KR20200131838A - 항체의 친화성 성숙화를 위한 방법 - Google Patents

항체의 친화성 성숙화를 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대상 항체의 프레임워크 영역 및 적어도 하나의 인접한 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성시키는 신규한 방법에 관한 것이다. 이들 라이브러리는 부모 항체와 비교하여 개선된 특징을 갖는 성숙된 항체를 수득하기 위한 친화성 성숙화 과정에서 사용에 적합하다.

Description

항체의 친화성 성숙화를 위한 방법
본 발명은 대상 항체의 프레임워커 영역 및 적어도 하나의 인접한 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성시키는 신규한 방법에 관한 것이다. 이들 라이브러리는 부모 항체와 비교하여 개선된 특징을 갖는 성숙된 항체를 수득하기 위해서 친화성 성숙화 과정에서 사용하기에 적합한다.
본 명세서에서, 특허 출원 및 제조사 매뉴얼을 포함한 많은 문헌들이 인용된다. 본 발명의 특허성과 관련된 것으로 간주되지 않더라도, 이들 문헌의 개시 내용은 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다. 보다 특히, 모든 참조 문헌은 각각의 개별 문헌이 특별히 개별적으로 참조로 편입된다고 표시한 바와 동일한 정도로 참조로 편입된다.
항체는 진단 및 치료 분야에서 광범위하게 사용된다. 이것은 이러한 항체의 성질의 최적화, 예를 들어 표적 항원에 대한 친화성의 증가를 위한 절차를 개발하는데 상당한 노력을 이끌어왔다. 항체의 친화성 증가는 감소된 항체 및/또는 항원 농도에서 개선된 특이성에 기인하여 항체의 성능을 증강시킬 것으로 기대된다. 세포-기반 디스플레이, 예를 들어 효모 세포 표면 디스플레이, 파지 디스플레이 또는 세포-무함유 디스플레이 예컨대 리보솜 디스플레이를 포함하여, 시험관내 친화성 성숙화를 위한 상이한 방법들이 알려져 있다. 이들 방법은 비특이적 결합제를 제거하고 높은 친화성을 갖는 특이적 결합제를 동정하기 위해서 음성 및 양성 선택의 수행을 가능하게 한다.
그러나, 기지의 친화성 성숙화 방법의 단점은 개선된 항체의 선택 및 동정을 시간 소모적이고 고되게 만드는 폴리뉴클레오티드 라이브러리 내 다량의 돌연변이유발되지 않은 부모 서열의 빈번한 발생이다. 일부 경우에서는, 친화성 성숙화 절차를 통해서 개선된 항체를 동정하는 것이 전혀 불가능하였다. 본 발명자는 이제 바람직하지 않은 다량의 부모 서열을 함유하지 않는 라이브러리를 제공하여 종래 기술과 연관된 단점을 극복하기 위한 방법을 발견하였다.
본 발명은 심장 트로포닌 T (cTnT)에 대한 항체를 예로 들지만, 이 방법을 다른 항원에 대한 항체에게 전달할 수 있다는 것을 고려한다.
심장 트로포닌 T는 심장 질환을 갖는 환자에서 광범위하게 사용되는 바이오마커이다. 심장 질환을 갖는 환자에서 이의 이용성은 최근에 Westermann 등 (Nature Reviews / Cardiology, vol 14 (2017) 473-483)이 검토하였다. cTnT의 사용은 급성 심근 경색 (AMI)이 의심되는 환자에서 충분히 확립되어 있지만, 트로포닌 측정은 또한 다른 급성 및 비급성 상황에서도 사용된다. AMI가 의심되는 환자에서, 초기 의사 결정은 신속한 치료 및 추가 진단 평가를 가능하게 하는데 결정적이다.
트로포닌에 대한 더 새로운, 고감도 어세이는 뚜렷하게 더 낮은 농도의 검출을 가능하게 한다. 이들 어세이 및 매우 낮은 컷오프 농도를 사용하여, 급성 심장 치료의 진단을 개선하기 위해 몇몇 신속 진단 전략이 보고된 바 있다. 더 나아가서, 트로포닌 어세이의 비-관상 및 비-급성 적용 - 심부전, 폐 색전증, 또는 안정된 관상 동맥 질환을 갖는 환자에서의 바이오마커 - 이 곧 일어나려 하고 개별 위험 계층화를 개선시킬 수 있을 것이다.
심장 트로포닌 T는 일반적으로 샌드위치 유형 면역 어세이에서 측정되는데, 여기서는 적어도 하나의 항체가 cTnT를 포획하는데 사용되고 적어도 2차 (표지) 항체가 샘플에서 cTnT를 검출하는데 사용된다. 이것은 또한 Roche Diagnostics (Germany)가 판매하는 cTnT에 대한 5세대 어세이에서도 그러하다. 유럽 균주 은행 (European Collection of Animal Cell Cultures) (GB)에 기탁된, 하이브리도마 클론 7.1 A 12.2-22 (ECACC 89060901)에 의해 생산되는 단일클론 항체 12.1A11.11-7은 거의 30여년 동안 cTnT의 어세이에서 최선의 검출 항체로서 사용되어 왔다. 이 항체가 1989년에 생성된 이래로, cTnT의 검출을 위해 더 나은 단일클론 항체가 부상된 적은 없다.
지난 수년간, 예를 들어 이러한 어세이에서 사용되는 검출 항체의 표지화를 위한 정교한 기술을 기반으로, 다양한 트로포닌의 측정을 위한 보다 민감한 어세이가 개발되었다.
많은 연구들이 AMI로 의심되는 환자의 환자분류를 개선시킬 그들 잠재성을 비롯하여 다른 임상 진단에서 그들 유용성에 대해 트로포닌의 다양한 고감도 어세이를 평가하였다.
가장 민감한 트로포닌 어세이 조차도 일정 비율의 건강한 개체에서 트로포닌을 측정하는데 실패했다고 보고하였다 (예를 들어, Westermann et al., 상기). 분명하게, 어세이 감도는 예를 들어, cTnT의 검출에서 가장 중요하고 그 목적을 위한 개선이 매우 바람직할 것이다.
이제 본 명세서의 청구항에서 정의된 바와 같이 친화성 성숙화를 위한 신규 방법을 기반으로 다른 한편으로는 cTnT와 항체의 복합체 형성에 음성적으로 영향을 미치지 않지만 cTnT 및 이러한 돌연변이체 항체 간에 형성된 복합체의 안정성에 대해서는 유의한 개선을 나타내는 항체 12.1A11.11-7의 상보성 결정 영역 (CDR)에 일정 돌연변이를 보유하는 항체를 선택하고 동정할 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 이들 놀라운 성질을 통해서 우수한 감도의 cTnT에 대한 어세이가 실현가능하다.
항체 12.1A11.11-7에 성공적으로 적용된 친화성 성숙화 방법은 본 개시를 기반으로 진단 및 치료 항체를 포함한 다양한 항체에 전달될 수 있다.
따라서, 본 발명은 일련의 증폭 반응을 수행하여 항체의 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성시키는 신규 방법에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 표적 항원에 대해 증가된 친화성과 같은 개선된 성질을 갖는 항체를 동정하기 위해 선택 절차에서 사용될 수 있다.
기지의 부모 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는 가변 사슬을 갖는 부모 항체와 비교하여 개선된 특징을 갖는 항체를 생성시키는 것이 본 발명의 목적이고, 여기서 이들 기지 CDR은 기지의 CDR 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
제1 단계에서, 다수의 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 상기 부모 항체의 가변 사슬의 하나의 무작위적 CDR 또는 상기 부모 항체의 가변 사슬의 2개의 인접한 무작위적 CDR을 코딩하여 생성된다. 이들 라이브러리는 CDR에 대한 개별 무작위화 정도에 따라서 약 107 내지 약 1011 구성원, 또는 약 108 내지 약 1010 구성원의 크기를 가질 수 있다.
이들 라이브러리를 조합하여, 추가의 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생성시킨다. 이러한 라이브러리의 구성원은 무작위적 가변 사슬, 즉, 상기 부모 항체의 가변 사슬의 무작위적 CDR1, 무작위적 CDR2 및 무작위적 CDR3을 코딩한다. 또한, 라이브러리의 구성원은 가변 사슬의 프레임워크 영역 FW1, FW2, FW3 및 FW4, 특히 부모 항체의 가변 사슬의 프레임워크 영역 FW1, FW2, FW3 및 FW4를 코딩할 수 있다. 이 라이브러리는 CDR의 개별 무작위화 정도에 따라서 약 106 내지 약 1022 구성원, 또는 약 1011 또는 약 1013, 또는 약 2x1011 내지 5x1012 구성원의 크기를 가질 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열이 실질적으로 없다. 이것은 임의의 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열의 부재 하에서 라이브러리를 생성시켜 획득될 수 있다. 따라서, 라이브러리 중 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 개별 라이브러리 구성원의 양은 하나의 무작위적 CDR 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 라이브러리의 경우에 약 1:106 이하, 1:5x105 이하, 또는 1:105 이하이거나 또는 2개의 무작위적 CDR 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우 1:107 이하이거나 또는 3개의 무작위적 CDR 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우 약 1:5x107 이하 또는 1:108 이하이다.
일 구현예에서 하나의 CDR은 무작위적이고 수득된 라이브러리 내 부모 폴리뉴클레오티드 서열 대 다른 (무작위적) 폴리뉴클레오티드 서열의 비율은 1:106 이하이다. 일 구현예에서 2개 CDR이 무작위적이고 수득된 라이브러리 내 부모 폴리뉴클레오티드 서열 대 다른 (무작위적) 폴리뉴클레오티드 서열의 비율은 1:107 이하이다. 일 구현예에서 3개의 CDR이 무작위적이고 수득된 라이브러리 내 부모 폴리뉴클레오티드 서열 대 다른 폴리뉴클레오티드 서열의 비율은 1:5x107 이하이다.
무작위적 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 기지 방법에 따라서 항체 라이브러리를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체 라이브러리로부터, 부모 항체와 비교하여 개선된 특징을 갖는 개별 항체의 효율적인 선택이 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 양상은 대상 항체의 프레임워크 영역 및 적어도 하나의 인접한 상보성 결정 영역 (CDR)을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하는 방법에 관한 것이고, 여기서 항체는 기지 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 기지의 부모 CDR을 포함하고, 이 방법은
i) 항체의 제1 프레임워크 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계,
ii) (i)의 폴리뉴클레오티드에 대한 제1 PCR 프라이머를 제공하는 단계,
iii) 각각 엘리먼트 A-B-C로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 제공하는 단계로서,
A)는 제1 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고,
각각의 B)는 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열와 동일한 코돈 개수를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 구성원으로서, 상기 라이브러리의 구성원은 적어도 하나의 무작위적 코돈, 예를 들어 하나의 무작위적 코돈 또는 2개의 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인되고,
C)는 제2 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드인, 단계,
iv) 엘리먼트 C)에 대한 제2 PCR 프라이머를 제공하는 단계,
v) 폴리뉴클레오티드 (i) 내지 (iv)를 기반으로 PCR을 수행하여, 폴리뉴클레오티드의 라이브러리리를 수득하는 단계로서, 이러한 PCR은 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열의 부재 하에서 수행되는 것인 단계
를 특징으로 한다.
이러한 양상에 따라서, 제1 프레임워크 영역은 FW1 또는 FW4이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 첫번째가 FW1이면 FW2이거나, 또는 첫번째가 FW4이면 FW1이거나, 또는 첫번째가 FW4이면 FW3이고, 상기 CDR은 제1 프레임워크 영역이 FW1이면 CDR1이거나, 또는 제1 프레임워크 영역이 FW4이면 CDR3이다.
따라서, 특별한 구현예에서, 제1 프레임워크 영역은 FW1이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 FW2이고, 상기 제1 프라이머는 FW1에 대한 전방향 프라이머이고, 상기 제2 프라이머는 FW2에 대한 역방향 프라이머이고, 상기 CDR은 CDR1이다.
이러한 양상의 추가의 특별한 구현예에서, 제1 프레임워크 영역은 FW4이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 FW3이고, 상기 제1 프라이머는 FW4에 대한 역방향 프라이머이고, 상기 제2 프라이머는 FW3에 대한 전방향 프라이머이고, 상기 부모 CDR은 CDR3이다.
본 발명의 추가 양상은 대상 항체의 프레임워크 영역 및 2개의 인접하는 상보성 결정 영역 (CDR)을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성시키는 방법에 관한 것으로서, 항체는 제1 및 제2 기지의 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 기지의 제1 및 제2 부모 CDR을 포함하고, 방법은
i) 항체의 제1 프레임워크 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계,
ii) 각각 엘리먼트 A-B-C로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 제1 혼합물을 제공하는 단계로서,
A)는 제1 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고,
각각의 B)는 제1 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 코돈을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 구성원으로서, 상기 라이브러리의 구성원은 적어도 하나의 무작위적 코돈, 예를 들어 하나의 무작위적 코돈 또는 2개의 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인되고,
C)는 제2 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드인, 단계,
iii) 엘리먼트 C)에 대한 제1 PCR 프라이머를 제공하는 단계,
iv) 각각 엘리먼트 A'-B'-C'로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 제2 혼합물을 제공하는 단계로서,
A')는 상기 제1 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고,
각각 B')은 제2 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 코돈을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 구성원으로서, 상기 라이브러리의 구성원은 적어도 하나의 무작위적 코돈, 예를 들어 하나의 무작위적 코돈 또는 2개의 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인되고,
C')은 제3 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드인, 단계,
v) 엘리먼트 C')에 대한 제2 PCR 프라이머를 제공하는 단계,
vi) 폴리뉴클레오티드 (i) 내지 (v)를 기반으로 PCR을 수행하여, 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 수득하는 단계로서, 이러한 PCR은 임의의 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열의 부재 하에서 수행되는 것인 단계
를 특징으로 한다.
이러한 양상의 특별한 구현예에서, 제1 프레임워크 영역은 FW2이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 FW1이고, 상기 제3 프레임워크 영역은 FW3이고, 제1 부모 CDR은 CDR1이고, 제2 부모 CDR은 CDR2이고, 엘리먼트 C)에 대한 상기 제1 프라이머는 FW1에 대한 전방향 프라이머이고, 엘리먼트 C')에 대한 상기 제2 프라이머는 FW3에 대한 역방향 프라이머이다.
이러한 양상의 추가의 특정한 구현예에서, 제1 프레임워크 영역은 FW3이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 FW2이고, 상기 제3 프레임워크 영역은 FW4이고, 제1 부모 CDR은 CDR2이고, 제2 부모 CDR은 CDR3이고, 엘리먼트 C)에 대한 상기 제1 프라이머는 FW2에 대한 전방향 프라이머이고, 엘리먼트 C')에 대한 상기 제2 프라이머는 FW4에 대한 역방향 프라이머이다.
사용되는 용어 "부모 항체" 또는 "부모 면역글로불린"은 각각 기지의, 또는 비변형된 항체를 의미한다. 본 개시에서 예시하는 바와 같이, 부모 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 일정 부분은 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성시키는데 사용된다.
"부모 CDR"은 기지의, 미변형되거나, 또는 부모 항체의 CDR-서열이다. "부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열"은 부모 항체의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데스옥시리보뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함하여, 다수의 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 약 10개 뉴클레오티드를 포함하는 분자를 포괄한다. 일정 구현예에서, 뉴클레오티드는 데스옥시리보뉴클레오티드이다.
용어 "하이브리드화할 수 있는"은 적절한 조건, 예를 들어 온도, 이온 강도 및 인큐베이션 시간의 적절한 조건 하에서, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드가 상보성 폴리뉴클레오티드와 어닐링하여 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하는 것으로 당분야에서는 이해된다. 본 발명에 따라서, 용어 "하이브리드화할 수 있는"은 특히 증폭 반응, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 PCR의 조건 하에서 단일-가닥 폴리뉴클레오티드가 상보성 폴리뉴클레오티드와 어닐링하여서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하는 것을 의미한다. 증폭 반응, 예를 들어 PCR에서 가닥 어닐링에 적절한 조건은 당분야에 충분히 공지되어 있다.
상기 기술된 바와 같은 방법은 엘리먼트 A-B-C 또는 A'-B'-C'로 이루어진 폴리뉴클레오티드 혼합물의 용도를 포함한다. 엘리먼트 B는 무작위적이게 되는 특별한 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 코돈을 포함하고 적어도 하나의 무작위적 코돈, 예를 들어 하나의 무작위적 코돈 또는 2개의 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인된다. 일정 구현예에서, 엘리먼트 B는 하나의 무작위적 코돈을 포함한다. 이들 폴리뉴클레오티드 혼합물은 공지의 방법에 따라서 화학적 폴리뉴클레오티드 합성을 통해 제공될 수 있다.
일정 구현예에서, 엘리먼트 B의 혼합물은 하나의 CDR 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상이한 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인되는 다수의 서브-세트로 구성된다. 따라서, CDR 폴리뉴클레오티드 서열이 10개 코돈, 즉 30개 뉴클레오티드를 포함하는 경우에, 엘리먼트 B의 개별 혼합물은 각각이 하나의 상이한 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인되는 10개 이하의 서브세트로 구성될 수 있다. 따라서, 일정 구현예에서, 엘리먼트 B의 혼합물은 각각이 하나의 무작위적 코돈 또는 2개의 무작위적 코돈을 포함하여서, CDR 폴리뉴클레오티드 서열의 모든 코돈의 무작위화를 포괄하도록 디자인된 다수의 서브-세트를 포함하도록 디자인된다.
폴리뉴클레오티드 혼합물 A-B-C 또는 A'-B'-C'의 엘리먼트 B는 적어도 하나의 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인된다. 무작위적 코돈은 제한없이, NNN (여기서 N은 A/C/G/T를 의미함), NNB (여기서 N은 A/C/G/T를 의미하고 B는 C/G/T를 의미함), NNK (여기서 N은 A/C/G/T를 의미하고 K는 G/T를 의미함), 또는 NNS (여기서 N은 A/C/G/T를 의미하고 S는 C/G를 의미함)를 포함하는, 임의의 적합한 무작위적 코돈으로부터 선택될 수 있다. 일정 구현예에서, 무작위적 코돈은 NNK 코돈이다. 그러나, 무작위화는 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하지 않게 디자인된다는 것을 유의해야 한다.
본 발명의 여전히 추가의 양상은 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라서 수득가능한 폴리뉴클레오티드의 라이브러리이고, 폴리뉴클레오티드는 가변 항체 사슬, 예를 들어 가변 H 사슬 또는 가변 L 사슬의 하나의 무작위적 CDR 또는 2개의 무작위적 CDR를 코딩한다. 본 발명자는 이러한 라이브러리는 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열이 실질적으로 없다는 것을 확인하였다. 라이브러리는 하나의 무작위적 CDR, 예를 들어 CDR1 또는 CDR3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 2개의 인접한 무작위적 CDR, 예를 들어 CDR1 및 CDR2, 또는 CDR2 및 CDR3의 조합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 이들 라이브러리는 예를 들어 3개의 무작위적 CDR, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 가변 항체 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생성하도록, 중복 PCR 또는 균등한 증폭 반응을 통해 조합될 수 있다.
따라서, 상기 기술된 바와 같은 라이브러리, 특히 각각이 항체의 하나의 CDR 또는 2개의 인접한 CDR의 무작위적 변이체를 코딩하는, 몇몇 라이브러리의 조합은항체의 가변 사슬, 예를 들어 무작위적 가변 H-사슬 또는 무작위적 가변 L-사슬의 무작위적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특별한 구현예에서, 가변 사슬은 무작위적 가변 H-사슬이다.
본 발명의 여전히 추가의 양상은 상기 기술된 바와 같이 생성된 라이브러리를 기반으로 중복 PCR 또는 동등한 증폭 반응을 수행하여 항체의 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성시키기 위한 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 무작위적 CDR1을 포함하는 라이브러리, 무작위적 CDR 1 및 무작위적 CDR2를 포함하는 라이브러리, 무작위적 CDR2 및 무작위적 CDR3을 포함하는 라이브러리, 및 무작위적 CDR3을 포함하는 라이브러리가 예를 들어 출발 물질로서 사용된다.
폴리뉴클레오티드 서열 라이브러리의 구성원은 기지의 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열, 특히 기지 CDR1 폴리뉴클레오티드 서열, 기지 CDR2 폴리뉴클레오티드 서열 및 기지 CDR3 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 대상 항체의 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체이다. 일정 구현예에서, 라이브러리는 임의의 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 부모 CDR1 폴리뉴클레오티드 서열, 부모 CDR2 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 부모 CDR3 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 실질적으로 없다.
따라서, 본 발명의 여전히 추가의 양상은 상기 기술된 바와 같은 방법에 따라서 수득가능한 항체의 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 의미하고, 가변 사슬은 무작위적 CDR1, 무작위적 CDR2 및 무작위적 CDR을 포함하고 라이브러리는 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열이 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 라이브러리는 가변 사슬, 예를 들어 항체의 H 사슬 또는 항체의 L 사슬을 코딩하고, 항체는 기지의 부모 CDR1 폴리뉴클레오티드 서열, 기지의 부모 CDR2 폴리뉴클레오티드 서열 및 기지의 부모 CDR3 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 기지의 부모 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 대상 항체이고 라이브러리는 그 기지의 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열이 실질적으로 없다.
본 발명의 여전히 추가의 양상은 항체 라이브러리를 생성시키는 방법에 관한 것으로서, 항체는 제1 가변 사슬 및 제2 가변 사슬을 포함하고, 상기 기술된 바와 같은 상기 항체의 제1 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 전사/번역 시스템, 예를 들어 세포-기반 시스템, 파지 시스템 또는 시험관내 시스템에서 발현되고, 예를 들어 제2 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공발현시키거나 또는 단백질로서 제2 가변 사슬을 첨가하여 상기 항체의 제2 가변 사슬과 조합된다. 항체 라이브러리를 생성시키기 위한 적합한 시스템은 당분야에 공지되어 있다. 특히 적합한 시스템은 예를 들어 [Stafford et al, Protein Eng Des Sel., 2014, 27 (4): 97-109]에 기술된 바와 같은 시험관내 번역/전사 시스템의 리보솜이다.
본 발명의 여전히 추가의 양상은 상기 기술된 바와 같은 항체의 라이브러리로부터의 제1 가변 사슬 및 제2 가변 사슬을 포함하는 항체를 선택하는 방법에 관한 것이고, 선택된 항체는 기지의 부모 CDR을 포함하는 기지의 부모 가변 사슬을 갖는 부모 항체와 비교하여 개선된 결합 특징을 갖는다. 이 방법은
전사/번역 시스템에서 본 발명에 따른 항체의 제1 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 발현시키는 단계,
상기 항체의 제2 가변 사슬과 상기 항체의 제1 가변 사슬의 발현된 라이브러리를 조합시키는 단계, 및
개선된 결합 특징을 갖는 제1 가변 사슬 및 제2 가변 사슬을 포함하는 항체를 선택하는 단계
를 포함할 수 있다.
선택된 항체는 H 사슬 및 L 사슬 둘 모두에서 기지의 부모 CDR을 갖는 항체와 비교하여 개선된 결합 친화성을 나타낼 수 있다.
이러한 구현예에 따라서, 제1 및 제2 가변 사슬은 각각 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 H 사슬 및 가변 L 사슬로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에 따라서, 제1 가변 사슬은 가변 H 사슬이고 제2 가변 사슬은 가변 L 사슬이다. 다른 구현예에서, 제1 가변 사슬은 L 사슬이고 제2 가변 사슬은 H 사슬이다. 빈번하게, 항체의 가변 H 사슬은 항원 결합의 주요 부분에 기여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 경우에 발현 주형으로서 단일 종 또는 제한된 수의 종의 가변 L 사슬과 조합된 디스플레이 주형으로서 가변 H 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 제조하는 것을 고려할 수 있다. 일 구현예에서 가변 H 사슬로부터의 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 부모 가변 L 사슬과 조합되고 개선된 결합 성질을 갖는 항체가 선택된다.
본 발명은 항체의 친화성 성숙화 및 이 방법에 따라서 수득된 항체를 의미한다. 항체는 디술피드 결합으로 연결된 2개 중 (H)쇄 및 2개 경 (L)쇄를 포함할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 각각은 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 이루어진다. 항원에 대한 결합 특이성은 항체를 형성하는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인에 의해 제공된다. 보다 특히, 그들 특이성을 결정하고 특이적 리간드와 접촉하게 하는 항체의 부분은 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 한다. CDR은 분자의 최고 가변 부분이고 이들 분자의 가변성에 기여한다. 4개의 프레임워크 영역 (FW)에 내포된, 각 가변 도메인에 3개의 CDR 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3이 존재한다. 본 명세서에서 사용되는, CDR-HC (또는 CDR(HC))는 가변 중쇄의 CDR 영역을 묘사하고 CDR-LC (또는 CDR(LC))는 가변 경쇄의 CDR 영역에 관한 것이다. 유사하게, FW-HC (또는 FW(HC))는 가변 중쇄의 프레임워크 영역을 묘사하고 FW-LC (또는 FW(LC))는 가변 경쇄의 프레임워크 영역에 관한 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 용어 "포함하는"은 추가 서열/성분이 특별히 명시된 서열 및/또는 성분 이외에도 포함될 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 이 용어는 또한 청구된 대상이 정확하게 명시된 서열 및/또는 성분으로 이루어진다는 것을 포괄한다.
본 발명의 항체가 명시된 아미노산 서열을 초과하여 포함하는 구현예에서, 추가의 아미노산은 N-말단부, 또는 C-말단부, 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 추가의 서열은 예를 들어 하기 본 명세서에 상세히 논의되는 바와 같이, 예를 들어 정제 또는 검출을 위해서, 예를 들어 도입된 서열을 포함할 수 있다. 더 나아가서, 개별 서열이 명시된 서열을 "포함하는" 경우에, 그들은 또한 N-말단부 또는 C-말단부 또는 둘 모두에서 추가의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서, 항체는 이의 표적 항원에 대한 결합 친화성 및/또는 이의 결합 특이성을 특징으로 할 수 있다. 표적 항원은 항체를 생성시킬 수 있는, 임의의 구조, 예를 들어 펩티드, 단백질, 탄수화물, 핵산 등을 포함할 수 있다. 항체가 결합되는 임의의 피분석물은 표적 항원으로서 제공될 수 있고 이에 결합하는 항체는 본 명세서에 개시된 바와 같은 친화성 성숙화가 수행될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원은 진단 절차에서 임의의 관심 피분석물일 수 있다. 일정 구현예에서, 표적 항원은 SEQ ID NO:1의 인간 심장 트로포닌 T (cTnT)이다. 또한 상기에 상술된 바와 같이, 본 발명의 항체가 추가의 아미노산을 포함하는 경우에, 상기 항체는 필수적으로 이의 표적 항원, 예를 들어 cTnT에 특이적으로 결합해야 한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 따라서, 용어 "특이적으로 결합하다" (본 명세서에서는 또한 "특이적으로 상호작용하다"라고도 함)는 항체가 오직 이의 표적 항원, 예를 들어 cTnT에 특이적으로 결합하지만, 상이한 표적 항원, 예를 들어 단백질, 특히 유사한 구조의 상이한 단백질과 교차-반응하지 않거나 또는 본질적으로 교차-반응하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, cTnT에 특이적으로 결합하는 항체는 트로포닌 I (SEQ ID NO:33)과 교차-반응한다.
항체의 "결합 친화성"은 하기 방정식에 따라서 항체의 결합 부위 및 표적 항원 상의 에피토프 간 상호작용의 강도를 측정한다:
Kd = kd/ka
식에서,
Kd = 해리 평행 상수 [M]이고,
kd = 해리 속도 상수 [s-1]이고,
ka = 결합 속도 상수 [M-1 s-1]이다.
항체의 결합 친화성에 대한 추가의 관련 매개변수는 다음과 같다:
t/2 = 해리 복합체 반감기 = ln2/kd/60 [분]
Rmax = 피분석물의 반응 최대값 [RU]
MR: 몰 비율 = 피분석물의 반응 최대값 (Rmax)의 비율
본 발명에 따라서, 본 발명의 방법으로 선택된 항체는 부모 항체의 친화성에 비해 더 높은 이의 표적 항원에 대한 친화성을 갖는다. 이러한 개선된 친화성은 부모 항체와 비교하여, 적어도 20%의 적어도 t/2의 증가로 표시될 수 있다. t/2의 측정은 예를 들어 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
항체의 특이성 및 친화성을 분석하기 위한 상이한 방법은 예를 들어 [Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and in Harlow & Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기술되어 있다. 적합한 연구의 비제한적인 예는 예를 들어 구조적으로 및/또는 기능적으로 밀접하게 관련된 분자와의 결합 연구, 차단 및 경쟁 연구이다. 이들 연구는 예를 들어 FACS 분석, 유세포측정 적정 분석 (FACS 적정), 표면 플라스몬 공명 (SPR, 예를 들어 BIAcore® 사용), 등온 적정 열량계 (ITC), 형광 적정, 또는 방사성표지된 리간드 결합 어세이와 같은 방법으로 수행될 수 있다. 추가 방법은 예를 들어 웨스턴 블롯, ELISA (경쟁 ELISA 포함)-, RIA-, ECL-, 및 IRMA-시험을 포함한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "항체"는 완전한 면역글로불린 분자를 비롯하여 이의 항원 결합 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv에 관한 것이다. 또한, 이 용어는 변형 및/또는 변경된 항체 분자를 비롯하여, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성/합성된 항체에 관한 것이다. 또한 용어 "항체"는 이기능성 항체, 3기능성 항체, 완전-인간 항체, 키메라 항체, 및 항체 구성체, 예컨대 단쇄 Fv (scFv) 또는 항체-융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "Fab 단편"은 하나의 중쇄의 가변 영역 및 CH1 및 하나의 경쇄로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. "Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 함유하는 하나의 중쇄의 일부분 및 또한 F(ab')2 분자를 형성하도록 2개 Fab' 단편의 2개 중쇄 사이에 사슬간 디술피드 결합이 형성될 수 있도록, CH1 및 CH2 도메인 사이의 영역을 함유한다. "F(ab')2 단편"은 사슬간 디술피드 결합이 2개 중쇄 사이에 형성되도록, CH1 및 CH2 도메인 간 불변 영역의 일부분을 함유하는 2개 중쇄 및 2개 경쇄를 함유한다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
Fab/c 단편은 Fc 및 Fab 결정부 둘 모두를 함유하고, 여기서 "Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 CH3 도메인의 소수성 상호작용 및 둘 이상의 디술피드 결합을 통해 함께 유지된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 모두로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여된다. "단쇄 Fv" ("scFv"로도 축약됨)는 본 발명의 상황에서, 항체의 VH 및 VL 도메인을 갖는 항체 단편이고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성할 수 있는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. 단쇄 항체의 제조를 위해 기재된 기술들은 예를 들어 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y. 113 (1994), 269-315]에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전체-인간 항체"는 오직 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 그럼에도, 전체 인간 항체는 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포 유래 하이브리도마에서 생산된다면 마우스 탄수화물 사슬을 함유할 수 있거나 또는 래트, 래트 세포, 또는 래트 세포 유래 하이브리도마에서 생산된다면 래트 탄수화물 사슬을 함유할 수 있다. 유사하게, 전체 인간 항체는 햄스터, 햄스터 세포, 예컨대, 예를 들어 CHO 세포, 또는 햄스터 세포 유래 하이브리도마에서 생산된다면 햄스터 탄수화물 사슬을 함유할 수 있다. 다른 한편으로, "마우스 항체" 또는 "쥐과 항체"는 마우스 (쥐과) 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체인 한편, "래트 항체" 또는 "토끼 항체"는 각각 오직 래트 또는 래트 면역글로불린 서열을 포함하는 항체이다. 완전 인간 항체처럼, 이러한 쥐과, 래트 또는 토끼 항체는 이러한 동물 또는 이러한 동물의 세포에서 생산되면, 다른 종 유래의 탄수화물 사슬을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 항체는 햄스터 세포, 예컨대 예를 들어 CHO 세포, 또는 햄스터 세포 유래 하이브리도마에서 생산되면 햄스터 탄수화물 사슬을 함유할 수도 있다. 완전-인간 항체는 예를 들어 완전 인간 항체의 생산 및 스크리닝을 가능하게 하는 광범위하게 사용되는 스크리닝 기술인 파지 디스플레이를 통해서 생산될 수 있다. 또한 파지 항체는 본 발명의 상황에서 사용될 수 있다. 예를 들어 US 5,403,484, US 5,969,108 및 US 5,885,793에 파지 디스플레이가 기술되어 있다. 완전-인간 항체의 개발을 가능하게 하는 다른 기술은 마우스 하이브리드 기술의 변형을 포함할 수 있다. 마우스는 그들 자신의 마우스 유전자와 교환하여 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하도록 유전자이식으로 만들어 진다 (예를 들어, US 5,877,397 참조).
용어 "키메라 항체"는 인간 또는 인간 이외의 다른 종 (예를 들어, 마우스, 말, 토끼, 개, 소, 닭) 유래의 항체 영역 (예를 들어, 불변 영역)과 융합되거나 또는 키메라화되는 인간 또는 인간이외의 종의 가변 영역을 포함하는 항체를 의미한다.
상기에 언급된 바와 같이, 용어 "항체"는 또한 항체 구성체, 예컨대 항체-융합 단백질을 포괄하고, 여기서 항체는 특별한 아미노산 서열에 의해 본 명세서에 정의된 도메인 이외에도, 예를 들어 재조합적으로 생산된 구성체의 단리 및/또는 제조를 위해서, 추가의 도메인(들)을 포함한다.
본 발명의 항체는 재조합 항체, 예를 들어 재조합 인간 항체, 또는 헤테로-하이브리드 항체이지만, 본 명세서에 개시되고 본 발명에서 정의된 CDR을 포함하도록 생산될 수 있다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 수단으로 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자가 유전자이식된 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, 숙주 세포를 형질감염시킨 재조합 발현 벡터를 사용해 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 다른 DNA 서열로 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단으로 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 재조합 인간 항체는 (존재한다면) 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 이러한 항체는 시험관내 돌연변이유발법 (또는 인간 Ig 서열이 유전자이식된 동물이 사용될 때, 생체내 체세포 돌연변이유발법)이 수행될 수 있어서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레파토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "헤테로-하이브리드 항체"는 상이한 유기체로부터 기원되는 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체를 의미한다. 예를 들어, 쥐과 경쇄와 연관된 인간 중쇄를 갖는 항체가 헤테로-하이브리드 항체이다. 헤테로-하이브리드 항체의 예는 키메라 및 인간화 항체를 포함한다.
본 발명에 따른 항체는 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR의 명시된 조합을 포함한다. CDR이 도입된 개별 가변 도메인의 주변 프레임워크 서열은 추가의 노력없이 당업자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 하기에 추가로 기술된 프레임워크 서열 또는 첨부된 실시예에서 적용된 특별한 프레임워크 서열이 사용될 수 있다.
본 발명에 따라서, CDR은 특별히 명시된 서열을 포함할 수 있거나 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 그와 상이할 수 있다. 이와 같이, CDR 각각에서 하나의 아미노산은 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환이 하나의 사슬 또는 하나의 항체의 모든 CDR이 아닌 일부에 존재한다는 것이 또한 포괄된다는 것도 이해하게 될 것이다.
본 발명에 따라서, 용어 "치환"은 다른 아미노산으로 아미노산의 치환을 지칭한다. 따라서, 아미노산의 총 개수는 동일한 채로 남아 있다. 일정 위치에서 아미노산의 결실 및 상이한 위치에서 하나 (또는 그 이상)의 아미노산(들)의 도입은 명백하게 용어 "치환"에 포괄되지 않는다. 본 발명에 따른 치환은 보존성 아미노산 치환일 수 있거나 또는 비보존성 아미노산 치환일 수 있다. 용어 "보존성 아미노산 치환"은 당분야에서 충분히 공지되어 있고 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 상이한 아미노산으로 아미노산의 치환을 지칭한다. 이러한 유사성은 예를 들어 포함된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 속성의 유사성을 포함한다. 아미노산 치환은 하기 그룹 중 하나의 아미노산 하나가 동일 그룹의 다른 아미노산으로 치환되는 경우에 보존성 아미노산 치환이다: 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양성 전하 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 시스티딘을 포함하고; 음성 전하 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
본 발명은 부모 항체와 비교하여 개선된 결합 특징을 나타내는 임의의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생성에 관한 것이다. 이것은 부모 항체 12.1A11.11-7과 비교하여 개선된 특징으로 나타나는 심장 트로포닌 T에 특이적으로 결합하는 항체의 생성으로 예시된다.
일 구현예에서, 인간 심장 트로포닌 T (SEQ ID NO:1)에 특이적으로 결합하는 항체는 (i) 경쇄 가변 도메인의 CDR이 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 또는 CDR 당 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하고, (ii) 중쇄 가변 도메인의 CDR이 SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; 또는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 여기서 CDR 중 적어도 2개는 SEQ ID NO:6; 또는 SEQ ID NO:7의 CDR1, SEQ ID NO:9의 CDR2 및 SEQ ID NO:12의 CDR3로부터 선택되거나, 또는 CDR1은 SEQ ID NO:7이고, CDR2는 SEQ ID NO:8이고 CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이고, 단 SEQ ID NO:6의 CDR1이 존재하는 경우에 a) CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이 아니거나 또는 b) 이 항체 내 CDR2 및 CDR3은 각각 동시에 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:12가 아닌 것을 특징으로 하는 항체이다.
일 구현예에서 본 발명은 인간 심장 트로포닌 T (SEQ ID NO:1)에 특이적으로 결합하는 항체를 개시하고, 이 항체는 CDR이 하기 아미노산 서열: (i) 경쇄 가변 도메인에서 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 및 (ii) 중쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; 또는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하고, 여기서 CDR 중 적어도 2개는 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:7의 CDR1, SEQ ID NO:9의 CDR2, 및 SEQ ID NO:12의 CDR3으로부터 선택되거나, 또는 CDR1은 SEQ ID NO:7이고, CDR2는 SEQ ID NO:8이고, CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이고, 단 SEQ ID NO:6의 CDR1이 존재하는 경우에 a) CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이 아니거나 또는 b) 이 항체 내 CDR2 및 CDR3은 각각 동시에 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:12가 아니다.
뿐만 아니라, 본 발명은 또한 인간 심장 트로포닌 T (SEQ ID NO:1)에 특이적으로 결합하는 항체를 개시하고,
여기서 항체는 하기 식 I으로 표시되는 프레임워크 영역 (FW) 및 CDR로 이루어진 경쇄 가변 도메인, 및 하기 식 II로 표시되는 FW 및 CDR로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함한다:
FW(LC)1 - CDR(LC)1 - FW(LC)2 - CDR(LC)2 - FW(LC)3 - CDR(LC)3 - FW(LC)4 (식 I)
FW(HC)1 - CDR(HC)1 - FW(HC)2 - CDR(HC)2 - FW(HC)3 - CDR(HC)3 - FW(HC)4 (식 II)
상기 식에서, FW는 하기 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85%가 동일한 이의 변이체를 포함한다:
경쇄에서
FW(LC)1 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열;
FW(LC)2 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열;
FW(LC)3 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열;
FW(LC)4 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열;
중쇄에서
FW(HC)1 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열;
FW(HC)2 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열;
FW(HC)3 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열;
FW(HC)4 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열;
CDR은 하기 아미노산 서열, 또는 CDR 당 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이들 CDR의 변이체를 포함한다: (i) 경쇄 가변 도메인에서 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 및 (ii) 중쇄 가변 도메인에서 SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; 또는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 여기서 CDR 중 적어도 2개는 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:7의 CDR1, SEQ ID NO:9의 CDR2, 및 SEQ ID NO:12의 CDR3으로부터 선택되거나, 또는 CDR1은 SEQ ID NO:7이고, CDR2는 SEQ ID NO:8이고, CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이고, 단 SEQ ID NO:6의 CDR1이 존재하는 경우에 a) CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이 아니거나 또는 b) 이 항체 내 CDR2 및 CDR3은 각각 동시에 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:12가 아니다.
뿐만 아니라, 본 발명은 하기 식 I로 표시되는 프레임워크 영역 (FW) 및 CDR로 이루어진 경쇄 가변 도메인; 및 하기 식 II으로 표시되는 FW 및 CDR로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-cTnT 항체를 개시한다:
FW(LC)1 - CDR(LC)1 - FW(LC)2 - CDR(LC)2 - FW(LC)3 - CDR(LC)3 - FW(LC)4 (식 I)
FW(HC)1 - CDR(HC)1 - FW(HC)2 - CDR(HC)2 - FW(HC)3 - CDR(HC)3 - FW(HC)4 (식 II)
상기 식에서 FW는 하기 아미노산 서열 또는 이와 적어도 85%가 동일한 이의 변이체를 포함한다:
경쇄에서,
FW(LC)1 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열;
FW(LC)2 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열;
FW(LC)3 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열;
FW(LC)4 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열;
중쇄에서,
FW(HC)1 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열;
FW(HC)2 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열;
FW(HC)3 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열;
FW(HC)4 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열;
여기서 CDR은 하기 아미노산 서열: (i) 경쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 및 (ii) 중쇄 가변 도메인에서 SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; 또는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, 여기서 CDR 중 적어도 2개는 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:7의 CDR1, SEQ ID NO:9의 CDR2, 및 SEQ ID NO:12의 CDR3으로부터 선택되거나, 또는 CDR1은 SEQ ID NO:7이고, CDR2는 SEQ ID NO:8이고, CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이고, 단 SEQ ID NO:6의 CDR1이 존재하는 경우에 a) CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이 아니거나 또는 b) 이 항체 내 CDR2 및 CDR3은 동시에 각각 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:12가 아니다.
식 I에 표시된 1차 구조는 N-말단에서 C-말단으로 본 발명의 항체의 경쇄 가변 도메인의 성분의 순서를 나타낸다. 식 II에 표시된 1차 구조는 N-말단에서 C-말단으로 본 발명의 항체의 중쇄 가변 도메인의 성분의 순서를 나타낸다. 각 경우에서, 프레임워크 영역 (FW) 1은 개별 가변 사슬 도메인의 최외 N-말단부를 나타내는 반면, FW 4는 개별 가변 사슬 도메인의 최외 C-말단부를 나타낸다.
상기 정의된 바와 같이, 각각의 FW 및 CDR 서열은 명시된 아미노산 서열을 "포함한다". 일 구현예에서, 각각의 FW 및 CDR 서열은 상기 아미노산 서열로 이루어지며, 즉 본 발명의 항-트로포닌 T 항체의 경쇄 가변 도메인(들) 및 중쇄 가변 도메인(들)은 각각 식 I 및 식 II로 표시되는 FW 및 CDR로 이루어지고, 여기서 각각의 FW 및 CDR 서열은 명시된 아미노산 서열로 이루어진다.
CDR 및 이의 변이체와 관련하여, 상기에 제공된 정의 및 특별히 예시된 구현예는 준용하여 적용된다.
프레임워크 영역과 관련하여, 일정한 정도의 가변성이 또한 본 명세서에서 고려되며, 즉, 개별 FW는 특별히 명시된 아미노산 서열 또는 이의 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 동일성은 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 92.5%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게 동일성은 적어도 98%, 예컨대 적어도 99%이고, 가장 바람직하게 동일성은 적어도 99.5%이다. 상이한 FW의 경우에, 상이한 정도의 서열 동일성이 실제 서열 및 예를 들어 개별 FW 서열의 길이를 비롯하여, 개별 가변 사슬 도메인 내 이의 위치에 따라서, 허용가능할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다.
본 발명에 따라서, 용어 "서열 동일성 %"는 아미노산 서열의 전체 길이 (또는 전체 비교되는 이의 부분)를 구성하는 아미노산 잔기의 개수와 비교하여 둘 이상의 정렬된 아미노산 서열의 동일한 아미노산의 일치부 ("히트") 개수를 기술한다. 동일성 백분율은 동일한 잔기의 개수를 잔기의 총 개수로 나누고 그 생성 값에 100을 곱하여 결정된다. 달리 말해서, 정렬을 사용하여, 동일한 아미노산 잔기의 백분율 (예를 들어, 85% 동일성)은 수동으로 정렬시키고 육안으로 검토하는 경우에, 또는 당분야에 공지된 서열 비교 알고리즘을 사용하여 측정시에 지정된 영역 또는 비교창 상에서 최대 상응도로 이들 (하위)서열을 비교하고 정렬하는 경우에 둘 이상의 서열 또는 하위 서열에 대해 결정될 수 있다.
당업자는 예를 들어 NCBI BLAST 알고리즘 (Altschul, S.F. et al. [1997] Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), CLUSTALW 컴퓨터 프로그램 (Tompson, J.D. et al. [1994] Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) 또는 FASTA (Pearson, W.R. & Lipman, D.J. [1988] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448)를 기반으로 하는 알고리즘을 사용하여 서열간/서열 중에서 서열 동일성 백분율을 결정하는 방법을 알고있다. 일 구현예에서, NCBI BLAST 알고리즘이 본 발명에 따라서 적용된다. 아미노산 서열의 경우 BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어 길이 (W), 및 10의 기대치 (E)를 사용한다. BLOSUM62 채점 매트릭스 (Henikoff, S. & Henikoff, J.G. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)는 50의 정렬 (B), 10의 기대치 (E), M=5, N=4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 따라서, 서열 동일성 %가 표시되는 구현예에서, NCBI BLAST 프로그램으로 결정하여 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 모든 아미노산 서열은 상기 구현예의 범주에 속한다.
개별적으로 특별히 명시된 아미노산 서열과 비교하여 프로임워크 영역에서의 상기 기술된 정도의 변이는 아미노산(들)의 치환, 삽입, 부가, 또는 결실에 의할 수 있다.
용어 "치환"은 상기에 본 명세서에서 정의되어 있다. 1개 초과의 아미노산을 치환하려는 경우에, 각 아미노산은 독립적으로 다른 아미노산으로 치환되는데, 다시 말해서, 제거되는 각 아미노산에 대해서, 상이한 아미노산이 동일 위치에 도입된다.
본 발명에 따른 용어 "삽입"은 특별히 명시된 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 아미노산의 부가를 의미하고, 여기서 부가는 폴리펩티드의 N-말단부 또는 C-말단부에서가 아니다.
본 발명에 따른 용어 "부가"는 폴리펩티드의 N-말단부 또는 C-말단부, 또는 둘 모두에서, 특별히 명시된 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산의 부가를 의미한다.
본 명세서에 따라서 사용되는 용어 "결실"은 특별히 명시된 아미노산 서열로부터 하나 이상의 아미노산의 상실을 의미한다.
일 구현예에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열의 변이는 아미노산(들)의 치환에 기인한다. 본 명세서에서 상기에 정의한 바와 같이, 치환은 보존성 아미노산 치환일 수 있거나 또는 비보존성 아미노산 치환일 수 있다. 용어 "치환"과 관련하여 상기에 제공되는 정의 및 특별히 예시된 구현예는 준용하여 적용된다. 일 구현예에서, 프레임워크 영역의 치환은 보존성 아미노산 치환이다.
추가 구현예에서, CDR은 상기 명시된 특별한 서열로 이루어지고 (즉, 임의의 변이 없음), 상기 명시된 프레임워크 영역 (FW)은 상기 명시된 특별한 서열 내에 아미노산 변이를 최대 하기 양으로 포함한다:
FW(LC)1 최대 3개 아미노산 변이;
FW(LC)2 최대 2개 아미노산 변이;
FW(LC)3 최대 4개 아미노산 변이;
FW(LC)4 최대 1개 아미노산 변이; 및
FW(HC)1 최대 3개 아미노산 변이;
FW(HC)2 최대 2개 아미노산 변이;
FW(HC)3 최대 4개 아미노산 변이; 및
FW(HC)4 최대 1개 아미노산 변이.
추가의 구현예에서, FW 내 아미노산 변이는 치환이다.
추가의 구현예에서, 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 영역에 존재하는 변이의 총량은 최대 9개 아미노산 치환, 예컨대, 예를 들어 최대 8개 아미노산 치환, 예를 들어, 최대 6개 아미노산 치환, 예컨대 최대 4개 아미노산 치환, 예를 들어, 최대 3개 아미노산 치환, 예컨대 최대 2개 아미노산 치환이다. 추가의 구현예에서, 함께 선택된 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 1 내지 4 또는 함께 선택된 중쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 1 내지 4에는 오직 1개의 아미노산 치환이 존재한다.
FW로서 본 명세서에 정의된 식 I 및 식 II의 부분이 가변 사슬 영역의 스캐폴드 또는 프레임의 일부를 형성하는 아미노산 서열이기 때문에, 특히 상보적 아미노산 치환의 형태로, 상기 서열 내 치환은 많은 경우에 항-cTnT 항체의 결합 능력에 영향을 미치지 않을 것이다. 이것은 이들 아미노산이 전형적으로 cTnT와의 결합에 직접적으로 관여하지 않기 때문이고, 적합한 대체 아미노산에 대한 그들 치환은 단백질의 폴딩 및 3차원 구조에 어떠한 변경도 일어나지 않도록 디자인될 수 있기 때문이다. 다른 한편으로, 이러한 치환은 예를 들어, 추가의 디술피드 브릿지의 도입에 의한 단백질의 안정화 또는 일정 숙주에서 개선된 발현과 같은, 수많은 유리한 효과를 제공할 수 있다.
일 구현예에서 상기 본 명세서에 개시된 바와 같은 cTnT에 대한 단일클론 항체는 10분 이상의 37℃에서의 t/2-diss로 cTnT에 결합한다.
본 발명은
(i) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인, 및
(ii) SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31; 및 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 항체를 더욱 개시하고, 이 항체는 인간 심장 트로포닌 T에 특이적으로 결합하고 10분 이상의 37℃에서의 t/2-diss를 갖는다.
또한 본 발명은
(i) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인, 및
(ii) SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31; 및 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열의 중쇄 가변 도메인
을 포함하는 항체를 개시하고,
여기서 CDR은 하기 아미노산 서열: (i) 경쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3, 및 (ii) 중쇄 가변 도메인에서, SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; 또는 SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:8; 또는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; 또는 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, CDR 중 적어도 2개는 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:7의 CDR1, SEQ ID NO:9의 CDR2, 및 SEQ ID NO:12의 CDR3으로부터 선택되거나, 또는 CDR1은 SEQ ID NO:7이고, CDR2는 SEQ ID NO:8이고, CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이고, 단 SEQ ID NO:6의 CDR1이 존재하는 경우에 a) CDR3은 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:13이 아니거나, 또는 b) 이 항체 내 CDR2 및 CDR3은 동시에 각각 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:12가 아니고,
이 항체는 인간 심장 트로포닌 T에 특이적으로 결합하고 10분 이상의 37℃에서의 t/2-diss를 갖는다.
일 구현예에서, 본 개시는
(i) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인, 및
(ii) SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31; 및 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항-cTnT 항체와 관련되어 상기 본 명세서에 제공되는 모든 정의 및 특별히 예시된 구현예들, 특히 변이의 명시된 정도 및 유형은 준용하여 적용된다.
본 발명에 따라서, 신규한 항체, 예를 들어 신규한 항-cTnT 항체는 그들의 개별 표적 항원, 예를 들어, cTnT (더 양호한 KD 값)에 대해 개선된 결합 성질을 가지며 따라서 이전 어세이와 비교하여 우수한 감도로 표적 항원, 예를 들어 cTnT의 검출을 가능하게 하는 것이 제공된다.
용어 "KD"는 평형 해리 상수 (평형 결합 상수의 역수)를 의미하고 본 명세서에서는 당분야에서 제공하는 정의에 따라 사용된다. KD 값을 결정하기 위한 수단 및 방법은 간략하게 하기에 제공되는 바와 같으며 제공되는 실시예에서 상세하게 설명된다.
항체, 예를 들어 항-cTnT 항체의 결합 성질은 Biacore 기술과 동의어가 된, 표면 플라스몬 공명 분광법과 같은, 실시간 바이오센서-기반 분자 상호작용 측정을 통해 최고로 결정된다. 실험 상세 사항은 실시예 5에 제공되고, 운동학 데이터는 표 3에 표시된다. 예를 들어, 표 3에서 조합 "12"로 표지된 항체는 cTnT에 대해 개선된 결합 성질, 즉 1.18E+06 1/Ms의 결합 상수 (ka); 3.7 E-04의 해리 상수 (kd)를 갖는다 (약 31분의 해리 반감기 및 따라서 3.2E-10 M의 전체 친화성 상수 (KD)로 번역됨).
이들 결과를 기반으로, 본 발명에서 개시되고 청구된 돌연변이된 항체는 놀랍게도 한편으로는 항체와 cTnT의 복합체 형성에 부정적으로 영향을 미치지 않고, 그들 전부에 대한 Ka가 부모 항체에 대한 것과 동일한 범위이다. 다른 한편으로 더 양호한 KD 값으로 번역되는 cTnT 간에 형성된 복합체의 안정성에 대한 상당한 개선을 달성할 수 있다.
일 구현예에서 상기 본 명세서에 개시된 바와 같이 본 발명에 따른 단일클론 항체는 10분 이상의 37℃에서의 t/2-diss로 cTnT에 결합한다.
일반적으로, 더 낮은 KD 값은 당분야에 충분히 공지된 바와 같이 더 높거나 또는 개선된 친화성에 상응한다. 일 구현예에서, 돌연변이체 항-cTnT 항체는 5.8 E-10 M의 KD 를 갖는 부모 항체의 KD 와 동일하거나 또는 그 보다 낮은 결합 친화성을 갖는다.
가변 경쇄 및 중쇄 영역에 대해 상기 명시된 서열은 첨부된 실시예에서 적용된 아미노산 서열이다.
본 발명은 또한 상기 본 명세서에 정의된 본 발명의 항체 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이 핵산 분자는 본 명세서에서 본 발명의 제1 핵산 분자라고 한다. 뿐만 아니라, 본 발명은 또한 상기 본 명세서에 정의된 본 발명의 항체 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 핵산 분자는 본 명세서에서 본 발명의 제2 핵산 분자라고 한다.
본 발명에 따라서, 용어 "핵산 분자"는 또한 본 명세서에서 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드라고도 하며, DNA, 예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 예를 들어 표준 화학 합성 방법 및/또는 재조합 방법에 의해 합성될 수 있거나, 또는 예를 들어, 화학 합성 및 재조합 방법을 조합하여 반-합성적으로 생산될 수 있다. 전사 조절 엘리먼트 및/또는 다른 아미노산 코딩 서열에 코딩 서열의 결찰은 확립된 방법, 예를 들어 제한효소 분해, 결찰 및 분자 클로닝을 통해서 수행될 수 있다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 제1 핵산 분자는
(i) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함하거나;
(ii) 상기 본 명 세서에 정의된 바와 같은 식 I의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는
(iii) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지는
경쇄 가변 영역을 코딩한다.
유사하게, 본 발명의 제2 핵산 분자는
(i) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(ii) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(iii) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(iv) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(v) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(vi) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(vii) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(viii) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(ix) SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(x) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체, 및 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 또는 최대 하나의 아미노산 치환이 상이한 이의 변이체를 포함하거나;
(xi) 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 식 II의 아미노산 서열로 이루어지거나;
(xii) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나;
(xiii) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나; 또는
(xiv) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나;
(xv) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나;
(xvi) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나; 또는
(xvii) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나;
(xviii) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나;
(xix) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나;
(xx) SEQ ID NO:31의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지거나; 또는
(xxi) SEQ ID NO:32의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 도메인과 적어도 85%가 동일한 아미노산 서열로 이루어지는
중쇄 가변 영역을 코딩한다.
본 발명은 또한 본 발명의 제1 핵산 분자, 즉 상기 본 명세서에 정의된 본 발명의 항체 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 제2 핵산 분자, 즉 상기 본 명세서에 정의된 본 발명의 항체 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 또한 본 명세서에서 "본 발명의 개별 벡터(들)"라고도 한다.
많은 적합한 벡터들이 분자 생물학 분야의 당업자에게 공지되어 있고, 이의 선택은 바람직한 기능에 따라 좌우된다. 벡터의 비제한적인 예는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지, 및 예를 들어 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 다른 벡터를 포함한다. 당업자에게 충분히 공지된 방법을 사용하여 다양한 플라스미드 및 벡터를 구축할 수 있으며, 예를 들어 [Sambrook et al. (loc cit.) and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994)]에 기술된 기술을 참조한다.
일 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 숙주에서 본 발명의 핵산 분자의 복제 및 발현을 유도할 수 있으며, 따라서 선택된 숙주에서 코딩되는 본 발명의 항-트로포닌 T 항체의 도메인의 가변 사슬 도메인의 발현을 제공한다. 추가의 구현예에서, 벡터(들)는 본 발명의 상기 가변 사슬 도메인뿐만 아니라, 또한 본 발명의 상기 가변 사슬 도메인을 포함하는 전체 길이 IgG 항체가 발현되는 것을 보장하도록 추가 서열을 포함한다.
발현 벡터는 예를 들어 클로닝 벡터, 이원 벡터 또는 통합 벡터일 수 있다. 발현은 예를 들어 번역가능한 mRNA로 핵산 분자의 전사를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 단일클론 토끼 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 일시적 재조합 발현을 위한 진핵생물 발현 플라스미드이다. 이러한 벡터는 예를 들어, 진핵생물 세포 예를 들어, HEK 293 또는 이의 유도체 또는 CHO 세포의 일시적 형질감염을 통해서, 항체 발현뿐만 아니라 항체 생산을 위해 특별히 개발되었다.
벡터의 비제한적인 예는 pQE-12, pUC-시리즈, pBluescript (Stratagene), pET-시리즈의 발현 벡터 (Novagen) 또는 pCRTOPO (Invitrogen), 람다 gt11, pJOE, pBBR1-MCS 시리즈, pJB861, pBSMuL, pBC2, pUCPKS, pTACT1, pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT, E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a) 벡터 시스템, pREP (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pIZD35, Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pcDNA3.1, pSPORT1 (GIBCO BRL), pGEMHE (Promega), pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen) 및 pCINeo (Promega)를 포함한다. 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에 적합한 플라스미드 벡터에 대한 비제한적인 예는 예를 들어, 플라스미드 pAO815, pPIC9K 및 pPIC3.5K (모두 Invitrogen)를 포함한다. 제노푸스 엠브리오스 (Xenopus embryos), 제브라피쉬 배아를 비롯하여 광범위하게 다양한 포유동물 및 조류 세포에서 단백질을 발현시키는데 적합한 다른 벡터는 다목적 발현 벡터 pCS2+이다.
일반적으로, 벡터는 하나 이상의 복제 기원 (ori) 및 클로닝 또는 발현을 위한 고유 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어 항생제 내성, 및 하나 이상의 발현 카세트를 함유할 수 있다. 또한, 벡터에 포함되는 코딩 서열은 확립된 방법을 사용하여 전사 조절 엘리먼트 및/또는 다른 아미노산 코딩 서열에 결찰될 수 있다. 이러한 조절 서열은 당업자에게 충분히 공지되어 있으며, 제한없이 전사의 개시를 보장하는 조절 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (Owens, G.C. et al. [2001] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:1471-1476) 및 임의로 전사의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 조절 엘리먼트를 포함한다. 전사의 개시를 보장하는 이러한 조절 엘리먼트의 비제한적인 예는 프로모터, 번역 개시 코돈, 인핸서, 인슐레이터 및/또는 본 발명의 핵산 분자의 하류에 포함되게 되는, 전사 종결을 보장하는 조절 엘리먼트를 포함한다. 추가 예는 Kozak 서열 및 RNA 스플라이싱을 위한 도너 및 억셉터 부위가 측접된 개재 서열, 분비 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는, 사용되는 발현 시스템에 따라서, 세포 구획 또는 배양 배지로 발현된 단백질을 유도시킬 수 있는 신호 서열을 포함한다. 벡터는 또한 올바른 단백질 폴딩을 촉진하기 위해서 하나 이상의 샤페론을 코딩하는 추가의 발현가능한 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
적합한 복제 기원의 추가 예는 예를 들어 전체 길이 ColE1, 절두형 ColEI, SV40 바이러스 및 M13의 복제 기원을 포함하는 한편, 적합한 프로모터의 추가 예는 제한없이 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40-프로모터, RSV (Rous sarcome virus)-프로모터, lacZ 프로모터, 테트라사이클린 프로모터/오퍼레이터 (tetp/o), 닭 β-액틴 프로모터, CAG-프로모터 (닭 β-액틴 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 최초기 인핸서의 조합), gai10 프로모터, 인간 연장 인자 1α-프로모터, AOX1 프로모터, GAL1 프로모터 CaM-키나제 프로모터, lac, trp 또는 tac 프로모터, T7 또는 T5 프로모터, lacUV5 프로모터, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 다핵 다각체병 바이러스 (AcMNPV) 다면체 프로모터 또는 포유동물 및 다른 동물 세포의 글로불린 인트론을 포함한다. 인핸서의 일례는 예를 들어, SV40-인핸서이다. 전사 종결을 보장하는 조절 엘리먼트의 비제한적인 추가예는 SV40-폴리-A 부위, tk-폴리-A 부위, rho-독립적 lpp 종결인자 또는 AcMNPV 다면체 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 선별 마커의 추가의 비제한적인 예는 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149), 아미노글리코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 내성을 부여하는 npt (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) 및 히그로마이신에 내성을 부여하는 hygro (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485)를 포함한다. 추가의 선별가능한 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용하게 하는 hisD (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); 세포가 만노스를 이용하게 하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (WO 94/20627) 및 오르니틴 디카르복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 디카르복실라제) (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) 또는 블라스티시딘 S에 내성을 부여하는 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus) 유래 디아미나제 (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338)가 설명된 바 있다.
추가의 구현예에서, 벡터는 인트론 A를 포함하는 5' CMV 프로모터, 및 3' BGH 폴리아데닐화 서열로 이루어진 발현 카세트를 함유하는 진핵생물 발현 플라스미드이다. 발현 카세트 이외에도, 플라스미드는 이. 콜라이에서 플라스미드 증폭을 위한 pUC18-유래 복제 기원 및 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 함유할 수 있다. 항체의 분비를 위해서, 진핵생물 리더 서열은 항체 유전자의 5'에 클로닝될 수 있다.
적합한 박테리아 발현 숙주는 예를 들어 JM83, W3110, KS272, TG1, K12, BL21 (예컨대 BL21(DE3), BL21(DE3)PlysS, BL21(DE3)RIL, BL21(DE3)PRARE) 또는 로제타로부터 유래된 균주를 포함한다. 벡터 변형, PCR 증폭 및 결찰 기술은, [Sambrook & Russel [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY)]을 참조한다.
본 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터는 예를 들어, 화학 기반 방법 (폴리에틸렌이민, 칼슘 포스페이트, 리포솜, DEAE-덱스트란, 뉴클레오펙션), 비-화학적 방법 (전기천공, 초음파 천공, 광학 형질감염, 유전자 전기전달, 유체역학 전달 또는 본 발명의 핵산 분자와 세포 접촉 시 천연 발생 형질전환), 입자-기반 방법 (유전자총, 자성감염, 임페일펙션), 파지 벡터-기반 방법 및 바이러스 방법에 의해 세포로 도입을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래되는 발현 벡터가 표적화된 세포 개체군으로 핵산 분자의 전달을 위해 사용될 수 있다. 추가로, 배큘로바이러스 시스템은 또한 본 발명의 핵산 분자를 위한 진핵생물 발현 시스템에서 벡터로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터는 칼슘 포스페이트에 의한 화학적 컴피턴트 이. 콜라이의 형질전환 및/또는 폴리에틸렌이민- 또는 리포펙타민-형질감염을 통한 HEK293 및 CHO의 일시적 형질감염을 위해 디자인된다.
본 발명은 또한
(i) 상기 본 명세서에 정의된 옵션 (i)에 따른 경쇄 가변 도메인 및 상기 본 명세서에 정의된 옵션 (i)에 따른 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자;
(ii) 상기 본 명세서에 정의된 옵션 (ii)에 따른 경쇄 가변 도메인 및 상기 본 명세서에 정의된 옵션 (ii)에 따른 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자; 또는
(iii) 상기 본 명세서에 정의된 옵션 (iii)에 따른 경쇄 가변 도메인 및 상기 본 명세서에 정의된 옵션 (iii)에 따른 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자
를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다.
본 발명의 벡터에 관하여 본 명세서에 제공되는 모든 정의 및 특별히 예시하는 구현예, 특히 벡터 유형 또는 조절 서열은 준용하여 적용된다. 이러한 제2 유형의 벡터는 적어도 2개의 핵산 분자, 즉 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 하나 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 조합으로부터 분명한 바와 같이, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 본 발명의 기능적 항-cTnT 항체의 발현이 가능하도록 벡터에서 조합된다. 이러한 제2 유형의 벡터는 또한 본 명세서에서 "본 발명의 조합 벡터"라고 한다.
본 발명은 또한
(i) 본 발명의 조합 벡터; 또는
(ii) 본 발명의 제1 핵산 분자, 즉 본 발명에 따른 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 본 발명의 개별 벡터 및 본 발명의 제2 핵산 분자, 즉 본 발명의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 본 발명의 개별 벡터로서, 이들 2개 벡터는 상기 옵션 (i) 내지 (iii)에 정의된 바와 같은 일치되는 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것인, 개별 벡터
를 포함하는 숙주 세포 또는 인간 이외의 숙주에 관한 것이다.
숙주 세포는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 용어 "원핵생물"은 본 발명의 단백질의 발현을 위해 DNA 또는 DNA 또는 RNA 분자에 의해 형질전환, 형질도입 또는 형질감염될 수 있는 모든 박테리아를 포함하는 의미이다. 원핵생물 숙주는 그람 음성을 비롯하여 그람 양성 박테리아, 예컨대, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli), 에스. 티리퓨리움 (S. typhimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 코리네박테리움 (Corynebacterium) (글루타미컴 (glutamicum)), 슈도모나스 (Pseudomonas) (플루오레센스 (fluorescens)), 락토바실러스 (Lactobacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 살모넬라 (Salmonella) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다.
용어 "진핵생물"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하려는 의미이다. 전형적인 포유동물 숙주 세포는 Hela, HEK293, H9, Per.C6 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3, NS/0, SP2/0 및 C127 세포, COS 세포, 예를 들어, COS 1 또는 COS 7, CV1, 메추라기 QC1-3 세포, 마우스 L 세포, 마우스 육종 세포, 마우스 흑색종 세포 및 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다. 본 발명에 따른 예시적인 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포이다. 다른 적합한 진핵생물 숙주 세포는 제한없이 닭 세포, 예컨대, 예를 들어 DT40 세포, 또는 효모 예컨대 사카로마이세스 세레비지아 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 및 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)를 포함한다. 발현에 적합한 곤충 세포는 예를 들어, 드로소필라 (Drosophila) S2, 드로소필라 Kc, 소포돕테라 (Spodoptera) Sf9 및 Sf21 또는 트리코플루시아 (Trichoplusia) Hi5 세포이다. 적합한 제브라피쉬 세포주는 제한없이 ZFL, SJD 또는 ZF4를 포함한다.
기술된 벡터(들)는 숙주의 게놈으로 통합될 수 있거나 또는 염색체외에서 유지될 수 있다. 벡터가 적절한 숙주에 도입되면, 숙주는 핵산 분자의 높은 발현 수준에 적합한 조건 하에서 유지되고, 바람직하다면, 본 발명의 항체의 수집 및 정제가 후속될 수 있다. 상기 기술된 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건은 당분야에 공지되어 있다.
일 구현예에서, 명시된 숙주는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포 또는 인간 세포주이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 벡터(들)로 형질전환되는 숙주 세포는 HEK293 또는 CHO이다. 역시 추가의 구현예에서, 본 발명의 벡터(들)로 형질전환되는 숙주 세포는 CHO이다. 이들 숙주 세포를 비롯하여 적합한 배지 및 세포 배양 조건은 당분야에 기술되어 있고, 예를 들어, [Baldi L. et al., Biotechnol Prog. 2005 Jan-Feb;21(1):148-53], [Girard P. et al., Cytotechnology. 2002 Jan;38(1-3):15-21] 및 [Stettler M. et al., Biotechnol Prog. 2007 Nov-Dec;23(6):1340-6]을 참조한다.
본 발명에 따라서 "포함하는 벡터"의 용어과 관련하여 본 발명의 항-cTnT 항체를 생산하기 위해 숙주 세포에 필수적이고/이거나 충분한 추가 핵산 서열이 벡터에 존재한다는 것을 이해한다. 이러한 추가 핵산 서열은 예를 들어, 경쇄의 나머지를 코딩하는 핵산 서열을 비롯하여 중쇄의 나머지를 코딩하는 핵산 서열이다.
본 발명에 따라서, 숙주 세포 또는 인간이외의 숙주는 상기 본 명세서에 정의된 바와 같은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 모두를 코딩하는 하나의 벡터를 포함하거나, 또는 2개의 별개 벡터로서, 한 벡터는 본 발명에 따른 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 보유하고 제2 벡터는 본 발명에 따른 일치되는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것을 포함한다. 따라서, 제1 벡터가 상기 본 명세서의 옵션 (i)에 따른 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 보유하는 경우라면, 제2 벡터는 또한 상기 옵션 (i)에 따라서 중쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자를 보유한다. 동일하게 옵션 (ii) 및 (iii)에 대해서도 준용하여 적용된다.
따라서, 각 경우에서, 그들 핵산 분자의 발현이 서로 연결되는 것이 상기 본 명세서에 기술된 결합 능력으로 이루어진 본 발명의 항체의 생산을 보장하기 위해 하나의 항체 분자 내에 존재하는데 요구된다.
이러한 구현예에 따른 숙주 세포는 예를 들어, 본 발명의 항체를 대량으로 생산하는데 적용될 수 있다. 상기 숙주 세포는 숙주에 상기 기술된 벡터(들)를 도입시켜 생산된다. 그러면 숙주 내 상기 벡터(들)의 존재가 본 발명의 항체의 상기 기술된 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자의 발현을 매개한다. 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 벡터(들)는 전체 길이 IgG 항체의 발현을 가능하게 하는 추가 서열을 포함할 수 있어서, 그 결과 숙주 세포에 의해 전체 길이 IgG 항체가 생산될 수 있고, 여기서 상기 항체는 본 발명에 따른 가변 경쇄 및/또는 중쇄 도메인의 존재를 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같이 수득되는 항체, 예를 들어 SEQ ID NO:1의 cTnT에 특이적으로 결합하는 항체의 제조를 위한 방법에 관한 것이고, 이 방법은 적합한 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 생성된 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
이러한 구현예에 따라서, 본 발명의 숙주에 존재하는 벡터(들)는 발현 벡터(들)이거나, 또는 벡터(들)는 이의 발현을 보장하는 방식으로 숙주 세포의 게놈에 본 발명의 핵산 분자(들)의 안정한 통합을 매개한다. 항체의 발현이 보장되도록 본 발명의 항-cTnT 항체의 각각의 경쇄 및 중쇄 도메인을 코딩하는 핵산 분자가 성공적으로 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 수단 및 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있고 기술되어 있다 (Browne, S.M. & Al-Rubeai, M. [2007] Trends Biotechnol. 25:425-432; Matasci, M et al. [2008] Drug Discov. Today: Technol. 5:e37-e42; Wurm, F.M. [2004] Nat. Biotechnol. 22:1393-1398).
원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포를 배양하기 위해 적합한 조건은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 박테리아 예컨대, 예를 들어 이. 콜라이는 통기 하에 Luria Bertani (LB) 배지 중에서, 전형적으로 4 내지 약 37℃의 온도에서 배양될 수 있다. 발현 생성물의 수율 및 가용성을 증가시키기 위해서, 배지는 둘 모두를 증강 또는 촉진시키는 것으로 알려진 적합한 첨가제로 완충 또는 보충될 수 있다. 유도성 프로모터가 숙주 세포에 존재하는 벡터(들) 중 본 발명의 핵산 분자를 제어하는 경우에, 폴리펩티드의 발현은 적절한 유도체, 예컨대, 예를 들어 언히드로테트라사이클린의 첨가에 의해 유도될 수 있다. 적절한 발현 프로토콜 및 전략은 당분야에 설명되어 있고 (예를 들어, [Dyson, M. R., et al. (2004). BMC Biotechnol. 4, 32-49] 및 [Baldi, L. et al. (2007). Biotechnol. Lett. 29, 677-684]), 특별한 숙주 세포의 요구, 및 필요하다면, 발현하려는 단백질의 요건에 따라 조정될 수 있다.
세포 유형 및 이의 특별한 요건에 따라서, 포유동물 세포 배양은 예를 들어10% (v/v) FCS, 2 mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI, 윌리엄스 E 또는 DMEM 배지에서 수행될 수 있다. 세포는 예를 들어 5% CO2, 수분-포화 대기에서, DT40 닭 세포의 경우 41℃ 또는 37℃에서 유지될 수 있다.
곤충 세포 배양에 적합한 배지는 예를 들어 TNM + 10% FCS, SF900 또는 HyClone SFX-Insect 배지이다. 곤충 세포는 일반적으로 부착 또는 현탁 배양으로서 27℃에서 성장된다.
진핵생물 또는 척추동물 세포에 적합한 발현 프로토콜은 당업자에게 충분히 공지되어 있고 예를 들어, [Sambrook, J & Russel, D.W. [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY]에서 검색할 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 포유동물 세포, 예컨대, 예를 들어 CHO 또는 HEK293 세포를 사용해 수행된다. 추가의 구현예에서, 방법은 CHO 세포를 사용해 수행된다.
재조합 제조 절차에서 적용되는 숙주에 따라서, 발현되는 항체는 글리코실화될 수 있거나 또는 비글리코실화될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체의 코딩 서열을 함유하고 N-말단 FLAG-태그 및/또는 C-말단 His-태그가 이에 유전자적으로 융합된 플라스미드 또는 바이러스가 사용된다. 추가의 구현예에서, 상기 FLAG-태그의 길이는 약 4 내지 8개 아미노산, 예컨대, 예를 들어 정확히 8개 아미노산이다. 상기 기술된 벡터는 당업자에게 통상적으로 공지된 임의 기술을 사용해 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 융합된, 작동적으로 연결된 유전자를 제조하고, 그들을 예를 들어 포유동물 세포 및 박테리아에서 발현시키는 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다 (Sambrook, loc cit.).
형질전환된 숙주는 최적 세포 배양을 달성하기 위해서 당분야에 공지된 방법에 따라서 생물반응기에서 성장될 수 있고 배양될 수 있다. 그 후에 본 발명의 항체는 성장 배지로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미생물에서 발현된 항체의 단리 및 정제는 임의의 통상적인 수단 예컨대, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 융합-태그 예컨대 Strep-태그 II 또는 His6 태그 사용), 겔 여과 (크기 배제 크로마토그래피), 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고압 액상 크로마토그래피 (HPLC), 역상 HPLC 또는 면역침강에 의할 수 있다. 이들 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있고, 일반적으로, 예를 들어 [Sambrook, J & Russel, D.W. [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY)]에 기술되어 있다.
본 발명에 따라서, 용어 "생성된 항체를 단리하는"은 항체, 예를 들어, 본 발명의 항-cTnT 항체의 단리를 의미한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 또한
(i) 본 발명의 항체,
(ii) 본 발명의 핵산 분자,
(iii) 본 발명의 벡터,
(iv) 본 발명의 숙주 세포, 및/또는
(v) 본 발명의 방법으로 생성된 항체
중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명에 따라서 사용되는 용어 "조성물"은 명시된 화합물 중 적어도 하나를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로, 본 발명의 화합물의 특징을 변경시켜서, 예를 들어 그들 기능을 안정화, 조절, 및/또는 증강시킬 수 있는 추가 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있고, 특히 분말(들), 정제(들) 또는 용액(들)의 형태일 수 있다.
조성물의 성분은 하나의 용기 또는 다수의 용기, 예를 들어 밀봉된 앰풀 또는 바이알에, 수성 용액으로서 또는 재구성용 동결건조 제제로서 포장될 수 있다. 동결건조된 제제의 예로서, 10 mL 바이알은 5 mL의 1% (w/v) 또는 10% (w/v) 수성 용액으로 채워지고, 최종 혼합물은 동결건조된다. 사용을 위한 용액은 동결건조된 화합물(들)을 예를 들어 치료 목적을 위한 주사용 물 또는 다른 바람직한 용매, 예를 들어 진단 목적을 위한, 완충액을 사용해 재구성시켜 제조된다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
조성물의 다양한 성분은 사용에 대한 설명서와 함께 키트로서 포장될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 당업자가 당분야에 충분히 공지된 시험관내 또는 생체외 방법, 예를 들어, 면역어세이와 같은 방법을 수행할 수 있게 하는 조성물이다.
본 발명의 항체를 이용할 수 있는 면역어세이의 예는 직접 또는 간접 형태의 면역어세이이다. 이러한 면역어세이의 예에는 효소 연결 면역 흡착 어세이 (ELISA), 효소 면역어세이 (EIA), 방사성면역어세이 (RIA), 또는 발광, 형광, 화학발광 또는 전기화학 발광의 검출을 기반으로 하는 면역어세이가 있다.
하기에서, 본 발명은 심장 트로포닌 T의 검출로 예시된다. 다른 표적 항원에 대한 본 발명의 항체가 그에 맞춰 변형된 어세이에서 사용될 수 있다는 것을 유의해야 한다.
심장 트로포닌 T (cTnT)는 예를 들어 각각 US 6,333,397 및 US 6,376,206에 개시된 바와 같은 샌드위치 면역어세이를 통해 최고로 검출되고, 본질적으로 모든 후속 세대의 cTnT 검출용 어세이에서 확인되었다. Roche Diagnostics (Germany)가 판매하는 cTnT (hs-cTnT)에 대한 고감도 어세이의, 5세대 cTnT-어세이에서, 여전히 샌드위치 면역 어세이 원리가 적용된다. 이 어세이는 고감도 어세이인데, 5 ng/mL의 검출 하한치 (LOD)로 cTnT를 검출할 수 있기 때문이다. 사용되는 어세이 프로토콜에 따라서, 각각 9분 또는 18분의 매우 짧은 총 인큐베이션 시간에도 불구하고 이러한 양호한 LOD에 도달한다. 이 어세이에서, 바이오틴화된 포획 항체 및 루테늄화된 검출 항체를 포함하는 샌드위치가 형성된다. 이 복합체는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드에 결합되고 결합되지 않은 물질은 세척해 버린다. 당업자에게 자명한 바와 같이, Kd가 두드러지지 않으면, 일부 해리가 일어나게 되어 신호 감소로 이어지고, 직접적으로 감소된 LOD로 번역되기 때문에 매우 결정적이다.
당업자에게 자명한 바와 같이, cTnT의 검출을 위한 방법에서 본 발명에 따른 항체를 사용하는 것이 유리할 것이다.
일 구현예에서 본 개시는 샘플에서 cTnT를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 a) 항-cTnT 항체/cTnT 복합체의 형성에 충분한 조건 하에 시간 동안 본 개시에 따른 항-cTnT 항체와 샘플을 접촉시키는 단계; 및 b) 항-cTnT 항체/cTnT 복합체를 측정하는 단계로서, 그 복합체의 양은 샘플에서 cTnT의 농도를 의미하는 것인 단계를 포함한다. 예를 들어 "항-cTnT 항체/cTnT 복합체"에서, 용어 "/"는 한편으로는 항-cTnT 항체 및 다른 한편으로는 cTnT 간에 비공유적 복합체가 형성된다는 것을 의미하기 위해 사용된다.
일 구현예에서 본 발명은 a) 제1 항-cTnT 항체/cTnT/제2 항-cTnT 항체 복합체를 형성하기에 충분한 조건 하에 시간 동안, cTnT에 대한 제1 항체 및 cTnT에 대한 제2 항체와 샘플을 접촉시키는 단계로서, 제2 항체는 검출가능하게 표지되는 것인 단계; 및 b) (a)에서 형성된 복합체를 측정하는 단계로서, 그 복합체의 양은 샘플 중 cTnT의 농도를 의미하고, 제1 또는 제2 항체는 본 발명에 따른 항체인 단계를 포함하는, 샘플에서 cTnT를 검출하는 방법에 관한 것이다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 샘플은 제1 및 제2 항체와, 임의의 바람직한 순서로, 즉 제1 항체가 제2 항체보다 먼저; 제2 항체가 제1 항체보다 먼저, 또는 동시에, 제1 항-cTnT 항체/cTnT/제2 항-cTnT 항체 복합체를 형성하기에 충분힌 조건 하에 시간 동안, 제1 및 제2 항체와 접촉될 수 있다.
당업자가 쉽게 이해하게 되는 바와 같이, 특이적 항 cTnT 항체 및 cTnT 항원/피분석물 간 복합체 (=항-cTnT 항체/cTnT 복합체)의 형성 또는 cTnT에 대한 제1 항체, cTnT (피분석물) 및 제2 항-cTnT 항체 복합체를 포함하는 2차 또는 샌드위치 복합체 (=제1 항-cTnT 항체/cTnT/제2 항-cTnT 항체 복합체)의 형성에 충분하거나 또는 적절한 조건 및 시간은 통상의 실험으로 확정된다.
항-cTnT 항체/cTnT 복합체의 검출은 임의의 적절한 수단으로 수행될 수 있다. 당업자는 이러한 수단/방법에 절대적으로 익숙하다.
용어 "샘플" 또는 "관심 샘플" 또는 "시험 샘플"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 샘플은 시험관내 샘플이고, 이것은 시험관 내에서 분석될 것이며 체내로 다시 전달되지 않는다. 샘플의 예는 제한없이 유체 샘플 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 활액, 소변, 타액 및 림프액, 또는 고형 샘플, 예컨대 조직 추출물, 연골, 뼈, 활막, 및 연결 조직을 포함한다. 일 구현예에서 샘플은 혈액, 혈청, 혈장, 활액 및 소변에서 선택된다. 일 구현예에서 샘플은 혈액, 혈청 및 혈장에서 선택된다. 일 구현예에서 샘플은 혈청 또는 혈장이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "기준 샘플"은 관심 샘플과 실질적으로 동일한 방식으로 분석되고 그 정보가 관심 샘플의 것과 비교되는 샘플이다. 그러므로 기준 샘플은 관심 샘플에서 수득된 정보의 평가를 가능하게 하는 표준을 제공한다. 기준 샘플은 건강하거나 또는 정상인 조직, 장기 또는 개체로부터 유래될 수 있어서, 조직, 장기 또는 개체의 건강한 상태의 표준을 제공한다. 정상 기준 샘플의 상태 및 관심 샘플의 상태 간 편차는 질환 발생의 위험성 또는 그러한 질환 또는 장애의 존재 또는 추가 진행을 의미할 수 있다. 기준 샘플은 비정상 또는 질환 조직, 장기 또는 개체로부터 유래되어서, 조직, 장기 또는 개체의 질환 상태의 표준을 제공할 수 있다. 비정상 기준 샘플의 상태 및 관심 샘플의 상태 간 편차는 저하된 질환 발생 위험성 또는 이러한 질환 또는 장애의 부재 또는 양호함을 의미할 수 있다.
용어 지시자의 "상승" 또는 "증가" 수준은 기준 또는 기준 샘플에서 이러한 지시자의 수준과 비교하여 더 높아진 샘플 중 이러한 지시자의 수준을 의미한다. 예를 들어, 소정 질환을 앓는 한 개체의 유체 샘플에서 상기 질환을 앓지 않는 개체의 동일 유체 샘플에 비해 더 높은 양으로 검출가능한 단백질은 상승된 수준을 갖는다.
일정 구현예에서, cTnT에 대한 제1 항체, cTnT (피분석물) 및 cTnT에 대한 제2 항체를 포함하는 샌드위치가 형성될 것이고, 여기서 제2 항체는 검출가능하게 표시된다.
일반적으로 하기 범주로 분류될 수 있는 수많은 표지 (염료라고도 함)가 이용가능하면, 이들 모두는 함께 그리고 그들 각가은 본 개시에 따른 구현예를 나타낸다:
(a) 형광 염료
형광 염료는 예를 들어, [Briggs et al "Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058)]에 기술되어 있다.
형광 표지 또는 형광단은 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), FITC, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인을 포함하는 플루오레세인 유형 표지; TAMRA를 포함하는 로다민 유형 표지; 단실; 리싸민; 시아닌; 파이코에리쓰린; 텍사스 레드; 및 이의 유사체를 포함한다. 형광 표지는 본 명세서에 개시된 기술을 사용하여 표적 분자에 포함된 알데히드 기에 접합될 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) 및 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.)에서 상업적으로 입수가능한 것들을 포함한다.
(b) 발광 염료
발광 염료 또는 표지는 화학발광 및 전기화학발광 염료도 더욱 세분될 수 있다.
상이한 부류의 화학발광 표지는 루미놀, 아크리디늄 화합물, 코엘렌테라진 및 유사체, 디옥세탄, 퍼옥시옥살산 기반 시스템 및 그들 유도체를 포함한다. 면역진단 절차의 경우 주로 아크리디늄 기반 표지가 사용된다 (상세한 개요는 [Dodeigne C. et al., Talanta 51 (2000) 415-439]에 제공됨).
전기화학발광 표지로서 사용되는 주요 관련성의 표지는 각각 루테늄- 및 이리듐-기반 전기화학발광 복합체이다. 전기화학발광 (ECL)은 고도로 민감하고 선택적인 방법으로서 분석적 적용에서 매우 유용한 것으로 증명되었다. 이것은 전극 전위의 적용에 의한 반응 제어의 용이함과 화학발광 분석의 분석적 장점 (배경 광학 신호의 부재)을 조합한다. 일반적으로, 액체상 또는 액체-고체 계면에서 TPA (트리프로필아민)로 재생되는 루테듐 복합체, 특히 [Ru (Bpy)3]2+ (∼620 nm에서 광자 방출)가 ECL-표지로서 사용된다. 최근에는 또한 이리듐-기반 ECL-표지가 기술된 바 있다 (WO2012107419(A1)).
(c) 방사능 표지는 방사성 동위원소 (방사성핵종), 예컨대 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 131Bi가 이용된다.
(d) 영상화 및 치료 목적을 위한 표지로 적합한 금속-킬레이트 복합체가 당분야에 충분히 공지되어 있다 (US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).
일 구현예에서, cTnT에 대한 제1 항체, cTnT (피분석물) 및 cTnT에 대한 제2 항체를 포함하는 샌드위치가 형성될 것이고, 여기서 제2 항체는 검출가능하게 표지되고 제1 항-cTnT 항체는 고체상에 결합할 수 있거나 또는 고체 상에 결합한다.
일 구현예에서 본 발명에서 개시된 항-cTnT 항체는 cTnT를 측정하기 위한 면역 어세이에서 사용된다. 일 구현예에서 상기 본 명세서에 개시된 항-cTnT 항체는 샌드위치-유형 면역 어세이에서 사용된다. 일 구현예에서 본 발명에서 개시된 항-cTnT 항체는 검출 항체로서 사용된다. 일 구현예에서 본 명세서에 개시된 항-cTnT 항체는 발광 염료, 특히 화학발광 염료 또는 전기화학발광 염료로 검출가능하게 표지된다.
이들 및 다른 구현예가 본 발명의 설명 및 실시예에 개시되고 포괄된다. 본 발명에 따라 적용하려는 방법, 용도 및 화합물 중 어느 하나에 관한 추가 문헌은 예를 들어 전자 장치를 사용하여, 공공 도서관 및 데이터베이스에서 검색할 수 있다. 예를 들어, 인터넷에서 이용가능한, 공공 데이터베이스 "Medline"은 예를 들어 ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html의 월드 와이드 웹에서 이용할 수 있다. 월드 와이드 웹에서 이용가능한 추가의 데이터베이스 및 주소, 예컨대 ncbi.nlm.nih.gov/, fmi.ch/biology/research_tools.html,tigr.org/, 또는 infobiogen.fr/은 당업자에게 공지되어 있고, 또한 lycos.com의 월드 와이드 웹에서 주소를 사용해 얻을 수 있다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 특허 명세서가 우세할 것이다.
본 명세서에 제공되는 모든 아미노산 서열은 당분야에서 관례적으로 행해지는 바와 같이, 최외 N-말단 잔기에서 시작하여 최외 C-말단 잔기에서 종료 (N→C)되는 것으로 제시되며, 본 발명 전반에서 아미노산을 식별하기 위해 사용되는 1-글자 또는 3-글자 코드 축약어는 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 것에 상응한다.
본 명세서, 특히 청구항에서 특징으로 하는 구현예에 관해서, 종속항에서 언급된 각각의 구현예는 상기 종속항이 종속되는 각각의 (독립 또는 종속) 청구항의 각각의 구현예와 조합하고자 한다. 예를 들어, 독립항 1이 3개의 대안 A, B 및 C를 인용하고, 종속항 2가 3개 대안 D, E 및 F를 인용하고, 제3항이 제1항 및 제2항에 종속되고, 3개 대안 G, H 및 I를 인용하는 경우에, 달리 특별히 언급하지 않으면, 명세서는 조합 A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I에 상응하는 구현예를 분명하게 개시하는 것으로 이해해야 한다.
유사하게, 그리고 또한 독립항 및/또는 종속항이 대안을 인용하지 않은 경우에, 종속항이 다시 다수의 전술한 청구항을 언급하면, 그에 의해 포괄되는 주제의 임의 조합이 명백하게 개시되는 것으로 간주된다는 것을 이해한다. 예를 들어, 독립항 1의 경우에, 종속항 2가 제1항을 다시 언급하고, 종속항 3이 다시 제2항 및 제1항 둘 모두를 언급하면, 제3항 및 제1항의 주제의 조합은 제3항, 제2항 및 제1항의 주제의 조합과 같이 분명하고 명확하게 개시되는 것으로 이해한다. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나를 언급하는 추가 종속항 4가 존재하는 경우에, 제4항 및 제1항, 제4항, 제2항 및 제1항, 제4항, 제3항 및 제1항을 비롯하여, 제4항, 제3항, 제2항 및 제1항의 주제의 조합은 분명하고 명확하게 개시되는 것으로 이해한다.
상기 고려사항은 모든 첨부된 청구항에 준용하여 적용된다. 비제한적인 예를 제공하기 위해서, 제13항, 제12항 및 제1항의 조합 (i)은 청구항 구조의 관점에서 분명하고 명확하게 예상된다. 예를 들어 제13항, 제11항 및 제4항의 조합 (ii) 등에 동일하게 적용된다.
본 발명의 일정한 양상들은 또한 첨부된 도면을 통해서 예시된다.
도면의 설명:
도 1: 하나 이상의 중쇄 CDR 내에 무작위 아미노산 치환을 포함하는 라이브러리의 구축
도 1A: 돌연변이체 라이브러리의 구축에 필요한 중쇄 단편의 생산 (단계 1)
제1 라운드 (PCR 1)에서, 각각 단편 1, 3 및 4에 상응하는 3종의 상이한 중쇄 단편은 상응하는 프라이머 세트의 도움으로 생성되었다. 연회색 스트레치는 CDR을 의미한다. 골격 서열은 검은색으로 제공된다. 수평 화살표는 사용된 프라이머를 의미한다. 수직 화살표는 PCR의 결과를 가리킨다. 도면에서 가위표된 짧은 42 bp 올리고뉴클레오티드 (단편 2)는 PCR에 의해 수득되지 않았지만 개별적으로 화학적으로 합성되었다.
도 1B: CDR 단일 아미노산 무작위화에 의한 HC 라이브러리 합성.
제2 단계 PCR 2에서, 도 1A에 기술된 바와 같이 수득된 4개 단편이 주형 (검은색 선)으로 제공되었다. 십자 표시의 수평 화살표는 각 CDR 코돈 위치에 대한 축퇴성 NNK 코돈을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 의미한다. 이들 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 또한 필요에 따라 표시된 바와 같이 단계 1의 단편 중 하나 또는 2개에 하이브리드화할 수 있는 서을 스트렛치를 포함한다. 각각 전방향 및 역방향 프라이머 (작은 화살표)가 개별 PCR을 수행하는데 사용되었다.
도 1C: 라이브러리 합성의 최종 단계
단계 1의 단편 중 하나 또는 2개에 하이브리드화할 수 있는 추가의 서열 스트렛치는 HC 라이브러리의 생산의 최종 단계, 즉 PCR 2의 모든 4개 생성물을 사용한 중복 PCR을 수행하는데 필요한다. 말단 프라이머 (F1A; R1A)를 사용하고 단편 그 자체가 이러한 중복 PCR에서 메가 프라이머로서 작용한다.
도 2: 주변세포질 Fab 발현용 벡터 맵
제공되는 도면의 설명은 자명한 것으로 간주된다.
도 3: cTnT 결합 Fab 단편의 스크리닝을 위한 ELISA 셋업
스트렙타비딘이 코팅된 마이크로타이터 플레이트 (SA 플레이트)를 사용하여 바이오틴화된 심장 트로포닌 T (bi-cTnT)를 고체상에 결합시킨다. 재조합 항-cTnT 중쇄 (<cTnT>-Fab)를 포함하는 Fab 단편은 TnT에 결합하고 퍼옥시다제 (POD)-표지된 항-인간 Fab 항체 (항 huFab-POD)를 통해 검출된다.
도 4: Elecsys 샌드위치 어세이
어세이 셋업을 도시한 개략도가 도시되어 있다. 바이오틴화 (bi) 포획 항체가 스트렙타비딘 (SA) 코팅된 비드에 부착된다. 다양한 친화성 성숙화된 항-cTnT 항체는 루테늄화 (Ru)되었고 친화성 성숙화의 효과는 ECL 분석으로 조사하였다.
도 5: 진짜 지정자 및 지정자 유도체에 대한 ECL 신호 계측
진짜 항-cTnT 항체 및 돌연변이체 항체 (조합 12는 각각 표 2에서 사용된 Fab 단편 식별자를 의미함)에 대한 계측이 제공된다. 연회색 막대는 희석제 다중 어세이 시약 (Diluent Multi Assay reagent)에서의 어세이 블랭크 값 (노이즈)를 보여주고, 진회색 막대는 시판 cTnT Elecsys® 어세이의 보정자 1로 수득된 계측치 (신호)를 보여준다. 항체 조합 12는 개선된 신호 대 노이즈 비율을 보여준다.
하기 실시예는 본 발명을 예시한다:
실시예 1: 재료 및 일반 방법
재조합 DNA 기술
표준 방법이 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하는데 사용되었다. 분자 생물학적 시약은 제조사의 설명서에 따라 사용되었다.
DNA 서열 결정
DNA 서열은 Microsynth AG (Balgach, Switzerland)에서 수행된 이중 가닥 시퀀싱을 통해 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
Vector NT1 Advance suite version 11.5.0이 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석첨가 및 예시에 사용되었다.
단백질 화학 및 표지화 기술
표준 단백질 화학 및 표지화 기술은 예를 들어 [Hermanson, G. "Bioconjugate Techniques" 3rd Edition (2013) Academic Press]에 제공되어 있다.
생물정보학
생물정보학 방법은 예를 들어, [Keith J.M. (ed.) "Bioinformatics" Vol. I and Vol. II, Methods in Molecular Biology Vol. 1525 and Vol. 1526 (2017) Springer], 및 [Martin, A.C.R. & Allen, J. "Bioinformatics Tools for Analysis of Antibodies" in: Dubel S. & Reichert J.M. (eds.) "Handbook of Therapeutic Antibodies" Wiley-VCH (2014)]에 제공된다.
전기화학발광 면역어세이
면역어세이 및 관련 방법은 예를 들어, [Wild D. (ed.) "The Immunoassay Handbook" 4th Edition (2013) Elsevier]에 제공된다. 전기화학발광 표지로서 루테늄 복합체는 예를 들어, [Staffilani M. et al. Inorg. Chem. 42 (2003) 7789-7798]에 제공된다. 전형적으로, 전기화학발광 (ECL) 기반 면역어세이의 수행을 위해서 Elecsys 2010 분석기 또는 후속자 시스템, 예를 들어, Roche 분석기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Germany) 예컨대 E170, cobas e 601 모듈, cobas e 602 모듈, cobas e 801 모듈, 및 cobas e 411, 및 이들 분석기용으로 디자인된 Roche Elecsys 어세이가 사용되었고, 각각은 달리 표시되지 않으면 표준 조건 하에서 사용되었다.
실시예 2: 라이브러리 구축
부모 항체 가변 중쇄는 쥐과 기원 (SEQ ID NO:34)이다. 돌연변이된 HCCDR을 포함하는 라이브러리는 각각 HCCDR1, HCCDR2 및/또는 HCCDR3에서 단일 아미노산 무작위화의 목적을 갖도록 구축되었다. 제1 단계에서 4개 DNA 단편은 4종의 상이한 부모 항체 프레임워크 영역 중 하나를 각각 코딩하는 것을 생성시켰다. 프레임워크 영역 1, 3 및 4는 내부에서 중합효소 연쇄 반응을 통해 수득되었고, 프레임워크 영역 2를 나타내는 짧은 단편 2 (42 bp)는 Metabion international AG (도 1A 참조)에서 주문하였다. 단편은 겔 정제하여 정량하였다. 100 ng의 이들 DNA 단편 중 하나를 각각의 4개의 애드-온 PCR 반응 혼합물에서 폴리뉴클레오티드 주형으로서 사용하였다. CDR 영역은 부모 CDR과 동일한 수의 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리의 사용을 통해 첨가하였고, 상기 라이브러리의 구성원은 각각의 HCCDR에서 개별 코돈 위치의 각각에 대해 하나의 NNK 코돈을 갖는 라이브러리 구성원을 포함하도록 디자인되었다. CDR 라이브러리 내 폴리뉴클레오티드는 또한 개별 CDR에 이웃하는 프레임워크 영역에 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하였다. 말단 프라이머는 네스티드 PcR 증폭에 사용되었다. 그리하여 (도 1B 참조) 부분적으로 중복된 서열을 갖는 4개 DNA 단편을 생성시켰다. FW1 서열의 3' 말단 및 FW4 서열의 5' 말단에 하이브리드화하는 말단 프라이머를 사용한, 중복 PCR을 수행하여 선형 DNA 라이브러리 구성체에 4개 단편을 연결시켰다 (도 1C 참조). 전형적인 PCR 반응물은 MgSO4, 200 μM dNTP 믹스, 0.5 μM 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 250 ng DNA 주형, 5 유닛 Pwo DNA 중합효소와 10 ㎕ 10 x PCR 완충액을 함유하는 100 ㎕ 반응 믹스에 PCR 등급 물을 채워 넣었다. 전형적인 PCR은 94℃에서 5분 동안 초기 주형 변성으로 시작하여, 30 사이클 (94℃ 2분, 60℃ 45초, 72℃ 1분)을 적용하였고, 72℃에서 5분간의 최종 연장 단계를 함유하였다. 프라이머, 주형 및 단편 서열은 표 1에 열거되어 있다. 라이브러리 단편은 무세포 시스템에서 성공적인 전사 및 번역을 위한 모든 필요한 조절 서열을 함유하였다. 당업자는 최신 방법에 따라서 이러한 라이브러리를 생성시킬 수 있으며, 예를 들어, [Hanes, J. & Pluckthun, A. (1997), "In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display", Proc Natl Acad Sci U.S.A. 94, 4937-42]를 참조한다. 약 5·1011 라이브러리 구성원에 상응하고, 3개 HC CDR을 포괄하는, 이렇게 생성된 250 ng의 DNA 라이브러리가 시험관내 디스플레이 접근법에서 사용되었다.
표 1:
항-cTnT Fab 단편 라이브러리의 생성에 사용된 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 3: 시험관내 디스플레이
Fab 디스플레이를 위한 완충액을 제조하였고 밤새 4℃에서 엔드-오버-엔드 회전으로 인큐베이션시켰다. 세척 완충액, WB, (60 mM Tris; AcOH로 조정된 pH 7.5, 180 mM NaCl, 60 mM 마그네슘 아세테이트, 5% 차단제 BSA, 33 mM KCl, 200 ㎍ t-RNA, 0,05 % Tween 20); 비드 세척 완충액 BWB (100 mM PBS, 0,1% Tween 20); 중지 완충액 SB (50 mM Tris AcOH로 조정된 pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM 마그네슘 아세테이트, 5% 차단제 BSA (Pierce), 33 mM KCl, 0,5% Tween 20, 8.2 mM ox. 글루타티온); 용리 완충액 (55 mM Tris, AcOH로 조정된 pH 7.5, 165 mM NaCl, 22 mM EDTA, 1 mg BSA, 5000 U rRNA (5000 U), 50 ㎍ tRNA).
자성 비드 (스트렙타비딘 코팅된 비스)의 필요한 부피는 4℃에서 밤새 엔드-오버-엔드 회전하면서 10 ㎕ 초기 현탁액 당 100 ㎕ 세척 완충액 (WB)으로 차단하였다. 25 ㎕의 비드를 사전 패닝 단계에서 사용하였고 20 ㎕가 표적/배경 샘플 당 패닝에 사용되었다. 비드 저장 완충액의 소듐 아지드를 제거하기 위해서, 비드는 4회 비스 세척 완충액 (BWB) 및 3회 WB로 세척하였다. 이들 단계는 2분 동안 비드를 수집하고 이후에 상청액을 폐기하기 위해서 자기장을 인가하여 수행하였다. 최종 세척 단계 이후에 비드는 그들 초기 부피까지 WB에 현탁하였다.
PUREfrex™ DS 2.0는 시험관내 전사 및 번역을 수행하기 위해서, 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 표적 (T) 용 1.5 mL 반응 튜브 및 배경 (BT) 용 하나가 준비되었다.
발현 주형 (LC) 및 디스플레이 주형 (HC)의 DNA 입력물을 2:1 분자 비율로 적용하였다. 디스플레이 및 발현 주형을 코딩하는, DNA의 양은 모든 Fab 디스플레이 사이클에서 일정하게 유지하였다. 시험관내 전사/번역 반응 믹스는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션이후에, 반응은 100 ㎕ 중지 완충액을 첨가하여 중지시킨 후에, 14 000 rpm으로 15분 동안 1℃에서 원심분리 단계를 후속하였다. 달리 표시하지 않으면, 후속 단계들은 4℃에서 수행하였다. 중지된 번역 믹스의 상청액을 제조된 비드 현탁액에 첨가하였고 30분 동안 락킹 플랫폼에서 인큐베이션시켰다. 이후에, 현탁액은 13 000 rpm 및 1℃에서 10분 동안 원심분리시켜서 비특이적 결합 분자와 비드를 나머지 3원 복합체의 상청액으로부터 분리시켰다. 사전패닝된 상청액 (300 ㎕)은 미리 WB로 차단시킨, 새로운 2 mL 반응 튜브로 옮겼고 추가 사용까지 얼음에 유지시켰다. 표적 (재조합 바이오틴화된 cTnT)은 10 nM 내지 50 nM 범위의 최종 농도로 300 ㎕ 의 사전패닝된 상청액에 첨가하였다. 바이오틴화된 cTnT 농도는 선택압을 상승시키기 위해서 모든 사이클에서 감소되었다. 현탁액은 30분 동안 락킹 플랫폼 상에서 인큐베이션시켰다. 용액 패닝 단계는 바이오틴화된 cTnT 및 3원 복합체 간 특이적 결합을 가능하게 하였다. 표적 TnT에 결합된 3원 복합체는 20분 인큐베이션 단계에서 스트렙타비딘 비드로 포획하였다. 선택압의 추가 증가는 항원 농도를 2 nM 까지 감소시키거나 또는 비바이오틴화된 경쟁자를 사용하는, 2가지 방식으로 사이클 III에서 획득되었다. 후자에서, 패닝 단계는 낮은 바이오틴화된 cTnT 농도 및 과량의 경쟁자 cTnT를 사용해 밤새 실시되었다.
세척 단계는 자기장에서 결합된 표적-3원 복합체로 비드의 포획이후, 상청액의 제거를 포함한다. 비드는 500 ㎕ 빙냉 WB로 세척하였다. 선택압은 세척 단계의 지속 기간을 5분에서 1시간으로 연장시켜 후속 디스플레이 사이클에서 증가되었다. 최종 세척 단계는 새로운 차단된 2 mL 반응 튜브로 비드를 옮기는데 사용되었다. 후속하여 비드는 자기장으로 포획되었고 상청액은 제거되었다. 후속 용리 단계는 EDTA를 함유하는 100 ㎕의 1x EB를 첨가하고 10분 동안 진탕하면서 인큐베이션하여 수행되었다. mRNA는 3원 복합체로부터 방출되었다. 이후에 용리 믹스는 14 000 rpm로 10분 동안 1℃에서 원심분리되었다. RNeasy MinElute 클린업 키트 (Qiagen)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여, 농축된 RNA를 단리 및 정제하였다. RNA는 16 ㎕의 RNase-무함유 물로 용리하였다. 선택 단계로부터의 임의의 나머지 DNA를 분해하기 위해서, Ambion DNA-free™ 키트를 제조사의 설명서에 따라 사용하였다. 나머지 DNA는 후속 PCR 반응에서 증폭될 수 없다. DNase 탈활성화 후에, 현탁액을 2분 동안 13 000 rpm 및 실온에서 원심분리하였다. 상청액 (50 ㎕)은 얼음 상의 신선한 1.5 mL 반응 튜브로 옮겼다. 정제된 RNA는 역전사 (RT)에 즉시 사용하였다. 임의의 나머지 상청액은 -20℃에 저장하였다.
용리된 mRNA는 cDNA로 역전사시켰다. 패닝 단계에서 표적을 함유하는, 샘플 T에 대해 2개 반응이 설정되었다. 2개의 후속 반응은 샘플 BG에 대해 준비되었고 음성 대조군은 물을 함유하였다. 샘플의 수에 따라서, 마스터 믹스를 준비하였고 프리믹스를 얼음 상에서 0.2 mL 반응 튜브에 분배하였다. 각각의 반응물은 12 ㎕의 용리된 RNA 및 0.5 ㎕의 역전사효소가 접종되었다. 음성 대조군은 RNA 대신에 12 ㎕의 RNase 무함유 물이 제공되었다. 역전사는 PCR 써모 사이클러에서 45분 동안 65℃에서 수행되었다. 이후에 cDNA 샘플은 얼음에서 5분 동안 인큐베이션되었고 후속 단계에서 증폭되었다. 나머지 샘플은 -20℃에 저장하였다. 2회 PCR 반응이 실시되었다: 첫번째 PCR "PCR on RT"는 선택 풀의 cDNA를 증폭하기 위해서 프라이머 Frt 및 Rrt를 사용해 수행되었다. 프라이머 F1A 및 F1A를 사용한 두번째 PCR "PCR on RT-PCR"은 시험관내 전사/번역을 위해 조절 엘리먼트를 재부착시키기 위해 적용되었다. 양쪽 반응은 Pwo DNA 중합효소를 사용해 수행되었다.
선택 풀의 충분한 DNA 농도를 제공하기 위해서, 샘플 T 및 BG 각각에 대해 4개 반응을 준비하였다.
추가로, 4개 대조군 샘플을 준비하였다. 처음 2개 샘플은 샘플 T 및 BG의 mRNA 단리 이후에 DNA 분해로부터 유래되었고 잠재적으로 나머지 DNA를 증폭하기 위해 PCR로 검증하였다. 세번째 및 네번째는 RT의 음성 대조군 및 PCR 등급 물을 사용하는 "PCR on RT"의 음성 대조군이었다.
T의 PCR 생성물은 분취용 1% 아가로스 겔로부터 QIAquick 겔 추출 키트를 사용해 정제하였고, 후속하여 정량하고 "PCR on RT-PCR"의 주형으로서 사용하였다. 선택 풀의 3개 반응물 및 DNA 주형 대신에 PCR 등급 물을 사용한 하나의 음성 대조군이 제조되었다. 각 반응의 경우에, 250 ng의 사전 정제된 "PCR on RT"가 사용되었다. PCR 생성물은 1% 분취용 아가로스 겔로부터 QIAquick 겔 추출 키트를 사용해 정제되었고 적절한 발현 시스템으로 후속 서브클로닝을 위해 더욱 변형되었다.
실시예 4: 농축 결합제의 주변세포질 발현
농축된 Fab 결합제를 단리하기 위해서, 쥐과 가변 HC는 Fab의 인간 CH1 도메인, 쥐과 VL 도메인 및 인간 CL 도메인을 함유하는, phoATIR3-9bi Fab TN-T M7chim 발현 벡터 (도 2 참조)에 클로닝하였다. 각각의 선택 풀은 발현 벡터로 클로닝할 수 있기 위해서 리더 서열 Tir9에 위치된 BsiWI 제한효소 부위가 제공되었다.
제2 제한효소 부위 KpnI는 HC의 가변 영역의 말단에 존재하고 그래서 부착될 필요가 없다. 그러므로, PCR은 BsiWI 제한효소 부위를 함유하는 전방향 프라이머 5' GCTACAAACGCGTACGCTATGGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCG-3' (SED ID NO: 95), 및 역방향 프라이머 Rrt 5'-GGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACGGATGCCCTGTGC-3' (SEQ ID NO:88)를 사용해 수행하였다. 주변세포질 발현은 96-웰 딥웰 블록 (DWB)에서 수행하였다. 사전배양 ("마스터") DWB에 Integra VIAFlo96을 사용하여 웰 당 1 mL LB (100 ㎍/mL 암피실린)를 채웠고 이전에 실시된 서브클로닝 및 형질전환의 단리된 클론을 접종하였다. 선택 풀 당 약 300개 콜로니를 선택하였다. 하나의 웰은 음성 대조군으로서 접종없이 남겨두었고; 다른 웰은 양성 대조군으로서 TnT M-7 (야생형) Fab 발현 벡터로 형질전환된 Xl1 블루를 접종하였다. DWB는 공기 투과가능한 막으로 밀봉하였고 오비탈 쉐이커 인큐베이터 (750 rpm)에서 밤새 30℃에서 인큐베이션시켰다. 후속하여, 마스터 DWB의 각 웰로부터 50 ㎕를 [Simmons, L. C., Reilly, D., Klimowski, L., Raju, T. S., Meng, G., Sims, P., Hong, K., Shields, R. L., Damico, L. A., Rancatore, P. & Yansura, D. G. (2002) "Expression of full-length immunoglobulins in Escherichia coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies", J Immunol Methods 263, 133-47]에 기술된 바와 같이 웰 당 1150 mL C.R.A.P 배지 (100 ㎍/mL 암피실린)로 제조된, 새로운 "발현" DWB로 옮겼다. DWB는 공기 투과성 막으로 밀봉하였고 오비탈 쉐이커 인큐베이터에서 30℃에서 인큐베이션시켰다. Fab 발현의 유도는 포스페이트-제한 C.R.A.P 배지를 사용하는 phoA 프로모터를 기반으로 한다. 24시간 후에 Fab가 발현된 세포를 4000 rpm에서 10분간 원심분리로 회수하였고 후속 사용까지 -20℃에 저장하였다.
사전배영 마스터 DWB는 950 ㎕의 40% 글리세롤을 첨가하고 -80℃에 저장하여 "글리세롤 스톡"으로 사용하였다. 세포 펠렛은 5분 동안 밀봉된 DWB를 강력하게 와류시키고 실온에서 추가 10분 동안 진탕하여서 50 ㎕ B-PERII 박테리아 단백질 추출 시약 (Thermo Fisher Scientific)에 재현탁시켰다. 세포 용해물은 950 ㎕ Tris 완충액 (20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl)에 희석시켰고 원심분리 (10분, 4000 rpm) 전에 10분 동안 인큐베이션시켰디. 미정제 세포 추출물을 함유하는 발현 블록은 SPR 운동학 조사에서 후속 사용까지 4℃에 유지시켰다.
실시예 5: ELISA 스크린
상세한 Biacore 분석을 위해 최고 돌연변이체 Fab 결합제를 발굴하기 위해서, 이전에 효소-연결된 면역흡착 어세이 (ELISA)를 실시하였다. ELISA 셋업은 도 3에 도시되어 있다. 바이오틴화된 재조합 심장 트로포닌 T (100 nM)는 오비탈 쉐이커에서 진탕하면서 RT에서 1시간 동안 스트렙타비딘 - MTP 96웰 플레이트에서 포획하였다. 항원 트로포닌 T는 100 ㎕ IP 완충액 (PBS pH 7.3, 1% BSA)에 희석하였다. 후속하여, 웰은 3회 300 ㎕ 1x 완충액 (150 mM NaCl, 0.05 % Tween20, 0.2% Bronidox)과 마이크로플레이트 세척기 BioTek ELx405 Select를 사용해 세척하였다. 세척 후에, 돌연변이된 항-cTnT Fab 결합제를 함유하는 미정제 세포 추출물은 1:2로 IP 완충액에 희석하였고 트로포닌 T 포획된 웰로 옮겼다. 다시, 웰은 3회 300 ㎕ 1x 세척 완충액으로 세척하였다. 염소에서 생산된 항-인간 IgG (Fab 특이적) - 퍼옥시다제-표지된 항체 (검출 항체)는 트로포닌 T 결합된 돌연변이된 Fab 단편을 검출하기 위해 (IP 완충액에) 1:40 000 희석하여 사용하였다. 다시 웰은 3회 300 ㎕ 1x 세척 완충액으로 세척하여 미결합된 검출 항체를 제거하였다. 마이크로플레이트는 웰 당 100 ㎕ ABTS와 30분 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 광학 밀도는 405 nm로 설정된 마이크로플레이트 판독기 BioTek Power wave XS로 측정하였다. 부모 항-cTnT 항체의 야생형 Fab는 양성 대조군으로서 사용하였다. 첫번째 히트를 확인하였고 이의 미정제 세포 추출물을 운동학 분석에 제공하였다.
실시예 6: SPR 기반 기능적 분석
상세한 운동학 조사는 37℃에서 GE Healthcare T200 장비 상에서 수행하였다. Biacore CM-5 시리즈 S 센서를 장비 상에 고정시켰고 제조사의 설명서에 따라서 사전조건화시켰다. 시스템 완충액은 HBS-ET (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 % (w/v) Tween® 20)였다. 샘플 완충액은 1 mg/mL CMD (카르복시메틸덱스트란, Fluka)이 보충된 시스템 완충액이었다. 일 구현예에서 항-인간 항체 포획 시스템을 CM5 바이오센서 상에 고정시켰다. GAHF(ab')2, (염소 항 인간 F(ab')2) (Code Nr.: 109-005-097, lot #13.12.2005, Jackson Immuno Research)는 NHS/EDC 화학을 사용해 제조사의 설명서에 따라 고정되었다. 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 중 30 ㎍/mL GAHF(ab')2는 플로우 셀 1, 2, 3 및 4에 사전농축시켰고 10.000 RU GAHF(ab')2로 고정시켰다. 센서를 이후에 1 M 에탄올아민 pH 8.5로 포화시켰다.
키메라 항-TnT 항체 단편은 기술된 대로 이. 콜라이 세포에서 주변세포질로 발현시켰고 공지된 방법으로 용해시켰다 (기술 상세사항은 [Andersen, D. C. & Reilly, D. E. (2004); Production technologies for monoclonal antibodies and their fragments. Curr Opin Biotechnol 15, 456-62] 참조). 용해물은 샘플 완충액에 1:20으로 희석하였다. Fab 단편은 10 ㎕/분의 유속으로 1분 동안 바이오센서 상에서 발현 용해물로부터의 그들 인간화 프레임워크 영역을 통해 포획된 후에 30 ㎕/분으로 10배 농축된 HBS-EP 완충액을 사용해 2분 세척 단계를 후속하였다. 반응 유닛 (RU)로 Fab 단편 포획 수준 (CL)을 모니터링하였다. 재조합 인간 TnT (Roche, 37 kDa)는 90 nM로 샘플 완충액에 희석되었고 농도 시리즈는 0 nM, 30 nM, 11 nM, 3.3 nM, 1.1 nM, 0 nM, 3.3 nM TnT 농도로 생성하였다. 피분석물 농도 시리즈는 3분 결합기의 경우 80 ㎕/분이었고 해리기는 3분 동안 모니터링하였다.
피분석물 결합기의 종료 시에 보고 지점, 반응 유닛 (RU)으로 "늦은 결합 (binding late)" (BL)을 모니터링하였다. 운동 속도 결정의 각 사이클 이후에 포획 시스템은 10 mM 글리신 pH 1.5의 15초 주입 이후 20 ㎕/분으로 10 mM 글리신 pH 1.7의 2회 1분 주입으로 재생되었다.
cTnT 피분석물의 운동학 매개변수 ka [1/Ms], kd [1/s], t1/2 diss [분], KD [M] 및 반응 화학양론 (몰 비율)(상세하게, [Schraeml, M. & Biehl, M. (2012); Kinetic screening in the antibody development process. Methods Mol Biol 901, 171-81.] 참조)은 제조사의 설명서에 따라서 Biaevaluation 소프트웨어 (GE healthcare)를 사용해 각각의 Fab 단편에 대해 결정되었다. 운동학 매개변수는 CDR 돌연변이 부위와 상관있었고 그들의 항원 복합체 안정성 (t1/2 diss)에 따라 표 3에 표시된다.
운동학 매개변수는 상응하는 CDR에서 확인된 돌연변이와 상관있었다. 이러한 스크리닝에서 수득된 돌연변이체는 모두 하나 초과의 아미노산 치환을 함유하였다. 스크리닝에서 확인된 모든 치환의 다양한 조합/변이를 비롯하여 단일 치환을 포함하는 돌연변이체 Fab-단편을 만들었고 시험하였다. 시험된 모든 돌연변이/조합은 표 2에 열거되어 있다.
표 2:
해석 및 분석된 전체 돌연변이체 (상응하는 아미노산 치환(들))을 가짐)의 개요
Figure pct00004
모든 상기 돌연변이체는 SPRㅇ로 분석하였고 그들 항원 복합체 안정성 (t1/2 diss)에 따라서 순위매겼다 (표 3 참조).
표 3:
친화성 성숙화된 cTnT 항체 Fab-단편의 운동학 데이터
Figure pct00005
표 3의 축약어: ka: 결합 속도 상수 [M-1s-1], kd: 해리 속도 상수 [s-1], KD: 해리 평형 상수 KD [M], t/2-diss: 복합체 반감기, ln(2)/kd*60 [분], Rmax: 피분석물의 반응 최대값 [RU], MR: 몰비율 = 피분석물의 반응 최대값 (Rmax)의 비율.
항체 조합 12에 포함된 개별 치환, 즉 번호, 9, 17 및 19 (표 3 참조)에 포함된 돌연변이를 별개로 분석할 때, 이러한 돌연변이된 항체의 친화성, 복합체 안정성 및 ECL 어세이 성능을 개선시키는 3개 돌연변이 부위의 상승적 효과가 존재한다는 것이 분명해진다. 이것은 또한 그에 포함된 돌연변이의 상승적 효과를 입증한다.
실시예 7: HEK 세포에서 키메라 항체의 발현
키메라 인간/마우스 항체는 표준 절차에 따라 수득하였다. 해당 벡터 및 클로닝 과정은 [Norderhaug et al. J Immunol Methods. 1997 May 12;204(1):77-87]에 기술되어 있다.
SPR에 의해 선택된 몇몇 Fab 단편으로부터 전체 길이 쥐과/인간 키메라 항체, 즉 인간 IgG CH1, CH2 및 CH3 도메인을 갖는 항체를 구축하였고 생성시켰다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA는 RP-PCR을 통해서 하이브리도마 클론 7.1 A 12.2-22 (ECACC 89060901)으로부터 수득하였고 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV) 최초기 인핸서/프로모터 영역 하류에서 개별 벡터에 클로닝하였고 BGH 폴리아데닐화 신호가 후속되었다.
현탁-적응된 인간 배아 신장 FreeStyle 293-F 세포주 (Thermo Fisher Scientific)가 항체의 일시적 유전자 발현 (TGE)에 사용되었다: 이 세포는 제조사의 지침에 따라서 PEIpro (Polyplus-transfection SA, Strasbourg) 형질감염 시약과 복합체를 형성한 동일한 양의 양쪽 발현 플라스미드 (총 0.7 mg/세포 배양물-L)로 대략 2 x 10E6 생존 세포/mL에서 형질감염되었다. 형질감염 후 3시간에, 발현을 북돋우기 위해서, HDAC 억제제인 발프로산을 첨가하였다 (최종 농도: 4 mM). 매일, 배양물은 6% (v/v)의 대두 펩톤 가수분해물-기반 공급물이 공급되었다. 형질감염 후 7일에, 배양 상청액을 원심분리를 통해 수집하였고 표준 절차에 따라 그로부터 항체를 정제하였다.
실시예 8: ECL 측정
실시예 7에 따라 생성된 항체는 샌드위치 면역 어세이 (도 4 참조)에서 시험하였다. 루테늄 접합체를 생성시켰고 부모 항-cTnT 항체와 돌연변이된 항-cTnT 항체의 성능을 비교하기 위해서 정품 Roche Elecsys 어세이, 카탈로그 번호 05092744190 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)에 포함된 본래의 표준 루테늄화 접합체 대신에 비교하여 사용하였다. 돌연변이된 mAb는 상이한 표지 화학양론으로 루테늄과 접합되었다. 일 구현예에서 루테늄 표지화 몰 비율은 1:10 항체 IgG:표지였다. 항-cTnT 항체 변이체로부터의 루테늄 접합체는 Elecsys R2 시약에 희석시켰고 측정은 Cobas E170 모듈 상에서 트로포닌 T hs 어세이 프로토콜을 사용하여 블랭크 대조군 (Diluent Universal, Id. 11732277122, Diluent Multi Assay, Id. 03609987170, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), 트로포닌 T hs 어세이 사양을 사용하는 트로포닌 T hs CalSet (Id. 05092752190, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)의 Cal1 및 Cal2과 함께 수행하였다. 결과는 도 5에 제공된다. 각각 조합 번호 11 및 12에 존재하는 돌연변이를 포함하는 항체는 부모 (비돌연변이된) 항체와 비교하여 개선된 신호 대 노이즈 비율을 보인다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for affinity maturation of antibodies <130> P34730-WO <150> EP18161699.6 <151> 2018-03-14 <160> 95 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ser Asp Ile Glu Glu Val Val Glu Glu Tyr Glu Glu Glu Glu Gln 1 5 10 15 Glu Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Asp Trp Arg Glu Asp Glu Asp 20 25 30 Glu Gln Glu Glu Ala Ala Glu Glu Asp Ala Glu Ala Glu Ala Glu Thr 35 40 45 Glu Glu Thr Arg Ala Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ala Lys Glu 50 55 60 Ala Glu Asp Gly Pro Met Glu Glu Ser Lys Pro Lys Pro Arg Ser Phe 65 70 75 80 Met Pro Asn Leu Val Pro Pro Lys Ile Pro Asp Gly Glu Arg Val Asp 85 90 95 Phe Asp Asp Ile His Arg Lys Arg Met Glu Lys Asp Leu Asn Glu Leu 100 105 110 Gln Ala Leu Ile Glu Ala His Phe Glu Asn Arg Lys Lys Glu Glu Glu 115 120 125 Glu Leu Val Ser Leu Lys Asp Arg Ile Glu Arg Arg Arg Ala Glu Arg 130 135 140 Ala Glu Gln Gln Arg Ile Arg Asn Glu Arg Glu Lys Glu Arg Gln Asn 145 150 155 160 Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ala Arg Arg 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musculus <400> 16 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala 1 5 10 15 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 17 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 31 <212> PRT <213> mus musculus <400> 18 Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> mus musculus <400> 19 Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> mus musculus <400> 20 Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 1 5 10 15 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 20 25 30 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr 35 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> mus musculus <400> 21 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 219 <212> PRT <213> mus musculus <400> 22 Met Asp Ile 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Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu 165 170 175 Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190 Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Ile 210 <210> 33 <211> 210 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 33 Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu 20 25 30 Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln 35 40 45 Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu Leu Glu Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys 65 70 75 80 Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu 85 90 95 Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr 100 105 110 Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu 115 120 125 Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu 130 135 140 Arg Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly 145 150 155 160 Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val 165 170 175 Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg 180 185 190 Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe 195 200 205 Glu Ser 210 <210> 34 <211> 212 <212> PRT <213> mus musculus <400> 34 Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30 Tyr Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Glu Thr Phe Tyr Asn Gln Lys 50 55 60 Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Thr Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 145 150 155 160 Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu 165 170 175 Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190 Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Ile 210 <210> 35 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 35 cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccc 44 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 36 ggtaaaggta tagccgctcg 20 <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 37 ccagaaattt aaggataaag cgaccc 26 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 38 ggtcgcgcaa taatacaccg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 39 cggtgtatta ttgcgcgacc 20 <210> 40 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 40 aacccccgca taggctgggg gttggaaagc ctctgaggac cagcacg 47 <210> 41 <211> 63 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 41 gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60 cat 63 <210> 42 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 42 gctctgtttc acccatttca tataatamnn ggtaaaggta tagc 44 <210> 43 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 43 gctctgtttc acccatttca tatamnnatc ggtaaaggta tagc 44 <210> 44 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> n is a, c, g, or t <400> 44 gctctgtttc acccatttca mnnaataatc ggtaaaggta tagc 44 <210> 45 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 45 gctctgtttc acccatttmn nataataatc ggtaaaggta tagc 44 <210> 46 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 46 gctctgtttc acccamnnca tataataatc ggtaaaggta tagc 44 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 47 ccatggctct gtttcaccc 19 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 48 cgagcggcta tacctttacc 20 <210> 49 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 49 gctatacctt taccnnktat tatatgaaat gggtgaaaca gagc 44 <210> 50 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 50 gctatacctt taccgatnnk tatatgaaat gggtgaaaca gagc 44 <210> 51 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 51 gctatacctt taccgattat nnkatgaaat gggtgaaaca gagc 44 <210> 52 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 gctatacctt taccgattat tatnnkaaat gggtgaaaca gagc 44 <210> 53 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 53 gctatacctt taccgattat tatatgnnkt gggtgaaaca gagc 44 <210> 54 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (48)..(49) <223> n is a, c, g, or t <400> 54 ccttaaattt ctggttataa aaggtttcgc cgttgttcgg attaatmnng ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 55 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (45)..(46) <223> n is a, c, g, or t <400> 55 ccttaaattt ctggttataa aaggtttcgc cgttgttcgg attmnnatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 56 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (42)..(43) <223> n is a, c, g, or t <400> 56 ccttaaattt ctggttataa aaggtttcgc cgttgttcgg mnnaatatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 57 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 ccttaaattt ctggttataa aaggtttcgc cgttgttmnn attaatatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 58 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (36)..(37) <223> n is a, c, g, or t <400> 58 ccttaaattt ctggttataa aaggtttcgc cgttmnncgg attaatatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 59 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (33)..(34) <223> n is a, c, g, or t <400> 59 ccttaaattt ctggttataa aaggtttcgc cmnngttcgg attaatatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 60 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> n is a, c, g, or t <400> 60 ccttaaattt ctggttataa aaggtttcmn ngttgttcgg attaatatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 61 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (27)..(28) <223> n is a, c, g, or t <400> 61 ccttaaattt ctggttataa aaggtmnngc cgttgttcgg attaatatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 62 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <400> 62 ccttaaattt ctggttataa aamnnttcgc cgttgttcgg attaatatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 63 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 ccttaaattt ctggttatam nnggtttcgc cgttgttcgg attaatatcg ccaatccatt 60 ccagg 65 <210> 64 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 64 gggtcgcttt atccttaaat ttctgg 26 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 65 gcaaaagcct ggaatggatt ggc 23 <210> 66 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 66 cctggaatgg attggcnnka ttaatccgaa caacggcgaa accttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 67 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 67 cctggaatgg attggcgatn nkaatccgaa caacggcgaa accttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 68 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 68 cctggaatgg attggcgata ttnnkccgaa caacggcgaa accttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 69 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 69 cctggaatgg attggcgata ttaatnnkaa caacggcgaa accttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 70 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 70 cctggaatgg attggcgata ttaatccgnn kaacggcgaa accttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 71 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <400> 71 cctggaatgg attggcgata ttaatccgaa cnnkggcgaa accttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 72 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <400> 72 cctggaatgg attggcgata ttaatccgaa caacnnkgaa accttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 73 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n is a, c, g, or t <400> 73 cctggaatgg attggcgata ttaatccgaa caacggcnnk accttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 74 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (41)..(42) <223> n is a, c, g, or t <400> 74 cctggaatgg attggcgata ttaatccgaa caacggcgaa nnkttttata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 75 <211> 65 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <400> 75 cctggaatgg attggcgata ttaatccgaa caacggcgaa accnnktata accagaaatt 60 taagg 65 <210> 76 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 76 ggtaccctgg ccccaataat caaacacmnn ggtcgcgcaa taatacacc 49 <210> 77 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 77 ggtaccctgg ccccaataat caaamnngcg ggtcgcgcaa taatacacc 49 <210> 78 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 78 ggtaccctgg ccccaataat cmnncacgcg ggtcgcgcaa taatacacc 49 <210> 79 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 79 ggtaccctgg ccccaatamn naaacacgcg ggtcgcgcaa taatacacc 49 <210> 80 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 80 ggtaccctgg ccccamnnat caaacacgcg ggtcgcgcaa taatacacc 49 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 81 cggtcagggt ggtaccctgg c 21 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 82 cggtgtatta ttgcgcgacc 20 <210> 83 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 83 ggtgtattat tgcgcgaccn nkgtgtttga ttattggggc cagggtacc 49 <210> 84 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (23)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 84 ggtgtattat tgcgcgaccc gcnnktttga ttattggggc cagggtacc 49 <210> 85 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 85 ggtgtattat tgcgcgaccc gcgtgnnkga ttattggggc cagggtacc 49 <210> 86 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 86 ggtgtattat tgcgcgaccc gcgtgtttnn ktattggggc cagggtacc 49 <210> 87 <211> 49 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <400> 87 ggtgtattat tgcgcgaccc gcgtgtttga tnnktggggc cagggtacc 49 <210> 88 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 88 ggaaagcctc tgaggaccag cacggatgcc ctgtgc 36 <210> 89 <211> 44 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 89 cgaaattaat acgactcact atagggagac cacaacggtt tccc 44 <210> 90 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 90 aacccccgca taggctgggg gttggaaagc ctctgaggac cagcacg 47 <210> 91 <211> 191 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 91 gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat aattttgttt aactttaaga aggagatata 60 catatggaag tgcagctgca gcagagcggc ccggaactgg tgaaaccggg cgcgagcgtg 120 aaaatgagct gcaaagcgag cggctatacc tttaccgatt attatatgaa atgggtgaaa 180 cagagccatg g 191 <210> 92 <211> 138 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 92 cgagcggcta tacctttacc gattattata tgaaatgggt gaaacagagc catggcaaaa 60 gcctggaatg gattggcgat attaatccga acaacggcga aaccttttat aaccagaaat 120 ttaaggataa agcgaccc 138 <210> 93 <211> 210 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 93 gcaaaagcct ggaatggatt ggcgatatta atccgaacaa cggcgaaacc ttttataacc 60 agaaatttaa ggataaagcg accctgaccg tggataaaag cagcagcacc gcgtatatgc 120 agctgaacag cctgaccagc gaagatagcg cggtgtatta ttgcgcgacc cgcgtgtttg 180 attattgggg ccagggtacc accctgaccg 210 <210> 94 <211> 512 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 94 cggtgtatta ttgcgcgacc cgcgtgtttg attattgggg ccagggtacc accctgaccg 60 tgagcagcgc gaaaaccacc ccgccgagcg tgtatccgct ggcgccgggc agcgcggcgc 120 agaccaacag catggtgacc ctgggctgcc tggtgaaagg ctattttccg gaaccggtga 180 ccgtgacctg gaacagcggc agcctgagca gcggcgtgca tacctttccg gcggtgctgc 240 agagcgatct gtataccctg agcagcagcg tgaccgtgcc gagcagcacc tggccgagcg 300 aaaccgtgac ctgcaacgtg gcgcatccgg cgagcagcac caaagtggat aaaaaaattg 360 gagctggtgc aggctctggt gctggcgcag gttctccagc agcggtgccg gcagcagttc 420 ctgctgcggt gggcgaaggc gagggagagt tcagtacgcc agtttggatc tcgcaggcac 480 agggcatccg tgctggtcct cagaggcttt cc 512 <210> 95 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 95 gctacaaacg cgtacgctat ggaagtgcag ctgcagcaga gcg 43

Claims (15)

  1. 기지의 부모 CDR을 포함하는 대상 항체의 적어도 하나의 인접한 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성시키는 방법으로서, 부모 CDR은 기지의 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 방법은
    i) 항체의 제1 프레임워크 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계,
    ii) (i)의 폴리뉴클레오티드에 대한 제1 PCR 프라이머를 제공하는 단계,
    iii) 각각 엘리먼트 A-B-C로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 제공하는 단계로서,
    A)는 제1 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고,
    각각의 B)는 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 구성원이고, 상기 라이브러리의 구성원은 적어도 하나의 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인되고,
    C)는 제2 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드인, 단계,
    iv) 엘리먼트 C)에 대한 제2 PCR 프라이머를 제공하는 단계,
    v) 폴리뉴클레오티드 (i) 내지 (iv)를 기반으로 PCR을 수행하여, 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 수득하는 단계로서, 이러한 PCR은 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열의 부재 하에서 수행되는 것인 단계
    를 특징으로 하는 것인 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 프레임워크 영역은 FW1 또는 FW4이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 첫번째가 FW1이면 FW2이거나, 또는 첫번째가 FW4이면 FW3이고, 상기 CDR은 제1 프레임워크 영역이 FW1이면 CDR1이거나, 또는 제1 프레임워크 영역이 FW4이면 CDR3인 생성 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 프레임워크 영역은 FW1이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 FW2이고, 상기 제1 프라이머는 FW1에 대한 전방향 프라이머이고, 상기 제2 프라이머는 FW2에 대한 역방향 프라이머이며, 상기 CDR은 CDR1인 생성 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 프레임워크 영역은 FW4이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 FW3이고, 상기 제1 프라이머는 FW4에 대한 역방향 프라이머이고 상기 제2 프라이머는 FW3에 대한 전방향 프라이머이며, 상기 부모 CDR은 CDR3인 생성 방법.
  5. 제1 및 제2 기지의 부모 CDR을 포함하는 대상 항체의 2개의 인접하는 상보성 결정 영역 (CDR) 및 프레임워크 영역을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성시키는 방법으로서, 제1 및 제2 부모 CDR은 제1 및 제2 기지 CDR 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 방법은
    i) 항체의 제1 프레임워크 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계,
    ii) 엘리먼트 A-B-C로 각각 이루어진 폴리뉴클레오티드의 제1 혼합물을 제공하는 단계로서,
    A)는 제1 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고,
    각각의 B)는 제1 부모 CDR과 동일한 수의 코돈을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 구성원이고, 상기 라이브러리의 구성원은 적어도 하나의 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인되고,
    C)는 제2 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드인, 단계,
    iii) 엘리먼트 C)에 대한 제1 PCR 프라이머를 제공하는 단계,
    iv) 엘리먼트 A'-B'-C'으로 각각 이루어진 폴리뉴클레오티드의 제2 혼합물을 제공하는 단계로서,
    A')은 상기 제1 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드이고,
    각각의 B')은 제2 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 코돈을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 구성원으로서, 상기 라이브러리의 구성원은 적어도 하나의 무작위적 코돈을 포함하도록 디자인되고,
    C')은 제3 프레임워크 영역과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드인, 단계,
    v) 엘리먼트 C')에 대한 제2 PCR 프라이머를 제공하는 단계,
    vi) 폴리뉴클레오티드 (i) 내지 (v)를 기반으로 PCR을 수행하여, 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 수득하는 단계로서, 이러한 PCR은 임의의 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열의 부재 하에서 수행되는 것인 단계
    를 특징으로 하는 것인 생성 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 프레임워크 영역은 FW2이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 FW1이고, 상기 제3 프레임워크 영역은 FW3이고, 제1 부모 CDR은 CDR1이고, 제2 부모 CDR은 CDR2이고, 엘리먼트 C)에 대한 상기 제1 프라이머는 FW1에 대한 전방향 프라이머이고, 엘리먼트 C')에 대한 상기 제2 프라이머는 FW3에 대한 역방향 프라이머인 생성 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 제1 프레임워크 영역은 FW3이고, 상기 제2 프레임워크 영역은 FW2이고, 상기 제3 프레임워크 영역은 FW4이고, 제1 부모 CDR은 CDR2이고, 제2 부모 CDR은 CDR3이고, 엘리먼트 C)에 대한 상기 제1 프라이머는 FW2에 대한 전방향 프라이머이고, 엘리먼트 C')에 대한 상기 제2 프라이머는 FW4에 대한 역방향 프라이머인 생성 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 엘리먼트 B)에서 부모 CDR 폴리뉴클레오티드 서열 중 1개 코돈 또는 2개 코돈은 무작위적인 생성 방법.
  9. 항체의 가변 사슬의 1개의 무작위적 CDR 또는 2개의 인접한 무작위적 CDR을 코딩하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따라 수득가능한 폴리뉴클레오티드의라이브러리로서, 수득된 라이브러리에서 부모 폴리뉴클레오티드 서열 대 다른 (무작위적) 폴리뉴클레오티드 서열의 비율은 1개 CDR이 무작위적인 경우 1:106 이하이고 2개 CDR이 무작위적인 경우 1:107 이하인 라이브러리.
  10. 항체의 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하기 위한 제9항에 따른 라이브러리의 용도로서, 가변 사슬은 가변 H 사슬 또는 가변 L 사슬로부터 선택되는 것인 용도.
  11. 제3항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 따라 생성된 라이브러리를 기반으로 중복 PCR을 수행하여 항체의 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하기 위한 방법.
  12. 제11항에 따라 수득가능한 항체의 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리로서, 가변 사슬은 무작위적 CDR1, 무작위적 CDR2 및 무작위적 CDR3을 포함하고, 수득된 라이브러리에서 라이브러리 중 부모 폴리뉴클레오티드 서열 대 다른 폴리뉴클레오티드 서열의 비율은 1:5x107 이하인 생성 방법.
  13. 항체 라이브러리를 생성시키기 위한 방법으로서, 항체는 제1 가변 사슬 및 제2 가변 사슬을 포함하고, 제12항에 따른 상기 항체의 제1 가변 사슬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 상기 항체의 제2 가변 사슬과 함께 발현되고 조합되는 것인 생성 방법.
  14. 제13항에 따라 생성된 라이브러리로부터의 제1 가변 사슬 및 제2 가변 사슬을 포함하는 항체를 선택하는 방법으로서, 선택된 항체는 기지의 부모 CDR을 갖는 부모 항체와 비교하여 개선된 결합 특징을 갖는 것인 선택 방법.
  15. 제14항에 있어서, 선택된 항체는 부모 항체와 비교하여 적어도 20%의 해리 복합체 반감기 t/2의 선택된 증가를 나타내는 것인 선택 방법.
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