒性を評価した。ヒト幹
細胞由来の心筋細胞(Pluriomics BV)を、白色平底アッセイ・プレート(
corning 655098)中に、20.000ウェルの濃度で播種した。培養の5
日目に、培地を、10ng/mlのHRGを補充したグルコースおよびガラクトース・フ
リーの培養培地に置き換えた。7日目に、試験抗体を、ドキソルビシン(3μM)と組み
合わせて添加した。細胞生存度を、Promega Cell力価Gloアッセイを使用
して、9日目にアッセイした。単一特異性抗体は、68nMの単一濃度で試験したが、P
B4188は、3μMのドキソルビシンの存在下で3つの濃度で試験した。図25は、心
筋細胞の生存度が、試験した全てのPB4188濃度によって影響を受けなかったことを
示している。対照的に、トラスツズマブならびにトラスツズマブおよびペルツズマブの組
み合わせの両方が、心筋細胞の細胞生存度を低減させた。
トラスツズマブおよびHER3抗体U1−59と比較した、PB4188の結合を、異
なるレベルのHER2を発現する乳癌細胞株および胃癌細胞株に対するFACSによって
分析した。細胞を、それらが数百万のHER2コピーを発現する場合、および/またはH
ER2遺伝子増幅されている場合、HER2+++とみなした。以下の細胞株を使用した
:MCF−7(HER2+);MDA−MB−468(HER2+、MKN−45(HE
R2+)、MDA−MB−175(HER2+)、MDA−MB−453(HER2++
)、MDA−MB−361(HER2++)、ZR−75−1(HER2++)、JIM
T−1(HER2+++)、BT−474(HER2+++)、SKBR−3(HER2
+++)、SK−OV−3(HER2+++)、N87(HER2+++)。指数関数的
に成長した培養物の細胞を、トリプシンによって回収し、FACS緩衝液(PBS/0.
5% BSA/0.5mM EDTA)中106細胞/mlに希釈した。1〜2×105
細胞を、U底96ウェル・プレート中の各ウェルに添加した。細胞を、4℃で300gで
2分間遠心分離した。上清を、上記のプレート(複数可)を反転させ、その後1回はじく
ことによって廃棄した。50μlの各IgGサンプルを、3.16ng〜10μg/ml
の連続希釈で添加し、氷上で1時間インキュベートした。細胞を、1回遠心分離し、上清
を除去し、細胞を、FACS緩衝液で2回洗浄した。50μlの1:100希釈したマウ
ス抗ヒトIgGガンマPE(Invitrogen)を添加し、暗中で氷上で30〜60
分間インキュベートした。細胞を、1回遠心分離し、上清を除去し、細胞を、FACS緩
衝液で2回洗浄した。細胞を、HTS設定のFACSCantoフロー・サイトメーター
で分析した。結合した抗体の量を、中央値蛍光によって評価した。データをプロットし、
曲線下面積(AUC、中央値蛍光強度の累積測定値)を、試験した細胞株当たりで、各抗
体について決定した(図26)。
ER++細胞およびHER+細胞に対するより高い結合親和性を有すると結論付けられる
。
PB4188およびトラスツズマブは、HER2への結合について競合しない
PB4188は、HER2タンパク質のドメインIに結合するが、トラスツズマブの結
合エピトープは、ドメインIV中に局在する。両方の抗体がHER2結合について競合し
ないことを実証するために、HER2増幅されたSKBR−3乳房細胞を用いた結合アッ
セイを実施した。最初に、未標識の抗体を、飽和濃度でSKBR−3に結合させた。次に
、FITC標識されたPB4188を、滴定範囲内で添加し、蛍光をFACSによって測
定した。図27は、PB4188FITCが、トラスツズマブまたは陰性コントロールの
存在下で細胞に効率的に結合したことを実証している。SKBR−3細胞とPB4188
とのプレインキュベーションは、PB4188FITCが結合することを防止した。従っ
て、トラスツズマブおよびPB4188は、HER2への結合について競合しない。
ン耐性を克服できる
HER2×HER3二量体上でのPB4188の配向が、HRGストレス条件下での細
胞増殖を阻害するのに好ましいかどうかを試験するために、3178のHER3アーム、
およびドメインI、II、IIIまたはIVのいずれかを標的化するHER2アームから
構成される二重特異性抗体を作製した。2つのHER2×HER3二重特異性抗体を、H
ER2ドメインI〜IVの各々のために作製した。HER2アームは以下を含んだ:ドメ
インIを標的化するMF3958およびMF3003;ドメインIIを標的化するMF2
889およびMF2913;ドメインIIIを標的化するMF1847およびMF300
1、ならびにドメインIVを標的化するMF1849およびMF1898。各HER2
Fabアームを、3178のHER3 Fabアームと組み合わせ、高濃度のヘレグリン
の存在下での細胞増殖を阻害するそれらの強度について試験した。抗体滴定を、HER2
低発現性MCF−7細胞ならびに、HER2過剰発現性のN87およびSK−BR−3細
胞に対して実施した。N87、SK−BR−3およびMCF−7細胞のコンフルエント未
満の細胞培養物を、PBSで洗浄し、トリプシン処理し、トリプシンを培養培地を添加す
ることによって不活化した。細胞を、大きい体積のアッセイ培地(0.05% BSAお
よび10μg/mlのホロ・トランスフェリンを含むRPMI1640培地)中で2回洗
浄した。抗体を、片対数滴定で希釈した。細胞を、実験的に規定されたストレス濃度のH
RG(SK−BR−3は10nM、N87およびMCF−7は100nM)の存在下で、
10000細胞/ウェル(N87、SKB−BR−3)および5000細胞/ウェルMC
F−7の密度で添加した。これらの細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2
で3〜4日間培養した。Alamar Blue(商標)(Invitrogen)を添
加して、増殖を評価した。吸光度を、590nmの発光波長を用いて550nmの励起波
長で測定した。試験した全てのアッセイにおいて、HER2のドメインIを標的化する二
重特異性抗体のみが、高いヘレグリン濃度の存在下で増殖を阻害することができた(図2
8)。
PB4188を小分子薬物と組み合わせる可能性を調査するために、PB4188を、
PI3KまたはMAPK経路の異なるレベルにおいて妨害する薬物と組み合わせた。さら
に、化学療法薬物およびサイクリン阻害剤との組み合わせを試験した。組み合わせを、マ
トリゲルにおいてHRGの存在下で(SK−BR−3およびBT−474)、またはHR
Gストレス濃度の存在下で(増殖アッセイに記載したように、N87およびSK−BR−
3)成長しているHER2過剰発現性細胞に対して試験した。薬物組み合わせの阻害効果
を、画像化によって、またはAlamar Blueを本明細書で上に記載したように使
用して増殖を測定することによって、試験した。最初に、EC20 PB4188および
試験する薬物を決定した。次に、交差力価測定を、PB4188および薬物を用いて実施
した。相乗作用が、チロシン・キナーゼ阻害剤(アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ
)、PI3Ka阻害剤BYL719、Akt阻害剤MK−2206、mTOR阻害剤エベ
ロリムス、Src阻害剤サラカチニブ、微小管破壊薬物パクリタキセルおよびHDAC阻
害剤ボリノスタット(図40中で「ボロニスタット(voronistat)」とスペル
ミスされている)を用いて試験した全ての細胞株において観察された。図29は、形態学
的変化および細胞成長の低減を結果的に生じる、マトリゲルにおいて増殖したSKBR−
3細胞に対する、PB4188とラパチニブとの相乗的組み合わせの一例を示す。各組み
合わせで得られた成長阻害の程度を計算した。強度のシフトは、その効果に到達するため
に必要とされる単剤と比較した場合に、所望のレベルを達成するために組み合わせにおい
て必要とされる薬物の量がどれだけ少ないかを示すアイソボログラム(Grecoら、1
995)を使用して示され得る。CHALICE(商標)Analyzerソフトウェア
が組み合わせ実験の阻害値を使用して、アイソボログラムを生成した。HER2増幅され
た細胞に対する異なる薬物組み合わせのアイソボログラムを、図40に示す。アイソボロ
グラム分析により、PB4188が、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、BYL7
19、MK−2206、エベロリムス、サラカチニブ、ボリノスタットおよびパクリタキ
セルとの相乗的な薬物組み合わせを示したことが示された。
せで特に有効であったことを実証している。さらに、チロシン・キナーゼ阻害剤との組み
合わせが有効である。さらに、成長および遊走/浸潤薬物サラカチニブとの組み合わせが
、転移の状況において好都合であり得る。
指数関数的に成長した培養物の細胞を回収し、飢餓培地(N87細胞:RPMI−16
40、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン;SKBR−3細
胞:DMEM/F−12、2mM L−グルタミン、0.05% BSA、10μg/m
l ホロ・トランスフェリン)中で6ウェル・プレート中に播種し(N87について3.
75×106細胞およびSKBR−3について1.5×106細胞)、95%の相対湿度
中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、抗体を、5nMの最終濃
度になるように添加し、細胞を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で1時間イ
ンキュベートした。次いで、HRGを、100ng/mlの最終濃度になるように添加し
た。95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で1、3、6または24時間の後、プレ
ートを氷上に配置し、細胞を冷PBSで2回洗浄した。引き続いて、0.3mlの氷冷溶
解緩衝液を添加し(Cell signaling RTK #9803またはIC #
7018)、細胞を、氷上で最低30分間溶解させた。次に、タンパク質濃度を、BCA
(Pierce #23235)を使用して測定した。タンパク質濃度を、溶解緩衝液を
用いて2mg/mlに調整した。次に、溶解物を、PathScan RTK Sign
aling Antibody Arrays(Cell signaling #79
49)またはPathScan Intracellular Signaling A
ntibody Arraysに適用した。全てのインキュベーションを、オービタル・
シェーカー上の密封ウェルを用いて室温で実施した。溶解物(75μl)を、プロテアー
ゼ阻害剤のカクテルを補充した75μlのアレイ希釈剤緩衝液で0.8mg/mlの濃度
まで2回希釈し、氷上で維持した。アレイ・ウェルを、100μlのアレイブロック緩衝
液で15分間ブロッキングした。ブロック緩衝液を除去し、溶解物をウェルに適用し、2
時間インキュベートした。溶解物を吸引し、ウェルを、100μlの洗浄緩衝液で4回洗
浄した。次に、1ウェル当たり100μlの検出抗体のカクテルを適用し、1時間インキ
ュベートした。抗体のカクテルを吸引し、ウェルを、100μlの洗浄緩衝液で4回洗浄
した。75μlのDylight80(商標)ストレプトアビジンを、各ウェルに添加し
た。Dylight80(商標)ストレプトアビジンを吸引し、ウェルを、100μlの
洗浄緩衝液で4回洗浄した。マルチ−ガスケット(multi−gasket)を除去し
、スライドを、脱イオン水中10mlで10秒間洗浄した。スライドを乾燥させ、Ody
see(登録商標)Clxでの画像化のために処理した。スポット蛍光強度を、Imag
e Studioソフトウェアを使用して計算した。
み合わせとは対照的に、インキュベーションの最初の6時間の間、AKTのリン酸化を完
全に遮断する。さらに、強い阻害が、トラスツズマブ+ペルツズマブの組み合わせとは対
照的に、ERKおよびS6のリン酸化において観察される。PB4188は、HER2の
リン酸化を阻害しない(図30)。
RTKおよび細胞内Pathscanアレイにおいて観察されたリン酸化阻害を検証す
るために、ウエスタン・ブロットを、HRGストレス濃度の存在下で、PB4188、ペ
ルツズマブおよびトラスツズマブの組合せ、ならびにコントロール抗体で処置した細胞に
対して実施した。指数関数的に成長した培養物の細胞を回収し、飢餓培地(N87細胞:
RPMI−1640、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン;
SKBR−3細胞:DMEM/F−12、2mM L−グルタミン、0.05% BSA
、10μg/ml ホロ・トランスフェリン)中で、10cmディッシュ中に播種した(
N87について20×106細胞およびSKBR−3について7×106細胞)。次の日
、抗体を、5nMの最終濃度になるように添加し、細胞を1時間インキュベートした。次
いで、HRGを、100ng/mlの最終濃度になるように添加した。1、3、6または
24時間後、ディッシュを氷上に配置し、細胞を、冷PBSで2回洗浄し、エッペンドル
フチューブに移し、250μlのRIPA溶解緩衝液(20mM Tris−HCl p
H7.5、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1%
NP−40、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、2.5mM ピロ
リン酸ナトリウム、1mM ベータ−グリセロホスフェート、1mM Na3VO4、1
μg/ml ロイペプチン)で溶解した。溶解を、氷上で30分間進行させた。細胞溶解
物を遠心分離し、上清を、新しいエッペンドルフチューブ中に収集した。タンパク質濃度
を、BCA法(Pierce)を使用して決定した。30μgの溶解物を、4〜12%の
Bis−Tris NuPageゲル(Invitrogen)上で分離し、ゲル上のタ
ンパク質を、ニトロセルロースのメンブレンに移した。メンブレンを、5% BSAを含
むTBS−Tで1時間ブロッキングし、製造者の指示(Cell Signaling
Technology)に従って、示された抗体で染色した。次いで、メンブレンを、H
RPコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートし、ECL基質と共にインキュベー
トし、X線フィルム(Amersham)を使用するオートラジオグラフィーに供した。
全ての検出抗体は、Cell Signaling Technologyからであった
:ホスホ(Phospho)−Akt(ser 473)#4060、総(Total)
Akt #4691、ホスホPhospho−HER2(Tyr 1221/1222
)#2243、総 HER2 #2242、ホスホ−HER3(Tyr 1289)#4
791、総HER3 #4754、ホスホ−ERK1/2(Thr 202/Tyr 2
04)#4377、総ERK1/2 #4695、ホスホ−S6 RP(Ser 235
/236)#2211、総S6 RP #2217、ヤギ抗ウサギHRP−linked
#7074。
APKおよびPI3キナーゼ経路の両方の阻害を生じる、HER3リン酸化の延長された
阻害を示すことを示している(図31)。
Luminexによるリンタンパク質分析
2用量のPB4188および4用量のPB4188で処置したJIMT−1移植マウス
の腫瘍(100mm3)を、投薬の24時間後に取り出した。腫瘍を、瞬間凍結し、粉末
に加工した。腫瘍溶解物を、凍結粉末サンプルへの冷BioRad溶解緩衝液(0.4%
BioRad Factor 1、0.2% BioRad Factor 2および
2mM PMSFを補充した)の使用により、50mg腫瘍/mLの濃度に調製し、ロッ
カー上で4℃で60分間インキュベートして、完全な溶解を確実にした。これらのサンプ
ルを、16000×gで4℃で10分間遠心分離し、アリコート化した。総タンパク質を
、製造業者の指示に従ってBiorad DC Protein Assay試薬を使用
して決定した。Luminexアッセイ:JIMT−1腫瘍溶解物サンプルを処理し、M
illiporeからの市販のLuminexキット(カタログ番号48−618MAG
(ロット番号2532050)、46−645MAG(ロット番号46645M−1K)
を使用して、総AKT、AKT(Ser473)およびAKT(Thr308)について
分析した。各サンプルを、2連で試験した。希釈物を、全ての総分析物およびリン酸化分
析物の決定のために、1ウェル当たりおよそ25μgタンパク質の標的をロードするよう
、サンプル希釈剤中に調製した。製造業者の仕様書に従って、Milliporeキット
を使用した。
示した。AKTのリン酸化は、2回の週1回の用量の後および4回の週1回の用量の後の
両方に、PB4188によって完全に阻害された(図32)。
1または2用量のPB4188で処置したJIMT−1移植マウスの腫瘍(100mm
3または400mm3)を取り出し、10%中性緩衝ホルマリン中で固定した。100m
m3腫瘍を保有するマウスは、単一PB4188用量(25mg/kg)の24時間後に
屠殺したが、400mm3腫瘍を保有するマウスは、25mg/kgの2回の週1回の用
量を投与され、投薬の4時間後に屠殺した。次に、サンプルをパラフィン包埋した。厚さ
7umの切片を、ミクロトーム(LEICA)を用いてスライスし、通し番号で標識した
、正に荷電したガラス・スライド(VWR)上に配置した。スライドを、30分間風乾し
、次いで、60℃に設定した加熱オーブン中で焼いた。次のサンプルを、異なるVera
Tag分析のために処理した。米国特許出願第12/340,436号に従う総HER2
分析(HT2)、米国特許第8,349,574号と米国特許出願公開第2013/00
71859号に従う総HER3分析(H3T)、ならびに最後に、国際特許出願PCT/
US2014/033208に従うHER2−HER3ヘテロ二量体(H23D)、HE
R3pY1289(H3pY1289)およびHER3−PI3キナーゼ(H3PI3K
)。両方の投薬レジメンにおいて、未処置のコントロールと比較して、HER2:HER
3二量体における顕著なPB4188媒介性の低減が、明らかになった。PB4188処
置した腫瘍とコントロールとの間で、総HER2、HER3またはリン酸化HER3にお
ける差異は観察されなかった。PB4188投薬の4時間後に分析した腫瘍は、未処置の
コントロールと比較して、HER3−p85(PI3K)における顕著な低減を示した。
PB4188が細胞周期の進行に影響を与える能力を、種々のタンパク質レベルのHE
R2を発現する癌細胞株において調査した。HER2+(MCF−7)、HER2+++
(JIMT−1、SK−BR−3およびN87細胞)細胞を、アッセイ培地(MCF−7
細胞については、RPMI−1640、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・ト
ランスフェリン、1mM ピルビン酸ナトリウム、MEM NEAA。JIMT−1につ
いては、DMEM、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン。S
K−BR−3細胞については、DMEM/F−12、2mM L−グルタミン、0.05
% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン。N87細胞については、RPM
I−1640、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トランスフェリン)中に播
種した。24ウェル・プレートの1ウェル当たり、300.000のMCF−7、または
400.000のN87または150.000のSK−BR−3または150.000の
JIMT−1または細胞を、1mlのアッセイ培地中に播種し、95%の相対湿度中で、
37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、PB4188またはペルツズマ
ブ+トラスツズマブまたはPG3178またはPG1337を、1ng/mlまたは10
0ng/mlの最終濃度のHRGの存在下で、細胞に添加した。95%の相対湿度中で、
37℃、5%CO2における24時間のインキュベーション(JIMT−1、N87また
はSK−BR−3細胞について)または48時間のインキュベーション(MCF−7細胞
について)の後、細胞に、回収する前に2時間にわたってEdU(10μM最終濃度)を
補充し、製造業者の指示に従ってClick−iT EdU AlexaFluor48
8キット(LifeTechnologies、カタログ番号C10425)を使用して
、EdU取込みについて染色した。FACSCantoでのフロー・サイトメトリーによ
って細胞を分析する少なくとも30分前に、細胞を、200nMのFxCycle遠赤色
色素(LifeTechnologies、カタログ番号F10348)および100μ
g/mlのRNAse A(LifeTechnologies、カタログ番号1209
1−039)と共にインキュベートした。事象を、AlexFluor488チャネル(
EdU検出について)およびAPCチャネル(FxCycle色素による総DNA染色に
ついて)において獲得した。データを、FSC幅対FSC高さ散布図上で単一細胞をゲー
ティングし、APC対AlexaFluor488散布図上でG0/G1、SおよびG2
M期の細胞周期をサブゲーティングすることによって、それぞれEdU陰性APC低、E
dU陽性およびEdU陰性APC高集団として、分析した。
率によって除算することによって計算した増殖指数として表す。図34は、PB4188
が、標準的(1ng/ml)または高い(100ng/ml)濃度のHRGによって誘導
された増殖を阻害することにおいて、PG3178またはペルツズマブ+トラスツズマブ
よりも一貫してより強力であることを示している。高濃度のHRGにおいても、PB41
88は、細胞周期の進行を阻害する。
抗体の内部移行パターンを、pH感受性色素を使用して測定した。これは、WO201
3134686 A1において当技術分野で記載されており、ここで、かかる色素は、抗
体とカップリングされた場合、より低いpHに曝露されたときに増加した蛍光シグナルを
示す。これは、色素カップリングした抗体が、標的細胞の表面から、穏やかに酸性のエン
ドソーム(pH6〜6.5)や酸性のリソソーム(5.5より低いpH)中に内部移行す
る場合に生じる。PB4188が癌細胞において内部移行するかどうかを調査するために
、抗体を、製造者の指示に従って、スクシンイミジル・エステル反応性基を有するpHセ
ンサー色素(Promega、カタログ番号CS1783A01)にカップリングさせた
。コンパレーターとして、抗HER2(トラスツズマブ、ペルツズマブ、PG3958)
、抗HER3(PG3178、#Ab6)および陰性コントロール(抗破傷風毒素、PG
1337)の色素標識された抗体を含めた。指数関数的に成長した培養物のHER2過剰
発現性SKBR−3およびN87癌細胞を回収し、1ng/mlのHRGを含む100μ
lのアッセイ培地(N87細胞については、RPMI−1640、0.05% BSA、
10μg/ml ホロ・トランスフェリン。SKBR−3細胞については、DMEM/F
−12、2mM L−グルタミン、0.05% BSA、10μg/ml ホロ・トラン
スフェリン)中で96ウェル・プレート上に播種し(1ウェル当たり15×103細胞)
、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、20
μlのpH感受性色素標識した抗体を添加して、100nMの最終濃度に到達させ、細胞
を、95%の相対湿度中で、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。次の日、非
接着性細胞を収集し、接着性細胞をトリプシン処理することによって、細胞を回収した。
FACS緩衝液(PBS 0.5% BSA 0.1% アジ化ナトリウム)で細胞を洗
浄した後、細胞を、APC標識した抗ヒトIgG(Jackson Immunores
earch、カタログ番号109−136−098、1:100希釈)で染色した。細胞
を、PEおよびAPCチャネルの中央値蛍光強度(MFI)を測定するFACSCant
o(BD Biosciences)でのフロー・サイトメトリーによって分析して、そ
れぞれ、抗体の内部移行および残留表面結合を決定した。図35に示されるデータは、P
B4188がトラスツズマブと同じ程度まで内部移行するが、組み合わせトラスツズマブ
+ペルツズマブは、増強された内部移行をもたらすことを示している。トラスツズマブ+
ペルツズマブの組み合わせは、トラスツズマブ単独と比較して、ADCCを低減する(図
36)。従って、PB4188内部移行のレベルは、ADCC強度に影響を与えないと理
解される。
抗HER3抗体MF3178のバリアントを、抗体特性を改善することを目的として設
計した。変異を、VH遺伝子フレームワーク領域1(FR1)、相補性決定領域1(CD
R1)、FR2、CDR2および/またはFR3中に導入したが、CDR3およびFR4
は改変しなかった。この設計は、翻訳後修飾(PTM)モチーフを除去するため(例えば
、脱アミド・モチーフNSをNQに変化させることによる)、表面疎水性を低減するため
(例えば、IをTに変化させることによる)または等電点を増加させるため(pI;例え
ば、QをKに変化させることによる)に導入された変異を含むが、それらに限定されない
。20全てのバリアント(図37を参照のこと)を、破傷風トキソイド(TT)アームと
組み合わせた二重特異性抗体として発現させ、MCF−7機能的アッセイにおいて試験し
たところ、20全てのバリアントが、この形式でMF3178抗体と類似の強度を有して
いた。20全てのバリアントを、MCF−7への結合について滴定でFACSにおいても
この形式で試験したところ、全てのバリアントが、非常に類似の結合プロファイルを有し
、これは、全てのバリアントの親和性が類似していることを示唆している。それぞれ、1
0、3および7つのアミノ酸変異を含む3つのリード・バリアントMF6058、MF6
061およびMF6065を、さらなる実験のために選択した(図16Eおよび図37の
配列を参照のこと)。対応する単一特異性IgG1 PG6058、PG6061および
PG6065を大規模で産生し、精製した。図38に示されるように、HRG依存的N8
7細胞株増殖アッセイにおける3つのバリアントの阻害活性は、PG3178のものと類
似である。3つのバリアントのCIEX−HPLCプロファイルは、図39に示されるよ
うに、電荷不均一性ならびにピーク幅および対称性に関して、PG3178のものと類似
であった。主要ピークの保持時間(tR)は、抗体のpIと大まかに相関した。即ち、p
Iが高いほど、より長い保持時間を生じた。二重特異性抗体または抗体の混合物の設計に
おいて、最適なtRを有する抗体バリアントを選択することは有用であるが、それは、C
IEXを使用した所望の抗体成分の精製が促進され得るからである。
体力価決定の日。表1:HER2に対する応答。表2:HER3に対する応答。使用した
細胞株が示される(MCF7、SKBR3、BT474)。異なるマウスを各列に示す。
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Claims (57)
- ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗原
結合部位を含む二重特異性抗体であって、
ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上の、ErbB−3のリガンド誘導性受容体
機能を低減できる、二重特異性抗体。 - 請求項1に記載の二重特異性抗体において、
前記抗体は、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減で
きる、二重特異性抗体。 - 請求項2に記載の二重特異性抗体において、
前記抗体が、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減で
き、該細胞が、細胞1つ当たり少なくとも100.000の細胞表面のErbB−2受容
体を有する、二重特異性抗体。 - 請求項1から3までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記細胞が、MCF−7細胞、SKBR−3細胞、NCI−N87細胞、BxPC−3
細胞、BT−474細胞またはJIMT−1細胞である、二重特異性抗体。 - 請求項1から4までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記第1の抗原結合部位が、ErbB−2のドメインIまたはドメインIVに結合する
、二重特異性抗体。 - 請求項1から5までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記第2の抗原結合部位が、ErbB−3へのErbB−3リガンドの結合を妨害する
、二重特異性抗体。 - ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗原
結合部位を含む二重特異性抗体であって、
前記第1の抗原結合部位が、ErbB−2のドメインIに結合し、前記第2の抗原結合
部位が、ErbB−3のドメインIIIに結合する、二重特異性抗体。 - ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗原
結合部位を含む二重特異性抗体であって、
ErbB−3陽性細胞に対する前記第2の抗原結合部位の親和性(KD)が、ErbB
−2陽性細胞に対する前記第1の抗原結合部位の親和性と等しいか、またはそれよりも高
い、二重特異性抗体。 - 請求項1から8までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
前記抗体は、ErbB−2およびErbB−3陽性細胞上のErbB−3のリガンド誘
導性受容体機能を低減できる、二重特異性抗体。 - 請求項1から9までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ErbB−2およびErbB−3陽性細胞のリガンド誘導性成長を低減できる、二重特
異性抗体。 - 請求項1から10までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ErbB−3陽性細胞に対する前記第2の抗原結合部位の親和性(KD)が、2.0n
M以下、好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下である、二重特
異性抗体。 - 請求項1から11までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ErbB−2陽性細胞に対する前記第1の抗原結合部位の親和性(KD)が、5.0n
M以下、好ましくは4.5nM以下、好ましくは4.0nM以下である、二重特異性抗体
。 - 請求項1から12までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
BT−474細胞に対する前記二重特異性抗体の親和性(KD)が、5.0nM以下、
好ましくは4.0nM以下、より好ましくは3.2nM以下であり、および/またはSK
−BR−3細胞に対する前記二重特異性抗体の親和性が、5.0nM以下、好ましくは3
.0nM以下、より好ましくは2.0nM以下である、二重特異性抗体。 - ErbB−2に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体であって、前記抗原結合部位の
うち少なくとも一方が、ErbB−2のドメインIに結合する、抗体。 - 請求項14に記載の二重特異性抗体において、
ErbB−2陽性細胞に対する前記抗原結合部位のうち少なくとも一方の親和性(KD
)が、5.0nM以下、好ましくは4.0nM以下、より好ましくは4.0nM以下であ
る、抗体。 - ErbB−3に結合する2つの抗原結合部位を含む抗体であって、前記抗原結合部位の
うち少なくとも一方が、ErbB−3のドメインIIIに結合する、抗体。 - 請求項16に記載の抗体において、
ErbB−3陽性細胞に対する前記抗原結合部位のうち少なくとも一方の親和性(KD
)が、2.0nM以下、好ましくは1.39nM以下、より好ましくは0.99nM以下
である、抗体。 - 請求項1から17までのいずれか一項に記載の抗体において、
前記ErbB−3陽性細胞および/または前記ErbB−2陽性細胞が、BT−474
細胞またはSK−BR−3細胞である、抗体。 - 請求項1から18までのいずれか一項に記載の抗体において、
T144、T164、R166、P172、G179、S180およびR181、なら
びにT144、T164、R166、P172、G179、S180またはR181から
約5アミノ酸位置以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択され
る、ErbB−2のドメインIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含
む、抗体。 - 請求項1から19までのいずれか一項に記載の抗体において、
R426およびネイティブErbB−3タンパク質中のR426から11.2オングス
トローム以内に位置する、表面に露出したアミノ酸残基からなる群から選択される、Er
bB−3のドメインIIIの少なくとも1つのアミノ酸に結合する抗原結合部位を含む、
抗体。 - 請求項1から20までのいずれか一項に記載の抗体において、
図16Aまたは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849、MF
2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、
MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF300
1、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB−2特異的重鎖
可変領域のCDR3配列を少なくとも含む、抗体。 - 請求項1から21のいずれか一項に記載の抗体において、
図16Bまたは図16Eまたは図37に示されるMF3178、MF3176、MF3
163、MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057、M
F6058、MF6059、MF6060、MF6061、MF6062、MF6063
、MF6064、MF6065、MF6066、MF6067、MF6068、MF60
69、MF6070、MF6071、MF6072、MF6073およびMF6074か
らなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域のCDR3配列を少なくとも含
む、抗体。 - 請求項1から22までのいずれか一項に記載の抗体において、
図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849、M
F2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916
、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF30
01、MF3003およびMF1898からなる群から選択されるErbB−2特異的重
鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3配列を少なくとも含む、またはMF29
26、MF2930、MF1849、MF2973、MF3004、MF3958、MF
2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、
MF2913、MF1847、MF3001、MF3003もしくはMF1898のCD
R1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3アミノ酸、好ましくは多くて2アミノ酸
、好ましくは多くて1アミノ酸が異なるCDR配列を含む、抗体。 - 請求項1から23までのいずれか一項に記載の抗体において、
図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178、MF3176、M
F3163、MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057
、MF6058、MF6059、MF6060、MF6061、MF6062、MF60
63、MF6064、MF6065、MF6066、MF6067、MF6068、MF
6069、MF6070、MF6071、MF6072、MF6073およびMF607
4からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域のCDR1、CDR2およ
びCDR3配列を少なくとも含む、またはMF3178、MF3176、MF3163、
MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057、MF605
8、MF6059、MF6060、MF6061、MF6062、MF6063、MF6
064、MF6065、MF6066、MF6067、MF6068、MF6069、M
F6070、MF6071、MF6072、MF6073もしくはMF6074のCDR
1、CDR2およびCDR3配列と、多くて3アミノ酸、好ましくは多くて2アミノ酸、
好ましくは多くて1アミノ酸が異なるCDR配列を含む、抗体。 - 請求項1から24のいずれか一項に記載の抗体において、
図16Aもしくは図16Eに示されるMF2926、MF2930、MF1849、M
F2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916
、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF30
01、MF3003およびMF1898の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるE
rbB−2特異的重鎖可変領域配列を含む、またはMF2926、MF2930、MF1
849、MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、M
F2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847
、MF3001、MF3003もしくはMF1898の重鎖可変領域配列と多くて15ア
ミノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む、抗体。 - 請求項1から25までのいずれか一項に記載の抗体において、
図16Bもしくは図16Eもしくは図37に示されるMF3178、MF3176、M
F3163、MF3099、MF3307、MF6055、MF6056、MF6057
、MF6058、MF6059、MF6060、MF6061、MF6062、MF60
63、MF6064、MF6065、MF6066、MF6067、MF6068、MF
6069、MF6070、MF6071、MF6072、MF6073およびMF607
4の重鎖可変領域配列からなる群から選択されるErbB−3特異的重鎖可変領域配列を
含む、またはMF3178、MF3176、MF3163、MF3099、MF3307
、MF6055、MF6056、MF6057、MF6058、MF6059、MF60
60、MF6061、MF6062、MF6063、MF6064、MF6065、MF
6066、MF6067、MF6068、MF6069、MF6070、MF6071、
MF6072、MF6073もしくはMF6074の重鎖可変領域配列と多くて15アミ
ノ酸が異なる重鎖可変領域配列を含む、抗体。 - 請求項1から26までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)を示す、二重特異性抗体。 - 請求項1から27までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ADCCを増強するために非フコシル化されている、二重特異性抗体。 - 請求項1から28までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
ヒトまたはヒト化抗体である、二重特異性抗体。 - 請求項1から29までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
適合的なヘテロ二量体化ドメインを有する2つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む、二
重特異性抗体。 - 請求項30に記載の二重特異性抗体において、
前記適合的なヘテロ二量体化ドメインが、適合的な免疫グロブリン重鎖CH3ヘテロ二
量体化ドメインである、二重特異性抗体。 - 請求項1から31までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
両方のアームが共通の軽鎖を含む、二重特異性抗体。 - 請求項32に記載の二重特異性抗体において、
前記共通の軽鎖が、生殖系列軽鎖、好ましくは、IgVKl−39遺伝子セグメントを
含む再編成された生殖系列ヒト・カッパ軽鎖、最も好ましくは、再編成された生殖系列ヒ
ト・カッパ軽鎖IgVKl−39*01/IGJKl*01である、二重特異性抗体。 - 請求項1から33までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体において、
標識、好ましくは、in vivo画像化のための標識をさらに含む、二重特異性抗体
。 - 請求項1から34までのいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
- ErbB−2、ErbB−3もしくはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、
または前記腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、
請求項1から35までのいずれか一項に記載の抗体または医薬組成物を対象に投与する
ことを含む方法。 - 請求項1から34までのいずれか一項に記載の抗体において、
ErbB−2、ErbB−3もしくはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、
または有するリスクがある対象の処置における使用のための抗体。 - 請求項37に記載の、使用のための抗体において、
前記二重特異性抗体は、心筋細胞の生存に顕著に影響を与えない、使用のための抗体。 - 請求項37または38に記載の、使用のための抗体において、
前記二重特異性抗体は、健康な心機能と比較して90%未満の心機能を有する対象への
使用のための抗体。 - ErbB−2、ErbB−3もしくはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、
または前記腫瘍を有するリスクがある対象の処置のための方法であって、
− ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2
の抗原結合部位を含む二重特異性抗体、ならびに
− PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊
薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択される1または複数の化合物、好ましくは
、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、Sr
c阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される1または複数
の化合物、を対象に投与することを含む方法。 - ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍の処置におけ
る使用のための、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合
する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
前記処置が、ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍
を有する対象に、前記二重特異性抗体、ならびに、PI3キナーゼ経路の成分の阻害剤、
MAPK経路の成分の阻害剤、微小管破壊薬物およびHDAC阻害剤からなる群から選択
される少なくとも1つの化合物を投与すること、好ましくは、前記二重特異性抗体、なら
びに、チロシン・キナーゼ阻害剤、PI3Ka阻害剤、Akt阻害剤、mTOR阻害剤、
Src阻害剤、ボリノスタットおよびパクリタキセルからなる群から選択される少なくと
も1つの化合物を投与することを含む、二重特異性抗体。 - 請求項40または41に記載の使用のための方法または抗体において、
前記チロシン・キナーゼ阻害剤は、アファチニブ、ラパチニブおよび/またはネラチニ
ブを含む、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から42までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記PI3K阻害剤がBYL719である、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から43までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記Akt阻害剤はMK−2206である、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から44までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記mTOR阻害剤がエベロリムスである、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から45までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記Src阻害剤はサラカチニブである、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から46までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記微小管標的化薬物はパクリタキセルである、使用のための方法または抗体。 - 請求項40から47までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記HDAC阻害剤がボリノスタットである、使用のための方法または抗体。 - ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する対象
において転移の形成に対抗するための方法であって、
前記ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍細胞は、
BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは
少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%
、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現レベルを有し、
ErbB−2に結合する第1の抗原結合部位およびErbB−3に結合する第2の抗原
結合部位を含む二重特異性抗体を対象に投与することを含む方法。 - ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍細胞の転移の
形成の処置または予防における使用のための、ErbB−2に結合する第1の抗原結合部
位およびErbB−3に結合する第2の抗原結合部位を含む二重特異性抗体であって、
前記ErbB−2、ErbB−3またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍細胞が、
BXPC3またはMCF7細胞のヘレグリン発現レベルの少なくとも60%、好ましくは
少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%
、より好ましくは少なくとも90%または95%であるヘレグリン発現レベルを有する、
二重特異性抗体。 - 請求項36から50までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記対象が、細胞1つ当たり1.000.000未満の細胞表面にあるErbB−2受
容体を有するErbB−2またはErbB−2/ErbB−3陽性腫瘍を有する、使用の
ための方法または抗体。 - 請求項36から51までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記抗体は、請求項1から34までのいずれか一項に記載の抗体である、使用のための
方法または抗体。 - 請求項36から52までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記腫瘍細胞が、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、胃食道癌、食道癌、子宮内膜癌、卵巣
癌、肝臓癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、明細胞肉腫、唾液腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、膀胱
癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌または黒色腫の細胞である、使用のための方法ま
たは抗体。 - 請求項36から53までのいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体において
、
前記対象が、健康な心機能と比較して90%未満の心機能を有する、使用のための方法
または抗体。 - 請求項39または54に記載の使用のための方法または抗体において、
前記心機能が、左室駆出分画(LVEF)を含む、使用のための方法または抗体。 - 請求項39、54または55のいずれか一項に記載の使用のための方法または抗体にお
いて、
前記対象は、うっ血性心不全(CHF)、左室機能不全(LVD)および/もしくは1
0%以上減少した左室駆出分画(LVEF)に罹患している、ならびに/または前記対象
は、心筋梗塞を有している、使用のための方法または抗体。 - Akt、ERKおよび/またはS6リボソーム・タンパク質のリン酸化に対抗する、好
ましくは阻害する、請求項1〜34のいずれか一項に記載の抗体の使用。
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