ES2758433T3 - Anticuerpos contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3) - Google Patents

Anticuerpos contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3) Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a un receptor HER3, de modo que el anticuerpo o el fragmento del mismo se une a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando, para utilizar en el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos contra el receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico (HER3)
Campo de la invención
Esta invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de los mismos que interactúan con el receptor HER3 de modo que los anticuerpos o fragmentos de los mismos reconocen un epítopo conformacional del receptor HER3 que comprende residuos tanto del dominio 2 como del 4 lo que produce la inhibición de la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando, para utilizar en el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata.
Antecedentes de la invención
El receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico humano (ErbB3, también conocido como HER3) es un receptor proteína tirosina cinasa y pertenece a la subfamilia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de los receptores proteínas tirosina cinasas, que también incluye EGFR (HER1, ErbB1), HER2 (ErbB2, Neu) y HER4 (ErbB4) (Plowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4905-4909; Kraus et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
86:9193-9197; y Kraus et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:2900-2904). Al igual que el receptor del factor de crecimiento epidérmico prototípico, el receptor transmembrana HER3 consta de un dominio extracelular de unión al ligando (ECD), un dominio de dimerización dentro del ECD, un dominio transmembrana, un dominio intracelular similar a la proteína tirosina cinasa (TKD) y un dominio de fosforilación C-terminal. A diferencia de los otros miembros de la familia HER, el dominio cinasa de HER3 muestra una actividad cinasa intrínseca muy baja.
Los ligandos neuregulina 1 (NRG) o neuregulina 2 se unen al dominio extracelular de HER3 y activan la vía de señalización mediada por el receptor promoviendo la dimerización con otras parejas de dimerización tales como HER2. La heterodimerización da como resultado la activación y la transfosforilación del dominio intracelular de HER3 y es un medio no solo para la diversificación de señales sino también para la amplificación de señales. Además, la heterodimerización de HER3 también puede ocurrir en ausencia de ligandos activadores y esto se denomina comúnmente activación de HER3 independiente de ligando. Por ejemplo, cuando HER2 se expresa a niveles altos como resultado de la amplificación génica (por ejemplo, en cáncer de mama, pulmón,
ovario o gástrico) se pueden formar dímeros espontáneos de HER2/HER3. En esta situación, el dímero de HER2/HER3 se considera el dímero de señalización ErbB más activo y, por lo tanto, es altamente transformador.
Se ha encontrado un aumento de HER3 en varios tipos de cáncer tales como cáncer de mama, pulmón, gastrointestinal y pancreático. Curiosamente, se ha demostrado una correlación entre la expresión de HER2/HER3 y el empeoramiento desde una etapa no invasiva a una invasiva (Alimandi et al., (1995) Oncogene 10:1813-1821; DeFazio et al., (2000) Cancer 87:487-498; Naidu et al., (1988) Br. J. Cancer 78:1385-1390). Por consiguiente, se necesitan agentes que interfieran con la señalización mediada por HER3.
Se ha demostrado una expresión mínima de Her3 en pacientes con hiperplasia benigna de próstata (KOUMAKPAYI ISMAEL HERVE ET AL., (2006) CLINICAL CANCER RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, vol. 12, N29, páginas 2730-2737).
Se ha sugerido la terapia de hiperplasia benigna de próstata (LEPOR HERBERT, (2007) REVIEWS IN UROLOGY FALL 2007, vol. 9, N24, páginas 181-190).
La relación entre la multiplicación celular desde una próstata saludable a hiperplasia benigna de próstata se trató en ROEHRBORN CG, (2002) INTERNATIONAL JOURNAL OF IMPOTENCE RESEARCH DEC 2008, vol. 20 Suppl 3, páginas S11 -S18, y PLATZ ELIZABETH A ET AL., (2002) UROLOGY JUN 2002, vol. 59, N26, páginas 877-883.
Resumen de la divulgación
La divulgación se basa en el descubrimiento de proteínas de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos) que se unen a un epítopo conformacional del receptor HER3 que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 de HER3. Esta unión de los anticuerpos o fragmentos de los mismos con el dominio 2 y el dominio 4 estabiliza al receptor HER3 en una conformación inactiva o cerrada de modo que se inhibe la activación de HER3. Sorprendentemente, la unión de los anticuerpos o fragmentos de los mismos con este epítopo conformacional bloquea las vías de señalización de HER3 tanto dependiente de ligando (por ejemplo, neuregulina) como independiente de ligando. Además, la inhibición mediada por anticuerpo de la señalización inducida por el ligando se produce sin bloquear la unión del ligando (es decir, tanto el ligando como el anticuerpo se pueden unir a HER3) presumiblemente porque HER3 no puede sufrir los reordenamientos conformacionales necesarios para la activación. También se dan a conocer métodos para usar los anticuerpos o fragmentos de los mismos para tratar una serie de enfermedades o trastornos caracterizados por una mayor expresión de HER3; y enfermedades o trastornos caracterizados por la capacidad de los anticuerpos o fragmentos de los mismos para disminuir el peso del tejido (p. ej., los pesos de la próstata o el útero) o para inducir atrofia del tejido (p. ej., atrofia de la mama masculina).
En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a un receptor HER3, de modo que el anticuerpo o el fragmento del mismo se une a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando, para utilizar en el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata.
En una realización, el anticuerpo o el fragmento del mismo se administra por una vía elegida entre el grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intraparenquimatosa, intratecal, intracraneal, bucal, mucósica, nasal y rectal. En una realización, el anticuerpo o el fragmento del mismo se formula en una composición farmacéutica que contiene un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. En otra realización, la composición farmacéutica contiene un agente terapéutico adicional. En una realización, el agente terapéutico adicional se elige del grupo que consiste en un inhibidor de HER1, un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3. En una realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 elegido del grupo que consiste en Matuzumab (EMD72000), Erbitux®/Cetuximab, Vectibix®/Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® /Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb®/Ditosilato de Lapatinib, Tarceva®/Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 elegido del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-111, neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib/Tykerb®; un inhibidor de HER3 elegido del grupo que consiste en, MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203(Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis) y moléculas pequeñas que inhiben a HER3; y un inhibidor de HER4. En una realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR elegido del grupo que consiste en Temsirolimus/Torisel®, ridaforolimus/Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus/Affinitor®. En una realización, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la cinasa PI3 elegido del grupo que consiste en GDC 0941, BEZ235, BMK120 y BYL719.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Curvas SET (titulación en equilibrio en la solución) representativas de MOR10701 obtenidas con HER3 humano, de ratón, rata y cinomólogo
Figura 2: Determinación de unión de células SK-Br-3 por titulación FACS
Figura 3: ELISA de la unión del dominio HER3
Figura 4: Mapeo del epítopo de intercambio de hidrógeno deuterio. A) Los péptidos de ECD de HER3 recuperados después del análisis HDX-MS se indican con líneas discontinuas. Se resaltan los posibles sitios de glicosilación unidos a N. B) El grado relativo de deuteración observado en péptidos identificados por MS. C) Residuos protegidos mapeados en la estructura cristalina de HER3 publicada.
Figura 5: A) Representación superficial de las estructuras cristalinas de rayos X de HER3/MOR09823 y HER3/MOR09825. HER3 (en gris más claro) está en la conformación cerrada, y MOR09823 o MOR09825 (en gris más oscuro) se unen a ambos dominios 2 y 4 B). Vista superficial de HER3 de la estructura HER3/MOR09823 que se muestra en una orientación similar a (A). MOR09823 se omitió por claridad. C) Estructura HER3/MOR09823 ilustrada como una estructura de cinta, vista en una rotación de 90° de los paneles (A), (B) y (D). D) Una representación de cinta de la conformación inactiva de HER3 reconocida por Fab de MOR09823 con una vista cercana de la interfase de dominio 2/dominio 4, resaltando los residuos de HER3 que están dentro de 5 Á de distancia de Fab. E) Determinación de la unión de HER3/MOR10703 mutante mediante titulación ELISA.
Figura 6: Inhibición de la fosforilación de HER3 inducida por ligando (A) o independiente de ligando (B). Figura 7: Inhibición de las vías de señalización posteriores dependientes de HER3 en líneas celulares amplificadas por HER2.
Figura 8: El impacto de la inhibición de HER3 sobre la multiplicación celular en A) células BT-474 y B) células MCF7 estimuladas con neuregulina.
Figura 9: El efecto de MOR09823 y MOR09825 sobre la unión de neuregulina a las células MCF7.
Figura 10: Impacto de la unión de MOR09823 sobre la formación del complejo HER3/neuregulina según lo evaluado por Biacore™. Sin anticuerpos (barras negras), MOR09823 (barras blancas), 105.5 (gris) e IgG de control (barras rayadas).
Figura 11: Inhibición mediada por MOR09823 in vivo de la señalización de HER3 (A) independiente de ligando (BT-474) y (B) dependiente de ligando (BxPC3).
Figura 12: El impacto de MOR10701 y MOR10703 sobre el crecimiento del tumor BT-474.
Figura 13: El impacto de MOR10701 y MOR10703 sobre el crecimiento del tumor BxPC3.
Figura 14: Isobologramas de MOR10703 de combinación de fármacos in vitro (A) MOR09823/trastuzumab, (B) MOR09823/lapatinib, (C) MOR10703/BEZ235, (D) MOR10703/BKM120, (E) MOR10703/BYL719, (F) MOR10703/RAD001, (G) MOR10703/cetuximab y (H) MOR10703/erlotinib.
Figura 15: Combinaciones in vivo de MOR10701 o MOR10703 con (A) trastuzumab y (B) erlotinib en BT-474 y L3.3.
Figura 16: MOR10703 solo o combinaciones in vitrode MOR10703 con (A) cetuximab y (B) BYL719 en células esofágicas
Figura 17: MOR10703 solo o combinaciones in vivo de MOR10703 con (A) cetuximab y (B) BYL719 en modelos tumorales esofágicos KYSE140 y KYSE180.
Figura 18: MOR10703 solo o combinaciones in vivo de MOR10703 con (A) cetuximab y (B) BYL719 en modelos de tumor esofágico CHE007, y (C) MOR10703 solo o combinaciones in vivo MOR10703 con cetuximab en modelo de tumor esofágico CHES015.
Figura 19: MOR10703 solo o combinaciones in vivo de MOR10703 con BYL719 en modelo de tumor gástrico N87 que muestra una regresión tumoral prolongada.
Figura 20: MOR10703 solo o combinaciones in vivo de MOR10703 con cetuximab en el modelo de SCCHN A253, el tratamiento con MOR10703 o cetuximab como agente único dio como resultado la estasis tumoral. La combinación de MOR10703 con cetuximab dio como resultado la regresión tumoral
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Para que la presente invención pueda ser fácilmente entendida, primero se definen ciertos términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
La frase "transducción de señales" o "actividad de señalización", según se usa en este documento, se refiere a una relación causal bioquímica generalmente iniciada por una interacción proteína-proteína tal como la unión de un factor de crecimiento a un receptor, dando como resultado la transmisión de una señal desde una porción de una célula a otra porción de una célula. Para HER3, la transmisión implica la fosforilación específica de uno o más residuos de tirosina, serina o treonina en una o más proteínas de la serie de reacciones que causan la transducción de señales. Los penúltimos procesos incluyen generalmente eventos nucleares, lo que resulta en un cambio en la expresión génica. Un "receptor HER" es un receptor proteína tirosina cinasa que pertenece a la familia de receptores HER e incluye receptores EGFR, HER2, HER3 y HER4 y otros miembros de esta familia que se identificarán en el futuro. El receptor HER comprenderá generalmente un dominio extracelular, que puede unirse a un ligando de HER; un dominio transmembrana lipófilo; un dominio tirosina cinasa intracelular conservado; y un dominio de señalización carboxilo terminal que alberga varios residuos de tirosina que se pueden fosforilar. Preferentemente, el receptor HER es el receptor HER humano de secuencia nativa.
Las expresiones "HER1", "ErbB1", "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" se usan indistintamente en este documento y se refieren a EGFR como se describe, por ejemplo, en Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem.
56:881-914 (1987), incluidas sus formas mutantes de origen natural (por ejemplo, un EGFR mutante por deleción como en Humphrey et al., (1990) PNAS (USA) 87:4207-4211). erbB1 se refiere al gen que codifica el producto proteína EGFR.
Los términos "HER2" y "ErbB2" se usan indistintamente en este documento y se refieren a la proteína HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba et al., (1985) PNAS (USA) 82:6497-6501 y Yamamoto et al.(1986) Nature 319:230-234 (número de acceso Genebank X03363). El término "erbB2" se refiere al gen que codifica ErbB2 humano y "neu" se refiere al gen que codifica p185neu de rata.
Los términos "HER4" y "ErbB4" en este documento, se refieren al polipéptido receptor según se da a conocer, por ejemplo, en la solicitud de patente europea N° 599,274; Plowman et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750; y Plowman et al., (1993) Nature, 366:473-475, incluidas sus isoformas, por ejemplo, según se da a conocer en el documento WO99/19488, publicado el 22 de abril de 1999.
Las expresiones "HER3" o "receptor HER3" también conocido como "ErbB3" según se usan en este documento, se refieren a la proteína HER3 de mamífero y "her3" o "erbB3" se refieren al gen her3 de mamífero. La proteína HER3 preferida es la proteína HER3 humana presente en la membrana celular de una célula. El gen her3 humano se describe en la patente de Estados Unidos 5,480,968 y Plowman et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909. HER3 humano según se define en el N° de acceso NP_001973 (humano), y se representa a continuación como SEQ ID NO: 1. Toda la nomenclatura es para HER3 inmaduro de longitud completa (aminoácidos 1-1342). El HER3 inmaduro se escinde entre las posiciones 19 y 20, dando como resultado la proteína HER3 madura (aminoácidos 20­ 1342).
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La expresión "ligando de HER" según se usa en este documento se refiere a polipéptidos que se unen a y activan los receptores HER tales como HER1, HER2, HER3 y HER4. Los ejemplos de ligandos de HER incluyen, pero no exclusivamente, la neuregulina 1 (NRG), neuregulina 2, neuregulina 3, neuregulina 4, la betacelulina, el factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, la epiregulina, el factor de crecimiento epidérmico, la anfiregulina y el factor de crecimiento transformante alfa. La expresión incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de un polipéptido de origen natural.
La expresión "ligando de HER3" según se usa en este documento se refiere a polipéptidos que se unen y activan a HER3. Los ejemplos de ligandos de HER3 incluyen, pero no exclusivamente, la neuregulina 1 (NRG) y neuregulina 2, la betacelulina, el factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina y la epiregulina. La expresión incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de un polipéptido de origen natural.
El "complejo de proteínas HER-HER" es un oligómero, asociado de forma no covalente, que contiene un correceptor HER en cualquier combinación (por ejemplo, HER1-HER2, HER1-HER3, HER1-HER4, HER2-HER3, HER3-HER4 y similares). Este complejo se puede formar cuando una célula que expresa ambos receptores está expuesta a un ligando de HER, por ejemplo, NRG, o cuando un receptor HER está activo o se sobreexpresa.
El "complejo de proteínas HER2-HER3" es un oligómero asociado no covalentemente que contiene el receptor HER2 y el receptor HER3. Este complejo se puede formar cuando una célula que expresa ambos receptores está expuesta a un ligando de HER3, por ejemplo, NRG o cuando HER2 está activo o se sobreexpresa.
La frase "actividad de HER3" o "activación de HER3", según se usa en este documento, se refiere a un aumento en la oligomerización (por ejemplo, un aumento en los complejos que contienen HER3), en la fosforilación de HER3, en los reordenamientos conformacionales (por ejemplo, los inducidos por ligandos) y en las sucesivas etapas de la señalización mediada por HER3.
Los términos "estabilización" o "estabilizado" utilizados en el contexto de HER3 se refieren a un anticuerpo o un fragmento del mismo que mantiene directamente (bloquea, ata, sujeta, une preferentemente, favorece) el estado inactivo o la conformación de HER3 sin bloquear la unión del ligando a HER3, de modo que la unión del ligando ya no puede activar a HER3. Los ensayos descritos en los ejemplos se pueden usar para medir la unión del ligando a un receptor HER3 estabilizado, por ejemplo, un ensayo Biacore.
La expresión "señalización dependiente de ligando" según se usa en este documento se refiere a la activación de HER (por ejemplo, HER3) a través de un ligando. La activación de HER3 se evidencia por el aumento de la oligomerización (por ejemplo, heterodimerización) y/o de la fosforilación de HER3 de modo que se activan las sucesivas etapas de las vías de señalización (por ejemplo, PI3K). El anticuerpo o fragmento del mismo puede reducir de manera estadísticamente significativa la cantidad de HER3 fosforilado en una célula estimulada, expuesta a la proteína de unión al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo), en relación con una célula sin tratar (control), según se mide utilizando los ensayos descritos en los ejemplos. La célula que expresa HER3 puede ser una línea celular de origen natural (por ejemplo, MCF7) o puede producirse por recombinación genética mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifican la proteína HER3 en una célula hospedadora. La estimulación celular se puede producir mediante la adición exógena de un ligando de activación de HER3 o mediante la expresión endógena de un ligando de activación.
El anticuerpo o fragmento del mismo que "reduce la activación de HER3 inducida por neregulina en una célula" es uno que reduce de manera estadísticamente significativa la fosforilación de tirosina de HER3 en relación con una célula sin tratar (control), según se mide utilizando los ensayos descritos en los ejemplos. Esto se puede determinar basándose en los niveles de fosfotirosina de HER3 después de la exposición de HER3 a NRG y al anticuerpo de interés. La célula que expresa la proteína HER3 puede ser una célula o línea celular de origen natural (por ejemplo, MCF7) o se puede producir por recombinación genética.
La expresión "señalización independiente de ligando" según se usa en este documento se refiere a la actividad celular de HER3 (por ejemplo, fosforilación) en ausencia de un requisito para la unión del ligando. Por ejemplo, la activación de HER3 independiente de ligando puede ser el resultado de la sobreexpresión de HER2 o de mutaciones activadoras en las parejas de heterodímeros de HER3 como EGFR y HER2. El anticuerpo o fragmento del mismo puede reducir de manera estadísticamente significativa la cantidad de HER3 fosforilado en una célula expuesta a la proteína de unión al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo), en relación con una célula sin tratar (control). La célula que expresa HER3 puede ser una línea celular de origen natural (por ejemplo, SK-Br-3) o puede producirse por recombinación genética mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifican la proteína HER3 en una célula hospedadora.
El término "bloquea", según se usa en este documento, se refiere a detener o evitar una interacción o un proceso, por ejemplo, detener la señalización dependiente o independiente de ligando.
El término "reconoce" según se usa en este documento se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo que encuentra a, e interactúa con (por ejemplo, se une), su epítopo conformacional.
La frase "se une concurrentemente" según se usa en este documento se refiere a un ligando de HER que se puede unir a un sitio de unión al ligando del receptor HER junto con el anticuerpo contra HER. Esto significa que tanto el ligando como el anticuerpo se pueden unir juntos al receptor HER. Solo a modo de ilustración, el ligando de HER3 NRG se puede unir al receptor HER3 junto con el anticuerpo contra HER3. El ensayo para medir la unión concurrente del ligando y el anticuerpo se describe en la sección de Ejemplos (por ejemplo, Biacore).
La expresión "fracaso en", según se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo que no realiza un hecho particular. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que "fracasa en activar la transducción de señales" es uno que no desencadena la transducción de señales; un anticuerpo o fragmento del mismo que "fracasa en inducir un cambio conformacional" es uno que no causa una alteración estructural en el receptor HER; un anticuerpo o fragmento del mismo que estabiliza el receptor HER en un estado inactivo tal que el receptor HER "fracasa en dimerizarse" es uno que no forma complejos proteína-proteína.
El término "anticuerpo" según se usa en este documento se refiere a anticuerpos enteros que interactúan con (por ejemplo, por unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) un epítopo de HER3 e inhiben la transducción de señales. Un "anticuerpo" de origen natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (abreviada aquí como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones Vh y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino-terminal al extremo carboxiterminal en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huéped, que incluyen varias células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelisados, anticuerpos quiméricos, Fv monocatenario (scFv), Fv unidos por disulfuro (sdFv), fragmentos Fab, fragmentos F (ab') y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de la divulgación) y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), y cualquier clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
Tanto la cadena ligera como la pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan funcionalmente. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de cadena ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales al sitio de unión al antígeno o al extremo amino-terminal del anticuerpo. El extremo N-terminal es una región variable y el extremo C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL en realidad comprenden el extremo carboxi-terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.
La frase "fragmento de anticuerpo", según se usa en este documento, se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que consesrvan la capacidad de interactuar específicamente (por ejemplo, mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) con un epítopo de HER3 e inhiben la transducción de señales. Los ejemplos de fragmentos de unión incluyen, pero no exclusivamente, un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y una región determinante de complementariedad (CDR) aislada.
Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes diferentes, se pueden juntar por métodos de recombinación, mediante un conector sintético que les permita ser preparados como una proteína monocatenaria en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Dichos anticuerpos monocatenarios también pretenden estar comprendidos por la expresión "fragmento de anticuerpo". Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se seleccionan en función de su utilidad de la misma manera que para los anticuerpos intactos.
Los fragmentos de anticuerpos también se pueden incorporar en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136). Los fragmentos de anticuerpos se pueden injertar en andamios basados en polipéptidos como la fibronectina tipo III (Fn3) (véase la patente de Estados Unidos N° 6,703,199, que describe monocuerpos del polipéptido fibronectina).
Los fragmentos de anticuerpos se pueden incorporar en moléculas de una sola cadena que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) los cuales, junto con polipéptidos complementarios de la cadena ligera, forman un par de regiones de unión al antígeno (Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; y la patente de Estados Unidos N° 5,641,870).
El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o de lo contrario interactuar con una molécula. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos o carbohidratos o cadenas laterales de azúcares y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional".
La expresión "epítopo lineal" se refiere a un epítopo en que todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula con la que interactúa (como un anticuerpo) se producen linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína (continua). Una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítopo, por ejemplo, usando las técnicas descritas en la presente divulgación. Alternativamente, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede dilucidar información sobre epítopos deseables. A partir de esta información, es posible después cribar competitivamente anticuerpos que se unan al mismo epítopo. Un método para lograr esto es realizar estudios de competencia cruzada para encontrar anticuerpos que se unan de manera competitiva entre sí, por ejemplo, los anticuerpos compiten por unirse al antígeno. Un proceso de alto rendimiento para "binning" (caracterización y clasificación) de anticuerpos basado en su competencia cruzada se describe en la publicación de patente internacional N° WO 2003/48731. Como apreciará un experto en la materia, prácticamente cualquier cosa a la que un anticuerpo pueda unirse específicamente podría ser un epítopo. Un epítopo puede comprender aquellos residuos a los que se une el anticuerpo.
La expresión "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo en el que los aminoácidos discontinuos se unen en una conformación tridimensional. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se producen a través de los residuos de aminoácidos de la proteína que están separados entre sí. En una realización, el epítopo es el descrito en los Ejemplos de esta memoria. En una realización, el epítopo conformacional se define por (i) los residuos de aminoácidos de HER3265-277 y 315 (del dominio 2) y (ii) los residuos de aminoácidos de h Er 3571, 582-584, 596­ 597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de SEQ ID NO: 1, o un subconjunto de los mismos. Como apreciará un experto en la materia, el espacio que está ocupado por un residuo o cadena lateral que crea la forma de una molécula ayuda a determinar qué es un epítopo.
Generalmente, los anticuerpos específicos para un antígeno diana particular reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo se pueden identificar usando cualquier cantidad de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en el área. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocolos en Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopos lineales se pueden determinar, por ej., sintetizando concurrentemente grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos que corresponden a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos aún están unidos a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en el área y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 4,708,871; Geysen etal., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. Análogamente, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos, por ejemplo, mediante intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de las proteínas también se pueden identificar usando gráficos estándar de antigenicidad e hidropatía, como los calculados usando, por ejemplo, el programa de software Omiga versión 1.0 disponible de Oxford Molecular Group. Este programa de computadora emplea el método Hopp/Woods, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828; para determinar los perfiles de antigenicidad y la técnica Kyte-Doolittle, Kyte et al., (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132; para gráficos de hidropatía.
El término "parátopo", según se usa en este documento, se refiere a la estructura general de una región de unión que determina la unión a un epítopo. Esta estructura influye en si una región de unión podría unirse, o no, a un epítopoo y de qué manera lo haría. Parátopo se puede referir a un sitio antigénico de un anticuerpo que es responsable de que un anticuerpo o fragmento del mismo, se una a un determinante antigénico. Parátopo también se refiere al idiotopo del anticuerpo y la zona de la región determinante de complementariedad (CDR) que se une al epítopo. En una realización, el parátopo es la región del anticuerpo que se une al epítopo conformacional que comprende (i) los residuos de aminoácidos de HER3 265-277 y 315 (del dominio 2), y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3 571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de SEQ ID NO: 1, o un subconjunto de los mismos. En una realización, el parátopo es la región del anticuerpo que comprende las secuencias de CDR. En una realización, el parátopo comprende las secuencias listadas en la tabla 1. En una realización, el parátopo comprende al menos un residuo de aminoácido que se une con los residuos de HER3: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. En una realización, el parátopo comprende al menos un residuo de aminoácido que se une con los residuos de HER3: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. Como apreciará un experto en la materia, el parátopo de cualquier anticuerpo, o variante del mismo, se puede determinar de la manera establecida por la presente solicitud.
Las frases "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" según se usan en este documento se refieren a polipéptidos, que incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, etc. que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica o se derivan de la misma fuente genética. Esta expresión también incluye preparaciones de moléculas de anticuerpos de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal tiene una especificidad y afinidad de unión únicas por un epítopo particular.
La frase "anticuerpo humano", según se usa en este documento, incluye anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como CDR se derivan de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de dichas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana o un anticuerpo que contiene secuencias marco de consenso derivadas del análisis de secuencias marco humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296: 57-86). Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina, por ejemplo, las CDR, se pueden definir utilizando esquemas de numeración bien conocidos, por ejemplo, el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia o una combinación de Kabat y Chothia (véanse, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Publicación NIH N° 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; y Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948.
Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o por mutación somática in vivo, o una sustitución conservadora para promover la estabilidad o la fabricación).
La frase "anticuerpo monoclonal humano", según se usa en este documento, se refiere a anticuerpos que tienen una especificidad de unión única, que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como CDR se derivan de secuencias humanas. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.
La frase "anticuerpo humano recombinante", según se usa en este documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios de recombinación genética, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulinas humanas o un hibridoma preparado a partir de ellos, anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma, anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante, combinatoria de anticuerpos humanos, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique empalmar todo o una parte de secuencias de un gen de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas realizaciones, dichos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, a mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien se derivan de, y están relacionadas con, las secuencias Vh y V l de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
La unión específica entre dos entidades significa una unión con una constante de equilibrio (Ka ) (kon/koff) de al menos 102 M-1, al menos 5 x 102 M-1, al menos 103 M-1, al menos 5 x 103 M-1, al menos 104 M-1 al menos 5 x 104 M-1, al menos 105 M-1, al menos 5 x 105 M-1, al menos 106 M-1, al menos 5 x 106 M-1, al menos 107 M-1, al menos 5 x 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 x 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 x 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 x 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 5 x 1012 M-1, al menos 1013 M-1, al menos 5 x 1013 M-1, al menos 1014 M-1, al menos 5 x 1014 M-1, al menos 1015 M-1 o al menos 5 x 1015 M-1.
La frase "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de unión a HER3) se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de un antígeno afín (por ejemplo, un HER3 humano) en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Además de la constante de equilibrio (Ka ) indicada antes, un anticuerpo de unión a HER3 de la divulgación también tiene generalmente una constante de velocidad de disociación (Kd ) (koff/kon) de menos de 5 x 10-2 M, menos de 10-2 M, menos de 5 x 10-3 M, menos de 10-3 M, menos de 5 x 10-4 M, menos de 10-4 M, menos de 5 x 10-5 M, menos de 10-5 M, menos de 5 x 10-6 M, menos de 10-6 M, menos de 5 x 10-7 M, menos de 10-7 M, menos de 5 x 10-8 M, menos de 10-8 M, menos de 5 x 10-9 M, menos de 10-9 M, menos de 5 x 10-10M, menos de 10-10 M, menos de 5 x 10-11 M, menos de 10-11 M, menos de 5 x 10­ 12 M, menos de 10-12 M, menos de 5 x 10-13 M, menos de 10-13 M, menos de 5 x 10-14 M, menos de 10-14 M, menos de 5 x 10-15 M, o menos de 10-15 M o menor, y se une a HER3 con una afinidad que es al menos 2 veces mayor que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, HSA).
En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo tiene una constante de disociación (Kd) de menos de 3000 pM, menos de 2500 pM, menos de 2000 pM, menos de 1500 pM, menos de 1000 pM, menos de 750 pM, menos de 500 pM , menos de 250 pM, menos de 200 pM, menos de 150 pM, menos de 100 pM, menos de 75 pM, menos de 10 pM, menos de 1 pM según se evalúa utilizando un método descrito en este documento o conocido por un experto en la materia (por ejemplo, un ensayo BIAcore, ELISA, FACS, SET) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia). Los términos "Kasoc" o "Ka", según se usan en este documento, se refieren a la velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que los términos "Kd¡s" o "Kd", según se usan en este documento, se refieren a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "Kd ", según se usa en este documento, se refiere la constante de disociación, que se obtiene de la relación entre Kd y Ka (es decir Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de Kd para los anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos muy consolidados en el área. Un método para determinar la Kd de un anticuerpo es utilizando resonancia de plasmones superficiales o utilizando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®.
El término "afinidad" según se usa en este documento se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte es la afinidad.
El término "avidez" según se usa en este documento se refiere a una medida informativa de la estabilidad general o fuerza del complejo anticuerpo-antígeno. Es controlada por tres factores principales: afinidad del epítopo del anticuerpo; la valencia tanto del antígeno como del anticuerpo; y la disposición estructural de las partes que interactúan. En última instancia, estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se una a un epítopo del antígeno preciso.
El término "valencia" según se usa en este documento se refiere al número de sitios potenciales de unión a dianas en un polipéptido. Cada sitio de unión a una diana se une específicamente a una molécula diana o un sitio específico (es decir, epítopo) en una molécula diana. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de unión a una diana, cada sitio de unión a una diana se puede unir específicamente a la misma o diferentes moléculas (por ejemplo, se puede unir a diferentes moléculas, por ejemplo, diferentes antígenos o diferentes epítopos en la misma molécula).
La frase "anticuerpo antagonista" según se usa en este documento se refiere a un anticuerpo que se une con HER3 y neutraliza la actividad biológica de señalización mediada por HER3, por ejemplo, reduce, disminuye y/o inhibe la actividad de señalización inducida por HER3, por ejemplo, en un ensayo de fosfo-HER3 o fosfo-Akt. Los ejemplos de ensayos se describen con más detalles en los Ejemplos siguientes. Por consiguiente, un anticuerpo que "inhibe" una o más de estas propiedades funcionales de HER3 (por ejemplo, actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas u otras actividades biológicas, o similares) según se determina de acuerdo con metodologías conocidas en el área y descritas en este documento, se entenderá que se relaciona con una disminución estadísticamente significativa en la actividad particular en relación con la observada en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando está presente un anticuerpo de control de especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhibe la actividad de HER3 produce una disminución estadísticamente significativa en al menos 10% del parámetro medido, en al menos 50%, 80% o 90%, y en ciertas realizaciones un anticuerpo de la divulgación puede inhibir más del 95%, 98% o 99% de la actividad funcional de HER3 como se evidencia por una reducción en el nivel de fosforilación celular de HER3.
La frase "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a HER3 está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de HER3). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a HER3 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos.
La frase "variante conservadoramente modificada" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de los ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU, todos codifican el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición en la que un codón especifica una alanina, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones descritos correspondientes sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico del presente documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para el triptófano) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
Para las secuencias de polipéptidos, las "variantes conservadoramente modificadas" incluyen sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia polipeptídica que dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en el área. Dichas variantes conservadoramente modificadas son adicionales y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la divulgación. Los ocho grupos siguientes contienen aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparragina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). En algunas realizaciones, la expresión "modificaciones conservadoras de secuencias" se usa para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.
Las expresiones "competir de forma cruzada" y "competencia cruzada" se usan indistintamente en el presente documento para dar a entender la capacidad de un anticuerpo u otro agente de unión para interferir con la unión de otros anticuerpos o agentes de unión a HER3 en un ensayo de unión competitiva estándar.
La capacidad o el grado en que un anticuerpo u otro agente de unión puede interferir con la unión de otro anticuerpo o molécula de unión a HER3 y, por lo tanto, si se puede decir que compite de forma cruzada de acuerdo con la divulgación, se puede determinar usando ensayos de unión competitiva estándar. Un ensayo adecuado implica el uso de la tecnología Biacore (por ejemplo, utilizando el instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), que puede medir el alcance de las interacciones utilizando la tecnología de resonancia de plasmones superficiales. Otro ensayo para medir la competencia cruzada utiliza un método basado en ELISA.
El término "optimizada", según se usa en este documento, se refiere a una secuencia de nucleótidos que ha sido alterada para codificar una secuencia de aminoácidos usando codones que se prefieren en la célula o el organismo de producción, generalmente una célula eucariota, por ejemplo, una célula de Pichia, una célula de Trichoderma, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se genomanipula para que retenga por completo o en la mayor medida posible la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia "parental". Los ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos con HER3 de diversas especies son conocidos en el área, incluidos, por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia tipo Western y RIA. Los ensayos adecuados se describen en detalle en los Ejemplos. La cinética de unión (por ejemplo, la afinidad de unión) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante ensayos estándar conocidos en el área, como el análisis Biacore o la afinidad relativa FACS (Scatchard). Los ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de HER3 (por ejemplo, ensayos de unión al receptor, modulando la ruta de Her) se describen con más detalle en los Ejemplos.
Las frases "porcentaje idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de identidad en una región especificada, o, cuando no se especifica, en toda la secuencia), cuando se compara y se alinea para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada según se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o por alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferentemente en una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.
Para la comparación de secuencias, habitualmente una secuencia actúa como secuencia de referencia respecto a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se ingresan en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden usar los parámetros predeterminados del programa o se pueden designar parámetros alternativos. Después el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de las secuencias para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", según se usa en este documento, incluye la referencia a un segmento de cualquiera de una cantidad de posiciones contiguas elegidas del grupo que consta de 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en la cual se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia de la misma cantidad de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias por comparación son bien conocidos en el área. La alineación óptima de secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de genética de Wisconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Brent etal., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).
Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res.
25:3389-3402; y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible para el público a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias con puntuaciones altas (HSP, por sus siglas en inglés) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, con una puntuación umbral T de correspondencia exacta o algo positiva cuando se alinean con una palabra de la misma longitud de una secuencia de una base de datos. T es la puntuación umbral de las palabras del vecindario (Altschul et al., supra). Estos hits (sitios) iniciales de palabras del vecindario actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar pares de secuencias de puntuación alta (HSP) más largas que las contengan. Los hits de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como se pueda incrementar el puntaje de alineación acumulada. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre> 0) y N (puntuación de penalización para residuos que no coinciden; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los hits de palabras en cada dirección se detiene cuando la puntuación de alineación acumulada cae fuera en una cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada tiende a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o cuando se alcanza el extremo de alguna de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por defecto una longitud de palabra de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas hebras.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo Karlin y Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que se puede producir por efecto del azar una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01 y de la manera más preferida inferior a aproximadamente 0,001.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de peso de residuos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5 o 6.
Además del porcentaje de identidad de secuencias señalado antes, otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico tiene inmunológicamente reactividad cruzada con los anticuerpos generados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por lo tanto, un polipéptido es generalmente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones restrictivas, como se describe a continuación. Aún otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que se pueden usar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.
La frase "ácido nucleico" se usa en este documento indistintamente con el término "polinucleótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de estructura carbonada modificada, que son sintéticos, de origen natural o no natural, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforoamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonats quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos peptidonucleicos (PNA).
A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, como se detalla a continuación, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de bases mixtas y/o desoxiinosina (Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; y Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).
La frase "unido operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótidos (por ejemplo, ADN). Habitualmente, se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de la transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora está unida operativamente a una secuencia de codificación si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras de la transcripción promotores que están unidas operativamente a una secuencia transcrita, son físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de acción cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, como los potenciadores, no necesitan ser físicamente contiguas o estar ubicadas cerca de las secuencias de codificación cuya transcripción potencian.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoacídicos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como también a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos que no son de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia polipeptídica particular también abarca implícitamente sus variantes modificadas conservadoramente.
El término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, como los primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indica, los términos "paciente" o "sujeto" se usan indistintamente.
La expresión "agente antineoplásico" significa cualquier agente que se puede utilizar para tratar un trastorno de proliferación celular como el cáncer, incluidos los agentes citotóxicos, los agentes quimioterápicos, la radioterapia y los agentes radioterápicos, los agentes antineoplásicos dirigidos y los agentes inmunoterápicos.
"Tumor" se refiere al crecimiento y la proliferación de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.
La expresión "actividad antitumoral" significa una reducción en la velocidad de proliferación, la viabilidad o la actividad metastásica de las células tumorales. Una forma posible de mostrar actividad antitumoral es mostrar una disminución en la velocidad de multiplicación de células anormales que surge durante la terapia, o la estabilidad o reducción del tamaño del tumor. Dicha actividad se puede evaluar utilizando modelos tumorales in vitro o in vivo aceptados, que incluyen, pero no exclusivamente, modelos de xenoinjerto, modelos de aloinjerto, modelos MMTV y otros modelos conocidos en el área para investigar la actividad antitumoral.
La expresión "tumor maligno" se refiere a un tumor no benigno o un cáncer. Según se usa en este documento, el término "cáncer" incluye una neoplasia maligna caracterizada por un crecimiento celular desregulado o descontrolado. Los ejemplos de cáncer incluyen: carcinomas, sarcomas, leucemias y linfomas. El término "cáncer" incluye tumores malignos primarios (por ejemplo, aquellos cuyas células no han migrado a sitios en el cuerpo del sujeto que no sean el sitio del tumor original) y tumores malignos secundarios (por ejemplo, los que surgen de metástasis, la migración de células tumorales a sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original).
Diversos aspectos de la invención se describen con más detalle en las secciones y subsecciones siguientes.
Estructura y mecanismo de activación de los receptores HER
Los cuatro receptores HER tienen un dominio de unión al ligando extracelular, un único dominio transmembrana y un dominio que contiene tirosina cinasa citoplasmática. El dominio intracelular tirosina cinasa de los receptores HER está muy conservado, aunque el dominio cinasa de HER3 contiene sustituciones de aminoácidos críticos y, por lo tanto, carece de actividad cinasa (Guy et al., (1994): PNAS 91, 8132-8136). La dimerización inducida por ligando de los receptores HER induce la activación de la cinasa, la transfosforilación del receptor en los residuos de tirosina de la cola C-terminal, seguido del reclutamiento y la activación de efectores de la señalización intracelular (Yarden y Sliwkowski, (2001) Nature Rev 2, 127-137; Jorissen et al., (2003) Exp Cell Res 284, 31-53.
Las estructuras cristalinas de los dominios extracelulares de los HER han proporcionado cierta información sobre el proceso de activación del receptor inducido por ligando (Schlessinger, (2002) Cell 110, 669-672). El dominio extracelular de cada receptor HER consta de cuatro subdominios: los subdominios I y III cooperan en la formación del sitio de unión al ligando, mientras que el subdominio II (y quizás también el subdominio IV) participa en la dimerización del receptor mediante interacciones directas receptor-receptor. En las estructuras de HER1 unido a ligando, una horquilla p (denominada bucle de dimerización) en el subdominio II interactúa con el bucle de dimerización del otro receptor, mediando la dimerización del receptor (Garrett et al, (2002) Cell 110, 763-773; Ogiso et al., (2002) Cell 110, 775-787). Por el contrario, en las estructuras de los HER1, HER3 y HER4 inactivos, el bucle de dimerización participa en interacciones intramoleculares con el subdominio IV, lo que evita la dimerización del receptor en ausencia de ligando (Cho y Leahy, (2002) Science 297, 1330-1333; Ferguson et al., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Bouyan et al., (2005) PNAS102, 15024-15029). La estructura de HER2 es única entre los h Er . En ausencia de un ligando, HER2 tiene una conformación que se asemeja al estado activado por ligando de HER1 con un bucle de dimerización que sobresale, disponible para interactuar con otros receptores HER (Cho et al., (2003) Nature 421, 756-760; Garrett et al., (2003) Mol Cell 11,495-505). Esto puede explicar la mayor capacidad de heterodimerización de HER2.
Aunque las estructuras cristalinas del receptor HER proporcionan un modelo para la homo y heterodimerización del receptor HER, los antecedentes de la prevalencia de algunos homo y heterodímeros de HER sobre otros (Franklin et al., (2004) Cancer Cell 5, 317-328) así como el papel conformacional de cada uno de los dominios en la dimerización y autoinhibición del receptor (Burgess et al., (2003) Mol Cell 12, 541-552; Mattoon et al., (2004) PNAS101, 923-928) sigue siendo algo poco claro. Como se describe a continuación, la estructura cristalina de rayos X de HER3 proporciona más información.
Estructura y epítopos conformacionales de HER3
En el presente documento se proporciona un epítopo conformacional al que se unen las proteínas de unión a antígenos, por ejemplo, anticuerpos anti-HER3. Por primera vez, se ha demostrado la estructura tridimensional de una forma truncada (residuos 20-640) del dominio extracelular de HER3 en un complejo con un anticuerpo. El complejo HER3-Fab de MOR09823 y el complejo HER3-MOR09825 se determinaron a una resolución de 3,2 Á y 3,4 Á, respectivamente, y se muestran en la figura 5A. La divulgación del presente documento también muestra por primera vez un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un estado inactivo de HER3 y estabiliza al receptor en el estado inactivo. Los anticuerpos de la divulgación también permiten la unión concurrente de un ligando de HER3, tal como la neuregulina con el receptor HER3.
Aunque sin estar obligados a proporcionar una teoría, un posible modelo para el mecanismo de acción es que HER3 exista típicamente en un estado inactivo (cerrado, atado) o activo (abierto). La unión del ligando induce un cambio conformacional de tal manera que HER3 exista en el estado activo (abierto) que es capaz de unirse a la pareja del heterodímero lo que da como resultado la activación de las sucesivas etapas de la señalización. Los anticuerpos como MOR09823 se unen al estado inactivo (atado) de HER3 pero no bloquean el sitio de unión al ligando. Los anticuerpos como MOR09823 inhiben a HER3 al evitar los reordenamientos estructurales inducidos por el ligando, necesarios para que HER3 haga la transición a la conformación activa, evitando así la transducción de señales. En una realización, los anticuerpos de la divulgación o sus fragmentos se unen al estado inactivo (atado) de HER3 pero no bloquean el sitio de unión al ligando. En otra realización, los anticuerpos o fragmentos de los mismos inhiben a HER3 evitando los reordenamientos estructurales inducidos por ligando, necesarios para que HER3 haga la transición a la conformación activa, evitando así la transducción de señales. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo estabiliza (mantiene directamente, bloquea, ata, retiene, preferentemente se une o favorece) al receptor HER3 en conformación o estado inactivo. En una realización, el receptor HER3 inactivo puede ser susceptible a la internalización o degradación preferenciales de modo tal que conduce a la pérdida de los receptores HER3 de la superficie celular. Los datos biológicos presentados en la sección de Ejemplos respaldan estas realizaciones.
Los cristales de HER3 se pueden preparar mediante expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica HER3 o una variante de la misma en una célula hospedadora adecuada, y luego cristalizando la o las proteínas purificadas en presencia del Fab pertinente dirigido a HER3. Preferentemente, el polipéptido HER3 contiene el dominio extracelular (aminoácidos 20 a 640 del polipéptido humano o una versión truncada del mismo, que preferentemente comprende los aminoácidos 20-640) pero carece de los dominios transmembrana e intracelular.
Los polipéptidos HER3 también se pueden producir como proteínas de fusión, por ejemplo, para ayudar en la extracción y purificación. Los ejemplos de parejas de proteínas de fusión incluyen glutatión-S-transferasa (GST), histidina (HIS), hexahistidina (6HIS), GAL4 (dominios de unión al ARN y/o de activación transcripcional) y betagalactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica entre la pareja de la proteína de fusión y la secuencia de la proteína de interés para permitir la eliminación de secuencias de la proteína de fusión.
Después de la expresión, las proteínas se pueden purificar y/o concentrar, por ejemplo mediante cromatografía por afinidad con metal inmovilizado, cromatografía de intercambio iónico y/o filtración en gel.
La proteína o proteínas se pueden cristalizar empleando técnicas descritas en este documento. Comúnmente, en un proceso de cristalización, se mezcla una gota que contiene la solución de proteína con el tampón de cristalización y se permite que se equilibre en un recipiente sellado. El equilibrio se puede lograr mediante técnicas conocidas, como el método de "gota colgante" o "gota sentada". En estos métodos, la gota se cuelga por encima o se sienta al lado de un recipiente de tampón de cristalización mucho más grande y el equilibrio se logra a través de difusión de vapor. Alternativamente, el equilibrio se puede producir por otros métodos, por ejemplo bajo aceite, a través de una membrana semipermeable mediante difusión sin interfase (véase por ejemplo, Chayen et al., (2008) Nature Methods 5, 147 - 153.
Una vez obtenidos los cristales, la estructura se puede resolver mediante técnicas conocidas de difracción de rayos X. Muchas técnicas usan cristales modificados químicamente, como los modificados mediante derivatización de átomos pesados para aproximar las fases. En la práctica, un cristal se embebe en una solución que contiene sales de átomos de metales pesados o compuestos organometálicos, por ejemplo, cloruro de plomo, tiomalato de oro, timerosal o acetato de uranilo, que pueden difundir a través del cristal y unirse a la superficie de la proteína. La ubicación o ubicaciones del o los átomos de metales pesados se pueden determinar por análisis de difracción de rayos X del cristal embebido. Los patrones obtenidos en la difracción de un haz monocromático de rayos X por los átomos (centros de dispersión) del cristal se pueden resolver mediante ecuaciones matemáticas para dar coordenadas matemáticas. Los datos de difracción se utilizan para calcular un mapa de densidad electrónica de la unidad repetitiva del cristal. Otro método para obtener información de la fase es usar una técnica conocida como reemplazo molecular. En este método, se aplican algoritmos rotacionales y translacionales a un modelo de búsqueda derivado de una estructura relacionada, lo que resulta en una orientación aproximada para la proteína de interés (Véase Rossmann, (1990) Acta Crystals A 46, 73-82). Los mapas de densidad electrónica se usan para establecer las posiciones de los átomos individuales dentro de la celda unitaria del cristal (Blundel et al., (1976) Protein Crystallography, Academic Press).
La presente divulgación describe por primera vez la estructura tridimensional de HER3 y un Fab de un anticuerpo anti-HER3. Los límites aproximados del dominio, del dominio extracelular de HER3 son los siguientes; dominio 1: aminoácidos 20-207; dominio 2: aminoácidos 208-328; dominio 3: aminoácidos 329-498; y dominio 4: aminoácidos 499-642. La estructura tridimensional de HER3 y el anticuerpo también permite la identificación de sitios de unión a dianas para potenciales moduladores de HER3. Los sitios de unión a dianas preferidos son aquellos implicados en la activación de HER3. En una realización, el sitio de unión a la diana está ubicado dentro del dominio 2 y el dominio 4 de HER3. Por lo tanto, un anticuerpo o fragmento del mismo que se una al dominio 2 o al dominio 4, y preferentemente a ambos dominios, puede modular la activación de HER3 evitando que los dominios se disocien entre sí o modificando las posiciones relativas de los dominios. Por lo tanto, unir un anticuerpo o fragmento del mismo a residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 o dominio 4 puede hacer que la proteína adopte una conformación que evite la activación. La divulgación del presente documento también muestra por primera vez un anticuerpo o fragmento del mismo que puede unirse concurrentemente con un ligando de HER3, tal como neuregulina.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo reconoce un estado conformacional específico de HER3 tal que el anticuerpo o fragmento del mismo impide que HER3 interactúe con un correceptor (que incluye, pero no exclusivamente, HER1, HER2 y HER4). En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo evita que HER3 interactúe con un correceptor estabilizando al receptor HER3 en un estado inactivo o cerrado. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo estabiliza al receptor HER3 uniéndose a residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 de HER3. En este estado inactivo, el bucle de dimerización ubicado dentro del dominio 2 no está expuesto y, por lo tanto, no está disponible para la dimerización con otros correceptores (incluidos, entre otros, HER1, HER2 y HER4). En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a la proteína HER3 humana que tiene un epítopo conformacional que comprende (i) los residuos de aminoácidos de HER3265-277 y 315 (del dominio 2) y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3571,582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de SEQ ID NO: 1, o un subconjunto de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a aminoácidos dentro de, o que se superponen a, los residuos de aminoácidos 265-277 y 315 (del dominio 2) y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3571,582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a aminoácidos dentro de (y/o secuencias de aminoácidos que consisten en) los aminoácidos 265-277 y 315 (del dominio 2) y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3571, 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de SEQ ID n O: 1, o un subconjunto de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al epítopo conformacional de modo que restringe la movilidad del dominio 2 y el dominio 4, estabilizándolo en una conformación inactiva o cerrada. El fracaso en formar la conformación activa da como resultado el fracaso en activar la transducción de señales. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al epítopo conformacional de modo que ocluye el bucle de dimerización dentro del dominio 2, lo que hace que no esté disponible para la interacción receptor-receptor. El fracaso en la formación de homo o heterodímeros resulta en el fracaso en activar la transducción de señales.
En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo conformacional del receptor HER, tal como un receptor HER3. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo estabiliza al receptor HER3 en el estado inactivo. En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al estado activo del receptor HER3 y lo conduce al estado inactivo. Por lo tanto, el anticuerpo o fragmento del mismo se puede unir al estado activo o inactivo de HER3, pero favorece la formación del estado inactivo y conduce al estado activo de HER3 al estado inactivo, lo que resulta en un fracaso en activar la transducción de señales.
En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo conformacional del receptor HER, tal como un receptor HER3 donde la unión del anticuerpo o fragmento del mismo estabiliza al receptor HER3 en un estado inactivo de modo que el receptor HER3 no se dimeriza con un correceptor para formar un complejo receptor-receptor. El fracaso en formar un complejo receptor-receptor impide la activación de la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando.
En otro aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epítopo conformacional del receptor HER tal como un receptor HER3, donde la unión del anticuerpo o fragmento del mismo al receptor HER3 permite la dimerización con un correceptor para formar un complejo receptor-receptor inactivo. La formación del complejo receptor-receptor inactivo impide la activación de la transducción de señales independiente de ligando. Por ejemplo, en la transducción de señales independiente de ligando, HER3 puede existir en un estado inactivo, sin embargo, la sobreexpresión de HER2 provoca la formación del complejo HER2-HER3, no obstante, estos complejos resultantes están inactivos y evitan la activación de la transducción de señales independiente de ligando.
La estructura representada también permite identificar residuos de aminoácidos centrales de HER3 específicos para la interfase de interacción de un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, MOR09823) con HER3. Esto se definió como los residuos que están dentro de 5 Á de distancia de la cadena VH de la proteína MOR09823. Los residuos centrales son los siguientes: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597.
Las estructuras también se pueden utilizar para identificar residuos de aminoácidos del límite de HER3 para la interfase de interacción con un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, MOR09823). Estos residuos pueden ser residuos de HER3 que estaban a 5-8 Á de distancia de la cadena VH de la proteína MOR09823. Los residuos del límite son los siguientes: Pro262, Val264, Tyr265, Phe270, Leu272, Thr278, Lys314, Gly316, Glu321, Asn566, Ser568, Gly569, Ser570, Thr572, Arg580, Asp581, Gly582, Gly595, Gly598, Ile600.
La estructura representada también permite identificar residuos de aminoácidos centrales de HER3 específicos para la interfase de interacción de un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, MOR09823) con HER3. Esto se definió como los residuos que están dentro de 5 Á de distancia de la cadena VL de la proteína MOR09823. Los residuos centrales son los siguientes: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.
Las estructuras también se utilizaron para identificar los residuos de aminoácidos del límite de HER3 para la interfase de interacción con un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, MOR09823). Estos residuos eran residuos de HER3 que estaban a 5-8 Á de distancia de la cadena VL de la proteína MOR09823. Los residuos del límite son los siguientes: Asn266, Thr269, Asp571, Arg580, Asp581, His584, Pro590, Ala596, Pro599, Tyr601, Tyr603, Asp605, Gln607, Cys610, Asn616, Cys617, Cys621, Gly623, Pro624.
Como se puede ver en las tablas 11 y 12 (MOR09823) y las tablas 13 y 14 (MOR09825), respectivamente, la cadena pesada está implicada principalmente en la unión de la proteína de unión al antígeno a los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 del epítopo, con menos interacciones con los residuos de aminoácidos del dominio 4, mientras que la cadena ligera está implicada principalmente en la unión a los residuos de aminoácidos dentro del dominio 4 del epítopo, con menos interacciones con los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2.
Como tal, un experto en la materia, dadas las presentes enseñanzas, puede predecir qué residuos y áreas de las proteínas de unión al antígeno se pueden variar sin interferir indebidamente con la capacidad de la proteína de unión al antígeno para unirse a HER3.
Se determinó que los aminoácidos centrales de la interfase de interacción eran todos residuos de aminoácidos con al menos un átomo a menos o a 5 Á de distancia de la proteína pareja de HER3. Se eligió 5 Á como la distancia de corte de la región central para permitir átomos dentro de un radio de van der Waals más un posible enlace de hidrógeno mediado por agua. Se determinó que los aminoácidos del límite de la interfase de interacción eran todos residuos de aminoácidos con al menos un átomo a menos o a 8 Á de distancia de la proteína pareja de HER3 pero no incluidos en la lista de interacción central.
En algunas realizaciones, cualquier proteína de unión al antígeno que se una a, cubra a, o evite que MOR09823 interactúe con cualquiera de los residuos anteriores se puede emplear para unirse o neutralizar a HER3. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen o interactúan con al menos uno de los residuos de HER3 siguientes (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. En algunas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de los mismos se unen o interactúan con al menos uno de los residuos de HER3 siguientes (SEQ ID NO: 1): Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen o interactúan con al menos uno de los residuos de HER3 siguientes (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen o interactúan con una combinación de los residuos de HER3 siguientes (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen o interactúan con todos los residuos de HER3 siguientes (SEQ ID NO: 1): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo está dentro de 5 angstroms de distancia de uno o más de los residuos anteriores. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo está entre 5 y 8 angstroms de distancia de uno o más de los residuos anteriores. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo interactúa, bloquea o está dentro de 8 angstroms de distancia de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 de los residuos anteriores.
La disponibilidad de estructuras 3D para HER3 y el complejo de HER3:MOR09823, por ejemplo, proporciona el marco para explorar otros anticuerpos contra HER3 con más detalle. La estructura 3D de HER3 permite mapear los epítopos para anticuerpos monoclonales y deducir su modo de acción, ya que algunos inhiben, algunos estimulan y otros no tienen ningún efecto sobre la multiplicación celular. El epítopo conformacional para MOR09823 ha sido localizado en los dominios 2 y 4 de HER3. La disponibilidad de las estructuras 3D de este receptor facilitará la determinación del mecanismo de acción preciso de estos agentes inhibidores y el diseño de nuevos métodos para interferir con la función del receptor HER3. En una realización, los anticuerpos de la divulgación se unen al mismo epítopo conformacional que MOR09823.
En algunas realizaciones, el epítopo conformacional al que se une cualquiera de los anticuerpos listados en la tabla 1 es especialmente útil. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un epítopo conformacional de HER3 para aislar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unan a HER3. En ciertas realizaciones, se puede utilizar un epítopo conformacional de HER3 para generar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unan a HER3. En ciertas realizaciones, un epítopo conformacional de HER3 se puede utilizar como un inmunógeno para generar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unan al epítopo conformacional de HER3. En ciertas realizaciones, se puede administrar un epítopo conformacional de HER3 a un animal, y los anticuerpos que se unan a HER3 se pueden obtener posteriormente del animal.
En algunas realizaciones, el dominio o dominios/la región o regiones que contienen residuos que están en contacto o están enterrados por un anticuerpo se pueden identificar mutando residuos específicos en HER3 (por ejemplo, un antígeno de tipo silvestre) y determinando si el anticuerpo o fragmento del mismo se puede unir a la proteína HER3 mutada o variante o medir cambios de afinidad respecto al tipo silvestre. Al realizar una serie de mutaciones individuales, se pueden identificar los residuos que juegan un papel directo en la unión o que están lo suficientemente cerca del anticuerpo como para que una mutación pueda afectar la unión entre el anticuerpo y el antígeno. A partir del conocimiento de estos aminoácidos, se pueden dilucidar el dominio o dominios o la región o regiones del antígeno (HER3) que contienen residuos en contacto con el anticuerpo o cubiertos por el anticuerpo. La mutagénesis utilizando técnicas conocidas como el escaneo de alanina puede ayudar a definir epítopos funcionalmente pertinentes. También se puede emplear la mutagénesis que utiliza un protocolo de escaneo de arginina/ácido glutámico (véase, por ejemplo, Nanevicz et al., (1995), J. Biol. Chem. 270(37):21619-21625 y Zupnick et al., (2006), J. Biol. Chem. 281(29):20464-20473). En general, los aminoácidos arginina y ácido glutámico se sustituyen (en general individualmente) por un aminoácido en el polipéptido de tipo silvestre porque estos aminoácidos están cargados y son voluminosos y, por lo tanto, tienen el potencial de interrumpir la unión entre una proteína de unión al antígeno y un antígeno, en la región del antígeno donde se introduce la mutación. Las argininas que existen en el antígeno de tipo silvestre se reemplazan con ácido glutámico. Se puede obtener una variedad de dichos mutantes individuales y analizar los resultados de unión recopilados para determinar qué residuos afectan la unión. Se puede crear una serie de antígenos HER3 mutantes, y cada antígeno mutante tener una sola mutación. La unión de cada antígeno HER3 mutante con varios anticuerpos contra HER3 o fragmentos de los mismos se puede medir y comparar con la capacidad del anticuerpo seleccionado o fragmentos del mismo para unirse a HER3 tipo silvestre (SEQ ID NO: 1).
Una alteración (por ejemplo, una reducción o aumento) en la unión entre un anticuerpo o fragmento del mismo y un HER3 mutante o variante, según se usa en este documento, significa que hay un cambio en la afinidad de unión, EC50, (por ejemplo, según se mide por métodos conocidos tales como la prueba Biacore o el ensayo basado en perlas descrito a continuación en los ejemplos) y/o un cambio (por ejemplo, una reducción) en la capacidad de unión total de la proteína de unión al antígeno (por ejemplo, como lo demuestra una disminución de Bmáx en una gráfica de concentración de proteína de unión al antígeno versus concentración de antígeno). Una alteración significativa en la unión indica que el residuo mutado está implicado en la unión al anticuerpo o fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, una reducción significativa en la unión significa que la afinidad de unión, EC50, y/o la capacidad der unión entre un anticuerpo o fragmentos del mismo y un antígeno HER3 mutante se reduce en más del 10%, más del 20%, más del 40%, más del 50%, más de 55%, más de 60%, más del 65%, más del 70%, más del 75%, más del 80%, más del 85%, más del 90% o más del 95% con respecto a la unión entre un anticuerpo o fragmento del mismo y un HER3 tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).
En algunas realizaciones, la unión de un anticuerpo o fragmentos del mismo se reduce o aumenta significativamente para una proteína HER3 mutante que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) mutaciones en comparación con una proteína HER3 tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).
Aunque se hace referencia a las formas variantes con respecto a la secuencia tipo silvestre que se muestra en SEQ ID N°: 1, se apreciará que en una variante alélica o de empalme de HER3 los aminoácidos podrían diferir. También se contemplan anticuerpos o fragmentos de los mismos que muestran una unión significativamente alterada (por ejemplo, una unión menor o mayor) para tales formas alélicas de HER3.
Además de los aspectos estructurales generales de los anticuerpos, la interacción más específica entre el parátopo y el epítopo se puede examinar mediante métodos estructurales. En una realización, la estructura de las CDR contribuye a un parátopo, a través del cual un anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo. La forma de dicho parátopo se puede determinar de varias maneras. Se pueden utilizar métodos tradicionales de examen estructural, como NMR o cristalografía de rayos X. Estos métodos pueden examinar la forma del parátopo solo, o mientras está unido al epítopo. Alternativamente, los modelos moleculares se pueden generar por simulación en computadora. Se puede generar una estructura a través del modelado de homología, con la ayuda de un paquete comercial, como el paquete de modelado InsightII de Accelrys (San Diego, California). En resumen, se puede usar la secuencia del anticuerpo que se va a examinar para buscar en una base de datos de proteínas de estructuras conocidas, como el Banco de datos de proteínas. Después que se identifican proteínas homólogas con estructuras conocidas, estas proteínas homólogas se usan como plantillas de modelado. Cada una de las posibles plantillas se puede alinear, produciendo así alineaciones de secuencias entre las plantillas basadas en la estructura. Después la secuencia del anticuerpo con la estructura desconocida se puede alinear con estas plantillas para generar un modelo molecular para el anticuerpo con la estructura desconocida. Como apreciará un experto en la materia, existen muchos métodos alternativos para generar tales estructuras en computadora, cualquiera de los cuales se puede usar. Por ejemplo, se puede usar un proceso similar al descrito en Hardman et al., presentado en la patente de Estados Unidos N° 5,958,708 que emplea QUANTA (Polygen Corp., Waltham, Mass.) y CHARM (Brooks et al., (1983), J. Comp. Chem. 4:187).
La forma del parátopo no solo es importante para determinar si un parátopo posible se unirá a un epítopo, y qué tan bien lo hará, sino que la interacción en sí, entre el epítopo y el parátopo es una fuente de gran información en el diseño de anticuerpos variantes. Como apreciará un experto en la materia, hay diversas formas en las que se puede estudiar esta interacción. Una forma es usar el modelo estructural generado, tal vez como se describió antes, y después usar un programa como InsightII (Accelrys, San Diego, California), que tiene un módulo de acoplamiento, que, entre otras cosas, es capaz de realizar una búsqueda Monte Carlo sobre los espacios conformacionales y orientativos entre el parátopo y su epítopo. El resultado es que uno es capaz de estimar dónde y cómo interactúa el epítopo con el parátopo. En una realización, solo se usa un fragmento, o variante, del epítopo para ayudar a determinar las interacciones pertinentes. En una realización, el epítopo completo se usa en el modelado de la interacción entre el parátopo y el epítopo.
Mediante el uso de estas estructuras modeladas, se puede predecir qué residuos son los más importantes en la interacción entre el epítopo y el parátopo. Por lo tanto, en una realización, se puede seleccionar fácilmente qué residuos cambiar para alterar las características de unión del anticuerpo. Por ejemplo, puede ser evidente a partir de los modelos de acoplamiento que las cadenas laterales de ciertos residuos en el parátopo pueden obstaculizar estéricamente la unión del epítopo, por lo que alterar estos residuos a residuos con cadenas laterales más pequeñas puede ser beneficioso. Esto se puede determinar de muchas maneras. Por ejemplo, se puede simplemente mirar los dos modelos y estimar las interacciones basadas en grupos funcionales y proximidad. Alternativamente, se pueden realizar apareamientos repetidos de epítopo y parátopo, como se describió antes, para obtener interacciones energéticas más favorables. También se pueden determinar estas interacciones para diversas variantes del anticuerpo a fin de determinar formas alternativas en las que el anticuerpo se puede unir al epítopo. También se pueden combinar los diversos modelos para determinar cómo se debería alterar la estructura de los anticuerpos para obtener un anticuerpo con las características particulares que se desean.
Los modelos determinados antes se pueden probar mediante diversas técnicas. Por ejemplo, la energía de interacción se puede determinar con los programas tratados antes a fin de determinar cuál de las variantes examinar más a fondo. Además, se utilizan las interacciones coulómbicas y de van der Waals para determinar las energías de interacción del epítopo y los parátopos de las variantes. También se usa la mutagénesis de sitio dirigido para ver si los cambios pronosticados en la estructura del anticuerpo realmente dan como resultado los cambios deseados en las características de unión. Alternativamente, se pueden hacer cambios en el epítopo para verificar que los modelos sean correctos o para determinar temas de unión generales que pueden estar ocurriendo entre el parátopo y el epítopo.
Como apreciará un experto en la materia, aunque estos modelos proporcionarán la orientación necesaria para preparar los anticuerpos y variantes de los mismos de las presentes realizaciones, puede ser aún deseable realizar pruebas de rutina de los modelos simulados por computadora, quizás a través de estudios in vitro. Además, como será evidente para un experto en la materia, cualquier modificación también puede tener efectos secundarios adicionales sobre la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, si bien cualquier alteración prevista para producir una mayor unión, puede inducir una mayor unión, también puede causar otros cambios estructurales que podrían reducir o alterar la actividad del anticuerpo. La determinación de si este es el caso, o no, es rutina en el área y se puede lograr de muchas maneras. Por ejemplo, la actividad se puede probar a través de una prueba ELISA. Alternativamente, las muestras se pueden analizar mediante el uso de un dispositivo de resonancia de plasmones superficiales.
Anticuerpos contra HER3
La presente divulgación proporciona anticuerpos que reconocen un epítopo conformacional de HER3. La divulgación se basa en el sorprendente hallazgo de que una clase de anticuerpos contra HER3 bloquea las vías de transducción de señales mediadas por HER3 tanto dependientes del ligando como independientes del ligando. En la tabla 1 se da a conocer una clase de anticuerpos que se unen al epítopo conformacional particular de HER3. En una realización, los anticuerpos inhiben la señalización mediada por HER3 tanto dependiente de ligando como independiente de ligando. En otra realización, los anticuerpos se unen a HER3 y no bloquean la unión del ligando de HER al sitio de unión al ligando (es decir, tanto el ligando como el anticuerpo se pueden unir concurrentemente a HER3)
La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo), dichos anticuerpos comprenden un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, 33, 51,69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231,249, 267, 285, 303, 321,339, 357 y 375. La presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo), dichos anticuerpos comprenden un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 y 374. La presente divulgación también proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo), dichos anticuerpos comprenden una CDR de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR de VH listadas en la tabla 1, infra. En particular, la divulgación proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo), donde dichos anticuerpos comprenden (o alternativamente, consisten en) una, dos, tres, cuatro, cinco o más CDR de VH que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR de VH listadas en la tabla 1, infra.
Otros anticuerpos de la divulgación incluyen aminoácidos que han sido mutados, pero que tienen aún al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 98 por ciento de identidad en las regiones CDR; las regiones CDR están representadas en las secuencias descritas en la tabla 1. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no se han mutado más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las regiones CDR en comparación con las regiones CDR representadas en la secuencia descrita en la tabla 1, mientras mantienen su especificidad para el epítopo del anticuerpo original.
Otros anticuerpos de la divulgación incluyen aminoácidos que han sido mutados, pero que tienen aún al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 98 por ciento de identidad en las regiones marco; las regiones marco están representadas en las secuencias descritas en la tabla 1. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no se han mutado más de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos en las regiones marco en comparación con las regiones marco representadas en la secuencia descrita en la tabla 1, mientras mantienen su especificidad por el epítopo del anticuerpo original. La presente divulgación también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican VH, VL, la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo).
Los anticuerpos contra HER3 de la invención se unen al epítopo conformacional de HER3 que comprende residuos de aminoácidos del dominio 2 y del dominio 4 de HER3.
T l 1: E m l ni r n r HER l r n iv l i n
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Otros anticuerpos de la divulgación incluyen aquellos en los que los aminoácidos o ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos han sido mutados, pero aún tienen al menos 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 y 99 por ciento de identidad con las secuencias descritas en la tabla 1. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no se han mutado más de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las regiones variables en comparación con las regiones variables representadas en la secuencia descrita en la tabla 1, mientras conservan sustancialmente la misma actividad terapéutica.
Como cada uno de estos anticuerpos o fragmentos de los mismos se puede unir a HER3, las secuencias VH, VL, de cadena ligera de longitud completa y de cadena pesada de longitud completa (secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) se pueden "mezclar y aparear "para crear otros anticuerpos de unión a HER3 de la divulgación. Dichos anticuerpos de unión a HER3 "mezclados y apareados" se pueden probar usando los ensayos de unión conocidos en el área (por ejemplo, ELISA y otros ensayos descritos en la sección de Ejemplos). Cuando estas cadenas se mezclan y aparean, una secuencia VH de un apareamiento VH/VL particular se debe reemplazar con una secuencia VH estructuralmente similar. Del mismo modo, una secuencia de cadena pesada de longitud completa de un apareamiento particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa se debe reemplazar con una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. Del mismo modo, una secuencia VL de un apareamiento VH/VL particular se debe reemplazar con una secuencia VL estructuralmente similar. Del mismo modo, una secuencia de cadena ligera de longitud completa de un apareamiento particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa se debe reemplazar con una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar. Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento del mismo que tiene: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 33, 51,69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231,249, 267, 285, 303, 321,339, 357, y 375; y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, y 374; en donde el anticuerpo se une específicamente a HER3 (por ejemplo, humana y/o de cinomólogo).
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos de unión a HER3 que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y de la cadena ligera como se describe en la tabla 1, o sus combinaciones. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de Vh de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, y 369. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ iD NO: 5, 11, 23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de Vl de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31,43, 49, 61,67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211,223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301,313, 319, 331,337, 349, 355, 367, y 373. Las regiones Cd R se delinean utilizando el sistema Kabat (Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N° 91-3242; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883; y Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948).
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 2; una CDR2 de SEQ ID NO: 3; una CDR3 de SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 5; una CDR2 de SEQ ID NO: 6; y una CDR3 de SEQ ID NO: 7.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 20; una CDR2 de s Eq ID NO: 21; una CDR3 de SEQ ID NO: 22; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 23; una CDR2 de SEQ ID NO: 24; y una CDR3 de SEQ ID NO: 25.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 38; una CDR2 de s Eq ID NO: 39; una CDR3 de SEQ ID NO: 40; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 41; una CDR2 de SEQ ID NO: 42; y una CDR3 de SEQ ID NO: 43.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 56; una CDR2 de s Eq ID NO: 57; una CDR3 de SEQ ID NO: 58; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 59; una CDR2 de SEQ ID NO: 60; y una CDR3 de SEQ ID NO: 61.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 74; una CDR2 de s Eq ID NO: 75; una CDR3 de SEQ ID NO: 76; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 77; una CDR2 de SEQ ID NO: 78; y una CDR3 de SEQ ID NO: 79.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 92; una CDR2 de s Eq ID NO: 93; una CDR3 de SEQ ID NO: 94; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 95; una CDR2 de SEQ ID NO: 96; y una CDR3 de SEQ ID NO: 97.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 110; una CDR2 de SEQ ID NO: 111; una CDR3 de SEQ ID NO: 112; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 113; una CDR2 de SEQ ID NO: 114; y una CDR3 de SEQ ID NO: 115.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 128; una CDR2 de SEQ ID NO: 129; una CDR3 de SEQ ID NO: 130; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 131; una CDR2 de SEQ ID NO: 132; y una CDR3 de SEQ ID NO: 133.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 146; una CDR2 de SEQ ID NO: 147; una CDR3 de SEQ ID NO: 148; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 149; una CDR2 de SEQ ID NO: 150; y una CDR3 de SEQ ID NO: 151.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 164; una CDR2 de SEQ ID NO: 165; una CDR3 de SEQ ID NO: 166; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 167; una CDR2 de SEQ ID NO: 168; y una CDR3 de SEQ ID NO: 169.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 182; una CDR2 de SEQ ID NO: 183; una CDR3 de SEQ ID NO: 184; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 185; una CDR2 de SEQ ID NO: 186; y una CDR3 de SEQ ID NO: 187.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 200; una CDR2 de SEQ ID NO: 201; una CDR3 de SEQ ID NO: 202; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 203; una CDR2 de SEQ ID NO: 204; y una CDR3 de SEQ ID NO: 205.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 218; una CDR2 de SEQ ID NO: 219; una CDR3 de SEQ ID NO: 220; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 221; una CDR2 de SEQ ID NO: 222; y una CDR3 de SEQ ID NO: 223.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 236; una CDR2 de SEQ ID NO: 237; una CDR3 de SEQ ID NO: 238; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 239; una CDR2 de SEQ ID NO: 240; y una CDR3 de SEQ ID NO: 241.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 254; una CDR2 de SEQ ID NO: 255; una CDR3 de SEQ ID NO: 256; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 257; una CDR2 de SEQ ID NO: 258; y una CDR3 de SEQ ID NO: 259.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 272; una CDR2 de SEQ ID NO: 273; una CDR3 de SEQ ID NO: 274; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 275; una CDR2 de SEQ ID NO: 276; y una CDR3 de SEQ ID NO: 277.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 290; una CDR2 de SEQ ID NO: 291; una CDR3 de SEQ ID NO: 292; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 293; una CDR2 de SEQ ID NO: 294; y una CDR3 de SEQ ID NO: 295.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 308; una CDR2 de SEQ ID NO: 309; una CDR3 de SEQ ID NO: 310; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 311; una CDR2 de SEQ ID NO: 312; y una CDR3 de SEQ ID NO: 313.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 326; una CDR2 de SEQ ID NO: 327; una CDR3 de SEQ ID NO: 328; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 329; una CDR2 de SEQ ID NO: 330; y una CDR3 de SEQ ID NO: 331.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 344; una CDR2 de SEQ ID NO: 345; una CDR3 de SEQ ID NO: 346; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 347; una CDR2 de SEQ ID NO: 348; y una CDR3 de SEQ ID NO: 349.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 362; una CDR2 de SEQ ID NO: 363; una CDR3 de SEQ ID NO: 364; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 365; una CDR2 de SEQ ID NO: 366; y una CDR3 de SEQ ID NO: 367.
En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO. 15 y VL de SEQ ID NO: 14. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 33 y VL de SEQ ID NO: 32. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 51 y VL de SEQ ID NO: 50. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 69 y VL de SEQ ID NO: 68. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 87 y VL de SEQ ID NO: 86. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de s Eq ID NO: 105 y VL de SEQ ID NO: 104. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 123 y VL de SEQ ID NO: 122. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de s Eq ID NO: 141 y VL de SEQ ID NO: 140. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 159 y VL de SEQ ID NO: 158. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 177 y VL de SEQ ID NO: 176. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 195 y VL de SEQ ID NO: 194. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 213 y VL de SEQ ID NO: 212. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 231 y VL de SEQ ID NO: 230. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 249 y VL de SEQ ID NO: 248. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 267 y VL de SEQ ID NO: 266. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de s Eq ID NO: 285 y VL de SEQ ID NO: 284. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 303 y VL de SEQ ID NO: 302. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 321 y VL de SEQ ID NO: 320. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 339 y VL de SEQ ID NO: 338. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 357 y VL de SEQ ID NO: 356. En una realización específica, un anticuerpo que se une a HER3 comprende una VH de SEQ ID NO: 375 y VL de SEQ ID NO: 374. En una realización, los anticuerpos contra HER3 son anticuerpos antagonistas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une a HER3 es un anticuerpo descrito en la tabla 1.
Según se usa en este documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera o cadenas pesadas o ligeras de longitud completa que son "el producto de" o "derivadas de" una secuencia de la línea germinal particular si las regiones variables o las cadenas de longitud completa del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Dichos sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o cribar una genoteca de inmunoglobulina humana expresada en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana se puede identificar como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con la secuencia de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana y eligiendo la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana más próxima en secuencia (es decir, mayor % de identidad) con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas que se producen naturalmente o introducción intencional de mutaciones de sitio dirigido. Sin embargo, en las regiones marco de VH o VL, un anticuerpo humano seleccionado es habitualmente al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican al anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal múrida). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 60%, 70%, 80%, 90% o al menos 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Habitualmente, un anticuerpo humano recombinante tendrá no más de 10 diferencias de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en las regiones marco de VH o VL. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede tener no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. En la tabla 2, se muestran diferentes versiones germinadas que usan las secuencias de la línea germinal de VH y VL para un número representativo de anticuerpos contra HER3, usando Kabat. Las posiciones de CDR se resaltan en negrita. La notación utilizada en las tablas con secuencias germinadas es la siguiente: MOR10701-VH_3-07 significa bucles CDR de MOR10701 en regiones marco de la secuencia 3-07 de VH de la línea germinal (la nomenclatura es de acuerdo con Vbase), MOR10703-VK_L1 significa CDR de MOR10703 en regiones marco de la línea germinal de VK_L1, donde VK es la cadena ligera kappa.
T l 2: Dif r n v r i n rmin n n m r l i n n i r r r n iv
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Tabla 3: Se mentos JH
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Tabla 4: Se mentos JK
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Se puede usar cualquier combinación de secuencias de VH germinadas con segmentos JH. Los ejemplos representativos de las combinaciones se muestran en la tabla 5.
T l : E m l r r n iv m in i n n i VH rmin n m n H.
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Se puede usar cualquier combinación de secuencias de VL germinadas con segmentos JK. Los ejemplos representativos de las combinaciones se muestran en la tabla 6.
T l : E m l r r n iv m in i n n i VK rmin n m n K.
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Una vez que se ha combinado VH con JH y VK con JK, entonces se puede usar cualquier combinación de VH o JH con VK o JK. En una realización, cualquiera de las regiones de VH germinadas se puede combinar con cualquiera de las regiones germinadas (VL) por VK para cualquier anticuerpo. Un número representativo de ejemplos de combinaciones se muestra en la tabla 7.
T l 7: E m l r r n iv m in i n n i rmin
Figure imgf000060_0003
Figure imgf000061_0001
En una realización, la divulgación se refiere a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de Xaa1-HCDR1-Xaa2-HCDR2-Xaa3-HCDR3-Xaa4 donde las HCDR1, HCDR2, HCDR3 de cadena pesada son cualquiera de las CDR de cadena pesada elegidas de las tablas 1 y 2. Solo con fines ilustrativos, la secuencia puede ser:
Xaa1 - SYAMS - Xaa2 - AINSQGKSTYYADSVKG - Xaa3 - WGDEGFDI - Xaa4 (SEQ ID NO: 493), donde,
Xaai es una región marco de 30 aminoácidos cualesquiera;
Xaa2 es una región marco de 14 aminoácidos cualesquiera;
Xaa3 es una región marco de 32 aminoácidos cualesquiera;
Xaa4 es una región marco de 11 aminoácidos cualesquiera;
En una realización, la divulgación se refiere a una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de Xaa1-LCDR1-Xaa2-LCDR2-Xaa3-LCDR3-Xaa4, donde las LCDR1, LCDR2, LCDR3 son cualquiera de las CDR de cadena ligera elegidas de las tablas 1 y 2. Solo con fines ilustrativos, la secuencia puede ser:
Xaa1 - RASQGISNWLA - Xaa2 - GASSLQS - Xaaa - QQYSSFPTT - Xaa4 (SEQ ID NO: 494), donde,
Xaa1 es una región marco de 23 aminoácidos cualesquiera;
Xaa2 es una región marco de 15 aminoácidos cualesquiera;
Xaa3 es una región marco de 32 aminoácidos cualesquiera; y
Xaa4 es una región marco de 10 aminoácidos cualesquiera.
Los anticuerpos dados a conocer en este documento pueden ser derivados de anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, anticuerpos de dominio, nanocuerpos y unicuerpos. Un "anticuerpo monocatenario" (scFv) consiste en una sola cadena polipeptídica que comprende un dominio VL enlazado a un dominio VH, en donde el dominio VL y el dominio VH se aparean para formar una molécula monovalente. Un anticuerpo monocatenario se puede preparar de acuerdo con métodos conocidos en el área (véanse, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Un ''diacuerpo'' consta de dos cadenas, cada cadena comprende una región variable de cadena pesada conectada a una región variable de cadena ligera en la misma cadena polipeptídica conectada por un conector peptídico corto, en donde las dos regiones de la misma cadena no se aparean entre sí sino con dominios complementarios en la otra cadena para formar una molécula biespecífica. Los métodos para preparar diacuerpos son conocidos en el área (véanse, por ejemplo, Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, y Poljak et al., (1994) Structure 2:1121-1123). Los anticuerpos de dominio (dAb) son unidades de unión funcionales pequeñas de anticuerpos, correspondientes a las regiones variables de las cadenas pesada o ligera de los anticuerpos. Los anticuerpos de dominio se expresan bien en sistemas celulares bacterianos, de levadura y de mamífero. Se conocen en el área más detalles de los anticuerpos de dominio y métodos de producción de los mismos (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; las patentes europeas 0368684 y 0616640; los documentos WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609. Los nanocuerpos se derivan de las cadenas pesadas de un anticuerpo. Habitualmente un nanocuerpo comprende un solo dominio variable y dos dominios constantes (CH2 y CH3) y mantiene la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo original. Los nanocuerpos se pueden preparar por métodos conocidos en el área (véanse por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6,765,087, la patente de Estados Unidos N°6,838,254 y el documento WO 06/079372). Los unicuerpos consisten en una cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo IgG4. Los unicuerpos también se pueden preparar por eliminación de la región bisagra de los anticuerpos IgG4. Más detalles de los unicuerpos y métodos para prepararlos se pueden encontrar en WO2007/059782.
Anticuerpos homólogos
Aún en otra realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias descritas en la tabla 1, y dicho anticuerpo se une a una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo), y mantiene las propiedades funcionales deseadas de esos anticuerpos descritos en la tabla 1.
Por ejemplo, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado (o un fragmento funcional del mismo) que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 33, 51, 69, 87, 105, 123, 141, 159, 177, 195, 213, 231, 249, 267, 285, 303, 321, 339, 357, y 375; la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356 y 374; el anticuerpo se une a HER3 (por ejemplo, He R3 humana y/o de cinomólogo) y neutraliza la actividad de señalización de HER3, que se puede medir en un ensayo de fosforilación u otra medición de la señalización mediada por HER (por ejemplo, ensayos fosfo-HER3, ensayos fosfo-Akt, ensayos de proliferación celular y de bloqueo de ligando según se describen en los Ejemplos). También se incluyen dentro del alcance de la divulgación las secuencias de nucleótidos parentales de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera; y las secuencias de cadenas pesadas y ligeras de longitud completa optimizadas para la expresión en una célula de mamífero. Otros anticuerpos de la divulgación incluyen aminoácidos o ácidos nucleicos que han sido mutados, pero que aún tienen al menos 60, 70, 80, 90, 95 o 98% de identidad con las secuencias descritas antes. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no se han mutado más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos por deleción, inserción o sustitución de aminoácidos en las regiones variables en comparación con las regiones variables representadas en la secuencia descrita precedentemente.
En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias expuestas en la tabla 1. En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser idénticas excepto por una sustitución de aminoácido en no más de 1,2, 3, 4 o 5 posiciones de aminoácidos. Se puede obtener un anticuerpo que tenga regiones VH y VL con alta identidad (es decir, 80% o mayor) con las regiones VH y VL de los anticuerpos descritos en la tabla 1 por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido o mediada por PCR), seguido de la prueba del anticuerpo alterado codificado para la función conservada usando los ensayos funcionales descritos en este documento.
En otras realizaciones, las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera pueden ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias establecidas precedentemente.
Según se usa en este documento, el "porcentaje de identidad" entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad es igual al número de posiciones idénticas/el número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que se debe introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes siguientes.
Además o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente divulgación se pueden usar además como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Por ejemplo, dichas búsquedas se pueden realizar usando el programa BLAST (versión 2.0) de Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
Anticuerpos con modificaciones conservadoras
En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la divulgación tiene una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias CDR tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en este documento o modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos mantienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a HER3 de la divulgación.
Por consiguiente, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal contra HER3 aislado, o un fragmento del mismo, que consta de una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en donde: las secuencias de aminoácidos CDR1 de la región variable de la cadena pesada se eligen del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368, y sus modificaciones conservadoras; las secuencias de aminoácidos CDR2 de la región variable de la cadena pesada se eligen del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291,297, 309, 315, 327, 333, 345, 351,363, y 369 y sus modificaciones conservadoras; las secuencias de aminoácidos CDR3 de la región variable de la cadena pesada se eligen del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370 y sus modificaciones conservadoras; las secuencias de aminoácidos CDR1 de la región variable de la cadena ligera se eligen del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, 11,23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221,227, 239, 245, 257, 263, 275, 281,293, 299, 311,317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371 y sus modificaciones conservadoras; las secuencias de aminoácidos CDR2 de la región variable de la cadena ligera se eligen del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372, y sus modificaciones conservadoras; las secuencias de aminoácidos CDR3 de la región variable de la cadena ligera se eligen del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31,43, 49, 61,67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, y 373, y sus modificaciones conservadoras; el anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a HER3, y neutraliza la actividad de HER3 al inhibir una vía de señalización mediada por HER, lo que se puede medir en un ensayo de fosforilación u otra medición de la señalización mediada por HER (por ejemplo, ensayos fosfo-HER3, ensayos fosfo-Akt, ensayos de proliferación celular y de bloqueo de ligando según se describen en los Ejemplos).
Anticuerpos que se unen al mismo epítopo
La presente divulgación proporciona anticuerpos que interactúan (por ejemplo, mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) con el mismo epítopo que los anticuerpos de unión a HER3 descritos en la tabla 1 y la figura 7. Por lo tanto, los anticuerpos adicionales se pueden identificar en función de su capacidad para competir de forma cruzada (p. ej., inhibir competitivamente la unión de, de una manera estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la divulgación en ensayos de unión a HER3. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de los anticuerpos de la presente divulgación a una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo) demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo en la unión a HER3; dicho anticuerpo puede, según una teoría no limitante, unirse al mismo epítopo o a uno relacionado (p. ej., estructuralmente similar o espacialmente proximal) en la proteína HER3 como el anticuerpo con el que compite. En una determinada realización, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en HER3 que los anticuerpos de la presente divulgación es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en este documento.
En una realización, el anticuerpo o fragmentos del mismo se unen tanto al dominio 2 como al dominio 4 de HER3 para mantener a HER3 en una conformación inactiva que evita la exposición de un bucle de dimerización presente dentro del dominio 2. Esto evita la heterodimerización con otros miembros de la familia, como HER1, HER2 y HER4. Los anticuerpos o sus fragmentos inhiben la transducción de señales de HER3 tanto dependiente de ligando como independiente de ligando.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al dominio 2 y al dominio 4 de HER3 y sin bloquear la unión concurrente de un ligando de HER3 tal como neuregulina. Si bien no es necesario proporcionar una teoría, es factible que el anticuerpo o fragmento del mismo que se une tanto al dominio 2 como al dominio 4 de HER3 mantenga a HER3 en una conformación inactiva sin bloquear el sitio de unión al ligando en HER3. Por lo tanto, un ligando de HER3 (por ejemplo, neuregulina) se puede unir a HER3 al mismo tiempo que el anticuerpo o fragmento del mismo.
Los anticuerpos de la divulgación o sus fragmentos inhiben la activación de HER3 tanto dependiente como independiente de ligando sin evitar la unión del ligando. Esto se considera ventajoso por las razones siguientes:
(i) El anticuerpo terapéutico tendría utilidad clínica en un espectro más amplio de tumores que un anticuerpo dirigido a un único mecanismo de activación de HER3 (es decir, dependiente del ligando o independiente del ligando) ya que cada mecanismo impulsa distintos tipos de tumores.
(ii) El anticuerpo terapéutico sería eficaz en tipos de tumores en los que ambos mecanismos de activación de HER3 están implicados simultáneamente. Un anticuerpo dirigido a un único mecanismo de activación de HER3 (es decir, dependiente de ligando o independiente de ligando) tendría poca o ninguna eficacia sobre esos tipos de tumores.
(iii) La eficacia de un anticuerpo que inhibe la activación de HER3 dependiente de ligando sin evitar la unión del ligando sería menos probable que se viera afectada negativamente por el aumento de las concentraciones del ligando. Esto se traduciría en una mayor eficacia sobre un tipo de tumor impulsado por concentraciones muy altas del ligando de HER3 o en una reducción en la capacidad de resistencia a los fármacos cuando la resistencia es mediada por el aumento de los ligandos de HER3.
(iv) Un anticuerpo que inhibe la activación de HER3 al estabilizar la forma inactiva sería menos propenso a la resistencia a los fármacos impulsada por mecanismos alternativos de activación de HER3.
En consecuencia, los anticuerpos de la divulgación se pueden usar para tratar afecciones en las que los anticuerpos terapéuticos existentes son clínicamente ineficaces.
Anticuerpos producidos y modificados por genomanipulación
Un anticuerpo de la divulgación se puede preparar además usando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias de VH y/o VL que se muestran en este documento como material de partida para producir por genomanipulación un anticuerpo modificado, donde dicho anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas respecto al anticuerpo de partida. Se puede producir un anticuerpo por genomanipulación, modificando uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. Adicional o alternativamente, un anticuerpo se puede producir por genomanipulación modificando residuos dentro de la región o regiones constantes, por ejemplo para alterar la función o funciones efectoras del anticuerpo.
Un tipo de genomanipulación de la región variable que se puede realizar es el injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con los antígenos diana predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se encuentran en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las cadenas pesadas y ligeras. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpoantígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de los anticuerpos de origen natural específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias CDR del anticuerpo de origen natural específico injertadas en las secuencias marco de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véanse, por ejemplo, Riechmann et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen etal., (1989) Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; la patente de Estados Unidos. N° 5,225,539 para Winter, y las patentes de Estados Unidos N° 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al.)
Por consiguiente, otra realización de la divulgación se refiere a un anticuerpo monoclonal de unión a HER3 aislado, o un fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las s Eq ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368; secuencias CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 9, 21,27, 39, 45, 57, 63, 75, 81,93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, y 369; secuencias CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370, respectivamente; y una región variable de cadena ligera que tiene secuencias CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, 11,23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371; secuencias CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372; y secuencias CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SeQ ID NO: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61,67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, y 373, respectivamente. Por lo tanto, dichos anticuerpos contienen las secuencias CDR de VH y VL de anticuerpos monoclonales, pero pueden contener diferentes secuencias marco de estos anticuerpos. Dichas secuencias marco se pueden obtener de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras humanas se pueden encontrar en la base de datos de la secuencia de la línea germinal humana "Vase" (disponible en Internet en www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH N° 91-3242; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol.
196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; and Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948; Tomlinson et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox et al., (1994) Eur. J Immunol. 24:827-836
Un ejemplo de secuencias marco para usar en los anticuerpos de la divulgación son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco utilizadas por anticuerpos seleccionados de la divulgación, por ejemplo, secuencias de consenso y/o secuencias marco utilizadas por los anticuerpos monoclonales de la divulgación. Las secuencias CDR1,2 y 3 de VH y las secuencias CDR1,2 y 3 de VL se pueden injertar en regiones marco que tienen la secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal de la que deriva la secuencia marco, o las secuencias CDR se pueden injertar en regiones marco que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que, en ciertos casos, es beneficioso mutar los residuos dentro de las regiones marco para mantener o mejorar la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al).
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VL para mejorar así una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés, conocida como "maduración por afinidad". Se puede realizar mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis mediada por PCR para introducir la mutación o mutaciones, y el efecto sobre la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, se puede evaluar en ensayos in vitro o in vivo según se describe en este documento y se proporciona en los Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se trató antes). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Además, habitualmente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR.
Por consiguiente, en otra realización, la divulgación proporciona anticuerpos monoclonales de unión a HER3 aislados, o fragmentos de los mismos, que constan de una región variable de cadena pesada que tiene: una región CDR1 de VH que consiste en una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que tiene las SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134,146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368; una región CDR2 de VH que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SeQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351,363, y 369 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201,207, 219, 225, 237, 243, 255, 261,273, 279, 291,297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, y 369; una región CDR3 de VH que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID n O: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370; una región CDR1 de VL que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 11, 23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191,203, 209, 221,227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311,317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 5, 11,23, 29, 41,47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281,293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371; una región CDR2 de VL que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372; y una región CDR3 de VL que tiene una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31,43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, y 373, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31,43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 135, 139, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301,313, 319, 331, 337, 349, 355, 367, y 373.
Injerto de fragmentos de anticuerpos en marcos o andamios alternativos
Se puede emplear una amplia variedad de marcos o andamios de anticuerpos/inmunoglobulinas siempre que el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que se una específicamente a HER3. Dichos marcos o andamios incluyen los 5 idiotipos principales de inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de las mismas, e incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, preferentemente que tengan aspectos humanizados. Nuevos marcos, andamios y fragmentos continúan siendo descubiertos y desarrollados por los expertos en la materia.
En un aspecto, la divulgación se refiere a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulina usando andamios no inmunoglobulínicos en los que se pueden injertar las CDR de la divulgación. Se pueden emplear marcos y andamios no inmunoglobulínicos conocidos o futuros, siempre que comprendan una región de unión específica para la proteína HER3 diana (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo). Los marcos o andamios no inmunoglobulínicos conocidos incluyen, entre otros, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), inmunofármacos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), proteína A (Affibody AG, Suecia) y afilina (gamma-cristalinina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania). Los andamios de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina tipo III (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronectina tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta que se distribuyen entre dos hojas beta, que se empaquetan entre sí para formar el centro de la proteína, y además contienen bucles (análogos a las CDR) que conectan las cadenas beta entre sí y están expuestos a solventes. Hay al menos tres de estos bucles en cada borde del sándwich de la hoja beta, donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase el documento US 6,818,418). Estos andamios a base de fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el pliegue general está estrechamente relacionado con el del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende la unidad de reconocimiento del antígeno completa en IgG de camello y llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo no inmunoglobulínico imita propiedades de unión al antígeno que son similares en naturaleza y afinidad a las de los anticuerpos. Estos andamios se pueden usar en una estrategia de aleatorización y barajado de bucles in vitro que es similar al proceso de maduración por afinidad de los anticuerpos in vivo. Estas moléculas a base de fibronectina se pueden usar como andamios donde las regiones bucle de la molécula se pueden reemplazar con las CDR de la divulgación usando técnicas de clonación estándar.
La tecnología de anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos de repetición derivados de anquirina como andamios para soportar regiones variables que se pueden usar para unirse a diferentes dianas. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consta de dos hélices a antiparalelas y un giro p. La unión de las regiones variables se optimiza principalmente mediante el uso de expresión en ribosomas.
Los avímeros se derivan de la proteína que contiene el dominio A natural tal como HER3. Estos dominios son utilizados por la naturaleza para las interacciones proteína-proteína y en humanos más de 250 proteínas se basan estructuralmente en dominios A. Los avímeros consisten en varios monómeros diferentes de "dominio A" (2-10) unidos a través de conectores de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que se puedan unir al antígeno diana utilizando la metodología descrita, por ejemplo, en las publicaciones de las patentes de Estados Unidos N° 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.
Los ligandos de afinidad afficuerpos son proteínas simples y pequeñas compuestas por un haz de tres hélices basado en el andamio de uno de los dominios de unión a IgG de la proteína A. La proteína A es una proteína de superficie de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de andamio consta de 58 aminoácidos, 13 de los cuales se asignan al azar para generar bibliotecas de afficuerpos con una gran cantidad de variantes de ligandos (véase, por ejemplo, el documento US 5,831,012). Las moléculas de afficuerpos imitan anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, en comparación con el peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de unión de las moléculas de afficuerpos es similar al de un anticuerpo.
Las anticalinas son productos desarrollados por la compañía Pieris ProteoLab AG. Se derivan de las lipocalinas, un grupo extenso de proteínas pequeñas y robustas que generalmente están involucradas en el transporte o almacenamiento fisiológicos de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Varias lipocalinas naturales se encuentran en tejidos humanos o líquidos corporales. La arquitectura de la proteína recuerda a las inmunoglobulinas, con bucles hipervariables en la parte superior de un marco rígido. Sin embargo, en contraste con los anticuerpos o sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas por una cadena polipeptídica única con 160 a 180 residuos de aminoácidos, que son marginalmente más grandes que un solo dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro bucles, que constituye el bolsillo de unión, muestra una plasticidad estructural pronunciada y tolera una variedad de cadenas laterales. De este modo, el sitio de unión se puede remodelar en un proceso patentado para reconocer moléculas diana prescritas de diferente forma, con altas afinidad y especificidad. Se ha utilizado una proteína de la familia de las lipocalinas, la proteína de unión a la bilina (BBP) de Pieris brassicae, para desarrollar anticalinas por mutagénesis del conjunto de cuatro bucles. Un ejemplo de una publicación de patente que describe anticalinas es la publicación PCT N° WO 199916873.
Las moléculas de afilina son pequeñas proteínas no inmunoglobulínicas que están diseñadas para afinidades específicas frente a proteínas y moléculas pequeñas. Se pueden seleccionar muy rápidamente nuevas moléculas de afilina de dos bibliotecas, cada una de las cuales se basa en una proteína andamio diferente derivada de humanos. Las moléculas de afilina no muestran ninguna homología estructural con las proteínas inmunoglobulinas. Actualmente, se emplean dos andamios de afilina, uno de los cuales es cristalina gamma, una proteína estructural del cristalino del ojo humano y el otro es proteínas de la superfamilia de "ubiquitina". Ambos andamios humanos son muy pequeños, muestran estabilidad a altas temperaturas y son casi resistentes a los cambios de pH y agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de hoja beta expandida de las proteínas. En el documento WO200104144 se describen ejemplos de proteínas derivadas de la cristalina gamma y en el documento WO2004106368 se describen ejemplos de proteínas "tipo ubiquitina".
Los miméticos de epítopos de proteínas (PEM) son moléculas tipo péptido, cíclicas, de tamaño mediano (PM 1 -2kDa), que imitan las estructuras secundarias horquilla beta de las proteínas, la principal estructura secundaria implicada en las interacciones proteína-proteína.
En algunas realizaciones, los Fab se convierten al formato IgG1 silenciosa cambiando la región Fc. Por ejemplo, los anticuerpos de la tabla 1 se pueden convertir al formato IgG.
Anticuerpos humanos o humanizados
La presente divulgación proporciona anticuerpos completamente humanos que se unen específicamente a una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo/ratón/rata). En comparación con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos de unión a HER3 humanos de la divulgación tienen una antigenicidad más reducida cuando se administran a sujetos humanos.
Los anticuerpos de unión a HER3 humanos se pueden generar empleando métodos que son conocidos en el área. Por ejemplo, la tecnología de humanización utilizada para convertir anticuerpos no humanos en anticuerpos humanos producidos por genomanipulación. La publicación de la patente de Estados Unidos N° 20050008625 describe un método in vivo para reemplazar en un anticuerpo una región variable de un anticuerpo no humano con una región variable humana manteniendo las mismas características de unión o proporcionando mejores características de unión en relación con las del anticuerpo no humano. El método se basa en el reemplazo guiado por epítopo de regiones variables de un anticuerpo de referencia no humano con un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo humano resultante generalmente no está relacionado estructuralmente con el anticuerpo no humano de referencia, pero se une al mismo epítopo en el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. En resumen, el método en serie de reemplazo de complementariedad guiado por epítopo se habilita mediante la creación de una competencia en las células entre un "competidor" y una biblioteca de diversos híbridos del anticuerpo de referencia ("anticuerpos de prueba") en la unión a cantidades limitantes de antígeno en presencia de un sistema reportero que responde a la unión del anticuerpo de prueba al antígeno. El competidor puede ser el anticuerpo de referencia o derivado del mismo, como un fragmento Fv monocatenario. El competidor también puede ser un ligando natural o artificial del antígeno que se une al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. Los únicos requisitos del competidor son que se una al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y que compita con el anticuerpo de referencia por la unión al antígeno. Los anticuerpos de prueba tienen una región V de unión al antígeno en común del anticuerpo de referencia no humano, y la otra región V elegida al azar de una fuente diversa tal como una biblioteca de repertorio de anticuerpos humanos. La región V común del anticuerpo de referencia sirve como guía, colocando los anticuerpos de prueba en el mismo epítopo en el antígeno y en la misma orientación, de modo que la selección esté sesgada hacia la mayor fidelidad de unión del antígeno al anticuerpo de referencia.
Se pueden usar muchos tipos de sistema reportero para detectar las interacciones deseadas entre los anticuerpos de prueba y el antígeno. Por ejemplo, los fragmentos reporteros complementarios pueden estar unidos al antígeno y al anticuerpo de prueba, respectivamente, de modo que la activación del reportero por complementación de fragmentos solo se produce cuando el anticuerpo de prueba se une al antígeno. Cuando las fusiones de anticuerpo de prueba- y antígeno-fragmento reportero se coexpresan con un competidor, la activación del reportero se vuelve dependiente de la capacidad del anticuerpo de prueba para competir con el competidor, que es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno. Otros sistemas reporteros que se pueden usar incluyen el reactivador de un sistema de reactivación autoinhibida del reportero (RAIR) como el dado a conocer en la publicación de patente de Estados Unidos N° 20030198971, o el sistema de activación competitivo dado a conocer en la publicación de patente Estados Unidos N220030157579.
Con el sistema en serie de reemplazo de complementariedad guiado por epítopo, se realiza una selección para identificar células que expresen un único anticuerpo de prueba junto con los componentes competidor, antígeno y reportero. En estas células, cada anticuerpo de prueba compite uno a uno con el competidor por la unión a una cantidad limitante de antígeno. La actividad del reportero es proporcional a la cantidad de antígeno unido al anticuerpo de prueba, que a su vez es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno y la estabilidad del anticuerpo de prueba. Los anticuerpos de prueba se seleccionan inicialmente en función de su actividad con respecto a la del anticuerpo de referencia cuando se expresan como el anticuerpo de prueba. El resultado de la primera ronda de selección es un conjunto de anticuerpos "híbridos", cada uno de los cuales está compuesto por la misma región V no humana del anticuerpo de referencia y una región V humana de la biblioteca, y cada uno de los cuales se une al mismo epítopo en el antígeno que el anticuerpo de referencia. Uno de los anticuerpos híbridos más seleccionados en la primera ronda tendrá una afinidad por el antígeno comparable o superior a la del anticuerpo de referencia.
En el segundo paso de reemplazo de la región V, las regiones V humanas seleccionadas en el primer paso se usan como guía para la selección de reemplazos humanos para la región V restante del anticuerpo de referencia no humano con una biblioteca diversa de regiones V humanas afines. Los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda también se pueden usar como competidores para la segunda ronda de selección. El resultado de la segunda ronda de selección es un conjunto de anticuerpos completamente humanos que difieren estructuralmente del anticuerpo de referencia, pero que compiten con el anticuerpo de referencia por la unión al mismo antígeno. Algunos de los anticuerpos humanos seleccionados se unen al mismo epítopo en el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. Entre estos anticuerpos humanos seleccionados, uno o más se unen al mismo epítopo con una afinidad que es similar o superior a la del anticuerpo de referencia.
Utilizando uno de los anticuerpos de unión a HER3 quiméricos o de ratón descritos antes como el anticuerpo de referencia, este método se puede emplear fácilmente para generar anticuerpos humanos que se unan a HER3 humana con la misma especificidad de unión y la misma o mejor afinidad de unión. Además, dichos anticuerpos de unión a HER3 humanos también se pueden obtener comercialmente de compañías que habitualmente producen anticuerpos humanos, por ejemplo, KaloBios, Inc. (Mountain View, CA).
Anticuerpos de camélidos
Las proteínas anticuerpos obtenidas de miembros de la familia de camellos y dromedarios (Camelus bactrianus y Calelus dromaderius) que incluyen nuevos miembros mundiales como la especie llama (Lama paccos, Lama glama y Lama vicugna) se han caracterizado con respecto al tamaño, la complejidad estructural y la antigenicidad para sujetos humanos. Ciertos anticuerpos IgG de esta familia de mamíferos que se encuentran en la naturaleza carecen de cadenas ligeras y, por lo tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, para anticuerpos de otros animales. Véase el documento WO 94/04678 publicado el 3 de marzo de 1994.
Se puede obtener una región del anticuerpo de camélido que es el pequeño dominio variable único identificado como VHH por genomanipulación para producir una proteína pequeña con una alta afinidad por una diana, lo que da como resultado una proteína derivada de anticuerpo, de bajo peso molecular, conocida como "nanocuerpo de camélido". Véase la patente de Estados Unidos N° 5,759,808 emitida el 2 de junio de 1998; véanse también Stijlemans et al., (2004) J Biol Chem 279:1256-1261; Dumoulin et al., (2003) Nature 424:783-788; Pleschberger et a l, (2003) Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo et al., (2002) Int J Cancer 89:456-62; y Lauwereys et al., (1998) EMBO J 17:3512-3520. Se dispone de bibliotecas producidas genéticamente de anticuerpos de camélidos y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, de Ablynx, Gante, Bélgica. (por ej., US20060115470; Domantis (US20070065440, US20090148434). Al igual que con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido se puede alterar por genomanipulación para obtener una secuencia que se parezca más a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo se puede "humanizar". Por lo tanto, la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélidos para humanos se puede reducir aún más.
El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte del de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solo unos pocos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélidos para unirse a sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para las proteínas anticuerpos más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélidos son útiles como reactivos que detectan antígenos que de otro modo son crípticos, utilizando técnicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por lo tanto, otra consecuencia del pequeño tamaño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir como resultado de la unión a un sitio específico en un surco o hendidura estrecha de una proteína diana, y por consiguiente puede servir con una habilidad que se asemeja más a la función de un fármaco clásico de bajo peso molecular que a la de un anticuerpo clásico.
El bajo peso molecular y el tamaño compacto dan como resultado además que los nanocuerpos de camélidos sean extremadamente termoestables, estables a pH extremo y a la digestión proteolítica, y poco antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélidos se mueven fácilmente del sistema circulatorio a los tejidos e incluso cruzan la barrera hematoencefálica y pueden tratar trastornos que afectan al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar aún más el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la publicación de patente de Estados Unidos N° 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características combinadas con la baja antigenicidad para los humanos indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas se pueden expresar completamente en células procariotas como E. co liy se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos y son funcionales.
Por consiguiente, una característica de la presente divulgación es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido con una alta afinidad por HER3. En ciertas realizaciones de este documento, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce naturalmente en el animal camélido, es decir, es producido por el camélido después de la inmunización con HER3 o un fragmento peptídico del mismo, usando técnicas descritas en este documento para otros anticuerpos. Alternativamente, el nanocuerpo de camélido de unión a HER3 es producido genéticamente, es decir, producido por selección, por ejemplo, a partir de una biblioteca de fagos que expresan proteínas nanocuerpos de camélido mutagenizadas apropiadamente usando procedimientos de panning (selección por afinidad) con HER3 como diana como se describe en los ejemplos de este documento. Los nanocuerpos genomanipulados se pueden personalizar aún más mediante genomanipulación para que tengan una vida media en un sujeto receptor de 45 minutos a dos semanas. En una realización específica, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene injertando las secuencias CDR de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la divulgación en secuencias marco de nanocuerpo o anticuerpo de dominio único, como se describe, por ejemplo, en el documento WO1994/004678. En una realización, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se une al menos a uno de los residuos de HER3 siguientes: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271, Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571, Pro583, His584, Ala596, Lys597. En una realización, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se une al menos a uno de los residuos de HER3 siguientes: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611, Pro612, Cys613, His614, Glu615.
Moléculas biespecíficas y anticuerpos multivalentes
En otro aspecto, la presente divulgación presenta moléculas biparatópicas, biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo de unión a HER3, o un fragmento del mismo, de la divulgación. Un anticuerpo de la divulgación, o fragmentos del mismo, se pueden derivatizar o unir a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se una al menos a dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. De hecho, el anticuerpo de la divulgación se puede derivatizar o unir a más de otra molécula funcional para generar moléculas biparatópicas o multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; tal como moléculas biparatópicas o multiespecíficas. Para crear una molécula biespecífica de la divulgación, un anticuerpo de la divulgación se puede unir funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra manera) a una o más moléculas de unión, como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que resulte una molécula biespecífica.
Se pueden proporcionar beneficios clínicos adicionales mediante la unión de dos o más antígenos con un anticuerpo (Coloma et al., (1997); Merchant et al., (1998); Alt et al., (1999); Zuo et al., (2000); Lu et al., (2004); Lu et al., (2005); Marvin et al., (2005); Marvin et al., (2006); Shen et al., (2007); Wu et al., (2007); Dimasi et al., (2009); Michaelson et al., (2009)). (Morrison et al., (1997) Nature Biotech. 15:159-163; Alt et al. (1999) FEBS Letters 454:90-94; Zuo et al., (2000) Protein Engineering 13:361-367; Lu et al., (2004) JBC 279:2856-2865; Lu et al., (2005) JBC 280:19665-19672; Marvin et al., (2005) Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658; Marvin et al., (2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9:184-193; Shen et al., (2007) J Immun Methods 218:65-74; Wu et al., (2007) Nat Biotechnol. 11:1290-1297; Dimasi et al., (2009) J Mol Biol. 393:672-692; y Michaelson et al., (2009) mAbs 1:128-141.
Las moléculas biespecíficas de la presente divulgación se pueden preparar conjugando las especificidades de unión del constituyente, usando métodos conocidos en el área. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica se puede generar por separado y después conjugar entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se pueden usar diversos agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véanse, por ejemplo, Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. N° 78:118-132; Brennan et al., (1985) Science 229:81 -83), y Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlaces sulfhidrilo de las regiones bisagra C-terminales de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región bisagra se modifica para que contenga un número impar de residuos sulfhidrilo, por ejemplo uno, antes de la conjugación.
Alternativamente, ambas especificidades de unión se pueden codificar en el mismo vector y expresar y ensamblar en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la divulgación puede ser una molécula monocatenaria que comprenda un anticuerpo monocatenario y un determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 5,260,203; la patente de Estados Unidos N° 5,455,030; la patente de Estados Unidos N° 4,881,175; la patente de Estados Unidos N° 5,132,405; la patente de Estados Unidos N° 5,091,513; la patente de Estados Unidos N° 5,476,786; la patente de Estados Unidos N° 5,013,653; la patente de Estados Unidos N° 5,258,498; y la patente de Estados Unidos N° 5,462,858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas se puede confirmar mediante, por ejemplo, un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o inmunotransferencia tipo Western. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos proteína-anticuerpo de particular interés mediante el empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona compuestos multivalentes que comprenden al menos dos fragmentos idénticos o diferentes de los anticuerpos de la divulgación que se unen a HER3. Los fragmentos de anticuerpos se pueden unir entre sí a través de la fusión de proteínas o enlace covalente o no covalente. Se pueden obtener compuestos tetravalentes por ejemplo mediante reticulación de anticuerpos de los anticuerpos de la divulgación con un anticuerpo que se une a las regiones constantes de los anticuerpos de la divulgación, por ejemplo la región Fc o la región bisagra. Se describen dominios de trimerización, por ejemplo, en la patente boreana EP 1012280B1. Se describen módulos de pentamerización, por ejemplo, en el documento WO1998/018943.
En una realización, una molecula biparatópica/biespecífica se une a residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 de HER3.
En otra realización, la divulgación se refiere a anticuerpos de doble función en los que se ha modificado un único anticuerpo monoclonal de modo que el sitio de unión al antígeno se una a más de un antígeno, tal como un anticuerpo de doble función que se une tanto a HER3 como a otro antígeno (por ejemplo, HER1, HER2 y HER4). En otra realización, la divulgación se refiere a un anticuerpo de doble función que se dirige a antígenos que tienen la misma conformación, por ejemplo, un antígeno que tiene la misma conformación de HER3 en el estado "cerrado" o "inactivo". Los ejemplos de antígenos con la misma conformación de HER3 en el estado "cerrado" o "inactivo" incluyen, entre otros, HER1 y HER4. Por lo tanto, un anticuerpo de doble función se puede unir tanto a HER3 como a HER1; HER3 y HER4, o HER1 y HER4. La especificidad de doble unión del anticuerpo de doble función se puede traducir además en doble actividad o inhibición de la actividad. (Véase, por ejemplo, Jenny Bostrom et al., (2009) Science: 323; 1610­ 1614).
Anticuerpos con vida media prolongada
La presente descripción proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la proteína HER3 que tienen una vida media prolongada in vivo.
Muchos factores pueden afectar la vida media de una proteína in vivo. Por ejemplo, la filtración renal, el metabolismo en el hígado, la degradación por enzimas proteolíticas (proteasas) y las respuestas inmunógenas (por ejemplo, neutralización de proteínas por anticuerpos y captación por macrófagos y células dentríticas). Se pueden usar diversas estrategias para prolongar la vida media de los anticuerpos de la presente divulgación. Por ejemplo, por enlace químico con polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, andamio de anticuerpo, ácido polisiálico (PSA), hidroxietilalmidón (HES), ligandos de unión a albúmina y protectores de carbohidratos; por fusión genética a proteínas que se unen a proteínas séricas, tales como albúmina, IgG, FcRn y transferrina; mediante el acoplamiento (genético o químico) a otros restos de unión que se unen a proteínas séricas, como nanocuerpos, Fab, DARPins, avímeros, afficuerpos y anticalinas; por fusión genética a rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de unión a albúmina y Fc; o por incorporación en nanovehículos, formulaciones de liberación lenta o dispositivos médicos.
Para prolongar la circulación sérica de anticuerpos in vivo, se pueden unir moléculas de polímeros inertes tales como PEG de alto peso molecular a los anticuerpos o un fragmento de los mismos, con o sin un conector multifuncional, ya sea a través de la conjugación en un sitio específico del PEG al extremo N- o C-terminal de los anticuerpos o a través de grupos épsilon-amino presentes en los residuos de lisina. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar generalmente con polietilenglicol (PEG), como un éster reactivo o un derivado aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento del anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de PEG (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo). Se pretende que el término "polietilenglicol", según se usa en este documento, englobe cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, tal como monoalcoxi- o ariloxi(C1-C10)polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo que se ha de pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Se utilizará la derivatización del polímero lineal o ramificado que da como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. El grado de conjugación se puede controlar estrechamente mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación apropiada de las moléculas de PEG a los anticuerpos. Se puede separar el PEG sin reaccionar de los conjugados anticuerpo-PEG mediante cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico. Los anticuerpos derivatizados con PEG se pueden analizar para determinar la actividad de unión así como la eficacia in vivo empleando métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en el presente documento. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en el área y se pueden aplicar a los anticuerpos de la divulgación. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0154316 por Nishimura et al. y EP 0401 384 por Ishikawa et al.
Otras tecnologías de pegilación modificadas incluyen la tecnología reconstituyente de ingeniería químicamente ortogonal dirigida (ReCODE PEG), que incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en proteínas biosintéticas a través de un sistema reconstituido que incluye ARNt sintetasa y ARNt. Esta tecnología permite la incorporación de más de 30 nuevos aminoácidos en proteínas biosintéticas en E. coli, levaduras y células de mamíferos. El ARNt incorpora un aminoácido no nativo en cualquier lugar donde se coloque un codón ámbar, convirtiendo el codón ámbar de un codón de parada en uno que señale la incorporación del aminoácido especificado químicamente.
También se puede usar tecnología de pegilación recombinante (rPEG) para extender la vida media sérica. Esta tecnología implica fusionar genéticamente una cola de proteína no estructurada de 300-600 aminoácidos con una proteína farmacéutica existente. Debido a que el peso molecular aparente de una cadena de proteína no estructurada de este tipo es aproximadamente 15 veces mayor que su peso molecular real, la vida media sérica de la proteína aumenta considerablemente. A diferencia de la PEGilación tradicional, que requiere conjugación química y repurificación, el proceso de fabricación se simplifica enormemente y el producto es homogéneo.
La polisialilación es otra tecnología que utiliza el ácido polisiálico polimérico natural (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de los péptidos y proteínas terapéuticos. El PSA es un polímero de ácido siálico (un azúcar). Cuando se usa para la administración de proteínas y péptidos terapéuticos, el ácido polisiálico proporciona un microambiente protector en la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación y evita que el sistema inmunitario la reconozca. El polímero PSA se encuentra naturalmente en el cuerpo humano. Fue adoptado por ciertas bacterias que evolucionaron durante millones de años para cubrir sus paredes con él. Estas bacterias naturalmente polisialiladas fueron capaces, en virtud de la imitación molecular, de hacer fracasar el sistema de defensa del cuerpo. El PSA, la última tecnología sigilosa de la naturaleza, se puede producir fácilmente a partir de dichas bacterias en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas. El PSA bacteriano es completamente no inmunógeno, incluso cuando está acoplado a proteínas, ya que es químicamente idéntico al PSA del cuerpo humano.
Otra tecnología incluye el uso de derivados de hidroxietilalmidón ("HES") unidos a anticuerpos. E1HES es un polímero natural modificado derivado del almidón de maíz ceroso y puede ser metabolizado por las enzimas corporales. Generalmente se administran soluciones de HES para sustituir el volumen sanguíneo deficiente y para mejorar las propiedades reológicas de la sangre. La hesilación de un anticuerpo permite la prolongación de la vida media en la circulación al aumentar la estabilidad de la molécula, así como al reducir la depuración renal, lo que resulta en una mayor actividad biológica. Al variar diferentes parámetros, como el peso molecular de HES, se puede personalizar una amplia gama de conjugados de anticuerpos HES.
Los anticuerpos que tienen una vida media aumentada in vivo también se pueden generar introduciendo una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión a FcRn del mismo (preferentemente un fragmento de dominio Fc o Fc bisagra). Véase, por ejemplo, la publicación internacional N°WO 98/23289; la publicación internacional N°WO 97/34631; y la patente de Estados Unidos N° 6,277,375.
Además, los anticuerpos se pueden conjugar con albúmina para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o tenga una vida media más larga in vivo. Las técnicas son bien conocidas en el área, véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales N° WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la patente europea N2 EP 413,622.
El anticuerpo HER3 o un fragmento del mismo también se puede fusionar con uno o más polipéptidos seroalbúmina humana (HSA), o una porción de la misma. HSA, una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura, es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero y también actúa como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. El papel de la albúmina como molécula vehículo y su naturaleza inerte son propiedades deseables para utilizarla como vehículo y transportador de polipéptidos in vivo. El uso de albúmina como componente de una proteína de fusión de albúmina como vehículo para diversas proteínas se ha sugerido en los documentos WO 93/15199, WO 93/15200 y EP 413622. También se ha propuesto el uso de fragmentos N-terminales de HSA para fusiones a polipéptidos (EP 399666). Por consiguiente, al fusionar o conjugar genética o químicamente los anticuerpos o fragmentos de los mismos con albúmina, se puede estabilizar o prolongar la vida útil y/o retener la actividad de la molécula durante largos períodos de tiempo en solución, in vitro y/o in vivo.
La fusión de la albúmina a otra proteína se puede lograr mediante manipulación genética, de modo que el ADN que codifica HSA, o un fragmento del mismo, se una al ADN que codifica la proteína. Después se transforma o transfecta un huésped adecuado con las secuencias de nucleótidos fusionadas, dispuestas de un modo en un plásmido adecuado como para expresar un polipéptido de fusión. La expresión se puede efectuar in vitro a partir, por ejemplo, de células procariotas o eucariotas, o in vivo, por ejemplo de un organismo transgénico. Se pueden encontrar otros métodos relacionados con las fusiones de HSA, por ejemplo, en los documentos WO 2001077137 y WO 200306007. En una realización específica, la expresión de la proteína de fusión se realiza en líneas celulares de mamífero, por ejemplo, líneas celulares CHO. La unión diferencial alterada de un anticuerpo a un receptor a pH bajo o alto también se contempla dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo se puede modificar de modo que permanezca unido a su receptor a un pH bajo, por ejemplo, el pH bajo dentro de un lisosoma, modificando el anticuerpo para que incluya aminoácidos adicionales como una histidina en una CDR del anticuerpo (véase, por ejemplo, Tomoyuki Igawa et al. (2010) Nature Biotechnology; 28, 1203-1207)
Conjugados de anticuerpos
La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a una proteína HER3 fusionada por recombinación genética o conjugada químicamente (incluidas conjugaciones covalentes y no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o uno de sus fragmentos, preferentemente a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR de VH, un dominio VL o una CDR de VL) y una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. Los métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos o péptidos con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos en el área. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 y y 5,112,946; las patentes europeas N° EP 307.434 y EP 367.166; las publicaciones internacionales N°wO 96/04388 y Wo 91/06570; Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng et al., (1995) J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.
Se pueden generar proteínas de fusión adicionales a través de las técnicas de barajado de genes, barajado de motivos, barajado de exones y/o barajado de codones (denominadas colectivamente "barajado de ADN"). Se puede emplear el barajado de ADN para alterar las actividades de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con afinidades más altas y tasas de disociación más bajas). Véanse, en general, las patentes de Estados Unidos N° 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, and 5,837,458; Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308-313. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, se pueden alterar al ser sometidos a mutagénesis aleatoria por PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos, antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína HER3 se puede recombinar con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden fusionar con secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como el marcador provisto en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, entre otros, el marcador hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe (Wilson et al., (1984) Cell 37:767), y el marcador "flag".
En otras realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación o fragmentos de los mismos se conjugan con un agente de diagnóstico o detectable. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para monitorear o pronosticar el inicio, el desarrollo, el empeoramiento y/o la gravedad de una enfermedad o un trastorno como parte de un procedimiento de análisis clínico, tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Dichos diagnóstico y detección se pueden lograr mediante el acoplamiento del anticuerpo a sustancias detectables que incluyen, pero no exclusivamente, varias enzimas, tales como, entre otras, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero no exclusivamente, estreptavidinilbiotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, entre otros, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no exclusivamente, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, entre otros, luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radioactivos, tales como, pero no exclusivamente, yodo (131I, 125I, 123I y 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In e 111In,), tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; y metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos.
La presente divulgación abarca además el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con una molécula terapéutica. Un anticuerpo o fragmento del mismo se puede conjugar con una molécula terapéutica tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radioactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.
Además, un anticuerpo o fragmento del mismo se puede conjugar con una molécula terapéutica o molécula de fármaco que modifique una respuesta biológica dada. Las moléculas terapéuticas o moléculas de fármacos no se deben interpretar como limitadas a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la molécula de fármaco puede ser una proteína, un péptido o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, toxina del cólera o toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno tisular, un agente apoptótico, un agente antiangiogénico; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina. En una realización, el anticuerpo anti-HER3, o un fragmento del mismo, se conjuga con una molécula terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Dichos conjugados se denominan en este documento “inmunoconjugados”. Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, destruya) las células. Los ejemplos incluyen taxón, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, t. colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, dacarbazina), agentes de ablación (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (previamente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (previamente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) (Véase por ejemplo, Seattle Genetics US20090304721).
Otros ejemplos de citotoxinas terapéuticas que se pueden conjugar con un anticuerpo de la divulgación incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo con caliqueamicina está disponible comercialmente (Mylotarg TM; Wyeth-Ayerst).
Las citotoxinas se pueden conjugar con anticuerpos de la divulgación usando la tecnología de conector disponible en el área. Los ejemplos de tipos de conectores que se han usado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no exclusivamente, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y conectores que contienen péptidos. Se puede elegir un conector que sea, por ejemplo, susceptible de escisión por pH bajo dentro del compartimiento lisosómico o susceptible de escisión por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral tal como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).
Por una discusión más detallada de los tipos de citotoxinas, conectores y métodos para conjugar agentes terapéuticos con anticuerpos, véanse también Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan y Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter y Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev.
53:247-264.
Los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden conjugar con un isótopo radioactivo para generar radiofármacos citotóxicos, también denominados radioinmunoconjugados. En los ejemplos de isótopos radioactivos que se pueden conjugar con anticuerpos para usar diagnóstica o terapéuticamente incluyen, pero no exclusivamente, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. Los métodos para preparar radioinmunoconjugados están establecidos en el área. Están disponibles comercialmente ejemplos de radioinmunoconjugados que incluyen Zevalin™ (DEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden usar métodos similares para preparar radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la divulgación. En ciertas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N'',N'''-tetraacético (DOTA) que se puede unir al anticuerpo a través de una molécula conectora. Dichas moléculas conectoras son conocidas comúnmente en el área y se describen en Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.
Las técnicas para conjugar moléculas terapéuticas con anticuerpos son bien conocidas, véanse, por ejemplo, Arnon et al., ''Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery'', en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., (1982) Immunol. Rev. 62:119-58.
Los anticuerpos también se pueden unir a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, pero no exclusivamente, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno.
Combinaciones de anticuerpos
En otro aspecto, la divulgación se refiere a anticuerpos contra HER3, o fragmentos de los mismos de la divulgación utilizados con otros agentes terapéuticos tales como otros anticuerpos, inhibidores de molécula pequeña, inhibidores de mTOR o inhibidores de la cinasa PI3. Los ejemplos incluyen, pero no exclusivamente, los siguientes: inhibidores de HERI: los anticuerpos contra HER3 o sus fragmentos se pueden usar con inhibidores de HER1 que incluyen, entre otros, Matuzumab (EMD72000), Erbitux®/Cetuximab (Imclone), Vectibix®/Panitumumab (Amgen), mAb 806 y Nimotuzumab (TheraCIM), Iressa®/Gefitinib (Astrazeneca); CI-1033 (PD183805) (Pfizer), Lapatinib (GW-572016) (GlaxoSmithKline), Tykerb®/Ditosilato de lapatinib (SmithKlineBeecham), Tarceva®/Erlotinib h Cl (OSI-774) (OSI Pharma) y PKI-166 (Novartis) y N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3"S")-tetrahidro-3-furanil]oxi]-6-quinazolinil]-4(dimetilamino)-2-butenamida, comercializada bajo el nombre comercial Tovok® por Boehringer Ingelheim).
inhibidores de HER2: los anticuerpos contra HER3 o sus fragmentos se pueden usar con inhibidores de HER2 que incluyen, entre otros, Pertuzumab (comercializado bajo la marca comercial Omnitarg®, por Genentech), T rastuzumab (comercializado bajo la marca comercial Herceptin® por Genentech/Roche), MM-111, neratinib (también conocido como HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-cloro-4-[(piridin-2-il)metoxi]fenil]amino]-3-ciano-7-etoxiquinolin-6-il]-4-(dimetilamino)but-2-enamida, y se describe en la publicación PCT N° WO 05/028443), lapatinib o ditosilato de lapatinib (comercializado bajo la marca comercial Tykerb® por GlaxoSmithKline.
inhibidores de HER3: los anticuerpos contra HER3 o sus fragmentos se pueden usar con inhibidores de HER3 que incluyen, entre otros, MM-121, Mm -111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech) y moléculas pequeñas que inhiben a HER3.
inhibidores de HER4: los anticuerpos contra HER3 o sus fragmentos se pueden usar con inhibidores de HER4. inhibidores de PI3K: los anticuerpos contra HER3 o sus fragmentos se pueden usar con inhibidores de la cinasa PI3 que incluyen, entre otros, 4-[2-(1H-Indazol-4-il)-6-[[4-(metilsulfonil) piperazin-1-il]metil]tieno[3,2-d] pirimidin-4-il]morfolina (también conocida como GDC 0941 y descrita en las publicaciones pCt N° WO 09/036082 y WO 09/055730), 2-metil-2-[4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenil]propionitrilo (también conocido como BEZ 235 o NVP-BEZ 235, y descrito en la publicación PCT N° WO 06/122806), BMK120 y BYL719.
inhibidores de mTOR: los anticuerpos contra HER3 o sus fragmentos se pueden usar con inhibidores de mTOR que incluyen, entre otros, Temsirolimus (comercializado bajo el nombre comercial Torisel® por Pfizer), ridaforolimus (conocido previamente como deferolimus, (1 R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1 R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21 R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexildimetilfosfinato, también conocido como Deforolimus, AP23573 y MK8669 (Ariad Pharm.), y descrito en la publicación PCT N° WO 03/064383), everolimus (RAD001) (comercializado bajo el nombre comercial Afinitor® por Novartis). Uno o más agentes terapéuticos se pueden administrar simultáneamente o antes o después de la administración de un anticuerpo contra HER3 o un fragmento del mismo de la presente divulgación.
Métodos para producir anticuerpos de la divulgación
(i) Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos
La descripción proporciona moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas de anticuerpos de unión a HER3 descritas antes. Algunos de los ácidos nucleicos de la divulgación comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo contra HER3, y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera. En una realización específica, las moléculas de ácido nucleico son las identificadas en la tabla 1. Algunas otras moléculas de ácido nucleico de la divulgación comprenden secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos 65%, 80%, 95% o 99%) a las secuencias de nucleótidos de las identificadas en la tabla 1. Cuando se expresan a partir de vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos son capaces de exhibir capacidad de unión al antígeno HER3.
También se proporcionan en la divulgación los polinucleótidos que codifican al menos una región CDR y usualmente las tres regiones CDR de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de unión a HER3 establecido precedentemente. Algunos otros polinucleótidos codifican toda o sustancialmente toda la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo de unión a HER3 establecido precedentemente. Debido a la degeneración del código, diversas secuencias de ácido nucleico codificarán cada una de las secuencias de aminoácidos de la inmunoglobulina.
Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de ácido nucleico de la divulgación comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de la región variable de la cadena pesada madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 80%, 90% o 99%) a la secuencia de la región variable de la cadena pesada madura de un anticuerpo contra HER3 indicado en la tabla 1. Algunas otras secuencias de ácido nucleico comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de la región variable de la cadena ligera madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos 80%, 90% o 99%) a la secuencia de la región variable de la cadena ligera madura de un anticuerpo contra HER3 indicado en la tabla 1.
Las secuencias de polinucleótidos se pueden producir por síntesis de novo de ADN en fase sólida o por mutagénesis por PCR de una secuencia existente (por ejemplo, secuencias como las descritas en los ejemplos siguientes) que codifica un anticuerpo de unión a HER3 o su fragmento de unión. La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede lograr mediante métodos conocidos en el área, tales como el método de fosfotriéster de Narang et al., (1979) Meth. Enzymol 68:90; el método del fosfodiéster de Brown et al., (1979) Meth. Enzymol 68:109; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., (1981) Tetra. Lett., 22:1859; y el método del soporte sólido de la patente de Estados Unidos N° 4,458,066. La introducción de mutaciones en una secuencia de polinucleótidos por PCR se puede realizar como se describe, por ejemplo, en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:967; y Eckert et al., (1991) PCR Methods and Applications 1:17.
También se proporcionan en la divulgación vectores de expresión y células hospedadoras para producir los anticuerpos de unión a HER3 descritos antes. Se pueden emplear diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas o fragmentos de unión de los anticuerpos que se unen a HER3. Tanto los vectores de expresión virales como los no virales se pueden usar para producir los anticuerpos en una célula hospedadora de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episómicos, habitualmente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, por ejemplo, Harrington et al., (1997) Nat Genet 15:345). Por ejemplo, los vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos de unión a HER3 en células de mamíferos (por ejemplo, humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B y C, (Invitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV y muchos otros vectores conocidos en el área para expresar otras proteínas. Los vectores virales útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, vectores basados en SV40, virus del papiloma, virus de Epstein Barr HBP, vectores del virus vaccinia y virus Semliki Forest (SFV). Véanse, Brent et al., (1995) supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807; y Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143.
La elección del vector de expresión depende de las células hospedadoras destinadas a expresar el vector. Habitualmente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadores) que están unidas operativamente a los polinucleótidos que codifican una cadena o un fragmento de un anticuerpo de unión a HER3. En algunas realizaciones, se emplea un promotor inducible para evitar la expresión de secuencias insertadas excepto en condiciones inductoras. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, arabinosa, lacZ, promotor de metalotioneína o un promotor de choque térmico. Los cultivos de organismos transformados se pueden expandir en condiciones no inductoras sin sesgar a la población para codificar secuencias cuyos productos de expresión sean mejor tolerados por las células hospedadoras. Además de los promotores, también pueden ser necesarios o deseables otros elementos reguladores para la expresión eficiente de una cadena o un fragmento de un anticuerpo de unión a HER3. Estos elementos incluyen generalmente un codón de iniciación ATG y un sitio de unión al ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficacia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véanse, por ejemplo, Scharf et al., (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125; y Bittner et al., (1987) Meth. Enzymol., 153:516). Por ejemplo, el potenciador SV40 o el potenciador CMV se pueden usar para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.
Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de secuencia de señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias de anticuerpos de unión a HER3 insertadas. Más a menudo, las secuencias de anticuerpos de unión a HER3 insertadas se unen a una secuencia señal antes de su inclusión en el vector. Los vectores que se utilizarán para recibir secuencias que codifican dominios variables de cadena ligera y pesada de anticuerpos de unión a HER3 a veces también codifican regiones constantes o partes de ellas. Dichos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, lo que conduce a la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Generalmente, dichas regiones constantes son humanas.
Las células hospedadoras para albergar y expresar las cadenas de anticuerpos de unión a HER3 pueden ser procariotas o eucariotas. E. co lies un huésped procariota útil para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente divulgación. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, como Salmonella, Serratia y varias especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, también se pueden preparar vectores de expresión, que contienen habitualmente secuencias de control de la expresión compatibles con la célula hospedadora (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de diversos promotores conocidos, como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor de fago lambda. Generalmente los promotores controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción. También se pueden emplear otros microorganismos, como levaduras, para expresar los polipéptidos de unión a HER3 de la divulgación. También se pueden usar células de insectos en combinación con vectores de baculovirus.
En algunas realizaciones preferidas, las células hospedadoras de mamífero se usan para expresar y producir los polipéptidos de unión a HER3 de la presente divulgación. Por ejemplo, pueden ser una línea celular de hibridoma que exprese genes de inmunoglobulina endógena (por ejemplo, el clon de hibridoma de mieloma 1D6.C9 según se describe en los Ejemplos) o una línea celular de mamífero que albergue un vector de expresión exógena (por ejemplo, las células de mieloma SP2/0 ejemplificadas a continuación). Estas incluyen cualquier célula animal normal o humana normal mortal o normal o anormal inmortal. Por ejemplo, se han desarrollado varias líneas celulares hospedadoras adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, incluidas las líneas celulares CHO, varias líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma, linfocitos B transformados e hibridomas. El uso del cultivo de células de tejidos de mamíferos para expresar polipéptidos se trata en general en, por ejemplo, Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Los vectores de expresión para células hospedadoras de mamíferos pueden incluir secuencias de control de la expresión, como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, por ejemplo, Queen et al., (1986) Immunol. Rev. 89:49-68), y los sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción. Estos vectores de expresión contienen generalmente promotores derivados de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos del tipo de célula, específicos del estadio y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, pero no exclusivamente, el promotor de metalotioneína, el promotor constitutivo tardío mayor del adenovirus, el promotor MMTV inducible por dexametasona, el promotor SV40, el promotor MRP polIII, el promotor constitutivo MPSV, el promotor CMV inducible por tetraciclina (tales como el promotor de CMV temprano inmediato humano), el promotor de CMV constitutivo y las combinaciones de promotor-potenciador conocidas en el área.
Los métodos para introducir vectores de expresión que contienen secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden usar para otros huéspedes celulares. (Véase en general Sambrook, et al., supra). Otros métodos incluyen, por ejemplo, electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión a la proteína estructural VP22 del virus del herpes (Elliot y O'Hare, (1997) Cell 88:223), captación de ADN potenciada por el agente y transducción ex vivo. Para la producción a largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes, a menudo se deseará una expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de forma estable cadenas o fragmentos de unión de anticuerpos que se unen a HER3 se pueden preparar usando vectores de expresión de la divulgación que contienen orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógena y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células se multipliquen durante 1 -2 días en un medio enriquecido antes de cambiar al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite la multiplicación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas en medios selectivos. Las células resistentes, transfectadas de forma estable, pueden proliferar utilizando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de célula.
(ii) Generación de anticuerpos monoclonales de la divulgación
Los anticuerpos monoclonales (mAb) se pueden producir mediante diversas técnicas, incluida la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495. Se pueden emplear muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B.
Un sistema animal para preparar hibridomas es el sistema múrido. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en el área. También se conocen las parejas de fusión (por ejemplo, células de mieloma múrido) y los procedimientos de fusión.
Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente divulgación se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal múrido preparado como se describió antes. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener del hibridoma múrido de interés y genomanipular para que contenga secuencias de inmunoglobulina no múridas (por ejemplo, humanas) utilizando técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables múridas se pueden unir a regiones constantes humanas empleando métodos conocidos en el área (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4,816,567 para Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, se pueden insertar regiones CDR múridas en un marco humano empleando métodos conocidos en el área. Véanse por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5225539 para Winter, y las patentes de Estados Unidos N° 5530101; 5585089; 5693762 y 6180370 para Queen et al.
En una cierta realización, los anticuerpos de la divulgación son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra HER3 se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones a los que se hace referencia en este documento como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en este documento "ratones Ig humana".
El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (g y y) y ligera k no reorganizadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de cadena g y k endógenos (véase, por ejemplo, Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida de IgM o k de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadenas pesada y ligera humanas introducidos experimentan un cambio de clase y mutación somática para generar IgGK monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg et al., (1994) supra; revisado en Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg y Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol.13:65-93, y Harding y Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas portadas por dicho ratones, se describen adicionalmente en Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et a l, (1993) EMBO J. 12:821 -830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al., (1994) International Immunology 579-591; y Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Véanse las patentes de Estados Unidos N° 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas para Lonberg y Kay; la patente de Estados Unidos N° 5,545,807 para Surani et al.; las publicaciones N° w O 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas para Lonberg y Kay; y la publicación PCT N° Wo 01/14424 para Korman et al.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la divulgación se pueden generar usando un ratón que porte secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados en este documento "ratones KM", se describen en detalle en la publicación PCT WO 02/43478 para Ishida et al.
Aún más, los sistemas alternativos de animales transgénicos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en el área y se pueden usar para generar anticuerpos de unión a HER3 de la divulgación. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo denominado Xenoratón (Abgenix, Inc.). Dichos ratones se describen por ejemplo en las patentes de Estados Unidos N° 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 y 6,162,963 para Kucherlapati et al.
Además, los sistemas alternativos de animales transcromosómicos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en el área y se pueden usar para generar anticuerpos de unión a HER3 de la divulgación. Por ejemplo, se pueden usar ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; dichos ratones se describen en Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, se han descrito en el área vacas que portan transcromosomas de cadenas pesada y ligera humanas (Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y se pueden usar para generar anticuerpos de unión a HER3 de la divulgación.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la divulgación también se pueden preparar usando métodos de expresión en fagos para cribar genotecas de inmunoglobulinas humanas. Dichos métodos de expresión en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en el área o se describen en los ejemplos siguientes. Véanse por ejemplo: las patentes de Estados Unidos N° 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 para Ladner et al.; las patentes de Estados Unidos N° 5,427,908 y 5,580,717 para Dower et al.; las patentes de Estados Unidos N° 5,969,108 y 6,172,197 para McCafferty et al.; y las patentes de Estados Unidos N° 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 para Griffiths et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la divulgación también se pueden preparar usando ratones SCID en los cuales las células inmunitarias humanas han sido reconstituidas de modo que se pueda generar una respuesta de anticuerpos humanos después de la inmunización. Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 5,476,996 y 5,698,767 para Wilson et al.
(iii) Genomanipulación del marco o Fc
Los anticuerpos genomanipulados de la divulgación incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones a los residuos del marco dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Generalmente, dichas modificaciones del marco se realizan para disminuir la inmunogenia del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es "retromutar" uno o más residuos marco a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos del marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Dichos residuos se pueden identificar comparando las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las cuales se deriva el anticuerpo. Para volver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden "retromutar" a la secuencia de la línea germinal, por ejemplo, mediante mutagénesis de sitio dirigido. También se prevé que dichos anticuerpos "retromutados" estén comprendidos por la divulgación.
Otro tipo de modificación del marco implica la mutación de uno o más residuos dentro de la región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de linfocitos T a fin de reducir así la potencial inmunogenia del anticuerpo. Este método también se conoce como "desinmunización" y se describe con más detalle en la publicación de patente de Estados Unidos N° 20030153043 por Carr et al.
Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro de las regiones marco o CDR, los anticuerpos de la divulgación se pueden genomanipular para que incluyan modificaciones dentro de la región Fc, habitualmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, como la vida media sérica, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la divulgación se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir una o más moléculas químicas al anticuerpo) o modificar para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.
En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de residuos de cisteína en la región bisagra se altere, por ejemplo, aumente o disminuya. Este método se describe con más detalle en la patente de Estados Unidos N° 5,677,425 por Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región Fc bisagra de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento Fc-bisagra de modo que el anticuerpo tenga una unión deteriorada de la proteína A estafilocóccica (SpA) con respecto a la unión de SpA al dominio Fc-bisagra nativo. Este método se describe con más detalle en la patente de Estados Unidos N° 6,165,745 por Ward et al.
En aún otras realizaciones, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector al cual se le altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este método se describe con más detalle en la patente de Estados Unidos N° 5,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter et al.
En otra realización, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos elegidos entre residuos de aminoácidos con un residuo de aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga alterada la unión a C1q y/o tenga reducida o eliminada la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este método se describe con más detalle en la patente de Estados Unidos N° 6,194,551 por Idusogie et al.
En otra realización, se alteran uno o más residuos de aminoácidos para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este método se describe con más detalle en la publicación PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.
En otra realización más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos. Este método se describe con más detalle en la publicación PCT 00/42072 por Presta. Además, se mapearon los sitios de unión en IgG1 humana para FcyR1, FcyRII, FcyRIII y FcRn y se describieron variantes con unión mejorada (véase Shields et al., (2001) J. Biol. Chen. 276:6591-6604).
En otra realización más, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el ''antígeno''. Dichas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del marco de la región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Un método de ese tipo se describe con más detalle en las patentes de Estados Unidos N° 5,714,350 y 6,350,861 por Co et al.
Adicional o alternativamente, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tenga mayor cantidad de estructuras GlcNac bisectrices. Se ha demostrado que dichos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de los carbohidratos se pueden conseguir, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con una maquinaria de glicosilación alterada. Se han descrito en el área células con maquinaria de glicosilación alterada y se pueden usar como células hospedadoras en las cuales expresar anticuerpos recombinantes de la divulgación para producir de ese modo un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1,176,195 por Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación. La publicación PCT WO 03/035835 por Presta describe una variante la línea celular CHO, las células Lecl3, con menor capacidad para unir fucosa a carbohidratos unidos a Asn(297), lo que también da como resultado hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 por Umana et al. describe líneas celulares genomanipuladas para que expresen glicosil transferasas modificadoras de glicoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares genomanipuladas presenten mayor cantidad de estructuras de GlcNac bisectrices lo que da como resultado una mayor actividad ADCC de los anticuerpos (véase también Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).
En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diferentes métodos. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las mutaciones siguientes: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de Estados Unidos N° 6,277,375 para Ward. Alternativamente, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de Estados Unidos 5,869,046 y 6,121,022 por Presta et al.
(iv) Métodos para producir por genomanipulación anticuerpos alterados
Como se trató antes, los anticuerpos de unión a HER3 que tienen secuencias de VH y VL o secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa que se muestran en este documento, se pueden usar para crear nuevos anticuerpos de unión a HER3 modificando las secuencias de la cadena pesada y/o la cadena ligera de longitud completa, las secuencias VH y/o VL, o las regiones constantes unidas a las mismas. Por lo tanto, en otro aspecto de la divulgación, las características estructurales de un anticuerpo de unión a HER3 de la divulgación se usan para crear anticuerpos de unión a HER3 estructuralmente relacionados que conserven al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la divulgación, como la unión a HER3 humano y también la inhibición de una o más propiedades funcionales de HER3. Por ejemplo, una o más regiones CDR de los anticuerpos de la presente divulgación, o mutaciones de los mismos, se pueden combinar por recombinación genética con regiones marco y/u otras CDR conocidas, para crear más anticuerpos de unión a HER3 genomanipulados por recombinación genética de la divulgación, como se trató antes. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección previa. El material de partida para el método de genomanipulación es una o más de las secuencias VH y/o VL provistas en este documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo genomanipulado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL provistas en este documento, o una o más de sus regiones CDR. Más bien, la información contenida en la secuencia o secuencias se usa como material de partida para crear una o más secuencias de "segunda generación" derivadas de la secuencia o secuencias originales y luego se preparan la secuencia o secuencias de "segunda generación" y se expresan como una proteína.
Por consiguiente, en otra realización, la divulgación proporciona un método para preparar un anticuerpo de unión a HER3 que consiste en: una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que tiene una secuencia CDR1 elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368; una secuencia c Dr 2 elegida del grupo que consiste en las SeQ ID NO: 3, 9, 21,27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291,297, 309, 315, 327, 333, 345, 351,363, y 369; y/o una secuencia CDR3 elegida del grupo que consiste en la SEQ
ID NO: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 75, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370; y una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que tiene una secuencia CDR1 elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO:
5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371; una secuencia CDR2 elegida del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372y/o una secuencia CDR3 elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, 13, 25, 31,43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 211, 223, 229, 241, 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301, 313, 319, 331,337, 349, 355, 367, y 373; alterar al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. La secuencia de anticuerpo alterada también se puede preparar cribando bibliotecas de anticuerpos que tienen secuencias CDR3 fijas o determinantes de unión esenciales mínimos, como se describe en el documento US20050255552 y diversidad en las secuencias CDR1 y CDR2. El cribado se puede realizar de acuerdo con cualquier tecnología de cribado apropiada para cribar anticuerpos de bibliotecas de anticuerpos, como la tecnología de expresión en fagos.
Se pueden utilizar técnicas estándar de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. El anticuerpo codificado por la secuencia o secuencias de anticuerpos alteradas, es uno que conserva una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos de unión a HER3 descritos en este documento, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no exclusivamente, unirse específicamente a HER3 humana y/o de cinomólogo; el anticuerpo se une a HER3 y neutraliza la actividad biológica de HER3 al inhibir la actividad de señalización de HER en un ensayo de fosfo-HER.
Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar empleando ensayos estándar disponibles en el área y/o descritos en este documento, tales como los expuestos en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA).
En ciertas realizaciones de los métodos de genomanipulación de anticuerpos de la descripción, se pueden introducir mutaciones aleatoria o selectivamente a lo largo de toda o una parte de una secuencia de codificación de un anticuerpo de unión a HER3 y los anticuerpos de unión a HER3 modificados resultantes se pueden cribar en función de su actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en este documento. Se han descrito en el área métodos de mutación. Por ejemplo, la publicación PCT WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y cribar mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, ensamblaje de ligadura sintético o una combinación de los mismos. Alternativamente, la publicación PCT WO 03/074679 por Lazar et al. describe métodos para usar métodos de cribado computacionales para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.
Caracterización de los anticuerpos de la divulgación
Los anticuerpos de la divulgación se pueden caracterizar mediante varios ensayos funcionales. Por ejemplo, se pueden caracterizar por su capacidad para neutralizar la actividad biológica inhibiendo la señalización mediada por HER en un ensayo de fosfo-HER como el que se describe en este documento, su afinidad por una proteína HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomólogo), el binning (caracterización y clasificación) de epítopos, su resistencia a la proteólisis y su capacidad para bloquear las sucesivas etapas de la señalización mediada por HER3. Se pueden usar varios métodos para medir la señalización mediada por HER3. Por ejemplo, la vía de señalización de HER se puede controlar mediante (i) la medición de fosfo-HER3; (ii) medición de la fosforilación de HER3 u otras proteínas de las sucesivas etapas de la señalización (p. ej. Akt), (iii) ensayos de bloqueo de ligandos como se describen en este documento, (iv) formación de heterodímero, (v) firma de expresión génica dependiente de HER3, (vi) internalización del receptor, y (vii) fenotipos celulares dirigidos por HER3 (por ejemplo, proliferación).
La capacidad de un anticuerpo para unirse a HER3 se puede detectar marcando el anticuerpo de interés directamente, o el anticuerpo puede no estar marcado y la unión detectarse indirectamente usando diversos formatos de ensayo sándwich conocidos en el área.
En algunas realizaciones, los anticuerpos de unión a HER3 de la divulgación bloquean o compiten con la unión de un anticuerpo de unión a HER3 de referencia, a un polipéptido o proteína HER3. Estos pueden ser anticuerpos de unión a HER3 completamente humanos descritos precedentemente. También pueden ser otros anticuerpos de unión a HER3 de ratón, quiméricos o humanizados que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. La capacidad de bloquear o competir con la unión del anticuerpo de referencia indica que un anticuerpo de unión a HER3 bajo prueba se une al mismo epítopo o similar al definido por el anticuerpo de referencia, o a un epítopo que está suficientemente próximo al epítopo al que esté unido el anticuerpo de unión a HER3 de referencia. Es especialmente probable que dicho anticuerpos compartan las propiedades ventajosas identificadas para el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el anticuerpo de referencia se puede determinar, por ejemplo, mediante un ensayo de unión competitiva. Con un ensayo de unión competitiva, se examina la capacidad del anticuerpo de prueba para inhibir la unión específica del anticuerpo de referencia a un antígeno común, como un polipéptido o proteína HER3. Un anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia por la unión específica al antígeno si un exceso del anticuerpo de prueba inhibe sustancialmente la unión del anticuerpo de referencia. La inhibición sustancial significa que el anticuerpo de prueba reduce la unión específica del anticuerpo de referencia generalmente en al menos 10%, 25%, 50%, 75% o 90%.
Existen varios ensayos de unión competitiva conocidos que se pueden utilizar para evaluar la competencia entre un anticuerpo de unión a HER3 y el anticuerpo de unión a HER3 de referencia para la unión a una proteína HER3. Estos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (RIA), enzimoinmunoensayo directo o indirecto en fase sólida (EIA), ensayo de competición sándwich (véase Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619); ensayo directo en fase sólida con marcado, ensayo sándwich directo en fase sólida con marcado (véase Harlow y Lane, supra); RIA directo en fase sólida con marcado usando el marcador I-125 (véase Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et al., (1990) Virology 176:546-552); y RIA de marcado directo (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82). Habitualmente, un ensayo de ese tipo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estos, un anticuerpo de unión a HER3 de prueba sin marcar y un anticuerpo de referencia marcado. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia del anticuerpo de prueba. Por lo general, el anticuerpo de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados por el ensayo de competencia (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo al que está unido el anticuerpo de referencia para que se produzca impedimento estérico.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales de unión a HER3 elegidos se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar empleando reactivos comerciales disponibles (por ejemplo, reactivos de Pierce, Rockford, IL). Los estudios de competencia que usan anticuerpos monoclonales sin marcar y anticuerpos monoclonales biotinilados se pueden realizar usando placas de ELISA recubiertas con polipéptido HER3. La unión de MAb biotinilado se puede detectar con una sonda de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de un anticuerpo de unión a HER3 purificado, se pueden realizar ELISA de isotipos. Por ejemplo, los pocillos de las placas de microtitulación se pueden recubrir con 1 pg/ml de IgG antihumana durante la noche a 4 °C. Después de bloquear con BSA al 1%, las placas se hacen reaccionar con 1 pg/ml o menos del anticuerpo monoclonal de unión a HER3 o controles de isotipos purificados, a temperatura ambiente, durante una o dos horas. Después los pocillos se pueden hacer reaccionar con IgG 1 humana o sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específica de IgM humana. Después las placas se desarrollan y analizan para poder determinar el isotipo del anticuerpo purificado. Para demostrar la unión de los anticuerpos monoclonales de unión a HER3 a las células vivas que expresan un polipéptido HER3, se puede utilizar citometría de flujo. En resumen, las líneas celulares que expresan HER3 (cultivadas en condiciones de cultivo estándar) se pueden mezclar con diversas concentraciones de un anticuerpo de unión a HER3 en PBS que contenga 0,1% de BSA y 10% de suero bovino fetal, y se incuban a 4 °C durante 1 hora. Después del lavado, las células se hacen reaccionar con anticuerpo anti-IgG humana marcado con fluoresceína en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar con el instrumento FACScan utilizando propiedades de dispersión de la luz y lateral para confinar en celdas individuales. Se puede usar un ensayo alternativo utilizando microscopía de fluorescencia (además de o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células se pueden teñir exactamente como se describió antes y examinar mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener una sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno.
Los anticuerpos de unión a HER3 de la divulgación se pueden analizar adicionalmente para determinar la reactividad con un polipéptido HER3 o fragmento antigénico mediante inmunotransferencia tipo Western. En resumen, se pueden preparar polipéptidos HER3 purificados o proteínas de fusión o extractos celulares de las células que expresan HER3 y someter a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero bovino fetal al 10% y se sondan con los anticuerpos monoclonales que se van a analizar. La unión de IgG humana se puede detectar usando anti-IgG humana-fosfatasa alcalina y desarrollar con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
Se pueden usar varias lecturas para evaluar la eficacia y la especificidad de los anticuerpos contra HER3 en ensayos celulares de formación de heterodímero inducida por ligando. La actividad puede ser evaluada por uno o más de los siguientes:
(i) Inhibición de la heterodimerización de HER2 inducida por ligando con otros miembros de la familia EGF en una línea celular diana, por ejemplo, células de cáncer de mama MCF-7. La inmunoprecipitación de los complejos de HER2 de los lisados celulares se puede realizar con un anticuerpo específico para el receptor, y la ausencia/presencia de otros receptores de EGF y sus ligandos biológicamente pertinentes dentro del complejo se puede analizar después de electroforesis/inmunotransferencia tipo Western mediante sondeo con anticuerpos para otros receptores de EGF. (ii) Inhibición de la activación de vías de señalización por heterodímeros activados por ligando. La asociación con HER3 parece clave para que otros miembros de la familia de receptores de EGF provoquen una respuesta celular máxima después de la unión del ligando. En el caso de la HER3 defectuoso en cinasa, HER2 proporciona un dominio tirosina cinasa funcional para permitir que se produzca la señalización después de la unión de ligandos del factor de crecimiento. Por lo tanto, las células que coexpresan HER2 y HER3 se pueden tratar con ligando, por ejemplo heregulina, en ausencia y presencia de inhibidor y el efecto sobre la fosforilación de tirosina de HER3 monitorear de diversas maneras, que incluyen la inmunoprecipitación de HER3 de lisados celulares tratados y posteriormente inmunotransferencia tipo Western usando anticuerpos anti-fosfotirosina (véase Agus op. cit. por más detalles). Alternativamente, se puede desarrollar un ensayo de alto rendimiento atrapando HER3 de lisados solubilizados en los pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta con un anticuerpo anti-receptor HER3, y medir el nivel de fosforilación de tirosina empleando, por ejemplo, anticuerpos anti-fosfotirosina marcados con europio, tal como lo realiza Waddleton et al., (2002) Anal. Biochem. 309: 150-157.
En una extensión más amplia de este método, las moléculas efectoras que se sabe que se activan posteriormente a los heterodímeros del receptor activados, como las proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK) y Akt, se pueden analizar directamente, por inmunoprecipitación de los lisados tratados e inmunotransferencia con anticuerpos que detectan formas activadas de estas proteínas, o analizando la capacidad de estas proteínas para modificar/activar sustratos específicos.
(iii) Inhibición de la proliferación celular inducida por ligando. Se sabe que diversas líneas celulares coexpresan combinaciones de receptores ErbB, por ejemplo, muchas líneas celulares de cáncer de mama y próstata. Los ensayos se pueden realizar en formatos de 24/48/96 pocillos con la lectura basada en la síntesis de ADN (incorporación de timidina tritiada), aumento en el número de células (tinción de cristal violeta), etc.
Se pueden usar varias lecturas para evaluar la eficacia y la especificidad de los anticuerpos contra HER3 en ensayos celulares de formación de homo y heterodímeros independiente de ligando. Por ejemplo, la sobreexpresión de HER2 desencadena la activación independiente de ligando del dominio cinasa como resultado de la formación espontánea de dímeros. El HER2 sobreexpresado genera homo o heterodímeros con otras moléculas de HER como HER1, HER3 y HER4.
Capacidad de los anticuerpos o fragmentos de los mismos para bloquear el crecimiento in vivo de xenoinjertos de tumores de líneas celulares tumorales humanas cuyo fenotipo tumorigénico se sabe que depende al menos en parte de la activación de la señalización celular del heterodímero de HER3 con el ligando, por ejemplo, células de cáncer de páncreas BxPC3, etc. Esta se puede evaluar en ratones inmunocomprometidos sola o en combinación con un agente citotóxico apropiado para la línea celular en cuestión. También se describen ejemplos de ensayos funcionales en la sección de Ejemplos siguiente.
Usos profilácticos y terapéuticos
La presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno asociados a la vía de señalización mediada por HER3 mediante administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de los anticuerpos de la divulgación. En una realización específica, la presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir distintos tipos de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina del nervio, schwannoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras de tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna (BPH, por sus siglas en inglés), ginecomastia y endometriosis) mediante la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de los anticuerpos de la divulgación. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para tratar o prevenir cánceres asociados a una vía de señalización de HER mediante administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de los anticuerpos de la divulgación.
En una realización específica, la presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir distintos tipos de cáncer asociados con una vía de señalización mediada por HER que incluyen, pero no exclusivamente, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina del nervio, schwannoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras de tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna (BPH), ginecomastia y endometriosis.
En una realización, la divulgación se refiere al tratamiento del cáncer esofágico utilizando anticuerpos contra HER3 o fragmentos de los mismos.
En una realización, la divulgación se refiere al tratamiento de la hiperplasia prostética benigna (BPH) utilizando anticuerpos contra HER3 o fragmentos de los mismos. La hiperplasia prostética benigna es una enfermedad común en hombres de edad avanzada que se caracteriza por un agrandamiento no neoplésico de la próstata que produce presión sobre la uretra y provoca problemas de micción y vejiga (Mahapokail W, van Sluijs FJ & Schalken JA. 2000 Prostate Cancer and Prostatic Diseases 3, 28-33). La evidencia anatómica o microscópica de la BPH esté presente en la autopsia de aproximadamente el 55% de los hombres de 60 a 70 años. La resección transuretral de la próstata ha sido el tratamiento de elección durante muchos años.
En consecuencia, la BPH es una de las razones més comunes para la intervención quirúrgica entre los hombres de edad avanzada. Los métodos de tratamiento menos invasivos incluyen:
(i) Los bloqueadores alfa 1 (doxazosina, prazosina, tamsulosina, terazosina y alfuzosina) son una clase de medicamentos que también se usan para tratar la hipertensión. Estos medicamentos relajan los músculos del cuello de la vejiga y la próstata, lo que permite orinar més fécilmente.
(ii) Finasterida y dutasterida reducen los niveles de andrógenos, reduciendo así el tamaño de la gléndula prostética, aumentando el flujo de orina y disminuyendo los síntomas de la BPH. Pueden pasar de 3 a 6 meses antes de que se observe una mejoría en los síntomas. Los posibles efectos secundarios relacionados con el uso de finasterida y dutasterida incluyen disminución del deseo sexual e impotencia.
Los resultados en la sección Experimentos demuestran por primera vez que la BPH es una indicación dependiente de neuregulina. El hallazgo también muestra que MOR10703 redujo significativamente el tamaño de la próstata en ratas sexualmente maduras sin afectar los niveles hormonales lo que sugiere que MOR10703 podría ser útil para el tratamiento de la BPH.
Para probar més a fondo a MOR10703 y otros anticuerpos contra HER3 como agentes terapéuticos para la BPH, se pueden trasplantar muestras quirúrgicas de BPH humanas primarias a ratones o ratas atímicos y estudiar el efecto de los anticuerpos contra Her3 usando modelos (Otto U et al. Urol Int 1992; 48: 167 -170). Alternativamente, se pueden inducir aspectos de BPH en perros castrados mediante la administración a largo plazo de 5a-androstano-3a,17p-diol més estradiol y probar los anticuerpos contra HER3 en estos modelos caninos (Walsh PC, Wilson JD. J Clin Invest 1976; 57: 1093 - 1097).
En una realización, la divulgación se refiere al tratamiento de la ginecomastia utilizando anticuerpos contra HER3 o fragmentos de los mismos. La manifestación física de la ginecomastia es el agrandamiento de los senos en los hombres, normalmente se produce en ambos senos, pero a veces puede ser solo en uno, conocida como ginecomastia asimétrica o unilateral. La ginecomastia es causada comúnmente por:
(i) Niveles elevados de estrógeno dan como resultado que la proporción de testosterona a estrógeno se desequilibre.
(ii) Antagonistas de andrógenos o antiandrógenos utilizados en el tratamiento del céncer de próstata o la BPH.
Estos férmacos suprimen la testosterona, pero al suprimir la testosterona, el estrógeno comienza a aumentar.
Aunque actualmente se estén evaluando varios férmacos experimentales no existen en la actualidad tratamientos aprobados para la ginecomastia. En consecuencia, la ginecomastia se trata mediante la extirpación quirúrgica del tejido mamario. La observación de que MOR10703 indujo atrofia irreversible de la gléndula mamaria del macho indica que puede ser beneficioso en el tratamiento de la ginecomastia. Para probar aún més MOR10703 y otros anticuerpos contra HER3 para el tratamiento de la ginecomastia humana, se pueden utilizar modelos de ginecomastia en ratones transgénicos. Estos modelos se han desarrollado mediante la expresión de aromatasa humana en la gléndula mamaria del ratón y recapitulan muchos aspectos de la ginecomastia humana (Li et al., Endocrinology 2002;143:4074-4083; Tekmal et al., Cancer Res 1996;56:3180-318).
En una realización, la divulgación se refiere al tratamiento de la endometriosis utilizando anticuerpos contra HER3 o fragmentos de los mismos. MOR10703 y otros anticuerpos contra HER3 también se pueden examinar para tratar la endometriosis, una afección ginecológica en la que las células del revestimiento del útero (endometrio) aparecen y florecen fuera de la cavidad uterina. El síntoma principal, pero no universal, de la endometriosis es el dolor pélvico en diversas manifestaciones. Aunque las causas subyacentes de la endometriosis no estén bien caracterizadas, se cree que dependen de la presencia de estrógenos. Dado que MOR10703 indujo atrofia endometrial en ratones hembra, lo que resultó en una disminución del peso del útero, se puede usar para tratar la endometriosis. Para estudiar més a fondo los efectos de MOR10703 y otros anticuerpos contra HER3 sobre la endometriosis, se puede implantar endometrio humano en fase proliferativa en la cavidad peritoneal de ratones atímicos que ciclan normalmente y ovariectomizados o en ratones (SCID) con inmunodeficiencia combinada severa-diabéticos no obesos (NOD) que ciclan, y usar estos ratones SCID como modelos (Grummer et al., 2001. Human Reproduction; 16; 1736-1743).
Los anticuerpos contra HER3 también se pueden usar para tratar o prevenir otros trastornos asociados con la señalización mediada por HER aberrante o defectuosa, que incluyen, pero no exclusivamente, enfermedades respiratorias, osteoporosis, artrosis, enfermedad renal poliquística, diabetes, esquizofrenia, enfermedad vascular, enfermedad cardíaca, enfermedades proliferativas no oncogénicas, fibrosis y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer.
Los agentes adecuados para el tratamiento combinado con anticuerpos de unión a HER3 incluyen agentes de atención médica estándar conocidos en el área que pueden modular la vía de señalización de ErbB. Los ejemplos adecuados de agentes de atención médica estándar para HER2 incluyen, pero no exclusivamente, Herceptin y Tykerb. Los ejemplos adecuados de agentes de atención médica estándar para EGFR incluyen, entre otros, Iressa, Tarceva, Erbitux y Vectibix. Otros agentes que pueden ser adecuados para el tratamiento combinado con anticuerpos de unión a HER3 incluyen, entre otros, los que modulan los receptores de tirosina cinasas, los receptores acoplados a proteínas G, las vías de transducción de señales de crecimiento/supervivencia, los receptores de hormonas nucleares, las vías apoptóticas, el ciclo celular y la angiogénesis.
Usos diagnósticos
En un aspecto, la divulgación abarca ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de proteína HER3 y/o ácido nucleico, así como la función de la proteína HER3, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejidos) o de un individuo que padece cáncer, o corre riesgo de padecer cáncer.
Los ensayos de diagnóstico, como los ensayos competitivos, se basan en la capacidad de un análogo marcado (el " trazador") para competir con el analito de la muestra de prueba por un número limitado de sitios de unión en una pareja de unión común. La pareja de la unión generalmente se insolubiliza antes o después de la competencia y después el trazador y el analito unidos a la pareja de la unión se separan del trazador y el analito no unidos. Esta separación se logra por decantación (cuando la pareja de la unión se preinsolubilizó) o por centrifugación (cuando la pareja de la unión se precipitó después de la reacción competitiva). La cantidad de analito de la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unido medido por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan curvas de dosis-respuesta con cantidades conocidas de analito y se comparan con los resultados de la prueba para determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando se utilizan enzimas como marcadores detectables. En un ensayo de esta forma, la unión competitiva entre anticuerpos y anticuerpos de unión a HER3 da como resultado la proteína HER3 unida, preferentemente los epítopos de HER3 de la divulgación, que es una medida de los anticuerpos en la muestra de suero, muy particularmente, de los anticuerpos neutralizantes en la muestra de suero.
Una ventaja significativa del ensayo es que la medición se hace directamente de los anticuerpos neutralizantes (es decir, aquellos que interfieren con la unión de la proteína HER3, específicamente, epítopos). Un ensayo de este tipo, particularmente en forma de una prueba ELISA, tiene considerables aplicaciones en el ambiente clínico y en el análisis de sangre de rutina.
Otro aspecto de la divulgación proporciona métodos para determinar la expresión de ácido nucleico de HER3 o la actividad de la proteína HER3 en un individuo para seleccionar de ese modo agentes terapéuticos o profilácticos apropiados para ese individuo (denominado en el presente documento "farmacogenómica"). La farmacogenómica permite la selección de agentes (por ejemplo, fármacos) para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo basado en el genotipo del individuo (por ejemplo, el genotipo del individuo se examina para determinar la capacidad del individuo para responder a un agente particular).
Otro aspecto más de la divulgación se refiere al control de la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos) en la expresión o actividad de la proteína HER3 en ensayos clínicos.
Composiciones farmacéuticas
Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyan anticuerpos de unión a HER3 (intactos o fragmentos de unión), los anticuerpos de unión a HER3 (intactos o fragmentos de unión) se mezclan con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener además uno o más de otros agentes terapéuticos que sean adecuados para tratar o prevenir distintos tipos de cáncer (cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina del nervio, schwannoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras de tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna (BPH), ginecomastia y endometriosis).
Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mediante mezcla con vehículos, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables en forma, por ejemplo, de polvos liofilizados, suspensiones densas, soluciones acuosas, lociones o suspensiones (véanse, por ejemplo, Hardman et al., (2001) Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.).
La elección de un régimen de administración con fines terapéuticos depende de varios factores, que incluyen la velocidad de renovación sérica o tisular de la entidad, el nivel de síntomas, la inmunogenia de la entidad y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. En ciertas realizaciones, un régimen de administración maximiza la cantidad de agente terapéutico administrado al paciente compatible con un nivel aceptable de efectos secundarios. En consecuencia, la cantidad de agente biológico administrado depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la afección a tratar. Se encuentra disponible una guía para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos, citocinas y moléculas pequeñas (véanse, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y.; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baert et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al., (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al., (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al., (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al., (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al., (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).
El médico determina la dosis apropiada, por ejemplo, usando parámetros o factores que se sabe o se sospecha en el área que afectan el tratamiento o que se prevé que afectarán el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y luego se aumenta en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen las de los síntomas, por ejemplo, de la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosis elegido dependerá de diversos factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgación empleadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el género, el peso, la afección, el estado general de salud y el historial médico previo del paciente en tratamiento, y factores similares conocidos en el área médica.
Las composiciones que contienen anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos se pueden proporcionar mediante infusión continua, o mediante dosis a intervalos, por ejemplo, de un día, una semana, o 1-7 veces por semana. Las dosis se pueden administrar por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral o por inhalación. Un protocolo de dosificación específico es uno que involucra la dosis o frecuencia de dosis máximas que evitan efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total puede ser de al menos 0,05 gg/kg de peso corporal, al menos 0,2 gg/kg, al menos 0,5 gg/kg, al menos 1 gg/kg, al menos 10 gg/kg, al menos 100 gg/kg, al menos 0.2 mg/kg, al menos 1,0 mg/kg, al menos 2,0 mg/kg, al menos 10 mg/kg, al menos 25 mg/kg o al menos 50 mg/kg (véanse, por ejemplo, Yang et al., (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al., (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu et al., (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144). La dosis deseada de anticuerpos o fragmentos de los mismos es aproximadamente la misma que para un anticuerpo o polipéptido en moles/kg de peso corporal. La concentración plasmática deseada de los anticuerpos o fragmentos de los mismos es aproximadamente, en moles/kg de peso corporal. La dosis puede ser de al menos 15 gg al menos 20 gg, al menos 25 gg, al menos 30 gg, al menos 35 gg, al menos 40 gg, al menos 45 gg, al menos 50 gg, al menos 55 gg, al menos 60 gg, al menos 65 gg, al menos 70 gg, al menos 75 gg, al menos 80 gg, al menos 85 gg, al menos 90 gg, al menos 95 gg o al menos 100 gg. Las dosis administradas a un sujeto pueden ser al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, o más.
Para los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación, la dosis administrada a un paciente puede ser de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosis puede ser entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0,0001 y 2 mg/kg, 0,0001 y 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,25 mg/kg, 0,0001 y 0,15 mg/kg, 0,0001 y 0,10 mg/kg, 0,001 y 0,5 mg/kg, 0,01 y 0,25 mg/kg o 0,01 y 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente.
La dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación se puede calcular usando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis que se va administrar en mg/kg. La dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación puede ser de 150 gg/kg o menos, 125 gg/kg o menos, 100 gg/kg o menos, 95 gg/kg o menos, 90 gg/kg o menos, 85 gg/kg o menos, 80 gg/kg o menos, 75 gg/kg o menos, 70 gg/kg o menos, 65 gg/kg o menos, 60 gg/kg o menos, 55 gg/kg o menos, 50 gg/kg o menos, 45 gg/kg o menos, 40 gg/kg o menos, 35 gg/kg o menos, 30 gg/kg o menos, 25 gg/kg o menos, 20 gg/kg o menos, 15 gg/kg o menos, 10 gg/kg o menos, 5 gg/kg o menos, 2,5 gg/kg o menos, 2 gg/kg o menos, 1,5 gg/kg o menos, 1 gg/kg o menos, 0,5 gg/kg o menos, o 0,5 gg/kg o menos del peso corporal de un paciente.
La dosis unitaria de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación puede ser de 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 12 mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 a 2,5 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 a 8 mg, 0,25 mg a 7 mg, 0,25 mg a 5 mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15 mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mg a 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg, o 1 mg a 2,5 mg.
La dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación, puede alcanzar un título sérico de al menos 0,1 gg/ml, al menos 0,5 gg/ml, al menos 1 gg/ml, al menos 2 gg/ml, al menos 5 gg/ml, al menos 6 gg/ml, al menos 10 gg/ml, al menos 15 gg/ml, al menos 20 gg/ml, al menos 25 gg/ml, al menos 50 gg/ml, al menos 100 gg/ml, al menos 125 gg/ml, al menos 150 gg/ml, al menos 175 gg/ml, al menos 200 gg/ml, al menos 225 gg/ml, al menos 250 gg/ml, al menos 275 gg/ml, al menos 300 gg/ml, al menos 325 gg/ml, al menos 350 gg/ml, al menos 375 gg/ml o al menos 400 gg/ml en un sujeto. Alternativamente, la dosis de los anticuerpos o fragmento de los mismos de la divulgación puede alcanzar un título sérico de al menos 0,1 gg/ml, al menos 0,5 gg/ml, al menos 1 gg/ml, al menos, 2 gg/ml, al menos 5 gg/ml, al menos 6 gg/ml, al menos 10 gg/ml, al menos 15 gg/ml, al menos 20 gg/ml, al menos 25 gg/ml, al menos 50 gg/ml, al menos 100 gg/ml, al menos 125 gg/ml, al menos 150 gg/ml, al menos 175 gg/ml, al menos 200 gg/ml, al menos 225 gg/ml, al menos 250 gg/ml, al menos 275 gg/ml, al menos 300 gg/ml, al menos 325 gg/ml, al menos 350 gg/ml, al menos 375 gg/ml o al menos 400 gg/ml en el sujeto.
Las dosis de anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación, se pueden repetir y las administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
Una cantidad eficaz para un paciente particular puede variar dependiendo de factores como la afección que se va a tratar, el estado general de salud del paciente, la vía del método y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios (véanse, por ejemplo, Maynard et al., (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, Reino Unido).
La vía de administración puede ser por ejemplo aplicación tópica o cutánea, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intracerebroespinal, intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida o un implante (véanse, por ejemplo, Sidman et al., (1983) Biopolymers 22:547-556; Langer et al., (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstein et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; las patentes de Estados Unidos N° 6,350,466 y 6,316,024). Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Además, también se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y una formulación con un agente aerosolizante. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 y 4,880,078; y las publicaciones PCT N2 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903.
Una composición de la presente divulgación también se puede administrar a través de una o más vías de administración utilizando uno o más de los diversos métodos conocidos en el área. Como apreciará un experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración elegidas para anticuerpos o fragmento de los mismos de la divulgación incluyen las vías intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo mediante inyección o infusión. La administración parenteral puede representar modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente mediante inyección, e incluye, pero no exclusivamente, la inyección e infusión por vía intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Alternativamente, una composición de la divulgación se puede administrar a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o en la mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. En una realización, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación se administran por infusión. En otra realización, la proteína de unión a epítopo multiespecífica de la divulgación se administra por vía subcutánea.
Si los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación se administran en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida, se puede usar una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véanse Langer, supra; Sefton, (1987) Cr C Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., (1980), Surgery 88:507; Saudek et al., (1989) N. Engl. J. Med. 321:574). Se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la divulgación (véanse por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véanse también Levy et al., (1985) Science 228:190; During et al., (1989) Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., (1989) J. Neurosurg. 7 1:105); la patente de Estados Unidos N° 5,679,377; la patente de Estados Unidos N° 5,916,597; la patente de Estados Unidos N° 5,912,015; la patente de Estados Unidos N° 5,989,463; la patente de Estados Unidos N° 5,128,326; la publicación PCT N° WO 99/15154; y la publicación PCT N° WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no exclusivamente, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. En una realización, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, exento de impurezas lixiviables, estable en el almacenamiento, estéril y biodegradable. Se puede colocar un sistema de liberación controlada o sostenida cerca de la diana profiláctica o terapéutica, requiriendo por lo tanto solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Los sistemas de liberación controlada se tratan en la revisión de Langer, (1990), Science 249:1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación. Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4,526,938, la publicación PCT WO 91/05548, la publicación PCT WO 96/20698, Ning et al., (1996) , Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., (1995) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, y Lam et al., (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
Si los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación se administran tópicamente, se pueden formular en forma de ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, pulverización, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para formas farmacéuticas de administración tópica no pulverizables, se emplean habitualmente formas viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica, en algunos casos, mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, entre otras, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, bálsamos y similares, que, si se desea, se esterilizan o mezclan con agentes auxiliares (por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales) para influir en diversas propiedades, como, por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas farmacéuticas de administración tópica adecuadas incluyen preparaciones en aerosol pulverizables en las que el principio activo, en algunos casos, en combinación con un vehículo inerte sólido o líquido, se envasa en una mezcla con un volátil presurizado (por ejemplo, un propelente gaseoso, como el freón) o en una botella exprimible. También se pueden agregar hidratantes o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas si se desea. Los ejemplos de tales ingredientes adicionales son bien conocidos en el área.
Si las composiciones que contienen anticuerpos o fragmentos de los mismos se administran por vía intranasal, se pueden formular en forma de aerosol, pulverización, niebla o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para usar de acuerdo con la presente divulgación se pueden administrar convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado (p. ej. diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la dosis unitaria se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos (compuestos por ejemplo, de gelatina) para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular de modo que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada como lactosa o almidón.
Los métodos para la coadministración o el tratamiento con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, una citocina, un esteroide, un agente quimioterápico, un antibiótico o radiación, son conocidos en el área (véanse, por ejemplo, Hardman et al., (eds.) (2001) Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.). Una cantidad eficaz de un agente terapéutico puede disminuir los síntomas en al menos 10%; en al menos 20%; al menos 30%; al menos 40% o al menos 50%.
Otras terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos), que se pueden administrar en combinación con los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación, se pueden administrar con menos de 5 minutos de separación, menos de 30 minutos de separación, 1 hora de separación, aproximadamente 1 hora de separación, aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas de separación, aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de separación, aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de separación, aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de separación, aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de separación, aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de separación, aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de separación, aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de separación, aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de separación, aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de separación, aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de separación, aproximadamente 12 horas a 18 horas de separación, 18 horas a 24 horas de separación, 24 horas a 36 horas de separación, 36 horas a 48 horas de separación, 48 horas a 52 horas de separación, 52 horas a 60 horas de separación, 60 horas a 72 horas de separación, 72 horas a 84 horas de separación, 84 horas a 96 horas de separación, o 96 horas a 120 horas de separación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación. Las dos o más terapias se pueden administrar dentro de una misma visita del paciente.
Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación y las otras terapias se pueden administrar cíclicamente. El ciclo de terapias implica la administración de una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguido de la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, opcionalmente, seguido de la administración de una tercera terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo y así sucesivamente, y la repetición de esta administración secuencial, es decir, el ciclo, para disminuir la aparición de resistencia a una de las terapias, para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o para mejorar la eficacia de las terapias.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación se pueden formular de modo de asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la divulgación atraviesen la barrera hematoencefálica (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Por métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más moléculas que son transportadas selectivamente a células u órganos específicos, mejorando así la administración dirigida del fármaco (véase, por ejemplo, Ranade, (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los ejemplos de moléculas diana incluyen folato o biotina (véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5,416,016 para Low etai); manósidos (Umezawa etal., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun.
153:1038); anticuerpos (Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother.
39:180); receptor de la proteína surfactante A (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120 (Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véanse también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
La divulgación proporciona protocolos para la administración a un sujeto que lo necesita, de una composición farmacéutica que contiene anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación, solos o en combinación con otras terapias. Las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente divulgación se pueden administrar a un sujeto concomitante o secuencialmente. Las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente divulgación también se pueden administrar cíclicamente. El ciclo de terapias implica la administración de una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguido de la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo y la repetición de esta administración secuencial, es decir, el ciclo, para reducir la aparición de resistencia a una de las terapias, para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o para mejorar la eficacia de las terapias.
Las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la divulgación se pueden administrar a un sujeto concurrentemente. El término "concurrentemente" no se limita a la administración de terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) exactamente al mismo tiempo, sino que significa que una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos de la divulgación se administra a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que los anticuerpos de la divulgación puedan actuar junto con la otra terapia o terapias para proporcionar un beneficio mayor que si se administraran de otra manera. Por ejemplo, cada terapia se puede administrar a un sujeto al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes momentos; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, deben administrarse lo suficientemente próximas en el tiempo para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada terapia se puede administrar a un sujeto por separado, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía adecuada. En diversas realizaciones, las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) se administran a un sujeto con menos de 15 minutos, menos de 30 minutos, menos de 1 hora de separación, aproximadamente 1 hora de separación, aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas de separación, aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de separación, aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de separación, aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de separación, aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de separación, aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de separación, aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de separación, aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de separación, aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de separación, aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de separación, aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de separación, 24 horas de separación, 48 horas de separación, 72 horas de separación o 1 semana de separación. En otras realizaciones, se administran dos o más terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) dentro de la misma visita del paciente.
Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación se pueden administrar a un sujeto en la misma composición farmacéutica. Alternativamente, los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación se pueden administrar concurrentemente a un sujeto en composiciones farmacéuticas diferentes. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar a un sujeto por las mismas vías de administración o diferentes.
Habiendo sida descrita completamente la divulgación, se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos y las reivindicaciones siguientes, que son ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Métodos, materiales y cribado de anticuerpos
(i) Líneas celulares
Las líneas celulares BXPC-3, SK-Br-3, BT-474, MDA-MB-453, FaDu y MCF-7 se adquirieron a ATCC y se mantuvieron rutinariamente en medios de cultivo complementados con suero bovino fetal al 10% (FBS).
(ii) Generación de vectores HER3 recombinantes humanos, de cinomólogo, ratón y rata
El dominio extracelular HER3 múrido se amplificó por PCR a partir de ADNc de cerebro de ratón (Clontech) y la secuencia se verificó por comparación con Refseq NM_010153. El ECD de HER3 de rata se transcribió inversamente a partir de ARNm de células Rat-2 y la secuencia se verificó por comparación con NM_017218. Se generó una plantilla de ADNc de HER3 de cinomólogo usando ARN de diversos tejidos de cinomólogo (Laboratorios Zyagen), y el producto de RT-PCR se clonó en pCR®-TOPO-XL (Invitrogen) antes de la secuenciación de ambas cadenas. La HER3 humana se derivó de una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano (Fuente) y se verificó la secuencia en comparación con NM_001982.
Para generar proteínas recombinantes marcadas, se amplificó por PCR HER3, humana, de ratón, rata y cinomólogo usando polimerasa Pwo Taq (Roche Diagnostics). Los productos de PCR amplificados se purificaron en gel y se clonaron en un vector de entrada Gateway pDonR201 (Invitrogen) que había sido modificado previamente para incluir una secuencia líder CD33 N-terminal en el marco y un marcador TAG C-terminal, por ejemplo, el TAG FLAG. El marcador TAG permite la purificación de proteínas monoméricas a través de un anticuerpo monoclonal anti-TAG. Los genes diana se flanquearon con AttB1 y AttB2 permitiendo la recombinación en vectores de destino patentados adaptados a Gateway (por ejemplo, pcDNA3.1) utilizando la tecnología de clonación Gateway® (Invitrogen). Las reacciones de recombinación se realizaron usando una reacción Gateway LR con vectores de destino patentados que contenían un promotor CMV para crear los vectores de expresión del marcador TAG, aunque se puede usar cualquier vector comercialmente disponible.
Se generaron proteínas HER3 recombinantes que fusionaron el ECD de HER3 en dirección 5’ de un sitio de escisión del factor X C-terminal y la bisagra de IgG humana y el dominio Fc para crear una proteína marcada con Fc. Para lograr esto, los diversos ECD de HER3 se amplificaron por PCR y se clonaron en un vector (por ejemplo, pcDNA3.1) modificado para contener una fusión C-terminal en el marco del sitio de factor X-bisagra-hFc. El marco de lectura abierto generado se flanqueó con los sitios AttB1 y AttB2 para la clonación adicional con la tecnología de clonación recombinante Gateway® (Invitrogen). Se usó una reacción LR Gateway para transferir HER3-Fc a un constructo de expresión de destino que contenía un promotor CMV. Se generaron constructos de expresión de mutación puntual de HER3 usando protocolos de mutagénesis de sitio dirigido estándar y se verificó la secuencia de los vectores resultantes.
Tabla 8. Generación de vectores de expresión de HER3. La numeración de aminoácidos de HER3 se basa en NP_00197 h m n NP 42 r n NP 14 r .
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(iii) Expresión de proteínas HER3 recombinantes
Las proteínas HER3 recombinantes deseadas se expresaron en líneas celulares derivadas de HEK293 previamente adaptadas al cultivo en suspensión y cultivadas en un medio sin suero patentado por Novartis. La verificación de la expresión a pequeña escala se realizó en ensayos de transfección transitoria en placa de 6 pocillos basados en lipofección. La producción de proteínas a gran escala mediante transfección transitoria se realizó a una escala de 10­ 20 L en el sistema de biorreactor Wave™ (Wave Biotech). Se usó ADN polietilenimina (Polysciences) como vehículo plasmídico en una proporción de 1:3 (p:p). Los sobrenadantes del cultivo celular se cosecharon 7-10 días después de la transfección y se concentraron mediante filtración de flujo cruzado y diafiltración antes de la purificación.
(iv) Purificación de proteínas marcadas
Las proteínas HER3 marcadas recombinantes (por ejemplo, TAG-HER3) se purificaron recogiendo el sobrenadante del cultivo celular y concentrándolo 10 veces por filtración de flujo cruzado con un filtro de corte de 10 kDa (Fresenius). Se preparó una columna anti-TAG acoplando un anticuerpo monoclonal anti-TAG a Sefarosa 4B activada con CNBr en una proporción final de 10 mg de anticuerpo por ml de resina. El sobrenadante concentrado se aplicó a una columna anti-Tag de 35 ml a una velocidad de flujo de 1-2 ml/minuto. Después del lavado inicial con PBS, el material unido se eluyó con glicina 100 mM (pH 2,7), se neutralizó y se esterilizó por filtración. Las concentraciones de proteínas se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nm y convirtiendo con un factor teórico de 0,66 UA/mg. La proteína purificada se caracterizó finalmente por SDS-PAGE, secuenciación N-terminal y LC-MS.
(v) Purificación de Fc Tag
Se aplicó sobrenadante del cultivo celular concentrado a una columna de flujo rápido de proteína A-Sefarosa de 50 ml a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después del lavado inicial con PBS, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de NaH2PO4 10 mM/isopropanol al 30% (v/v), pH 7,3, seguido de 5 volúmenes de columna de PBS. Finalmente, el material unido se eluyó con citrato 50 mM/NaCl 140 mM (pH 2,7), se neutralizó y se esterilizó por filtración.
(vi) Generación de líneas celulares que sobreexpresan
Para generar una línea celular que exprese altos niveles de HER3 en la superficie celular, se construyó un vector de expresión de mamífero que contenía un inserto que codifica una secuencia líder CD33 en dirección 5’ de los residuos de aminoácidos 20-667 de HER3 humana fusionada en el marco a los residuos de aminoácidos 669-1210 de EGFR humano. Cuando se expresa en células de mamífero, la proteína quimérica resultante contiene un dominio extracelular y transmembrana HER3 N-terminal y un dominio citoplasmático EGFR C-terminal. El vector HER3/1 se transfectó en células CHO-S (Invitrogen) y se generaron mezclas estables después de la selección de antibióticos. La línea celular resultante (CHO HER3/1) expresó altos niveles de dominio extracelular de HER3 en su superficie celular.
(vii) Pannings HuCAL GOLD®
Para la selección de anticuerpos que reconocen HER3 humana se emplearon múltiples estrategias de panning. Se generaron anticuerpos terapéuticos contra la proteína HER3 humana mediante selección de clones con altas afinidades de unión, utilizando como fuente de proteínas variantes de anticuerpos una biblioteca de expresión en fagos comercialmente disponible, la biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®. La biblioteca de fagémidos se basa en el concepto HuCAL® (Knappik etal., (2000) J Mol Biol 296:57-86) y emplea la tecnología CysDisplay® para expresar el Fab en la superficie del fago (WO01/05950 para Lohning).
Para el aislamiento de anticuerpos anti-HER3, se realizaron estrategias de panning estándar así como RapMAT empleando métodos de panning en fase sólida, solución, célula entera y diferencial en célula entera.
(viii) Panning en fase sólida
Para identificar anticuerpos anti-HER3, se llevaron a cabo diversas estrategias de panning en fase sólida usando diferentes proteínas HER3 recombinantes. Para realizar cada ronda de panning en fase sólida, se recubrieron placas Maxisorp (Nunc) con proteína HER3. Las proteínas marcadas se capturaron usando placas previamente recubiertas con anti-Fc (anti-IgG humana de cabra o ratón, Jackson Immuno Research), anticuerpo anti-Tag o mediante adsorción pasiva. Las placas recubiertas se lavaron con PBS y se bloquearon. Las placas recubiertas se lavaron dos veces con PBS antes de la adición de anticuerpos-fago HuCAL GOLD® durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador. Los fagos unidos se eluyeron, se añadieron a TG-1 de E. co liy se incubaron para infección por fagos. Posteriormente, las bacterias infectadas se aislaron y se colocaron en placas de agar. Las colonias se rasparon para retirarlas de las placas y se rescataron y amplificaron los fagos. Cada estrategia de panning de HER3 comprendió rondas individuales de panning y contuvo antígenos, concentraciones de antígeno y rigurosidad de lavado únicos.
(ix) Panning en fase en solución
Cada ronda de panning en fase en solución se llevó a cabo utilizando diversas proteínas HER3 recombinantes biotiniladas en presencia o ausencia de neuregulina 1-p1 (R&D Systems). Las proteínas se biotinilaron usando el kit de biotinilación EZ-link sulfo-NHS-LC (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se lavaron con PBS, una vez, 800 pl de perlas magnéticas unidas a estreptavidina (Dynabeads, Dynal) y se bloquearon durante la noche con Chemiblocker (Chemicon). Los anticuerpos-fago HuCAL GOLD® y la HER3 biotinilada apropiada se incubaron en un tubo de reacción. Se añadieron perlas magnéticas con estreptavidina durante 20 minutos y se recogieron con un separador de partículas magnéticas (Dynal). Los fagos unidos se eluyeron de las Dynabeads mediante la adición de DTT que contenía tampón a cada tubo y se añadieron a TG-1 de E. coli. La infección por fago se realizó de manera idéntica a la descrita en el panning en fase sólida. Cada estrategia de panning de HER3 comprendió rondas individuales de panning y contuvo antígenos, concentraciones de antígenos y rigurosidad de lavado únicos.
(x) Panning celular
Para pannings celulares, los anticuerpos-fago HuCAL GOLD® se incubaron con aproximadamente 107 células en un rotador durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de centrifugación. Se aisló el sedimento celular y los fagos se eluyeron de las células. El sobrenadante se recogió y se añadió al cultivo de TG-1 de E. coli y se continuó mediante el proceso descrito antes. Se emplearon dos estrategias celulares para identificar anticuerpos anti-HER3:
a) Panning en célula entera: en esta estrategia se usaron diversas líneas celulares intactas como antígenos. b) Panning diferencial en célula entera: en esta estrategia los antígenos consistieron secuencialmente en células y proteínas HER3 recombinantes (véase 1981.09 como un ejemplo). Los pannings celulares se realizaron como se describió precedentemente, mientras que se utilizaron protocolos de panning en fase sólida cuando se emplearon proteínas recombinantes como antígenos. Los lavados se realizaron usando PBS (2-3 X) y PBST (2-3 X).
(xi) Generación de la biblioteca RapMAT™ y pannings
Para aumentar la afinidad de unión de los anticuerpos pero manteniendo la diversidad de la biblioteca, se ingresaron los resultados de la segunda ronda de los pannings tanto en fase en solución como en fase sólida en el proceso RapMAT™ mientras que se ingresaron los resultados de la tercera ronda de las estrategias de panning en célula entera y diferencial en célula entera (Prassler et al., (2009) Immunotherapy; 1: 571-583. Se generaron bibliotecas RapMAT™ mediante la subclonación de insertos de fagos que codifican Fab seleccionados mediante panning en el vector de expresión pMORPH®25_bla_LHC y se digirieron para generar bibliotecas H-CDR2 RapMAT™ y L-CDR3 RapMAT™ utilizando enzimas de restricción específicas. Se reemplazaron los insertos con casetes de maduración TRIM (Virnekas et al., (1994) Nucleic Acids Research 22:5600-5607) para H-CDR2 o L-CDR3 de acuerdo con la composición del pool. Se estimó que el tamaño de las bibliotecas varió entre 8 x 106-1 x 108 clones. Se produjeron los anticuerpo-fago RapMAT y se sometieron a dos rondas adicionales de panning en solución, en fase sólida o en células utilizando los métodos experimentales descritos antes.
Ejemplo 2: Expresión transitoria de IgG anti-HER3
Se cultivaron células HEK293-6E adaptadas a la suspensión en un BioWave20 hasta una densidad de aproximadamente 2 x 106 células viables/ml. Las células se transfectaron transitoriamente con el ADN estéril pertinente: PEI-MIX y se cultivaron adicionalmente. Siete días después de la transfección, las células se eliminaron por filtración de flujo cruzado usando filtros Fresenius (0,2 pm). El material exento de células se concentró con filtración de flujo cruzado usando un filtro de corte de 10 kDa (Fresenius) y el concentrado se esterilizó por filtración a través de un filtro stericup (0,22 pm). El sobrenadante estéril se almacenó a 4 °C.
Ejemplo 3: Purificación de IgG anti-HER3
La purificación de IgG se realizó en un sistema de cromatografía de aire ÁKTA 100 explorer a 6 °C en un gabinete de enfriamiento, usando una columna XK16/20 con 25 ml de resina MabSelect SuRe autoempaquetada (todo GE Healthcare). Todas las velocidades de flujo fueron de 3,5 ml/min, excepto para la carga, a un límite de presión de 5 bar. La columna se equilibró con 3 volúmenes de columna de PBS antes de cargar el sobrenadante de la fermentación filtrado a 2,0 mL/min. La columna se lavó con 8 volúmenes de columna de PBS. La IgG se eluyó con un gradiente de pH, comenzando con citrato 50 mM/NaCl 70 mM (pH 4,5), descendiendo linealmente en 12 volúmenes de columna a citrato 50 mM/NaCl 70 mM (pH 2,5), seguido de un paso constante de 2 volúmenes de columna del mismo tampón de pH 2,5. Las fracciones que contenían IgG se juntaron inmediatamente y se esterilizaron por filtración (Millipore Steriflip, 0,22 gm). Se midió la OD280 y se calculó la concentración de proteína basándose en los datos de la secuencia. Se analizaron los pools por separado para determinar la agregación (SEC-MALS) y la pureza (SDS-PAGE y MS).
Ejemplo 4: Expresión y purificación de anticuerpos HuCAL®-Fab en E. coli
La expresión de fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_MH en células TG-1 se llevó a cabo en cultivos en matraces agitadores utilizando 500 mL de medio 2 x YT complementado con 34 gg/mL de cloranfenicol. Los cultivos se agitaron a 30 °C hasta que la OD600 nm alcanzó 0,5. Se indujo la expresión mediante la adición de IPTG 0,75 mM (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido) durante 20 horas a 30 °C. Las células se rompieron con lisozima. Los fragmentos Fab marcados con His6 se aislaron vía IMAC (Bio-Rad). El intercambio de tampón a 1 x PBS de Dulbecco (pH 7,2) se realizó usando columnas PD10. Las muestras se esterilizaron por filtración (0,2 gm). Las concentraciones de proteínas se determinaron por espectrofotometría UV. La pureza de las muestras se analizó en SDS-PAGE desnaturalizante, reductora, al 15%. La homogeneidad de las preparaciones de Fab se determinó en estado nativo por cromatografía de exclusión por tamaño (HP-SEC) con estándares de calibración.
Ejemplo 5: Mediciones de afinidad de anticuerpos HER3 (Kd ) por titulación en equilibrio en la solución (SET)
La determinación de la afinidad en solución se realizó esencialmente como se describió previamente (Friguet et al., (1985) J Immunol Methods 77:305-19). Para mejorar la sensibilidad y la precisión del método SET, se transfirió del ELISA clásico a la tecnología basada en ECL (Haenel et al., (2005) Anal biochem 339:182-84).
Se utilizó HER3-Tag sin marcar (humana, de rata, ratón o cinomólogo) descrita previamente para la determinación de la afinidad por SET.
Los datos se evaluaron con el software XLfit (ID Business Solutions) aplicando modelos de ajuste personalizados. Para la determinación Kd de cada IgG utilizó el modelo siguiente (modificado de acuerdo con Piehler, et al (Piehler et al., 1997 J Immunol Methods 201:189-206.
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[IgG]: concentración total de IgG aplicada
x: concentración total de antígeno soluble aplicado (sitios de unión)
Bmáx: máxima señal de IgG sin antígeno
Kd : afinidad
Ejemplo 6: Determinación de la unión de anticuerpos a células por FACS
Se evaluó la unión de anticuerpos al antígeno humano endógeno expresado en células cancerosas humanas por FACS. Con el fin de determinar los valores de EC50 del anticuerpo, se cosecharon células SK-Br-3 con acutasa y se diluyeron hasta 1 x 106 células/ml en tampón de FACS (PBS/FBS al 3%/NaN3 al 0,2%). Se añadieron 1 x 105 células/pocillo a cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Nunc) y se centrifugó a 210 g durante 5 minutos a 4 °C antes de eliminar el sobrenadante. Se añadieron diluciones en serie de anticuerpos de prueba (diluidos en pasos de dilución 1:4 con tampón de FACS) a las células sedimentadas y se incubó durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron y se sedimentaron tres veces con 100 gL de tampón de FACS. Se añadió anti-IgG humana de cabra conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch) diluido 1/200 con tampón de FACS a las células y se incubó en hielo durante 1 hora. Se realizaron pasos de lavado adicionales tres veces con 100 gL de tampón de FACS seguido de pasos de centrifugación a 210 g durante 5 minutos a 4 °C. Finalmente, las células se resuspendieron en 200 gL de tampón de FACS y se midieron los valores de fluorescencia con FACSArray (BD Biosciences). La cantidad de anticuerpo anti-HER3 unido a la superficie celular se evaluó midiendo la fluorescencia media del canal.
Ejemplo 7: Unión del dominio HER3 y mutante
Se recubrieron placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) toda la noche a 4 °C con 200 ng de la proteína humana recombinante apropiada (HER3-Tag, D1-2-Tag, D2-Tag, D3-4-Tag, D4-Tag, HER3 K267A-Tag, HER3 L268A-Tag, HER3 K267A/L268A y un control irrelevante marcado). Después se lavaron todos los pocilios tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1%, se bloquearon durante una hora con PBS/BSA al 1%/Tween-20 al 0,1% y se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1%. Se agregaron anticuerpos anti-HER3 a los pocillos pertinentes hasta una concentración final de 10 pg/ml en los pocillos apropiados y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. Las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1% antes de la adición del anticuerpo de detección unido a peroxidasa apropiado, diluido 1/10.000 en PBS/BSA al 1%/Tween-20 al 0,1%. Los anticuerpos de detección utilizados fueron anti-ratón de cabra (Pierce, 31432), anti-cabra de conejo (Pierce, 31402) y anti-humano de cabra (Pierce, 31412). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora antes de lavar tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1%. Se añadieron 100 pl de solución de sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) (BioFx) a todos los pocillos durante 6 minutos antes de detener la reacción con 50 pl de H2SO4 al 2,5%. El grado de unión del anticuerpo HER3 a cada proteína recombinante se determinó midiendo la OD450 usando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices). Cuando fue apropiado, se analizaron las curvas de respuesta a la dosis usando Graphpad Prism.
Ejemplo 8: Mapeo de epítopos de HER3 usando espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio
Materiales
Se preparó tampón de D2O disolviendo TBS 25 mM (pH 7,5)/NaCl 500 mM en agua pesada (Sigma). La solución de reducción fue tampón de formiato 50 mM (pH 4) TCEP 500 mM y la solución de detención fue ácido trifluoroacético al 0,5% en agua (v/v). El tampón A fue ácido fórmico al 0,25%/metanol al 10%/etilenglicol al 10% en agua y el tampón B fue ácido fórmico al 0,25% en acetonitrilo. Todos los productos químicos se adquirieron a Sigma, y los solventes de grado HPLC fueron de Fisher Scientific.
Manipulación de líquidos y cromatografía
Los experimentos automatizados de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX MS) se diseñaron basándose en métodos y equipos descritos por Wales etal., (2006) Anal. Chem 78:1005-1014). En resumen, todas las operaciones de manipulación de líquidos utilizaron un manipulador de líquidos Pa1HTS (LEAP Technologies) alojado en un recinto refrigerado mantenido a 2 °C. Una válvula de inyección de 6 puertos y una estación de lavado se montaron en el riel de manipulación de líquidos y facilitaron la inyección de muestras en el sistema cromatográfico y el lavado de jeringas. El sistema cromatográfico constó de una válvula adicional de 10 puertos, una columna de pepsina Poroszyme de 2,1 mm x 30 mm (Applied Biosystems), un cartucho Cap Trap de 0,5 mm x 2 mm de fase inversa (Michrom Bioresources) y un emisor electronebulizador autoempacado como columna analítica (100 pm x ~60 mm, Kinetex 2,6 pm C18, Phenomenex). La cabeza de la válvula de 10 puertos, el cartucho de trampa y la columna analítica se alojaron en un recinto separado construido de aluminio y se mantuvieron a -5 °C mediante pilas peltier. Las válvulas y columnas se configuraron de tal manera que permitieran la digestión de proteínas en línea, la desalinización de péptidos y la cromatografía de fase inversa antes de la introducción de la muestra en la fuente de ionización por electronebulización (ESI) del espectrómetro de masas (LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific).
Las corrientes de líquido requeridas para la operación fueron proporcionadas por dos bombas de HPLC separadas. La primera bomba de HPLC (bomba Surveyor MS, Thermo Scientific) suministró el tampón A a una velocidad de flujo constante de 125 pL/min y se usó para transferir la muestra a través del cartucho de pepsina inmovilizada al cartucho de trampa de fase inversa, montado de lado a lado de la válvula de 10 puertos. Después del período de carga y desalinización, la válvula de 10 puertos se conmutó para que eluyera la muestra con ayuda de una bomba de gradiente (AQUITY UPLC, Waters) desde el cartucho de trampa de fase inversa a través de la columna analítica y hacia la fuente de iones del espectrómetro de masas. El cartucho de enzima inmovilizada se aisló del desperdicio durante la elución en gradiente. La bomba de gradiente suministró segmentos de gradiente lineal de 0 a 40% de fase móvil B durante 35 minutos a 5 pL/min y de 40 a 95% de fase móvil B a 5 pL/min durante 10 minutos. El flujo de gradiente de la bomba se dividió en la válvula de 10 puertos utilizando un divisor pasivo para que el flujo real a través del cartucho de trampa y la columna analítica para la elución del gradiente fuera de ~1 pL/min. La corrida cromatográfica completa fue de 70 minutos, incluidos los pasos de lavado y equilibrio.
Espectrometría de masas
Con el propósito de identificar fragmentos proteolíticos resultantes de la digestión en línea, se realizaron varios experimentos de MS/MS dependientes de los datos. Para estas adquisiciones, se adquirieron espectros MS en tándem con el analizador LTQ del espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap. La selección de la masa del precursor se basó en escaneos MS adquiridos por el analizador Orbitrap. Las adquisiciones MS de una sola etapa realizadas con el propósito de determinar el nivel de deuteración fueran adquiridas por el analizador Orbitrap (en m/z 400-2000) a una resolución de 60.000
Preparación de la proteína y de complejos proteína:Fab
Se preparó la proteína HER3 diluyendo 50 pg de HER3-Tag con TBS 25 mM (pH 7,5)/NaCl 500 mM para obtener un volumen final de 50 pL. Se prepararon los complejos proteína:Fab mezclando 50 pg de HER3-Tag en una relación molar 1:1 molar con los Fab estudiados. Después las mezclas proteína:Fab se diluyeron hasta un volumen final de 50 pL con TBS 25 mM (pH 7,5)/NaCl 500 mM.
Se prepararon los complejos proteína:Fab y se dejaron en incubación durante al menos 2 horas a 4 °C. Se cargaron 4 placas de 96 pocillos que contenían muestra, diluyente, tampón de detención y soluciones de reducción en un manipulador de líquidos, antes del inicio de cada experimento. Para el experimento de intercambio se diluyeron 50 pL de HER3 o HER3:Fab con 150 pL de tampón de D2O. La mezcla se redujo agregando 200 pL de tampón de reducción durante 1 minuto antes de detener con 600 pL tampón de detención. El volumen total después de todos los pasos de manipulación de líquidos fue de ~1 mL. Una vez mezclada, la solución detenida se inyectó en el sistema cromatográfico en el que fue digerida, separada y analizada por LCMS automáticamente. El cambio promedio en la deuteración entre la muestra y el control se calculó como la diferencia entre los niveles de captación de deuterio de la muestra y el control.
Procesamiento de datos
Los archivos Orbitrap RAW se convirtieron en archivos mzXML utilizando un programa interno (RawXtract). Posteriormente, las adquisiciones de MS en tándem se buscaron utilizando SEQUEST (Yates Lab, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) y los resultados de la búsqueda se filtraron automáticamente usando DTASelect 2.0 (Yates Lab, Scripps Research Institute, La Jolla, CA). Usando las identificaciones de la secuencia de péptidos, se usó un programa escrito interno para extraer automáticamente los cromatogramas de iones individuales para cada secuencia identificada y generar espectros promedio a lo largo del pico cromatográfico. Los espectros promedio se suavizaron y se les calculó el centroide. El nivel de captación de deuterio se tomó como la diferencia de masa entre una muestra deuterada y una referencia sin deuterar. Los datos procesados se validaron y ajustaron manualmente para corregir imprecisiones y errores de los pasos de procesamiento automatizados. Se asignaron niveles de captación de deuterio a cada residuo de la secuencia de proteínas deslocalizando el contenido de deuterio a lo largo de cada péptido (es decir, dividiendo el nivel de deuteración observado entre el número de aminoácidos en ese péptido). Si un residuo estaba cubierto por más de un péptido, se promediaron las captaciones de deuterio normalizadas de todos los péptidos que cubrían ese residuo.
Ejemplo 9
Figure imgf000094_0001
ación de la estructura cristalográfica por rayos X de los complejos HER3 humano/Fab de MOR09823 y HER3 humano/Fab de MOR09825
El presente ejemplo presenta la estructura cristalina de HER3 de longitud completa unida_ al fragmento Fab de MOR09823 y al fragmento Fab de MOR09825, determinada a una resolución de 3,2 Á y 3,4 Á, respectivamente. La HER3 humana marcada se purificó adicionalmente en una columna HiLoad 26/60 Superdex 200 PrepGrade (GE Healthcare) equilibrada en PBS (pH 7,3). Se aislaron los Fab de MOR09823 y MOR09825 expresados en E. coli mediante lisis de células con lisozima y se capturaron fragmentos Fab marcados con His6 en una columna HisT rap_HP (GE Healthcare). Los fragmentos Fab de MOR09823 se purificaron posteriormente mediante cromatografía de filtración en gel usando una columna Superdex 75 16/60 (GE Healthcare) equilibrada en Tris 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM.
Se prepararon complejos Fab-HER3 mezclando el exceso de Fab con HER3 marcada (Tag) en una relación molar de 1,3-1,8:1 (concentración estimada por absorbancia a 280 nm usando coeficientes de extinción calculados de 0,9 y 1,4 (mg/ml)-1cm-1 para HER3 y Fab, respectivamente) y purificando los complejos en una columna Superdex 200 10/300 (GE Healthcare) equilibrada en Tris 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM. Las fracciones de los picos se analizaron por SDS-PAGE y LCMS. Para cada complejo, las fracciones que contenían tanto HER3 como Fab en una relación aproximadamente equimolar se agruparon y se concentraron. Se desarrollaron cristales de HER3/MOR09823 a 293 K por el método de difusión de vapor de gota sentada de las gotas que contenían 150 nl de complejo HER3/MOR09823 y 150 nl de solución del depósito (citrato de sodio 100 mM pH 5,6, PEG 4000 al 20% e isopropanol al 20%). Los cristales se transfirieron a la solución del depósito que contenía 8% adicional de glicerol y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido. Se desarrollaron cristales de HER3/MOR09825 a 293 K por el método de difusión de vapor de gota sentada de las gotas que contenían 150 nl de complejo HER3/MOR09825 y 150 nl de solución del depósito (bistris 100 mM pH 6,5, PEG 10.000 al 16%). Los cristales se transfirieron a bis-tris 100 mM pH 6,5, PEG 10.000 al 18% y glicerol al 22% y se enfriaron instantáneamente en nitrógeno líquido.
Los datos se recopilaron en la línea de haz 17-ID en Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory). Los datos de los complejos HER3/Fab de MOR09823 se procesaron y escalaron a 3,2 Á usando HKL2000 (HKL Research Inc) en el grupo espacial I222 con dimensiones de celda a = 124,16, b = 139,44, c = 180,25 Á, con buena estadística. La estructura de HER3/Fab de MOR09823 se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando Phaser (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674) con fragmentos de un Fab y la estructura de ECD de HER3 publicada 1 mb6 como modelos de búsqueda. El modelo final, que contenía 1 molécula del complejo HER3/Fab de MOR09823 por unidad asimétrica, se construyó en COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132) y se refinó hasta valores R y Rlibre de 19,0 y 24,5%, respectivamente, con un valor rmsd de 0,010 Á y 1,37° para longitudes de enlace y ángulos de enlace, respectivamente, usando BUSTER (Global Phasing, LTD). Los residuos de HER3 que contienen átomos dentro de una distancia de 5 Á de cualquier átomo de Fab de MOR09823 como se identifica en PyMOL (Schrodinger, LLC) se listan en las tablas 11 y 12. Los datos de los complejos HER3/Fab de MOR09825 se procesaron y escalaron a 3,4 Á usando autoPROC (Global Phasing, LTD) en el grupo espacial I222 con dimensiones de celda a = 124,23, b = 140,94, c = 180,25 Á, con buena estadística. La estructura de HER3/Fab de MOR09825 se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando Phaser (McCoy etal., (2007) J. Appl. Cryst.40:658-674) con la estructura de HER3/Fab de MOR09823 como modelo de búsqueda. El modelo final, que contenía 1 molécula del complejo HER3/Fab de MOR09825 por unidad asimétrica, se construyó en COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132) y se refinó hasta valores R y Rlibre de 18,8 y 24,9%, respectivamente, con un valor rmsd de 0,009 Á y 1,21° para longitudes de enlace y ángulos de enlace, respectivamente, usando BUSTER (Global Phasing, LTD). Los residuos de HER3 que contienen átomos dentro de una distancia de 5 Á de cualquier átomo de Fab de MOR09825 como se identifica en PyMOL (Schrodinger, LLC) se listan en las tablas 13 y 14.
Ejemplo 10: Ensayos celulares in vitro de fosfo-HER3.
Se mantuvieron rutinariamente células MCF-7 en DMEM/F12, HEPES 15 mM, L-glutamina, FCS al 10% y SK-Br-3 en medio 5a de McCoy, FCS al 10%, L-glutamina 1,5 mM. Las células MCF7 o SK-Br-3 subconfluentes cultivadas en medios completos se cosecharon con acutasa (PAA Laboratories) y se resuspendieron en los medios de cultivo apropiados a una concentración final de 5 x 105 células/ml. Luego se añadieron 100 pl de suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos (Nunc) para obtener una densidad final de 5 x 104 células/pocillo. Se permitió que las células MCF7 se adhirieran durante aproximadamente 3 horas antes del cambio de medio por medio de inanición que contenía 0,5% de FBS. Después todas las placas se incubaron durante la noche a 37 °C antes del tratamiento con la concentración apropiada de anticuerpos contra HER3 (diluidos en los medios apropiados) durante 80 minutos a 37 °C. Las células MCF7 se trataron con 50 ng/ml de dominio EGF de neuregulina 1-p 1 (R&D Systems) durante los últimos 20 minutos para estimular la fosforilación de HER3. Todos los medios se aspiraron suavemente y las células se lavaron con PBS helado que contenía CaCl21 mM y MgCl20,5 mM (Gibco). Las células se lisaron agregando 50 pL de tampón de lisis helado (Tris 20 mM (pH 8,0)/NaCl 137 mM/Glicerol al 10%/EDTA 2 mM/1% de NP-40/ortovanadato de sodio 1 mM/Aprotinina (10 pg/mL)/Leupeptina (10 pg/mL)) y se incubaron en hielo con agitación durante 30 minutos. Después se recogieron los lisados y se centrifugaron a 1800 g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares. Se agregaron 20 pL del lisado a una placa de captura preparada previamente.
Se generaron placas de captura de HER3 utilizando una placa de carbono (Mesoscale Discovery) que se recubrió durante toda la noche a 4 °C con 20 pL de anticuerpo de captura MAB3481 4 pg/ml (R&D Systems) diluido en PBS y posteriormente se bloqueó con seroalbúmina bovina al 3% en 1 x tampón Tris (Mesoscale Discovery)/Tween-20 al 0,1%. Se capturó a HER3 del lisado incubando la placa a temperatura ambiente durante una hora con agitación, antes de aspirar el lisado, y los pocillos se lavaron con 1 x tampón Tris (Mesoscale Discovery)/Tween-20 al 0,1%. Se detectó HER3 fosforilada utilizando 0,75 pg/ml de anticuerpo anti-fosfotirosina biotinilado (R&D Systems) preparado en BSA al 1%/1 x Tris/Tween-20 al 0,1% mediante incubación con agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocillos se lavaron cuatro veces con 1 x Tris/Tween-20 al 0,1% y se detectaron las proteínas biotiniladas incubando con estreptavidina marcada con S-Tag (Mesoscale Discovery) diluida en BSA al 1%/1 x Tris/Tween-20 al 0,1% durante una hora a temperatura ambiente. Cada pocillo se aspiró y se lavó cuatro veces con 1 x Tris/Tween-20 al 0,1% antes de agregar 20 pL de tampón de lectura T con surfactante (Mesoscale Discovery) y la señal se cuantificó con un equipo Mesoscale Sector Imager. Se incluyeron los anticuerpos MOR06391 o MOR03207 en los experimentos de señalización como controles de isotipo.
Ejemplo 11: Ensayos celulares in vitro de fosfo-Akt (S473).
Células SK-Br-3 y BT-474 subconfluentes cultivadas en medios completos se cosecharon con acutasa (PAA Laboratories) y se resuspendieron en los medios de cultivo apropiados a una concentración final de 5 x 105 células/ml. Después se añadieron 100 pl de suspensión de células a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos (Nunc) para obtener una densidad final de 5 x 104 células/pocillo. Después todas las placas se incubaron toda la noche a 37 °C antes del tratamiento con la concentración apropiada de anticuerpos contra HER3 (diluidos en los medios apropiados) durante 80 minutos a 37 °C. Todos los medios se aspiraron suavemente y las células se lavaron con PBS helado que contenía CaCl21 mM y MgCl20,5 mM (Gibco). Las células se lisaron agregando 50 pL de tampón de lisis helado (Tris 20 mM (pH 8,0)/NaCl 137 mM/Glicerol al 10%/EDTA 2 mM/1% de NP-40/ortovanadato de sodio 1 mM/Aprotinina (10 pg/mL)/Leupeptina (10 pg/mL)) y se incubaron en hielo con agitación durante 30 minutos. Después se recogieron los lisados y se centrifugaron a 1800 g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar los restos celulares. Se agregaron 20 pL de lisado a una placa de carbono multipunto de fosfo-Akt de 384 pocillos (Mesoscale Discovery) que había sido bloqueada previamente con BSA al 3%/1 x Tris/Tween-20 al 0,1%. La placa se incubó a temperatura ambiente durante dos horas con agitación, antes de aspirar el lisado, y los pocillos se lavaron cuatro veces con 1 x tampón Tris (Mesoscale Discovery)/Tween-20 al 0,1%. Se detectó Akt fosforilada con 20 pL de anticuerpo SULFO-Ta G anti-fosfo-Akt (S473) (Mesoscale Discovery) diluido 50 veces en BSA al 1%/1 x Tris/Tween-20 al 0,1% mediante incubación con agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. Los pocillos se lavaron cuatro veces con 1 x Tris/Tween-20 al 0,1% antes de agregar 20 pL de tampón de lectura T con surfactante (Mesoscale Discovery) y la señal se cuantificó con un equipo Mesoscale Sector Imager. Se incluyeron anticuerpos los MOR06391 o MOR03207 en los experimentos de señalización como controles de isotipo.
Ejemplo 12: Ensayos de proliferación de líneas celulares.
Se cultivaron rutinariamente células SK-Br-3 en medio 5A de McCoy modificado, complementado con 10% de suero bovino fetal y se cultivaron células BT-474 en DMEM complementado con 10% de FBS. Las células subconfluentes se tripsinizaron, se lavaron con PBS, se diluyeron hasta 5 x 104 células/ml con medio de cultivo y se sembraron en placas negras de fondo transparente de 96 pocillos (Costar 3904) a una densidad de 5000 células/pocillo. Las células se incubaron toda la noche a 37 °C antes de agregar la concentración apropiada de anticuerpo contra HER3 (concentraciones finales habituales de 10 o 1 Mg/ml). Las placas se volvieron a la estufa de incubación durante 6 días antes de evaluar la viabilidad celular con CellTiter-Glo (Promega). Se añadieron 100 mL de solución CellTiter-Glo a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 10 minutos. La cantidad de luminiscencia se determinó utilizando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices). El grado de inhibición de la multiplicación obtenido con cada anticuerpo se calculó comparando los valores de luminiscencia obtenidos con cada anticuerpo contra HER3 con un anticuerpo de control de isotipo estándar (MOR06391).
Para los ensayos de proliferación, se cultivaron rutinariamente células MCF-7 en DMEM/F12 (1:1) que contenía L-Glutamina 4 mM/HEPES 15 mM/FBS al 10%. Las células subconfluentes se tripsinizaron, se lavaron con PBS y se diluyeron a 1 x 105 células/ml con DMEM/F12 (1:1) que contenía L-glutamina 4 mM/HEPES 15 mM/10 Mg/ml de trasnsferrina humana/BSA al 0,2%. Las células se sembraron en placas negras de fondo transparente de 96 pocillos (Costar) a una densidad de 5000 células/pocillo. Después se agregó la concentración apropiada de anticuerpo contra HER3 (concentraciones finales habituales de 10 o 1 Mg/mL). También se agregaron 10 ng/mL de dominio EGF de NRG1-p1 (R&D Systems) a los pocillos apropiados para estimular la multiplicación celular. Las placas se volvieron a la estufa de incubación durante 6 días antes de evaluar la viabilidad celular con CellTiter-Glo (Promega). El grado de inhibición de la multiplicación obtenido con cada anticuerpo se calculó sustrayendo los valores de luminiscencia de fondo (no neuregulina) y comparando los valores resultantes obtenidos con cada anticuerpo contra HER3 con un anticuerpo de control de isotipo estándar (MOR06391).
Ejemplo 13: Ensayos celulares de bloqueo del ligando
Las células MCF-7 cultivadas en MEM complementado con 10% de FBS y 1 Mg/ml de insulina (Sigma) se enjuagaron y se recogieron en un pequeño volumen de tampón de disociación celular FACSmax (Genlantis) antes de la adición de 5 ml de tampón de FACS (PBS/1% de FBS/0,1% de azida de sodio). Se contó la densidad celular y se ajustó a una concentración final de 1 x 106 células/ml. Se añadieron 100 mI de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y las células se sedimentaron por centrifugación (220 g, 3 minutos, 4 °C). Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 mL de los anticuerpos de prueba apropiados diluidos en tampón de FACS (las concentraciones finales de anticuerpo habituales variaron entre 100 y 0,1 nM) y la placa se incubó en hielo durante 45 minutos. Se incluyó como control positivo el anticuerpo de bloqueo de ligando MAB3481 (R&D Systems). Las células se lavaron dos veces con tampón de tinción antes de agregar dominio EGF de NRG1-p1 10 nM (R&D Systems) diluido en tampón de FACS e incubar en hielo durante 45 minutos. Las células se lavaron dos veces con tampón de tinción y la neuregulina unida se detectó incubando las células con anticuerpo antidominio EGF de NRG1-p1 humana 10 nM (R&D Systems) en hielo durante 45 minutos. Las células se lavaron dos veces con tampón de tinción y se incubaron en hielo durante 45 minutos con anticuerpo anti-cabra unido a PE (Jackson ImmunoResearch) diluido 1/500 con tampón de FACS. Después las células se sedimentaron por centrifugación y el sedimento se resuspendió en 200 mI de tampón de FACS. Para cuantificar cada muestra, se contaron 10.000 células vivas en un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences) y se evaluó la cantidad de neuregulina unida a la superficie celular midiendo la fluorescencia media del canal.
Ejemplo 14: Ensayo bioquímico de bloqueo del ligando
El presente método incluye la utilidad de un biosensor basado en resonancia de plasmones superficiales (SPR) (Biacore™, GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para examinar la capacidad de los complejos HER3/anticuerpo para unirse a la neuregulina.
Biacore™ utiliza el fenómeno de resonancia de plasmones superficiales (SPR) para detectar y medir las interacciones de unión. En un experimento Biacore típico, una de las moléculas que interactúan (neuregulina) se inmoviliza en una matriz mientras que la pareja de la interacción (HER3) se hace fluir sobre la superficie. Una interacción de unión da como resultado un aumento de la masa en la superficie del sensor y un cambio directo correspondiente en el índice de refracción del medio en las proximidades de la superficie del sensor. Los cambios en el índice o la señal de refracción se registran en unidades de resonancia (R.U.). Los cambios de señal debidos a la asociación y disociación de complejos se controlan de forma no invasiva, de forma continua y en tiempo real, cuyos resultados se informan en forma de sensorgrama.
Se utilizó Biacore™ T100 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para llevar a cabo todos los experimentos informados en este documento. La preparación de la superficie del sensor y los análisis de interacción se realizaron a 25 °C. Los reactivos y el tampón Biacore se compraron a GE Healthcare. Se utilizó tampón de corrida que contenía Hepes 10 mM, pH 7,4/NaCl 150 mM, 0,05% de P20, 0,5% de BSA durante todo el ensayo.
El dominio extracelular de NRG-1p1 (R&D Systems) se incubó en hielo durante 45 minutos con EZ-link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina (Pierce) en una relación molar de 5:1. La reacción se detuvo mediante la adición de etanolamina en exceso y la biotina sin acoplar se eliminó de la NRG biotinilada usando columnas de rotación de desalinización (Zeba). La NRG biotinilada se capturó en un chip sensor CAP preinmovilizado con aproximadamente 3000 R.U. de ADNmcestreptavidina (kit Biotin CAPture) para producir densidades de superficie de neuregulina que variaron entre 400-600 R.U. Se generó una celda de flujo de referencia omitiendo la NRG biotinilada de los pasos de inyección de modo que solo estuviese presente ADNmc-estreptavidina en la superficie de la celda de flujo.
Se generaron complejos HER3/anticuerpo incubando HER3 humana-Fc 10 nM con concentraciones crecientes (0-50 nM) del anticuerpo de prueba apropiado durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de incubar en Biacore™ a 10 °C. Se llevaron a cabo análisis de interacción inyectando en serie complejos HER3/anticuerpo en superficies de referencia y de neuregulina durante 180 segundos a una velocidad de flujo de 60 |uL/min. La disociación del complejo se controló durante 180 segundos a una velocidad de flujo de 60 |ul/min. La regeneración de la superficie se realizó al final de cada ciclo de análisis utilizando una inyección de 120 segundos de guanidina 8 M: NaOH 1 M (3:1) seguido de una inyección de 120 segundos de acetonitrilo al 30%/NaOH 0,25 M a una velocidad de flujo de 30 |uL/min.
Ejemplo 15: Estudios PD in vivo
Se cultivaron células BxPC3 y BT-474 y se implantaron en ratones hembras atímicos nu/nu Balb/C (Harlan Laboratories) como se describe en los ejemplos 16 y 17.
Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño apropiado, se examinó la calidad del tumor en los animales. Los animales con tumores ulcerados o animales con tumores llenos de líquido se excluyeron del estudio. Los animales restantes recibieron dosis de anticuerpo por vía intravenosa mediante inyección en la vena lateral de la cola. En los tiempos indicados, se sacrificaron los animales por asfixia con CO2 y se les extrajo sangre entera mediante punción cardíaca que se colocó en un tubo de extracción Eppendorf de 1,5 ml. El tejido tumoral se disecó inmediatamente, se colocó en un tubo de muestra de polipropileno con tapa de rosca y se congeló en nitrógeno líquido. El tejido se almacenó a -80 °C hasta que se prepararon los lisados.
Ejemplo 16: Estudios de eficacia en BT-474 in vivo
Se cultivaron células BT-474 en DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación.
Un día antes de la inoculación de las células, se implantó subcutáneamente en ratones hembra nu/nu Balb/C (Laboratorios Harlan) un gránulo de 17p-estradiol de liberación sostenida (Innovative Research of America) para mantener los niveles séricos de estrógeno. Un día después de la implantación del gránulo de 17p-estradiol, se inyectaron 5 x106 células ortotópicamente en la cuarta almohadilla de grasa mamaria en una suspensión que contenía 50% de matrigel sin rojo fenol (BD Biosciences) en solución salina equilibrada de Hank. El volumen total de inyección que contenía células en suspensión fue de 200 |ul. Veinte días después de la implantación de las células, se incluyeron en el estudio de eficacia los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 200 mm3. En general, se incluyeron en el estudio de eficacia un total de 10 animales por grupo.
Para los estudios con un solo agente, los animales recibieron dosis de MOR10701 o MOR10703 por vía intravenosa mediante inyección en la vena lateral de la cola. En la primera dosis se les administró una dosis de carga inicial de 40 mg/kg. Después de la dosis inicial, los animales recibieron 20 mg/kg, día por medio mientras duró el estudio. Para los estudios de combinación, los animales recibieron dosis de MOR10701 o MOR10703 (20 mg/kg, iv, cada 2 días) y una dosis subóptima de trastuzumab (1 mg/kg, iv, cada 2 semanas).
Mientras duraron los estudios, el volumen del tumor se midió mediante calibre dos veces por semana. Los valores de porcentaje de tratamiento/control (T/C) se calcularon utilizando la fórmula siguiente:
% T/C = 100 x AT/AC si AT >0
donde:
T = volumen medio del tumor del grupo tratado con fármaco el día final del estudio;
AT = volumen medio del tumor del grupo tratado con fármaco el día final del estudio - volumen medio del tumor del grupo tratado con fármaco el día de inicio de la administración de dosis;
C = volumen medio del tumor del grupo de control el día final del estudio; y
AC = volumen medio del tumor del grupo de control el día final del estudio - volumen medio del tumor del grupo de control el día de inicio de la administración de dosis.
El peso corporal (BW) se midió dos veces por semana y la dosis se ajustó según el peso corporal. El % de cambio en el peso corporal se calculó como (BWactual - BWinicial)/(BWinicial) x 100. Los datos se presentan como porcentaje de cambio del peso corporal desde el día de inicio del tratamiento.
Todos los datos se expresaron como la media ± el error estándar de la media (SEM). Para el análisis estadístico se utilizaron el delta volumen del tumor y el peso corporal. Las comparaciones entre grupos se llevaron a cabo utilizando un ANOVA unidireccional seguido de un Tukey post hoc. Para todas las evaluaciones estadísticas, el nivel de significación se estableció en p <0,05. Se informa la significación en comparación con el grupo de control con vehículo.
Ejemplo 17: Estudios de eficacia en BxPC3 in vivo
Se cultivaron células BxPC3 en medio RPMI-1640 que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación.
Se implantaron por vía subcutánea a ratones hembra atímicos nu/nu Balb/C (Harlan Laboratories) 10 x 106 células en una mezcla de 50% de solución salina tamponada con fosfato y 50% de matrigel. El volumen total de inyección que contenía células en suspensión fue de 200 pl. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 200 mm3, se incluyeron los animales en el estudio de eficacia. En general, se incluyeron en los estudios un total de 10 animales por grupo. Se excluyeron los animales que presentaban características inusuales de crecimiento del tumor antes de la inclusión.
Los animales recibieron dosis por vía intravenosa a través de la vena lateral de la cola. En la primera dosis se les administró una dosis de carga inicial de 40 mg/kg. Después de la dosis inicial, los animales recibieron 20 mg/kg, día por medio mientras duró el estudio (25 días en tratamiento). Se calcularon los valores de volumen del tumor y T/C según se detalló previamente.
Ejemplo 18: Ensayos PD in vivo para fosfo-Akt (S473).
Se descongelaron aproximadamente 50 mm3 de tejido de tumor congelado (por ejemplo, BT-474 o BXPC-3) en hielo y se agregaron 100-300 pL de tampón T-PER (Pierce) que contenía fosfatasa (Roche) e inhibidores de proteasa (Roche) a cada muestra. El volumen de tampón de lisis agregado dependió del tamaño de la muestra tumoral. El tejido se rompió usando una mano de mortero de 1,5 ml (Fisher Scientific) y las suspensiones resultantes se incubaron en hielo durante 15 minutos antes de congelarlas toda la noche a -80 °C. Las muestras se descongelaron y se centrifugaron durante 15 minutos a 13.000 g, 4 °C, antes de cuantificar la concentración de proteína sobrenadante mediante el ensayo BCA (Thermo Scientific). Los sobrenadantes tisulares se diluyeron con tampón de lisis (Mesoscale Discovery) y se agregaron 25 pg a una placa de carbono multipunto de Fosfo-Akt de 96 pocillos (Mesoscale Discovery) que había sido bloqueada previamente con solución de bloqueo A (Mesoscale Discovery). La placa se incubó a temperatura ambiente durante una hora con agitación antes de aspirar el lisado y los pocillos se lavaron cuatro veces con tampón de lavado Tris (Mesoscale Discovery). Se detectó Akt fosforilada utilizando 25 pL de anticuerpo anti-fosfo-Akt SULFO-TAG (S473) (Mesoscale Discovery) diluido en tampón de dilución de anticuerpos mediante incubación con agitación a temperatura ambiente durante una hora. Los pocillos se lavaron cuatro veces con tampón de lavado Tris antes de agregar 150 pL de tampón de lectura T con surfactante (Mesoscale Discovery) y la señal se cuantificó con un equipo Mesoscale Sector Imager.
Ejemplo 19: Ensayos PD in vivo para fosfo-HER3 (Y1197)
Se descongelaron aproximadamente 50 mm3 de tejido de tumor congelado (por ejemplo, BXPC-3) en hielo y se agregaron 100-300 pL de tampón T-PER (Pierce) que contenía fosfatasa (Roche) e inhibidores de proteasa (Roche) a cada muestra. El tejido se rompió usando una mano de mortero de 1,5 ml (Fisher Scientific) y las suspensiones resultantes se incubaron en hielo durante 15 minutos antes de congelarse toda la noche a -80 °C. Las muestras se descongelaron y se centrifugaron durante 15 minutos a 13.000 g, 4 °C, antes de cuantificar la concentración de proteína sobrenadante mediante el ensayo BCA (Thermo Scientific). Los sobrenadantes tisulares se diluyeron con tampón de lisis y se agregaron 150 pg a una placa de carbono multipunto de 96 pocillos (Mesoscale Discovery) que había sido recubierta previamente toda la noche con 4 pg/mL de MAB3481 (R&D Systems) y bloqueada con leche al 3%. La placa se incubó a temperatura ambiente durante dos horas con agitación antes de aspirar el lisado y los pocillos se lavaron cuatro veces con tampón de lavado Tris (Mesoscale Discovery). La HER3 fosforilada se unió usando pY1197 anti-HER3 diluido 1/8000 con tampón de bloqueo. Después de la incubación a temperatura ambiente durante una hora los pocillos se lavaron con tampón de lavado Tris y se detectó el anticuerpo anti-pY1197 utilizando anticuerpo anti-conejo marcado con S-Tag (Mesoscale Discovery) diluido 1/1000 en tampón de bloqueo incubando con agitación a temperatura ambiente durante una hora. Los pocillos se lavaron cuatro veces con tampón de lavado Tris antes de agregar 150 pL de tampón de lectura T diluido 1/4 (con surfactante) (Mesoscale Discovery) y la señal se cuantificó con un equipo Mesoscale Sector Imager.
Ejemplo 20: Estudios de combinación de fármacos in vitro
Para evaluar la capacidad de los anticuerpos dirigidos a HER3 para combinarse con terapias dirigidas, se combinaron MOR09825 o MOR10703 con trastuzumab, lapatinib, BEZ235, BKM120, BYL719, RAD001, erlotinib y cetuximab en ensayos de viabilidad celular. Aproximadamente 1000-1500 células SK-Br-3 (McCoy), MDA-MB-453 (RPMI), FaDu (EMEM) o L3.3 (RPMI) se sembraron en placas de 384 pocillos en los medios de cultivo apropiados complementados con 2% de FBS y se permitió que se adhirieran toda la noche a 37 °C. Las combinaciones de fármacos apropiadas (las concentraciones de fármaco finales habituales para lapatinib, BKM120 y BYL719 variaron de 3 pM a 13 nM; para RAD001 variaron de 27 nM a 0,0041 nM; para erlotinib variaron de 1 pM a 0,0025 nM; para MOR1073 variaron de 100 nm a 0,01 nm; para cetuximab variaron de 100 nM a 0,0015 nM; y para trastuzumab variaron de 300 nM a 0,046 nM)) se agregaron posteriormente a los pocillos de manera que cada placa contuviera una curva de respuesta a la dosis de cada fármaco en una matriz bidimensional. Las placas se volvieron a la estufa de incubación durante 3-6 días antes de evaluar la viabilidad celular con CellTiter-Glo (Promega). Se agregó solución de CellTiter-Glo a cada pocillo y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 10 minutos. La cantidad de luminiscencia se determinó utilizando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices). Se calculó el grado de inhibición de la multiplicación obtenido con cada combinación y se resaltó la actividad de combinación usando el modelo de aditividad de Loewe.
Ejemplo 21: Estudios de combinación de fármacos en células L3.3 in vivo.
Se cultivaron células pancreáticas L3.3 en medio DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor hasta el momento de la implantación. Se implantaron subcutáneamente en ratones atímicos hembra Foxn1 (Harlan Laboratories) 3 x 106 células en DMEM exento de FBS. El volumen total de inyección que contenía células en suspensión fue de 100 pl. Doce días después de la implantación de células, se incluyeron en el estudio de eficacia los animales con un volumen tumoral medio de aproximadamente 100 mm3 para todos los grupos. En general, se incluyeron en los estudios un total de 8 animales por grupo. Se excluyeron los animales que presentaban características inusuales de crecimiento del tumor antes de la inclusión.
Los animales recibieron dosis intravenosas de MOR10703 mediante inyección en la vena lateral de la cola de 20 mg/kg, día por medio mientras duró el estudio (14 días en tratamiento). Se les administró Erlotinib en una dosis de 50 mg/kg (PO) diariamente como agente único o en combinación con MOR10703. Se calcularon los valores de volumen del tumor y T/C según se detalló previamente.
Resultados y discusión
En conjunto, estos resultados muestran que una clase de anticuerpos se une a residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 de un epítopo conformacional de HER3 y estabiliza a HER3 en una conformación inactiva o cerrada. La unión de estos anticuerpos inhibe tanto la señalización dependiente de ligando como la independiente de ligando. Estos anticuerpos también se pueden unir concurrentemente con un ligando de HER3.
(i) Determinación de la afinidad
La afinidad del anticuerpo se determinó mediante titulación en equilibrio en la solución (SET) como se describió antes. Los resultados se resumen en la Tabla 9 y los ejemplos de curvas de titulación para MOR10701 están contenidos en la figura 1. Los datos indican que se identificaron varios anticuerpos que se unían estrechamente a HER3 humana, de cinomólogo de rata y múrida.
Tabla 9: Valores Kd de las IgG anti-HER3 determinados por titulación en equilibrio en la solución (SET). Hu (humana), Cy (de cinomólo o , Mu múrida ra de rata
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(ii) Determinación de EC50 para células SK-Br-3
La capacidad de los anticuerpos identificados para unirse a células que expresan HER3 se determinó calculando los valores de EC50 para su unión a la línea celular SK-Br-3 amplificada por HER2 (véanse la figura 2 y la tabla 10).
Tabla 10: V l r E r FA I ni-HER n l l K-Br- . n. . n rmin
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(iii) Unión a dominios de HER3
Se caracterizó un subconjunto de anticuerpos anti-HER3 por su capacidad para unirse a los diversos dominios extracelulares de HER3 humano en un ensayo ELISA. Para lograr esto, el dominio extracelular de HER3 se dividió en sus cuatro dominios constitutivos y varias combinaciones de estos dominios se clonaron, se expresaron y se purificaron como proteínas independientes como se describió antes. Usando esta estrategia, se generaron con éxito los dominios siguientes como proteínas solubles: dominios 1 y 2 (D1-2), dominio 2 (D2), dominios 3 y 4 (D3-4) y dominio 4 (D4). También se probaron varios anticuerpos anti-HER3 humana de ratón generados internamente (8D7, 1F5 y 8P2) como controles positivos para demostrar la integridad de cada dominio aislado.
Como se muestra en la figura 3, se observó que MOR09823 y MOR09825 se unían con éxito al dominio extracelular de HER3, pero se observó poca unión a los dominios aislados en este ensayo con estos anticuerpos. Hay varias explicaciones posibles para este patrón de unión:
a) MOR09823 y MOR09825 se pueden unir a un epítopo lineal que se extiende por un límite del dominio, por lo que parte del epítopo de unión se habría perdido cuando los dominios se expresaron como proteínas aisladas. b) MOR09823 y MOR09825 se pueden unir a un epítopo no lineal que actúa de puente entre múltiples dominios.
En consecuencia, la separación de HER3 en sus unidades componentes puede destruir el sitio de unión. c) La forma/conformación de HER3 puede ser un componente de la unión de MOR09823 y MOR09825 a HER3 de modo que solo el dominio extracelular de longitud completa de HER3 es capaz de adoptar esta forma/conformación en tanto los dominios aislados no pueden asumir completamente esta conformación.
(vi) Mapeo de epítopos de HER3 usando espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio
El epítopo de HER3 se exploró adicionalmente mediante análisis HDX-MS de ECD de HER3 en presencia y ausencia de versiones Fab de MOR09823, MOR09824, MOR09825 y MOR09974. La figura 4A muestra que en ausencia de Fab unido, aproximadamente el 69% de la secuencia ECD de HER3 estaba cubierta por al menos un péptido. Los huecos en la cobertura se pueden deber a la glicosilación de residuos dentro de estas regiones o a la reducción insuficiente de los enlaces disulfuro en las regiones ricas en cisteína, lo cual es particularmente evidente en el dominio 2. Curiosamente, aunque cada Fab produjo patrones de protección individuales, se observó consistentemente una región de protección fuerte con MOR09823, MOR09824, MOR09825 y MOR09974 (véase Figura 4B) lo que indica que esta familia de anticuerpos altamente relacionados se une a HER3 de manera idéntica. La protección más fuerte se observó para los residuos del dominio 2, 269-286 (TFQLEPNPHTKYQYGGVC) (SEQ ID NO: 146) lo que indica que los residuos de esta vecindad pueden ser importantes para la unión de mAb. El mapeo de los residuos protegidos Fab en la estructura cristalina de HER3 publicada (Cho & Leahy, (2002) Science 297:1330-1333) resalta que los residuos 269-286 están dentro y próximos a un bucle en horquilla p funcionalmente importante dentro del dominio 2 (véase Figura 4C).
(vii) Estructura cristalina de HER3/MOR09823
Se resolvió la estructura cristalina por rayos X con resolución 3,2 Á del fragmento Fab de MOR09823 unido al dominio extracelular de HER3 para definir aún más el epítopo de HER3 que es reconocido por esta familia de anticuerpos relacionados (véase Figura 5A). Además, se resolvió la estructura a 3,4 Á del fragmento Fab de MOR09825 unido a HER3 humana. En ambas estructuras cristalinas de MOR09823/HER3 y MOR09825/HER3, HER3 está en la conformación atada (inactiva) (véanse Figuras 5A, B, C y D). Esta conformación se caracteriza por una interfase de interacción significativa entre los dominios 2 y 4 mediada por un bucle de dimerización en horquilla p en el dominio 2. La conformación observada de HER3 es similar a la descrita previamente por Cho etal. (Cho & Leahy, (2002), Science 297:1330-1333) quienes publicaron la estructura cristalina del dominio extracelular de HER3 en ausencia de neuregulina. Dado que la neuregulina puede activar a HER3, se presume que la conformación atada de HER3 está inactiva. También se han observado conformaciones atadas similares cuando se cristalizaron los miembros relacionados HER4 (Bouyain et al., (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:15024-15029) y HER1 (Ferguson et al, (2003) Molec. Cell 11:507-517) de la familia de EGFR.
Las relaciones espaciales entre los dominios 1 y 4 de HER3 en el estado inactivo (atado) son significativamente diferentes de las del estado extendido (activo). Este hallazgo se basa en las estructuras cristalinas de los miembros HER2 y HER1 unidos a ligando relacionados, de la familia de EGFR (Cho et al., (2003) Nature 421:756-760; Ogiso et al., (2002) Cell 110:775-787; Garrett et al., (2002) Cell 110:763-773) los cuales están en un estado extendido (activo). En el estado extendido, el bucle de dimerización en horquilla p del dominio 2 se libera de su interacción inhibidora con 4 y, por lo tanto, es libre de interactuar con las proteínas con las que se dimeriza. Por lo tanto, el bucle de dimerización en horquilla p del dominio 2 es funcionalmente importante tanto para mantener el estado atado (inactivo) como para mediar en la dimerización de los receptores de EGF en el estado extendido, lo que conduce a la activación del dominio intracelular cinasa. Por lo tanto las estructuras cristalinas de MOR09823/HER3 y MOR09825/HER3 (véase Figura 5) sugieren que tanto MOR09823 como MOR09825 actúan estabilizando la conformación inactiva de HER3.
La estructura cristalina también reveló que el epítopo de HER3 reconocido tanto por MOR09823 como por MOR09825 es un epítopo no lineal que incluye residuos de ambos dominios 2 y 4 (véanse Figuras 5C y D, Tablas 11, 12, 13 y 14). El epítopo de HER3 reconocido por esta familia de anticuerpos altamente relacionados se puede definir por lo tanto como:
Dominio 2: residuos 265-277, 315
Dominio 4 residuos: 571,582-584, 596-597, 600-602, 609-615
La unión de ambos dominios 2 y 4 por MOR09823 o MOR09825 estabilizaría consecuentemente la conformación atada de HER3 antagonizando así su capacidad de señalización.
El modo de unión de MOR09823/MOR09825 observado en la estructura cristalina es compatible con nuestros otros estudios de mapeo de epítopos. Específicamente, los experimentos ELISA de unión al dominio demuestran que la afinidad de MOR09823 y MOR09825 es significativamente mayor por la proteína extracelular HER3 intacta que por cualquier dominio aislado (por ejemplo, fragmentos D1, D1-D2, D3 o D3-D4) (véase Figura 3). También hay acuerdo con los datos HDX-MS de HER3 (véase Figura 4B), que identifican la horquilla p del dominio 2 como parte del epítopo de reconocimiento de anticuerpos. Finalmente, ambas estructuras cristalinas indican que la superficie de unión a ligando de HER3, que ha sido mapeada por analogía con HER1 para los dominios 1 y 3 (Ogiso et al., (2002) Cell, 110:775-787; Garrett et al., (2002) Cell, 110:763-773) no es ocluida por la unión de Mo R09823 ni de MOR09825 (véase Figura 5B). Esto es compatible con nuestros hallazgos de que ni MOR09823 ni MOR09825 bloquean la unión de neuregulina a las células MCF7 (véase Figura 9) y que los complejos HER3/MOR09823 se pueden unir a neuregulina inmovilizada, en estudios Biacore (véase Figura 10).
Tabla 11: Interacciones entre la cadena pesada de Fab de MOR09823 y HER3 humana. Los residuos de VH de Fab se numeran en función de su secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 15). Los residuos de HER3 se numeran basándose en NP_001973. Los residuos de HER3 que se muestran tienen al menos un átomo dentro de 5 Á de distancia de un átomo en el Fab de MOR09823.
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Tabla 12: interacciones entre la cadena ligera de Fab de MOR09823 y HER3 humana. Los residuos de VL de Fab se numeran en función de su secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 14). Los residuos de HER3 se numeran basándose en NP_001973. Los residuos de HER3 que se muestran tienen al menos un átomo dentro de 5 Á de distancia de un átomo en el Fab de MOR09823.
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Tabla 13: interacciones entre la cadena pesada de Fab de MOR09825 y HER3 humana. Los residuos de VH de Fab se numeran en función de su secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 51). Los residuos de HER3 se numeran basándose en NP_001973. Los residuos de HER3 que se muestran tienen al menos un átomo dentro de 5 Á de distancia de un átomo en el Fab de MOR09825.
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Tabla 14: interacciones entre la cadena ligera de Fab de MOR09825 y HER3 humana. Los residuos de VL de Fab se numeran en función de su secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 50). Los residuos de HER3 se numeran basándose en NP_001973. Los residuos de HER3 que se muestran tienen al menos un átomo dentro de 5 Á de distancia de un átomo en el Fab de MOR09825.
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La inspección visual de las estructuras cristalinas de MOR09823/MOR09825 resaltó que los residuos de HER3 Lys267 y Leu268 formaron múltiples interacciones con varias CDR del anticuerpo, lo que sugiere que pueden ser importantes para la unión del anticuerpo. En consecuencia, Lys267 y/o Leu268 se mutaron a alanina, se expresaron y las proteínas recombinantes resultantes se purificaron para evaluar su impacto sobre la unión del anticuerpo. Los ensayos ELISA de unión indicaron que la mutación de Lys267 o Leu268 eliminó la unión de MOR10703 a HER3 (Figura 5F), lo que sugiere que ambos residuos son una parte integral del epítopo de HER3 y, por lo tanto, respaldan las interacciones propuestas entre MOR09823/MOR09825 y HER3.
(viii) Inhibición de la señalización celular
Para determinar el efecto de los anticuerpos anti-HER3 sobre la actividad de HER3 dependiente de ligando, se incubaron células MCF7 con IgG antes de la estimulación con neuregulina. Los ejemplos de curvas de inhibición se ilustran en la figura 6A y se resumen en la tabla 15. El efecto de los anticuerpos anti-HER3 sobre la activación de HER3 mediada por HER2 también se estudió usando la línea celular SK-Br-3 amplificada por HER2 (Figura 6B y Tabla 15).
Tabla 15: I HER m ni l v l r inhi i i n I ni-HER n l l M F7 K-Br-3.
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Para determinar si la inhibición de la actividad de HER3 afectaba las sucesivas etapas de la señalización celular de Akt, también se midió la fosforilación en células amplificadas con HER2 después del tratamiento con anticuerpos anti-HER3 (véanse Figura 7 y Tabla 16).
Tabla 16: IC50 de pAkt (S473) y magnitud de los valores de inhibición de IgG anti-HER3 en células SK-Br-3 BT-474 y MCF7.
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En resumen, MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 MOR10703, MOR12609 y MOR12610 son todos capaces de inhibir la actividad celular de HER3 tanto de manera dependiente de ligando como independiente de ligando.
(ix) Inhibición de la proliferación
Dado que MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701, MOR10702 y MOR10703 todos inhibieron la actividad de HER3 y las sucesivas etapas de la señalización, se probó su capacidad para bloquear la multiplicación celular in vitro de manera dependiente e independiente del ligando (Los datos de los ejemplos se muestran en la figura 8 y se resumen en la tabla 17). Todos los anticuerpos anti-HER3 probados fueron inhibidores eficaces de la proliferación celular.
Tabla 17: Inhibición de la proliferación después del tratamiento con 10 pg/ml de IgG anti-HER3 en células SK-Br-3, BT-474 y MCF7.
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(x) Evaluación del bloqueo del ligando
La capacidad de los anticuerpos anti-HER3 descritos para bloquear la unión del ligando se evaluó examinando la unión de neuregulina a células MCF7 tratadas previamente con MOR09823 o MOR09825. La presencia de MOR09823 o MOR09825 no tuvo un efecto significativo sobre la capacidad de la neuregulina para unirse a las células MCF7, mientras que el control positivo utilizado en el experimento (Mab3481) fue capaz de interferir profundamente con la unión de la neuregulina (véase Figura 9). Estos resultados son compatibles con la estructura cristalina dado que MOR09823 interactúa con los dominios 2 y 4, mientras que los principales puntos de contacto para la interacción de HER3 con la neuregulina se tiene la hipótesis de que están agrupados principalmente dentro de los dominios 1 y 3. Puesto que la neuregulina es capaz de unirse a la conformación inactiva de HER3 (Kani et al., (2005) Biochemistry 44: 15842-15857) es probable que MOR09823 y MOR09825 actúen evitando los reordenamientos del dominio HER3 necesarios para la señalización o interfiriendo con la dimerización del receptor.
(xi) Evaluación del bloqueo del ligando (bioquímica)
Para explorar si MOR09823 y neuregulina se pueden unir a HER3 concurrentemente se llevó adelante un ensayo bioquímico utilizando la tecnología Biacore™. Se realizaron análisis de interacción capturando neuregulina biotinilada en la superficie de un chip sensor CAP Biacore™ (GE Healthcare) empleando un kit Biotin CAPture (GE Healthcare). Se generaron complejos de HER3 incubando HER3 humana-Fc con concentraciones crecientes de MOR09823, 105.5 (Thermo Scientific) o IgG humana. Se inyectaron los complejos de HER3/anticuerpo preformados sobre superficies de referencia y activas, y se observó la interacción de HER3 con neuregulina.
La IgG de control no tuvo efecto sobre la formación del complejo HER3/neuregulina en tanto que se observó que 105.5 inhibía significativamente la capacidad de HER3 para unirse a neuregulina lo que confirma su descripción como un anticuerpo que bloquea el ligando (Figura 10). En contraste los complejos HER3/MOR09823 fueron capaces de unirse a neuregulina lo que demuestra que MOR09823 no evita la unión del ligando. Curiosamente, solo se observó un aumento dependiente de la dosis en los valores de RU cuando se inyectaron los complejos MOR09823/HER3. Este dato indica que se genera un complejo trimérico que contiene neuregulina, HER3 y MOR09823 en la superficie del chip. La capacidad de este complejo trimérico para formarse se predice por la estructura cristalina de HER3/MOR09823 dado que la unión de MOR09823 no ocluye el sitio de unión al ligando de HER3 lo que sugiere que la unión de neuregulina y MOR09823 no son mutuamente excluyentes.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al dominio 2 y al dominio 4 de HER3 y sin bloquear la unión concurrente de un ligando de HER3 tal como neuregulina. Si bien no es necesario proporcionar una teoría, es factible que el anticuerpo o fragmento del mismo que se une tanto al dominio 2 como al dominio 4 de HER3 mantenga a HER3 en una conformación inactiva sin bloquear el sitio de unión al ligando en HER3. Por lo tanto, un ligando de HER3 (por ejemplo, neuregulina) es capaz de unirse a HER3 al mismo tiempo que el anticuerpo.
Los anticuerpos de la divulgación o sus fragmentos inhiben la activación de HER3 tanto dependiente como independiente de ligando sin evitar la unión del ligando. Esto se considera ventajoso por las razones siguientes:
(i) El anticuerpo terapéutico tendría utilidad clínica en un espectro más amplio de tumores que un anticuerpo dirigido a un único mecanismo de activación de HER3 (es decir, dependiente del ligando o independiente del ligando) ya que cada mecanismo impulsa distintos tipos de tumores.
(ii) El anticuerpo terapéutico sería eficaz en tipos de tumores en los que ambos mecanismos de activación de HER3 están implicados simultáneamente. Un anticuerpo dirigido a un único mecanismo de activación de HER3 (es decir, dependiente de ligando o independiente de ligando) tendría poca o ninguna eficacia sobre esos tipos de tumores.
(iii) La eficacia de un anticuerpo que inhibe la activación de HER3 dependiente de ligando sin evitar la unión del ligando sería menos probable que se viera afectada negativamente por el aumento de las concentraciones del ligando. Esto se traduciría en una mayor eficacia sobre un tipo de tumor impulsado por concentraciones muy altas del ligando de HER3 o en una reducción en la capacidad de resistencia a los fármacos cuando la resistencia es mediada por el aumento de los ligandos de HER3.
(iv) Un anticuerpo que inhibe la activación de HER3 al estabilizar la forma inactiva sería menos propenso a la resistencia a los fármacos impulsada por mecanismos alternativos de activación de HER3.
En consecuencia, los anticuerpos de la divulgación se pueden usar para tratar afecciones en las que los anticuerpos terapéuticos existentes son clínicamente ineficaces.
(xii) Inhibición de la actividad de HER3 in vivo y efecto sobre el crecimiento del tumor
Para determinar la actividad in vivo de los anticuerpos anti-HER3 descritos, se probó MOR09823 en ambos modelos tumorales BxPC-3 y BT-474. Se demostró que MOR09823 inhibe la actividad de HER3 como se evidencia mediante una significativa reducción de los niveles de pHER3 en el tumor (Figura 11). Las sucesivas etapas de la señalización mediada por HER3 se inhibieron de manera similar, como lo demuestran los niveles reducidos de pAkt tanto en BxPC-3 como en BT-474 (Figura 11). En un estudio de eficacia de BT-474 controlado por HER2, el tratamiento repetido con MOR10701 produjo una inhibición del 74% del crecimiento tumoral (véase Figura 12A) mientras que MOR10703 produjo una inhibición del 83%. En el modelo de crecimiento tumoral BxPC3, tanto MOR10701 como MOR10703 inhibieron muy eficazmente el crecimiento tumoral controlado por ligando (ver Figura 13).
(xiii) Combinaciones de fármacos in vitro e impacto sobre la multiplicación celular.
Dado que la multiplicación de células tumorales es frecuentemente controlada por múltiples vías de señalización, evaluamos si las combinaciones de MOR09823 o MOR10703 con diversos agentes dirigidos serían beneficiosas para bloquear la proliferación celular. Los agentes dirigidos elegidos inhibieron principalmente a HER2 (trastuzumab, lapatinib) EGFR (cetuximab, erlotinib), PI3K/mTOR (BEZ235), PI3K (BKM120), PIK3CA (BYL719) y mTOR (RAD001) dado que estas dianas se activan comúnmente en tumores humanos. El análisis de isobolograma (véase Figura 14) indicó que MOR09823 y MOR10703 mostraron combinaciones de fármacos sinérgicas con trastuzumab, lapatinib, erlotinib, cetuximab, BEZ235, BKM120, BYL719 y RAD001. Este dato sugiere que la inhibición de la señalización mediada por HER3 es particularmente beneficiosa para los inhibidores que se dirigen a los receptores tirosina cinasas o la vía de señalización de PI3K.
(xiv) Combinaciones de fármacos y MOR10703 in vivo
Dada la inhibición de HER3 combinada con agentes dirigidos al receptor tirosina cinasa in vitro, evaluamos el impacto de MOR10701 o MOR10703 en combinación con trastuzumab y erlotinib in vivo. En los xenoinjertos BT-474 (véase Figura 15A), la combinación de MOR10701 o MOR10703 (20 mg/kg) con una dosis subóptima de trastuzumab (1 mg/kg) fue suficiente para inducir regresiones tumorales (% de T/C = -50 y -37 respectivamente). En xenoinjertos pancreáticos L3.3, la combinación de MOR10703 (20 mg/kg) con erlotinib diario (50 mg/kg) dio como resultado la estasis tumoral (% de T/C = 3, véase Figura 15B). En ambos modelos, la combinación de dos fármacos fue significativamente más eficaz que cualquier fármaco solo, lo que respalda nuestro hallazgo in vitro anterior del beneficio de combinar anticuerpos dirigidos contra HER3 con agentes dirigidos contra ErbB.
En resumen, la capacidad única de esta familia de anticuerpos para estabilizar la conformación inactiva de HER3 da como resultado una significativa eficacia in vivo en modelos en los que HER3 es activado de manera dependiente o independiente del ligando. Además, la inhibición de HER3 por esta familia de anticuerpos parece beneficiosa en combinación con una amplia gama de terapias dirigidas.
Ejemplo 22: Anticuerpos HER3 para la hiperplasia prostática benigna (BPH), la ginecomastia y la endometriosis
Procedimiento experimental
A ratas IGS Wistar Hannover sexualmente maduras de aproximadamente 9 semanas de vida se les administraron mediante inyección intravenosa según un programa de dos veces por semana 30, 75 y 200 mg/kg de MOR10703. Después de completar el período de administración de 13 semanas, se sacrificaron 10 ratas de cada grupo de dosis y se recogieron los órganos principales para su análisis posterior. Además, a 6 ratas del grupo de dosis de 200 mg/kg se les permitió recuperarse de MOR10703 durante 10 semanas antes del sacrificio, para determinar la reversibilidad de cualquier cambio observado. Después del sacrificio de los animales, se registraron los pesos de los órganos antes de la fijación en formalina al 10% tamponada neutra. Se prepararon cortes de los tejidos y se evaluaron mediante examen microscópico.
Resultados
En las ratas macho, se observó una disminución del peso de la próstata en todas las dosis, lo que se correlacionó con la menor secreción en la próstata y las vesículas seminales (Tabla 18). Estos efectos fueron reversibles después de 10 semanas de recuperación. Las diferencias en la media absoluta frente al control fueron las siguientes: 30 mg/kg: -31%, 75 mg/kg: -40% y 200 mg/kg: -35%. Estuvo presente atrofia de la glándula mamaria, mayormente moderada o marcada, en todos los machos que recibieron dosis y no fue reversible después de 10 semanas de recuperación. Este cambio se caracterizó por la ausencia del desarrollo acinar y lobular normalmente abundante que se observa en la glándula mamaria de los machos. En contraste con los controles, estuvieron presentes elementos ductulares dispersos en las glándulas mamarias de todos los machos tratados.
Tabla 18. Dif r n i r l i n n M R1 7 n l l r n n r m h
Figure imgf000109_0001
a Expresado como porcentaje de diferencia de las medias grupales (% de dif).
b Relativo.
c Basado en el análisis estadístico de las medias grupales, los valores son significativamente diferentes del grupo de control.
En las hembras, se observó disminución del peso del útero en todas las dosis, que fue reversible después de 10 semanas de recuperación (Tabla 19). Las diferencias entre la media absoluta y el control fueron 30 mg/kg: -24%, 75 mg/kg: -27% y 200 mg/kg: -19%. La atrofia del endometrio, observada como una profunda disminución en el epitelio glandular en el útero en todas las dosis > 30 mg/kg/día se correlacionó con la disminución en los pesos de los úteros observada al final del tratamiento. Esto fue ligeramente reversible después de 10 semanas de recuperación ya que había presente una mayor cantidad de epitelio glandular aunque no tanto como en los animales de control. Otros órganos reproductivos: ovarios, oviductos, cuello uterino y vagina parecieron estar dentro de los límites normales, considerando las diferentes etapas del ciclo que se pueden observar.
Tabla 19. Diferencias relacionadas con MOR10703 en los pesos de los ór anos en ratas hembra
Figure imgf000109_0002
Figure imgf000110_0001
a Expresado como porcentaje de diferencia de las medias grupales (% de dif).
b Relativo.
c Basado en el análisis estadístico de las medias grupales, los valores son significativamente diferentes del grupo de control. Consulte las tablas de datos para conocer los niveles de significación reales y las pruebas utilizadas.
Discusión
La hiperplasia prostática benigna (BPH) es una enfermedad común en hombres de edad avanzada que se caracteriza por un agrandamiento no neoplásico de la próstata que produce presión sobre la uretra y provoca problemas de micción y vejiga (Mahapokai1 W, van Sluijs FJ & Schalken JA. 2000 Prostate Cancer and Prostatic Diseases 3, 28­ 33). La evidencia anatómica o microscópica de la BPH está presente en la autopsia de aproximadamente el 55% de los hombres de 60 a 70 años. La resección transuretral de la próstata ha sido el tratamiento de elección durante muchos años. En consecuencia, la BPH es una de las razones más comunes para la intervención quirúrgica entre los hombres de edad avanzada. Los métodos de tratamiento menos invasivos incluyen:
(i) Los bloqueadores alfa 1 (doxazosina, prazosina, tamsulosina, terazosina y alfuzosina) son una clase de medicamentos que también se usan para tratar la hipertensión. Estos medicamentos relajan los músculos del cuello de la vejiga y la próstata, lo que permite orinar más fácilmente.
(ii) Finasterida y dutasterida reducen los niveles de andrógenos, reduciendo así el tamaño de la glándula prostática, aumentando el flujo de orina y disminuyendo los síntomas de la BPH. Pueden pasar de 3 a 6 meses antes de que se observe una mejoría en los síntomas. Los posibles efectos secundarios relacionados con el uso de finasterida y dutasterida incluyen disminución del deseo sexual e impotencia.
Los resultados en la sección Experimentos demuestran por primera vez que la BPH es una indicación dependiente de neuregulina. El hallazgo de que MOR10703 redujo significativamente el tamaño de la próstata en ratas sexualmente maduras sin afectar los niveles hormonales sugiere que MOR10703 podría ser útil para el tratamiento de la BPH.
Para probar más a fondo a MOR10703 y otros anticuerpos contra HER3 como agentes terapéuticos para la BPH, se pueden trasplantar muestras quirúrgicas de BPH humanas primarias a ratones o ratas atímicos y estudiar el efecto de los anticuerpos contra Her3 usando modelos (Otto U et al. Urol Int 1992; 48: 167 -170). Alternativamente, se pueden inducir aspectos de BPH en perros castrados mediante la administración a largo plazo de 5a-androstano-3a,17p-diol más estradiol y probar los anticuerpos contra HER3 en estos modelos caninos (Walsh PC, Wilson JD. J Clin Invest 1976; 57: 1093 - 1097).
La manifestación física de la ginecomastia es el agrandamiento de los senos en los hombres, normalmente se produce en ambos senos, pero a veces puede ser solo en uno, conocida como ginecomastia asimétrica o unilateral. La ginecomastia es causada comúnmente por:
(i) Niveles elevados de estrógeno dan como resultado que la proporción de testosterona a estrógeno se desequilibre.
(ii) Antagonistas de andrógenos o antiandrógenos utilizados en el tratamiento del cáncer de próstata o la BPH.
Estos fármacos suprimen la testosterona, pero al suprimir la testosterona, el estrógeno comienza a aumentar.
Aunque actualmente se están evaluando varios fármacos experimentales no existen en la actualidad tratamientos aprobados para la ginecomastia. En consecuencia, la ginecomastia se trata mediante la extirpación quirúrgica del tejido mamario. La observación de que MOR10703 indujo atrofia irreversible de la glándula mamaria del macho indica que puede ser beneficioso en el tratamiento de la ginecomastia.
Para probar aún más MOR10703 y otros anticuerpos HER3 para el tratamiento de la ginecomastia humana, se pueden utilizar modelos de ginecomastia en ratones transgénicos. Estos modelos se han desarrollado mediante la expresión de aromatasa humana en la glándula mamaria del ratón y recapitulan muchos aspectos de la ginecomastia humana (Li et al., Endocrinology 2002;143:4074-4083; Tekmal et al., Cancer Res 1996;56:3180-318).
MOR10703 y otros anticuerpos contra HER3 también se pueden examinar para tratar la endometriosis, una afección ginecológica en la que las células del revestimiento del útero (endometrio) aparecen y florecen fuera de la cavidad uterina. El síntoma principal, pero no universal, de la endometriosis es el dolor pélvico en diversas manifestaciones. Aunque las causas subyacentes de la endometriosis no están bien caracterizadas, se cree que dependen de la presencia de estrógenos. Dado que MOR10703 indujo atrofia endometrial en ratones hembra, lo que resultó en una disminución del peso del útero, se puede usar para tratar la endometriosis. Para estudiar más a fondo los efectos de MOR10703 y otros anticuerpos contra HER3 sobre la endometriosis, se puede implantar endometrio humano en fase proliferativa en la cavidad peritoneal de ratones atímicos que ciclan normalmente y ovariectomizados o en ratones (SCID) con inmunodeficiencia combinada severa-diabéticos no obesos (NOD) que ciclan, y usar estos ratones SCID como modelos (Grummer etal., 2001. Human Reproduction; 16; 1736-1743).
Ejemplo 23: Estudios in vitro para evaluar los anticuerpos contra HER3 para el cáncer esofágico
Estudios de combinación de fármacos esofágicos in vitro
Para evaluar la capacidad de los anticuerpos dirigidos contra HER3 para combinarse con terapias dirigidas, se combinó MOR10703 con cetuximab o BYL719 en ensayos de viabilidad celular. Aproximadamente 1000-1200 células KYSE140 y KYSE180 se sembraron en placas de 384 pocillos en los medios de cultivo apropiados complementados con FBS al 2% y se permitió que se adhirieran toda la noche a 37 °C. Posteriormente, se agregaron a los pocillos las combinaciones apropiadas de fármacos (las concentraciones finales habituales de fármacos para BYL719 variaron de 2,8 |uM a 3,8 nM; para cetuximab variaron de 93 nM a 0,13 nM; para MOR10703 de 100 nM a 4,1 nM), de modo que cada placa contuviera una curva de respuesta a la dosis de cada fármaco en una matriz bidimensional. Las células tratadas se incubaron posteriormente durante 96-120 horas. Al final del tratamiento farmacológico, se agregó reactivo CellTiter-Glo a cada pocillo para lisar las células y se registraron las señales de luminiscencia utilizando un lector de placas Envision. Se calculó el grado de inhibición de la multiplicación obtenido con cada combinación y se resaltó la actividad de combinación usando el modelo de aditividad de Loewe.
Combinaciones de fármacos esofágicos in vitro e impacto sobre la multiplicación celular.
Dado que la multiplicación de células tumorales es frecuentemente controlada por múltiples vías de señalización, se evaluaron combinaciones de MOR10703 con cetuximab o BYL719 para determinar si serían beneficiosas para bloquear la proliferación de líneas celulares de cáncer de esófago. Los agentes dirigidos elegidos inhibieron principalmente a EGFR (cetuximab) y PIK3CA (BYL719) ya que estas dianas se activan comúnmente en tumores humanos. El análisis de isobolograma (véase Figura 16) indicó que MOR10703 presentó combinaciones sinérgicas de fármacos con cetuximab y BYL719. Este dato sugiere que la inhibición de la señalización mediada por HER3 es particularmente beneficiosa para los inhibidores que se dirigen a los receptores tirosina cinasas o la vía de señalización de PI3K.
Ejemplo 24: Estudios in vivo para evaluar los anticuerpos contra HER3 para el cáncer esofágico
Para evaluar la capacidad in vivo de los anticuerpos dirigidos contra HER3 para combinarse con terapias dirigidas, se combinó MOR10703 con cetuximab o BYL719 y se probó en dos modelos de xenoinjerto in vivo.
(i) Xenoinjertos de KYSE140 in vivo
Se cultivaron células KYSE140 en RPMI1640 que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación. Las células KYSE140 se cosecharon en crecimiento exponencial. Diez millones de células se mezclaron con PBS/Matrigel (50:50) y se implantaron por vía subcutánea en el flanco superior derecho de ratones SCID-Beige. El día 28, se midieron los tumores y los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 200 mm3 se incluyeron en el estudio de eficacia. En general, se incluyeron en el estudio de eficacia un total de 10 animales por grupo. Para los estudios con un solo agente y de combinación, los animales recibieron dosis de MOR10703 o cetuximab por vía intravenosa mediante inyección en la vena lateral de la cola. Se formuló BYL719 en metilcelulosa al 0,5% y se administró por sonda oral.
(ii) Xenoinjertos de KYSE180 in vivo
Se cultivaron células KYSE180 en RPMI1640 que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación. Las células KYSE180 se cosecharon en crecimiento exponencial. Cinco millones de células se implantaron por vía subcutánea en el flanco superior derecho de ratones atímicos. El día 18, se midieron los tumores y los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 200 mm3 se incluyeron en el estudio de eficacia. En general, se incluyeron en el estudio de eficacia un total de 10 animales por grupo. Para los estudios con un solo agente y de combinación, los animales recibieron dosis de MOR10703 o cetuximab por vía intravenosa mediante inyección en la vena lateral de la cola. Se formuló BYL719 en metilcelulosa al 0,5% y se administró por sonda oral.
(iii) Xenoinjertos esofágicos primarios in vivo
Se pasaron a ratones tumores esofágicos primarios humanos. Cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 150 mm3, se incluyeron los animales en el estudio de eficacia. Para los estudios con un solo agente y de combinación, los animales recibieron dosis de MOR10703 o cetuximab por vía intravenosa mediante inyección en la vena lateral de la cola. Se formuló BYL719 en metilcelulosa al 0,5% y se administró por sonda oral.
Inhibición de HER3 in vivo y efecto sobre el crecimiento del tumor esofágico
Para determinar la actividad in vivo de los anticuerpos anti-HER3 descritos, se probó MOR10703 en modelos tumorales esofágicos tanto KYSE140 como KYSE180, así como en dos modelos de tumor esofágico primario, CHES007 y CHES015. En ambos modelos tanto KYSE140 como KYSE180 in vivo, el tratamiento con el único agente MOR10703 demostró ser eficaz para inhibir el crecimiento del tumor (Figura 17). En KYSE180, la combinación de MOR10703 y BYL719 fue suficiente para inducir regresiones significativas del tumor. Estos hallazgos se extendieron a los modelos de tumor esofágico primario, en los que una combinación de MOR10703 con cetuximab o BYL719 también indujo regresiones potentes del tumor (Figura 18). En conjunto, estos datos respaldan aún más nuestro hallazgo previo in vitrodel beneficio de combinar anticuerpos dirigidos contra HER3 con agentes dirigidos contra EGFR o a PI3K.
Ejemplo 25: Estudios in vivo para evaluar combinaciones de HER3 con BYL719 en cáncer gástrico.
Para evaluar la capacidad in vivo de los anticuerpos dirigidos contra HER3 para combinarse con terapias dirigidas en el cáncer gástrico, se combinó MOR10703 con BYL719 y se probó en dos modelos de xenoinjerto in vivo.
(i) Xenoinjerto de NCI-N87 in vivo
Se cultivaron células NCI-N87 en medio de cultivo DMEM que contenía 4,5 g/l de glucosa complementado con 10% de FCS inactivado por calor, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM hasta el momento de la implantación. Se establecieron los tumores NCI-N87 inyectando por vía subcutánea de 8 x 106 a 1 x 107 células (en HBSS que contenía 50% v/v de Matrigel). El día 10, se midieron los tumores y los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 250 mm3 se incluyeron en el estudio de eficacia. Para los estudios con un solo agente y de combinación, los animales recibieron dosis de MOR10703 por vía intravenosa mediante inyección en la vena lateral de la cola. Se formuló BYL719 en metilcelulosa al 0,5% y se administró por sonda oral.
Efecto del tratamiento de combinación sobre el crecimiento del tumor gástrico N87
Como se vio para los tumores esofágicos, la combinación de MOR10703 y BYL719 fue suficiente para inducir regresiones tumorales significativas, prolongadas, en el modelo de tumor gástrico N87, lo que respalda aún más el beneficio de combinar anticuerpos dirigidos contra HER3 con agentes dirigidos contra PI3K (véase Figura 19).
Ejemplo 26: Estudios in vivo para evaluar combinaciones de HER3 con Cetuximab en cáncer de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN).
Para evaluar la capacidad in vivo de los anticuerpos dirigidos contra HER3 para combinarse con terapias dirigidas en el SCCHN, se combinó MOR10703 con cetuximab y se probó en un modelo de xenoinjerto in vivo.
(i) Xenoinjerto de A253 in vivo
Se cultivaron células A253 en DMEM que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación. Las células A253 se cosecharon en crecimiento exponencial. Cinco millones de células en 200 pl de PBS se implantaron por vía subcutánea en el flanco superior derecho de ratones atímicos. El día 25, se midieron los tumores y los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 200 mm3 se incluyeron en el estudio de eficacia. En general, se incluyeron en el estudio de eficacia un total de 9 animales por grupo. Para los estudios con un solo agente y de combinación, los animales recibieron dosis de MOR10703 o cetuximab por vía intravenosa mediante inyección en la vena lateral de la cola.
Efecto del tratamiento de combinación sobre el crecimiento del tumor de SCCHN A253
En el modelo de SCCHN A253, el tratamiento con MOR10703 o cetuximab como único agente dio como resultado la estasis tumoral. La combinación de MOR10703 con cetuximab fue significativamente más activa y yo como resultado la regresión del tumor (véase Figura 20).
En conjunto, estos resultados muestran que MOR10703 como único agente puede inhibir el crecimiento del tumor. Estos resultados también muestran que existe un efecto sinérgico sobre la regresión del tumor cuando MOR10703 se combina con inhibidores dirigidos contra otros receptores tirosina cinasas o contra la vía de señalización PI3K.
Equivalentes
La memoria escrita precedentemente se considera suficiente para permitir que un experto en la materia practique la invención. La descripción y los ejemplos anteriores detallan ciertas realizaciones preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Sin embargo, se apreciará que no importa cuán detallado pueda aparecer lo anterior en el texto, la invención se puede practicar de muchas maneras y la invención debe interpretarse de conformidad con las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a un receptor HER3, de modo que el anticuerpo o el fragmento del mismo se une a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente de ligando como independiente de ligando, para utilizar en el tratamiento de la hiperplasia benigna de próstata.
2. El anticuerpo o fragmento del mismo para utilizar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el epítopo conformacional se define por (i) los residuos de aminoácidos de HER3265-277 y 315 (del dominio 2) y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3571,582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de SEQ ID NO: 1, o un subconjunto de los mismos.
3. El anticuerpo o fragmento del mismo para utilizar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el epítopo conformacional se define por (i) los residuos de aminoácidos de HER3265-277 y 315 (del dominio 2) y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3571,582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de SEQ ID NO: 1.
4. El anticuerpo o el fragmento del mismo para usar de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se administra por una vía elegida entre el grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intraparenquimatosa, intratecal, intracraneal, bucal, mucósica, nasal y rectal.
5. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende:
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 2; una CDR2 de SEQ ID NO: 3; una CDR3 de SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 5; una CDR2 de SEQ ID NO: 6; y una CDR3 de SEQ ID NO: 7;
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 20; una CDR2 de SEQ ID NO: 21; una CDR3 de SEQ ID NO: 22; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 23; una CDR2 de SEQ ID NO: 24; y una CDR3 de SEQ ID NO: 25;
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 38; una CDR2 de SEQ ID NO: 39; una CDR3 de SEQ ID NO: 40; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 41; una CDR2 de SEQ ID NO: 42; y una CDR3 de SEQ ID NO: 43;
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 56; una CDR2 de SEQ ID NO: 57; una CDR3 de SEQ ID NO: 58; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 59; una CDR2 de SEQ ID NO: 60; y una CDR3 de SEQ ID NO: 61;
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 92; una CDR2 de SEQ ID NO: 93; una CDR3 de SEQ ID NO: 94; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 95; una CDR2 de SEQ ID NO: 96; y una CDR3 de SEQ ID NO: 97;
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 110; una CDR2 de SEQ ID NO: 111; una CDR3 de SEQ ID NO: 112; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 113; una CDR2 de SEQ ID NO: 114; y una CDR3 de SEQ ID NO: 115;
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 128; una CDR2 de SEQ ID NO: 129; una CDR3 de SEQ ID NO: 130; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 131; una CDR2 de SEQ ID NO: 132; y una CDR3 de SEQ ID NO: 133;
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 344; una CDR2 de SEQ ID NO: 345; una CDR3 de SEQ ID NO: 346; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 347; una CDR2 de SEQ ID NO: 348; y una CDR3 de SEQ ID NO: 349;
o
una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 362; una CDR2 de SEQ ID NO: 363; una CDR3 de SEQ ID NO: 364; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 365; una CDR2 de SEQ ID NO: 366; y una CDR3 de SEQ ID NO: 367.
6. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de SEQ ID NO: 128; una CDR2 de SEQ ID NO: 129; una CDR3 de SEQ ID NO: 130; una región variable de cadena ligera CDR1 de SEQ ID NO: 131; una CDR2 de SEQ ID NO: 132; y una CDR3 de SEQ ID NO: 133.
7. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una VH y VL elegidas del grupo que consiste en
una VH de SEQ ID NO: 15 y VL de SEQ ID NO: 14
una VH de SEQ ID NO: 33 y VL de SEQ ID NO: 32
una VH de SEQ ID NO: 51 y VL de SEQ ID NO: 50
una VH de SEQ ID NO: 69 y VL de SEQ ID NO: 68
una VH de SEQ ID NO: 105 y VL de SEQ ID NO: 104
una VH de SEQ ID NO: 123 y VL de SEQ ID NO: 122
una VH de SEQ ID NO: 141 y VL de SEQ ID NO: 140
una VH de SEQ ID NO: 357 y VL de SEQ ID NO: 356
y
una VH de SEQ ID NO: 375 y VL de SEQ ID NO: 374.
8. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una VH de SEQ ID NO: 141 y VL de SEQ ID NO: 140.
9. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 144 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 145.
10. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se formula en una composición farmacéutica que comprende un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.
11. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la composición farmacéutica comprende un agente terapéutico adicional.
12. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente terapéutico adicional se elige del grupo que consiste en un inhibidor de HER1, un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de la cinasa PI3.
13. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 elegido del grupo que consiste en Matuzumab (EMD72000), Cetuximab, Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (g W-572016), Ditosilato de Lapatinib, Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166 y N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3"S")-tetrahidro-3-furanil]oxi]-6-quinazolinil]-4(dimetilamino)-2-butenamida; un inhibidor de HER2 elegido del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-111, neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib; un inhibidor de HER3 elegido del grupo que consiste en, MM-121, MM-111, IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203(Aveo), MEHD7945A (Genentech), y moléculas pequeñas que inhiben a HER3; y un inhibidor de HER4.
14. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR elegido del grupo que consiste en Temsirolimus, ridaforolimus/Deforolimus, AP23573, MK8669 y everolimus.
15. El anticuerpo o fragmento del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de la cinasa PI3 elegido del grupo que consiste en GDC 0941, BEZ235, BMK120 y BYL719.
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