MX2014006735A

MX2014006735A - Anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento epidermico 3 (her3).

Info

Publication number: MX2014006735A
Application number: MX2014006735A
Authority: MX
Inventors: Xizhong Huang; Winfried Elis; Seth Ettenberg; Andrew Paul Garner; Nicole Haubst; Christian Carsten Silvester Kunz; Elizabeth Anne Reisinger Sprague; Qing Sheng
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2015-06-04
Also published as: CN108341873A; CN104159924B; US9192663B2; US20160158358A1; CN108341873B; KR102083957B1; KR102151383B1; US20130330324A1; TW201328706A; MX362521B; US10080800B2; WO2013084147A2; AU2012349735A1; AU2012349735B2; JP2015500828A; JP6243345B2; CA2858012C; US20130251703A1; KR20200105534A; SG11201402783YA

Abstract

Esta invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de los mismos que interactúan con la familia de receptores HER, por ejemplo, el receptor HER3. En particular, se refiere a anticuerpos o fragmentos de los mismos que reconocen un epítopo conformacional del receptor HER3 que comprende residuos a partir de ambos dominios 2 y 4, dando como resultado la inhibición de la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando; y que permiten el enlace del ligando (por ejemplo, neurregulina), mientras que impiden la activación de la transducción de señales inducida por el ligando. Estos anticuerpos o fragmentos se pueden utilizar para tratar un número de enfermedades o trastornos caracterizados por un aumento en los niveles de expresión del HER3 (por ejemplo, cáncer esofágico). Estos anticuerpos o fragmentos se pueden utilizar para tratar un número de enfermedades o trastornos caracterizados por la capacidad de los anticuerpos o de los fragmentos para disminuir el peso del tejido (por ejemplo, el peso de la próstata o el peso uterino), o para inducir atrofia del tejido (por ejemplo, atrofia de la mama masculina). De una manera alternativa, estos anticuerpos o fragmentos se pueden utilizar para tratar un trastorno caracterizado por un aumento en los niveles de expresión del HER3 en un cáncer del conducto esofágico, cáncer gástrico, o cáncer de cabeza y cuello.

Description

ANTICUERPOS PARA EL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO 3 (HER3) Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama prioridad para la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Número 61/566,890 presentada el 5 de diciembre de 201 1 , el contenido de la cual se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Campo de la Invención Esta invención se refiere, en términos generales, a anticuerpos o fragmentos de los mismos, los cuales interactúan con la familia de receptores HER, por ejemplo, el receptor HER3. En particular, se refiere a anticuerpos o fragmentos de los mismos que reconocen un epítopo conformacional del receptor HER3 que comprende residuos a partir de ambos dominios 2 y 4 que dan como resultado la inhibición de la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando; y que permiten el enlace del ligando (por ejemplo, neurregulina), mientras que previenen la activación de la transducción de señales inducida por el ligando. Estos anticuerpos o fragmentos se pueden utilizar para tratar un número de enfermedades o trastornos caracterizados por un aumento de los niveles de expresión de HER3 (por ejemplo, cáncer esofágico). Estos anticuerpos o fragmentos se pueden utilizar para tratar un número de enfermedades o trastornos caracterizados por la capacidad de los anticuerpos o fragmentos para disminuir el peso del tejido (por ejemplo, el peso de la próstata o uterino) o para inducir atrofia del tejido (por ejemplo, atrofia de la mama masculina).

Antecedentes de la Invención El receptor del factor de crecimiento epidermico humano 3 (ErbB3, también conocido como HER3) es una cinasa de proteína tirosina receptora y pertenece a la subfamilia de cinasas de proteína tirosina receptoras del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que también incluye EGFR (HER1 , ErbB1 ), HER2 (ErbB2, Neu), y HER4 (ErbB4) (Plowman y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87: 4905-4909; Kraus y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86: 9193-9197; y Kraus y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 2900-2904). Como el receptor del factor de crecimiento epidérmico prototípico, el receptor HER3 transmembrana consiste en un dominio de enlace a ligando extracelular (ECD), un dominio de dimerización dentro del dominio de enlace a ligando extracelular (ECD), un dominio transmembrana, un dominio de tipo cinasa de proteína tirosina intracelular (TKD), y un dominio de fosforilación C-terminal. A diferencia de los otros miembros de la familia HER, el dominio de cinasa de HER3 exhibe una actividad de cinasa intrínseca muy baja.

Los ligandos neurregulina 1 (NRG) o neurregulina 2 se enlazan al dominio extracelular de HER3 y activan la senda de señalización mediada por el receptor mediante la promoción de la dimerización con otros compañeros de dimerización, tales como HER2. La heterodimerización da como resultado la activación y trans- fosforilación del dominio intracelular de HER3, y es un medio no solamente para la diversificación de la señal, sino también para la amplificación de la señal. En adición, la heterodimerización de HER3 también se puede presentar en ausencia de ligandos activadores, y esto se denomina comúnmente como activación de HER3 independiente del ligando. Por ejemplo, cuando HER2 se expresa en altos niveles como un resultado de la amplificación genética (por ejemplo, en cáncer de mama, pulmón, ovario o gástrico), se pueden formar dímeros de HER2/HER3 espontáneos. En esta situación, el HER2/HER3 se considera como el dímero de señalización de ErbB más activo y, por consiguiente, es altamente transformante.

Se ha encontrado un aumento de HER3 en varios tipos de cáncer, tales como cánceres de mama, de pulmón, gastromtestinal y pancreático. Es interesante que se ha demostrado una correlación entre la expresión de HER2/HER3 y el progreso desde una etapa no invasiva hasta una etapa invasiva (Alimandi y colaboradores (1995) Oncogene 10: 1813-1821 ; DeFazio y colaboradores (2000) Cáncer 87: 487-498; Naidu y colaboradores (1988) Br. J. Cáncer 78: 1385-1390). De conformidad con lo anterior, se necesitan agentes que interfieran con la señalización mediada por HER3.

Breve Descripción de la Invención La invención se basa en el descubrimiento de proteínas que se enlazan a antígeno (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos) que se enlazan a un epítopo conformacional del receptor HER3, el cual comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 de HER3. Este enlace de los anticuerpos o fragmentos de los mismos con el dominio 2 y el dominio 4 estabiliza el receptor HER3 en una conformación inactiva o cerrada, de tal manera que se inhiba la activación de HER3. De una manera sorprendente, el enlace de los anticuerpos o fragmentos de los mismos con este epítopo conformacional bloquea las sendas de señalización de HER3 tanto dependiente del ligando (por ejemplo, neurregulina), como independiente del ligando. Adicionalmente, la inhibición de la señalización inducida por el ligando mediada por el anticuerpo se presenta sin bloquear el enlace del ligando (es decir, tanto el ligando como el anticuerpo pueden enlazarse a HER3) presumiblemente debido a que HER3 no puede experimentar las reconfiguraciones conformacionales requeridas para la activación. También se dan a conocer métodos para utilizar los anticuerpos o fragmentos de los mismos para tratar un número de enfermedades o trastornos caracterizados por un aumento en la expresión de HER3; y las enfermedades o trastornos caracterizados por la capacidad de los anticuerpos o fragmentos para disminuir el peso del tejido (por ejemplo, el peso de la próstata o uterino) o para inducir atrofia del tejido (por ejemplo, atrofia de la mama masculina).

De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención pertenece a un método para el tratamiento de un trastorno caracterizado por un aumento de los niveles de expresión de H ER3 en el tracto esofágico, el cual comprende: seleccionar al paciente que padezca de un aumento de los niveles de expresión de HER3 en el tracto esofágico; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera el trastorno. En una modalidad, el trastorno se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer esofágico y cáncer esofágico de Barretts.

En otro aspecto, la invención pertenece a un metodo para el tratamiento de cáncer gástrico, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de cáncer gástrico; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera el cáncer gástrico.

En otro aspecto, la invención pertenece a un método para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello, el cual comprende seleccionar a un paciente que padezca de cáncer de cabeza y cuello; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera el cáncer de cabeza y cuello.

En otro aspecto, la invención pertenece a un método para el tratamiento de hipoplasia benigna de la próstata, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de hipoplasia benigna de la próstata; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera la hipoplasia benigna de la próstata.

En todavía otro aspecto, la invención pertenece a un método para el tratamiento de ginecomastia, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de ginecomastia; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera la ginecomastia.

En todavía otro aspecto, la invención pertenece a un metodo para el tratamiento de endometriosis, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de endometriosis: y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera la endometriosis.

En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo se administra por una vía seleccionada a partir del grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intraparenquimal, intratecal, intracraneal, bucal, mucosal, nasal, y rectal. En una modalidad, el anticuerpo o un fragmento del mismo se formula en una composición farmacéutica, la cual comprende un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un agente terapéutico adicional. En una modalidad, el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de HER 1 , un inhibidor de H ER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3. En una modalidad, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EM D72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 1 1 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib / Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en M M-121 , MM-1 1 1 , IB4C3, 2DID 12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moleculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de HER4. En una modalidad, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affinitor®. En una modalidad, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BM K120 y BYL719.

En otro aspecto, la invención pertenece al uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un trastorno esofágico, o cáncer gástrico, o cáncer de cabeza y cuello, o hiperplasia prostática benigna (BPH), o ginecomastia, o endometriosis.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : Curvas de MOR10701 SET representativas obtenidas con HER3 humano, de ratón, de rata, y de cinomolgo.

Figura 2: Determinación de enlace de celulas SK-Br-3 mediante titulación FACS.

Figura 3: ELISA de enlace de dominio de HER3.

Figuras 4A, 4B y 4C: Mapeo de epítopo de intercambio de hidrógeno-deuterio. Figura 4A: Los péptidos HER3 ECD recuperados en seguida del análisis HDX-MS se indican mediante líneas punteadas. Los sitios de glicosilación N-enlazados potenciales están resaltados. Figura 4B: El grado de deuteración relativo observado en los péptidos identificados mediante MS. Figura 4C: Residuos protegidos mapeados sobre la estructura del cristal de HER3 publicada.

Figuras 5A, 5B, 5C, 5D, 5E: Figura 5A: Representación superficial de las estructuras del cristal de rayos-X de HER3/MOR09823 y HER3/MOR09825. HER3 (en gris más claro) está en la conformación cerrada, y MOR09823 ó MOR09825 (en gris más oscuro) se enlazan a ambos dominios 2 y 4. Figura 5B: Vista superficial de HER3 a partir de la estructura de HER3/MOR09823 mostrada en una orientación similar a la Figura 5A. Se omitió MOR09823 para mayor claridad. Figura 5C: Estructura de HER3/MOR09823 ¡lustrada como una estructura de listón, vista en una rotación de 90° a partir de los paneles de las Figuras A, B, y D. Figura 5D: Una representación de listón de la conformación de HER3 inactivo reconocida por MOR09823 Fab con una vista de acercamiento de la interfase del dominio 2/dominio 4, resaltando los residuos de HER3 que están dentro de 5A del Fab. Figura 5E: Determinación de enlace de HER3 Mutante/MOR10703 mediante titulación ELISA.

Figuras 6A y 6B: Inhibición de la fosforilación de HER3 inducida por el ligando (Figura 6A) o independiente del ligando (Figura 6B).

Figuras 7A y 7B: Inhibición de las sendas de señalización corriente abajo dependientes de HER3 en líneas celulares amplificadas por HER2.

Figuras 8A y 8B: Impacto de la inhibición de HER3 sobre el crecimiento celular en (Figura 8A) BT-474 y (Figura 8B) celulas MCF7 estimuladas por neurregulina.

Figura 9: Efecto de MOR09823 y MOR09825 sobre el enlace de neurregulina a las células MCF7.

Figura 10: Impacto del enlace de MOR09823 sobre la formación del complejo de HER3/neurregulina, como se evalúa mediante BiacoreMR. Ningún anticuerpo (barras negras), MOR09823 (barras blancas), 105.5 (barras grises), e IgG de control (barras rayadas).

Figuras 1 1A y 1 1 B : Inhibición mediada por MOR09823 de la señalización de HER3 independiente del ligando (BT-474) (Figura 1 1 A), y dependiente del ligando (BxPC3) (Figura 1 1 B ) in vivo.

Figuras 12A y 12B: Impacto de MOR10701 y MOR10703 sobre el crecimiento tumoral BT-474.

Figura 13: Impacto de MOR10701 y MOR10703 sobre el crecimiento tumoral BxPC3.

Figuras 14A, 14B, 14C, 14D, 14E, 14F, 14G y 14H: Isobologramas de combinación de fármacos de MOR10703 in vitro (Figura 14A) MOR09823/trastuzumab, (Figura 14B) MOR09823/ lapatinib, (Figura 14C) MOR10703/BEZ235, (Figura 14D) MOR10703/ BKM120, (Figura 14E) MOR10703/BYL719, (Figura 14F) MOR10703/ RAD001 , (Figura 14G) MOR10703/cetuximab, y (Figura 14H) MOR1 0703/erlotinib.

Figuras 15A y 15B: Combinaciones de MOR10701 ó MOR10703 in vivo con (Figura 15A) trastuzumab y (Figura 15B) erlotinib en BT-474 y L3.3.

Figuras 16A y 16B: MOR10703 solo o combinaciones de MOR10703 in vitro con (Figura 16A) cetuximab y (Figura 16B) BYL719 sobre celulas esofágicas.

Figuras 17A y 17B: MOR10703 solo o combinaciones de MOR10703 in vivo con (Figura 17A) cetuximab y (Figura 17B) BYL719 en modelos de tumor esofágico KYSE140 y KYSE180.

Figuras 18A, 18B y 18C: MOR10703 solo o combinaciones de MOR10703 in vivo con (Figura 18A) cetuximab y (Figura 18B) BYL719 en modelos de tumor esofágico CHE007, y (Figura 18C) MOR10703 solo o combinaciones de MOR10703 in vivo con cetuximab en un modelo de tumor esofágico CHES015.

Figura 19: MOR10703 solo o combinaciones de MOR10703 in vivo con BYL719 en un modelo de tumor gástrico N87 que muestra una regresión prolongada del tumor.

Figura 20: MOR10703 solo o combinaciones de MOR10703 in vivo con cetuximab en el modelo A253 SCCHN; el tratamiento con cualquiera de MOR10703 o cetuximab como un solo agente dio como resultado estasis del tumor. La combinación de MOR10703 con cetuximab dio como resultado la regresión del tumor.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Con el objeto de que la presente invención pueda ser más fácilmente entendida, primero se definen ciertos terminos. A través de toda la descripción detallada se estipulan definiciones adicionales.

La frase “transducción de señales" o "actividad de señalización", como se utiliza en la presente, se refiere a una relación bioquímica causal iniciada en términos generales por la interacción de proteína-proteína, tal como el enlace de un factor de crecimiento a un receptor, que da como resultado la transmisión de una señal desde una porción de una célula hasta otra porción de una célula. Para HER3, la transmisión involucra la fosforilación específica de uno o más residuos de tirosina, serina, o treonina sobre una o más proteínas en la serie de reacciones que provocan la transducción de señales. Los penúltimos procesos típicamente incluyen eventos nucleares, que dan como resultado un cambio en la expresión genetica.

Un “receptor HER” es una cinasa de proteína tirosina receptora que pertenece a la familia de receptores HER, e incluye los receptores EGFR, HER2, HER3 y HER4 y otros miembros de esta familia por identificarse en el futuro. El receptor HER comprenderá en términos generales un dominio extracelular, el cual puede enlazarse a un ligando de HER; un dominio transmembrana lipofílico; un dominio de cinasa de tirosina intracelular conservado; y un dominio de señalización carboxi-terminal que aloja varios residuos de tirosina que pueden ser fosforilados. De preferencia el receptor HER es el receptor HER humano de la secuencia activa.

Los términos “HER1", “ErbB 1", “receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR” se utilizan indistintamente en la presente, y se refieren al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como se da a conocer, por ejemplo, en Carpenter y colaboradores, Ann. Rev. Biochem . 56: 881 -914 (1987), incluyendo las formas mutantes que se presentan naturalmente del mismo (por ejemplo, un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mutante de supresión, como en Humphrcy y colaboradores (1990) PNAS (EUA) 87: 4207-421 1 ). erbB1 se refiere al gen que codifica el producto de proteína del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Los términos “HER2" y "ErbB2” se utilizan indistintamente en la presente, y se refieren a la proteína de HER2 humano descrita, por ejemplo, en Semba y colaboradores (1985) PNAS (EUA) 82: 6497-6501 y Yamamoto y colaboradores (1986) Nature 319: 230-234 (Genebank, número de acceso X03363). El término “erbB2” se refiere al gen que codifica el ErbB2 humano, y “neu” se refiere al gen que codifica el p185neu de rata.

Los términos “HER4" y "ErbB4” en la presente se refieren al polipéptido del receptor como se da a conocer, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Europea Número EP 599,274; en Plowman y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90: 1746-1750; y en Plowman y colaboradores (1993) Nature, 366: 473-475, incluyendo las isoformas de los mismos, por ejemplo, como se dan a conocer en la Publicación Internacional Número W099/19488, publicada el 22 de abril de 1999.

El término “HER3" o "receptor HER3”, también conocido como “ErbB3", como se utiliza en la presente, se refiere a una proteína de HER3 de mamífero, y “her3" o "erbB3" se refiere a un gen her3 de mamífero. La proteína de HER3 preferida es la proteína de HER3 humano presente en la membrana celular de una célula. El gen her3 humano se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,480,968, y en Plowman y colaboradores (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 87: 4905-4909.

El HER3 humano, como se define en el Número de Acceso NP_001973 (humano), está representado más adelante como la SEQ ID NO: 1. Toda la nomenclatura es para el HER3 inmaduro de longitud completa (aminoácidos 1 a 1342). El HER3 inmaduro se disocia entre las posiciones 19 y 20, lo cual da como resultado la proteína del HER3 maduro (de 20 a 1342 aminoácidos) mrandalqvl gllfslargs evgnsqavcp gtlnglsvtg daenqyqtly klyercevvm gnleivltgh nadlsflqwi revtgyvlva mnefstlplp nlrvvrgtqv ydgkfaifvm Inyntnssha Irqlrltqlt eilsggvyie kndklchmdt idwrdivrdr daeivvkdng rscppchevc kgrcwgpgse dcqtltktic apqenghcfg pnpnqcchde caggcsgpqd tdcfacrhfn dsgacvprcp qplvynkltf qlepnphtky qyggvcvasc phnfvvdqts cvracppdkm evdknglkmc epcgglcpka cegtgsgsrf qtvdssnidg fvnctkilgn Idflitglng dpwhkipald peklnvfrtv reitgylniq swpphmhnfs vfsnlttigg rslynrgfsl limknlnvts Igfrslkeis agriyisanr qlcyhhslnw tkvlrgptee rldikhnrpr rdcvaegkvc dplcssggcw gpgpgqclsc rnysrggvcv thcnflngep refaheaecf schpecqpme gtatcngsgs dtcaqcahfr dgphcvsscp hgvlgakgpi ykypdvqnec rpchenctqg ckgpelqdcl gqtlvligkt hltmaltvia glvvifmmlg gtflywrgrr iqnkramrry lergesiepl dpsekankvl arifketelr klkvlgsgvf gtvhkgvwip egesikipvc ikviedksgr qsfqavtdhm laigsldhah ivrllglcpg sslqlvtqilo plgslldhvr qhrgalgpql llnwgvqiak gmyyleehgm vhrnlaarnv llkspsqvqv adfgvadllp pddkqllyse aktpikwmal esihfgkyth qsdvwsygvt vwelmtfgae pyaglrlaev pdllekgerl aqpqictidv ymvmvkcwmi denirptfke laneftrmar dpprylvikr esgpgiapgp ephgltnkkl eevelepeld Idldleaeed nlatttlgsa Islpvgtlnr prgsqsllsp ssgympmnqg nlgescqesa vsgssercpr pvslhpmprg clasessegh vtgseaelqe kvsmcrsrsr srsprprgds ayhsqrhsll tpvtplsppg leeedvngyv mpdthlkgtp ssregtlssv glssvlgtee ededecyeym nrrrrhspph pprpssleel gyeymdvgsd Isaslgstqs cplhpvpimp tagttpdedy eymnrqrdgg gpggdyaamg acpaseqgye emrafqgpgh qaphvhyarl ktlrsleatd safdnpdywh srlfpkanaq rt (SEQ ID NO: 1 ).

El término “ligando de HER", como se utiliza en la presente, se refiere a los polipéptidos que se enlazan con , y activan, los receptores HER, tales como HER1 , HER2, HER3 y HER4. Los ejemplos de los ligandos de HER incluyen, pero no se limitan a, neurregulina 1 (NRG), neurregulina 2, neurregulina 3, neurregulina 4, beta-celulina, factor de crecimiento epidérmico que se enlaza a heparina, epirregulina, factor de crecimiento epidérmico, anfirregulina, y factor de crecimiento transformante-alfa. El término incluye los fragmentos y/o variantes biológicamente activos de un polipéptido que se presente naturalmente.

El término “ligando de HER3", como se utiliza en la presente, se refiere a los polipéptidos que se enlazan con, y activan, HER3. Los ejemplos de los ligandos de HER3 incluyen, pero no se limitan a, neurregulina 1 (NRG), y neurregulina 2, beta-celulina, factor de crecimiento epidérmico que se enlaza a heparina, y epirregulina. El término incluye los fragmentos y/o variantes biológicamente activos de un polipéptido que se presente naturalmente.

El “complejo de proteína de HER-HER” es un oligómero no covalentemente asociado que contiene co-receptores HER en cualquier combinación (por ejemplo, HER1 -HER2, HER1 -HER3, HER1 -HER4, HER2-HER3, HER3- HER4, y similares). Este complejo se puede formar cuando una célula que exprese ambos de estos receptores se exponga a un ligando de HER, por ejemplo, NRG, o cuando un receptor HER sea activo o se sobre-exprese.

El “complejo de proteína de HER2-HER3” es un oligómero no covalentemente asociado que contiene el receptor H ER2 y el receptor HER3. Este complejo se puede formar cuando una célula que exprese ambos de estos receptores se exponga a un ligando de HER3, por ejemplo, NRG, o cuando HER2 sea activo o se sobre exprese.

La frase “actividad de HER3" o " activación de HER3", como se utiliza en la presente, se refiere a un aumento en la oligomerización (por ejemplo, un aumento en los complejos que contienen HER3), en la fosforilación de HER3, en las reconfiguraciones conformacionales (por ejemplo, aquéllas inducidas por ligandos), y en la señalización corriente abajo mediada por HER3.

El término “estabilización" o "estabilizado’, utilizado en el contexto de HER3, se refiere a un anticuerpo o a un fragmento del mismo que mantiene directamente (asegura, ata, detiene, enlaza preferencialmente, favorece) el estado inactivo o la conformación de HER3 sin bloquear el enlace del ligando al HER3, de tal manera que el enlace del ligando ya no es capaz de activar el HER3. Los ensayos descritos en los Ejemplos se pueden utilizar para medir el enlace del ligando a un receptor HER3 estabilizado, por ejemplo, el ensayo Biacore.

El término “señalización dependiente del ligando", como se utiliza en la presente, se refiere a la activación de HER (por ejemplo, HER3) por medio del ligando. La activación de HER3 es evidenciada por un aumento en la oligomerización (por ejemplo, heterodimerización) y/o en la fosforilación de HER3, de tal manera que se activan las sendas de señalización corriente abajo (por ejemplo, PI3K). El anticuerpo o el fragmento del mismo puede reducir de una manera estadísticamente significativa la cantidad de HER3 fosforilado en una célula estimulada expuesta a la proteína de enlace al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) en relación con una célula no tratada (control), como se mide utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos. La célula que expresa HER3 puede ser una línea celular que se presente naturalmente (por ejemplo, MCF7) o se puede producir de una manera recombinante mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifiquen la proteína HER3 en una célula huésped. La estimulación celular se puede presentar ya sea por medio de la adición exógena de un ligando de HER3 activador, o mediante la expresión endógena de un ligando activador.

El anticuerpo o el fragmento del mismo que “reduce la activación de HER3 inducida por neurregulina en una célula” es uno que reduce de una manera estadísticamente significativa la fosforilación de tirosina de HER3 en relación con una célula no tratada (control), como se mide utilizando los ensayos descritos en los Ejemplos. Esto se puede determinar basándose en los niveles de fosfotirosina de HER3 en seguida de la exposición de HER3 al NRG y al anticuerpo de interés. La célula que expresa la proteína de HER3 puede ser una célula o línea celular que se presente naturalmente (por ejemplo, MCF7) o se puede producir de una manera recombinante.

El término “señalización independiente del ligando", como se utiliza en la presente, se refiere a la actividad de HER3 celular (por ejemplo, la fosforilación), en ausencia de un requerimiento de enlace del ligando. Por ejemplo, la activación de HER3 independiente del ligando puede ser un resultado de la sobre-expresión de HER2 o las mutaciones activadoras en los componentes del heterodímero de HER3, tales como EGFR y HER2. El anticuerpo o el fragmento del mismo puede reducir de una manera estadísticamente significativa la cantidad de HER3 fosforilado en una célula expuesta a la proteína de enlace al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) en relación con una célula no tratada (control). La célula que expresa HER3 puede ser una línea celular que se presente naturalmente (por ejemplo, SK-Br-3) o se puede producir de una manera recombinante mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifiquen la proteína de HER3 en una célula huésped.

El término “bloquea", como se utiliza en la presente, se refiere a detener o impedir una interacción o un proceso, por ejemplo, detener la señalización dependiente del ligando o independiente del ligando.

El término “reconocer", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo o a un fragmento del mismo que encuentra e interactúa (por ejemplo, se enlaza) con su epítopo conformacional.

La frase “se enlaza de una manera concurrente", como se utiliza en la presente, se refiere a un ligando de HER que puede enlazarse a un sitio de enlace de ligando sobre el receptor HER junto con el anticuerpo de HER. Esto significa que tanto el ligando como el anticuerpo pueden enlazarse al receptor HER juntos. Por conveniencia de ilustración solamente, el ligando de HER3 NRG, puede enlazarse al receptor HER3 junto con el anticuerpo de HER3. El ensayo para medir el enlace concurrente del ligando y el anticuerpo se describen en la sección de Ejemplos (por ejemplo, Biacore).

El término “fracasa", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo o a un fragmento del mismo que no hace un evento particular. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo que “fracasa para activar la transducción de señales” es uno que no desencadena la transducción de señales; un anticuerpo o un fragmento del mismo que “fracasa para inducir un cambio conformacional” es uno que no provoca una alteración estructural en el receptor HER; un anticuerpo o un fragmento del mismo que estabiliza el receptor HER en un estado inactivo, de tal manera que el receptor HER “fracasa para dimerizarse” es uno que no forma complejos de proteína-proteína.

El término “anticuerpo", como se utiliza en la presente, se refiere a anticuerpos enteros que interactúan con (por ejemplo, mediante enlace, impedimento estérico, estabilización/ desestabilización, distribución espacial) un epítopo de HER3 e inhiben la transducción de señales. Un "anticuerpo" que se presenta naturalmente es una glicoproteína que comprende cuando menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH), y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH 1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL), y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas como regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas como regiones de estructura (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y cuatro regiones de estructura (FRs) arregladas desde el término amino hasta el término carboxilo en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmunológico (por ejemplo, las células efectoras), y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término “anticuerpo” incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, Fvs de una sola cadena (scFv), Fvs enlazado con disulfuro (sdFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) para los anticuerpos de la invención), y fragmentos de enlace al epítopo de cualquiera de los anteriores. Los anticuerpos pueden ser de cualquier clase de isotipo (por ejemplo, I g G , IgE, IgM , IgD, IgA e I g Y) , o subclase de isotipo (por ejemplo, I g G 1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA 1 e I g A2 ) .

Ambas cadenas ligera y pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos “constante" y "variable” se utilizan funcionalmente. En este aspecto, se apreciará que los dominios variables de ambas porciones de cadena ligera (VL) y de cadena pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Inversamente, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y de la cadena pesada (CH 1 , CH2 ó CH3) confieren importantes propiedades biológicas, tales como secreción, movilidad transplacentaria, enlace al receptor de Fe, enlace al complemento, y similares. Por convención, la numeración de los dominios de las regiones constantes aumenta a medida que llegan a hacerse más distales desde el sitio de enlace al antígeno o el término amino del anticuerpo. El término-N es una región variable, y el término-C es una región constante; los dominios CH3 y CL realmente comprenden el término carboxilo de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

La frase “fragmento de anticuerpo", como se utiliza en la presente, se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que conservan la capacidad para interactuar específicamente (por ejemplo, mediante enlace, impedimento estérico, estabilización/ desestabilización, distribución espacial) con un epítopo de HER3 e inhibir la transducción de señales. Los ejemplos de los fragmentos de enlace un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH , CL y CH 1 ; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1 ; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward y colaboradores (1989) Nature 341 : 544-546), el cual consiste en un dominio VH; y una región determinante de complementariedad (CDR) aislada.

Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, se pueden unir, empleando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les haga posible elaborarse como una sola cadena de proteína en donde el par de regiones VL y VH formen moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv); véase, por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242: 423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85: 5879-5883). También se pretende que estos anticuerpos de una sola cadena sean abarcados dentro del término “fragmento de anticuerpo". Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen empleando téenicas convencionales conocidas por las personas expertas en la materia, y los fragmento se rastrean para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los fragmentos de anticuerpos tambien se pueden incorporar en anticuerpos de un solo dominio, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23: 1 126-1 136). Los fragmentos de anticuerpos se pueden injertar en andamiajes basados en polipéptidos, tales como Fibronectina tipo III (Fn3) (véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,703, 199, la cual describe monocuerpos de polipéptidos de fibronectina).

Los fragmentos de anticuerpos se pueden incorporar en moléculas de una sola cadena que comprendan un par de segmentos Fv en fila (VH-CH 1 -VH-CH1 ), los cuales, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementaria, forman un par de regiones de enlace al antígeno (Zapata y colaboradores (1995) Protein Eng. 8: 1057-1062; y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,641 ,870).

El término “epítopo” incluye cualquier determinante de proteína capaz de tener un enlace específico a una inmunoglobulina o de otra manera interactuar con una molécula. Los determinantes epitópicos en términos generales consisten en agrupaciones de moléculas superficiales químicamente activas, tales como cadenas laterales de aminoácidos o de carbohidratos o de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser “lineal" o "conformacional”.

El término “epítopo lineal” se refiere a un epítopo con todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula interactuante (tal como un anticuerpo) que se presenta linealmente a lo largo de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína (continua). Una vez que se determina un epítopo deseado sobre un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítopo, por ejemplo, empleando las téenicas descritas en la presente invención. De una manera alternativa, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de los anticuerpos puede elucidar información acerca de los epítopos deseables. A partir de esta información, entonces es posible rastrear de una manera competitiva los anticuerpos para enlazarse al mismo epítopo. Un planteamiento para lograr esto es conducir estudios de competición cruzada para encontrar los anticuerpos que se enlacen competitivamente unos con otros, por ejemplo, los anticuerpos compiten por el enlace al antígeno. Se describe un proceso de alta producción para “reservar” los anticuerpos basándose en su competición cruzada, en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 2003/48731 . Como será apreciado por un experto en la materia, prácticamente cualquier cosa a la que se pueda enlazar específicamente un anticuerpo podría ser un epítopo. Un epítopo puede comprender los residuos a los que se enlaza el anticuerpo.

El término “epítopo conformacional” se refiere a un epítopo en donde los aminoácidos discontinuos llegan a juntarse en una conformación tridimensional. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se presentan a traves de los residuos de aminoácidos que están separados unos de otros sobre la proteína. En una modalidad, el epítopo es aquél descrito en los Ejemplos de esta memoria descriptiva. En una modalidad, el epítopo conformacional es definido por: (i) los residuos de aminoácidos de HER3 265-277 y 315 (del dominio 2), y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3 571 , 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de la SEQ ID NO: 1 , o un subconjunto de los mismos. Como será apreciado por un experto en la materia, el espacio que es ocupado por un residuo o por una cadena lateral que crea la forma de una molécula ayuda a determinar lo que es un epítopo.

En términos generales, los anticuerpos específicos para un antígeno objetivo particular reconocerán preferencialmente un epítopo sobre el antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo se pueden identificar utilizando cualquier número de téenicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Volumen 66 (Glenn E. Morris, Editor, 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jerscy. Por ejemplo, los epítopos lineales se pueden determinar, por ejemplo, sintetizando de una manera concurrente grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de la proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con los anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Estas téenicas se conocen en la materia, y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,708,871 ; en Gcysen y colaboradores (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 8: 3998-4002; en Geysen y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 78-182; y en Geysen y colaboradores (1986) Mol. Immunol. 23: 709-715. De una manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de los aminoácidos, tal como mediante, por ejemplo, intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos-X, y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de las proteínas también se pueden identificar utilizando gráficas convencionales de antigenicidad e hidropatía, tales como aquéllas calculadas utilizando, por ejemplo, el programa de software Omiga versión 1 .0 disponible en el Oxford Molecular Group. Este programa de computación emplea el método de Hopp/Woods, Hopp y colaboradores (1981 ) Proc. Nati. Acad. Sci EUA 78: 3824-3828; para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte y colaboradores (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132; para las gráficas de hidropatía.

El término “parátopo", como se utiliza en la presente, se refiere a la estructura general de una región de enlace que determina el enlace a un epítopo. Esta estructura tiene influencia sobre si la región de enlace podría enlazarse o no a un epítopo y de qué manera. Parátopo puede referirse a un sitio antigénico de un anticuerpo que es responsable de que un anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un determinante antigénico. Parátopo también se refiere al idiótopo del anticuerpo y la región determinante de complementariedad (CDR) que se enlaza al epítopo. En una modalidad, el parátopo es la región del anticuerpo que se enlaza al epítopo conformacional, el cual comprende: (i) los residuos de aminoácidos de HER3 265-277 y 315 (del dominio 2), y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3 571 , 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de la SEQ ID NO: 1 , o un subconjunto de los mismos. En una modalidad, el parátopo es la región del anticuerpo que comprende las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR). En una modalidad, el parátopo comprende las secuencias enlistadas en la Tabla 1 . En una modalidad, el parátopo comprende cuando menos un residuo de aminoácido que se enlaza con los residuos de HER3: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271 , Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571 , Pro583, His584, Ala596, Lys597. En una modalidad, el parátopo comprende cuando menos un residuo de aminoácido que se enlaza con los residuos de HER3: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, He600, Lys602, Glu609, Arg611 , Pro612, Cys613, His614, Glu615. Como será apreciado por un experto en la materia, el parátopo de cualquier anticuerpo, o variante del mismo, se puede determinar de la manera estipulada por la presente solicitud.

Las frases “anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se utilizan en la presente, se refieren a polipeptidos, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, etc. que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica o que se derivan a partir de la misma fuente genética. Este término también incluye las preparaciones de moléculas de anticuerpos de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una sola especificidad de enlace y afinidad por un epítopo particular.

La frase “anticuerpo humano”, como se utiliza en la presente, incluye los anticuerpos que tienen regiones variables en donde tanto las regiones de estructura (FR) como la regiones determinantes de complementariedad (CDR) se derivan a partir de secuencias de origen humano. Adicionalmente, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva a partir de las secuencias humanas, por ejemplo, las secuencias de la línea germinal humana, o las versiones mutadas de las secuencias de la línea germinal humana, o el anticuerpo contiene secuencias de estructura en consenso derivadas a partir del análisis de las secuencias de estructura humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik y colaboradores (2000) J Mol Biol 296: 57-86). Las estructuras y localizaciones de los dominios variables de inmunoglobulina, por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad (CDRs), se pueden definir utilizando los esquemas de numeración bien conocidos, por ejemplo, el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chotia, o una combinación de Kabat y Chotia (véase, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunologlcal Interest, U .S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos) (1991 ), Editores Kabat y colaboradores; Lazikani y colaboradores (1997) J. Mol. Bio. 273: 927-948); Kabat y colaboradores (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edición, N1H Publicación No. 91 -3242 U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos); Chotia y colaboradores (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 -917; Chotia y colaboradores (1989) Nature 342: 877-883; y Al-Lazikani y colaboradores (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-948.

Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, las mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo, o una sustitución conservadora para promover la estabilidad en la elaboración).

La frase “anticuerpo monoclonal humano", como se utiliza en la presente, se refiere a los anticuerpos que exhiben una sola especificidad de enlace, los cuales tienen regiones variables en donde tanto las regiones de estructura (FR) como la regiones determinantes de complementariedad (CDR) se derivan a partir de secuencias humanas. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una celula-B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humano y un transgén de cadena ligera fusionado con una célula inmortalizada.

La frase “anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, los anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, los anticuerpos aislados a partir de una biblioteca recombinante de anticuerpos humanos de combinación, y los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involuere el empalme de toda o de una porción de una secuencia genética de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Los anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en donde las regiones de estructura (FR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se derivan a partir de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, los anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de inmunoglobulina (Ig) humana, mutagénesis somática in vivo) y, por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son las secuencias que, aunque se deriven a partir de, y estén relacionadas con las secuencias VH y una VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de anticuerpos de la línea germinal humana in vivo.

El enlace específico entre dos entidades significa un enlace con una constante en equilibrio (KA) (kact¡vada/kdesactivada) de cuando menos 102M 1, cuando menos 5x102M 1, cuando menos 103M 1, cuando menos 5x103M 1, cuando menos 104M 1cuando menos 5x104M 1, cuando menos 105M 1, cuando menos 5x105M 1, cuando menos 106M 1, cuando menos 5x106M 1, cuando menos 107M 1, cuando menos 5x107M 1, cuando menos 10aM 1, cuando menos 5x108M 1, cuando menos 109M 1, cuando menos 5x109M 1, cuando menos 101°M 1, cuando menos 5x101°M 1, cuando menos 1011M 1, cuando menos 5x1011M 1, cuando menos 1012M 1, cuando menos 5x1012M \ cuando menos 1013M 1, cuando menos 5x1013 M 1, cuando menos 1014M 1, cuando menos 5x1014M 1, cuando menos 1015M 1, o cuando menos 5x101sM 1.

La frase “se enlaza específicamente (o selectivamente)’’ a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza a HER3) se refiere a una reacción de enlace que es determinante de la presencia de un antígeno cognado (por ejemplo, un HER3 humano) en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. En adición a la constante en equilibrio (KA) mencionada anteriormente, un anticuerpo que se enlaza a HER3 de la invención típicamente también tiene una constante de índice de disociación (KD) (kdesactivada/kactivada) de menos de 5x102M, menos de 102M, menos de 5X103M, menos de 103M, menos de 5x104M, menos de 104M, menos de 5x105M, menos de 105M, menos de 5x10eM, menos de 106M, menos de 5x107M, menos de 107M, menos de 5x108 , menos de 108M, menos de 5x109M, menos de 109M, menos de 5x101°M, menos de 101°M, menos de 5x1011M, menos de 1011M, menos de 5x1012M, menos de 10 a 12M, menos de 5x1013M, menos de 1013M, menos de 5x1014M, menos de 1014M, menos de 5x1015M, o menos de 1015M o menos, y se enlaza a HER3 con una afinidad que es cuando menos dos veces mayor que su afinidad para enlazarse a un antígeno no específico (por ejemplo, HSA).

En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo tiene una constante de disociación (Kd) de menos de 3,000 pM, menos de 2,500 pM, menos de 2,000 pM, menos de 1,500 pM, menos de 1,000 pM, menos de 750 pM, menos de 500 pM, menos de 250 pM, menos de 200 pM, menos de 150 pM, menos de 100 pM, menos de 75 pM, menos de 10 pM, o menos de 1 pM, como se evalúa empleando un método descrito en la presente o conocido por un experto en la materia (por ejemplo, un ensayo BIAcore, ELISA, FACS, SET) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia). El término “KaSoc" o "Ka”, como se utiliza en la presente, se refiere al índice de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, mientras que el término “Kd¡s" o "Kd", como se utiliza en la presente, se refiere al índice de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. El término “KD”, como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de disociación, la cual se obtiene a partir de la proporción de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka), y se expresa como una concentración molar (M). Los valores KD para los anticuerpos se pueden determinar empleando los métodos bien establecidos en la materia. Un método para determinar la KD de un anticuerpo es utilizando resonancia de plasmón superficial, o utilizando un sistema biosensor, tal como un sistema Biacore®.

El término “afinidad", como se utiliza en la presente, se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en los sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del “brazo” del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con antígeno en numerosos sitios; mientras más interacciones haya, más fuerte será la afinidad.

El término “avidez", como se utiliza en la presente, se refiere a una medida informativa de la estabilidad o fuerza global del complejo de anticuerpo-antígeno. Se controla mediante tres factores principales: afinidad de anticuerpo-epítopo; la valencia tanto del antígeno como del anticuerpo; y la configuración estructural de las partes que interactúan. Por último estos factores definen la especificidad del anticuerpo, es decir, la probabilidad de que el anticuerpo particular se enlace a un epítopo de antígeno preciso.

El término “valencia", como se utiliza en la presente, se refiere al número de sitios de enlace objetivo potenciales en un polipéptido. Cada sitio de enlace objetivo se enlaza específicamente a una molécula objetivo o a un sitio específico (es decir, a un epítopo) sobre una molécula objetivo. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de enlace objetivo, cada sitio de enlace objetivo se puede enlazar específicamente a las mismas o a diferentes moléculas (por ejemplo, se puede enlazar a diferentes moléculas, por ejemplo, a diferentes antígenos, o a diferentes epítopos sobre la misma molécula).

La frase “anticuerpo antagonista", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que se enlaza con HER3 y neutraliza la actividad biológica de la señalización de HER3, por ejemplo, reduce, disminuye y/o inhibe la actividad de señalización inducida por HER3, por ejemplo, en un ensayo de fosfo-HER3 ó fosfo-Akt. Los ejemplos de los ensayos se describen con más detalles en los Ejemplos que se encuentran más adelante. De conformidad con lo anterior, se entenderá que un anticuerpo que “inhibe” una o más de estas propiedades funcionales de HER3 (por ejemplo, actividades bioquímicas, inmunoquímicas, celulares, fisiológicas, u otras actividades biológicas, o similares), como se determine de acuerdo con las metodologías conocidas en este campo y descritas en la presente, se relaciona con una disminución estadísticamente significativa en la actividad particular en relación con la que se ve en ausencia del anticuerpo (por ejemplo, o cuando está presente un anticuerpo de control de una especificidad irrelevante). Un anticuerpo que inhibe la actividad de HER3 efectúa dicha disminución estadísticamente significativa por cuando menos el 10 por ciento del parámetro medido, por cuando menos el 50 por ciento, el 80 por ciento o el 90 por ciento, y en ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención pueden inhibir más del 95 por ciento, del 98 por ciento o del 99 por ciento de la actividad funcional de HER3, como sea evidenciado por una reducción en el nivel de fosforilación celular de HER3.

La frase “anticuerpo aislado” se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tengan diferentes especificidades antigenicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a HER3 está sustancialmente libre de anticuerpos que se enlacen específicamente con antígenos diferentes de HER3). Un anticuerpo aislado que se enlaza específicamente a HER3, sin embargo, puede tener reactividad cruzada con otros antígenos. Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o productos químicos.

La frase “variante conservadoramente modificada” se aplica a las secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, hasta secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en toda posición en donde una alanina sea especificada por un codón, el codón se puede alterar hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son “variaciones silenciosas", las cuales son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Toda secuencia de ácido nucleico en la presente que codifique un polipéptido, también describe toda posible variación silenciosa del ácido nucleico. Una persona experta reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, el cual es ordinariamente el único codón para triptófano) se puede modificar para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. De conformidad con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifique un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita.

Para las secuencias de polipéptidos, las “variantes conservadoramente modificadas” incluyen las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia de polipéptido lo cual da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan los aminoácidos funcionalmente similares, son bien conocidas en este campo. Las variantes conservadoramente modificadas son en adición a, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos inter-especies, y los alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen los aminoácidos que son sustituciones conservadoras unos por otros: 1 ) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). En algunas modalidades, el término "modificaciones conservadoras de secuencias" se utilizan para referirse a las modificaciones de aminoácidos que no afecten o alteren significativamente las características de enlace del anticuerpo que contenga la secuencia de aminoácidos.

Los términos “compite cruzadamente” y “competición cruzada", se utilizan indistintamente en la presente para significar la capacidad de un anticuerpo o de otro agente de enlace para interferir con el enlace de otros anticuerpos o agentes de enlace a H ER3 en un ensayo de enlace competitivo convencional.

La capacidad o el grado hasta el cual un anticuerpo u otro agente de enlace es capaz de interferir con el enlace de otro anticuerpo o molécula de enlace a HER3 y, por consiguiente, si se puede decir que compite cruzadamente de acuerdo con la invención, se puede determinar utilizando ensayos de enlace competitivo convencionales. Un ensayo adecuado involucra el uso de la teenología Biacore (por ejemplo, utilizando el instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), el cual puede medir el grado de interacciones utilizando la tecnología de resonancia de plas ón superficial. Otro ensayo para medir la competición cruzada utiliza un planteamiento basado en ELISA.

El término “optimizada”, como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de nucleótidos que se ha alterado para codificar una secuencia de aminoácidos utilizando los codones que son preferidos en la célula u organismo productor, en términos generales una célula eucariótica, por ejemplo, una célula de Pichia, una célula de Trichoderma, una célula de ovario de hámster chino (CHO), o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se diseña para conservar completamente, o tanto como sea posible, la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos inicial, la cual también se conoce como la secuencia "progenitora".

Los ensayos convencionales para evaluar la capacidad de enlace de los anticuerpos hacia la HER3 de diferentes especies son conocidos en la materia, incluyendo, por ejemplo, ELISAs, Western blots, y RIAs. Los ensayos adecuados se describen con detalle en los Ejemplos. La cinética de enlace (por ejemplo, la afinidad de enlace) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante los ensayos convencionales conocidos en la materia, tales como mediante el análisis Biacore o la afinidad relativa de FACS (Scatchard). Los ensayos para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre las propiedades funcionales de HER3 (por ejemplo, ensayos de enlace al receptor o modulación de la senda de HER) se describen con mayor detalle en los Ejemplos.

Las frases “por ciento identicas" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son ¡guales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60 por ciento de identidad, opcionalmente 65 por ciento, 70 por ciento, 75 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, o 99 por ciento de identidad sobre una región especificada, o, cuando no se especifica, sobre la secuencia entera), cuando se comparan y se alinean para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o una región designada como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es de cuando menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente sobre una región que es de 100 a 500 ó 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en una computadora, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una “ventana de comparación”, como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas a partir del grupo que consiste en 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en donde una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias se alinean de una manera óptima. Los métodos de alineación de las secuencias para comparación son bien conocidos en la materia. La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. EUA 85: 2444, mediante las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Brent y colaboradores (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias, son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul y colaboradores (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; y Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo involucra primero identificar los pares de secuencias de alta puntuación (HSPs), mediante la identificación de palabras cortas de una longitud W en la secuencia pedida, las cuales concuerdan o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando son alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T es referido como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul y colaboradores, supra). Estos impactos iniciales de la palabra vecina actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar secuencias de alta puntuación (HSPs) más largas que las contengan. Los impactos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto como se pueda incrementar la puntuación acumulativa de alineación. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos concordantes; siempre > 0), y N (puntuación de penalidad para los residuos que no concuerdan; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación con el fin de calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los impactos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae fuera por la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa llega hasta cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por omisión una longitud de palabra (W) de 1 1 , una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por omisión una longitud de palabra de 3, y expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 10915), alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentaría una concordancia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos por azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia, es menor de aproximadamente 0.2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.01 , y de una manera muy preferible menor de aproximadamente 0.001 .

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Mcyers y W. Miller ((1988) Comput. Appl. Biosci. 4: 1 1 -17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM 120, una penalidad por longitud de hueco de 12, y una penalidad de hueco de 4. En adición, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453), el cual se ha incorporado en el programa Gap del paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4, y un peso de longitud de 1 , 2, 3, 4, 5, ó 6.

De otra forma que no sea el porcentaje de identidad de secuencias mencionado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas, es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico reacciona cruzadamente de una manera inmunológica con los anticuerpos reproducidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por consiguiente, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que las dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan una con la otra bajo condiciones restringentes, como se describe a continuación. Todavía otra indicación de que las dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, es que se pueden utilizar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

La frase “ácido nucleico” se utiliza en la presente de una manera intercambiable con el término “polinucleótido”, y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, ya sea en una forma de una sola cadena o de doble cadena. El término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de la estructura base modificados, los cuales son sintéticos, se presentan naturalmente, y se presentan no naturalmente, que tienen propiedades de enlace similares a aquéllas del ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de estos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metil-fosfonatos, metil-fosfonatos quirales, ribonucleótidos de 2-O-metilo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs).

A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular tambien abarca implícitamente las variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), y las secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. De una manera específica, como se detalla más adelante, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación de secuencias en donde la tercera posición de uno o más (o todos los) codones seleccionados es sustituida con residuos de base mixta y/o de desoxi-inosina (Batzer y colaboradores (1991 ), Nucleic Acid Res. 19: 5081 ; Ohtsuka y colaboradores (1985) J. Biol. Chem . 260: 2605-2608; y Rossolini y colaboradores (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91 -98).

La frase “operativamente enlazado” se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótidos (por ejemplo, ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de transcripción con una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora se enlaza operativamente con una secuencia de codificación si estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula huesped apropiada o en otro sistema de expresión En términos generales, las secuencias reguladoras de transcripción del promotor que se enlazan operativamente con una secuencia transcrita, están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de acción cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de transcripción, tales como las potenciadoras, no necesitan estar físicamente contiguas o localizadas en cercana proximidad a las secuencias de codificación cuya transcripción potencian.

Los términos “polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido que se presente naturalmente correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos que se presentan naturalmente y a los polímeros de aminoácidos que no se presentan naturalmente. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de polipéptido particular también abarca implícitamente las variantes conservadoramente modificadas de la misma.

El término “sujeto” incluye los animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, reses, pollos, anfibios, y reptiles. Excepto cuando se observe, los términos “paciente" o "sujeto” se utilizan en la presente indistintamente.

El término “agente contra el cáncer” significa cualquier agente que se pueda utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular, tal como cáncer, incluyendo agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes de radioterapia y radioterapéuticos, agentes dirigidos contra los cánceres, y agentes inmunoterapéuticos.

“Tumor” se refiere al crecimiento y proliferación de células neoplásicas, ya sea malignas o benignas, y a todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.

El término “actividad anti-tumoral” significa una reducción en el índice de proliferación, viabilidad, o actividad metastásica de las células tumorales. Una posible forma de mostrar la actividad anti-tumoral es cuando se muestra una declinación en el índice de crecimiento de las células anormales, que se presenta durante la terapia, o la estabilidad o reducción del tamaño del tumor. Esta actividad se puede evaluar utilizando los modelos de tumores in vitro o in vivo aceptados, incluyendo, pero no limitándose a, los modelos de xenomjerto, los modelos MMTV, y otros modelos conocidos en el campo para investigar la actividad anti-tumoral.

El término “malignidad” se refiere a un tumor no benigno o a un cáncer. Como se utiliza en la presente, el término “cáncer” incluye una malignidad caracterizada por un crecimiento celular mal regulado o incontrolado. Los cánceres de ejemplo incluyen: carcinomas, sarcomas, leucemias, y linfomas. El término “cáncer” incluye los tumores malignos primarios (por ejemplo, aquéllos cuyas células no han migrado hacia los sitios del cuerpo del sujeto diferentes del sitio del tumor original), y tumores malignos secundarios (por ejemplo, aquéllos que se presentan a partir de metástasis, la migración de las células tumorales hacia sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original).

Diferentes aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes secciones y subsecciones.

Estructura y Mecanismo de Activación de los Receptores HER Los cuatro receptores HER tienen un dominio de enlace a ligando extracelular, un único dominio transmembrana, y un dominio que contiene cinasa de tirosina citoplásmica. El dominio de cinasa de tirosina intracelular de los receptores HER está altamente conservado, aunque el dominio de cinasa de HER3 contiene sustituciones de aminoácidos críticos y, por consiguiente, carece de actividad de cinasa (Guy y colaboradores (1994): PNAS 91 , 8132-8136). La dimerización de los receptores HER inducida por el ligando induce la activación de la cinasa, la transfosforilación del receptor sobre los residuos de tirosina en la cola C-terminal, seguida por el reclutamiento y la activación de los efectores de señalización intracelulares (Yarden y Sliwkowski, (2001 ) Nature Rev 2, 127-137; Jorissen y colaboradores (2003) Exp Cell Res 284, 31 -53.

Las estructuras de cristal de los dominios extracelulares de los HERs han proporcionado alguna perspectiva del proceso de activación del receptor inducida por el ligando (Schlessinger, (2002) Cell 1 10, 669-672). El dominio extracelular de cada receptor HER consiste en cuatro subdominios: Los subdominios I y III cooperan en la formación del sitio de enlace al ligando, mientras que el subdominio II (y tal vez también el subdominio IV) participa en la dimerización del receptor por medio de interacciones directas de receptor-receptor. En las estructuras del HER1 enlazado al ligando, una horquilla-b (denominada como el ciclo de dimerización) en el subdominio II interactúa con el ciclo de dimerización del receptor compañero, mediando la dimerización del receptor (Garrett y colaboradores (2002) Cell 1 10, 763-773; Ogiso y colaboradores (2002) Cell 1 10, 775-787). En contraste, en las estructuras de los HER1 , HER3 y HER4 inactivos, el ciclo de dimerización se ocupa de las interacciones intramoleculares con el subdominio IV, el cual impide la dimerización del receptor en ausencia del ligando (Cho y Leahy, (2002) Science 297, 1330-1333; Ferguson y colaboradores (2003) Mol Cell 12, 541 -552; Bouyan y colaboradores (2005) PNAS102, 15024-15029). La estructura de HER2 es única entre los HERs. En ausencia de un ligando, HER2 tiene una conformación que se parece al estado activado por el ligando de HER1 con un ciclo de dimerización protuberante, disponible para interactuar con otros receptores HER (Cho y colaboradores (2003) Nature 421 , 756-760; Garrett y colaboradores (2003) Mol Cell 1 1 , 495-505). Esto puede explicar la mejor capacidad de heterodi erización del HER2.

Aunque las estructuras de cristal del receptor HER proporcionan un modelo para la homo- y hetero-dimerización del receptor HER, el fondo para la prevalencia de algunos homo- y hetero-dímeros de HER sobre otros (Franklin y colaboradores (2004) Cáncer Cell 5, 317-328), así como la función conformacional de cada dominio en la dimerización y automhibición del receptor (Burgess y colaboradores (2003) Mol Cell 12, 541 -552; Mattoon y colaboradores (2004) PNAS 101 , 923-928) sigue siendo poco claro. Como se describe a continuación, la estructura del cristal de rayos-X de HER3 proporciona más perspectivas.

Estructura de HER3 y Epítopos Conformacionaies Un epítopo conformacional con el que se enlazan las proteínas al antígeno, por ejemplo, el enlace de los anticuerpos anti-HER3 proporcionado en la presente. Por primera vez, se ha demostrado la estructura tridimensional de una forma truncada (residuos 20-640) del dominio extracelular de HER3 que forma complejo con un anticuerpo. El complejo de HER3-MOR09823 Fab y el HER3-MOR09825 se han determinado en una resolución de 3.2 Á y 3.4 Á, respectivamente, y se muestran en la Figura 5A. La divulgación de la presente tambien muestra por primera vez un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza a un estado inactivo de HER3 y estabiliza el receptor en el estado inactivo. Los anticuerpos de la invención también permiten el enlace concurrente de un ligando de HER3, tal como neurregulina con el receptor HER3.

Aunque hay obligación de proporcionar una teoría, un posible modelo para el mecanismo de acción es que el HER3 típicamente existe en un estado inactivo (cerrado, atado) o activo (abierto). El enlace del ligando induce un cambio conformacional, de tal manera que HER3 existe en el estado activo (abierto), el cual es capaz de enlazarse a los componentes del heterodímero que dan como resultado la activación en la señalización corriente abajo. Los anticuerpos tales como MOR09823 se enlazan al estado inactivo (atado) del HER3 pero no bloquean el sitio de enlace del ligando. Los anticuerpos tales como MOR09823 inhiben HER3 impidiendo las reconfiguraciones estructurales inducidas por el ligando requeridas para que el H ER3 haga una transición hasta la conformación activa, impidiendo de esta manera la transducción de señales. En una modalidad, los anticuerpos de la invención o los fragmentos de los mismos se enlazan al estado inactivo (atado) del HER3 pero no bloquean el sitio de enlace del ligando. En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de los mismos inhiben HER3 impidiendo las reconfiguraciones estructurales inducidas por el ligando requeridas para que HER3 haga una transición hasta la conformación activa, impidiendo de esta manera la transducción de señales. En otra modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo estabiliza (directamente mantiene, asegura, ata, detiene, enlaza preferencialmente, o favorece) el receptor HER3 en el estado o en la conformación inactiva. En una modalidad, el receptor HER3 inactivo puede ser susceptible a la internalización preferencial o a la degradación, de tal manera que conduce a la pérdida de los receptores HER3 de superficie celular. Los datos biológicos presentados en la sección de Ejemplos apoya estas modalidades.

Los cristales de HER3 se pueden preparar mediante la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifique HER3 ó una variante del mismo en una célula huésped adecuada, y entonces se cristalizan las proteínas purificadas, en la presencia del Fab dirigido por HER3 relevante. De preferencia el polipéptido de HER3 contiene el dominio extracelular (aminoácidos 20 a 640 del polipéptido humano o una versión truncada del mismo, que comprende de preferencia los aminoácidos 20-640) pero carece de los dominios transmembrana e intracelulares.

Los polipéptidos de HER3 también se pueden producir como proteínas de fusión, por ejemplo, para ayudar en la extracción y purificación. Los ejemplos de los componentes de la proteína de fusión incluyen glutationa-S-transferasa (GST), histidina (HIS), hexahistidina (6H IS), GAL4 (dominios de enlace de ADN y/o de activación de transcripción), y beta-galactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de disociación proteolítica entre el componente de la proteína de fusión y la secuencia de la proteína de interés para permitir la remoción de las secuencias de proteínas de fusión.

Después de la expresión, las proteínas se pueden purificar y/o concentrar, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado, cromatografía de intercambio de iones, y/o filtración de gel.

Las proteínas se pueden cristalizar utilizando las téenicas descritas en la presente. Comúnmente, en un proceso de cristalización, una gota que contenga la solución de proteína se mezcla con el regulador de cristalización, y se deja equilibrarse en un recipiente sellado. La equilibración se puede lograr mediante las teenicas conocidas, tales como el método de “gota colgante” o de “gota asentada”. En estos métodos, la gota se cuelga por arriba o se asienta a un lado de un depósito mucho más grande de regulador de cristalización, y se alcanza el equilibrio a través de la difusión de vapor. De una manera alternativa, la equilibración se puede presentar mediante otros métodos, por ejemplo, bajo aceite, a través de una membrana semi-permeable, o mediante difusión sin interfase (véase, por ejemplo, Chayen y colaboradores (2008) Nature Methods 5, 147 -153).

Una vez que se han obtenido los cristales, la estructura se puede resolver mediante las técnicas de difracción de rayos-X conocidas. Muchas técnicas utilizan cristales químicamente modificados, tales como aquéllos modificados mediante derivación de átomo pesado hasta las fases aproximadas. En la práctica, un cristal se remoja en una solución que contiene sales de átomo de metal pesado, o compuestos organometálicos, por ejemplo, cloruro de plomo, tiomalato de oro, timerosal, o acetato de uranilo, que pueden difundirse a través del cristal y se enlazan a la superficie de la proteína. Las localizaciones de los átomos de metal pesado enlazados se pueden determinar entonces mediante el análisis de difracción de rayos-X del cristal remojado. Los patrones obtenidos en la difracción de un haz monocromático de rayos-X mediante los átomos (centros de dispersión) del cristal se pueden resolver mediante ecuaciones matemáticas para dar las coordenadas matemáticas. Los datos de difracción se utilizan para calcular un mapa de densidad de electrones de la unidad de repetición del cristal. Otro metodo para obtener la información de fases es empleando una téenica conocida como reemplazo molecular. En este método, se aplican algoritmos de rotación y traslación a un modelo de búsqueda derivado a partir de una estructura relacionada, lo cual da como resultado una orientación aproximada para la proteína de interés (véase Rossmann, (1990) Acta Crystals A 46, 73-82). Los mapas de densidad de electrones se utilizan para establecer las posiciones de los átomos individuales dentro de la celda unitaria del cristal (Blundel y colaboradores (1976) Protein Crystallography, Academic Press).

La presente divulgación describe por primera vez, la estructura tridimensional de HER3 y un Fab de un anticuerpo anti-HER3. Los límites de dominio aproximados del dominio extracelular de HER3 son como sigue; dominio 1 : aminoácidos 20-207; dominio 2: aminoácidos 208-328; dominio 3: aminoácidos 329-498; y dominio 4: aminoácidos 499-642. La estructura tridimensional de HER3 y el anticuerpo también permite la identificación de los sitios de enlace objetivo para los moduladores potenciales de HER3. Los sitios de enlace objetivo preferidos son aquéllos involucrados en la activación de HER3. En una modalidad, el sitio de enlace objetivo se localiza dentro del dominio 2 y el dominio 4 de HER3. Por consiguiente, un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlace a cualquiera del dominio 2 ó el dominio 4, y de preferencia a ambos dominios, puede modular la activación de HER3 ya sea evitando que los dominios se disocien unos de otros, o bien modificando las posiciones relativas de los dominios. Por consiguiente, el enlace de un anticuerpo o de un fragmento del mismo con los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 ó del dominio 4, puede hacer que la proteína adopte una conformación que impida la activación. La divulgación de la presente tambien muestra por primera vez un anticuerpo o un fragmento del mismo que se puede enlazar de una manera concurrente con un ligando de HER3, tal como neurregulina.

En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo reconocen un estado conformacional específico de HER3, de tal manera que el anticuerpo o el fragmento del mismo impide que HER3 interactúe con un co-receptor (incluyendo, pero no limitándose a, HER1 , HER2 y HER4). En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo impide que HER3 interactúe con un co-receptor mediante la estabilización del receptor HER3 en un estado inactivo o cerrado. En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo estabiliza el receptor HER3 mediante el enlace con los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 de HER3. En este estado inactivo, el ciclo de dimerización localizado dentro del dominio 2 no se expone y, por consiguiente, no está disponible para la dimerización con otros co-receptores (incluyendo, pero no limitándose a, HER1 , HER2 y HER4). En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a la proteína de HER3 humano que tiene un epítopo conformacional que comprende: (i) los residuos de aminoácidos de HER3 265-277 y 315 (del dominio 2), y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3 571 , 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de la SEQ ID NO: 1 , o un subconjunto de los mismos. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a los aminoácidos dentro de, o traslapando, los residuos de aminoácidos 265-277 y 315 (del dominio 2), y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3 571 , 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a los aminoácidos dentro de (y/o a las secuencias de aminoácidos que consisten en) los aminoácidos 265-277 y 315 (del dominio 2), y (ii) los residuos de aminoácidos de HER3 571 , 582-584, 596-597, 600-602, 609-615 (del dominio 4) de la SEQ ID NO: 1 , o un subconjunto de los mismos. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza al epítopo conformacional de tal manera que restringe la movilidad del dominio 2 y del dominio 4, estabilizándolo en una conformación inactiva o cerrada. El fracaso para formar la conformación activa da como resultado el fracaso para activar la transducción de señales. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza al epítopo conformacional de tal manera que obstruye el ciclo de dimerización dentro del dominio 2, haciendo de esta manera que no esté disponible para la interacción del receptor-receptor. El fracaso para formar los homo- o hetero-dímeros da como resultado el fracaso para activar la transducción de señales.

En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional del receptor HER, tal como un receptor HER3. En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo estabiliza el receptor HER3 en el estado inactivo. En otra modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza al estado activo del receptor HER3 y lo impulsa hasta el estado inactivo como el estado inactivo. Por consiguiente, el anticuerpo o el fragmento del mismo puede enlazarse ya sea al estado activo o bien al estado inactivo de HER3, pero favorece la formación del estado inactivo e impulsa el estado activo de HER3 hasta el estado inactivo, lo cual da como resultado un fracaso para activar la transducción de señales.

En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional del receptor HER, tal como un receptor HER3, en donde el enlace del anticuerpo o del fragmento del mismo estabiliza el receptor HER3 en un estado inactivo, de tal manera que el receptor HER3 fracasa para dimerizarse con un co-receptor para formar un complejo de receptor-receptor. El fracaso para formar un complejo de receptor-receptor impide la activación de la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando.

En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional del receptor HER, tal como un receptor HER3, en donde el enlace del anticuerpo o del fragmento del mismo al receptor HER3 permite la dimerización con un co- receptor para formar un complejo de receptor-receptor inactivo. La formación del complejo de receptor-receptor inactivo impide la activación de la transducción de señales independiente del ligando. Por ejemplo, en la transducción de señales independiente del ligando, HER3 puede existir en un estado inactivo; sin embargo, la sobre-expresión de HER2 provoca la formación del complejo de HER2-HER3; sin embargo, estos complejos resultantes son inactivos e impiden la activación de la transducción de señales independiente del ligando.

La estructura ilustrada tambien permite identificar los residuos de aminoácidos de HER3 del núcleo específicos para la interfase de interacción de un anticuerpo o de un fragmento del mismo (por ejemplo, MOR09823) con HER3. Ésta se definió como los residuos que están dentro de 5 A de la cadena VH de la proteína MOR09823. Los residuos del núcleo son como sigue: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271 , Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571 , Pro583, His584, Ala596, Lys597.

Las estructuras también se pueden utilizar para identificar los residuos de aminoácidos del límite de HER3 para la interfase de interacción con un anticuerpo o un fragmento del mismo (por ejemplo, MOR09823). Estos residuos pueden ser los residuos de HER3 que fueron de 5 a 8 A a partir de la cadena VH de la proteína MOR09823. Los residuos del límite son como sigue: Pro262, Val264, Tyr265, Phe270, Leu272, Thr278, Lys314, Gly316, Glu321 , Asn566, Ser568, Gly569, Ser570, Thr572, Arg580, Asp581 , Gly582, Gly595, G ly 598 , Ile600.

La estructura ¡lustrada tambien permite identificar los residuos de aminoácidos de HER3 del núcleo específicos para la interfase de interacción de un anticuerpo o de un fragmento del mismo (por ejemplo, MOR09823) con HER3. Ésta se definió como los residuos que están dentro de 5 A de la cadena VL de la proteína MOR09823. Los residuos del núcleo son como sigue: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611 , Pro612, Cys613, His614, Glu615.

Las estructuras también se utilizaron para identificar los residuos de aminoácidos del límite de HER3 para la interfase de interacción con un anticuerpo o un fragmento del mismo (por ejemplo, MOR09823). Estos residuos fueron los residuos de HER3 que estaban a 5-8 A a partir de la cadena VL de la proteína MOR09823. Los residuos del límite son como sigue: Asn266, Thr269, Asp571 , Arg580, Asp581 , His584, Pro590, Ala596, Pro599, Tyr601 , Tyr603, Asp605, Gln607, Cys610, Asn616, Cys617, Cys621 , Gly623, Pro624.

Como se puede ver en las Tablas 1 1 y 12 (MOR09823), y en las Tablas 13 y 14 (MOR09825), respectivamente, la cadena pesada está principalmente involucrada en el enlace de la proteína de enlace al antígeno con los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 del epítopo con menos interacciones con los residuos de aminoácidos del dominio 4, mientras que la cadena ligera está principalmente involucrada con el enlace a los residuos de aminoácidos dentro del dominio 4 del epítopo con menos interacciones con los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2.

Como tal, un experto en la materia, dadas las presentes enseñanzas, puede predecir cuáles residuos y áreas de las proteínas que se enlazan a antígeno se pueden variar sin interferir indebidamente con la capacidad de la proteína de enlace al antígeno para enlazarse al HER3.

Los aminoácidos de la interfase de interacción del núcleo se determinaron como todos los residuos de aminoácidos con cuando menos un átomo menos que, o igual a, 5 A a partir de la proteína compañera de HER3. Se seleccionó 5 A como la distancia de corte de la región del núcleo para permitir tener átomos dentro de un radio de van der Waals más un posible límite de hidrógeno mediado por agua. Los aminoácidos de la interfase de interacción del límite se determinaron como todos los residuos de aminoácidos con cuando menos un átomo menos que, o igual a, 8 A a partir de la proteína compañera de H ER3, pero no incluidos en la lista de interacción del núcleo.

En algunas modalidades, se puede emplear cualquier proteína de enlace al antígeno que se enlace a, que cubra, o que impida la interacción de MOR09823 con cualquiera de los residuos anteriores, para enlazarse a, o para neutralizar, el HER3. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se enlazan a, o interactúan con, cuando menos uno de los siguientes residuos de HER3 (SEQ ID NO: 1 ): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271 , Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571 , Pro583, His584, Ala596, Lys597. En algunas modalidades, los anticuerpos y fragmentos de los mismos se enlazan a, o interactúan con, cuando menos uno de los siguientes residuos de HER3 (SEQ ID NO: 1 ): Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, He600, Lys602, Glu609, Arg61 1 , Pro612, Cys613, His614, Glu615. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se enlazan a, o interactúan con, cuando menos uno de los siguientes residuos de HER3 (SEQ ID NO: 1 ): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271 , Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571 , Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg611 , Pro612, Cys613, His614, Glu615. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se enlazan a, o ¡nteractúan con, una combinación de los siguientes residuos de HER3 (SEQ ID NO: 1 ): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271 , Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571 , Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg61 1 , Pro612, Cys613, His614, Glu615. En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se enlazan a, o interactúan con, todos los siguientes residuos de HER3 (SEQ ID NO: 1 ): Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271 , Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571 , Pro583, His584, Ala596, Lys597, Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, Ile600, Lys602, Glu609, Arg61 1 , Pro612, Cys613, His614, Glu615. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo está dentro de 5 angstroms de uno o más de los residuos anteriores. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo está a 5 a 8 angstroms de uno o más de los residuos anteriores. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del mismo interactúa, bloquea, o está dentro de 8 angstroms de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 de los residuos anteriores.

La disponibilidad de las estructuras tridimensionales para el HER3 y el complejo de HER3:MOR09823, por ejemplo, proporciona la estructura para explorar otros anticuerpos de HER3 con mayor detalle. La estructura tridimensional de HER3 permite que se mapeen los epítopos para los anticuerpos monoclonales, y que se infiera su modo de acción, debido a que algunos inhiben, algunos estimulan, y otros no tienen efecto alguno sobre el crecimiento celular. El epítopo conformacional para MOR09823 se ha localizado en los dominios 2 y 4 de HER3. La disponibilidad de las estructuras tridimensionales de este receptor facilitará la determinación del mecanismo de acción preciso de estos agentes inhibidores, y el diseño de nuevos planteamientos para interferir con la función del receptor HER3. En una modalidad, los anticuerpos de la invención se enlazan al mismo epítopo conformacional que MOR09823.

En algunas modalidades, es especialmente útil el epítopo conformacional enlazado por cualquiera de los anticuerpos enlistados en la Tabla 1 . En ciertas modalidades, se puede utilizar un epítopo conformacional de HER3 para aislar los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlacen al HER3. En ciertas modalidades, se puede utilizar un epítopo conformacional de HER3 para generar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlacen al HER3. En ciertas modalidades, se puede utilizar un epítopo conformacional de HER3 como un inmunógeno para generar los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlacen al epítopo conformacional de HER3. En ciertas modalidades, se puede administrar un epítopo conformacional de H ER3 a un animal, y subsiguientemente se pueden obtener los anticuerpos que se enlacen al HER3 a partir del animal.

En algunas modalidades, los dominios/regiones que contengan residuos que esten en contacto con, o que sean enterrados por, un anticuerpo, se pueden identificar mediante la mutación de residuos específicos en HER3 (por ejemplo, un antígeno de tipo silvestre), y mediante la determinación de si el anticuerpo o el fragmento del mismo puede enlazarse a la proteína mutada o variante de HER3, o mediante la medición de los cambios de afinidad desde el tipo silvestre. Haciendo un número de mutaciones individuales, se pueden identificar los residuos que tengan una función directa en el enlace, o que estén en una proximidad suficientemente cercana al anticuerpo, de tal manera que una mutación pueda afectar el enlace entre el anticuerpo y el antígeno. A partir de un conocimiento de estos aminoácidos, se pueden elucidar los dominios o las regiones del antígeno (HER3) que contengan residuos en contacto con el anticuerpo, o que estén cubiertos por el anticuerpo. La mutagénesis empleando las téenicas conocidas, tales como la exploración de alanina, puede ayudar a definir los epítopos funcionalmente relevantes. También se puede emplear la mutagénesis utilizando un protocolo de exploración de arginina/ácido glutámico (véase, por ejemplo, Nanevicz y colaboradores (1995), J. Biol. Chem . 270(37): 21619-21625 y Zupnick y colaboradores (2006), J . Biol. Chem. 281 (29): 20464-20473). En general, se utilizan arginina y ácidos glutámicos para sustituir (típicamente de una manera individual) un aminoácido en el polipéptido de tipo silvestre, debido a que estos aminoácidos están cargados y son voluminosos y, por consiguiente, tienen el potencial para interrumpir el enlace entre una proteína de enlace al antígeno y un antígeno en la región del antígeno en donde se introduce la mutación. Las argininas que existen en el antígeno de tipo silvestre son reemplazadas con ácido glutámico. Se puede obtener una variedad de estos mutantes individuales, y se pueden analizar los resultados de enlace recolectados, para determinar cuáles residuos afectan el enlace. Se puede crear una serie de antígenos de HER3 mutantes, teniendo cada antígeno mutante una sola mutación. El enlace de cada antígeno de HER3 mutante con diferentes anticuerpos o fragmentos de los mismos de HER3, se puede medir y comparar con la capacidad de del anticuerpo seleccionado o de los fragmentos del mismo para enlazarse con el HER3 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1 ).

Una alteración (por ejemplo, una reducción o un aumento) en el enlace entre un anticuerpo o un fragmento del mismo y un HER3 mutante o variante, como se utiliza en la presente, significa que hay un cambio en la afinidad de enlace (por ejemplo, como se mide mediante los métodos conocidos, tales como la prueba Biacore, o el ensayo basado en gránulos descrito más adelante en los Ejemplos), en la EC50, y/o un cambio (por ejemplo, una reducción) en la capacidad de enlace total de la proteína de enlace al antígeno (por ejemplo, como es evidenciado por una disminución en Bmax en una gráfica de concentración de la proteína de enlace al antígeno contra la concentración del antígeno). Una alteración significativa en el enlace indica que el residuo mutado está involucrado en el enlace al anticuerpo o al fragmento del mismo.

En algunas modalidades, una reducción significativa en el enlace significa que la afinidad de enlace, la EC50, y/o la capacidad entre un anticuerpo o los fragmentos del mismo y un antígeno de HER3 mutante, se reduce por más del 10 por ciento, por más del 20 por ciento, por más del 40 por ciento, por más del 50 por ciento, por más del 55 por ciento, por más del 60 por ciento, por más del 65 por ciento, por más del 70 por ciento, por más del 75 por ciento, por más del 80 por ciento, por más del 85 por ciento, por más del 90 por ciento o por más del 95 por ciento en relación con el enlace entre el anticuerpo o un fragmento del mismo y un HER3 de tipo silvestre (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ).

En algunas modalidades, el enlace de un anticuerpo o fragmentos del mismo se reduce o se incrementa significativamente para una proteína muíante de HER3 que tenga una o más (por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) mutaciones, comparándose con una proteína de tipo silvestre de HER3 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ).

Aunque las formas variantes son referenciadas con respecto a la secuencia de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 , se apreciará que en las variantes alélicas o de empalme de HER3 los aminoácidos podrían ser diferentes. También se contemplan los anticuerpos o fragmentos de los mismos que muestren un enlace significativamente alterado (por ejemplo, un enlace más bajo o más alto) para esas formas alélicas de HER3.

En adición a los aspectos estructurales generales de los anticuerpos, se puede examinar la interacción más específica entre el parátopo y el epítopo a través de planteamientos estructurales. En una modalidad, la estructura de las regiones determinantes de complementariedad contribuye a un parátopo, a través del cual un anticuerpo es capaz de enlazarse a un epítopo. La forma de este parátopo se puede determinar en un número de formas. Se pueden emplear planteamientos tradicionales de examinación estructural, tales como RMN o cristalografía de rayos-X. Estos planteamientos pueden examinar la forma del parátopo solo, o mientras se enlaza al epítopo. De una manera alternativa, se pueden generar modelos moleculares ¡n silico. Se puede generar una estructura a través de la modelación de homología, auxiliada con un paquete comercial, tal como el paquete de modelación Insightll de Accelrys (San Diego, Calif.). Dicho de una manera breve, se puede utilizar la secuencia del anticuerpo que se vaya a examinar, para hacer una búsqueda contra una base de datos de las proteínas de estructuras conocidas, tales como el Banco de Datos de Proteínas. Después de identificar las proteínas homologas con estructuras conocidas, se utilizan estas proteínas homólogas como las plantillas de la modelación. Cada una de las posibles plantillas se puede alinear, por consiguiente, produciendo alineaciones de secuencias basadas en la estructura entre las plantillas. La secuencia del anticuerpo con la estructura desconocida se puede alinear entonces con estas plantillas para generar un modelo molecular para el anticuerpo con la estructura desconocida. Como será apreciado por un experto en la materia, existen muchos métodos alternativos para generar estas estructuras in silico, cualquiera de los cuales se puede utilizar. Por ejemplo, se puede emplear un proceso similar al descrito en Hardman y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Expedida Número 5,958,708 que emplea QUANTA (Poligen Corp., Waltham, Mass.), y CHARM (Brooks y colaboradores (1983), J. Comp. Chem. 4: 187) (incorporados a la presente en su totalidad como referencia).

No solamente la forma del parátopo es importante en la determinación de si y qué tan bien se enlazará un posible parátopo a un epítopo, pero la interacción misma entre el epítopo y el parátopo es una fuente de gran información en el diseño de los anticuerpos variantes. Como es apreciado por un experto en la materia, existe una variedad de formas en las que se puede estudiar esta interacción. Una manera es utilizar el modelo estructural generado, tal vez como se describe anteriormente, y entonces utilizar un programa, tal como Insightll (Accelrys, San Diego, Calif.), el cual tiene un módulo de atraque, el cual, entre otras cosas, es capaz de llevar a cabo una búsqueda Monte Cario sobre los espacios conformacionales y de orientación entre el parátopo y su epítopo. El resultado es que se puede estimar en dónde y la manera en que el epítopo interactúa con el parátopo. En una modalidad, solamente se utiliza un fragmento o una variante del epítopo para asistir en la determinación de las interacciones relevantes. En una modalidad, se utiliza el epítopo entero en la modelación de la interacción entre el parátopo y el epítopo.

A través del uso de estas estructuras modeladas, se puede predecir cuáles residuos son los más importantes en la interacción entre el epítopo y el parátopo. Por consiguiente, en una modalidad, se puede seleccionar fácilmente cuáles residuos cambiar con el objeto de alterar las características de enlace del anticuerpo. Por ejemplo, puede ser evidente, a partir de los modelos de atraque, que las cadenas laterales de ciertos residuos en el parátopo pueden impedir estéricamente el enlace del epítopo, y por consiguiente, puede ser benéfico alterar estos residuos hasta tener residuos con cadenas laterales más pequeñas. Se puede determinar esto de muchas formas. Por ejemplo, se puede simplemente mirar los dos modelos y estimar las interacciones basándose en los grupos funcionales y en la proximidad. De una manera alternativa, se pueden llevar a cabo emparejamientos repetidos de epítopo y parátopo, como se describe anteriormente, con el objeto de obtener interacciones de energía más favorables. Tambien se pueden determinar estas interacciones para una variedad de variantes del anticuerpo con el fin de determinar formas alternativas en donde el anticuerpo se pueda enlazar al epítopo. También se pueden combinar los diferentes modelos para determinar la manera en que se debería alterar la estructura de los anticuerpos con el objeto de obtener un anticuerpo con las características particulares que se deseen.

Los modelos determinados anteriormente se pueden probar a través de diferentes téenicas. Por ejemplo, la energía de interacción se puede determinar con los programas discutidos anteriormente con el objeto de determinar cuáles de las variantes se examinará adicionalmente. También, se utilizan las interacciones coulúmbicas y de van der Waals para determinar las energías de interacción del epítopo y los parátopos variantes. También se utiliza la mutagénesis dirigida al sitio para ver si los cambios predichos en la estructura del anticuerpo realmente dan como resultado los cambios deseados en las características de enlace. De una manera alternativa, se pueden hacer cambios al epítopo con el fin de verificar que los modelos son correctos o para determinar los temas generales de enlace que puedan presentarse entre el parátopo y el epítopo.

Como será apreciado por un experto en la materia, aunque estos modelos proporcionarán la guía necesaria para hacer los anticuerpos y las variantes de los mismos de las presentes modalidades, todavía puede ser deseable llevar a cabo las pruebas de rutina de los modelos in silico, tal vez a traves de estudios in vitro. En adición, como será evidente para un experto en la materia, cualquier modificación también puede tener efectos secundarios adicionales sobre la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, aunque cualquier alteración predicha por dar como resultado un mayor enlace, puede inducir un mayor enlace, también puede provocar otros cambios estructurales que podrían reducir o alterar la actividad del anticuerpo. La determinación de si éste es el caso o no, es rutinaria en la materia y se puede lograr de muchas maneras. Por ejemplo, la actividad se puede probar a través de una prueba ELISA. De una manera alternativa, las muestras se pueden probar a través del uso de un aparato de resonancia de plasmón superficial. Anticuerpos de HER3 La presente invención proporciona anticuerpos que reconocen un epítopo conformacional de HER3. La invención se basa en el hallazgo sorprendente de que una clase de anticuerpos contra HER3, bloquean las sendas de transducción de señales de HER3 tanto dependiente del ligando como independiente del ligando en la Tabla 1 se da a conocer una clase de anticuerpos que se enlazan al epítopo de conformación particular de HER3. En una modalidad, los anticuerpos inhiben la señalización de HER3 tanto dependiente del ligando como independiente del ligando. En otra modalidad, los anticuerpos se enlazan a HER3 y no bloquean el enlace del ligando de HER al sitio de enlace de ligando (es decir, tanto el ligando como el anticuerpo pueden enlazarse a HER3 de una manera concurrente).

La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con la proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), comprendiendo estos anticuerpos un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 15, 33, 51 , 69, 87, 105, 123, 141 , 159, 177, 195, 213, 231 , 249, 267, 285, 303, 321 , 339, 357, y 375. La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con la proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), comprendiendo estos anticuerpos un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, y 374. La presente invención tambien proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con la proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), comprendiendo estos anticuerpos una VH CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VH CDRs enlistadas en la Tabla 1 más adelante. En particular, la invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente a la proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), comprendiendo estos anticuerpos (o de una manera alternativa, consistiendo en) una, dos, tres, cuatro, cinco o más VH CDRs que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VH CDRs enlistadas en la Tabla 1 más adelante.

Otros anticuerpos de la invención incluyen aminoácidos que se han mutado, y no obstante tienen cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, o 98 por ciento de identidad en las regiones CDR con las regiones CDR ilustradas en las secuencias descritas en la Tabla 1 . En algunas modalidades, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en donde no más de 1 , 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos han sido mutados en las regiones CDR, cuando se comparan con las regiones CDR ilustradas en la secuencia descrita en la Tabla 1 , mientras que todavía mantienen su especificidad por el epítopo del anticuerpo original.

Otros anticuerpos de la invención incluyen aminoácidos que se han mutado, y no obstante tienen cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, o 98 por ciento de identidad en las regiones de estructura con las regiones de estructura ilustradas en las secuencias descritas en la Tabla 1. En algunas modalidades, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en donde no más de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, o 7 aminoácidos se han mutado en las regiones de estructura, cuando se comparan con las regiones de estructura ilustradas en la secuencia descrita en la Tabla 1 , mientras que todavía mantienen su especificidad por el epítopo del anticuerpo original. La presente invención también proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH , VL, la cadena pesada de longitud completa, y la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos que se enlazan específicamente a la proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo).

Los anticuerpos de HER3 de la invención se enlazan al epítopo conformacional de HER3, el cual comprende los residuos de aminoácidos a partir del dominio 2 y del dominio 4 de HER3.

Tabla 1 Ejemplos de Anticuerpos HER3 de la Presente Invención Otros anticuerpos de la invención incluyen aquellos en donde los aminoácidos o ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos se han mutado, y no obstante, tienen cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, y 99 por ciento de identidad con las secuencias descritas en la Tabla 1 . En algunas modalidades, incluyen secuencias de aminoácidos mutantes, en donde se han mutado no más de 1 , 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos en las regiones variables cuando se comparan con las regiones variables ilustradas en la secuencia descrita en la Tabla 1 , mientras que conservan sustancialmente la misma actividad terapéutica.

Debido a que cada uno de estos anticuerpos o fragmentos de los mismos puede enlazarse a HER3, las secuencias VH , VL, de cadena ligera de longitud completa, y de cadena pesada de longitud completa (las secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) se pueden "mezclar y emparejar" para crear otros anticuerpos de enlace con HER3 de la invención. Estos anticuerpos de enlace con HER3 "mezclados y emparejados" se pueden probar utilizando los ensayos de enlace conocidos en la materia (por ejemplo, ELISAs, y otros ensayos descritos en la sección de Ejemplos). Cuando estas cadenas se mezclan y se emparejan, una secuencia VH a partir de un emparejamiento de VH/VL particular debe ser reemplazada con una secuencia VH estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia de cadena pesada de longitud com pleta a partir de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud completa / cadena ligera de longitud completa, debe ser reemplazada con una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia VL a partir de un emparejamiento de VH/VL particular debe ser reemplazada con una secuencia VL estructuralmente similar. De la misma manera, una secuencia de cadena ligera de longitud completa a partir de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud completa / cadena ligera de longitud completa debe ser reemplazada con una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar. De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento del mismo, que tiene: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 33, 51 , 69, 87, 105, 123, 141 , 159, 177, 195, 213, 231 , 249, 267, 285, 303, 321 , 339, 357, y 375; y una región variable de cadena ligera, la cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, y 374; en donde el anticuerpo se enlaza específicamente al HER3 (por ejemplo, humano y/o de cinomolgo).

En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos de enlace con HER3 que comprenden las cadenas pesadas y las cadenas ligeras CDR1 s, CDR2s y CDR3s como se describe en la Tabla 1 , o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las VH CDR1s de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368. Las secuencias de aminoácidos de las VH CDR2s de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 3, 9, 21, 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81, 93, 99, 111, 117, 129, 135, 147, 153, 165, 171, 183, 189, 201, 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261, 273, 279, 291, 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351, 363, y 369. Las secuencias de aminoácidos de las VH CDR3s de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 112, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370. Las secuencias de aminoácidos de las VL CDR1s de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 5, 11, 23, 29, 41, 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101, 113, 119, 131, 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191, 203, 209, 221, 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281, 293, 299, 311, 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371. Las secuencias de aminoácidos de las VL CDR2s de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 114, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372. Las secuencias de aminoácidos de las VL CDR3s de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31, 43, 49, 61, 67, 79, 85, 97, 103, 115, 121, 133, 139, 151, 157, 169, 175, 187, 193, 205, 21 1 , 223, 229, 241 , 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301 , 313, 319, 331 , 337, 349, 355, 367, y 373. Las regiones CDR se delinean utilizando el sistema Kabat (Kabat y colaboradores (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Qumta Edición, U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos), N 1H Publicación No. 91 -3242; Chotia y colaboradores (1987) J. Mol. Biol. 196:901 -917; Chotia y colaboradores (1989) Nature 342: 877-883; y Al-Lazikani y colaboradores (1997) J. Mol. Biol. 273, 927-948).

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 2; una CDR2 de la SEQ ID NO: 3; una CDR3 de la SEQ ID NO: 4; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 5; una CDR2 de la SEQ ID NO: 6; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 7.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 20; una CDR2 de la SEQ ID NO: 21 ; una CDR3 de la SEQ ID NO: 22; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 23; una CDR2 de la SEQ ID NO: 24; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 25.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 38; una CDR2 de la SEQ ID NO: 39; una CDR3 de la SEQ ID NO: 40; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 41 ; una CDR2 de la SEQ ID NO: 42; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 43.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 56; una CDR2 de la SEQ ID NO: 57; una CDR3 de la SEQ ID NO: 58; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 59; una CDR2 de la SEQ ID NO: 60; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 61.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 74; una CDR2 de la SEQ ID NO: 75; una CDR3 de la SEQ ID NO: 76; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 77; una CDR2 de la SEQ ID NO: 78; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 79.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 92; una CDR2 de la SEQ ID NO: 93; una CDR3 de la SEQ ID NO: 94; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 95; una CDR2 de la SEQ ID NO: 96; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 97.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 1 10; una CDR2 de la SEQ ID NO: 1 1 1 ; una CDR3 de la SEQ ID NO: 1 12; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 1 13; una CDR2 de la SEQ ID NO: 1 14; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 1 15.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 128; una CDR2 de la SEQ ID NO: 129; una CDR3 de la SEQ ID NO: 130; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 131 ; una CDR2 de la SEQ ID NO: 132; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 133.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 146; una CDR2 de la SEQ ID NO: 147; una CDR3 de la SEQ ID NO: 148; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 149; una CDR2 de la SEQ ID NO: 150; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 151 .

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 164; una CDR2 de la SEQ ID NO: 165; una CDR3 de la SEQ ID NO: 166; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 167; una CDR2 de la SEQ ID NO: 168; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 169.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 182; una CDR2 de la SEQ ID NO: 183; una CDR3 de la SEQ ID NO: 184; una región variable de cadena ligera CDR 1 de la SEQ ID NO: 185; una CDR2 de la SEQ ID NO: 186; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 187.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 200; una CDR2 de la SEQ ID NO: 201 ; una CDR3 de la SEQ ID NO: 202; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 203; una CDR2 de la SEQ ID NO: 204; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 205.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 218; una CDR2 de la SEQ ID NO: 219; una CDR3 de la SEQ ID NO: 220; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 221 ; una CDR2 de la SEQ ID NO: 222; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 223.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 236; una CDR2 de la SEQ ID NO: 237; una CDR3 de la SEQ ID NO: 238; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 239; una CDR2 de la SEQ ID NO: 240; y a CDR3 de la SEQ ID NO: 241 .

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 254; una CDR2 de la SEQ ID NO: 255; una CDR3 de la SEQ ID NO: 256; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 257; una CDR2 de la SEQ ID NO: 258; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 259.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 272; una CDR2 de la SEQ ID NO: 273; una CDR3 de la SEQ ID NO: 274; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO; 275; una CDR2 de la SEQ ID NO: 276; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 277.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 290; una CDR2 de la SEQ ID NO: 291 ; una CDR3 de la SEQ ID NO: 292; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 293; una CDR2 de la SEQ ID NO: 294; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 295.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 308; una CDR2 de la SEQ ID NO: 309; una CDR3 de la SEQ ID NO: 310; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 31 1 ; una CDR2 de la SEQ ID NO: 312; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 313.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 326; una CDR2 de la SEQ ID NO: 327; una CDR3 de la SEQ ID NO: 328; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 329; una CDR2 de la SEQ ID NO: 330; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 331 .

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 344; una CDR2 de la SEQ ID NO: 345; una CDR3 de la SEQ ID NO: 346; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 347; una CDR2 de la SEQ ID NO: 348; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 349.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una región variable de cadena pesada CDR1 de la SEQ ID NO: 362; una CDR2 de la SEQ ID NO: 363; una CDR3 de la SEQ ID NO: 364; una región variable de cadena ligera CDR1 de la SEQ ID NO: 365; una CDR2 de la SEQ ID NO: 366; y una CDR3 de la SEQ ID NO: 367.

En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO. 15 y una VL de la SEQ ID NO: 14. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 33 y una VL de la SEQ ID NO: 32. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 51 y una VL de la SEQ ID NO: 50. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 69 y una VL de la SEQ ID NO: 68. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 87 y una VL de la SEQ I D NO: 86. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 105 y una VL de la SEQ ID NO: 104. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 123 y una VL de la SEQ ID NO: 122. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 141 y una VL de la SEQ ID NO: 140. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 159 y una VL de la SEQ ID NO: 158. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 177 y una VL de la SEQ ID NO: 176. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 195 y una VL de la SEQ ID NO: 194. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a H ER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 213 y una VL de la SEQ ID NO: 212. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 231 y una VL de la SEQ ID NO: 230. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 249 y una VL de la SEQ ID NO: 248. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 267 y una VL de la SEQ ID NO: 266. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 285 y una VL de la SEQ ID NO: 284. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 303 y una VL de la SEQ ID NO: 302. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 321 y una VL de la SEQ ID NO: 320. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 339 y una VL de la SEQ ID NO: 338. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 357 y una VL de la SEQ ID NO: 356. En una modalidad específica, un anticuerpo que se enlaza a HER3 comprende una VH de la SEQ ID NO: 375 y una VL de la SEQ ID NO: 374. En una modalidad, los anticuerpos de H ER3 son anticuerpos antagonistas. En ciertas modalidades, un anticuerpo que se enlaza a HER3 es un anticuerpo que se describe en la Tabla 1 .

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera o cadenas pesada o ligera de longitud completa que son "el producto de" o "derivados de" una secuencia de la línea germinal particular si las regiones variables o las cadenas del anticuerpo de longitud completa se obtienen a partir de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los sistemas incluyen inmunizar a un ratón transgénico que lleva genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o rastrear una librería de genes e inmunoglobulina humana exhibida en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana se puede identificar como tal, comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la linea germinal humana, y seleccionando las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana que estén más cercanas en su secuencia (es decir, el mayor porcentaje de identidad) con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos comparándose con la secuencia de la línea germinal, debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas que se presentan naturalmente o la introducción intencional de mutaciones dirigidas al sitio. Sin embargo, en las regiones de estructura VH o VL, un anticuerpo humano típicamente seleccionado es cuando menos el 90 por ciento identico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de aminoácidos de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal de murino). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser cuando menos el 60 por ciento, el 70 por ciento, el 80 por ciento, el 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento, o incluso cuando menos el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano recombinante exhibirá no más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en las regiones de estructura VH o VL. En ciertos casos, el anticuerpo humano podría exhibir no más de 5, o aún no más de 4, 3, 2, ó 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. En la tabla 2 se muestran diferentes versiones de la línea germinal utilizando las secuencias VH y VL de la línea germinal para un número representativo de anticuerpos de HER3, utilizando la numeración de Kabat. Las posiciones de CDR se resaltan en negrillas. La anotación utilizada en las Tablas con las secuencias de la línea germinal es como sigue: MOR10701 -VH_3-07 significa ciclos de MOR10701 CDR en las regiones de estructura de la secuencia de la línea germinal VH 3-07 (la nomenclatura es de acuerdo con Vbase), MOR10703-VK_L1 significa CDR a partir de MOR10703 en las regiones de la línea germinal de estructura a partir de VK_L1 , en donde VK es la cadena ligera kappa.

Tabla 2 Versiones de la línea germinal diferentes de un número seleccionado de anticuerpos representativos Tabla 3 Segmentos JH Tabla 4 Segmentos JK Se puede utilizar cualquier combinación de las secuencias de la línea germinal VH con segmentos JH. Los ejemplos representativos de las combinaciones se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Ejemplos representativos de las combinaciones de las secuencias de la línea germinal VH con segmentos JH Se puede utilizar cualquier combinación de las secuencias de la línea germinal VL con segmentos JK. Los ejemplos representativos de las combinaciones se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Ejemplos representativos de las combinaciones de las secuencias de la línea germinal VL con segmentos JK Una vez que la VH se ha combinado con JH y la VK con JK, entonces se puede utilizar cualquier combinación de VH o JH con VK ?0 o JK. En una modalidad, cualquiera de las regiones de la línea germinal VH se puede combinar con cualquiera de las regiones de la línea germinal VK (VL) para cada anticuerpo. Un número representativo de los ejemplos de combinaciones se muestra en la Tabla 7. 15 Tabla 7 Ejemplos representativos de las combinaciones de las secuencias de la línea germinal En una modalidad, la invención pertenece a una región variable de cadena pesada, la cual comprende una secuencia de Xaa^ HCDR1 -Xaa2-HCDR2-Xaa3-HCDR3-Xaa4 en donde las cadenas pesadas de HCDR1 , HCDR2, HCDR3 son cualesquiera regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada seleccionadas a partir de las Tablas 1 y 2. Para propósitos ilustrativos solamente, la secuencia puede ser: Xaa! - SYAMS - Xaa2 - AI SQGKSTYYADSVKG - Xaa3 WGDEGFDI - Xaa4 (SEQ ID NO: 493), en donde, Xaa1 es la región de estructura de cualesquiera 30 aminoácidos; Xaa2 es la región de estructura de cualesquiera 14 aminoácidos; Xaa3 es la región de estructura de cualesquiera 32 aminoácidos; Xaa4 es la región de estructura de cualesquiera 11 aminoácidos.

En una modalidad, la invención pertenece a una región variable de cadena ligera, la cual comprende una secuencia de Xaa!-LCDRI -Xaa2-LCDR2-Xaa3-LCDR3-Xaa , en donde las cadenas ligeras de LCDR1 , LCDR2, LCDR3 son cualesquiera regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena ligera seleccionadas a partir de las Tablas 1 y 2. Para propósitos ilustrativos solamente, la secuencia puede ser: Xaa! - RASQGISNWLA - Xaa2 - GASSLQS - Xaa3 - QQYSSFPTT - Xaa4 (SEQ ID NO: 494), en donde, Xaai es una región de estructura de cualesquiera 23 aminoácidos; Xaa2 es una región de estructura de cualesquiera 15 aminoácidos; Xaa3 es una región de estructura de cualesquiera 32 aminoácidos; y Xaa4 es una región de estructura de cualesquiera 10 aminoácidos.

Los anticuerpos que se dan a conocer en la presente pueden ser derivados de anticuerpos de una sola cadena, diacuerpos, anticuerpos de dominio, nanocuerpos, y unicuerpos. Un "anticuerpo de una sola cadena" (scFv) consiste en una sola cadena de polipeptido que comprende un dominio VL enlazado a un dominio VH, en donde el dominio VL y el dominio VH se emparejan para formar una molécula monovalente. El anticuerpo de una sola cadena se puede preparar de acuerdo con el método conocido en la materia (véase, por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242: 423-426, y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883). Un “disbud” consiste en dos cadenas, comprendiendo cada cadena una región variable de cadena pesada conectada con una región variable de cadena ligera sobre la misma cadena del polipéptido, conectadas mediante un enlazador peptídico corto, en donde las dos regiones sobre la misma cadena no se emparejan una con la otra, sino con los dominios complementarios sobre la otra cadena, para formar una molécula biespecífica. Los métodos para la preparación de diacuerpos se conocen en la téenica (véanse, por ejemplo, Holliger y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6444-6448, y Poljak y colaboradores (1994) Structure 2: 1 121 -1123). Los anticuerpos de dominio (dAbs) son pequeñas unidades de anticuerpos de enlace funcional, correspondientes a las regiones variables de cualquiera de las cadenas pesada o ligera de los anticuerpos. Los anticuerpos de dominio se expresan bien en sistemas bacterianos, de levadura, y de celulas de mamíferos. Otros detalles de los anticuerpos de dominio y de los métodos de producción de los mismos se conocen en la téenica (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,291 , 158; 6,582,915; 6,593,081 ; 6, 172, 197; 6,696,245; las Patentes Europeas Números 0368684 y 0616640; y las Publicaciones Internacionales Números WO05/035572, W004/101790, WO04/ 081026, W004/058821 , W004/003019 y W003/002609. Los nanocuerpos se derivan a partir de las cadenas pesadas de un anticuerpo. Un nanocuerpo típicamente comprende un solo dominio variable y dos dominios constantes (CH2 y CH3), y conserva la capacidad de enlace al antígeno del anticuerpo original. Los nanocuerpos se pueden preparar mediante los métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,765,087, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,838,254, y la Publicación Internacional Número WO 06/079372). Los unicuerpos consisten en una cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo de lgG4. Los unicuerpos se pueden hacer mediante la remoción de la región de articulación de los anticuerpos de lgG4. Otros detalles de los unicuerpos y de los métodos para la preparación de los mismos, se pueden encontrar en la Publicación Internacional Número W02007/ 059782.

Anticuerpos homólogos En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo, el cual comprende las secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias descritas en la Tabla 1 , y el anticuerpo se enlaza a una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humana y/o de cinomolgo), y conserva las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 .

Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado (o un fragmento funcional del mismo), el cual comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento identica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 15, 33, 51 , 69, 87, 105, 123, 141 , 159, 177, 195, 213, 231 , 249, 267, 285, 303, 321 , 339, 357, y 375; la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es cuando menos el 80 por ciento, cuando menos el 90 por ciento, o cuando menos el 95 por ciento idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 14, 32, 50, 68, 86, 104, 122, 140, 158, 176, 194, 212, 230, 248, 266, 284, 302, 320, 338, 356, y 374; el anticuerpo se enlaza a HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), y neutraliza la actividad de señalización de HER3, la cual se puede medir en un ensayo de fosforilación u otra medida de señalización de HER (por ejemplo, ensayos de fosfo-HER3, ensayos de fosfo-Akt, proliferación celular, y ensayos que bloquean el ligando como se describe en los Ejemplos). Tambien se incluyen dentro del alcance de la invención las secuencias de nucleótidos progenitoras de cadena pesada y ligera variables; y las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa optimizadas para la expresión en una célula de mamífero. Otros anticuerpos de la invención incluyen aminoácidos o ácidos nucleicos que han mutado, y todavía tienen cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, o 98 por ciento de identidad con las secuencias descritas anteriormente. En algunas modalidades, se incluyen secuencias de aminoácidos mutantes en donde no más de 1 , 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos han mutado por supresión, inserción o sustitución de aminoácidos en las regiones variables, cuando se comparan con las regiones variables mostradas en las secuencias descritas anteriormente.

En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento idénticas a las secuencias estipuladas en la Tabla 1. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL pueden ser idénticas excepto por una sustitución de aminoácido en no más de 1 , 2, 3, 4, ó 5 posiciones de aminoácidos.

Un anticuerpo que tiene las regiones VH y VL que tienen identidad alta (es decir, 80 por ciento o mayor) con las regiones VH y VL de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 , se puede obtener mediante mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), seguida por la prueba del segundo anticuerpo alterado codificado para la función conservada utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.

En otras modalidades, las regiones variables de las secuencias de nucleótidos de cadena pesada y/o cadena ligera pueden ser 60 por ciento, 70 por ciento, 80 por ciento, 90 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento idénticas a las secuencias estipuladas anteriormente.

Como se utiliza en la presente, el “porcentaje de identidad” entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el porcentaje de identidad es igual al número de posiciones idénticas / el número total de posiciones x 100), tomando en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesite introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, se pueden llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático, como se describe en el los ejemplos no limitantes más adelante.

Adicionalmente o de una manera alternativa, las secuencias de proteína de la presente invención se pueden utilizar adicionalmente como una “secuencia pedida” para llevar a cabo una búsqueda contra las bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Por ejemplo, estas búsquedas se pueden llevar a cabo utilizando el programa BLAST (versión 2.0) de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10.

Anticuerpos con modificaciones conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención tiene una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1 , CDR2, y CDR3, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1 , CDR2, y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) tienen las secuencias de aminoácidos especificadas basándose en los anticuerpos descritos en la presente o en modificaciones conservadoras de los mismos, y en donde los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos que se enlazan al HER3 de la invención.

De conformidad con lo anterior, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado de HER3, o un fragmento del mismo, que consiste en una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1 , CDR2, y CDR3, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1 , CDR2, y CDR3, en donde: las secuencias de aminoácidos de la CDR1 de la región variable de cadena pesada se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 1 10, 1 16, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de región variable CDR2 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 9, 21 , 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81 , 93, 99, 1 1 1 , 1 17, 129, 135, 147, 153, 165, 171 , 183, 189, 201 , 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261 , 273, 279, 291 , 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351 , 363, y 369 y modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de región variable CDR3 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 1 12, 118, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370 y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de región variable CDR1 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 1 1 , 23, 29, 41 , 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101 , 1 13, 1 19, 131 , 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191 , 203, 209, 221 , 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281 , 293, 299, 31 1 , 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371 y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de región variable CDR2 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 1 14, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372, y las modificaciones conservadoras de las mismas; las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de región variable CDR3 se seleccionan a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31 , 43, 49, 61 , 67, 79, 85, 97, 103, 1 15, 121 , 133, 139, 151 , 157, 169, 175, 187, 193, 205, 21 1 , 223, 229, 241 , 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301 , 313, 319, 331 , 337, 349, 355, 367, y 373, y las modificaciones conservadoras de las mismas; el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza específicamente a HER3, y neutraliza la actividad de HER3 mediante la inhibición de una senda de señalización de HER, la cual se puede medir en un ensayo de fosforilación u otra medida de señalización de HER (por ejemplo, ensayos de fosfo-HER3, ensayos de fosfo-Akt, proliferación celular, ensayos que bloquean el ligando como se describen en los Ejemplos).

Anticuerpos que se enlazan al mismo epítopo La presente invención proporciona anticuerpos que interactúan con (por ejemplo, mediante enlace, impedimento esterico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) con el mismo epítopo que los anticuerpos que se enlazan al HER3 descritos en la Tabla 1 y en la Figura 7. Por consiguiente, se pueden identificar anticuerpos adicionales basándose en su capacidad para competir cruzadamente (por ejemplo, para inhibir de una manera competitiva el enlace, de una manera estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención en los ensayos de enlace de HER3. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir el enlace de los anticuerpos de la presente invención con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo) demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con ese anticuerpo para enlazarse a H ER3; este anticuerpo, de acuerdo con una teoría no limitante, se puede enlazar al mismo epítopo o a un epítopo relacionado (por ejemplo, a un epítopo estructuralmente similar o espacialmente proximal) sobre la proteína de HER3 que el anticuerpo con el que compite. En una cierta modalidad, el anticuerpo que se enlaza al mismo epítopo sobre la proteína relacionada con HER3 que los anticuerpos de la presente invención, es un anticuerpo monoclonal humano. Estos anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar como se describe en la presente.

En una modalidad, el anticuerpo o los fragmentos del mismo se enlaza al dominio 2 y al dominio 4 de HER3 para mantener el HER3 en una conformación inactiva que impida la exposición de un ciclo de dimerización presente dentro del dominio 2. Esto impide la heterodimerización con otros miembros de la familia, tales como HER1 , HER2, y HER4. Los fragmentos de anticuerpos de los mismos inhiben la transducción de señales dependiente del ligando e independiente del ligando de HER3.

En otra modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza al dominio 2 y al dominio 4 de HER3 y sin bloqueo del enlace concurrente de un ligando de HER3 tal como neurregulina. Mientras no se requiera proporcionar una teoría, es factible que el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlace con el dominio 2 y el dominio 4 de HER3, manteniendo el HER3 en una conformación inactiva sin bloquear el sitio de enlace de ligando en HER3. Por consiguiente, un ligando de HER3 (por ejemplo, neurregulina) es capaz de enlazarse a HER3 al mismo tiempo que el anticuerpo o el fragmento del mismo.

Los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos inhiben los ligandos dependientes e independientes de la activación de HER3 sin impedir el enlace del ligando. Esto se considera ventajoso por las siguientes razones: (i) El anticuerpo terapéutico tendría utilidad clínica en un amplio espectro de tumores que un anticuerpo cuyo objetivo sea un solo mecanismo de la activación de H ER3 (es decir, dependiente del ligando o independiente del ligando), debido a que se manejan distintos tipos de tumores por cada mecanismo. (ii) El anticuerpo terapéutico sería eficaz en tipos de tumores en donde se involucren simultáneamente los mecanismos de la activación de HER3. Un anticuerpo que focaliza un solo mecanismo de la activación de HER3 (es decir, dependiente del ligando o independiente del ligando) podría exhibir poca o ninguna eficacia en este tipo de tumores. (iii) La eficacia de un anticuerpo que inhiba la activación dependiente del ligando de HER3 sin impedir el enlace del ligando podría ser menos probable que afectara adversamente mediante el aumento de las concentraciones del ligando. Esto podría traducirse a cualquiera de una eficacia incrementada en un tipo de tumor manejado por concentraciones muy altas del ligando de HER3, o bien una resistencia reducida al riesgo del fármaco, en donde la resistencia es mediada por la sobre-regulación de los ligandos de HER3. (iv) Un anticuerpo que inhiba la activación de HER3 mediante la estabilización de la forma inactiva podría ser menos propenso a tener resistencia al fármaco, manejado por mecanismos alternativos de la activación de HER3.

En consecuencia, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para tratar condiciones en donde existan anticuerpos terapéuticos clínicamente inefectivos.

Anticuerpos diseñados y modificados Un anticuerpo de la invención se puede preparar además utilizando un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL mostradas en la presente como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas en relación con el anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicionalmente o de una manera alternativa, un anticuerpo se puede diseñar mediante la modificación de los residuos dentro de las regiones constantes, por ejemplo, para alterar las funciones efectoras del anticuerpo.

Un tipo de diseño de región variable que se puede llevar a cabo es el injerto de la región determinante de complementariedad (CDR). Los anticuerpos interactúan con los antígenos objetivo predominantemente a través de los residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias que están fuera de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Debido a que las secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar los anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de los anticuerpos que se presentan naturalmente específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) a partir del anticuerpo que se presente naturalmente específico injertadas sobre las secuencias de estructura a partir de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann y colaboradores (1998) Nature 332: 323-327; Jones y colaboradores (1986) Nature 321 : 522-525; Queen y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad., EUA 86: 10029-10033; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,225,539 a Winter, y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530,101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 180,370 a Queen y colaboradores).

De conformidad con lo anterior, otra modalidad de la invención pertenece a un anticuerpo monoclonal que se enlaza al HER3 aislado, o a un fragmento del mismo, el cual comprende una región variable de cadena pesada, la cual comprende las secuencias de CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 1 10, 1 16, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368; las secuencias de CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 9, 21 , 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81 , 93, 99, 1 1 1 , 1 17, 129, 135, 147, 153, 165, 171 , 183, 189, 201 , 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261 , 273, 279, 291 , 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351 , 363, y 369; las secuencias de CDR3 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 1 12, 1 18, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370, respectivamente; y una región variable de cadena ligera que tiene las secuencias de CDR1 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 1 1 , 23, 29, 41 , 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101 , 1 13, 1 19, 131 , 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191 , 203, 209, 221 , 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281 , 293, 299, 31 1 , 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371 ; las secuencias de CDR2 que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 1 14, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372; y las secuencias de CDR3 que consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31 , 43, 49, 61 , 67, 79, 85, 97, 103, 1 15, 121 , 135, 139, 151 , 157, 169, 175, 187, 193, 205, 21 1 , 223, 229, 241 , 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301 , 313, 319, 331 , 337, 349, 355, 367, y 373, respectivamente. Por consiguiente, estos anticuerpos contienen las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) VH y VL de los anticuerpos monoclonales, y no obstante, pueden contener diferentes secuencias de estructura en relación con estos anticuerpos. Estas secuencias de estructura se pueden obtener a partir de las bases de datos de ADN públicas o de las referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de región variable de cadena pesada y ligera humanos se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana “Vase” (disponible en la Internet en www.mrc-cpe.cam .ac.uk/vbase), así como en Kabat y colaboradores (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Qumta Edición, U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos), N 1H Publicación No. 91 -3242; Chothia y colaboradores (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 -917; Chothia y colaboradores (1989) Nature 342: 877-883; y Al-Lazikani y colaboradores (1997) J. Mol. Biol. 273: 927-948; Tomlinson y colaboradores (1992) J. fol. Biol. 227: 776-798; y Cox y colaboradores (1994) Eur. J Immunol. 24: 827-836; el contenido de cada uno de los cuales se incorpora expresamente a la presente como referencia.

Un ejemplo de las secuencias de estructura para utilizarse en los anticuerpos de la invención son aquellos que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invención, por ejemplo, las secuencias en consenso y/o las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos monoclonales de la invención. Las secuencias de CDR1 , 2 y 3 VH, y las secuencias de CDR1 , 2 y 3 VL, se pueden injertar sobre las regiones de estructura que tengan una secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal a partir del cual se derive la secuencia de estructura, o las secuencias de regiones determinantes de complementariedad (CDR) se pueden injertar sobre las regiones de estructura que contengan una o más mutaciones comparándose con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que, en ciertas instancias, es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o mejorar la capacidad de enlace al antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,530, 101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6, 180,370 a Queen y colaboradores).

Otro tipo de modificación de región variable es mutar los residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR1 , CDR2 y/o CDR3 VH y/o VL para mejorar de esta manera una o más propiedades de enlace (por ejemplo, la afinidad) del anticuerpo de interés, siendo esto conocido como "maduración de afinidad." Se puede llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para introducir las mutaciones, y se puede evaluar el efecto sobre el enlace del anticuerpo, o otra propiedad funcional de interés, en ensayos ¡n vitro o in vivo, como se describen en la presente, y como se proporcionan en los Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservadoras (como se discute anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos. Más aún, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región determinante de complementariedad (CDR).

De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos monoclonales de enlace de HER3 aislados, o un fragmento de los mismos, los cuales consisten en una región variable de cadena pesada que tiene: una región CDR1 VH que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que tiene las SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 110, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 1 10, 1 16, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368; una región VH CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 9, 21 , 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81 , 93, 99, 1 1 1 , 1 17, 129, 135, 147, 153, 165, 171 , 183, 189, 201 , 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261 , 273, 279, 291 , 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351 , 363, y 369 o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 3, 9, 21 , 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81 , 93, 99, 1 1 1 , 1 17, 129, 135, 147, 153, 165, 171 , 183, 189, 201 , 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261 , 273, 279, 291 , 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351 , 363, y 369; una región VH CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 1 12, 1 18, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 76, 82, 94, 100, 1 12, 1 18, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370; una región VL CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 1 1 , 23, 29, 41 , 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101 , 1 13, 119, 131 , 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191 , 203, 209, 221 , 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281 , 293, 299, 31 1 , 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371 , o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 5, 1 1 , 23, 29, 41 , 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101 , 1 13, 1 19, 131 , 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191 , 203, 209, 221 , 227 , 239, 245, 257, 263, 275, 281 , 293, 299, 31 1 , 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371 ; una región VL CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 1 14, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 1 14, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372; y una región VL CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31 , 43, 49, 61 , 67, 79, 85, 97, 103, 1 15, 121 , 135, 139, 139, 151 , 157, 169, 175, 187, 193, 205, 21 1 , 223, 229, 241 , 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301 , 313, 319, 331 , 337, 349, 355, 367, y 373, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparándose con las SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31 , 43, 49, 61 , 67, 79, 85, 97, 103, 1 15, 121 , 135, 139, 139, 151 , 157, 169, 175, 187, 193, 205, 21 1 , 223, 229, 241 , 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301 , 313, 319, 331 , 337, 349, 355, 367, y 373.

Injerto de fragmentos de anticuerpos en estructuras o andamiajes alternativos Se pueden emplear una amplia variedad de estructuras o andamiajes de anticuerpo/inmunoglobulina siempre que el polipeptido resultante incluya cuando menos una región de enlace que se enlace específicamente a HER3. Estas estructuras o andamiajes incluyen los 5 idiotipos principales de las inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de los mismos, e incluyen las inmunoglobulinas de otras especies de animales, de preferencia que tengan aspectos humanizados. Los expertos en este campo continúan descubriendo y desarrollando estructuras, andamiajes y fragmentos novedosos.

En un aspecto, la invención pertenece a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulina utilizando andamiajes que no son de inmunoglobulina sobre los cuales se pueden injertar las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la invención. Se pueden emplear estructuras y andamiajes que no sean de inmunoglobulina conocidos o futuros, siempre que comprendan una región de enlace específica para la proteína de HER3 objetivo (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo). Las estructuras o andamiajes que no son de inmunoglobulina conocidos incluyen, pero no se limitan a, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc. , Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd . , Cambridge, MA, y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), productos farmacéuticos inmunológicos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidía, Inc., Mountaín Víew, CA), Proteína A (Affibody AG, Suecia), y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH , Halle, Alemania).

Los andamiajes de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina tipo II I (dominio 10 Fn3)). El dominio de fibronectina tipo I II tiene 7 u 8 cadenas beta que están distribuidas entre dos hojas beta, que por sí mismas se empacan unas contra otras para formar el núcleo de la proteína, y que además contienen ciclos (análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDRs)) que conectan las cadenas beta unas con otras y se exponen al solvente. Hay cuando menos tres de estos ciclos en cada orilla del emparedado de hojas beta, en donde la orilla es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 6,818,418). Estos andamiajes basados en fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el pliegue global está estrechamente relacionado con aquél del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende la unidad entera de reconocimiento de antígeno en la IgG de camello y de llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo que no es de inmunoglobulina imita las propiedades de enlace al antígeno que son de una naturaleza y afinidad similar a aquéllas de los anticuerpos. Estos andamiajes se pueden utilizar en una estrategia de selección aleatoria y mezcla en ciclo irt vitro, que es similar al proceso de maduración de afinidad de los anticuerpos in vivo. Estas moléculas basadas en fibronectina se pueden utilizar como andamiajes en donde las regiones de ciclo de la molécula pueden ser reemplazadas con las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la invención utilizando téenicas de clonación convencionales.

La tecnología de anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos de repetición derivados de anquirina como andamiajes para soportar las regiones variables, las cuales se pueden utilizar para enlazarse a diferentes objetivos. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices-a anti-paralelas y una vuelta-b. El enlace de las regiones variables se optimiza en su mayor parte utilizando la exhibición de ribosomas.

Los avímeros se derivan a partir de la proteína que contiene el dominio A natural, tal como HER3. Estos dominios se utilizan por naturaleza para las interacciones de proteína-proteína, y en el ser humano, más de 250 proteínas se basan estructuralmente en los dominios-A. Los avímeros consisten en un número de diferentes monómeros de “dominio-A” (2-10) enlazados por medio de enlazadores de aminoácidos. Se pueden crear avímeros que pueden enlazarse a un antígeno objetivo empleando la metodología descrita, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.

Los ligandos de afinidad Affibody son proteínas simples pequeñas compuestas de un haz de tres hélices basado en el andamiaje de uno de los dominios de enlace a IgG de la proteína A. La proteína A es una proteína superficial a partir de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de andamiaje consiste en 58 aminoácidos, 13 de los cuales se seleccionan aleatoriamente para generar bibliotecas Affibody con un gran número de variantes de ligandos (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 5,831 ,012). Las moléculas Affibody imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, comparándose con el peso molecular de los anticuerpos, el cual es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de enlace de las moléculas Affibody es similar a aquél de un anticuerpo.

Las anticalinas son productos desarrollados por la compañía Pieris ProteoLab AG. Se derivan a partir de las lipocalinas, un grupo ampliamente extendido de proteínas pequeñas y robustas que usualmente están involucradas en el transporte o almacenamiento fisiológico de los compuestos químicamente sensibles o insolubles. Se presentan varias lipocalinas naturales en los tejidos o en los líquidos corporales humanos. La arquitectura de la proteína hace recordar a las inmunoglobulinas, con ciclos hipervariables encima de una estructura rígida. Sin embargo, en contraste con los anticuerpos o con sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas de una sola cadena de polipéptido con 160 a 180 residuos de aminoácidos, lo cual es apenas marginalmente mayor que un solo dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro ciclos, el cual forma la buchaca de enlace, muestra una plasticidad estructural pronunciada y tolera una variedad de cadenas laterales. El sitio de enlace, por consiguiente, se puede reconfigurar en un proceso registrado con el objeto de reconocer las moléculas objetivo prescritas de forma diferente con una alta afinidad y especificidad. Se ha utilizado una proteína de la familia de lipocalina, la proteína de enlace a bilina (BBP) de Pieris Brassicae, para desarrollar anticalinas mediante la mutagenización del conjunto de cuatro ciclos. Un ejemplo de una solicitud de patente que describe las anticalinas está en la Publicación Internacional del TCP Número WO 199916873.

Las moléculas de afilina son proteínas pequeñas que no son de inmunoglobulina, las cuales están diseñadas para tener afinidades específicas hacia las proteínas y las moléculas pequeñas. Las nuevas moléculas de afilina se pueden seleccionar muy rápidamente a partir de dos bibliotecas, cada una de los cuales se basa en una proteína de andamiaje diferente derivada del ser humano. Las moléculas de afilina no muestran ninguna homología estructural con las proteínas de ¡nmunoglobulina. Actualmente, se emplean dos andamiajes de afilina, uno de los cuales es la gamma-cristalina, una proteína estructural humana del lente del ojo, y el otro es el de las proteínas de la superfamilia de "ubiquitina". Ambos andamiajes humanos son muy pequeños, muestran una alta estabilidad a la temperatura, y son casi resistentes a los cambios de pH y a los agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de hoja beta expandida de las proteínas. Los ejemplos de de las proteínas derivadas de gamma-cristalina se describen en la Publicación Internacional Número WO2001 04144, y los ejemplos de las proteínas "de tipo ubiquitina" se describen en la Publicación Internacional Número WO 2004106368.

Los miméticos de epítopos de proteína (PEM) son moléculas de tipo péptido cíclicas de tamaño mediano (MW 1 -2kDa) que imitan a las estructuras secundarias de horquilla-beta de las proteínas, la principal estructura secundaria involucrada en las interacciones de proteína-proteína.

En algunas modalidades, los Fabs se convierten hasta el formato silencioso de Ig G 1 mediante el cambio de la región Fe. Por ejemplo, los anticuerpos de la Tabla 1 se pueden convertir hasta el formato de IgG.

Anticuerpos humanos o humanizados La presente invención proporciona anticuerpos completamente humanos que se enlazan específicamente a una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo/ratón/rata). Comparándose con los anticuerpos quimericos o humanizados, los anticuerpos que se enlazan a HER3 humano de la invención tienen además una antigenicidad reducida cuando se administran a sujetos humanos.

Los anticuerpos que se enlazan a HER3 humano se pueden generar empleando los métodos que son conocidos en la materia. Por ejemplo, la teenología de "humaneering" (humanodiseño) utilizada para convertir los anticuerpos no humanos en anticuerpos humanos diseñados. La Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20050008625 describe un método in vivo para reemplazar una región variable de anticuerpo no humano con una región variable humana en un anticuerpo, mientras que se mantienen las mismas características de enlace o se proporcionan mejores características de enlace en relación con aquéllas del anticuerpo no humano. El método se apoya en el reemplazo guiado por el epítopo de las regiones variables de un anticuerpo de referencia no humano con un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo humano resultante en general no está relacionado estructuralmente con el anticuerpo no humano de referencia, pero se enlaza al mismo epítopo sobre el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. Dicho de una manera breve, el planteamiento de reemplazo de complementariedad guiado por el epítopo en serie se hace posible mediante el establecimiento de una competición en las células entre a "competidor" y una biblioteca de diversos híbridos del anticuerpo de referencia ("anticuerpos de prueba") para enlazarse a cantidades limitantes de antígeno en la presencia de un sistema reportero que responde al enlace del anticuerpo de prueba con el antígeno. El competidor puede ser el anticuerpo de referencia o un derivado del mismo, tal como un fragmento Fv de una sola cadena. El competidor también puede ser un ligando natural o artificial del antígeno que se enlaza al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. Los únicos requerimientos del competidor son que se enlace al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, y que compita con el anticuerpo de referencia por el enlace al antígeno. Los anticuerpos de prueba tienen una región-V de enlace al antígeno en común a partir del anticuerpo de referencia no humano, y la otra región-V se selecciona aleatoriamente a partir de una fuente diversa, tal como una biblioteca de repertorio de los anticuerpos humanos. La región-V común a partir del anticuerpo de referencia sirve como una guía, colocando los anticuerpos de prueba sobre el mismo epítopo en el antígeno, y en la misma orientación, de tal manera que se fuerza la selección hacia la fidelidad más alta de enlace al antígeno con el anticuerpo de referencia.

Se pueden utilizar muchos tipos de sistemas reporteros para detectar las interacciones deseadas entre los anticuerpos de prueba y el antígeno. Por ejemplo, se pueden enlazar fragmentos de reportero complementarios al antígeno y al anticuerpo de prueba, respectivamente, de tal manera que solamente se presente la activación del reportero mediante la complementación de los fragmentos cuando se enlace el anticuerpo de prueba al antígeno. Cuando las fusiones de anticuerpo de prueba- y antígeno-fragmento de reportero se co-expresan con un competidor, la activación del reportero llega a ser dependiente de la capacidad del anticuerpo de prueba para competir con el competidor, la cual es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno. Otros sistemas reporteros que se pueden utilizar incluyen el reactivador de un sistema de reactivación de reportero auto-inhibido (RAIR), como se da a conocer en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 10/208,730 (Publicación Número 20030198971 ), o el sistema de activación competitiva que se da a conocer en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 10/076,845 (Publicación Número 20030157579).

Con el sistema de reemplazo de complementariedad guiado por el epítopo en serie, se hace la selección para identificar las células que expresen un solo anticuerpo de prueba junto con los componentes de competidor, antígeno, y reportero. En estas células, cada anticuerpo de prueba compite uno a uno con el competidor para enlazarse a una cantidad limitante de antígeno. La actividad del reportero es proporcional a la cantidad de antígeno enlazado al anticuerpo de prueba, la cual a su vez es proporcional a la afinidad del anticuerpo de prueba por el antígeno y la estabilidad del anticuerpo de prueba. Los anticuerpos de prueba se seleccionan inicialmente con base en su actividad en relación con aquélla del anticuerpo de referencia cuando se expresa como el anticuerpo de prueba. El resultado de la primera ronda de selección es un conjunto de anticuerpos "híbridos", cada uno de los cuales está comprendido de la misma región-V no humana a partir del anticuerpo de referencia y una región-V humana a partir de la biblioteca, y cada uno de los cuales se enlaza al mismo epítopo sobre el antígeno que el anticuerpo de referencia. Uno o más de los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda tendrán una afinidad por el antígeno comparable con, o mayor que, aquélla del anticuerpo de referencia.

En el segundo paso de reemplazo de la región-V, las regiones-V humanas seleccionadas en el primero paso se utilizan como guía para la selección de los reemplazos humanos para la región-V del anticuerpo de referencia no humano restante con una biblioteca diversa de regiones-V humanas cognadas. Los anticuerpos híbridos seleccionados en la primera ronda también se pueden utilizar como competidores para la segunda ronda de selección. El resultado de la segunda ronda de selección es un conjunto de anticuerpos completamente humanos que difieren estructuralmente del anticuerpo de referencia, pero que compiten con el anticuerpo de referencia para enlazarse al mismo antigeno. Algunos de los anticuerpos humanos seleccionados se enlazan al mismo epítopo sobre el mismo antígeno que el anticuerpo de referencia. Entre estos anticuerpos humanos seleccionados, uno o más se enlaza al mismo epítopo con una afinidad que es comparable a, o mayor que, aquélla del anticuerpo de referencia.

Utilizando uno de los anticuerpos que se enlazan al HER3 de ratón o quimérico descritos anteriormente como el anticuerpo de referencia, este método se puede emplear fácilmente para generar anticuerpos humanos que se enlacen al HER3 humano con la misma especificidad de enlace y la misma o mejor afinidad de enlace. En adición, estos anticuerpos que se enlazan al HER3 humano también se pueden obtener comercialmente en las compañías que producen por costumbre anticuerpos humanos, por ejemplo, KaloBios, Inc. (Mountain View, CA).

Anticuerpos de camélido Las proteínas de anticuerpos obtenidas a partir de los miembros de la familia del camello y el dromedario ( Camelus bactrianus y Camelus dromedarius), incluyendo los miembros del nuevo mundo, tales como las especies de llama ( Lama paceos, Lama glama y lama vicugna), se han caracterizado con respecto al tamaño, la complejidad estructural, y la antigenicidad para los sujetos humanos. Ciertos anticuerpos de IgG a partir de esta familia de mamíferos, como se encuentran en la naturaleza, carecen de cadenas ligeras y, por consiguiente, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, para los anticuerpos de otros animales. Véase la Publicación Internacional del TCP Número PCT/EP93/022 14 (Publicación Internacional Número WO 94/04678 publicada el 3 de marzo de 1994).

Una región del anticuerpo de camélido, que es el único dominio variable pequeño identificado como VHH, se puede obtener mediante ingeniería genética para proporcionar una proteína pequeña que tiene una alta afinidad por un objetivo, que da como resultado una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular conocida como un “nanocuerpo de camélido”. Véase la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,759,808 expedida el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans y colaboradores (2004) J Biol Chem 279: 1256-1261 ; Dumoulin y colaboradores (2003) Nature 424: 783-788; Pleschberger y colaboradores (2003) Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo y colaboradores (2002) Int J Cáncer 89: 456-62; y Lauwercys y colaboradores (1998) EM BO J 17: 3512-3520. Las bibliotecas diseñadas de anticuerpos de camélido y fragmentos de anticuerpos están comercialmente disponibles, por ejemplo, en Ablynx, Ghent, Bélgica (por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números US200601 15470; Domantis US20070065440, US20090148434). Como con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélido se puede alterar de una manera recombinante para obtener una secuencia que se parezca más cercanamente a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo se puede “humanizar”. Por consiguiente, se puede reducir adicionalmente la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélido para los seres humanos.

El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte de aquél de una molécula de IgG humana, y la proteína tiene un diámetro físico de solamente unos cuantos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélido para enlazarse a los sitios antigénicos que son funcionalmente invisibles para las proteínas de anticuerpo más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélido son útiles como reactivos para detectar los antígenos que sean de otra manera crípticos, utilizando las téenicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por consiguiente, todavía otra consecuencia del pequeño tamaño es que un nanocuerpo de camélido puede ser inhibidor como un resultado del enlace a un sitio específico en una ranura o hendidura estrecha de una proteína objetivo y, por consiguiente, puede servir en una capacidad que se parezca más cercanamente a la función de un fármaco de bajo peso molecular clásico, que aquélla de un anticuerpo clásico.

El bajo peso molecular y el tamaño compacto además dan como resultado nanocuerpos de camélido que son extremadamente termoestables, estables a pHs extremos y a la digestión proteolítica, y pobremente antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélido se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio hacia los tejidos, e incluso cruzan la barrera hematoencefálica y pueden tratar los trastornos que afecten al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar adicionalmente el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características, combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos, indican el gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas se pueden expresar completamente en las células procarióticas, tales como de E. coli, y se expresan como proteínas de fusión con los bacteriófagos, y son funcionales.

De conformidad con lo anterior, una característica de la presente invención es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene una alta afinidad por HER3. En ciertas modalidades de la presente, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce naturalmente en el animal camélido, es decir, es producido por el camélido en seguida de la inmunización con HER3 o con un fragmento peptídico del mismo, utilizando las téenicas descritas en la presente para otros anticuerpos. De una manera alternativa, el nanocuerpo de camélido que se enlaza al HER3 se diseña, es decir, se produce, mediante una selección, por ejemplo, a partir de una biblioteca de fagos que exhiban las proteínas de nanocuerpos de camélido apropiadamente mutagenizadas, utilizando procedimientos de paneo con LRP6 como un objetivo, como se describe en los Ejemplos de la presente. Los nanocuerpos diseñados se pueden hacer además a la medida mediante ingeniería genética para tener una vida media en un sujeto receptor de 45 minutos a dos semanas. En una modalidad específica, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene mediante el injerto de las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la invención, en las secuencias de estructura del nanocuerpo o del anticuerpo de un solo dominio, como se describe, por ejemplo, en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/EP93/02214. En una modalidad, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se enlaza a cuando menos uno de los siguientes residuos de HER3: Asn266, Lys267, Leu268, Thr269, Gln271 , Glu273, Pro274, Asn275, Pro276, His277, Asn315, Asp571 , Pro583, His584, Ala596, Lys597. En una modalidad, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se enlaza a cuando menos uno de los siguientes residuos de HER3: Tyr265, Lys267, Leu268, Phe270, Gly582, Pro583, Lys597, He600, Lys602, Glu609, Arg61 1 , Pro612, Cys613, His614, Glu615.

Moléculas biespecíficas y anticuerpos multivalentes En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas biparatópicas, biespecíficas o multiespecíficas que comprendan un anticuerpo que se enlaza al HER3, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o los fragmentos del mismo, se pueden derivar o enlazar a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se enlace a cuando menos dos sitios de enlace o moléculas objetivo diferentes. El anticuerpo de la invención, de hecho, se puede derivar o se puede enlazar a más de otra molecula funcional para generar moléculas biparatópicas o multiespecíficas que se enlacen a más de dos sitios de enlace y/o moléculas objetivo diferentes; tales moléculas biparatópicas o multiespecíficas. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención se puede enlazar funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, o de otra manera) a una o más moléculas de enlace diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido, o mimético de enlace, de tal manera que resulte una molécula biespecífica.

Se pueden proporcionar otros beneficios clínicos mediante el enlace de dos o más antígenos dentro de un anticuerpo (Coloma y colaboradores (1997); Merchant y colaboradores (1998); Alt y colaboradores (1999); Zuo y colaboradores (2000); Lu y colaboradores (2004); Lu y colaboradores (2005); Marvin y colaboradores (2005); Marvin y colaboradores (2006); Shen y colaboradores (2007); Wu y colaboradores (2007); Dimasi y colaboradores (2009); Michaelson y colaboradores (2009)). (Morrison y colaboradores (1997) Nature Biotech. 15: 159-163; Alt y colaboradores (1999) FEBS Letters 454: 90-94; Zuo y colaboradores (2000) Protein Engineering 13: 361 -367; Lu y colaboradores (2004) JBC 279: 2856-2865; Lu y colaboradores (2005) JBC 280: 19665-19672; Marvin y colaboradores (2005) Acta Pharmacologica Sínica 26: 649-658; Marvin y colaboradores (2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9: 184-193; Shen y colaboradores (2007) J Immun Methods 218: 65-74; Wu y colaboradores (2007) Nat Biotechnol. 1 1 : 1290-1297; Dimasi y colaboradores (2009) J Mol Blol. 393: 672-692; y Michaelson y colaboradores (2009) mAbs 1 : 128-141 .

Las moléculas biespeclflcas de lar presente invención se pueden preparar mediante la conjugación de las especificidades de enlace constitutivas, empleando los métodos conocidos en la téenica. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de la molécula biespecífica se puede generar por separado, y entonces se conjugan entre sí. Cuando las especificidades de enlace son proteínas o péptidos, se pueden utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o de reticulación para la conjugación covalente. Los ejemplos de los agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitro-benzoico) (DTNB), o-fenilen-dimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciclohexan-1 -carboxilato (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 8648). Otros métodos incluyen aquéllos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78: 1 18-132; Brennan y colaboradores (1985) Science 229: 81 -83), y Glennie y colaboradores (1987) J . Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlace de sulfhidrilo de las regiones de articulación del término C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particular, la región de articulación se modifica para contener un número non de residuos de sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.

De una manera alternativa, ambas especificidades de enlace se pueden codificar en el mismo vector, y se pueden expresar y ensamblar en la misma célula huésped. Este método es en particular útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ó ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena que comprenda un anticuerpo de una sola cadena y un determinante de enlace, o una molécula biespecífica de una sola cadena que comprenda dos determinantes de enlace. Las moléculas biespecíficas pueden comprender cuando menos dos moléculas de una sola cadena. Los métodos para la preparación de moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en Las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,260,203; 5,455,030; 4,881 ,175; 5,132,405; 5,091 ,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; y 5,482,858.

El enlace de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicos se puede confirmar, por ejemplo, mediante el análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radiommunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento), o ensayo Western Blot. Cada uno de estos ensayos en términos generales detecta la presencia de los complejos de proteína-anticuerpo de un interés particular, mediante el empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.

En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos multivalentes que comprenden cuando menos dos fragmentos idénticos o diferentes de los anticuerpos de la invención que se enlazan al HER3. Los fragmentos de anticuerpos pueden estar enlazados entre sí por medio de fusión de proteína o por medio de un enlace covalente o no covalente. Los compuestos tetravalentes se pueden obtener, por ejemplo, mediante la reticulación de los anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se enlace a las regiones constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, la Fe o la región de articulación. El dominio trimerizante se describe, por ejemplo, en Borean, Patente Europea Número EP 1012280B1. Los módulos pentamerizantes se describen, por ejemplo, en la Publicación Internacional del TCP Número PCT/EP97/05897.

En una modalidad, una molécula biparatópica/biespecífica se enlaza a los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y del dominio 4 de H ER3.

En otra modalidad, la invención pertenece a anticuerpos de doble función, en donde un solo anticuerpo monoclonal se ha modificado de tal manera que el sitio de enlace al antígeno se enlaza a más de un antígeno, tal como un anticuerpo de doble función que se enlaza tanto al HER3 como a otro antígeno (por ejemplo, HER1 , HER2, y HER4). En otra modalidad, la invención pertenece a un anticuerpo de doble función que se dirige a los antígenos que tengan la misma conformación, por ejemplo, un antígeno que tenga la misma conformación de HER3 en el estado “cerrado" o "inactivo”. Los ejemplos de los antígenos con la misma conformación de HER3 en el estado “cerrado" o "inactivo” incluyen, pero no se limitan a, HER1 y HER4. Por consiguiente, un anticuerpo de doble función se puede enlazar a HER3 y HER1 ; a HER3 y HER4, o a HER1 y HER4. La especificidad de enlace doble del anticuerpo de doble función se puede traducir además en una actividad doble, o en la inhibición de actividad. (Véase, por ejemplo, Jenny Bostrom y colaboradores (2009) Science: 323; 1610-1614).

Anticuerpos con una vida media prolongada La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente a la proteína de HER3, los cuales tienen una vida media prolongada in vivo.

Muchos factores pueden afectar a la vida media de una proteína in vivo. Como ejemplos tenemos la filtración renal, el metabolismo en el hígado, la degradación mediante las enzimas proteolíticas (proteasas), y las respuestas inmunogénicas (por ejemplo, la neutralización de la proteína mediante los anticuerpos y la absorción mediante los macrófagos y las células dendríticas). Se pueden emplear una variedad de estrategias para prolongar la vida media de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, mediante enlace químico a polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, andamiaje de anticuerpo, poli-ácido siálico (PSA), almidón de hidroxi-etilo (H ES), ligandos de enlace de albúmina, y protectores de carbohidrato; Mediante la fusión genética a las proteínas que se enlazan a las proteínas del suero, tales como albúmina, I g G , FcRn, y transferrina; mediante el acoplamiento (genético o químico) con otras fracciones de enlace que se enlacen a las proteínas del suero, tales como nanocuerpos, Fabs, DARPins, avímeros, Affibodies, y anticalinas; mediante fusión genética con rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de enlace a la albúmina, y Fe; o mediante su incorporación en nanovehículos, formulaciones de liberación lenta, o dispositivos médicos.

Con el fin de prolongar la circulación en suero de los anticuerpos in vivo, las moléculas poliméricas inertes, tales como el PEG de alto peso molecular, se pueden unir a los anticuerpos o a un fragmento de los mismos, con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de la conjugación específica del sitio del PEG al término N o C de los anticuerpos, o por medio de los grupos épsilon-amino presentes sobre los residuos de sina. Para la pegilación, un anticuerpo, el anticuerpo, o el fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un derivado de éster reactivo o aldehido de PEG, bajo condiciones en donde uno o más grupos PEG lleguen a unirse al anticuerpo o al fragmento del anticuerpo. La pegilación se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se utiliza en la presente, el término “polietilenglicol” pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivar otras proteínas, tales como mono alcoxilo (de 1 a 10 átomos de carbono)- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Se utilizará la derivación del polímero lineal o ramificado que dé como resultado una pérdida m ínima de la actividad biológica. El grado de la conjugación se puede monitorear estrechamente mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para asegurar la conjugación apropiada de las moléculas de PEG con los anticuerpos. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante cromatografía por exclusión de tamaños o de intercambio de iones. Los anticuerpos derivados de PEG se pueden probar para determinar su actividad de enlace, así como su eficacia in vivo, empleando los métodos bien conocidos por las personas expertas en la materia, por ejemplo, mediante los inmunoensayos descritos en la presente. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la téenica, y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, la Patente Europea Número EP 0 154 316 por Nishimura y colaboradores, y la Patente Europea Número EP 0 401 384 por Ishikawa y colaboradores Otras tecnologías de pegilación modificadas incluyen la tecnología de reconstitución de ingeniería dirigida químicamente ortogonal (ReCODE PEG), la cual incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en las proteínas biosintéticas, por medio de un sistema reconstituido que incluye la sintetasa de tARN y el tARN . Esta teenología hace posible la incorporación de más de 30 nuevos aminoácidos en las proteínas biosintéticas en E.coli, levadura, y células de mamífero. El tARN incorpora un aminoácido no activo en cualquier lugar en que se coloque un codón ámbar, convirtiendo el ámbar desde un codón de paro hasta uno que señaliza la incorporación del aminoácido químicamente especificado.

La tecnología de pegilación recombinante (rPEG) también se puede utilizar para prolongar la vida media en suero. Esta tecnología involucra fusionar genéticamente una cola de proteína no estructurada de 300 a 600 aminoácidos con una proteína farmacéutica existente. Debido a que el peso molecular aparente de esta cadena de proteína no estructurada es aproximadamente 15 veces mayor que su peso molecular real, aumenta mucho la vida media en suero de la proteína. En contraste con la PEGilacíón tradicional, la cual requiere de conjugación química y re-purificación, el proceso de elaboración se simplifica mucho, y el producto es homogéneo.

La poli-sialilación es otra tecnología, la cual utiliza el polímero natural de poli-ácido siálico (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de los péptidos y proteínas terapéuticas. El poli-ácido siálico (PSA) es un polímero de ácido siálico (un azúcar). Cuando se utiliza para el suministro de fármacos de proteínas y péptidos terapéuticos, el poli-ácido siálico proporciona un micro-medio ambiente protector en la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación, e impide que sea reconocida por ei sistema inmunológico. El polímero de poli-ácido siálico (PSA) se encuentra naturalmente en el cuerpo humano. Fue adoptado por ciertas bacterias que evolucionaron durante millones de años para recubrir sus paredes con el mismo. Entonces estas bacterias naturalmente poli-sialiladas fueron capaces, en virtud de la imitación molecular, de recubrir el sistema de defensa del cuerpo. El poli-ácido siálico (PSA), lo último en teenología de protección de la naturaleza, se puede producir fácilmente a partir de estas bacterias en grandes cantidades y con características físicas previamente determinadas. El poli-ácido siálico (PSA) bacteriano es completamente no inmunogénico, incluso cuando se acopla a las proteínas, debido a que es químicamente idéntico al poli-ácido siálico (PSA) del cuerpo humano.

Otra tecnología incluye el uso de derivados de almidón de hidroxi-etilo (“HES") enlazado a los anticuerpos. El almidón de hidroxi-etilo (HES) es un polímero natural modificado derivado a partir del almidón de maíz ceroso, y puede ser metabolizado por las enzimas del cuerpo. Las soluciones de almidón de hidroxi-etilo (HES) se administran usualmente para sustituir el volumen sanguíneo deficiente y para mejorar las propiedades reológicas de la sangre. La HESilación de un anticuerpo hace posible la prolongación de la vida media en la circulación, mediante el aumento de la estabilidad de la molécula, así como mediante la reducción de la eliminación renal, dando como resultado un aumento de la actividad biológica.

Mediante la variación de diferentes parámetros, tales como el peso molecular del almidón de hidroxi-etilo (HES), se puede hacer a la medida una amplia gama de conjugados de anticuerpos de almidón de hidroxi-etilo (HES).

También se pueden generar anticuerpos que tengan un aumento de su vida media in vivo mediante la introducción de una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o supresiones) en un dominio constante de IgG, o un fragmento de enlace a FcRn del mismo (de preferencia un fragmento de dominio Fe o de Fe de articulación). Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 98/23289; la Publicación Internacional Número WO 97/34631 ; y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,277,375.

Además, los anticuerpos se pueden conjugar con albúmina con el objeto de hacer que el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo sea más estable in vivo o de que tenga una vida media más larga in vivo. Las téenicas son bien conocidas en este campo, véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Números WO 93/15199, WO 93/15200, y WO 01/77137; y la Patente Europea Número EP 413,622.

El anticuerpo de HER3 o un fragmento del mismo también se puede fusionar con uno o más de albúmina de suero humano (HSA) polipéptidos, o una porción de los mismos. La albúmina de suero humano (HSA), una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura, es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica del suero, y también funciona como un vehículo de ligandos endógenos y exógenos. La función de la albúmina como una molécula portadora y su naturaleza inerte, son propiedades deseables para utilizarse como un vehículo y transportador de polipéptidos in vivo. El uso de albúmina como el componente de una proteína de fusión de albúmina como un vehículo para diversas proteínas se ha sugerido en la Publicación Internacional Número WO 93/15199, en la Publicación Internacional Número WO 93/15200, y en la Patente Europea Número EP 413 622. También se ha propuesto el uso de los fragmentos N-terminales de la albúmina de suero humano (HSA) para las fusiones con polipéptidos (Patente Europea Número EP 399 666). De conformidad con lo anterior, mediante la fusión o conjugación genética o química de los anticuerpos o fragmentos de los mismos con la albúmina, se puede estabilizar o prolongar la vida media, y/o se puede conservar la actividad de la molécula durante períodos de tiempo prolongados en solución, in vitro y/o in vivo.

La fusión de la albúmina con otra proteína se puede lograr mediante manipulación genética, de tal manera que el ADN que codifique la albúmina de suero humano (HSA), o un fragmento del mismo, se una al ADN que codifique la proteína. Entonces se transforma o se transfecta un huésped adecuado con las secuencias de nucleótidos fusionadas, arregladas de tal manera sobre un plásmido adecuado, que expresen un polipéptido de fusión. La expresión se puede efectuar in vitro, por ejemplo, a partir de células procarióticas o eucarióticas, o in vivo, por ejemplo, a partir de un organismo transgénico. Se pueden encontrar métodos adicionales pertenecientes a las fusiones de la albúmina de suero humano (HSA), por ejemplo, en las Publicaciones Internacionales Números WO 2001077137 y WO 200306007, incorporadas a la presente como referencia. En una modalidad específica, la expresión de la proteína de fusión se lleva a cabo en líneas celulares de mamífero, por ejemplo, en líneas celulares CHO. El enlace diferencial alterado de un anticuerpo a un receptor a pHs bajos o altos también se contempla dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo se puede modificar de tal manera que permanezca enlazado a su receptor a un pH bajo, por ejemplo, el pH bajo dentro de un lisosoma, mediante la modificación del anticuerpo para incluir aminoácidos adicionales, tales como una histidina en una región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo (véase, por ejemplo, Tomoyuki Igawa y colaboradores (2010) Nature Biotechnology; 28, 1203-1207).

Conjugados de anticuerpos La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se enlazan específicamente a una proteína de HER3 recombinantemente fusionada o químicamente conjugada (incluyendo las conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, de preferencia a un polipéptido de cuando menos 10, de cuando menos 20, de cuando menos 30, de cuando menos 40, de cuando menos 50, de cuando menos 60, de cuando menos 70, de cuando menos 80, de cuando menos 90 ó de cuando menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de anticuerpo descrito en la presente (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR VH, un dominio VL o una CDR VL), y una proteína, polipeptido, o péptido heterólogo. Los métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos, o péptidos a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 , y 5, 1 12,946; las Patentes Europeas Números EP 307,434 y EP 367,166; las Publicaciones Internacionales Números WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi y colaboradores (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88: 10535-10539; Zheng y colaboradores (1995) J. Immunol. 154: 5590-5600; y Vil y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 11337-1 1341.

Se pueden generar proteínas de fusión adicionales a través de las téenicas de mezcla de genes, mezcla de motivos, mezcla de exones, y/o mezcla de codones (colectivamente referidos como “mezcla de ADN”). La mezcla de ADN se puede emplear para alterar las actividades de los anticuerpos de la invención o los fragmentos de los mismos (por ejemplo, los anticuerpos o los fragmentos de los mismos con afinidades más altas e índices de disociación más bajos). Véanse, en términos generales, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamerica Números 5,605,793; 5,81 1 ,238; 5,830,721 ; 5,834,252; y 5,837,458; Patten y colaboradores (1997) Curr. Opinión Biotechnol. 8: 724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hansson y colaboradores (1999) J. Mol. Biol. 287: 265-76; y Lorenzo y Blasco, (1998) Biotechniques 24(2): 308-313 (cada una de estas patentes y publicaciones se incorpora a la presente como referencia en su totalidad). Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, se pueden alterar sometiéndolos a mutagénesis aleatoria mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) susceptible a error, inserción aleatoria de nucleótido, o mediante otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a una proteína de HER3, se puede recombinar con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.

Más aún , los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden fusionar con secuencias marcadoras, tales como un péptido, con el objeto de facilitar la purificación. En las modalidades preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc. , 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 9131 1 ), entre otras, muchas de las cuales están comercialmente disponibles. Como se describe en Gentz y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86: 821 -824, por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras marcas de peptidos útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la marca de hemaglutinina (“HA”), la cual corresponde a un epítopo derivado a partir de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson y colaboradores (1984) Cell 37: 767), y la marca “flag".

En otras modalidades, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos, se conjugan con un agente de diagnóstico o detectable. Estos anticuerpos pueden ser útiles para monitorear o pronosticar el establecimiento, desarrollo, progreso y/o la gravedad de una enfermedad o de un trastorno como parte de un procedimiento de prueba clínica, tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Este diagnóstico y detección se puede llevar a cabo mediante el acoplamiento del anticuerpo con sustancias detectables, incluyendo, pero no limitándose a, diversas enzimas, tales como, pero no limitándose a, peroxidasa de radícula roja, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetil-colinesterasa; grupos protésicos, tales como, pero no limitándose a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitándose a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, dicloro-triazinil-amina-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitándose a, luminol; biomateriales luminiscentes, tales como, pero no limitándose a, luciferasa, luciferina, y acuorina; materiales radioactivos, tales como, pero no limitándose a, yodo (131 l, 125l, 123l, y 1211 ,) , carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (1 15ln, 113ln, 112l n, y 1111 n , ) , teenecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno ("Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166l-lo, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97RU , 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 1 13Sn, y 117Tin; y metales emisores de positrones utilizando diferentes tomografías de emisión de positrones, y iones de metales paramagneticos no radioactivos.

La presente invención abarca además los usos de los anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con una fracción terapéutica. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, se puede conjugar con una fracción terapéutica, tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion de metal radioactivo, por ejemplo, emisores-alfa. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.

Además, un anticuerpo o un fragmento del mismo se puede conjugar con una fracción terapéutica o una fracción de fármaco que se modifique para dar una respuesta biológica. Las fracciones terapéuticas o las fracciones de fármaco no deben interpretarse como limitadas a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la fracción de fármaco puede ser una proteína, péptido, o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina de cólera, o toxina de difteria; una proteína, tal como factor de necrosis tumoral, a- interferón, b-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno de tejido, un agente apoptótico, un agente anti-angiogénico; o, un modificador de la respuesta biológica, tal como, por ejemplo, una linfocina. En una modalidad, el anticuerpo anti- HER3 o un fragmento del mismo, conjugado con una fracción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Estos conjugados son referidos en la presente como “inmunoconjugados”. Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas son referidos como “inmunotoxinas”. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que aniquile a) las células. Los ejemplos incluyen taxón, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, t. colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina, y los análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercapto-purina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoro-uracil-decarbazina), agentes de ablación (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa-clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU), y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfano, dibromo-manitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-dicloro-diamina-platino (II) (DDP) cisplatina, antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). (Véase, por ejemplo, Seattle Genetics, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US20090304721 ).

Otros ejemplos de las citotoxinas terapéuticas que se pueden conjugar con un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maytansinas y auristatinas, y derivados de las mismas. Un ejemplo de un anticuerpo de caliqueamicina conjugado está comercialmente disponible (MylotargMR; Wyeth-Ayerst).

Las citotoxinas se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención utilizando la teenología de enlazadores disponible en la materia. Los ejemplos de los tipos de enlazadores que se han utilizado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptidos. Se puede seleccionar un enlazador, es decir, por ejemplo, que sea susceptible a la disociación mediante un bajo pH dentro del compartimiento lisosomal, o que sea susceptible a la disociación mediante las proteasas, tales como las proteasas preferencialmente expresadas en el tejido tumoral, tales como las catepsinas (por ejemplo, las catepsinas B, C, D).

Para una discusión adicional de los tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar los agentes terapéuticos a los anticuerpos, véanse también Saito y colaboradores (2003) Adv. Fármaco Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail y colaboradores (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne, (2003) Cáncer Cell 3: 207-212; Alien, (2002) Nat. Rev. Cáncer 2: 750-763; Pastan y Kreltman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091 ; Senter y Sprlnger, (2001 ) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264.

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar a un isótopo radioactivo para generar productos radiofarmacéuticos citotóxicos, también referidos como radiommunoconjugados. Los ejemplos de los isótopos radioactivos que se pueden conjugar con los anticuerpos para utilizarse diagnósticamente o terapéuticamente incluyen, pero no se limitan a, yodo131 , indio11 1, itrio90, y lutecio177. Los métodos para la preparación de los radioinmunoconjugados están establecidos en la materia. Los ejemplos de los radioinmunoconjugados están comercialmente disponibles, incluyendo ZevalinMR (DEC Pharmaceuticals), y BexxarMR (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden emplear métodos similares para preparar los radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención. En ciertas modalidades, el quelato macrocíclico es el ácido 1 ,4,7,10-tetra-azaciclododecan-N,N’,N”,N”’-tetra-acético (DOTA), el cual se puede unir al anticuerpo por medio de una molécula enlazadora. Estas moléculas enlazadoras son comúnmente conocidas en la materia y se describen en Denardo y colaboradores (1998) Clin Cáncer Res. 4(10): 2483-90; Peterson y colaboradores (1999) Bioconjug. Chem. 10(4): 553-7; y Zimmerman y colaboradores (1999) Nucí. Med. Biol. 26(8): 943-50, cada uno Incorporado como referencia en su totalidad.

Las téenicas para conjugar las fracciones terapéuticas a los anticuerpos son bien conocidas, véase, por ejemplo, Arnon y colaboradores, “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy”, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Reisfeld y colaboradores (Editores), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y colaboradores, “Antibodies for Drug Delivery’’, en Controlled Drug Delivery (2a Edición), Robinson y colaboradores (Editores), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinical Applications, Pinchera y colaboradores (Editores), páginas 475-506 (1985); “Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cáncer Therapy”, en Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, Baldwin y colaboradores (Editores), páginas 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y colaboradores (1982) Immunol. Rev. 62: 119-58.

Los anticuerpos también se pueden unir a soportes sólidos, que son particularmente útiles para los inmunoensayos o para la purificación del antígeno objetivo. Estos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, poli-cloruro de vinilo o polipropileno.

Combinaciones de anticuerpos En otro aspecto, la invención pertenece a anticuerpos de HER3, o a fragmentos de los mismos de la invención, utilizados con otros agentes terapeuticos, tales como otros anticuerpos, inhibidores de molécula pequeña, inhibidores de mTOR, o inhibidores de cinasa PI3. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: Inhibidores de HER1: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos se pueden utilizar con inhibidores de HER1 , los cuales incluyen, pero no se limitan a, Matuzumab (EMD72000), Erbitux®/Cetuximab (Imclone), Vectibix®/Panitumumab (Amgen), mAb 806, y Nimotuzumab (TheraCIM), lressa®/Gefitinib (Astrazeneca); CI-1033 (PD183805) (Pfizer), Lapatinib (GW-572016) (GlaxoSmithKIine), Tykerb®/Ditosilato de Lapatinib (SmithKIine Beecham), Tarceva®/Erlotinib HCL (OSI-774) (OSI Pharma), y PKI-166 (Novartis), y N-[4-[(3-cloro-4-fluoro-fenil)-amino]-7-[[(3"S")-tetrahidro-3-furanil]-oxi]-6-qumazolinil]-4-(dimetil-amino)-2-butenamida, vendida bajo el nombre comercial Tovok® por Boehringer Ingelheim).

Inhibidores de HER2: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar con los inhibidores de HER2, los cuales incluyen, pero no se limitan a, Pertuzumab (vendido bajo la marca comercial registrada Omnitarg® por Genentech), Trastuzumab (vendido bajo la marca comercial registrada Herceptin® por Genentech/Roche), MM-1 1 1 , neratinib (también conocido como HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-cloro-4-[(piridin-2-il)-metoxi]-fenil]-amino]-3-ciano-7-etoxi-quinolin-6-il]-4-(dimetil-amino)-but-2-enamida, y descrita en la Publicación Internacional del TCP Número WO 05/028443), lapatinib o Ditosilato de Lapatinib (vendido bajo la marca comercial registrada Tykerb® por GlaxoSmithKIine.

Inhibidores de HER3: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos se pueden utilizar con los inhibidores de HER3, los cuales incluyen, pero no se limitan a, MM-121 , MM-1 1 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), y moleculas pequeñas que inhiben HER3.

Inhibidores de HER4: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar con inhibidores de HER4.

Inhibidores de PI3K: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar con inhibidores de cinasa PI3, los cuales incluyen, pero no se limitan a, 4-[2-(1 H-indazol-4-il)-6-[[4-(metil-sulfonil)-piperazin-1 -il]-metil]-tieno-[3,2-d]-pir¡midin-4-il]-morfolina (también conocida como GDC 0941 y descrita en las Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 09/036082 y WO 09/055730), 2-metil-2-[4-[3-metil-2-oxo-8-(qumolin-3-il)-2,3-dihidro-imidazo-[4,5-c]-quinolin-1 -il]-fenil]-propionitrilo (también conocido como BEZ 235 ó NVP-BEZ 235, y descrito en la Publicación Internacional del TCP Número WO 06/122806), BMK120 y BYL719.

Inhibidores de mTOR: Los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos, se pueden utilizar con los inhibidores de mTOR, los cuales incluyen, pero no se limitan a, Temsirolimus (vendido bajo el nombre comercial Torisel® por Pfizer), ridaforolimus (formalmente conocido como deferolimus, dimetil-fosfinato de (1 R,2R,4S)-4-[(2R)-2-[(1 R,9S,12S, 15R, 16E, 18R, 19R,21 R,23S,24E, 26E,28Z,30S,32S,35R)-1 , 18-dih¡droxi-19,30-d¡metoxi-15,17,21 ,23,29, 35-hexametil-2,3, 10, 14,20-pentaoxo-1 1 ,36-dioxa-4-aza-triciclo-[30.3.1 .04,9]-hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-¡l]-propil]-2-metoxi-ciclohexilo, también conocido como Deforolimus, AP23573 y MK8669 (Ariad Pharm .), y descrito en la Publicación Internacional del TCP Número WO 03/064383), everolimus (RAD001 ) (vendido bajo el nombre comercial Afinitor® por Novartis). Se pueden administrar uno o más agentes terapéuticos ya sea simultáneamente o bien antes o después de la administración de un anticuerpo de HER3 o un fragmento del mismo de la presente invención.

Métodos para la producción de los anticuerpos de la invención (i) Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos La invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos sustancialmente purificadas que codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas del anticuerpo que se enlaza a HER3 descrito anteriormente. Algunos de los ácidos nucleicos de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo de HER3 y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de cadena ligera. En una modalidad específica, las moléculas de ácidos nucleicos son aquéllas identificadas en la Tabla 1. Algunas otras moléculas de ácidos nucleicos de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, cuando menos el 65 por ciento, el 80 por ciento, el 95 por ciento, o el 99 por ciento) a las secuencias de nucleótidos de aquéllas identificadas en la Tabla 1. Cuando se expresan a partir de los vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados para estos polinucleótidos son capaces de exhibir capacidad de enlace al antígeno de HER3.

En la invención también se proporcionan polinucleótidos que codifican cuando menos una región determinante de complementariedad (CDR) y usualmente todas las tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) a partir de la cadena pesada o ligera del anticuerpo que se enlaza al HER3 estipulado anteriormente. Algunos otros polinucleótidos codifican toda o sustancialmente toda la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o de la cadena ligera del anticuerpo que se enlaza al HER3 estipulado anteriormente. Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácidos nucleicos codificarán cada una de las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de región variable de cadena pesada madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, cuando menos el 80 por ciento, el 90 por ciento, o el 99 por ciento) a la secuencia de región variable de cadena pesada madura de un anticuerpo de HER3, estipulada en la Tabla 1 .

Las secuencias de polinucleótidos se pueden producir mediante la síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagenesis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una secuencia existente (por ejemplo, las secuencias como se describen en los Ejemplos más adelante) que codifica un anticuerpo que se enlaza al HER3 o a su fragmento de enlace. La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo mediante los métodos conocidos en la téenica, tales como el método de fosfo-triéster de Narang y colaboradores (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; el método de fosfodiéster de Brown y colaboradores (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; el método de dietil-fosforamidita de Beaucage y colaboradores (1981 ) Tetra. Lett., 22: 1859; y el método de soporte sólido de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,458,066. La introducción de mutaciones a una secuencia de polinucleótido mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se puede llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Editor), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y colaboradores (Editores), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila y colaboradores (1991 ) Nucleic Acids Res. 19: 967; y Eckert y colaboradores (1991) PCR Methods and Applications 1 : 17.

En la invención también se proporcionan vectores de expresión y células huésped para producir los anticuerpos que se enlazan al HER3 descritos anteriormente. Se pueden emplear diferentes vectores de expresión para expresar el polinucleótidos que codifican las cadenas o los fragmentos de enlace del anticuerpo que se enlazan al HER3. Se pueden utilizar vectores de expresión tanto basados en virus como no virales, con el fin de producir los anticuerpos en una célula huésped de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episomales, típicamente con un casete de expresión para expresar una proteína o un ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, por ejemplo, Harrington y colaboradores (1997) Nat Genet 15: 345). Por ejemplo, los vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos que se enlazan al HER3 en células de mamífero (por ejemplo, humanas) incluyen pTioHis A, B y C, pcDNA3.1 /His, pEBVHis A, B y C, (Invitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV, y otros numerosos vectores conocidos en la materia para expresar otras proteínas. Los vectores virales útiles incluyen los vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus de Herpes, vectores basados en SV40, virus de papiloma, virus HBP Epstein Barr, vectores de virus de vacuna, y virus de Semliki Forest (SFV). Véanse, Brent y colaboradores (1995) supra ; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49: 807; y Rosenfeld y colaboradores (1992) Cell 68: 143.

La elección del vector de expresión depende de las células huésped pretendidas en las que se vaya a expresar el vector. Típicamente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadoras) que se enlacen operativamente a los pollnucleótidos que codifiquen una cadena o un fragmento de anticuerpo que se enlace al HER3. En algunas modalidades, se emplea un promotor inducible para prevenir la expresión de las secuencias insertadas, excepto bajo condiciones de inducción. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, arabinosa, lacZ, el promotor de metalotioneína, o un promotor de choque por calor. Los cultivos de los organismos transformados se pueden expandir bajo condiciones no inductoras sin forzar a la población para codificar secuencias cuyos productos de expresión sean mejor tolerados por las células huésped. En adición a los promotores, también se pueden requerir o desear otros elementos reguladores para la expresión eficiente de una cadena o un fragmento del anticuerpo que se enlace al HER3. Estos elementos típicamente incluyen un codón de inicio de ATG y el sitio de enlace de ribosoma adyacente, u otras secuencias. En adición, se puede mejorar la eficiencia de la expresión mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véanse, por ejemplo, Scharf y colaboradores (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125; y Bittner y colaboradores (1987) Meth. Enzymol. , 153: 516).

Por ejemplo, se puede utilizar el potenciador de SV40 o el potenciador de CMV para aumentar la expresión en células huésped de mamífero.

Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de secuencia de señal de secreción para formar una proteína de fusión con los polipéptidos codificados por las secuencias del anticuerpo que se enlaza al H ER3 insertadas. Más frecuentemente, las secuencias del anticuerpo que se enlaza al HER3 insertadas se enlazan a las secuencias de señales antes de incluirse en el vector. Los vectores para utilizarse con el fin de recibir las secuencias que codifiquen los dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo que se enlaza al HER3 algunas veces también codifican las regiones constantes o partes de las mismas. Estos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión, conduciendo las regiones constantes de esta manera a la producción de los anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Típicamente, estas regiones constantes son humanas.

Las células huésped para alojar y expresar las cadenas de anticuerpos que se enlazan al HER3 pueden ser ya sea procarióticas o bien eucarióticas. E. coli es un huésped procariótico útil para la clonación y expresión de los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para usarse incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonela, Serratia, y diferentes especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos, también se pueden hacer vectores de expresión, los cuales típicamente contienen secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). En adición, estará presente cualquier número de una variedad de promotores bien conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor a partir del fago lambda. Los promotores típicamente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de enlace al ribosoma y similares, para iniciar y realizar la transcripción y la traducción. También se pueden emplear otros microbios, tales como levadura, para expresar los polipéptidos que se enlazan al HER3 de la invención. También se pueden utilizar células de insectos en combinación con los vectores de baculovirus.

En algunas modalidades preferidas, se utilizan células huésped de mamífero para expresar y producir los polipéptidos que se enlazan al HER3 de la presente invención. Por ejemplo, pueden ser cualquiera de una línea celular de hibridoma que exprese los genes de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, el clon de hibridoma de mieloma 1 D6.C9, como se describe en los Ejemplos), o una línea celular de mamífero que aloje u vector de expresión exógeno (por ejemplo, las células de mieloma SP2/0 ejemplificadas más adelante). Éstas incluyen cualquier célula animal o humana mortal normal o normal o inmortal anormal. Por ejemplo, se han desarrollado un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de secretar las inmunoglobulinas intactas, incluyendo las líneas celulares CHO, diferentes líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma, células-B transformadas, e hibridomas. El uso del cultivo celular de tejido de mam ífero para expresar polipéptidos se discute en términos generales, por ejemplo, en Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Los vectores de expresión para las células huésped de mamífero pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, y un potenciador (véase, por ejemplo, Queen y colaboradores (1986) Immunol. Rev. 89: 49-68), y los sitios de información de procesamiento necesarios, tales como los sitios de enlace de ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias terminadoras de transcripción. Estos vectores de expresión usualmente contienen promotores derivados a partir de genes de mam ífero o a partir de virus de mamífero. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos del tipo de célula, específicos de la etapa, y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneína, el promotor tardío mayor de adenovirus constitutivo, el promotor de MMTV inducible por dexametasona, el promotor de SV40, el promotor de MRP pollll, el promotor constitutivo de MPSV, el promotor de CMV inducible por tetracielina (tal como el promotor de CMV humano inmediato-temprano), el promotor constitutivo de CMV, y las combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la materia.

Los métodos para introducir vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, comúnmente se utiliza la transfección con cloruro de calcio para las células procarióticas, mientras que se puede utilizar el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación para otros huéspedes celulares. (Véase en general Sambrook y colaboradores, supra). Otros métodos incluyen, por ejemplo, electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y micromyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión : ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión con la proteína estructural VP22 del virus de Herpes (Elliot y O'Hare, (1997) Cell 88: 223), absorción del ADN potenciada por el agente, y transducción ex vivo. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de las proteínas recombinantes, con frecuencia se deseará una expresión estable. Por ejemplo, se pueden preparar líneas celulares que expresen establemente las cadenas o los fragmentos de enlace de los anticuerpos que se enlazan al HER3, utilizando los vectores de expresión de la invención que contengan orígenes de replicación viral o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. En seguida de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento de las células que expresen con éxito las secuencias introducidas en el medio selectivo. Las células establemente transfectadas resistentes se pueden hacer proliferar utilizando las téenicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula. (ii) Generación de los anticuerpos monoclonales de la invención Los anticuerpos monoclonales (mAbs) se pueden producir mediante una variedad de téenicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas convencional de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256: 495. Se pueden emplear muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos-B.

Un sistema animal para la preparación de hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de los esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la materia. También se conocen los componentes de fusión (por ejemplo, las células de mieloma de murino) y los procedimientos de fusión.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal de murino preparado como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener a partir del hibridoma de murino de interés, y se diseña para contener secuencias de inmunoglobulina que no sean de murino (por ejemplo, humanas), utilizando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino se pueden enlazar a las regiones constantes humanas empleando los métodos conocidos en la téenica (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,816,567 a Cabilly y colaboradores). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de murino se pueden insertar en una estructura humana empleando los métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5225539 a Winter, y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5530101 ; 5585089; 5693762 y 6180370 a Queen y colaboradores En cierta modalidad, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra HER3 se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos portadores de partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema de ratón.. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones referidos en la presente como ratones HuMAb y ratones KM , respectivamente, y son colectivamente referidos en la presente como “ratones de Ig humana”.

El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humanas no reconfiguradas de cadena pesada (m y Y) y ligera K, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de cadena m y k (véase, por ejemplo, Lonberg y colaboradores (1994) Nature 368(6474): 856-859). De conformidad con lo anterior, los ratones exhiben una expresión reducida de IgM o k de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos de cadena pesada y ligera introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de IgGx humanos de alta afinidad (Lonberg y colaboradores (1994) supra ; revisado en Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 1 13: 49-101 ; Lonberg y Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding y Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546). La preparación y uso de ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas portadas por estos ratones, se describe además en Taylor y colaboradores (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen y colaboradores (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 94: 3720-3724; Choi y colaboradores (1993) Nature Genetics 4: 1 17-123; Chen y colaboradores (1993) EMBO J. 12: 821 -830; Tuaillon y colaboradores (1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Taylor y colaboradores (1994) International Immunology 579-591 ; y Fishwild y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 , el contenido de todos los cuales se incorpora específicamente a la presente como referencia en su totalidad. Veanse además, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,545,806; 5,569,825; 5,625, 126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661 ,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas a Lonberg y Kay; la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,545,807 a Surani y colaboradores; las Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 971 13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas a Lonberg y Kay; y la Publicación Internacional del TCP Número WO 01 /14424 a Korman y colaboradores En otra modalidad, los anticuerpos humanos de la invención se pueden reproducir utilizando un ratón portador de secuencias de inmunoglobulina humana sobre los transgenes y transcromosomas, tales como a ratón portador del transgén de cadena pesada humano y un transcromosoma de cadena ligera humano. Estos ratones, referidos en la presente como "ratones KM", se describen con detalle en la Publicación Internacional del TCP Número WO 02/43478 a Ishida y colaboradores Todavía además, en la materia están disponibles sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos que se enlazan al HER3 de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo referido como el Xeno-ratón (Abgenix, Inc.). Estos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,939,598; 6,075, 181 ; 6, 1 14,598; 6, 150,584 y 6, 162,963 a Kucherlapati y colaboradores Más aún, en la materia están disponibles los sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana, y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos que se enlazan al HER3 de la Invención. Por ejemplo, se pueden utilizar los ratones portadores de tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, referidos como "ratones TC"; estos ratones se describen en Tomizuka y colaboradores (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97: 722-727. Adicionalmente, en la téenica se han descrito reses portadoras de transcromosomas de cadena pesada y ligera humanas (Kurolwa y colaboradores (2002) Nature Biotechnology 20: 889-894), y se pueden utilizar para reproducir los anticuerpos que se enlazan al HER3 de la invención.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar empleando métodos de exhibición de fagos para rastrear bibliotecas de genes de inmunoglobullna humana. Estos métodos de exhibición de fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la materia o se describen en los Ejemplos más adelante. Véanse, por ejemplo: las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,223,409; 5,403,484; y 5,571 ,698 a Ladner y colaboradores; las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,427,908 y 5,580,717 a Dower y colaboradores; las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,969, 108 y 6, 172, 197 a McCafferty y colaboradores; y las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,885,793; 6,521 ,404; 6,544,731 ; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 a Griffiths y colaboradores Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando ratones SCID en los cuales se han reconstituido las células inmunitarias humanas, cuyas células inmunitarias humanas se han reconstituido de tal manera que se puede generar una respuesta de anticuerpo humano después de la inmunización. Estos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,476,996 y 5,698,767 a Wilson y colaboradores (¡ii) Diseño de Estructura o Fe Los anticuerpos diseñados de la invención incluyen aquéllos en donde se han hecho modificaciones a los residuos de estructura dentro de la VH y/o de la VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente estas modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un planteamiento es “retromutar” uno o más residuos de estructura hasta la secuencia de la línea germinal correspondiente. De una manera más específica, un anticuerpo que se ha sometido a una mutación somática puede contener residuos de estructura que difieran de la secuencia de la línea germinal a partir de la cual se derive el anticuerpo. Estos residuos se pueden identificar comparando las secuencias de estructura del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal a partir de las cuales se derive el anticuerpo. Con el fin de regresar a las secuencias de la región de estructura hasta su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden “retromutar” hasta la secuencia de la línea germinal, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio. Se pretende que estos anticuerpos “retromutados” también sean abarcados por la invención.

Otro tipo de modificación de estructura involucra mutar uno o más residuos dentro de la región de estructura, o incluso dentro de una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR), para remover los epítopos de células-T con el fin de reducir de esta manera la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este planteamiento también es referido como “desinmunización” y se describe con mayor detalle en la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 20030153043 por Carr y colaboradores En adición o de una manera alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones de estructura (FR) o de las regiones determinantes de complementariedad (CDR), los anticuerpos de la invención se pueden diseñar para incluir modificaciones dentro de la región Fe, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como vida media en suero, fijación del complemento, enlace al receptor de Fe, y/o citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, se pueden unir una o más fracciones químicas al anticuerpo), o se puede modificar para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe con mayor detalle más adelante. La numeración de los residuos en la región Fe es aquélla del índice de la Unión Europea de Kabat.

En una modalidad, la región de articulación de CH 1 se modifica de tal manera que se altere el número de residuos de cisteína en la región de articulación, por ejemplo, que aumente o disminuya. Este planteamiento se describe además en la Patente de los Estados Unidos de Norteamerica Número 5,677,425 por Bodmer y colaboradores; el número de residuos de cisteína en la región de articulación de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamble de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra modalidad, la región de articulación Fe de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. De una manera más específica, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfase del dominio CH2-CH3 del fragmento de Fc-articulación, de tal manera que el anticuerpo tenga un enlace deteriorado a la proteína A de Estafilococcilo (SpA) en relación con el enlace de SpA del dominio nativo de Fc-articulación. Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6, 165,745 por Ward y colaboradores En todavía otras modalidades, la región Fe se altera, mediante el reemplazo de cuando menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero que conserve la capacidad de enlace al antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector con el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fe o el componente de complemento C 1. Este planteamiento se describe con mayor detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter y colaboradores En otra modalidad, uno o más aminoácidos seleccionados a partir de los residuos de aminoácidos, pueden ser reemplazados con un residuo de aminoácido diferente, de tal manera que el anticuerpo tenga un enlace alterado de C 1 q y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o abolida. Este planteamiento se describe con mayor detalle en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,194,551 por Idusogie y colaboradores En otra modalidad, uno o más residuos de aminoácidos son alterados para alterar de esta manera la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este planteamiento se describe además en la Publicación Internacional del TCP Número WO 94/29351 por Bodmer y colaboradores En todavía otra modalidad, la región Fe se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy, mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Este planteamiento se describe además en la Publicación Internacional del TCP Número WO 00/42072 por Presta. Más aún, se han mapeado los sitios de enlace sobre la lgG 1 humana para FcyRI, FCYR I I , Fe g R I II y FcRn, y se han descrito las variantes con un mejor enlace (vease Shields y colaboradores (2001 ) J. Biol. Chen. 276: 6591 -6604).

En todavía otra modalidad, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante la alteración de uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de estructura de la región variable para eliminar de esta manera la glicosilación en ese sitio. Esta aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Este planteamiento se describe con mayor detalle en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,714,350 y 6,350,861 por Co y colaboradores Adicionalmente o de una manera alternativa, se puede hacer un anticuerpo que tenga un tipo de glicosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo, o un anticuerpo que tenga un aumento de las estructuras de bisección GIcNac. Se ha demostrado que estos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) de los anticuerpos. Estas modificaciones de carbohidratos se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante la expresión del anticuerpo en una celula huésped con una maqumaria de glicosilación alterada. Las células con una maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en este campo, y se pueden utilizar como células huésped en donde se expresen los anticuerpos recombinantes de la invención, para producir de esta manera un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, la Patente Europea Número EP 1 , 176, 195 por Hang y colaboradores, describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil-transferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en esta línea celular exhiben hipofucosilación. La Publicación Internacional del TCP Número WO 03/035835 por Presta describen una línea celular CHO variante, las células Lecl3, con una capacidad reducida para unir la fucosa a los carbohidratos enlazados con Asn(297), dando también como resultado la hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields y colaboradores (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La Publicación Internacional del TCP Número WO 99/54342 por Umana y colaboradores, describe líneas celulares diseñadas para expresar las glicosil-transferasas modificadoras de glicoproteína (por ejemplo, beta(1 ,4)-N acetil-glucosaminil-transferasa III (GnTIII)), de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares diseñadas exhiban un aumento de las estructuras de bisección GIcNac, lo cual da como resultado un aumento en la actividad de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) de los anticuerpos (vease también Umana y colaboradores (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180).

En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diferentes planteamientos. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 6,277,375 a Ward. De una manera alternativa, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo se puede alterar dentro de la región CH 1 o CL para contener un epítopo de enlace al receptor de salvamento tomado a partir de dos ciclos de un dominio CH2 de una región Fe de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,869,046 y 6, 121 ,022 por Presta y colaboradores (iv) Métodos para diseñar anticuerpos alterados Como se discute anteriormente, los anticuerpos que se enlazan al HER3 que tienen las secuencias VH y VL o las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa mostradas en la presente, se pueden utilizar para crear nuevos anticuerpos que se enlazan al HER3 mediante la modificación de las secuencias de cadena pesada y/o de cadena ligera de longitud completa, de las secuencias VH y/o VL, o de las regiones constantes unidas a las mismas. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se utilizan las características estructurales de un anticuerpo que se enlaza al HER3 de la invención para crear anticuerpos que se enlazan al HER3 estructuralmente relacionados que conserven cuando menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como el enlace al HER3 humano, y también la inhibición de una o más propiedades funcionales del HER3. Por ejemplo, una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de los mismos, se pueden combinar de una manera recombinante con las regiones de estructura conocidas y/o con otras regiones determinantes de complementariedad (CDRs), para crear anticuerpos que se enlazan al HER3 recombinantemente diseñados adicionales de la invención, como se discute anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquéllas descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de diseño es una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL proporcionadas en la presente, o una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las mismas. En su lugar, la información contenida en las secuencias se utiliza como el material de partida para crear secuencias de una “segunda generación” derivadas a partir de las secuencias originales, y entonces se preparan las secuencias de la “segunda generación", y se expresan como una proteína.

De conformidad con lo anterior, en otra modalidad, la invención proporciona un método para la preparación de un anticuerpo que se enlaza al HER3, el cual consiste en: una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2, 8, 20, 26, 38, 44, 56, 62, 74, 80, 92, 98, 1 10, 116, 128, 134, 146, 152, 164, 170, 182, 188, 200, 206, 218, 224, 236, 242, 254, 260, 272, 278, 290, 296, 308, 314, 326, 332, 344, 350, 362, y 368; una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 3, 9, 21 , 27, 39, 45, 57, 63, 75, 81 , 93, 99, 1 1 1 , 1 17, 129, 135, 147, 153, 165, 171 , 183, 189, 201 , 207, 219, 225, 237, 243, 255, 261 , 273, 279, 291 , 297, 309, 315, 327, 333, 345, 351 , 363, y 369; y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 4, 10, 22, 28, 40, 46, 58, 64, 75, 82, 94, 100, 1 12, 1 18, 130, 136, 148, 154, 166, 172, 184, 190, 202, 208, 220, 226, 238, 244, 256, 262, 274, 280, 292, 298, 310, 316, 328, 334, 346, 352, 364, y 370; y una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 5, 1 1 , 23, 29, 41 , 47, 59, 65, 77, 83, 95, 101 , 1 13, 1 19, 131 , 137, 149, 155, 167, 173, 185, 191 , 203, 209, 221 , 227, 239, 245, 257, 263, 275, 281 , 293, 299, 31 1 , 317, 329, 335, 347, 353, 365, y 371 ; una secuencia de CDR2 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 6, 12, 24, 30, 42, 48, 60, 66, 78, 84, 96, 102, 1 14, 120, 132, 138, 150, 156, 168, 174, 186, 192, 204, 210, 222, 228, 240, 246, 258, 264, 276, 282, 294, 300, 312, 318, 330, 336, 348, 354, 366, y 372; y/o una secuencia de CDR3 seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 7, 13, 25, 31 , 43, 49, 61 , 67, 79, 85, 97, 103, 1 15, 121 , 133, 139, 151 , 157, 169, 175, 187, 193, 205, 21 1 , 223, 229, 241 , 247, 259, 265, 277, 283, 295, 301 , 313, 319, 331 , 337, 349, 355, 367, y 373; alterar cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear cuando menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. La secuencia de anticuerpo alterada también se puede preparar mediante el rastreo de bibliotecas de anticuerpos que tengan secuencias de CDR3 fijas o determinantes de enlace esencial m ínimo, como se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US20050255552, y diversidad en las secuencias de CDR1 y CDR2. El rastreo se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier teenología de rastreo apropiada para el rastreo de anticuerpos a partir de bibliotecas de anticuerpos, tal como la tecnología de exhibición de fagos.

Se pueden emplear las técnicas convencionales de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. El anticuerpo codificado por las secuencias de anticuerpo alteradas es uno que conserva una, algunas, o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos que se enlazan a HER3 descritos en la presente, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a, enlazarse específicamente al HER3 humano y/o de cinomolgo; el anticuerpo se enlaza al HER3 y neutraliza la actividad biológica del MER3 mediante la inhibición de la actividad de señalización de HER en un ensayo de fosfo-HER.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados se pueden evaluar utilizando los ensayos convencionales disponibles en la materia y/o descritos en la presente, tales como aquéllos estipulados en los Ejemplos (por ejemplo, ELISAs).

En ciertas modalidades de los métodos de diseño de los anticuerpos de la invención, se pueden introducir mutaciones de una manera aleatoria o selectiva, junto con toda o parte de una secuencia de codificación de un anticuerpo que se enlaza al HER3, y se pueden rastrear los anticuerpos que se enlazan a HER3 modificados resultantes para determinar su actividad de enlace y/u otras propiedades funcionales, como se describe en la presente. Los métodos de mutación se han descrito en este campo. Por ejemplo, la Publicación Internacional del TCP Número WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y rastrear las mutaciones de anticuerpos utilizando mutagénesis de saturación, ensamble de ligamiento sintético, o una combinación de los mismos. De una manera alternativa, la Publicación Internacional del TCP Número WO 03/074679 por Lazar y colaboradores, describe métodos para utilizar métodos de rastreo por computadora para optimizar las propiedades físico-químicas de los anticuerpos.

Caracterización de los anticuerpos de la invención Los anticuerpos de la invención se pueden caracterizar mediante diferentes ensayos funcionales. Por ejemplo, se pueden caracterizar por su capacidad para neutralizar la actividad biológica mediante la inhibición de la señalización de HER en un ensayo de fosfo-HER, como se describe en la presente, por su afinidad con una proteína de HER3 (por ejemplo, HER3 humano y/o de cinomolgo), por el enlace al epítopo, por su resistencia a la proteólisis, y por su capacidad para bloquear la señalización corriente abajo de HER3. Se pueden emplear diferentes metodos para medir la señalización mediada por HER3. Por ejemplo, la senda de señalización de HER3 se puede monitorear mediante: (i) la medición de fosfo-HER3; (ii) la medición de la fosforilación de HER3 o de otras proteínas de señalización corriente abajo (por ejemplo, Akt); (iii) ensayos de bloqueo de ligando, como se describen en la presente; (iv) formación de heterodímero; (v) firma de expresión genética dependiente de HER3; (vi) internalización del receptor; y (vii) fenotipos celulares impulsados por HER3 (por ejemplo, proliferación).

La capacidad de un anticuerpo para enlazarse al HER3 se puede detectar marcando el anticuerpo de interés directamente, o el anticuerpo se puede desmarcar y se detecta el enlace indirectamente utilizando diferentes formatos de ensayo de emparedado conocidos en la materia.

En algunas modalidades, los anticuerpos que se enlazan al HER3 de la invención bloquean o compiten con el enlace de un anticuerpo que se enlace al HER3 de referencia, con un polipéptido o una proteína de HER3. Éstos pueden ser los anticuerpos que se enlazan al HER3 completamente humanos descritos anteriormente. También pueden ser otros anticuerpos que se enlacen al HER3 de ratón, quiméricos, o humanizados, que se enlacen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el enlace del anticuerpo de referencia indica que un anticuerpo que se enlaza al HER3 bajo prueba se enlaza al mismo epítopo o a un epítopo similar a aquél definido por el anticuerpo de referencia, o a un epítopo que está suficientemente próximo al epítopo enlazado por el anticuerpo que se enlaza al HER3 de referencia. Estos anticuerpos tienen probabilidades especiales de compartir las propiedades convenientes identificadas para el anticuerpo de referencia. La capacidad para bloquear o competir con el anticuerpo de referencia se puede determinar, por ejemplo, mediante un ensayo de enlace de competición. Con un ensayo de enlace de competición, el anticuerpo bajo prueba se examina para determinar su capacidad para inhibir el enlace específico del anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como un polipéptido o una proteína de HER3. Un anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia por el enlace específico al antígeno si un exceso del anticuerpo de prueba inhibe sustancialmente el enlace del anticuerpo de referencia. Inhibición sustancial significa que el anticuerpo de prueba reduce el enlace específico del anticuerpo de referencia usualmente por cuando menos el 10 por ciento, el 25 por ciento, el 50 por ciento, el 75 por ciento, o el 90 por ciento.

Hay un número de ensayos de enlace de competición conocidos que se pueden utilizar para evaluar la competición de un anticuerpo que se enlace al HER3, con el anticuerpo que se enlace al HER3 de referencia, para enlazarse a una proteína de HER3. Éstos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de emparedado (véase Stahli y colaboradores (1983) Methods in Enzymology 9: 242-253); inmunoensayo enzimático (EIA) directo de biotina-avidina en fase sólida (véase Kirkland y colaboradores (1986) J. Immunol. 137: 3614-3619); ensayo de marcado directo en fase sólida, ensayo de emparedado de marcado directo en fase sólida (véase Harlow y Lañe, supra ); radioinmunoensayo (RIA) de marcado directo en fase sólida utilizando la marca de 1-125 (véase Morel y colaboradores (1988) Molec. Immunol. 25: 7-15); inmunoensayo enzimático (EIA) directo de biotina-avidina en fase sólida (Cheung y colaboradores (1990) Virology 176: 546-552); y radioinmunoensayo (RIA) de marcado directo (Moldenhauer y colaboradores (1990) Scand. J. Immunol. 32: 77-82). Típicamente, este ensayo involucra el uso del antígeno purificado enlazado a una superficie sólida o a células portadoras de cualquiera de los mismos, un anticuerpo que se enlaza al HER3 de prueba no marcado, y un anticuerpo de referencia marcado. La inhibición competitiva se mide mediante la determinación de la cantidad de marca enlazada a la superficie sólida o a las células en la presencia del anticuerpo de prueba. Usualmente, el anticuerpo de prueba está presente en exceso. Los anticuerpos identificados mediante el ensayo de competición (anticuerpos competidores), incluyen los anticuerpos que se enlazan al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, y los anticuerpos que se enlazan a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo enlazado por el anticuerpo de referencia para que se presente el impedimento estérico.

Con el fin de determinar si los anticuerpos monoclonales que se enlazan al HER3 seleccionados se enlazan a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar utilizando los reactivos comercialmente disponibles (por ejemplo, los reactivos de Pierce, Rockford, IL). Los estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados, se pueden llevar a cabo utilizando placas de ELISA recubiertas con el polipéptido de HER3. El enlace de los anticuerpos monoclonales (mAb) biotinilados se puede detectar con una sonda de estreptavidina-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de un anticuerpo que se enlaza al HER3 purificado, se pueden llevar a cabo ELISAs de isotipos. Por ejemplo, los pozos de las placas de microtitulación se pueden recubrir con 1 microgramo/ mililitro de IgG anti-humano durante la noche a 4°C. Después del bloqueo con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento, las placas se hacen reaccionar con 1 microgramo/mililitro o menos del anticuerpo monoclonal que se enlaza al HER3 o de los controles de isotipos purificados, a temperatura ambiente, durante una a dos horas. Los pozos se pueden hacer reaccionar entonces con ya sea la I g G 1 humana o bien con las sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específicas de la IgM humana. Entonces se revelan las placas y se analizan de tal manera que se pueda determinar el isotipo del anticuerpo purificado.

Con el fin de demostrar el enlace de los anticuerpos monoclonales que se enlazan al HER3, a las celulas vivas que expresan un polipéptido de HER3, se puede utilizar citometría de flujo. Dicho de una manera breve, las líneas celulares que expresen la HER3 (cultivadas bajo condiciones de crecimiento convencionales) se pueden mezclar con diferentes concentraciones de un anticuerpo que se enlaza al HER3 en suero regulado con fosfato (PBS) que contenga albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1 por ciento y suero fetal de becerro al 10 por ciento, y se incuban a 4°C durante 1 hora. Después de lavarse, las células se hacen reaccionar con el anticuerpo de IgG anti-humano marcado con fluoresceína bajo las mismas condiciones que el teñido del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar mediante el instrumento FACScan utilizando las propiedades de dispersión de luz y lateral para dar compuerta a las células individuales. Se puede emplear un ensayo alternativo utilizando microscopía de fluorescencia (en adición a, o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células se pueden teñir exactamente como se describe anteriormente, y se pueden examinar mediante microscopía de fluorescencia. Este metodo permite hacer la visualización de las células individuales, pero puede una sensibilidad reducida, dependiendo de la densidad del antígeno.

Los anticuerpos que se enlazan al H ER3 de la invención se pueden probar adicionalmente para determinar su reactividad con un polipéptido de HER3 o un fragmento antigénico, mediante Western blot. Dicho de una manera breve, se pueden preparar polipéptidos o proteínas de fusión de HER3 purificados, o extractos celulares a partir de las células que expresen el H ER3, y se someten a electroforesis en gel de dodecil-sulfato de sodio / poliacrilamida. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero fetal de becerro al 10 por ciento, y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se vayan a probar. El enlace de la IgG humana se puede detectar utilizando IgG anti-humano / fosfatasa alcalina, y se revela con tabletas de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

Se pueden utilizar un número de lecturas para evaluar la eficacia y la especificidad de los anticuerpos de HER3 en ensayos basados en células de la formación de heterodímeros inducida por el ligando. La actividad se puede evaluar mediante uno o más de los siguientes: (i) Inhibición de heterodimerización de HER2 inducida por el ligando, con otros miembros de la familia EGF en una línea celular objetivo, por ejemplo, células de cáncer de mama MCF-7. La inmunoprecipitación de los complejos de HER2 a partir de los Usados celulares se puede llevar a cabo con un anticuerpo específico del receptor, y se puede analizar la ausencia/presencia de otros receptores de EGF y sus ligandos biológicamente relevantes dentro del complejo, en seguida de la electroforesis/transferencia Western, mediante el sondeo con anticuerpos para otros receptores de EGF. (ii) Inhibición de la activación de las sendas de señalización mediante los heterodímeros activados por el ligando. La asociación con HER3 parece ser una clave para otros miembros de la familia de receptores de EGF, para provocar la máxima respuesta celular en seguida del enlace del ligando. En el caso del HER3 defectuoso en cinasa, el HER2 proporciona un dominio de cinasa de tirosina funcional para hacer posible que se presente la señalización en seguida del enlace de los ligandos del factor de crecimiento. Por consiguiente, las células que co-expresen HER2 y HER3 se pueden tratar con el ligando, por ejemplo, herregulina, en ausencia y en la presencia del inhibidor, y se monitorea el efecto sobre la fosforilación de tirosina de HER3 mediante un número de formas, incluyendo inmunoprecipitación de HER3 a partir de los lisados celulares tratados y el subsiguiente Western blot utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina (véase Agus op. cit. para los detalles). De una manera alternativa, se puede desarrollar un ensayo de alta producción mediante el atrape de HER3 a partir de los lisados solubilizados sobre los pozos de una placa de 96 pozos recubierta con un anticuerpo anti-receptor HER3, y se mide el nivel de fosforilación de tirosina utilizando, por ejemplo, anticuerpos anti-fosfotirosina marcados con europio, como son incorporados por Waddleton y colaboradores (2002) Anal. Biochem. 309: 150-157.

En una extensión más amplia de este planteamiento, se pueden analizar directamente las moleculas efectoras que se sepa que son activadas corriente abajo de los heterodímeros del receptor activados, tales como las cinasas de proteína activadas por mitógeno (MAPK) y Akt, mediante inmunoprecipitación a partir de los lisados tratados, y haciendo la transferencia con los anticuerpos que detecten las formas activadas de estas proteínas, o mediante el análisis de la capacidad de estas proteínas para modificar/activar los sustratos específicos. (iii) Inhibición de la proliferación celular inducida por el ligando. Se sabe que una variedad de líneas celulares co-expresan combinaciones de receptores ErbB, por ejemplo, muchas líneas celulares de cáncer de mama y de próstata. Los ensayos se pueden llevar a cabo en formatos de 24/48/96 pozos, con la lectura basada alrededor de la síntesis del ADN (incorporación de timidina tritiada), incremento en el número de células (teñido de violeta cristal), etc.

Se pueden utilizar un número de lecturas para evaluar la eficacia y la especificidad de los anticuerpos de HER3 en ensayos basados en células de la formación de homo- y hetero-dímero independiente del ligando. Por ejemplo, la sobre-expresión de HER2 desencadena la activación del dominio de cinasa independiente del ligando como un resultado de la formación espontánea del dímero. El HER2 sobre-expresado genera ya sea homo- o hetero-dímeros con otras moleculas de HER, tales como HER1 , HER3 y HER4.

La capacidad de los anticuerpos o de los fragmentos de los mismos para bloquear el crecimiento in vivo de los xenomjertos de tumores de líneas celulares tumorales humanas, de las que se sabe que su fenotipo tumorigénico es cuando menos parcialmente dependiente de la activación de la señalización del heterodímero de HER3 mediante el ligando, por ejemplo, las células de cáncer pancreático BxPC3, etc. Ésta se puede evaluar en ratones inmunocomprometidos, ya sea solo o bien en combinación con un agente citotóxico apropiado para la línea celular en cuestión. Los ejemplos de los ensayos funcionales también se describen en la sección de Ejemplos más adelante.

Usos profilácticos y terapéuticos La presente invención proporciona métodos para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno asociado con la senda de señalización de HER3 mediante la administración a un sujeto que lo necesite, de una cantidad efectiva de los anticuerpos de la invención. En una modalidad específica, la presente invención proporciona un método para el tratamiento o la prevención de cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina de los nervios, schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostética benigna (BPH), ginecomastia y endometriosis), mediante la administración a un sujeto que lo necesite, de una cantidad efectiva de los anticuerpos de la invención. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de los cánceres asociados con una senda de señalización de HER, mediante la administración a un sujeto que lo necesite, de una cantidad efectiva de los anticuerpos de la invención.

En una modalidad específica, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de los cánceres asociados con una senda de señalización de HER que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores periféricos de la vaina de los nervios, schwanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna (BPH), ginecomastia, y endometriosis.

En una modalidad, la invención pertenece al tratamiento de cáncer esofágico utilizando los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos.

En una modalidad, la invención pertenece al tratamiento de hiperplasia prostática benigna (BPH), utilizando los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos. La hiperplasia prostática benigna (BPH) es una enfermedad común en los hombres mayores, que se caracteriza por un agrandamiento no neoplásico de la próstata que conduce a presión sobre la uretra y que da como resultado problemas de micción y de vejiga (Mahapokail W, van Sluijs FJ y Schalquen JA. 2,000 Prostate Cáncer and Prostatic Diseases 3, 28-33). Hay evidencia anatómica o microscópica de hiperplasia prostática benigna (BPH) presente en la autopsia en aproximadamente el 55 por ciento de los hombres de 60 a 70 años de edad. La resección transuretral de la próstata ha sido el tratamiento de elección durante muchos años. En consecuencia, la hiperplasia prostática benigna (BPH) es una de las razones más comunes para la intervención quirúrgica entre los hombres ancianos. Los métodos menos invasivos para el tratamiento incluyen: (i) Los bloqueadores alfa-1 (doxazosina, prazosina, tamsulosina, terazosina, y alfuzosina) son una clase de medicamentos también utilizados para tratar la alta presión sanguínea. Estos medicamentos relajan los músculos de la vejiga, el cuello y la próstata, permitiendo, por consiguiente, una micción más fácil. (ii) La finasterida y la dutasterida disminuyen los niveles de andrógeno, reduciendo, por consiguiente, el tamaño de la glándula próstata, aumentando la velocidad de flujo de la orina, y disminuyendo los síntomas de la hiperplasia prostática benigna (BPH). Puede tomar de 3 a 6 meses antes de que se observe una mejora en los síntomas. Los efectos secundarios potenciales relacionados con el uso de finasterida y dutasterida incluyen una disminución en el impulso sexual e impotencia.

Los resultados de la sección de Experimentos demuestran por primera vez que la hiperplasia prostática benigna (BPH) es una indicación dependiente de la neurregulina. El hallazgo también muestra que MOR10703 redujo significativamente el tamaño de la próstata en las ratas sexualmente maduras sin afectar a los niveles de hormonas, sugiriendo que MOR10703 podría ser útil para el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna (BPH).

Para probar adicionalmente MOR10703 y otros anticuerpos de HER3 como productos terapéuticos para la hiperplasia prostática benigna (BPH), se pueden trasplantar muestras quirúrgicas de hiperplasia prostática benigna (BPH) humana primaria en ratas o ratones atímicos, y se puede estudiar el efecto de los anticuerpos de HER3 utilizando modelos (Otto U y colaboradores, Urol Int 1992; 48: 167-170). De una manera alternativa, se pueden inducir algunos aspectos de la hiperplasia prostática benigna (BPH) en perros castrados por medio de la administración a largo plazo de 5a-androstano-3a, 17 b-d io I más estradiol, y se pueden probar los anticuerpos de HER3 en estos modelos caninos (Walsh PC, Wilson JD. J Clin Invest 1976; 57: 1093-1097).

En una modalidad, la invención pertenece al tratamiento de ginecomastia utilizando los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos. La manifestación física de la ginecomastia es el agrandamiento de la mama en los hombres, normalmente se presenta en ambas mamas, pero algunas veces puede ser en una solamente, conocida como ginecomastia asimetrica o unilateral. La ginecomastia es comúnmente causada por: (i) Niveles elevados de estrógeno que dan como resultado que llegue a desequilibrarse la proporción de la testosterona al estrógeno. (ii) Los antagonistas de andrógeno o los anti-andrógenos utilizados en el tratamiento de cáncer de próstata o de hiperplasia prostática benigna (BPH). Estos fármacos suprimen la testosterona pero cuando se suprime la testosterona, empieza a elevarse el estrógeno.

Aunque actualmente se están evaluando un número de fármacos experimentales, actualmente no existen tratamientos aprobados para la ginecomastia. En consecuencia, la ginecomastia se trata por medio de la remoción quirúrgica del tejido de la mama. La observación de que MOR10703 indujo atrofia irreversible de la glándula mamaria masculina indica que puede ser benéfico en el tratamiento de la ginecomastia.

Para probar adicionalmente que MOR 10703 y otros anticuerpos de HER3 para el tratamiento de ginecomastia humana, se pueden utilizar modelos de ginecomastia de ratón transgénico. Estos modelos se han desarrollado mediante la expresión de la aromatasa humana en la glándula mamaria del ratón, y recapitulan muchos aspectos de la ginecomastia humana (Li y colaboradores, Endocrinology 2002; 143: 4074-4083; Tekmal y colaboradores, Cáncer Res 1996; 56: 3180-318).

En una modalidad, la invención pertenece al tratamiento de ginecomastia utilizando los anticuerpos de HER3 o los fragmentos de los mismos. También se pueden examinar MOR10703 y otros anticuerpos de HER3 para el tratamiento de endometriosis, una condición ginecológica en donde aparecen células a partir del revestimiento del útero (endometrio) y florecen hacia afuera de la cavidad uterina. El síntoma principal, pero no universal, de la endometriosis es el dolor pélvico en diversas manifestaciones. Aunque no está bien caracterizada la causa subyacente de la endometriosis, se piensa que es dependiente de la presencia de estrógeno. Debido a que MOR10703 indujo atrofia endometrial en los ratones hembras dando como resultado una disminución en el peso del útero, se puede utilizar para tratar endometriosis. Con el fin de estudiar adicionalmente los efectos de MOR10703 y de otros anticuerpos de HER3 sobre la endometriosis, se puede implantar endometrio humano en la fase proliferativa en la cavidad peritoneal de los ratones atímicos con ciclo normal y ovariectomizados o en los ratones con ciclo diabeticos no obesos (NOD) con inmunodeficiencia grave combinada (SCID), y se pueden utilizar estos ratones SCID como modelos (Grummer y colaboradores, 2001. Human Reproduction; 16; 1736-1743).

Los anticuerpos de HER3 también se pueden utilizar para tratar o prevenir otros trastornos asociados con una señalización aberrante o defectuosa de HER, incluyendo, pero no limitándose a, enfermedades respiratorias, osteoporosis, osteoartritis, enfermedad de riñón poliquístico, diabetes, esquizofrenia, enfermedad vascular, enfermedad cardíaca, enfermedades proliferativas no oncogénicas, fibrosis, y enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer.

Los agentes adecuados para el tratamiento de combinación con anticuerpos que se enlazan al HER3 incluyen los agentes estándares de cuidado conocidos en la materia que son capaces de modular la senda de señalización de ErbB. Los ejemplos adecuados de los agentes estándares de cuidado para HER2 incluyen, pero no se limitan a, Herceptina y Tykerb. Los ejemplos adecuados de los agentes estándares de cuidado para EGFR incluyen, pero no se limitan a, Iressa, Tarceva, Erbitux y Vectibix. Otros agentes que pueden ser adecuados para el tratamiento de combinación con anticuerpos que se enlazan al HER3 incluyen, pero no se limitan a, aquéllos que modulan las cinasas de tirosina receptoras, receptores acoplados con proteína-G, la senda de transducción de señales de crecimiento/sobrevivencia, receptores de hormona nuclear, sendas apoptóticas, ciclo celular, y angiogenesis.

Usos de Diagnóstico En un aspecto, la invención abarca los ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de la proteína y/o del ácido nucleico de HER3, así como la función de la proteína de HER3, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido), o a partir de un individuo que padezca cáncer, o es en riesgo de desarrollar cáncer.

Los ensayos de diagnóstico, tales como los ensayos competitivos, se apoyan en la capacidad de un análogo marcado (el "rastreador") para competir con el analito de la muestra de prueba por al número limitado de sitios de enlace en un componente de enlace común. El componente de enlace en términos generales se insolubiliza antes o después de la competición, y entonces el rastreador y el analito enlazados al componente de enlace se separan del rastreador y el analito no enlazados. Esta separación se lleva a cabo mediante decantación (en donde el componente de enlace fue previamente insolubilizado) o mediante centrifugación (en donde el componente de enlace se precipitó después de la reacción competitiva). La cantidad de analito de la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de rastreador enlazado, como se mide por la cantidad de sustancia marcadora. Se preparan las curvas de respuesta a la dosis con cantidades conocidas del analito, y se comparan con los resultados de prueba, con el objeto de determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra de prueba. Estos ensayos se denominan como sistemas ELISA cuando se utilizan enzimas como los marcadores detectables. En un ensayo de esta forma, el enlace competitivo entre los anticuerpos y los anticuerpos que se enlazan al HER3, da como resultado la proteína de HER3 enlazada, de preferencia los epítopos de HER3 de la invención, que es una medida de los anticuerpos en la muestra de suero, más particularmente, de la neutralización de los anticuerpos en la muestra de suero.

Una ventaja significativa del ensayo es que se hace la medición de la neutralización de los anticuerpos directamente (es decir, aquéllos que interfieren con el enlace de la proteína de HER3, de una manera específica, los epítopos). Este ensayo, en particular en la forma de una prueba ELISA, tiene aplicaciones considerables en el medio ambiente clínico y en el rastreo de sangre de rutina.

Otro aspecto de la invención proporciona métodos para determinar la expresión del ácido nucleico de HER3 o la actividad de la proteína de HER3 en un individuo, para seleccionar de esta manera los agentes terapéuticos o profilácticos apropiados para ese individuo (referidos en la presente como "farmacogenómicos"). Los farmacogenómicos permiten hacer la selección de agentes (por ejemplo, los fármacos) para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo basándose en el genotipo del individuo (por ejemplo, el genotipo del individuo examinado para determinar la capacidad del individuo para responder a un agente particular).

Todavía otro aspecto de la invención pertenece al monitoreo de la influencia de los agentes (por ejemplo, los fármacos) sobre la expresión o actividad de la proteína de HER3 en los estudios clínicos.

Composiciones Farmacéuticas Para preparar las composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen los anticuerpos que se enlazan al HER3 (intactos o fragmentos de enlace), los anticuerpos que se enlazan al HER3 (intactos o fragmentos de enlace) se mezclan con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones adicionalmente pueden contener uno o más agentes terapéuticos diferentes que sean adecuados para el tratamiento o la prevención de cáncer (cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de pulmón, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer gástrico, cáncer pancreático, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, osteosarcoma, carcinoma de células escamosas, tumores de vaina de nervios periféricos schwannoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer esofágico, cáncer esofágico de Barretts, glioblastoma, sarcoma de células claras del tejido blando, mesotelioma maligno, neurofibromatosis, cáncer renal, melanoma, cáncer de próstata, hiperplasia prostática benigna (BPH), ginecomastia, y endometriosis).

Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mediante la mezcla con vehículos, excipientes, o estabilizantes fisiológicamente aceptables en la forma, por ejemplo, de polvos liofilizados, pastas acuosas, soluciones acuosas, lociones, o suspensiones (véase, por ejemplo, Hardman y colaboradores (2001 ) Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, N .Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, N .Y.; Avis y colaboradores (Editores) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman y colaboradores (Editores) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman y colaboradores (Editores) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, I n c . , N ueva York, N.Y.).

La selección de un régimen de administración para un producto terapéutico depende de varios factores, incluyendo el índice de rotación del suero o del tejido de la entidad, el nivel de los síntomas, la inmunogenicidad de la entidad, y la accesibilidad de las células objetivo en la matriz biológica. En ciertas modalidades, un régimen de administración maximiza la cantidad de producto terapéutico suministrado al paciente de una manera consistente con un nivel aceptable de efectos secundarios. De conformidad con lo anterior, la cantidad de producto biológico suministrado depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la condición que se esté tratando. Está disponible la guía para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos, citoqumas, y moléculas pequeñas (véase, por ejemplo, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido; Kresina (Editor) (1991 ) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y.; Bach (Editor) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y.; Baert y colaboradores (2003) New Engl. J. Med. 348: 601 -608; Milgrom y colaboradores (1999) New Engl. J. Med. 341 : 1966-1973; Slamon y colaboradores (2001 ) New Engl. J. Med. 344: 783-792; Beniam inovitz y colaboradores (2000) New Engl. J. Med. 342: 613-619; Ghosh y colaboradores (2003) New Engl. J. Med. 348: 24-32; Lipsky y colaboradores (2000) New Engl. J. Med. 343: 1594-1602).

La determinación de la dosis apropiada es hecha por el clínico, por ejemplo, utilizando parámetros o factores que se sepa o se sospeche en la materia que afectan al tratamiento o que se prediga que afectan al tratamiento. En términos generales, la dosis empieza con una cantidad un poco menor que la dosis óptima, y se incrementa mediante incrementos pequeños posteriormente hasta que se logre el efecto deseado u óptimo en relación con cualesquiera efectos secundarios negativos. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen aquéllas de los síntomas, por ejemplo, de la inflamación o del nivel de citoquinas inflamatorias producidas.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar como para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración particular, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o del éster, la sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, el índice de excreción del compuesto particular que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición , la salud general, y la historia médica previa del paciente que sea tratado, y de factores similares conocidos en la téenica médica.

Las composiciones que comprenden los anticuerpos o los fragmentos de los mismos de la invención, se pueden proporcionar mediante infusión continua, o mediante dosis a intervalos, por ejemplo, de un día, una semana, o de 1 a 7 veces por semana. La dosis se puede proporcionar intravenosamente, subcutáneamente, tópicamente, oralmente, nasalmente, rectalmente, intra muscularmente, intracerebralmente, o mediante inhalación. Un protocolo de dosificación específico es uno que involucra la dosis máxima o una frecuencia de dosificación que evite los efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total puede ser de cuando menos 0.05 microgramos/ kilogramo de peso corporal, de cuando menos 0.2 microgramos/ kilogramo, de cuando menos 0.5 microgramos/kilogramo, de cuando menos 1 microgramo/kllogramo, de cuando menos 10 microgramos/ kilogramo, de cuando menos 100 microgramos/kilogramo, de cuando menos 0.2 miligramos/kilogramo, de cuando menos 1 .0 miligramo/ kilogramo, de cuando menos 2.0 miligramos/kilogramo, de cuando menos 10 miligramos/kilogramo, de cuando menos 25 miligramos/ kilogramo, o de cuando menos 50 miligramos/kilogramo (véase, por ejemplo, Yang y colaboradores (2003) New Engl. J . Med. 349: 427-434; Herold y colaboradores (2002) New Engl. J. Med. 346: 1692-1698; Liu y colaboradores (1999) J . Neurol. Neurosurg. Psych. 67: 451 -456; Portielji y colaboradores (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52: 133-144). La dosis deseada de los anticuerpos o fragmentos de los mismos, es aproximadamente la misma que para un anticuerpo o polipéptido, sobre una base de moles/kilogramo de peso corporal. La concentración en plasma deseada de los anticuerpos o fragmentos de los mismos, es aproximadamente la misma que para un anticuerpo, sobre una base de moles/kilogramo de peso corporal. La dosis puede ser de cuando menos 15 microgramos, de cuando menos 20 microgramos, de cuando menos 25 microgramos, de cuando menos 30 microgramos, de cuando menos 35 microgramos, de cuando menos 40 microgramos, de cuando menos 45 microgramos, de cuando menos 50 microgramos, de cuando menos 55 microgramos, de cuando menos 60 microgramos, de cuando menos 65 microgramos, de cuando menos 70 microgramos, de cuando menos 75 microgramos, de cuando menos 80 microgramos, de cuando menos 85 microgramos, de cuando menos 90 microgramos, de cuando menos 95 microgramos, o de cuando menos 100 microgramos. Las dosis administradas a un sujeto pueden sumar cuando menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , o 12, o más.

Para los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, la dosificación administrada a un paciente puede ser de 0.0001 miligramos/ kilogramo a 100 miligramos/kilogramo del peso corporal del paciente. La dosificación puede ser de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 20 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 10 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 5 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 y 2 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 y 1 miligramo/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 0.75 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 0.5 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 miligramos/kilogramo y 0.25 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 y 0.15 miligramos/kilogramo, de entre 0.0001 y 0.10 miligramos/ kilogramo, de entre 0.001 y 0.5 miligramos/kilogramo, de entre 0.01 y 0.25 miligramos/kilogramo, o de entre 0.01 y 0.10 miligramos/ kilogramo del peso corporal del paciente.

La dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, se puede calcular utilizando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por las dosis que se vayan a administrar en miligramos/kilogramo. La dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, puede ser de 150 microgramos/kilogramo o menos, de 125 microgramos/kilogramo o menos, de 100 microgramos/kilogramo o menos, de 95 microgramos/ kilogramo o menos, de 90 microgramos/kilogramo o menos, de 85 microgramos/kilogramo o menos, de 80 microgramos/kilogramo o menos, de 75 microgramos/kilogramo o menos, de 70 microgramos/ kilogramo o menos, de 65 microgramos/kilogramo o menos, de 60 microgramos/kilogramo o menos, de 55 microgramos/kilogramo o menos, de 50 microgramos/kilogramo o menos, de 45 microgramos/ kilogramo o menos, de 40 microgramos/kilogramo o menos, de 35 microgramos/kilogramo o menos, de 30 microgramos/kilogramo o menos, de 25 microgramos/kilogramo o menos, de 20 microgramos/ kilogramo o menos, de 15 microgramos/kilogramo o menos, de 10 microgramos/kilogramo o menos, de 5 microgramos/kilogramo o menos, de 2.5 microgramos/kilogramo o menos, de 2 microgramos/ kilogramo o menos, de 1 .5 microgramos/kilogramo o menos, de 1 microgramo/kilogramo o menos, de 0.5 microgramos/kilogramo o menos, o de 0.5 microgramos/kilogramo o menos, del peso corporal del paciente.

La dosis unitaria de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, puede ser de 0.1 miligramos a 20 miligramos, de 0.1 miligramos a 15 miligramos, de 0.1 miligramos a 12 miligramos, de 0.1 miligramos a 10 miligramos, de 0.1 miligramos a 8 miligramos, de 0.1 miligramos a 7 miligramos, de 0.1 miligramos a 5 miligramos, de 0.1 a 2.5 miligramos, de 0.25 miligramos a 20 miligramos, de 0.25 a 15 miligramos, de 0.25 a 12 miligramos, de 0.25 a 10 miligramos, de 0.25 a 8 miligramos, de 0.25 miligramos a 7 miligramos, de 0.25 miligramos a 5 miligramos, de 0.5 miligramos a 2.5 miligramos, de 1 miligramo a 20 miligramos, de 1 miligramo a 15 miligramos, de 1 miligramo a 12 miligramos, de 1 miligramo a 10 miligramos, de 1 miligramo a 8 miligramos, de 1 miligramo a 7 miligramos, de 1 miligramo a 5 miligramos, o de 1 miligramo a 2.5 miligramos.

La dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, puede alcanzar una titulación en suero de cuando menos 0.1 microgramos/mililitro, de cuando menos 0.5 microgramos/mililitro, de cuando menos 1 microgramo/mililitro, de cuando menos 2 microgramos/mililitro, de cuando menos 5 microgramos/mililitro, de cuando menos 6 microgramos/mililitro, de cuando menos 10 microgramos/mililitro, de cuando menos 15 microgramos/mililitro, de cuando menos 20 microgramos/mililitro, de cuando menos 25 microgramos/mililitro, de cuando menos 50 microgramos/mililitro, de cuando menos 100 microgramos/mililitro, de cuando menos 125 microgramos/mililitro, de cuando menos 150 microgramos/mililitro, de cuando menos 175 microgramos/mililitro, de cuando menos 200 microgramos/mililitro, de cuando menos 225 microgramos/mililitro, de cuando menos 250 microgramos/mililitro, de cuando menos 275 microgramos/mililitro, de cuando menos 300 microgramos/mililitro, de cuando menos 325 microgramos/mililitro, de cuando menos 350 microgramos/mililitro, de cuando menos 375 microgramos/mililitro, o de cuando menos 400 microgramos/mililitro, en un sujeto. De una manera alternativa, la dosificación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, puede alcanzar una titulación en suero de cuando menos 0.1 microgramos/mililitro, de cuando menos 0.5 microgramos/mililitro, de cuando menos 1 microgramo/mililitro, de cuando menos 2 microgramos/mililitro, de cuando menos 5 microgramos/mililitro, de cuando menos 6 microgramos/mililitro, de cuando menos 10 microgramos/mililitro, de cuando menos 15 microgramos/mililitro, de cuando menos 20 microgramos/mililitro, de cuando menos 25 microgramos/mililitro, de cuando menos 50 microgramos/mililitro, de cuando menos 100 microgramos/mililitro, de cuando menos 125 microgramos/mililitro, de cuando menos 150 microgramos/mililitro, de cuando menos 175 microgramos/mililitro, de cuando menos 200 microgramos/mililitro, de cuando menos 225 microgramos/mililitro, de cuando menos 250 microgramos/mililitro, de cuando menos 275 microgramos/mililitro, de cuando menos 300 microgramos/mililitro, de cuando menos 325 microgramos/mililitro, de cuando menos 350 microgramos/mililitro, de cuando menos 375 microgramos/mililitro, o de cuando menos 400 microgramos/mililitro, en el sujeto.

Las dosis de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, se pueden repetir, y la administraciones se pueden separar por cuando menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, o por cuando menos 6 meses.

Una cantidad efectiva para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la condición que se trate, la salud global del paciente, el método, la vía, y la dosis de administración, y la gravedad de los efectos secundarios (véase, por ejemplo, Maynard y colaboradores (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Ratón, Fia.; Dent (2001 ) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, Reino Unido).

La vía de administración puede ser, por ejemplo, mediante aplicación tópica o cutánea, inyección o infusión intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intra-cerebro-espinal, intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida o mediante un implante (véase, por ejemplo, Sidman y colaboradores (1983) Biopolymers 22: 547-556; Langer y colaboradores (1981 ) J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277; Langer, (1982) Chem. Tech. 12: 98-105; Epstein y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 3688-3692; Hwang y colaboradores (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77: 4030-4034; las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,350,466 y 6,316,024). Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lidocaína, para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En adición, también se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y la formulación con un agente aerosolizante. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540, y 4,880,078; y las Publicaciones Internacionales del TCP Números WO 92/19244, Publicación I nternacional Número WO 97/32572, Publicación Internacional Número WO 97/44013, y Publicaciones Internacionales Números WO 98/31346 y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Una composición de la presente invención también se puede administrar por medio de una o más vías de administración utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la téenica. Como será apreciado por la persona experta, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración seleccionadas para los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal, u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La administración parenteral puede representar modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intra-peritoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. De una manera alternativa, una composición de la invención se puede administrar por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, ¡ntranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, se administran mediante infusión. En otra modalidad, la proteína multiespecífica de enlace al epítopo de la invención se administra subcutáneamente.

Si los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención se administran en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida, se puede utilizar una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véase Langer, supra Sefton, (1987) CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14: 20; Buchwald y colaboradores (1980) Surgery 88: 507; Saudek y colaboradores (1989) N. Engl. J. Med. 321 : 574). Se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (Editores), CRC Pres., Boca Ratón, Fia. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (Editores), Wilcy, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, (1983), J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61 ; véase también Levy y colaboradores, (1985), Science 228: 190; During y colaboradores, (1989), Ann. Neurol. 25: 351 ; Howard y colaboradores, (1989), J. Neurosurg. 7 1 : 105); Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,679,377; 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; 5, 128,326; Publicación Internacional del TCP Número WO 99/15154; y la Publicación Internacional del TCP Número WO 99/20253. Los ejemplos de los polímeros utilizados en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli-(metacrilato de 2-hidroxi-etilo), poli-(metacrilato de metilo), poli-(ácido acrílico), poli-(etileno-co-acetato de vinilo), poli-(ácido metacrílico), poli-glicólidos (PLG), poli-anhídridos, poli-(N-vinil-pirrolidona), poli-(alcohol vinílico), poli-acrilamida, poli-(etilenglicol), poli-láctidos (PLA), poli-(láctido-co-glicólidos) (PLGA), y poli-orto-ésteres. En una modalidad, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, está libre de impurezas lixiviables, es estable en el almacenamiento, estéril, y biodegradable. Un sistema de liberación controlada o sostenida se puede colocar en proximidad al objetivo profiláctico o terapéutico y, por consiguiente, se requiere solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, volumen 2, páginas 1 15-138 (1984)).

Los sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer ((1990), Science 249: 1527-1533). Se puede emplear cualquier téenica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención. Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,526,938, la Publicación Internacional del TCP Número WO 91/05548, la Publicación Internacional del TCP Número WO 96/20698, Ning y colaboradores, (1996), Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song y colaboradores (1995) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397, Cleek y colaboradores (1997) Pro. Int'l. Symp. Control. Reí. Bioact. Mater. 24: 853-854, y Lam y colaboradores (1997) Proc. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24: 759-760, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Si los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención se administran tópicamente, se pueden formular en la forma de un ungüento, crema, parche transdermico, loción, gel, champú, aspersión, aerosol, solución, emulsión, u otra forma bien conocida por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a Edición, Mack Pub. Co. , Easton, Pa. (1995). Para las formas de dosificación tópicas no rociables, típicamente se emplean formas viscosas a semi-sólidas o sólidas que comprendan un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica, y que tengan una viscosidad dinámica, en algunas instancias, mayor que la del agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, bálsamos, y similares, los cuales, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares (por ejemplo, conservadores, estabilizantes, agentes humectantes, reguladores del pH, o sales) para tener influencia sobre las diferentes propiedades, tales como, por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas de dosificación tópicas adecuadas incluyen preparaciones en aerosol rociables en donde el ingrediente activo, en algunas instancias, en combinación con un vehículo inerte sólido o líquido, se empaca en una mezcla con un agente volátil presurizado (por ejemplo, un propelente gaseoso, tal como freón) o en una botella apretable. También se pueden agregar humedecedores o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación si se desea. Los ejemplos de estos ingredientes adicionales son bien conocidos en este campo.

Si las composiciones que comprenden los anticuerpos o los fragmentos de los mismos, se administran intranasalmente, se pueden formular en una forma de aerosol, aspersión, niebla, o en la forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para usarse de acuerdo con la presente invención se pueden suministrar de una manera conveniente en la forma de una presentación de aspersión en aerosol a partir de paquetes presurlzados o de un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado (por ejemplo, dicloro-difluoro-metano, tricloro-fluoro-metano, dicloro-tetrafluoro-etano, dióxido de carbono, u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unida de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos (compuestos, por ejemplo, de gelatina), para utilizarse en un inhalador o insuflador, conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Los métodos para su co-administración o el tratamiento con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, una citoquma, esteroide, agente quimioterapéutico, antibiótico, o radiación, se conocen en la téenica (véase, por ejemplo, Hardman y colaboradores (Editores) (2001 ) Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a Edición, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Poole y Peterson (Editores) (2001 ) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams y Wilkins, Fila., Pa.; Chabner y Longo (Editores) (2001 ) Cáncer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams y Wilkins, Fila., Pa.). Una cantidad efectiva del producto terapéutico puede disminuir los síntomas por cuando menos el 10 por ciento; por cuando menos el 20 por ciento; por cuando menos aproximadamente el 30 por ciento; por cuando menos el 40 por ciento, o por cuando menos el 50 por ciento.

Se pueden administrar terapias adicionales (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos), las cuales se pueden administrar en combinación con los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, con menos de 5 minutos de separación, con menos de 30 minutos de separación, con 1 hora de separación, con aproximadamente 1 hora de separación, con aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas de separación, con aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de separación, con aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de separación, con aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de separación, con aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de separación, con aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de separación, con aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de separación, con aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de separación, con aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de separación, con aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de separación, con aproximadamente 1 1 horas a aproximadamente 12 horas de separación, con aproximadamente 12 horas a 18 horas de separación, con 18 horas a 24 horas de separación, con 24 horas a 36 hora de separación, con 36 horas a 48 horas de separación, con 48 horas a 52 horas de separación, con 52 horas a 60 horas de separación, con 60 horas a 72 horas de separación, con 72 horas a 84 horas de separación, con 84 horas a 96 horas de separación, o con 96 horas a 120 horas de separación de los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención. Las dos o más terapias se pueden administrar dentro de una misma cita del paciente.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención y las otras terapias se pueden administrar cíclicamente. La terapia cíclica involucra la administración de una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguida por la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, opcionalmente, seguida por la administración de una tercera terapia (por ejemplo, un tercer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, y así sucesivamente, y repitiendo esta administración en secuencia, es decir, el ciclo, con el objeto de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias, con el fin de evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o para mejorar la eficacia de las terapias.

En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención se pueden formular para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Con el objeto de asegurar que los compuestos terapeuticos de la invención crucen la barrera hematoencefálica (BBB) (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para conocer los métodos para la elaboración de liposomas, véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,522,811 ; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que sean selectivamente transportadas hacia dentro de células u órganos específicos y, por consiguiente, mejoren el suministro dirigido del fármaco (véase, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Las fracciones de dirección de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,416,016 a Low y colaboradores); manosidas (Umezawa y colaboradores (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (Bloeman y colaboradores (1995) FEBS Lett. 357: 140; Owais y colaboradores (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor tensoactivo de proteína A (Briscoe y colaboradores (1995) Am . J. Physiol. 1233: 134); página 120 (Schreier y colaboradores (1994) J. Biol. Chem . 269: 9090); vease también K. Keinanen; M . L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.

La invención proporciona protocolos para la administración de la composición farmacéutica que comprende los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, solos o en combinación con otras terapias, a un sujeto que lo necesite. Las terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente invención se pueden administrar de una manera concomitante o en secuencia a un sujeto. La terapia (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente invención también se pueden administrar cíclicamente. La terapia cíclica involucra la administración de una primera terapia (por ejemplo, un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguida por la administración de una segunda terapia (por ejemplo, un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, y repitiendo esta administración en secuencia, es decir, el ciclo, con el objeto de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias (por ejemplo, los agentes) con el fin de evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias (por ejemplo, los agentes), y/o para mejorar, la eficacia de las terapias.

Las terapias (por ejemplo, los agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la invención se pueden administrar a un sujeto de una manera concurrente. El término "de una manera concurrente" no se limita a la administración de las terapias (por ejemplo, los agentes profilácticos o terapéuticos) exactamente al mismo tiempo, sino que en su lugar, esto significa que la composición farmacéutica, la cual comprende los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención, se administra a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo, de tal manera que los anticuerpos de la invención puedan actuar junto con las otras terapias, para proporcionar un mayor beneficio que si se administraran de otra manera. Por ejemplo, cada terapia se puede administrar a un sujeto al mismo tiempo o en secuencia en cualquier orden en diferentes puntos del tiempo; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, se deben administrar suficientemente cerca en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada terapia se puede administrar a un sujeto por separado, en cualquier forma apropiada, y por cualquier vía adecuada. En diferentes modalidades, las terapias (por ejemplo, los agentes profilácticos o terapéuticos) se administran a un sujeto con menos de 15 minutos, con menos de 30 minutos, con menos de 1 hora de separación, con aproximadamente 1 hora de separación, con aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas de separación, con aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de separación, con aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de separación, con aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de separación, con aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de separación, con aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de separación, con aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de separación, con aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de separación, con aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de separación, con aproximadamente 10 horas a aproximadamente 1 1 horas de separación, con aproximadamente 1 1 horas a aproximadamente 12 horas de separación, con 24 horas de separación, con 48 horas de separación, con 72 horas de separación, o con 1 semana de separación. En otras modalidades, las dos o más terapias (por ejemplo, agentes profilácticos o terapéuticos) se administran dentro de una misma cita del paciente.

Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación se pueden administrar a un sujeto en la misma composición farmacéutica. De una manera alternativa, los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación se pueden administrar de una manera concurrente a un sujeto en composiciones farmacéuticas separadas. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar a un sujeto por la misma o diferentes vías de administración.

Habiéndose descrito completamente la invención, se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y reivindicaciones, los cuales son ilustrativos y no pretenden ser adicionalmente limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Metodos, Materiales y Rastreo de Anticuerpos (i) Líneas celulares Las líneas celulares BXPC-3, SK-Br-3, BT-474, MDA-MB-453, FaDu y MCF-7 se adquirieron en ATCC y se mantuvieron rutinariamente en un medio de crecimiento complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento. (ii) Generación de Vectores de HER3 Recombinantes Humano, de Cinomolgo, de Ratón, y de Rata El dominio extracelular de HER3 de murino se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc de cerebro de ratón (Clontech), y se verificó la secuencia mediante una comparación con Refseq NM_010153. Rata HER3 ECD se transcribió inversamente a partir del ARNm de células de Rata-2, y se verificó la secuencia mediante una comparación con NM_017218. Se generó la plantilla de ADNc de HER3 de cinomolgo utilizando ARN a partir de diferentes tejidos de cinomolgo (Zyagen Laboratories), y el producto de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) se clonó en pCR®-TOPO-XL (Invitrogen) antes de la secuenciación de ambas cadenas. El HER3 humano se derivó a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano (Source), y se verificó la secuencia mediante una comparación con NM_001982.

Para generar las proteínas recombinantes marcadas, el HER3 humano, de ratón, de rata, y de cinomolgo se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando polimerasa Pwo Taq (Roche Diagnostics). Los productos amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se purificaron en gel y se clonaron en un vector de entrada Gateway pDonR201 (Invitrogen) que se había modificado anteriormente para incluir una secuencia líder CD33 N-terminal dentro del marco y un TAG C-terminal, por ejemplo, FLAG TAG. El TAG permite la purificación de las proteínas monoméricas por medio de un anticuerpo monoclonal anti-TAG. Los genes objetivo se flanquearon con AttB 1 y AttB2, permitiendo la recombinación en los vectores de destino registrados adaptados por Gateway (por ejemplo, pcDNA3.1 ), utilizando la teenología de clonación Gateway® (Invitrogen). Las reacciones de recombinación se llevaron a cabo utilizando una reacción LR Gateway con vectores de destino registrados que contenían un promotor CMV, para crear los vectores de expresión de TAG, aunque se puede utilizar cualquier vector comercialmente disponible.

Se generaron otras proteínas de HER3 recombinantes que se fusionaron con el ECD de HER3 corriente arriba de un sitio de disociación del Factor X C-terminal y la articulación de IgG humana y el dominio Fe, para crear una proteína marcada por Fe. Para lograr esto, las diferentes ECDs del HER3 se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y se clonaron en un vector (por ejemplo, pcDNA3.1 ) modificado para contener una fusión C-terminal dentro del marco del sitio del Factor X-Articulación-hFc. El marco de lectura abierta generado se flanqueó con los sitios AttB1 y AttB2 para su clonación adicional con la teenología de clonación recombinante Gateway® (Invitrogen). Se utilizó una reacción LR Gateway para transferir el HER3-Fc hasta una construcción de expresión de destino que contenía un promotor CMV. Se generaron construcciones de expresión de mutación puntual de HER3 empleando los protocolos convencionales de mutagenesis dirigida al sitio, y se verificaron las secuencias de los vectores resultantes.

Tabla 8 Generación de vectores de expresión de HER3. La numeración de aminoácidos de HER3 se basa en NP_001973 (humana), NP_034283 (ratón), y NP_058914 (rata). (iii) Expresión de Proteínas de HER3 Recombinante Las proteínas recombinantes de HER3 deseadas se expresaron en las líneas celulares derivadas de HEK293 previamente adaptadas al cultivo en suspensión, y se hicieron crecer en un medio sin suero registrado de Novartis. La verificación de la expresión a pequeña escala se emprendió en ensayos de transfección transitoria de placa de 6 pozos con base en lipofección. La producción de proteína a gran escala por medio de transfección transitoria se llevó a cabo en la escala de 10 a 20 litros en el sistema de bio-reactor WaveMR (Wave Biotech). Se utilizó Polietilenimina de ADN (Polisciences) como un portador de plásmido en una proporción de 1 :3 (peso:peso). Los sobrenadantes del cultivo celular se cosecharon a los 7-10 días despues de la transfección, y se concentraron mediante filtración de flujo cruzado y diafiltración antes de la purificación. (iv) Purificación de Proteína Marcada Las proteínas de HER3 marcadas recombinantes (por ejemplo, TAG-HER3) se purificaron recolectando el sobrenadante de cultivo celular y concentrando 10 veces mediante filtración de flujo cruzado con un filtro de corte de 10 kDa (Fresenius). Se preparó una columna de anti-TAG mediante el acoplamiento de un anticuerpo monoclonal anti-TAG a Sepharose 4B activada por CNBr en una proporción final de 10 miligramos de anticuerpo por mililitro de resina. El sobrenadante concentrado se aplicó a una columna de 35 mililitros de anti-Tag a una velocidad de flujo de 1 a 2 mililitros/minuto. Después de lavar la línea de base con PBS, el material enlazado se eluyó con glicina 100 mM (pH de 2.7), se neutralizó, y se filtró para esterilizarse. Las concentraciones de proteína se determinaron midiendo la absorbencia a 280 nanómetros y se convirtieron utilizando un factor de conversión teórica de 0.66 AU/mg. La proteína purificada se caracterizó finalmente mediante SDS-PAGE, secuenciación N-terminal, y LC-MS. (v) Purificación de Marca Fe El sobrenadante de cultivo celular concentrado se aplicó a una columna de Flujo Rápido de Sepharose de 50 mililitros de Proteína A, a una velocidad de flujo de 1 mililitro/minuto. Despues del lavado de la línea base con PBS, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de NaH2P04 10 mM / 30 por ciento (volumen/volumen) de isopropanol, pH de 7.3, seguidos por 5 volúmenes de columna de PBS. Finalmente, el material enlazado se eluyó con Citrato 50 mM / NaCI 140 mM (pH de 2.7), se neutralizó, y se esterilizó mediante filtración. (vi) Generación de líneas celulares que se sobre-expresan Para generar una línea celular que expresara altos niveles de HER3 sobre la superficie celular, se construyó un vector de expresión de mamífero que contenía un inserto que codificaba para una secuencia líder CD33 corriente arriba de los residuos de aminoácidos 20-667 del HER3 humano fusionado dentro del marco a los residuos de aminoácidos 669-1210 del EGFR humano. Cuando se expresa en células de mamífero, la proteína quimérica resultante contiene un dominio extracelular y transmembrana de HER3 N- terminal, y un dominio citoplasmático de EGFR C-terminal. El vector de HER3 / 1 se transfectó en células CHO-S (Invitrogen), y se generaron reservas estables en seguida de la selección de antibióticos. La línea celular resultante (CHO HER3 / 1 ) expresó altos niveles del dominio extracelular de HER3 sobre su superficie celular. (vii) Paneos de HuCAL GOLD® Para la selección de anticuerpos que reconocen el HER3 humano, se emplearon múltiples estrategias de paneo. Los anticuerpos terapéuticos contra la proteína de HER3 humano se generaron mediante la selección de clones que tenían altas afinidades de enlace, utilizando como la fuente de las proteínas variantes de anticuerpos, una biblioteca de exhibición de fagos comercialmente disponible, la biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®. La biblioteca de fagémidos se basa en el concepto HuCAL® (Knappik y colaboradores (2000), J Mol Biol 296: 57-86), y emplea la teenología CysDisplay® para la exhibición de los fragmentos Fab sobre la superficie del fago (Publicación Internacional Número W001 /05950 a Lohning).

Para el aislamiento de los anticuerpos anti-HER3, se llevaron a cabo estrategias de paneo estándares así como RapMAT, utilizando planteamientos de paneo de células enteras en fase sólida, en solución, de células enteras, y diferencial. (viii) Paneo en fase sólida Para identificar los anticuerpos anti-HER3, se llevaron a cabo una variedad de estrategias de paneo en fase sólida utilizando diferentes proteínas de HER3 recombinantes. Para llevar a cabo cada ronda de paneo en fase sólida, las placas Maxisorp (Nunc) se recubrieron con proteína de HER3. Las proteínas marcadas fueron capturadas usando placas previamente recubiertas con anticuerpo anti-Fc (o IgG de cabra o de ratón anti-humano, Jackson Immuno Research), anticuerpo anti-Tag, o mediante adsorción pasiva. Las placas recubiertas se lavaron con PBS y se bloquearon. Las placas recubiertas se lavaron dos veces con PBS antes de la adición de los fagos-anticuerpos HuCAL GOLD ® durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador. Los fagos enlazados se eluyeron y se añadieron a TG-1 de E. coli, y se incubaron para la infección de fagos. Posteriormente, las bacterias infectadas se aislaron y se cultivaron sobre placas de agar. Las colonias se rasparon de las placas y los fagos se rescataron y se amplificaron. Cada estrategia de paneo de HER3 comprendió rondas individuales de paneo y contenía antígenos únicos, las concentraciones de antígenos, y la restringencia del lavado. (ix) Paneo en fase de solución Cada ronda de paneo en fase de solución se llevó a cabo utilizando diversas proteínas de HER3 recombinantes biotiniladas en la presencia o en ausencia de neurregulina 1 -b 1 (R & D Systems). Las proteínas se biotinilaron utilizando el kit de biotinilación EZ-link sulfo-NHS-LC (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 800 microlitros de perlas magneticas enlazadas a estreptavidina (Dynabeads, Dynal) se lavaron una vez con PBS y se bloquearon durante la noche con Chemiblocker (Chemicon). Los fagos-anticuerpos HuCAL GOLD® y el HER3 biotin Nado apropiado se incubaron en un tubo de reacción. Las perlas magneticas de estreptavidina se agregaron durante 20 minutos y se recolectaron con un separador de partículas magnéticas (Dynal). Los fagos enlazados se eluyeron a partir de las Dynabeads mediante la adición de regulador que contenía DTT a cada tubo, y se agregaron a E. cotí TG-1. La infección del fago se llevó a cabo de una manera idéntica a la descrita en el paneo en fase sólida. Cada estrategia de paneo de HER3 estuvo comprendida de rondas individuales de paneo y contuvo antígenos únicos, las concentraciones de antígenos, y la restringencia del lavado. ( x ) Paneo basado en células Para los paneos de células, los fagos-anticuerpos HuCAL GOLD® se incubaron con aproximadamente 107 células sobre un aparato giratorio durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por centrifugación. El aglomerado celular fue aislado, y se eluyeron los fagos de las células Se recolectó el sobrenadante y se agregó al cultivo de E. cotí TG-1 , continuando con el proceso descrito anteriormente. Se emplearon dos estrategias basadas en células para identificar los anticuerpos anti-HER3: a) Paneo de células enteras: En esta estrategia se usaron una variedad de líneas celulares intactas como los antígenos. b) Paneo diferencial de células enteras: En esta estrategia, los antígenos consistieron secuencialmente en células y proteínas recombinantes de HER3 (véase 1981.09 como un ejemplo). Los paneos basados en células se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente, mientras que se emplearon los protocolos de paneo en fase sólida cuando se utilizaron las proteínas recombinantes como antígenos. Los lavados se realizaron usando PBS (2-3X) y PBST (2-3X). (xi) Generación de biblioteca RapMA TMR y paneos Con el fin de aumentar la afinidad de enlace del anticuerpo mientras que se mantenía la diversidad de la biblioteca, se introdujo la producción de la segunda ronda de paneos tanto en fase de solución como en fase sólida, en el proceso RapMATMR, mientras que se introducía la producción de la tercera ronda de las estrategias de paneo de células enteras y de diferencial de células enteras (Prassler y colaboradores (2009) Immunotherapy; 1 : 571-583. Las bibliotecas RapMATMR se generaron mediante la subclonación de los insertos que codificaban Fab de los fagos seleccionados a través del paneo en el vector de exhibición pMORPH® 25_bla_LHC, y se digirieron adicionalmente para generar ya sea las bibliotecas H-CDR2 RapMATMR o las bibliotecas L-CDR3 RapMATMR utilizando enzimas de restricción específicas Las inserciones fueron reemplazadas con los casetes de maduración TRIM (Virnekas y colaboradores (1994) Nucleic Acids Research 22: 5600-5607) para H-CDR2 o L-CDR3 de acuerdo con la composición de la reserva. Se estimó que los tamaños de biblioteca estuvieron en el intervalo de entre 8x106 - 1 x108 clones Se produjeron anticuerpos-fagos RapMAT, y se sometieron a dos rondas adicionales de paneo en solución, en fase sólida, o basado en celulas, empleando los métodos experimentales descritos anteriormente.

Ejemplo 2: Expresión transitoria de IqGs anti-HER3 Las células HEK293-6E adaptadas en suspensión se cultivaron en un BioWave20 a una densidad de aproximadamente 2x106 células viables/mililitro. Las células se transfectaron transitoriamente con la mezcla estéril relevante de ADN:PEI y se cultivaron adicionalmente. Siete días después de la transfección, las células se retiraron por filtración de flujo cruzado usando filtros Fresenius (0.2 mieras). El material libre de células se concentró mediante filtración de flujo cruzado usando un filtro de corte de 10 kDa (Fresenius), y el concentrado se esterilizó por filtración a través de un filtro Stericup (0.22 mieras). El sobrenadante estéril se guardó a 4°C.

Ejemplo 3: Purificación de laG anti-HER3 La purificación de IgG se hizo en un sistema de cromatografía ÁKTA 100 Explorer Air a 6°C en una cabina de enfriamiento, usando una columna XK16/20 con 25 mililitros de resina MabSelect SuRe auto-empaquetada (todo de GE Healthcare). Todas las velocidades de flujo fueron de 3.5 mililitros/minuto, excepto la carga, a un límite de presión de 5 bar. La columna se equilibró con 3 volúmenes de columna de suero regulado con fosfato (PBS) antes de cargar el sobrenadante de fermentación filtrado a 2.0 mililitros/minuto. La columna se lavó con 8 volúmenes de columna de suero regulado con fosfato (PBS). La IgG se eluyó con un gradiente de pH , empezando con citrato 50 mM / NaCI 70 mM (pH de 4.5), yendo linealmente hacia abajo en 12 volúmenes de columna con citrato 50 mM / NaCI 70 mM (pH de 2.5), seguido por un paso constante de 2 volúmenes de columna del mismo regulador de pH de 2.5. Las fracciones que contenían IgG se reunieron e inmediatamente se neutralizaron y se esterilizaron por filtración (Millipore Steriflip, 0.22 mieras). Se midió la D028O y se calculó la concentración de proteína basándose en los datos de la secuencia. Las fracciones reunidas se probaron separadamente para determinar la aglomeración (SEC-MALS) y la pureza (SDS-PAGE y MS).

Ejemplo 4: Expresión v purificación de anticuerpos HuCAL®-Fab en E. cob La expresión de los fragmentos Fab codificados por pMORPH®X9_Fab_MH en celulas TG-1 se hizo en cultivos de matraz agitado usando 500 mililitros del medio YT 2x complementado con 34 microgramos/mililitro de cloranfenicol. Los cultivos se agitaron a 30°C hasta que la D060onm alcanzó 0.5. La expresión se indujo agregando IPTG (isopropil- -D-tiogalactopiranosida) 0.75 mM durante 20 horas a 30°C. Las células se rompieron usando lisozima. Los fragmentos Fab con marca de His6 se aislaron por medio de IMAC (Bio-Rad). El regulador se intercambió a suero regulado con fosfato (PBS) de Dulbecco 1 x (pH de 7.2) usando columnas PD10. Las muestras se esterilizaron por filtración (0.2 mieras). Las concentraciones de proteína se determinaron mediante espectrofotometría UV. La pureza de las muestras se analizó en SDS al 15 por ciento-PAGE desnaturalizante reductora. La homogeneidad de las preparaciones de Fab se determinó en estado nativo mediante cromatografía de exclusión de tamaños (HP-SEC) con estándares de calibración.

Ejemplo 5: Mediciones de la afinidad (Kn) del anticuerpo de HER3 por medio de titulación de la solución en equilibrio (SET) La determinación de la afinidad en solución se hizo esencialmente como se describió anteriormente (Friguet y colaboradores (1985), J Immunol Methods 77: 305-19). Para mejorar la sensibilidad y exactitud del metodo SET, se transfirió del ELISA clásico hasta la teenología basada en ECL (Haenel y colaboradores (2005), Anal Biochem 339: 182-84).

Para la determinación de la afinidad mediante SET se usó HER3-Tag no marcada (de humano, rata, ratón o mono cinomolgo).

Los datos se evaluaron con el software Xlfit (ID Business Solutions) aplicando modelos de ajuste adaptados particularmente. Para la determinación de la KD de cada IgG se usó el siguiente modelo (modificado de acuerdo con Piehler y colaboradores (Piehler y colaboradores (1997) J Immunol Methods 201 : 189-206).

[IgG]: concentración total de IgG aplicada x: concentración total de antígeno soluble aplicado (sitios de enlace).

Bmax: señal máxima de IgG sin antígeno.

KD: afinidad.

Ejemplo 6: Determinación del enlace de celula-anticuerpo por medio de FACS El enlace de los anticuerpos al antígeno humano endógeno expresado sobre células de cáncer humanas se evaluó mediante FACS. Para determinar los valores de CE50 del anticuerpo, las células SK-Br-3 se cosecharon con acutasa y se diluyeron a 1 x 106 células/mililitro en regulador FACS (PBS/3% FBS/0.2% NaN3). Se agregaron 1 x 105 células/pozo a cada pozo de una placa de 96 pozos (Nunc), y se centrifugaron a 210 g durante 5 minutos a 4°C antes de remover el sobrenadante. Se agregaron diluciones seriadas de los anticuerpos de prueba (diluidos en pasos de dilución de 1 :4 con regulador FACS) a las células aglomeradas, y se incubaron durante 1 hora sobre hielo. Las células se lavaron y se aglomeraron tres veces con 100 microlitros de regulador FACS. Se agregó a las células la IgG de cabra anti-humano conjugada con PE (Jackson ImmunoResearch), diluida a 1/200 con regulador FACS, y se incubó sobre hielo durante 1 hora. Se hicieron pasos de lavado adicionales tres veces con 100 microlitros de regulador FACS, seguidos por pasos de centrifugación a 210 g durante 5 minutos a 4°C. Finalmente, las células se volvieron a suspender en 200 microlitros de regulador FACS y los valores de fluorescencia se midieron con FACSArray (BD Biosciences). La cantidad de anticuerpo anti-HER3 enlazado en la superficie celular se determinó midiendo la fluorescencia del canal promedio.

Ejemplo 7: Enlace del dominio HER3 v mutante Las placas de 96 pozos Maxisorp (Nunc) se recubrieron durante la noche a 4°C con 200 nanogramos de la proteína humana recombinante apropiada (HER3-Tag, D1 -2-Tag, D2-Tag, D3-4-Tag, D4-Tag, HER3 K267A-Tag, HER3 L268A-Tag, HER3 K267A/L268A, y un control irrelevante marcado). Despues, todos los pozos se lavaron tres veces con suero regulado con fosfato (PBS) / Tween 20 al 0.1 por ciento, se bloquearon durante una hora con suero regulado con fosfato (PBS) / albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento / Tween 20 al 0.1 por ciento, y se lavaron tres veces con suero regulado con fosfato (PBS) /Tween 20 al 0.1 por ciento. Los anticuerpos anti-HER3 se agregaron a los pozos relevantes en una concentración final de 10 microgramos/mililitro, y se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. Las placas se lavaron tres veces con suero regulado con fosfato (PBS) / Tween 20 al 0.1 por ciento, antes de agregar el anticuerpo de detección apropiado enlazado con peroxidasa, diluido a 1/10,000 en suero regulado con fosfato (PBS) / albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1 por ciento / Tween 20 al 0.1 por ciento. Los anticuerpos de detección usados fueron de cabra anti-ratón (Pierce, 31432), de conejo anti-cabra (Pierce, 31402) y de cabra anti-humano (Pierce, 31412). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora antes de lavar tres veces con suero regulado con fosfato (PBS) / Tween 20 al 0.1 por ciento. A todos los pozos se les agregaron 100 microlitros de solución de substrato de TMB (3,3’,5,5’-tetrametil-bencidina) (BioFx) durante 6 minutos antes de detener la reacción con 50 microlitros de H2SO4 al 2.5 por ciento. La magnitud del enlace del anticuerpo de HER3 a cada proteína recombinante se determinó midiendo la DO450 utilizando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices). Cuando fue apropiado, se analizaron las curvas de respuesta a la dosis usando Graphpad Prism.

Ejemplo 8; Mapeo del epítopo de HER3 usando espectrometría de masas de intercambio de hidróaeno/deuterio Materiales Se preparó un regulador de D20 disolviendo TBS 25 mM (pH de 7.5) / NaCI 500 mM en agua pesada (Sigma). La solución de reducción fue de regulador de formato 50 mM (pH de 4) y TCEP 500 mM, y la solución de apagado fue ácido trifluoro-acetico (TFA) al 0.5 por ciento (volumen/volumen) en agua. El regulador A fue del 0.25 por ciento de ácido fórmico / 10 por ciento de metanol / 10 por ciento de etilenglicol en agua, y el regulador B fue del 0.25 por ciento de ácido fórmico en acetonitrilo. Todas las sustancias químicas se le compraron en Sigma y los disolventes de grado de HPLC fueron de Fisher Scientific.

Manejo de líquidos y cromatografía Se diseñaron experimentos de espectrometría de masas automática de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX MS) basándose en los métodos y equipo descritos por Wales y colaboradores (2006) Anal. Chem. 78: 1005-1014). Brevemente, todas las operaciones de manejo de líquidos se hicieron usando un manejador de líquidos Pal HTS (LEAP Technologies) alojado en un recinto refrigerado mantenido a 2°C. Se montaron una válvula de inyección de 6 orificios y una estación de lavado en el riel del manejador de líquidos y se facilitó la inyección de muestra en el sistema cromatográfico y el lavado de la jeringa. El sistema cromatográfico consistió en una válvula adicional de 10 orificios, una columna de pepsina Poroszyme de 2.1 milímetros x 30 milímetros (Applied Biosystems), un cartucho de fase inversa Cap Trap de 0.5 milímetros x 2 milímetros (Michrom Bioresources), y un emisor de electroaspersión auto-empaquetado como columna analítica (100 mieras x aproximadamente 60 milímetros, Kinetex 2.6 mieras C18, Phenomenex). La cabeza de la válvula de 10 orificios, el cartucho de trampa y la columna analítica se alojaron en un recinto separado construido de aluminio y se mantuvieron a -5°C por medio de pilas de peltre. Las válvulas y columnas se configuraron de tal manera que se permitiera la digestión de la proteína, la desalación del péptido, y la cromatografía de fase inversa en línea, antes de introducir la muestra en la fuente de ionización por electroaspersión (ESI) del espectrómetro de masas (LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific).

Las corrientes de fluido requeridas para la operación fueron provistas por dos bombas de HPLC separadas. La primera bomba de HPLC (bomba Surveyor MS, Thermo Scientific) suministró el regulador A a una velocidad de flujo constante de 125 microlitros/ minuto, y se usó para transferir la muestra a traves del cartucho de pepsina inmovilizada al cartucho de trampa de fase inversa montado a través de la válvula de 10 orificios. Después del periodo de carga y desalación, la válvula de 10 orificios se conmutó para eluir la muestra con la ayuda de una bomba de gradiente (AQUITY UPLC, Waters) desde el cartucho de trampa de fase inversa, a través de la columna analítica y hacia la fuente de iones del espectrómetro de masas. El cartucho de enzima inmovilizada se aisló para consumirse durante la elución en gradiente. La bomba de gradiente suministró segmentos de gradiente lineales del 0 al 40 por ciento de la fase móvil B durante 35 minutos a 5 microlitros/minuto, y del 40 al 95 por ciento de la fase móvil B a 5 microlitros/minuto durante 10 minutos. El flujo de gradiente de la bomba se dividió en la válvula de 10 orificios usando un divisor pasivo, de modo que el flujo real a través del cartucho de trampa y la columna analítica para el gradiente de elución fuera de aproximadamente 1 microlitro/minuto. La corrida cromatográfica completa duró 70 minutos incluyendo los pasos de lavado y equilibración.

Espectrometría de masas Con el propósito de identificar los fragmentos proteolíticos que resultan de la digestión en línea, se hicieron varios experimentos de MS/MS dependientes de los datos. Para estas adquisiciones, se adquirieron en fila los espectros de MS con el analizador LTQ del espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap. La selección de masas de precursor se basó en los escaneos de MS adquiridos por el analizador Orbitrap. Se hicieron adquisiciones de MS de una sola etapa con el fin de determinar el nivel de deuterio, obtenidas a una resolución de 60,000 por el analizador Orbitrap (sobre m/z 400-2000).

Preparación de la proteína y los complejos de proteína. Fab La proteína HER3 se preparó diluyendo 50 microgramos de HER3-Tag con TBS 25 mM (pH 7.5) / NaCI 500 mM para producir un volumen final de 50 microlitros. Los complejos de proteína:Fab se prepararon mezclando 50 microgramos de HER3-Tag en una relación molar de 1 :1 con los Fabs estudiados. Despues, las mezclas de proteína:Fab se diluyeron hasta un volumen final de 50 microlitros con TBS 25 mM (pH de 7.5) /NaCI 500 mM.

Los complejos de proteína-Fab se prepararon y se dejaron incubar por lo menos durante 2 horas a 4°C. Cuatro placas de 96 pozos que contenían soluciones de muestra, diluyente, apagador y dilución, se cargaron en el manejador de líquidos antes de empezar cada experimento. Para los experimentos de intercambio se diluyeron 50 microlitros de HER3 o complejo de HER3:Fab con 150 microlitros de regulador de D20. La mezcla se redujo agregando 200 microlitros de regulador de reducción durante 1 minuto, antes de apagar con 600 microlitros de regulador de apagado. El volumen total después de todos los pasos de manejo de líquido fue de aproximadamente 1 mililitro. Una vez mezclada, la solución apagada se inyectó en el sistema cromatográfico en donde automáticamente se digirió, se separó y se analizó mediante LCMS. El cambio promedio en la deuteración entre la muestra y el control fue calculado como la diferencia entre los grados de captación de deuterio de la muestra y el control.

Procesamiento de datos Los archivos RAW de Orbitrap se convirtieron en archivos mzXML usando un programa de la empresa (RawXtract). Subsiguientemente, las adquisiciones en fila de MS se examinaron usando SEQUEST (Yates Lab, Scripps Research Institute, La Jolla, CA), y los resultados de búsqueda se filtraron automáticamente usando DTASelect 2.0 (Yates Lab, Scripps Research Institute, La Jolla, CA). Usando las identificaciones de secuencias de peptidos, se utilizó un programa escrito en la empresa para extraer automáticamente los cromatogramas de un solo ion para cada secuencia identificada y para generar los espectros promedio a través del pico cromatográfico. Los espectros promedio se suavizaron y se sometieron a un método de centroide. El grado de captación de deuterio se tomó como la diferencia de masa entre una muestra deuterada y una referencia no deuterada. Los datos procesados se validaron manualmente y se ajustaron para corregir las inexactitudes y errores de los pasos del procesamiento automático. Se asignaron grados de captación de deuterio a cada residuo de la secuencia de proteína, deslocalizando el contenido de deuterio a través de cada péptido (es decir, dividiendo el grado de deuteración observado entre el número de aminoácidos en ese peptido). Si un residuo fue cubierto por más de un péptido, se promediaron las captaciones de deuterio normalizadas de todos los péptidos que cubrían ese residuo.

Ejemplo 9: Determinación de la estructura cristalográfica de ravos-X de los complejos de HER humano / Fab MORQ9823 v de HER humano / Fab MORQ9825 El presente ejemplo presenta la estructura de cristal de HER3 de longitud completa enlazado al fragmento Fab de MOR09823 y el fragmento Fab de MOR09825, determinada a una resolución de 3.2 A y 3.4 A, respectivamente. El HER3 humano marcado se purificó adicionalmente sobre una columna HiLoad 26/60 Superdex 200 PrepGrade (GE Healthcare) equilibrada en suero regulado con fosfato (PBS) (pH de 7.3). Los Fabs MOR09823 y MOR09825 expresados en E. coli se aislaron Usando las células con lisozima, y se capturaron los fragmentos Fab marcados con His6 en una columna HisTrap_HP (GE Healthcare). Los fragmentos Fab MOR09823 se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel usando una columna Superdex 75 16/60 (GE Healthcare) equilibrada en Tris 25 mM (pH de 7.5), NaCI 150 mM.

Los complejos de HER3-Fab se prepararon mezclando un exceso de Fab con HER3 marcado en relaciones molares de 1.3-1 .8 : 1 (concentración estimada por la absorbancia a 280 nanómetros usando los coeficientes de extinción calculados de 0.9 y 1.4 (mili-gramos/mililitro) 1cm 1 para HER3 y Fab, respectivamente), y purificando los complejos en una columna Superdex 200 10/300 (GE Healthcare) equilibrada en Tris 25 mM (pH de 7.5), NaCI 150 mM . Las fracciones de los picos se analizaron mediante SDS-PAGE y LCMS. Para cada complejo, se reunieron y se concentraron las fracciones que contenían tanto HER3 como Fab en una relación aproximadamente equimolar. Los cristales de HER3/MOR09823 se desarrollaron a 293K asentando la difusión de vapor por goteo a partir de las gotas que contenían 150 nanolitros del complejo de HER3/ MOR09823 y 150 nanolitros de solución de reserva (citrato de sodio 100 mM , pH de 5.6, 20 por ciento de PEG 4000 y 20 por ciento de isopropanol). Los cristales se transfirieron a la solución de reserva que contenía el 8 por ciento adicional de glicerol, y se enfriaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Los cristales de HER3/MOR09825 se desarrollaron a 293K asentando la difusión de vapor por goteo a partir de las gotas que contenían 150 nanolitros del complejo de HER3/ MOR09825 y 150 nanolitros de solución de reserva (bis-Tris 100 mM , pH de 6.5, 16 por ciento de PEG 10,000). Los cristales se transfirieron a bis-Tris 100 mM , pH de 6.5, 18 por ciento de PEG 10,000 y 22 por ciento de glicerol, y se enfriaron instantáneamente en nitrógeno líquido.

Se recopilaron datos en la línea del haz 17-ID en el Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory). Los datos del complejo de H ER3/Fab MOR09823 se procesaron y se escalaron a 3.2 A usando HKL2000 (HKL Research Inc.) en el grupo de espacio I222, con dimensiones de celda a = 124.16, b= 139.44, c=180.25 A, con una buena estadística. La estructura de HER3 / Fab MOR09823 se resolvió por medio de reemplazo molecular usando el Phaser (McCoy y colaboradores, (2007) J. Appl. Cryst. 40: 658-674), con fragmentos de un Fab y la estructura publicada de HER3 ECD 1 mb6 como modelos de búsqueda. El modelo final, que contuvo 1 molecula del complejo de HER3/Fab MOR09823 por unidad asimétrica, fue construido en COOT (Emslcy & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60: 2126-2132) y se refinó a valores de R y R bre del 19.0 y el 24.5 por ciento, respectivamente, con un rmsd de 0.010 A y 1 .37° para las longitudes de enlace y los ángulos de enlace, respectivamente, usando el BUSTER (Global Phasing, LTD). Los residuos de HER3 que contenían átomos en el espacio de 5Á de cualquier átomo en Fab MOR09823, identificados en PyMOL (Schródinger, LLC), se enlistan en las Tablas 1 1 y 12. Los datos del complejo de HER3 / Fab MOR09825 se procesaron y se escalaron a 3.4A usando el autoPROC (Global Phasing, LTD) en el grupo de espacio I222, con dimensiones de celda a=124.23, b=140.94, c=180.25 A, con una buena estadística. La estructura de HER3 / Fab MOR09825 se resolvió mediante reemplazo molecular usando el Phaser (McCoy y colaboradores, (2007) J. Appl. Cryst. 40: 658-674), con la estructura de HER3 / Fab MOR09823 como modelo de búsqueda. El modelo final, que contenía 1 molécula del complejo de HER3 / Fab MOR09825 por unidad asimétrica, se construyó en COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60: 2126-2132) y se refinó a valores de R y R ubre del 18.8 y el 24.9 por ciento, respectivamente, con un rmsd de 0.009 A y 1.21 ° para las longitudes de enlace y los ángulos de enlace, respectivamente, usando el BUSTER (Global Phasing, LTD). Los residuos de HER3 que contenían átomos en el espacio de 5A de cualquier átomo en Fab MOR09825, identificados en PyMOL (Schródinger, LLC), se enlistan en las Tablas 13 y 14.

Ejemplo 10: Pruebas celulares in vitro de fosfo-HER3 Las celulas MCF-7 se mantuvieron rutinariamente en DMEM/F12, HEPES 15 mM, L-glutamina, suero fetal de becerro (FCS) al 10 por ciento, y SK-Br-3 en McCoy 5a, suero fetal de becerro (FCS) al 10 por ciento, L-glutamina 1 .5 mM. Las células MCF7 o SK-Br-3 subconfluentes desarrolladas en un medio completo se cosecharon con acutasa (PAA Laboratories) y se volvieron a suspender en el medio de crecimiento apropiado en una concentración final de 5 x 105 células/mililitro. Después se agregaron 100 microlitros de suspensión celular a cada pozo de una placa de fondo plano de 96 pozos (Nunc) para dar una densidad final de 5 x 104 células/pozo. Las células MCF7 se dejaron adherir durante aproximadamente 3 horas antes de intercambiar el medio por un medio de inanición que contenía suero bovino fetal (FBS) al 0.5 por ciento. Después, todas las placas se incubaron durante la noche a 37°C antes del tratamiento con la concentración apropiada de anticuerpos de HER3 (diluidos en el medio apropiado) durante 80 minutos a 37°C. Las células MCF7 se trataron con 50 nanogramos/ mililitro del dominio EGF de neurregulina 1 -b1 (R&D Systems) durante los 20 minutos finales para estimular la fosforilación de HER3. Todos los medios se aspiraron suavemente y las células se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS) enfriado sobre hielo que contenía CaCI2 1 mM y MgCI2 0.5 mM (Gibco). Las celulas se Usaron añadiendo 50 microlitros de regulador de lisis enfriado sobre hielo (Tris 20 mM (pH de 8.0) / NaCI 137 mM / glicerol al 10 por ciento / EDTA 2mM / NP-40 al 1 por ciento / ortovanadato de sodio 1 mM / aprotinina (10 microgramos/mililitro) / leupeptina (10 micro-gramos/mililitro)), y se incubaron sobre hielo con agitación durante 30 minutos. Después, los Usados se recogieron y se centrifugaron a 1800 g durante 15 minutos a 4°C para remover los desechos celulares. Se agregaron 20 microlitros del Usado a una placa de captura previamente preparada.

Se generaron placas de captura de HER3 usando una placa de carbono (Mesoscale Discovery) recubierta durante la noche a 4°C con 20 microlitros del anticuerpo de captura de MAB3481 (R&D Systems) diluido a 4 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato (PBS), y se bloquearon subsiguientemente con albúmina de suero bovino al 3 por ciento en regulador de Tris 1 x (Mesoscale Discovery) / Tween-20 al 0.1 por ciento. El HER3 se capturó del Usado incubando la placa a temperatura ambiente durante una hora con agitación, antes de aspirar el Usado, y los pozos de lavaron con regulador de Tris 1 x (Mesoscale Discovery) / Tween-20 al 0.1 por ciento. El HER3 fosforilado se detectó usando 0.75 microgramos/ mililitro del anticuerpo anti-fosfotirosina biotinilado (R&D Systems) preparado en albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento / Tris 1x / Tween-20 al 0.1 por ciento, incubando con agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pozos se lavaron cuatro veces con Tris 1 x / Tween-20 al 0.1 por ciento, y se detectaron las proteínas biotiniladas incubando con estreptavidina marcada con S-Tag (Mesoscale Discovery) diluida en albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento / Tris 1 x / Tween-20 al 0.1 por ciento, durante una hora a temperatura ambiente. Cada pozo se aspiró y se lavó cuatro veces con Tris 1 x / Tween-20 al 0.1 por ciento antes de agregar 20 microlitros de regulador de Lectura T con tensoactivo (Mesoscale Discovery), y la señal se cuantificó usando un Mesoscale Sector Imager. Los anticuerpos MOR06391 o MOR03207 se incluyeron en los experimentos de señalización como controles de isotipos.

Ejemplo 11 : Ensayos celulares in vitro de fosfo-Akt (S473) Las celulas SK-Br-3 y BT-474 subconfluentes desarrolladas en el medio completo se cosecharon con acutasa (PAA Laboratories) y se volvieron a suspender en el medio de crecimiento apropiado en una concentración final de 5 x 105 células/mililitro. Después se agregaron 100 microlitros de suspensión celular a cada pozo de una placa de fondo plano de 96 pozos (Nunc), para producir una densidad final de 5 x 104 células/pozo. Después, todas las placas se incubaron durante la noche a 37°C antes del tratamiento con la concentración apropiada de anticuerpos de HER3 (diluidos en el medio apropiado), durante 80 minutos a 37°C. Todo el medio se aspiró suavemente y las células se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS) enfriado sobre hielo que contenía CaCI2 1 mM y MgCI2 0.5 mM (Gibco). Las celulas se Usaron agregando 50 microlltros del regulador de lisis enfriado sobre hielo (Tris 20 mM (pH de 8.0) / NaCI 137 mM / gllcerol al 10 por ciento / EDTA 2 mM / NP-40 al 1 por ciento / ortovanadato de sodio 1 mM / aprotinina (10 microgramos/ mililitro) / leupeptina (10 microgramos/mililitro)), y se incubaron sobre hielo con agitación durante 30 minutos. Después, los lisados se recolectaron y se centrifugaron a 1800 g durante 15 minutos a 4°C para remover todos los desechos celulares. Se agregaron 20 microlitros del Usado a una placa de carbono Phospho-Akt Multi-Spot de 384 pozos (Mesoscale Discovery), que previamente se habían bloqueado con albúmina de suero bovino (BSA) al 3 por ciento / Tris 1 x / Tween-20 al 0.1 por ciento. La placa se incubó a temperatura ambiente durante dos horas con agitación antes de aspirar el Usado, y los pozos se lavaron cuatro veces con regulador de Tris 1x (Mesoscale Discovery) / Tween-20 al 0.1 por ciento. La Akt fosforilada se detectó usando 20 microlitros del anticuerpo SULFO-TAG anti-fosfo-Akt (S473) (Mesoscale Discovery) diluido 50 veces en albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento / Tris 1 x / Tween-20 al 0.1 por ciento, incubando con agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. Los pozos se lavaron cuatro veces con Tris 1 x / Tween-20 al 0.1 por ciento, antes de agregar 20 microlitros del regulador de Lectura T con tensoactivo (Mesoscale Discovery), y la señal se cuantificó usando un Mesoscale Sector Imager. Los anticuerpos MOR06391 o MOR03207 se incluyeron en los experimentos de señalización como controles de isotipos.

Ejemplo 12: Pruebas de proliferación de la línea celular Las celulas SK-Br-3 se cultivaron rutinariamente en un medio de McCoy 5A modificado, complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento, y las células BT-474 se cultivaron en DMEM complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento. Las células subconfluentes se tripsinizaron, se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS), se diluyeron a 5 x 104 células/mililitro con el medio de crecimiento, y se sembraron en placas negras de fondo transparente de 96 pozos (Costar 3904) a una densidad de 5,000 células/pozo. Las células se incubaron durante la noche a 37°C antes de agregar la concentración apropiada del anticuerpo de HER3 (concentraciones finales típicas de 10 o 1 microgramo/ mililitro). Las placas se regresaron a la incubadora durante 6 días antes de determinar la viabilidad celular usando el CelITiter-Glo (Promega). A cada pozo se le agregaron 100 microlitros de la solución CelITiter-Glo, y se incubaron a temperatura ambiente con agitación suave durante 10 minutos. La cantidad de luminiscencia se determinó utilizando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices). La magnitud de la inhibición de crecimiento obtenida con cada anticuerpo se calculó comparando los valores de luminiscencia obtenidos con cada anticuerpo de HER3 con un anticuerpo de control estándar de isotipo (MOR06391 ).

Para las pruebas de proliferación, las células MCF-7 se cultivaron rutinariamente en DMEM / F12 (1 : 1 ) que contenía L- glutamina 4 mM / HEPES 15 mM / FBS al 10 por ciento. Las células subconfluentes se tripsinizaron, se lavaron con suero regulado con fosfato (PBS) y se diluyeron a 1 x105 células/mililitro con DMEM / F12 (1 :1 ), que contenía L-glutam¡na 4 mM/ HEPES 15mM / 10 micro-gramos/mililitro de transferrina humana / albúmina de suero bovino (BSA) al 0.2 por ciento. Las células se sembraron en placas negras de fondo transparente de 96 pozos (Costar) a una densidad de 5,000 células/pozo. Entonces se agregó la concentración apropiada del anticuerpo de HER3 (concentraciones finales típicas de 10 o 1 microgramo/mililitro). También se agregaron 10 nanogramos/ mililitro del dominio EGF de NRGI -bI (R&D Systems) a los pozos apropiados para estimular el crecimiento celular. Las placas se regresaron a la incubadora durante 6 días antes de determinar la viabilidad celular usando CelITiter-Glo (Promega). La magnitud de la inhibición de crecimiento obtenida con cada anticuerpo se calculó restando los valores de luminiscencia de fondo (sin neurregulina) y comparando los valores resultantes obtenidos con cada anticuerpo anti-HER3 con un anticuerpo de control estándar del isotipo (MOR06391 ).

Ejemplo 13: Ensayos celulares de bloqueo de ligando Las células MCF-7 cultivadas en MEM complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 por ciento y 1 microgramo/mililitro de insulina (Sigma) se enjuagaron y recogieron en un volumen pequeño de regulador de disociación celular FACSmax (Genlantis), antes de la adición de 5 mililitros de regulador FACS (PBS / FBS al 1 por ciento / azida de sodio al 0.1 por ciento). La densidad celular se contó y se ajustó a una concentración final de 1 x 106 celulas/ mililitro. Se agregaron 100 microlitros de suspensión celular a cada pozo de una placa de 96 pozos, y las células se aglomeraron por medio de centrifugación (220 g, 3 minutos, 4°C). Los aglomerados celulares se volvieron a suspender en 100 microlitros de los anticuerpos de prueba apropiados diluidos en regulador FACS (las concentraciones finales típicas de anticuerpo variaron de 100 a 0.1 nM), y la placa se incubó sobre hielo durante 45 minutos. Se incluyó como control positivo el anticuerpo de bloqueo de ligando MAB3481 (R&D Systems). Las células se lavaron dos veces con regulador de teñido antes de agregar 10 nM del dominio EGF de NRGI -bI (R&D Systems), diluido en regulador FACS, e incubando sobre hielo durante 45 minutos. Las células se lavaron dos veces con regulador de teñido, y la neurregulina enlazada se detectó incubando las células con 10 nM de anticuerpo anti-dominio EGF de NRGI -bI humano (R&D Systems), sobre hielo durante 45 minutos. Las células se lavaron dos veces con regulador de teñido y se incubaron sobre hielo durante 45 minutos con anticuerpo anti-cabra enlazado con PE (Jackson ImmunoResearch) diluido a 1/500 con regulador FACS. Después, las células se aglomeraron mediante centrifugación y el aglomerado se volvió a suspender en 200 microlitros de regulador FACS. Para cuantificar cada muestra, se contaron 10,000 células vivas en un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences), y la cantidad de neurregulina enlazada a la superficie celular se evaluó midiendo la fluorescencia del canal promedio.

Ejemplo 14: Ensayo bioquímico de bloqueo de ligando El presente metodo incluye la utilidad de un biosensor basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) (BiacoreMR, GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para examinar la capacidad de los complejos de HER3/anticuerpo para unirse a la neurregulina.

El BiacoreMR utiliza el fenómeno de resonancia de plasmón superficial (SPR) para detectar y medir las interacciones de enlace. En un experimento típico Biacore, una de las moléculas que interaccionan (neurregulina) es inmovilizada sobre una matriz, mientras que el asociado que interacciona (HER3) se hace fluir sobre la superficie. Una interacción de enlace da como resultado un aumento de la masa sobre la superficie del sensor, y en un cambio directo correspondiente en el índice de refracción del medio en la vecindad de la superficie del sensor. Los cambios del índice o señal de refracción son registrados en unidades de resonancia (R.U.). Los cambios de señal debidos a la asociación y disociación de los complejos son monitoreados de una manera no invasiva, continuamente y en tiempo real, los resultados de lo cual son reportados en la forma de un sensograma.

El BiacoreMR T100 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) se usó para realizar todos los experimentos aquí reportados. La preparación de la superficie del sensor y los análisis de interacción se hicieron a 25°C. El regulador y los reactivos Biacore se adquirieron en GE Healthcare. Se utilizó en todo el ensayo un regulador de corrida que contenía Hepes 10 mM, pH de 7.4 / NaCI 150 mM, P20 al 0.05 por ciento, albúmina de suero bovino (BSA) al 0.5 por ciento.

El dominio extracelular NRG-I b? (R&D Systems) se incubó sobre hielo durante 45 minutos con EZ-enlace Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina (Pierce), en una proporción molar de 5: 1 . La reacción se apagó por medio de la adición de un exceso de etanolamina, y se removió la biotina no acoplada del NRG biotinilado usando columnas centrífugas de desalación (Zeba). El NRG biotinilado se capturó sobre un chip sensor CAP previamente inmovilizado con aproximadamente 3,000 R.U. de ssADN-estreptavidina (kit Biotin CAPture), para producir densidades de superficie de neurregulina en la escala de 400 - 600 R.U . Se generó una celda de flujo de referencia omitiendo el NRG biotinilado de los pasos de inyección, de tal manera que sólo estuviera presente ssADN-estreptavidina sobre la superficie de la celda de flujo.

Se generaron complejos de HER3/anticuerpo mediante la incubación de HER3 humano-Fc 10 mM , con concentraciones crecientes (de 0 a 50 nM) del anticuerpo de prueba apropiado durante 15 minutos, a temperatura ambiente, antes de incubar el BiacoreMR a 10°C. Se hicieron análisis de interacción inyectando los complejos de HER3/anticuerpo sobre las superficies de referencia y de neurregulina en serie durante 180 segundos a una velocidad de flujo de 60 microlitros/minuto. La disociación del complejo se monitoreó durante 180 segundos a una velocidad de flujo de 60 microlitros/minuto. Se hizo la regeneración superficial al final de cada ciclo de análisis usando una inyección de 120 segundos de guanidina 8M : NaOH 1 M (3: 1 ), seguida por una inyección de 120 segundos de acetonitrilo al 30 por ciento / NaOH 0.25 M, a una velocidad de flujo de 30 microlitros/minuto.

Ejemplo 15: Estudios Farmacodínámicos in vivo Se cultivaron celulas BxPC3 y BT-474 y se implantaron en ratones atímicos hembras nu/nu Balb/C (Harían Laboratories) como se describe en los Ejemplos 16 y 17.

Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño apropiado, los animales se examinaron para determinar la calidad del tumor. Los animales con tumores ulcerados o los animales con tumores llenos de fluido se excluyeron del estudio. El resto de los animales recibieron dosis intravenosas de anticuerpo por medio de inyección en la vena lateral de la cola. En los puntos del tiempo dados, los animales se sometieron a eutanasia por medio de asfixia con CO2 y se extrajo la sangre por medio de punción cardiaca, que se puso en un tubo de recolección Eppendorf de 1 .5 mililitros. El tejido tumoral se disectó inmediatamente, se puso en un tubo de muestras de polipropileno con tapa de rosca, y se congeló en nitrógeno líquido. El tejido se guardó a -80°C hasta que se prepararon los Usados.

Ejemplo 16; Estudios de eficacia de BT-474 in vivo Se cultivaron células BT-474 en un medio DMEM que contenía suero de bovino fetal al 10 por ciento inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación.

Un día antes de la inoculación de las células, se implantó subcutáneamente a ratones nu/nu Balb/C hembras atímicos (Harían Laboratories) con un aglomerado de 173-estradiol de liberación sostenida (Innovative Research of America) para mantener los niveles de estrógeno en suero. Un día después de la implantación del aglomerado de 173-estradiol, se inyectaron ortotópicamente 5 x 106 células en la 4a almohadilla de grasa mamaria en una suspensión que contenía Matrigel al 50 por ciento libre de rojo de fenol (BD Biosciences) en una solución salina balanceada de Hank. El volumen de inyección total que contenía las células en suspensión fue de 200 litros. 20 días después de la implantación de las células, se inscribieron en el estudio de eficacia los animales con un volumen del tumor de aproximadamente 200 mm3. En general, se inscribió un total de 10 animales por grupo en los estudios de eficacia.

Para los estudios con el agente individual, se dosificó a los animales intravenosamente por medio de inyección en la vena lateral de la cola con MOR10701 o MOR10703. Se dio una dosis de carga inicial de 40 miligramos/kilogramo en la primera dosis. Después de la dosis inicial, los animales estuvieron en un plan de 20 miligramos/ kilogramo cada tercer día por la duración del estudio. Para los estudios de combinación, se dosificó a los animales con MOR10701 o MOR10703 (20 miligramos/kilogramo, intravenosamente (iv), cada 2 días) y una dosis sub-óptima de trastuzumab (1 miligramo/ kilogramo, intravenosamente (iv), cada 2 semanas).

Por la duración de los estudios, se midió el volumen del tumor mediante calibración dos veces por semana. Se calcularon los valores del porcentaje de tratamiento/control (T/C) usando la siguiente fórmula: % de T/C = 100 x DT/DO si DT >0 en donde: T = volumen medio del tumor del grupo tratado con el fármaco en el día final del estudio; DT = volumen medio del tumor del grupo tratado con el fármaco en el día final del estudio - volumen medio del tumor del grupo tratado con el fármaco en el día inicial de la dosificación; C = volumen medio del tumor del grupo control en el día final del estudio; y DO = volumen medio del tumor del grupo control en el día final del estudio - volumen medio del tumor del grupo tratado con el fármaco en el día inicial de la dosificación.

Se midió el peso corporal dos veces por semana y la dosis se ajustó al peso corporal. El porcentaje de cambio en el peso corporal se calculó como (BWactuai - BWin¡ciai)/(BW¡nic¡ai) x 100. Los datos se presentan como el porcentaje de cambio en el peso corporal a partir del día de inicio del tratamiento.

Todos los datos se expresaron con el promedio + error estándar del promedio (SEM). Se usaron el volumen delta del tumor y el peso corporal para el análisis estadístico. Se llevaron a cabo comparaciones entre los grupos usando un ANOVA unidireccional seguid de un Tukey post hoc. Para todas las evaluaciones estadísticas, el nivel de significancia se ajustó a p < 0.05. Se reporta la significancia comparada con el grupo de control de vehículo.

Ejemplo 17: Estudios de eficacia de BxPC3 in vivo Se cultivaron celulas BxPC3 en un medio RPMI-1640 que contenía suero de bovino fetal al 10 por ciento inactivado por calor sin antibióticos hasta el momento de la implantación.

Se implantaron subcutáneamente a ratones nu/nu Balb/C hembras atímicos (Harían Laboratories), 10 x 106 células en una mezcla de solución salina regulada con fosfato al 50 por ciento con Matrigel al 50 por ciento. El volumen de inyección total que contenía células en suspensión fue de 200 litros. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 200 mm3, se inscribió a los animales en el estudio de eficacia. En general, se inscribió un total de 10 animales por grupo en los estudios de eficacia. Se excluyó a los animales de la inscripción si exhibían características inusuales de crecimiento del tumor antes de la inscripción.

Se dosificó a los animales intravenosamente por medio de inyección en la vena lateral de la cola. Se dio una dosis de carga inicial de 40 miligramos/kilogramo en la primera dosis. Después de la dosis inicial, los animales estuvieron en un plan de 20 miligramos/ kilogramo cada tercer día por la duración del estudio (25 días bajo tratamiento). El volumen del tumor y los valores de T/C se calcularon como se detalló previamente.

Ejemplo 18: Pruebas farmacodinámicas (PD) in vivo para Fosfo- Akt Se descongelaron aproximadamente 50 mm3 de tejido tumoral congelado (por ejemplo BT-474 o BXPC-3) en hielo, y se agregaron a cada muestra de 100 a 300 microlitros de solución reguladora T-PER (Pierce) que contenía inhibidores de fosfatasa (Roche) y proteasa (Roche). El volumen de solución reguladora para lisis agregado fue dependiente del tamaño de la muestra de tumor. El tejido se rompió utilizando un pistilo de 1 .5 mililitros (Fisher Scientific) y las suspensiones resultantes se incubaron en hielo durante 15 minutos antes de que se congelaran durante toda la noche a -80°C. Las muestras se descongelaron y se centrifugaron durante 15 minutos a 13,000 g, 4°C antes de cuantificar la concentración de proteína del sobrenadante utilizando la prueba BCA (Thermo Scientific). Los sobrenadantes de tejido se diluyeron con una solución reguladora para lisis (Mesoscale Discovery) y se agregaron 25 microgramos a una placa de carbón fosfo-Akt de 96 pozos de puntos múltiples (Mesoscale Discovery) que previamente había sido bloqueada con solución para bloqueo A (Mesoscale Discovery). La placa se incubó a temperatura ambiente durante una hora con agitación antes de que el lisado se aspirara y que los pozos se lavaran cuatro veces con solución reguladora de Tris para lavado (Mesoscale Discovery). La Akt fosforilada se detectó utilizando 25 microlitros de anticuerpo anti-fosfo-Akt SULFO-TAG (S473) (Mesoscale Discovery) diluido en la solución reguladora para dilución de anticuerpo incubando con agitación a temperatura ambiente durante una hora. Los pozos se lavaron cuatro veces con una solución reguladora de Tris para lavado antes de agregar 150 microlitros de solución reguladora T para lectura (con agente tensoactivo) (Mesoscale Discovery) y la señal se cuantificó utilizando un aparato para formación de imágenes Mesoscale Sector Imager.

Ejemplo 19: Pruebas farmacodinámicas in vivo para Fosfo Se descongelaron aproximadamente 50 mm3 de tejido tumoral congelado (por ejemplo BXPC-3) en hielo y se agregaron de 100 a 300 microlitros de solución reguladora T-PER (Pierce) que contenía inhibidores de fosfatasa (Roche) y de proteasa (Roche) a cada muestra. El tejido se rompió utilizando un pistilo de 1 .5 mililitros (Fisher Scientific) y las suspensiones resultantes se incubaron en hielo durante 15 minutos antes que se congelaran durante toda la noche a -80°C. Las muestras se descongelaron y centrifugaron durante 15 minutos a 13,000 g, a 4°C antes de cuantificar la concentración de proteína del sobrenadante utilizando la prueba BCA (Thermo Scientific). Los sobrenadantes de tejido se diluyeron con una solución reguladora para lisis, y se agregaron 150 microlitros a una placa de carbón de 96 pozos de puntos múltiples (Mesoscale Discovery) que previamente había sido revestida durante la noche con 4 microgramos/mililitro de MAB3481 (R&D Systems) y bloqueada con leche al 3 por ciento. La placa se incubó a temperatura ambiente durante dos horas con agitación antes de aspirar el lisado, y los pozos se lavaron cuatro veces con una solución reguladora de Tris para lavado (Mesoscale Discovery). El HER3 fosforilado se enlazó utilizando pY1 197 anti-HER3 diluido a 1/8,000 con una solución reguladora para bloqueo. Despues de incubar a temperatura ambiente durante una hora, los pozos se lavaron con una solución reguladora de Tris para lavado, y el anticuerpo anti-pY1197 se detectó utilizando el anticuerpo anti-conejo marcado con S-Tag (Mesoscale Discovery) diluido a 1 /1 ,000 en una solución reguladora para bloqueo incubando con agitación a temperatura ambiente durante una hora. Los pozos se lavaron cuatro veces con una solución reguladora de Tris para lavado antes de agregar 150 microlitros de solución reguladora T para lectura diluida a 1/4 (con agente tensoactivo) (Mesoscale Discovery) y la señal se cuantificó utilizando un aparato para formación de imágenes Mesoscale Sector Imager.

Ejemplo 20: Estudios de combinación de fármacos in vitro Para evaluar la capacidad de los anticuerpos dirigidos a HER3 para combinarse con terapias dirigidas, se combinaron MOR09825 o MOR10703 con trastuzumab, lapatinib, BEZ235, BKM120, BYL719, RAD001 , erlotinib y cetuximab en ensayos de viabilidad celular. Se sembraron de aproximadamente 1 ,000 a 1 ,500 celulas SK-Br-3 (McCoy’s), MDA-MB-453 (RPMI), FaDu (EMEM) o L3.3 (RPMI) en placas de 384 pozos en el medio de cultivo apropiado complementado con suero bovino fetal (FBS) al 2 por ciento, y se dejaron adherir durante toda la noche a 37°C. Las combinaciones de fármaco apropiadas (las concentraciones de fármaco finales típicas para lapatinib, BKM 120, y BYL719 variaron desde 3 mM hasta 13 nM; para RAD001 variaron desde 27 nM hasta 0.0041 nM; para erlotinib variaron desde 1 mM hasta 0.0025 nM; para MOR1073 variaron desde 100 nM hasta 0.01 nM ; para cetuximab variaron desde 100 nM hasta 0.0015 nM ; y para trastuzumab variaron desde 300 nM hasta 0.046 nM)) se agregaron subsiguientemente a los pozos, de modo tal que cada placa contuviera una curva de respuesta a la dosis de cada fármaco en una matriz bidimensional. Las placas se regresaron a la incubadora durante 3 a 6 días antes de evaluar la viabilidad celular utilizando CelITiter-Glo (Promega). La solución CelITiter-Glo se agregó a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente con agitación suave durante 10 minutos. La cantidad de luminiscencia se determinó utilizando un lector de placas SpectraMax (Molecular Devices). Se calculó el grado de inhibición de crecimiento obtenido con cada com binación y se resaltó la actividad de la combinación utilizando el modelo de aditividad de Loewe.

Ejemplo 21 : Estudios de combinación de fármacos irt vivo en celulas L3.3 Se cultivaron células L3.3 pancreáticas en un medio DMEM que contenía suero bovino fetal al 10 por ciento ¡nactivado por calor hasta el momento de la implantación. Los ratones sin pelo Foxnl hembras (Harían Laboratories) se implantaron por vía subcutánea con 3 x 106 células en DMEM libre de suero bovino fetal (FBS). El volumen total de inyección que contenía las células en suspensión fue de 100 microlitros. 12 días después de la implantación de las células, los animales se inscribieron en el estudio de eficacia con un volumen de tumor promedio de aproximadamente 100 mm3 para todos los grupos. En general, se inscribió un total de 8 animales por grupo en los estudios. Los animales se excluyeron de la inscripción si estos presentaban características de crecimiento de tumor inusuales antes de que se inscribieran.

Los animales se dosificaron por vía intravenosa con MOR 10703 mediante inyección en la vena lateral de la cola en un programa de 20 miligramos/kilogramo, cada tercer día por toda la duración del estudio (14 d ías bajo tratamiento). El Erlotinib se dosificó a 50 miligramos/kilogramo (por vía oral) en un programa diario ya sea como un agente individual o en combinación con MOR10703. El volumen del tumor y los valores TIC se calcularon como se detalló previamente.

Resultados v Discusión Colectivamente, estos resultados muestran que una clase de anticuerpos se enlazan a los residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 de un epítopo conformacional de HER3 y estabilizan a HER3 en una conformación inactiva o cerrada. El enlace de estos anticuerpos inhibe tanto la señalización dependiente del ligando como la señalización independiente del ligando. Estos anticuerpos también son capaces de unirse en forma concurrente con un ligando de HER3. (i) Determinación de afinidad La afinidad del anticuerpo se determinó mediante titulación en equilibrio en solución (SET) como se describió anteriormente. Los resultados se presentan en forma resumida en la Tabla 9, y las curvas de titulación de ejemplo para MOR10701 están contenidas en la Figura 1. Los datos indican que se identificó un número de anticuerpos que se enlazaron fuertemente a HER3 humano, de cinomolgo, de rata y de murino.

TABLA 9 Valores de KD de IgGs anti-HER3 según se determina mediante titulación en equilibrio en solución (SET). Hu ( humano), Cy (Cinomolgo), Mu (murino) y ra (rata) (ii) Determinación de CE50 en celulas SK-Br-3 La capacidad de los anticuerpos identificados para enlazarse a las células que expresan HER3 se determinó calculando los valores de CE50 para su enlace a la línea celular amplificada con HER2, SK-Br-3 (véase la Figura 2 y la Tabla 10).

TABLA 10 Valores de CES0 de FACS de IgG anti-HER3 en células SK-Br-3. n.d. (no determinado) (iii) Enlace al dominio de HER3 Se caracterizó un subconjunto de anticuerpos anti-HER3 respecto para determinar su capacidad para enlazarse a los diversos dominios extracelulares de HER3 humano en un ensayo ELISA. Para lograr esto, el dominio extracelular de HER3 se dividió en sus cuatro dominios constitutivos y se clonaron, se expresaron y purificaron varias combinaciones de dichos dominios como proteínas independientes como se describió anteriormente. Utilizando esta estrategia, se generan exitosamente los siguientes dominios como proteínas solubles: dominios 1 y 2 (D1 -2), dominio 2 (D2), dominios 3 y 4 (D3-4) y dominio 4 (D4). Tambien se probaron un número de anticuerpos de ratón anti-HER3 humano generados internamente (8D7, 1 F5 y 8P2) como controles positivos para demostrar la integridad de cada dominio aislado.

Como se muestra en la Figura 3, se observó que tanto MOR09823 como MOR09825 se enlazaron exitosamente al dominio extracelular de HER3, pero se observó poco enlace con los dominios aislados en esta prueba con estos anticuerpos. Existen varias posibles explicaciones para este patrón de enlace: a) MOR09823 y MOR09825 pueden enlazarse a un epítopo lineal que abarca un límite de dominio y, de esta manera, parte del epítopo de enlace se perdería cuando los dominios se expresaran como proteínas aisladas. b) MOR09823 y MOR09825 pueden enlazarse a un epítopo no lineal que sirve de puente a múltiples dominios. Por consiguiente, la separación de HER3 en sus unidades componentes puede destruir el sitio de enlace. c) La forma/conformación de HER3 puede ser un componente del enlace de MOR09823 y MOR09825 a HER3, de modo tal que solamente el dominio extracelular de longitud completa de HER3 es capaz de adoptar esta forma/conformación mientras que los dominios aislados no pueden asumir completamente esta conformación. (vi) Mapeo del epítopo de HER3 utilizando espectrometría de masas con intercambio de hidrógeno/deuterio El epítopo de HER3 se exploró adicionalmente mediante análisis HDX-MS de ECD de HER3 en la presencia y en ausencia de las versiones Fab de MOR09823, MOR09824, MOR09825 y MOR09974. La Figura 4A muestra que, en ausencia de Fab enlazado, aproximadamente el 69 por ciento de la secuencia de ECD de HER3 fue cubierta por lo menos por un peptido. Los huecos en la cobertura podrían deberse a la glucosilación de los residuos dentro de estas regiones, o a una reducción insuficiente de los enlaces de disulfuro en las regiones ricas en cisteína, lo cual es particularmente evidente en el dominio 2. Como un aspecto interesante, aunque cada Fab produjo patrones de protección individuales, se observó una región de protección fuerte consistentemente con MOR09823, MOR09824, MOR09825 y OR09974 (véase la Figura 4B), lo que indica que esta familia altamente relacionada de anticuerpos se enlazan a HER3 de una manera idéntica. La protección más fuerte se observó para los residuos 269-286 del dominio 2 (TFQLEPNPHTKYQYGGVC) (SEQ ID NO: 146), lo que indica que los residuos en esta vecindad pueden ser importantes para el enlace del mAb. El mapeo de los residuos protegidos con Fab sobre la estructura cristalina de HER3 publicada (Cho & Leahy, (2002) Science 297: 1330-1333) resalta que los residuos 269-286 están dentro y proximales a un ciclo de horquilla-b funcionalmente importante dentro del dominio 2 (véase la Figura 4C). (vii) Estructura del cristal de HER3/MOR09823 Se resolvió la estructura del cristal de rayos-X con resolución a 3.2 A del fragmento Fab de MOR09823 enlazado al dominio extracelular de HER3 para definir adicionalmente el epítopo de HER3 que es reconocido por esta familia de anticuerpos relacionados (véase la Figura 5A). Además, se resolvió la estructura a 3.4 A del fragmento Fab de MOR09825 enlazado a HER3 humano. Tanto en la estructura del cristal de MOR09823/HER3 como en la estructura del cristal de MOR09825/HER3, HER3 está en la conformación fija (inactiva) (véanse las Figuras 5A, 5B, 5C y 5D). Esta conformación se caracteriza por una interfase de interacción significativa entre los dominios 2 y 4 mediada por un ciclo de dimerización de horquilla-b en el dominio 2. La conformación observada de HER3 es similar a la previamente descrita por Cho y colaboradores, (Cho & Leahy, (2002), Science 297: 1330-1333) quienes publicaron la estructura de cristal del dominio extracelular de HER3 en ausencia de neurregulina. Debido a que la neurregulina puede activar a H ER3, se presume que la conformación fija de HER3 es inactiva. Tambien se han observado conformaciones fijas similares cuando se han cristalizado los miembros HER4 de la familia de EGFR relacionados (Bouyain y colaboradores, 2005 Proc. Netl. Acad. Sci. EUA, 102: 15024-15029) y HER1 (Ferguson y colaboradores, (2003) Molec. Cell 1 1 : 507-517).

Las relaciones espaciales entre los dominios 1 a 4 de HER3 en el estado inactivo (fijo) son significativamente diferentes de aquéllas del estado extendido (activo). Este descubrimiento se basa en las estructuras de cristal de los miembros HER2 de la familia de EGFR relacionados y HER1 enlazado al ligando (Cho y colaboradores, (2003) Nature 421 : 756-760; Ogiso y colaboradores, (2002) Cell 1 10: 775-787; Garrett y colaboradores, (2002) Cell 1 10: 763-773) de las cuales ambas están en el estado extendido (activo). En el estado extendido, el ciclo de dimerización de la horquilla-b del dominio 2 se libera de su interacción inhibidora con el 4 y de esta manera queda libre para interactuar con sus proteínas compañeras de dimerización. Por lo tanto, el ciclo de dimerización de horquilla-b del dominio 2 es funcionalmente importante tanto para mantener el estado fijo (inactivo) como para mediar la dimerización de los receptores de EGF en el estado extendido, lo que conduce a la activación del dominio de cinasa intracelular. Por lo tanto, las estructuras de cristal de MOR09823/HER3 y MOR09825/HER3 (véase la Figura 5) sugieren que tanto MOR09823 como MOR09825 funcionan mediante la estabilización de la conformación inactiva de HER3.

La estructura del cristal también revela que el epítopo de HER3 reconocido tanto por MOR09823 como por MOR09825 es un epítopo no lineal que incluye residuos provenientes de ambos dominios 2 y 4 (véanse las Figuras 5C y 5D, y las Tablas 1 1 , 12, 13 y 14). Por lo tanto, el epítopo de HER3 reconocido por esta familia de anticuerpos altamente relacionados se puede definir como: Residuos del dominio 2: 265-277, 315 Residuos del dominio 4: 571 , 582-584, 596-597, 600-602, 609- 615 El enlace de ambos dominios 2 y 4 por parte de MOR09823 o MOR09825, por consiguiente, podría estabilizar la conformación fija de HER3, antagonizando de esta manera su capacidad para señalizar.

El modo de enlace de MOR09823/MOR09825 observado en la estructura de cristal es consistente con nuestros otros estudios de mapeo de epítopos. Específicamente, los experimentos de enlace de dominio con ELISA demuestran que las afinidades de MOR09823 y MOR09825 son significativamente mayores para la proteína extracelular de HER3 intacta que para cualquiera de los dominios aislados (por ejemplo, los fragmentos D1 , D1 -D 1 , D3, o D3-D4) (véase la Figura 3). Esto también es consistente con los datos de HDX-MS para HER3 (véase la Figura 4B), los cuales identifican a la horquilla-b del dominio 2 como parte del epítopo de reconocimiento del anticuerpo. Por último, ambas estructuras de cristal indican que la superficie de enlace al ligando de HER3, la cual ha sido mapeada mediante analogía con HER1 hasta los dominios 1 y 3 (Ogiso y colaboradores, (2002) Ce 11 , 1 10: 775-787; Garrett y colaboradores, (2002) Cell, 1 10: 763-773) no es obstruida por el enlace a cualquiera de MOR09823 o MOR09825 (véase la Figura 5B). Esto es consistente con el descubrimiento de los inventores de que ninguno de MOR09823 o MOR09825 bloquea el enlace de la neurregulina a las células M CF7 (véase la Figura 9) y que los complejos de HER3/MOR09823 se pueden enlazar a la neurregulina inmovilizada en los estudios con Biacore (véase la Figura 10).

TABLA 11 Interacciones entre la cadena pesada de Fab de MOR09823 y HER3 humano. Los residuos VH de Fab se numeran tomando como base su secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 15).

Los residuos de HER3 se numeran tomando como base NP_001973. Los residuos de HER3 mostrados tienen por lo menos un átomo dentro de 5Á de un átomo en el Fab de MOR09823.

TABLA 12 Interacciones entre la cadena ligera de Fab de MOR09823 y HER3 humano. Los residuos VL de Fab se numeran tomando como base su secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 14). Los residuos de HER3 se numeran tomando como base NP_001973. Los residuos de HER3 mostrados tienen por lo menos un átomo dentro de 5Á de un átomo en el Fab de MOR09823.

TABLA 13 Interacciones entre la cadena pesada de Fab de MOR09825 y HER3 humano. Los residuos VH de Fab se numeran tomando como base su secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 51 ).

Los residuos de HER3 se numeran tomando como base NP_001973. Los residuos de HER3 mostrados tienen por lo menos un átomo dentro de 5Á de un átomo en el Fab de MOR09825.

TABLA 14 Interacciones entre la cadena ligera de Fab de MOR09825 y HER3 humano. Los residuos VL de Fab se numeran tomando como base su secuencia de aminoácidos lineal (SEQ ID NO: 50). Los residuos de HER3 se numeran tomando como base NP_001973. Los residuos de HER3 mostrados tienen por lo menos un átomo dentro de 5Á de un átomo en el Fab de MOR09825.

La inspección visual de las estructuras de cristal de MOR09823/MOR09825 resaltaron que los residuos Lys267 y Leu268 de HER3 formaron interacciones múltiples con varias CDRs del anticuerpo, lo que sugiere que estos pueden ser importantes para el enlace del anticuerpo. Por consiguiente, Lys267 y/o Leu268 se mutaron a alanina, se expresaron, y las proteínas recombinantes resultantes se purificaron con el fin de evaluar su impacto sobre el enlace del anticuerpo. Los ensayos de enlace ELISA indicaron que la mutación de cualquiera de Lys267 o Leu268 eliminó el enlace de MOR10703 a HER3 (Figura 5F), lo que sugiere que ambos residuos son una parte integral del epítopo de HER3 y, por lo tanto, apoyan las interacciones propuestas entre MOR09823/MOR09825 y HER3. (vi i i) Inhibición de la señalización celular Para determinar el efecto de los anticuerpos anti-HER3 sobre la actividad de HER3 dependiente del ligando, se incubaron células MCF7 con IgG antes de la estimulación con neurregulina. Las curvas de inhibición de ejemplo se ilustran en la Figura 6A y se presentan en forma resumida en la Tabla 15. También se estudió el efecto de los anticuerpos anti-HER3 sobre la activación de HER3 mediada por HER2 utilizando la línea celular SK-Br-3 amplificada con HER2 (Figura 6B y Tabla 15).

TABLA 15 Cl so de pHER3 y valores del grado de inhibición de IgG anti-HER3 en celulas MCF7 y SK-Br-3 Para determinar si la inhibición de la actividad de HER3 impactaba a la Akt de señalización celular corriente abajo, también se midió la fosforilación en células amplificadas con HER2 después del tratamiento con anticuerpos anti-HER3 (véanse la Figura 7 y la Tabla 16).

TABLA 16 Cl so de pAkt (S473) y valores del grado de inhibición de IgG anti- HER3 en células SK-Br-3 BT-474 y MCF7 En resumen, cada uno de MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701 , MOR10702 MOR10703, MOR12609 y MOR12610 es capaz de inhibir la actividad de HER3 celular tanto de una manera dependiente del ligando como de una manera independiente del ligando. (ix) Inhibición de proliferación Debido a que MOR09823, MOR09824, MOR09825, MOR09974, MOR10701 , MOR10702 y MOR10703 inhibieron todos la actividad de HER3 y la señalización corriente abajo, éstos se analizaron con respecto a su capacidad para bloquear el crecimiento celular in vitro dependiente e independiente del ligando (los datos de ejemplo se muestran en la Figura 8 y se presentan en forma resumida en la Tabla 17). Todos los anticuerpos anti-HER3 analizados fueron inhibidores efectivos de la proliferación celular.

TABLA 17 Inhibición de proliferación después de tratamiento con 10 mg/ml de IgG anti-HER3 en células SK-Br-3, BT-474 y MCF7. (x) Evaluación del bloqueo del ligando Se analizó la capacidad de los anticuerpos anti-HER3 descritos para bloquear el enlace al ligando examinando el enlace de la neurregulina a las celulas MCF7 previamente tratadas con cualquiera de MOR09823 o MOR09825. La presencia de cualquiera de MOR09823 o MOR09825 no tuvo un efecto significativo sobre la capacidad de la neurregulina para enlazarse a las células MCF7 mientras que el control positivo utilizado en el experimento (Mab3481 ) puede interferir profundamente con el enlace de la neurregulina (véase la Figura 9). Estos resultados son consistentes con la estructura del cristal debido a que MOR09823 interactúa con los dominios 2 y 4 aunque se tiene la hipótesis de que los puntos de contacto principales para la interacción de HER3 con la neurregulina están principalmente agrupados dentro de los dominios 1 y 3. Dado que la neurregulina puede enlazarse a la conformación inactiva de HER3 (Kani y colaboradores, (2005) Biochemistry 44: 15842-15857), es probable que MOR09823 y MOR09825 funcionen impidiendo las reconfiguraciones de dominio de HER3 necesarios para la señalización o interfiriendo con la dimerización del receptor. (xi) Evaluación (bioquímica) del bloqueo del ligando Con el fin de explorar si MOR09823 y la neurregulina pueden o no enlazarse a HER3 en forma concurrente, se estableció un ensayo bioquímico utilizando la teenología BiacoreMR. Los análisis de interacción se efectúan capturando la neurregulina biotinilada sobre la superficie de un chip detector BiacoreMR CAP (GE Healthcare) utilizando un kit “Biotin CAPture” (GE Healthcare). Los complejos de HER3 se generaron incubando el HER3-Fc humano con concentraciones crecientes de cualquiera de MOR09823, 105.5 (Thermo Scientific), o IgG humana. Los complejos de HER3/ anticuerpo preformados se inyectaron sobre las superficies de referencia y activa, y se observó la interacción de HER3 con la neurregulina.

La IgG de control no tuvo efecto alguno sobre la formación del complejo de HER3/neurregulina, mientras que se observó que el 105.5 inhibía de manera significativa la capacidad de HER3 para enlazarse a la neurregulina, lo que confirma su descripción como un anticuerpo bloqueador del ligando (Figura 10). En contraste, los complejos de HER3/MOR09823 fueron capaces de enlazarse a la neurregulina, lo que demuestra que MOR09823 no impide el enlace al ligando. Como un aspecto interesante, se observó de una manera única un incremento dependiente de la dosis en los valores de UR cuando se inyectaron los complejos de MOR09823/HER3. Estos datos indican que se genera un complejo trimérico que contiene neurregulina, HER3 y MOR09823 sobre la superficie del chip. La capacidad de formarse de este complejo trimérico es predicha por la estructura del cristal de HER3/MOR09823 debido a que el enlace de MOR09823 no obstruye el sitio de enlace al ligando de HER3, lo que sugiere que el enlace de la neurregulina y del MOR09823 no son mutuamente excluyentes.

En otra modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza tanto al dominio 2 como al dominio 4 de HER3 y sin bloquear el enlace concurrente de un ligando de HER3 tal como la neurregulina. Aunque no se requiere proveer una teoría, es factible que el anticuerpo o el fragmento del mismo que se enlaza tanto al dominio 2 como al dominio 4 de HER3, mantenga a HER3 en una conformación inactiva sin bloquear el sitio de enlace al ligando en HER3. Por lo tanto un ligando de HER3 (por ejemplo, neurregulina) se puede enlazar a HER3 al mismo tiempo que el anticuerpo.

Los anticuerpos de la invención o los fragmentos de los mismos inhiben tanto la activación dependiente del ligando como la activación independiente del ligando de HER3 sin impedir el enlace del ligando. Esto se considera conveniente por las siguientes razones: (i) El anticuerpo terapéutico podría tener utilidad clínica en un amplio espectro de tumores que la de un anticuerpo que se dirija hacia un solo mecanismo de activación de HER3 (es decir, dependiente del ligando o independiente del ligando), debido a que distintos tipos de tumores son controlados por cada mecanismo. (ii) El anticuerpo terapéutico podría ser eficaz en tipos de tumores en los cuales estén implicados simultáneamente ambos mecanismos de activación de HER3. Un anticuerpo que se dirija hacia un solo mecanismo de activación de HER3 (es decir, dependiente del ligando o independiente del ligando) podría exhibir poca o ninguna eficacia en estos tipos de tumor. (iii) La eficacia de un anticuerpo que inhiba la activación dependiente del ligando de HER3 sin impedir el enlace al ligando tendría menos probabilidad de ser afectado de manera adversa por las concentraciones crecientes del ligando. Esto se traduciría ya sea en una mayor eficacia en un tipo de tumor impulsado por concentraciones muy altas del ligando de H ER3 o bien en una susceptibilidad de resistencia al fármaco reducida en donde la resistencia sea mediada por la regulación positiva de los ligandos de HER3. (iv) Un anticuerpo que inhiba la activación de HER3 mediante la estabilización de la forma inactiva sería menos propenso a la resistencia al fármaco impulsada por los mecanismos alternativos de activación de HER3.

Por consiguiente, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para tratar condiciones en las cuales los anticuerpos terapeuticos existentes sean clínicamente inefectivos. (xii) Inhibición in vivo de la actividad de HER3 y efecto sobre el crecimiento dei tumor Para determinar la actividad in vivo de los anticuerpos anti-HER3 descritos, se probó el MOR09823 en modelos tanto de tumor BxPC-3 como de tumor BT-474. Se demostró que MOR09823 inhibía la actividad de HER3 como fue demostrado por una reducción significativa en los niveles de pHER3 del tumor (Figura 1 1 ). La señalización corriente abajo de HER3 es inhibida en forma similar como se demuestra por los niveles reducidos de pAkt tanto en BxPC-3 como en BT-474 (Figura 1 1 ). En un estudio de eficacia de BT-474 controlado por HER2, el tratamiento repetido con MOR10701 produjo un 74 por ciento de inhibición del crecimiento del tumor (véase la Figura 12A) mientras que MOR10703 produce el 83 por ciento de inhibición. En el modelo de crecimiento de tumor BxPC3, tanto MOR10701 como MOR10703 inhibieron de una manera muy efectiva el crecimiento del tumor controlado por el ligando (véase la Figura 13). (xiii) Combinaciones de fármaco in vitro e impacto sobre el crecimiento celular Debido a que el crecimiento de células tumorales es frecuentemente controlado por múltiples sendas de señalización, los inventores evaluaron si las combinaciones de MOR09823 o MOR10703 con varios agentes dirigidos podría ser o no de beneficio para bloquear la proliferación celular. Los agentes dirigidos elegidos inhibieron principalmente HER2 (trastuzumab, lapatinib), EGFR (cetuximab, erlotinib), PI3K/mTOR (BEZ235), PI3K (BKM120), PIK3CA (BYL719) y mTOR (RAD001 ), debido a que estos objetivos son comúnmente activados en los tumores humanos. El análisis de isobolograma (véase la Figura 14) indicó que MOR09823 y MOR10703 exhibían combinaciones sinérgicas de fármacos con trastuzumab, lapatinib, erlotinib, cetuximab, BEZ235, BKM120, BYL719 y RAD001 . Estos datos sugieren que la inhibición de la señalización de HER3 es de un beneficio particular para los inhibidores que se dirigen hacia las cinasas de tirosina receptoras o hacia la senda de señalización de PI3K. (xiv) Combinaciones de fármacos y MOR10703 in vivo Debido a la inhibición de HER3 combinado con los agentes dirigidos hacia la cinasa de tirosina receptora in vitro, los inventores evaluaron el impacto de cualquiera de MOR10701 o MOR10703 en combinación con trastuzumab y erlotinib in vivo. En los xenomjertos de BT-474 (vease la Figura 15A), la combinación de cualquiera de MOR10701 o MOR10703 (20 miligramos/kilogramo) con una dosis sub-óptima de trastuzumab (1 miligramo/kilogramo) fue suficiente para inducir regresiones de tumor (%T/C = -50 y -37, respectivamente). En los xenoinjertos de L3.3 pancreáticos, la combinación de MOR10703 (20 miligramos/kilogramo) con erlotinib (50 miligramos/kilogramo) diariamente, dio como resultado la estasis del tumor (%T/C = 3, véase la Figura 15B). En ambos modelos, la combinación de dos fármacos fue significativamente más eficaz que cualquier fármaco solo apoyando por lo tanto el descubrimiento anterior in vitro del beneficio de combinar los anticuerpos dirigidos hacia HER3 con los agentes dirigidos hacia ErbB.

En resumen, la capacidad única de esta familia de anticuerpos para estabilizar la conformación inactiva de HER3 da como resultado una eficacia significativa in vivo en modelos en los cuales HER3 es activado ya sea de una manera dependiente del ligando o bien de una manera independiente del ligando. Asimismo, la inhibición de HER3 por esta familia de anticuerpos parece ser benéfica en combinación con una amplia variedad de terapias dirigidas.

Ejemplo 22: Anticuerpos de HER3 para hiperplasia prostática benigna (BPH), Ginecomastia, y Endometriosis: Procedimiento experimental Las ratas IGS Wistar Hannover sexualmente maduras de aproximadamente 9 semanas de edad se dosificaron por medio de inyección intravenosa en un programa de dos veces por semana con 30, 75 y 200 miligramos/kilogramo de MOR10703. En seguida de terminarse el período de dosificación de 13 semanas, 10 ratas a partir de cada grupo de dosis se sacrificaron, y se recolectaron los órganos mayores para el análisis adicional. En adición, 6 ratas a partir del grupo de dosis 200 miligramos/kilogramo se dejaron recuperarse a partir de MOR10703 durante 10 semanas antes del sacrificio con el objeto de determinar la reversibilidad de cualesquiera cambios observados. Despues del sacrificio de los animales, se registraron los pesos de los órganos antes de la fijación en formalina regulada neutra al 10 por ciento. Las secciones de tejido se prepararon y se evaluaron mediante examinación microscópica.

Resultados En las ratas machos, se observó una disminución en el peso de la próstata, la cual se correlacionó con una secreción reducida en la próstata y en las vesículas seminales (Tabla 18). Estos efectos fueron reversibles después de 10 semanas de la recuperación. Las diferencias en la media absoluta contra el control fueron como sigue: 30 miligramos/kilogramo: -31 por ciento, 75 miligramos/kilogramo: -40 por ciento, y 200 miligramos/kilogramo: -35 por ciento. La atrofia de glándula mamaria, en su mayor parte moderada o notoria, estuvo presente en todos los machos dosificados y no fue reversible después de 10 semanas de la recuperación. Este cambio se caracterizó por la ausencia del desarrollo acinar y lobular que se ve normalmente en la glándula mamaria masculina. En contraste con los controles, hubo elementos ductulares dispersados presentes en las glándulas mamarias de todos los machos tratados.

Tabla 18 Diferencias relacionadas con MOR10703 en los pesos de los órganos en las ratas machos Expresado como el porcentaje de diferencia de los promedios del grupo (% dif.).

Relativo.

Basándose en el análisis estadístico de los promedios de los grupos, los valores son significativamente diferentes del grupo de control.

En las hembras, se observó una reducción en el peso del útero en todas las dosis, la cual fue reversible despues de 10 semanas de la recuperación (Tabla 19). Las diferencias del promedio absoluto contra el control fueron de 30 miligramos/kilogramo: -24 por ciento, 75 miligramos/kilogramo: -27 por ciento, y 200 miligramos/kilogramo: -19 por ciento. La atrofia endometrial, observada como una profunda disminución en el epitelio glandular en el útero en todas las dosis ³ 30 miligramos/kilogramo/día, se correlacionó con la disminución en los pesos del útero observados al final del tratamiento. Ésta fue ligeramente reversible después de 10 semanas de la recuperación en que estuvo presente un aumento en la cantidad de epitelio glandular, aunque no tanto como en los animales de control. Otros órganos reproductivos: ovarios, oviductos, cérvix y vagina, parecieron estar dentro de los límites normales, considerando las diferentes etapas del ciclo que se pueden observar.

Tabla 19 Diferencias relacionadas con MOR10703 en los pesos de los órganos en ratas hembras a Expresado como el porcentaje de diferencia de los promedios del grupo (% dif.). b Relativo. c Basándose en el análisis estadístico de los promedios de los grupos, los valores son significativamente diferentes del grupo de control. Se refieren a las tablas de datos para los niveles reales de significancia y para las pruebas empleadas.

Discusión La hiperplasia prostética benigna (BPH) es una enfermedad común en los hombres mayores que se caracteriza por un agrandamiento no neoplásico de la próstata que conduce a presión sobre la uretra y que da como resultado problemas de micción y de vejiga {MahapokaM W, van Sluijs FJ & Schalquen JA. 2,000 Prostate Cáncer and Prostatic Diseases 3, 28-33}. Está presente una evidencia anatómica o microscópica de hiperplasia prostática benigna (BPH) en la autopsia en aproximadamente el 55 por ciento de los hombres de 60 a 70 años de edad. La resección transuretral de la próstata ha sido el tratamiento de elección durante muchos años. En consecuencia, la hiperplasia prostática benigna (BPH) es una de las razones más comunes para la intervención quirúrgica entre los hombres ancianos. Los metodos menos invasivos para el tratamiento incluyen: (i) Los bloqueadores alfa-1 (doxazosina, prazosina, tamsulosina, terazosina, y alfuzosina) son una clase de medicamentos también utilizados para tratar la alta presión sanguínea. Estos medicamentos relajan los músculos de la vejiga, el cuello y la próstata, permitiendo, por consiguiente, una micción más fácil. (ii) La finasterida y la dutasterida disminuyen los niveles de andrógeno, reduciendo, por consiguiente, el tamaño de la glándula próstata, aumentando la velocidad de flujo de la orina, y disminuyendo los síntomas de la hiperplasia prostática benigna (BPH). Se pueden necesitar de 3 a 6 meses antes de que se observe alguna mejora en los síntomas. Los efectos secundarios potenciales relacionados con el uso de finasterida y dutasterida incluyen una disminución en el impulso sexual y en la impotencia.

Los resultados en la sección de experimentos demuestran por primera vez que la hiperplasia prostética benigna (BPH) es una indicación dependiente de la neurregulina. El hallazgo de que MOR10703 redujo significativamente el tamaño de la próstata en las ratas sexualmente maduras sin afectar a los niveles de hormonas, sugiere que MOR10703 podría ser útil para el tratamiento de la hiperplasia prostética benigna (BPH).

Para probar adicionalmente MOR10703 y otros anticuerpos de HER3 como productos terapéuticos para la hiperplasia prostética benigna (BPH), se pueden trasplantar muestras quirúrgicas de hiperplasia prostética benigna (BPH) humana primaria a ratas o ratones atímicos, y se puede estudiar el efecto de los anticuerpos de HER3 utilizando modelos (Otto U y colaboradores, Urol Int 1992; 48: 167 -170). De una manera alternativa, se pueden inducir aspectos de la hiperplasia prostética benigna (BPH) en perros castrados por medio de la administración a largo plazo de 5a-Androstano-3a, 17b-diol más estradiol, y se probaron los anticuerpos de HER3 en estos modelos caninos (Walsh PC, Wilson JD. J Clin Invest 1976; 57: 1093 - 1097).

La manifestación física de ginecomastia es el agrandamiento de la mama en los hombres, normalmente se presenta en ambas mamas, pero algunas veces puede presentarse en una solamente, conocida como ginecomastia asimétrica o unilateral. La ginecomastia es comúnmente causada por: (i) Niveles elevados de estrógeno que dan como resultado que se desquilibre la proporción de la testosterona al estrógeno. (ii) Antagonistas de andrógeno o anti-andrógenos utilizados en el tratamiento de cáncer de próstata o de la hiperplasia prostética benigna (BPH). Estos fármacos suprimen la testosterona pero cuando se suprime la testosterona, el estrógeno empieza a elevarse.

Aunque actualmente se están evaluando un número de fármacos experimentales, no hay en el presente tratamientos aprobados para la ginecomastia. En consecuencia, la ginecomastia se trata por medio de la remoción quirúrgica del tejido de la mama. La observación de que MOR10703 indujera la atrofia irreversible de la glándula mamaria masculina indica que puede ser benéfico en el tratamiento de ginecomastia.

Para probar adicionalmente MOR10703 y otros anticuerpos de HER3 para el tratamiento de ginecomastia humana, se pueden utilizar modelos de ginecomastia de ratones transgénicos. Estos modelos se han desarrollado mediante la expresión de la aromatasa humana en la glándula mamaria del ratón, y recapitulan muchos aspectos de la ginecomastia humana (Li y colaboradores, Endocrinology 2002; 143: 4074-4083; Tekmal y colaboradores, Cáncer Res 1996; 56: 3180-318).

MOR10703 y otros anticuerpos de HER3 también se pueden examinar para el tratamiento de endometriosis, una condición ginecológica en donde aparecen células a partir del revestimiento del útero (endometrio) y florecen hacia afuera de la cavidad uterina. El síntoma principal, pero no universal, de la endometriosis es el dolor pélvico en diversas manifestaciones. Aunque no está bien caracterizada la causa subyacente de la endometriosis, se piensa que es dependiente de la presencia de estrógeno. Debido a que MOR10703 indujo atrofia endometrial en los ratones hembras dando como resultado una disminución en el peso del útero, se puede utilizar para tratar endometriosis. Con el fin de estudiar adicionalmente los efectos de MOR10703 y otros anticuerpos de HER3 sobre la endometriosis, se puede implantar el endometrio humano en la fase proliferativa en la cavidad peritoneal de los ratones atímicos con ciclo normal y ovariectomizados o de los ratones con ciclo diabéticos no obesos (NOD) con inmunodeficiencia combinada grave (SCID), y se pueden utilizar estos ratones SCID como modelos (Grummer y colaboradores, 2001. Human Reproduction; 16; 1736-1743).

Ejemplo 23: Estudios in vitro para evaluar los anticuerpos de HER3 para cáncer esofágico Estudios esofágicos de combinación de fármacos in vitro Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos dirigidos a HER3 para combinarse con las terapias dirigidas, se combinó MOR10703 con cetuximab o BYL719 en los ensayos de viabilidad celular. Se sembraron de aproximadamente 1 ,000 a 1 ,200 células KYSE140 y KYSE180 en placas de 384 pozos en el medio de cultivo apropiado complementado con suero bovino fetal (FBS) al 2 por ciento y se dejaron adherirse durante la noche a 37°C. Subsiguientemente se agregaron a los pozos las combinaciones de fármacos apropiadas (la concentración final típica de los fármacos para BYL719 estuvo en el intervalo de 2.8 mM a 3.8 nM; para el cetuximab estuvo en el intervalo de 93 nM a 0.13 nM ; y para el MOR10703 estuvo en el intervalo de 100 nM a 4.1 nM), de tal manera que cada plato contuvo una curva de respuesta a la dosis de cada fármaco en una matriz bidimensional. Las células tratadas se incubaron subsiguientemente durante 96 a 120 horas. Al final del tratamiento con el fármaco, se agregó el reactivo CelITiter-Glo a cada pozo para lisar las células, y se registraron las señales de luminiscencia utilizando un lector de placas Envision. Se calculó el grado de inhibición del crecimiento obtenido con cada combinación, y se resaltó la actividad de la combinación utilizando el modelo de aditividad de Loewe.

Combinaciones de fármacos esofágicos in vitro e impacto sobre el crecimiento celular Debido a que el crecimiento de las células tumorales es con frecuencia impulsado por múltiples sendas de señalización, se evaluaron las combinaciones de MOR10703 con cetuximab o BYL719 para determinar si serían benéficas para bloquear la proliferación de las líneas celulares de cáncer esofágico. Los agentes dirigidos seleccionados inhibieron primordialmente EGFR (cetuximab) y PIK3CA (BYL719), debido a que estos objetivos son comúnmente activados en los tumores humanos. El análisis de isobolograma (véase la Figura 16) indicó que MOR10703 exhibió las combinaciones sinérgicas del fármaco con cetuximab y BYL719.

Estos datos muestran que la inhibición de la señalización de HER3 es de un beneficio particular para los inhibidores que dirigen las cinasas de tirosina receptoras o la senda de señalización de PI3K. Ejemplo 24: Estudios in vivo para evaluar los anticuerpos de HER3 para cáncer esofágico Con el fin de evaluar la capacidad in vivo de los anticuerpos dirigidos a HER3 para combinarse con las terapias dirigidas, se combinó el MOR10703 con cetuximab o BYL719, y se probó en dos modelos de xenomjerto in vivo. (i) Xenoinjertos de KYSE140 in vivo Las celulas KYSE140 se cultivaron en el medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal inactivado por calor al 10 por ciento sin antibióticos hasta el momento de la implantación. Las células KYSE140 se cosecharon en un crecimiento exponencial. Se mezclaron diez millones de células con suero regulado con fosfato (PBS) / Matrigel (50:50) y se implantaron subcutáneamente en el flanco derecho superior de los ratones SCID-Beige. En el día 28, se midieron los tumores, y los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 200 milímetros cúbicos se inscribieron en el estudio de eficacia. En general, se inscribió un total de 10 animales por grupo en los estudios de eficacia. Para los estudios de un solo agente y de la combinación, los animales se dosificaron intravenosamente por medio de una inyección en la vena lateral de la cola con MOR10703 o cetuximab. El BYL719 se formuló en metil-celulosa al 0.5 por ciento y se dosificó por medio de intubación oral. (ii) Xenoinjertos de KYSE180 in vivo Las celulas KYSE180 se cultivaron en el medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal ¡nactivado por calor al 10 por ciento sin antibióticos hasta el momento de la implantación. Las células KYSE180 se cosecharon en un crecimiento exponencial. Se implantaron subcutáneamente cinco millones de células en el flanco derecho superior de los ratones sin pelo. En el día 18, se midieron los tumores, y los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 200 milímetros cúbicos se inscribieron en el estudio de eficacia. En general, se inscribió un total de 10 animales por grupo en los estudios de eficacia. Para los estudios de un solo agente y de combinación, los animales se dosificaron intravenosamente por medio de una inyección en la vena lateral de la cola con MOR10703 o cetuximab. El BYL719 se formuló en metil-celulosa al 0.5 por ciento y se dosificó por medio de intubación oral. (iii) Xenoinjertos esofágicos primarios in vivo Se pasaron tumores primarios esofágicos humanos a los ratones. Cuando el tamaño del tumor alcanzó un tamaño de aproximadamente 150 milímetros cúbicos, los animales se inscribieron en el estudio de eficacia. Para los estudios de un solo agente y de combinación, los animales se dosificaron intravenosamente por medio de una inyección en la vena lateral de la cola con MOR10703 o cetuximab. El BYL719 se formuló en metil-celulosa al 0.5 por ciento y se dosificó por medio de intubación oral.

Inhibición in vivo de HER3 y efecto sobre el crecimiento tumoral esofágico Con el fin de determinar la actividad in vivo de los anticuerpos anti-HER3 descritos, el MOR10703 se probó en ambos modelos de tumor esofágico KYSE140 y KYSE180, así como en dos modelos de tumor esofágico primario, CHES007 y CHES015. En ambos modelos KYSE140 y KYSE180 in vivo, el tratamiento con MOR10703 como un solo agente demostró inhibir efectivamente el crecimiento tumoral (Figura 17). En KYSE180, la combinación de MOR10703 y BYL719 fue suficiente para inducir regresiones tumorales significativas. Estos hallazgos se extendieron a los modelos de tumor esofágico primario, en donde una combinación de MOR10703 con cualquiera de cetuximab o BYL719 tambien indujo potentes regresiones tumorales (Figura 18). Juntos, estos datos apoyan además nuestro hallazgo anterior in vitro del beneficio de combinar los anticuerpos dirigidos a HER3 con cualquiera de los agentes dirigidos a EGFR o PI3K. Ejemplo 25: Estudios in vivo para evaluar las combinaciones de HER3 con BYL719 en cáncer gástrico.

Con el fin de evaluar la capacidad in vivo de los anticuerpos dirigidos a HER3 para combinarse con las terapia dirigidas en el cáncer gástrico, se combinó MOR10703 con BYL719, y se probó en un modelo de xenomjerto in vivo. (i). Xenoinjerto de NCI-N87 in vivo Las células NCI-N87 se hicieron crecer en un medio de cultivo DMEM que contenía 4.5 gramos/litro de glucosa, complementado con suero fetal de becerro (FCS) inactivado por calor al 10 por ciento, L- glutamina 2 mM , piruvato de sodio 1 mM, hasta el punto de la implantación. Los tumores NCI-N87 se establecieron mediante la inyección de 8 x 1 O6 a 1 x 107 celulas (en HBSS que contenía el 50 por ciento en volumen/volumen de Matrigel) subcutáneamente. En el día 10, se midieron los tumores, y los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 250 milímetros cúbicos se inscribieron en el estudio de eficacia. Para los grupos de un solo agente y de combinación, los animales se dosificaron intravenosamente por medio de una inyección en la vena lateral de la cola con MOR10703. El BYL719 se formuló en metil-celulosa al 0.5 por ciento y se dosificó por medio de intubación oral.

Efecto del tratamiento de combinación sobre el crecimiento tumoral gástrico N87 Como se vio para los tumores esofágicos, la combinación de MOR10703 y BYL719 fue suficiente para inducir regresiones tumorales prolongadas significativas en el modelo de tumor gástrico N87, apoyando además, por consiguiente, el beneficio de combinar los anticuerpos dirigidos a HER3 con los agentes dirigidos a PI3K (véase la Figura 19).

Ejemplo 26: Estudios in vivo para evaluar las combinaciones de HER3 con cetuxi ab en cáncer de cabeza y cuello de células escamosas (SCCHN).

Con el fin de evaluar la capacidad in vivo de los anticuerpos dirigidos a HER3 para combinarse con las terapias dirigidas en SCCHN, se combinó MOR10703 con cetuximab, y se probó en un modelo de xenomjerto in vivo. (i) Xenoinjerto de A253 in vivo A253 celulas se cultivaron in DMEM que contiene suero bovino fetal inactivado por calor al 10 por ciento sin antibióticos hasta el tiempo de implantación. Las células A253 se cosecharon en un crecimiento exponencial. Se implantaron subcutáneamente cinco millones de células en 200 microlitros de suero regulado con fosfato (PBS) en el flanco derecho superior de los ratones sin pelo. En el día 25, se midieron los tumores, y los animales con un volumen tumoral de aproximadamente 200 milímetros cúbicos se inscribieron en el estudio de eficacia. En general, se inscribió un total de 9 animales por grupo en los estudios de eficacia. Para los estudios de un solo agente y de combinación, los animales se dosificaron intravenosamente por medio de una inyección en la vena lateral de la cola con MOR10703 o cetuximab.

Efecto del tratamiento de combinación sobre el crecimiento del tumor A253 SCCHN En el modelo de A253 SCCHN, el tratamiento con cualquiera de MOR10703 o cetuximab como un solo agente dio como resultado estasis de tumor. La combinación de MOR10703 con cetuximab fue significativamente más activa y dio como resultado la regresión del tumor (véase la Figura 20).

Colectivamente, estos resultados muestran que el MOR10703 como un solo agente puede inhibir el crecimiento tumoral. Los resultados también muestran que hay un efecto sinérgico sobre la regresión del tumor cuando se combina el MOR 10703 con los inhibidores que se dirigen hacia otras cinasas de tirosina receptoras o hacia la senda de señalización de PI3K.

Incorporación como referencia Todas las referencias citadas en la presente solicitud, incluyendo las patentes, solicitudes de patente, artículos, libros de texto, y similares, y las referencias citadas en los mismos, hasta el grado en que estos no hayan sido incorporados, quedan incorporados como referencia en la presente solicitud en su totalidad.

Equivalentes La memoria descriptiva escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la téenica practique la invención. La descripción anterior y los ejemplos presentan con detalle ciertas modalidades preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Se apreciará, sin embargo, que no importa qué tan detallada aparezca la descripción en el texto, la invención se puede practicar en muchas formas y la invención debe ser considerada de conformidad con las reivindicaciones adjuntas y cualesquiera equivalentes de las mismas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para el tratamiento de un trastorno caracterizado por un aumento de los niveles de expresión de HER3 en un tracto esofágico, el cual comprende: seleccionar al paciente que padezca de un aumento de los niveles de expresión de HER3 en un tracto esofágico; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera el trastorno.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde el trastorno se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer esofágico y cáncer esofágico de Barretts.

3. El método de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se administra por una vía seleccionada a partir del grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, ¡ntracerebroventricular, intra-parenquimal, intratecal, intracraneal, bucal, mucosal, nasal, y rectal.

4. El método de la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o el fragmento se formula en una composición farmacéutica, la cual comprende un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

5. El metodo de la reivindicación 4, el cual comprende además un agente terapéutico adicional.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de HER1 , un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EM D72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 1 1 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib / Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en MM-121 , MM-1 1 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moléculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de HER4.

8. El método de la reivindicación 6, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affinitor®.

9. El método de la reivindicación 6, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BMK120 y BYL719.

10. Un método para el tratamiento de cáncer gástrico, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de cáncer gástrico; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera el cáncer gástrico.

1 1 . El método de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se administra por una vía seleccionada a partir del grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intra-parenquimal, intratecal, intracraneal, bucal, mucosal, nasal, y rectal.

12. El método de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o el fragmento se formula en una composición farmacéutica, la cual comprende un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

13. El método de la reivindicación 12, el cual comprende además un agente terapéutico adicional.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de H ER1 , un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EM D72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 1 1 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib / Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en MM-121 , MM-1 1 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moléculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de HER4.

16. El método de la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affinitor®.

17. El método de la reivindicación 14, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BMK120 y BYL719.

18. Un método para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de cáncer de cabeza y cuello; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera el cáncer de cabeza y cuello.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se administra por una vía seleccionada a partir del grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intra-parenquimal, intratecal, intracraneal, bucal, mucosal, nasal, y rectal.

20. El método de la reivindicación 18, en donde el anticuerpo o el fragmento se formula en una composición farmacéutica, la cual comprende un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

21 . El método de la reivindicación 20, el cual comprende además un agente terapeutico adicional.

22. El método de la reivindicación 21 , en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de HER1 , un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3.

23. El método de la reivindicación 22, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EMD72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 1 1 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib / Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en MM-121 , MM-1 1 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moléculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de HER4.

24. El método de la reivindicación 22, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affinitor®.

25. El método de la reivindicación 22, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BMK120 y BYL719.

26. Un método para el tratamiento de hipoplasia benigna de la próstata, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de hipoplasia benigna de la próstata; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera la hipoplasia benigna de la próstata.

27. El método de la reivindicación 26, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se administra por una vía seleccionada a partir del grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intra-parenquimal, intratecal, intracraneal, bucal, mucosal, nasal, y rectal.

28. El método de la reivindicación 26, en donde el anticuerpo o el fragmento se formula en una composición farmacéutica, la cual comprende un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

29. El método de la reivindicación 28, el cual comprende además un agente terapéutico adicional.

30. El metodo de la reivindicación 29, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de HER1 , un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3.

31. El método de la reivindicación 30, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EM D72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 1 1 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib / Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en M M-121 , MM-1 1 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moléculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de HER4.

32. El método de la reivindicación 30, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affinitor®.

33. El método de la reivindicación 30, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BMK120 y BYL719.

34. Un método para el tratamiento de ginecomastia, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de ginecomastia; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera la ginecomastia.

35. El método de la reivindicación 34, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se administra por una vía seleccionada a partir del grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intrapa re n q u i m a I , intratecal, intracraneal, bucal, mucosal, nasal, y rectal.

36. El método de la reivindicación 34, en donde el anticuerpo o el fragmento se formula en una composición farmacéutica, la cual comprende un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

37. El método de la reivindicación 36, el cual comprende además un agente terapéutico adicional.

38. El método de la reivindicación 37, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de HER1 , un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3.

39. El método de la reivindicación 38, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EMD72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 1 1 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib / Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en MM-121 , MM-1 1 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), M EHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moléculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de HER4.

40. El método de la reivindicación 38, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affinitor®.

41 . El método de la reivindicación 38, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BMK120 y BYL719.

42. Un método para el tratamiento de endometriosis, el cual comprende: seleccionar a un paciente que padezca de endometriosis; y administrar un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlace específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlace a un epítopo conformacional que comprenda residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3, y que bloquee la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, tratando de esta manera la endometriosis.

43. El metodo de la reivindicación 42, en donde el anticuerpo o un fragmento del mismo se administra por una vía seleccionada a partir del grupo que consiste en administración oral, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intracerebroventricular, intra-parenquimal, intratecal, intracraneal, bucal, mucosal, nasal, y rectal.

44. El método de la reivindicación 42, en donde el anticuerpo o el fragmento se formula en una composición farmacéutica, la cual comprende un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable.

45. El método de la reivindicación 44, el cual comprende además un agente terapéutico adicional.

46. El método de la reivindicación 45, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona a partir del grupo que consiste en un inhibidor de H ER1 , un inhibidor de HER2, un inhibidor de HER3, un inhibidor de HER4, un inhibidor de mTOR y un inhibidor de cinasa PI3.

47. El metodo de la reivindicación 46, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de HER1 seleccionado a partir del grupo que consiste en Matuzumab (EM D72000), Erbitux® / Cetuximab, Vectibix® / Panitumumab, mAb 806, Nimotuzumab, Iressa® / Gefitinib, CI-1033 (PD183805), Lapatinib (GW-572016), Tykerb® / Ditosilato de lapatinib, Tarceva® / Erlotinib HCL (OSI-774), PKI-166, y Tovok®; un inhibidor de HER2 seleccionado a partir del grupo que consiste en Pertuzumab, Trastuzumab, MM-1 1 1 , neratinib, lapatinib o ditosilato de lapatinib /Tykerb®; un inhibidor de HER3 seleccionado a partir del grupo que consiste en MM-121 , MM-1 1 1 , IB4C3, 2DID12 (U3 Pharma AG), AMG888 (Amgen), AV-203 (Aveo), MEHD7945A (Genentech), MOR10703 (Novartis), y moléculas pequeñas que inhiben HER3; y un inhibidor de HER4.

48. El método de la reivindicación 46, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de mTOR seleccionado a partir del grupo que consiste en Temsirolimus / Torisel®, ridaforolimus / Deforolimus, AP23573, MK8669, everolimus / Affinitor®.

49. El método de la reivindicación 46, en donde el agente terapéutico adicional es un inhibidor de cinasa PI3 seleccionado a partir del grupo que consiste en GDC 0941 , BEZ235, BMK120 y BYL719.

50. El uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un trastorno esofágico.

51 . El uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer gástrico.

52. El uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello.

53. El uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducclón de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hiperplasia prostática benigna (BPH).

54. El uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de ginecomastia.

55. El uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que se enlaza específicamente a un receptor HER3, de tal manera que el anticuerpo o un fragmento del mismo se enlaza a un epítopo conformacional que comprende residuos de aminoácidos dentro del dominio 2 y el dominio 4 del receptor HER3 y bloquea la transducción de señales tanto dependiente del ligando como independiente del ligando, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de endometriosis.