BR112020018235A2

BR112020018235A2 - Métodos para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos, bibliotecas de polinucleotídeos, uso de uma biblioteca, método para gerar uma biblioteca de anticorpos e método de seleção de um anticorpo

Info

Publication number: BR112020018235A2
Application number: BR112020018235-4A
Authority: BR
Inventors: Frank Kroner; Michael Schraeml; Sarah Liedke
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2018-03-14
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2020-12-29
Also published as: WO2019175131A1; US20210009993A1; EP3765498A1; JP7333332B2; KR20200131838A; CN111801351A; JP2021515573A

Abstract

a presente invenção refere-se a um novo método de geração de bibliotecas de polinucleotídeos que codificam uma região estrutural (framework) e, pelo menos, uma região determinante de complementaridade (cdr) de um anticorpo de interesse. estas bibliotecas são adequadas para uso em procedimentos de maturação de afinidade, a fim de se obter anticorpos maturados com características melhoradas em comparação com o anticorpo parental.

Description

“MÉTODOS PARA GERAR UMA BIBLIOTECA DE POLINUCLEOTÍDEOS, BIBLIOTECAS DE POLINUCLEOTÍDEOS, USO DE UMA BIBLIOTECA, MÉTODO PARA GERAR UMA BIBLIOTECA DE ANTICORPOS E MÉTODO DE SELEÇÃO DE UM ANTICORPO”

[001] A presente invenção refere-se a um novo método de geração de bibliotecas de polinucleotídeos que codificam uma região estrutural (framework) e, pelo menos, uma região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo de interesse. Estas bibliotecas são adequadas para uso em procedimentos de maturação de afinidade, a fim de obter anticorpos maturados com características melhoradas em comparação com o anticorpo parental.

[002] Neste relatório descritivo são citados vários documentos, incluindo pedidos de patentes e manuais de fabricantes. A divulgação desses documentos, embora não seja considerada relevante para a patenteabilidade desta invenção, é integralmente incorporada ao presente por referência. Mais especificamente, todos os documentos referenciados são incorporados por referência na mesma medida como se cada documento individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado pela referência.

[003] Os anticorpos são amplamente utilizados em aplicações diagnósticas e terapêuticas. Isso levou a esforços consideráveis no desenvolvimento de procedimentos para otimizar as propriedades de tais anticorpos, por exemplo, aumentando a afinidade para o antígeno alvo. Espera- se que o aumento da afinidade dos anticorpos melhore o desempenho dos anticorpos devido à especificidade melhorada em concentrações de anticorpos e/ou antígenos reduzidas. São conhecidos diferentes métodos para a maturação de afinidade in vitro que envolvem a exibição baseada em células, por exemplo, exibição na superfície de célula de levedura, exibição de fago ou exibição livre de células, tal como exibição de ribossomo. Esses métodos permitem a realização de seleções negativas e positivas de forma a eliminar ligantes não específicos e identificar ligantes específicos com alta afinidade.

[004] Entretanto, uma desvantagem nos métodos de maturação de afinidade conhecidos é a frequente ocorrência de grandes quantidades de sequências parentais não mutagenizadas em bibliotecas de polinucleotídeos que tornam a seleção e a identificação de anticorpos aprimorados demoradas e trabalhosas. Em alguns casos, foi mesmo impossível identificar anticorpos melhorados por meio de um procedimento de maturação de afinidade. Os presentes inventores descobriram agora um método para ultrapassar as desvantagens associadas à técnica anterior, proporcionando bibliotecas que não contêm quantidades elevadas indesejadas de sequências parentais.

[005] A presente invenção é exemplificada com anticorpos contra a troponina T cardíaca (cTnT), no entanto, é contemplado que o método pode ser transferido para anticorpos direcionados a outros antígenos.

[006] A troponina T cardíaca é um biomarcador amplamente utilizado em pacientes com doença cardíaca. Sua utilidade em pacientes com doenças cardíacas foi recentemente revisada por Westermann et al. (Nature Reviews / Cardiology, vol 14 (2017) 473-483. O uso de cTnT está bem estabelecido em pacientes com suspeita de infarto agudo do miocárdio (IAM), mas a medição da troponina também é usada em outros contextos agudos e não agudos. Em pacientes com suspeita IAM, a tomada de decisão precoce é crucial para permitir um tratamento rápido e avaliação diagnóstica adicional.

[007] Os novos ensaios de alta sensibilidade para a troponina permitem a detecção de concentrações nitidamente mais baixas. Usando esses ensaios e concentrações de corte muito baixas, foram divulgadas várias estratégias de diagnóstico rápido para melhorar o diagnóstico em cuidados cardíacos agudos. Além disso, aplicações não coronárias e não agudas de ensaios de troponina - por exemplo, como um biomarcador em pacientes com insuficiência cardíaca, embolismo pulmonar, ou doença da artéria coronária estável - estão no horizonte e podem melhorar a estratificação do risco individual.

[008] A troponina T cardíaca é geralmente medida em um imunoensaio tipo sanduíche, em que pelo menos um anticorpo é usado para capturar a cTnT e pelo menos um segundo anticorpo (marcado) é usado para detectar a cTnT em uma amostra. Este também é o caso do ensaio de quinta geração para cTnT vendido pela Roche Diagnostics, Alemanha. O anticorpo monoclonal 12.1A11.11-7, produzido pelo clone de hibridoma 7.1 A 12.2-22 (ECACC 89060901) conforme depositado na Coleção Europeia de Culturas de Células Animais, GB, tem sido usado há quase três décadas como o melhor anticorpo de detecção em ensaios para cTnT. Desde que esse anticorpo foi gerado em 1989, nenhum anticorpo monoclonal melhor para a detecção de cTnT apareceu.

[009] Nos últimos anos, foram desenvolvidos ensaios cada vez mais sensíveis para a medição das várias troponinas, por exemplo, com base em técnicas sofisticadas de marcação de anticorpos de detecção usadas em tais ensaios.

[010] Diversos estudos avaliaram os vários ensaios de alta sensibilidade para a troponina tanto quanto ao potencial para melhorar a triagem de pacientes com suspeita de IAM, como a utilidade desses ensaios em outros campos do diagnóstico clínico.

[011] Mesmo os ensaios de troponina mais sensíveis foram relatados por fracassarem na medição da troponina em certa porcentagem de indivíduos saudáveis (consulte, por exemplo, Westermann et al., acima).

Obviamente, a sensibilidade do ensaio é de extrema importância, por exemplo, na detecção de cTnT e uma melhora para esse fim seria altamente desejável.

[012] Agora de maneira bastante surpreendente, com base no novo método para a maturação de afinidade, tal como definido nas reivindicações da presente invenção, podem ser selecionados e identificados anticorpos que abrigam certas mutações nas regiões determinantes da complementaridade (CDR) do anticorpo 12.1A11.11-7 que, por um lado, não influenciam negativamente na formação do complexo do anticorpo com cTnT, mas representam uma melhoria significativa no que diz respeito à estabilidade do complexo formado entre a cTnT e tais anticorpos mutantes. Por meio dessas propriedades surpreendentes, um ensaio para cTnT com sensibilidade superior é viável.

[013] O método de maturação de afinidade que foi aplicado com sucesso ao anticorpo 12.1A11.11-7 pode ser transferido para diferentes anticorpos, incluindo anticorpos de diagnóstico e terapêuticos com base na presente divulgação.

[014] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um novo método para gerar bibliotecas de polinucleotídeos que codificam a cadeia variável de um anticorpo pela realização de uma série de reações de amplificação. Estas bibliotecas de polinucleotídeos podem ser usadas em procedimentos de seleção para identificar anticorpos com propriedades melhoradas, como uma afinidade aumentada contra o antígeno alvo.

[015] O objetivo da presente invenção é gerar anticorpos com características melhoradas em comparação com um anticorpo parental possuindo cadeias variáveis com regiões determinantes de complemento (CDRs) parentais conhecidas, cujas CDRs conhecidas são codificadas por sequências polinucleotídicas de CDR conhecidas.

[016] Em uma primeira etapa, uma pluralidade de bibliotecas de polinucleotídeos é gerada codificando uma CDR aleatória da cadeia variável do referido anticorpo parental ou duas CDRs aleatórias adjacentes da cadeia variável do referido anticorpo parental. Essas bibliotecas podem ter um tamanho de cerca de 107 a cerca de 1011 membros, ou cerca de 108 a cerca de 1010 membros, dependendo dos respectivos graus de aleatorização para CDRs.

[017] Ao combinar essas bibliotecas, outra biblioteca de polinucleotídeos é gerada. Os membros desta biblioteca codificam uma cadeia variável aleatória, isto é, uma CDR1 aleatória, uma CDR2 aleatória e uma CDR3 aleatória da cadeia variável do referido anticorpo parental. Além disso, os membros da biblioteca podem codificar as regiões estruturais (frameworks) FW1, FW2, FW3 e FW4 de uma cadeia variável, particularmente as regiões estruturais FW1, FW2, FW3 e FW4 da cadeia variável do anticorpo parental.

Esta biblioteca pode ter um tamanho de cerca de 106 a cerca de 1022 membros, ou cerca de 1011 a cerca de 1013, ou cerca de 2x1011 a 5x1012 membros, dependendo dos respectivos graus de aleatorização para CDRs.

[018] As bibliotecas de polinucleotídeos da presente invenção estão substancialmente livres de sequências polinucleotídicas de CDR parentais. Isto pode ser conseguido gerando as bibliotecas na ausência de quaisquer sequências polinucleotídicas de CDR parental. Consequentemente, a quantidade de membros individuais da biblioteca compreendendo sequências polinucleotídicas de CDR parental na biblioteca é cerca de 1:10 6 ou menos, 1:5x105 ou menos, ou 1:105 ou menos para uma biblioteca compreendendo uma sequência polinucleotídica de CDR aleatória ou 1:10 7 ou menos para uma biblioteca compreendendo duas sequências polinucleotídicas de CDR aleatórias, ou cerca de 1:5x107 ou menos, ou 1:108 ou menos para uma biblioteca compreendendo três sequências polinucleotídicas de CDR aleatórias.

[019] Em um exemplo de realização, uma CDR é aleatorizada e a relação da sequência de polinucleotídeos com outras sequências de polinucleotídeos (aleatorizadas) na biblioteca obtida é de 1:10 6 ou menos. Em um exemplo de realização, duas CDR são aleatorizadas e a relação da sequência de polinucleotídeos com outras sequências de polinucleotídeos (aleatorizadas) na biblioteca obtida é de 1:107 ou menos. Em um exemplo de realização, três CDR são aleatorizadas e a relação da sequência de polinucleotídeos com outras sequências de polinucleotídeos na biblioteca obtida é de 1:5x107 ou menos.

[020] A biblioteca de polinucleotídeos que codifica uma cadeia variável aleatória pode ser usada para gerar bibliotecas de anticorpos de acordo com métodos conhecidos. A partir dessas bibliotecas de anticorpos, pode ser realizada uma seleção eficiente de anticorpos individuais com características melhoradas em comparação com o anticorpo parental.

[021] Assim, um primeiro aspecto da invenção refere-se a um método para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos cada um codificando uma região estrutural (framework) e pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) adjacente de um anticorpo de interesse, em que o anticorpo compreende uma CDR parental conhecida codificada por uma sequência polinucleotídica de CDR parental conhecida, cujo método é caracterizado pelo: i) fornecimento de um polinucleotídeo que codifica uma primeira região estrutural (framework) de anticorpo; ii) fornecimento de um primeiro iniciador (primer) de PCR para o polinucleotídeo de (i); iii) fornecimento de uma mistura de polinucleotídeos, cada um consistindo de elementos A-B-C; - em que: A) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar com uma primeira região estrutural; cada B) é um membro de uma biblioteca de polinucleotídeos compreendendo o mesmo número de códons que a sequência polinucleotídica da CDR parental, em que os membros da referida biblioteca são projetados para compreender pelo menos um códon aleatorizado, por exemplo, um códon aleatório ou dois códons aleatorizados; e C) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar com uma segunda região estrutural; iv) fornecimento de um segundo iniciador de PCR para o elemento C); e v) realização de uma PCR com base nos polinucleotídeos de (i) a (iv), obtendo assim a biblioteca de polinucleotídeos, e em que tal PCR é realizada na ausência da sequência polinucleotídica da CDR parental.

[022] De acordo com este aspecto, a primeira região estrutural é FW1 ou FW4, em que a referida segunda região estrutural é FW2 se a primeira for FW1, ou é FW3 se a primeira for FW4, e em que a referida CDR é CDR1 se a primeira região estrutural for FW1 ou é CDR3 se a primeira região estrutural for FW4.

[023] Assim, em um exemplo de realização específico, a primeira região estrutural é FW1, em que a referida segunda região estrutural é FW2, em que o referido primeiro iniciador é um iniciador direto para FW1 e em que o referido segundo iniciador é um iniciador reverso para FW2, e em que a referida CDR é CDR1.

[024] Em outro exemplo de realização específico deste aspecto, a primeira região estrutural é FW4, em que a referida segunda região estrutural é FW3, aqui o referido primeiro iniciador é um iniciador reverso (reverse) para FW4 e em que o referido segundo iniciador é um iniciador direto (forward) para FW3, e em que a referida CDR parental é CDR3.

[025] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de geração de uma biblioteca de polinucleotídeos, cada um codificando uma região estrutural e duas regiões determinantes de complementaridade (CDRs)

adjacentes de um anticorpo de interesse, em que o anticorpo compreende a primeira e segunda CDRs parentais conhecidas codificadas pela primeira e segunda sequência polinucleotídica da CDR parental conhecida, cujo método é caracterizado pelo:

i) fornecimento de um polinucleotídeo que codifica uma primeira região estrutural de anticorpo;

ii) fornecimento de uma primeira mistura de polinucleotídeos,

cada um consistindo de elementos A-B-C;

- em que:

- A) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar à primeira região estrutural;

- cada B) é um membro de uma biblioteca do primeiro polinucleotídeo compreendendo o mesmo número de códons que a primeira sequência polinucleotídica da CDR parental, em que os membros da referida biblioteca são projetados para compreender pelo menos um códon aleatorizado, por exemplo, um códon aleatório ou dois códons aleatorizados; e

- C) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar com uma segunda região estrutural;

iii) fornecimento de um primeiro iniciador de PCR para o elemento C);

iv) fornecimento de uma segunda mistura de polinucleotídeos,

cada um consistindo de elementos A’-B’-C’;

- em que:

- A’) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar à referida primeira região estrutural;

- cada B’) é um membro de uma biblioteca do segundo polinucleotídeo compreendendo o mesmo número de códons que a segunda sequência polinucleotídica da CDR parental, em que os membros da referida biblioteca são projetados para compreender pelo menos um códon aleatorizado, por exemplo, um códon aleatório ou dois códons aleatorizados; e - C’) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar com uma terceira região estrutural; v) fornecimento de um segundo iniciador de PCR para o elemento C’); e v) realização de uma PCR com base nos polinucleotídeos de (i) a (iv), obtendo assim a biblioteca de polinucleotídeos, e em que tal PCR é realizada na ausência de qualquer sequência polinucleotídica da CDR parental.

[026] Em um exemplo de realização específico deste aspecto, a primeira região estrutural é FW2, em que a referida segunda região estrutural é FW1, em que a referida terceira região estrutural é FW3, em que a primeira CDR parental é CDR1, em que a segunda CDR parental é CDR2, em que o referido primeiro iniciador para o elemento C) é o iniciador direto (forward) para FW1, em que o referido segundo iniciador para o elemento C') é um iniciador reverso (reverse) para FW3.

[027] Em outro exemplo de realização específico deste aspecto, a primeira região estrutural é FW3, em que a referida segunda região estrutural é FW2, em que a referida terceira região estrutural é FW4, em que a primeira CDR parental é CDR2, em que a segunda CDR parental é CDR3, em que o referido primeiro iniciador para o elemento C) é o iniciador direto (forward) para FW2, em que o referido segundo iniciador para o elemento C') é um iniciador reverso (reverse) para FW4.

[028] O termo “anticorpo parental” ou “imunoglobulina parental”, conforme usado, refere-se a um anticorpo conhecido ou não modificado, respectivamente. Tal como ilustrado na presente descrição, certas partes da sequência de polinucleotídeo codificante do anticorpo parental são utilizadas para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos.

[029] Um “CDR parental” é a sequência CDR do anticorpo conhecido, não modificado, parental (original). Uma “sequência polinucleotídica da CDR parental” é a sequência polinucleotídica que codifica uma CDR do anticorpo parental.

[030] O termo “polinucleotídeo”, tal como utilizado na presente invenção, abrange moléculas que compreendem uma pluralidade de nucleotídeos, geralmente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos, incluindo ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos e análogos de nucleotídeos. Em certos exemplos de realização, os nucleotídeos são desoxirribonucleotídeos.

[031] O termo “capaz de hibridizar” é entendido na técnica que um polinucleotídeo de fita simples (única) pareia com um polinucleotídeo complementar, formando assim um polinucleotídeo de fita dupla sob condições apropriadas, por exemplo, condições apropriadas de temperatura, força iônica e tempo de incubação. De acordo com a presente invenção, a expressão “capaz hibridizar” indica particularmente que um polinucleotídeo de fita simples pareia com um polinucleotídeo complementar, formando assim um polinucleotídeo de fita dupla sob as condições de uma reação de amplificação, por exemplo, de uma PCR tal como descrita na presente invenção. As condições apropriadas para o pareamento da cadeia em uma reação de amplificação, por exemplo uma PCR, são bem conhecidas no estado da técnica.

[032] Os métodos descritos acima envolvem o uso de misturas de polinucleotídeos que consistem nos elementos A-B-C ou A'-B'-C'. Os elementos B compreendem o mesmo número de códons que a sequência polinucleotídica da CDR parental específica a ser aleatorizada e são projetados para compreender pelo menos um códon aleatorizado, por exemplo, um códon aleatorizado ou dois códons aleatorizados. Em determinados exemplos de realização, os elementos B compreendem um códon aleatorizado. Estas misturas de polinucleotídeos podem ser fornecidas por síntese química de polinucleotídeos de acordo com métodos conhecidos.

[033] Em determinados exemplos de realização, as misturas de elementos B são constituídas por uma pluralidade de subconjuntos que são projetados para compreender diferentes códons aleatórios com uma sequência de polinucleotídeo CDR. Assim, no caso de uma sequência de polinucleotídeo CDR compreender 10 códons, isto é, 30 nucleotídeos, a respectiva mistura de elementos B pode ser constituída de até 10 subconjuntos, cada um sendo projetado para compreender um códon aleatório diferente. Assim, em certos exemplos de realização, as misturas de elementos B são projetadas para compreender uma pluralidade de subconjuntos, cada um projetado para compreender um códon aleatório ou dois códons aleatórios, abrangendo, assim, a aleatorização de todos os códons de uma sequência polinucleotídica de CDR.

[034] Os elementos B das misturas polinucleotídicas A-B-C ou A'-B'-C' são concebidos para compreender pelo menos um códon aleatorizado.

O códon aleatorizado pode ser selecionado a partir de quaisquer códons aleatorizados adequados, incluindo, mas não se limitando a NNN, em que N significa A/C/G/T, NNB, em que N significa A/C/G/T e B significa C/G/T, NNK, em que N significa A/C/G/T e K significa G/T, ou NNS, em que N significa A/C/G/T e S significa C/G. Em determinados exemplos de realização, o códon aleatorizado é um códon NNK. Deve-se notar, no entanto, que a aleatorização é projetada para não gerar uma sequência polinucleotídica da CDR parental.

[035] Outro aspecto da invenção é uma biblioteca de polinucleotídeos obtenível de acordo com os métodos descritos acima e, em que os polinucleotídeos codificam uma CDR aleatorizada ou duas CDR aleatorizadas de uma cadeia variável de anticorpo, por exemplo, uma cadeia pesada (H) variável ou uma cadeia leve (L) variável. Os presentes inventores descobriram que tal biblioteca é substancialmente livre de sequências polinucleotídicas da CDR parental. A biblioteca pode abranger polinucleotídeos que codificam uma CDR aleatorizada, por exemplo, CDR1 ou CDR3, ou polinucleotídeos que codificam combinações de duas CDRs aleatorizadas adjacentes, por exemplo, CDR1 e CDR2, ou CDR2 e CDR3. Estas bibliotecas podem ser combinadas, por exemplo, por meio de uma PCR de sobreposição (overlapping PCR) ou uma reação de amplificação equivalente, para gerar bibliotecas de polinucleotídeos que codificam uma cadeia de anticorpo variável com três CDRs aleatorizadas, nomeadamente CDR1, CDR2 e CDR3.

[036] Assim, uma biblioteca como descrita acima, em particular, uma combinação de várias bibliotecas, cada um delas codificando variantes aleatorizadas de uma CDR ou de duas CDR adjacentes de um anticorpo, pode ser utilizada para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos que codifica uma variante aleatorizada de uma cadeia variável de um anticorpo, por exemplo, uma cadeia H variável aleatorizada ou uma cadeia L variável aleatorizada. Em um exemplo de realização específico, a cadeia variável é uma cadeia H variável aleatorizada.

[037] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos codificantes de uma cadeia variável de um anticorpo pela realização de uma PCR de sobreposição ou uma reação de amplificação equivalente com base nas bibliotecas geradas conforme descrito acima. Em um exemplo de realização, é utilizada uma biblioteca que compreende uma CDR1 aleatorizada, uma biblioteca que compreende uma CDR1 aleatorizada e uma CDR2 aleatorizada, uma biblioteca que compreende uma CDR2 aleatorizada e uma CDR3 aleatorizada e uma biblioteca que compreende uma CDR3 aleatorizada, por exemplo, como materiais de partida.

[038] Os membros da biblioteca de sequências polinucleotídicas são variantes da sequência polinucleotídica que codifica a cadeia variável de um anticorpo de interesse com uma sequência polinucleotídica da CDR parental conhecida, especificamente uma sequência polinucleotídica de CDR1 conhecida, uma sequência polinucleotídica de CDR2 conhecida e uma sequência polinucleotídica de CDR3 conhecida. Em determinados exemplos de realização, a biblioteca está substancialmente livre de polinucleotídeos compreendendo qualquer sequência polinucleotídica de CDR parental, por exemplo, a sequência polinucleotídica da CDR1 parental, a sequência polinucleotídica da CDR2 parental e/ou a sequência polinucleotídica da CDR3 parental.

[039] Assim, outro aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma biblioteca de polinucleotídeos codificantes de cadeias variáveis de um anticorpo obtenível de acordo com o método descrito acima em que a cadeia variável compreende uma CDR1 aleatorizada, uma CDR2 aleatorizada e uma CDR aleatorizada, e em que a biblioteca está substancialmente livre de sequências polinucleotídicas de CDR parentais.

[040] Em alguns exemplos de realização, a biblioteca codifica uma cadeia variável, por exemplo, a cadeia H de um anticorpo ou a cadeia L de um anticorpo em que o anticorpo é um anticorpo de interesse codificado por uma sequência polinucleotídica parental conhecida, incluindo uma sequência polinucleotídica de CDR1 parental conhecida, uma sequência polinucleotídica de CDR2 parental conhecida e uma sequência polinucleotídica de CDR3 parental conhecida e em que a biblioteca está substancialmente livre das sequências de polinucleotídeos das CDRs parentais conhecidas.

[041] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de geração de uma biblioteca de anticorpos em que o anticorpo compreende uma primeira cadeia variável e uma segunda cadeia variável, em que uma biblioteca de polinucleotídeos que codifica a primeira cadeia variável do referido anticorpo, como descrito acima, é expressa em um sistema de transcrição/tradução, por exemplo, um sistema baseado em células, um sistema baseado em fago ou um sistema in vitro, e combinado com a segunda cadeia variável do referido anticorpo, por exemplo, coexpressando um polinucleotídeo que codifica a segunda cadeia variável ou adicionando a segunda cadeia variável como uma proteína. Sistemas adequados para gerar bibliotecas de anticorpos são conhecidos no estado da técnica. Um sistema particularmente adequado é um sistema ribossômico de tradução/transcrição in vitro, por exemplo, conforme descrito em Stafford et al, Protein Eng Des Sel., 2014, 27 (4): 97-109.

[042] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de seleção de um anticorpo compreendendo uma primeira cadeia variável e uma segunda cadeia variável a partir de uma biblioteca de anticorpos conforme descrito acima, em que o anticorpo selecionado tem características de ligação melhoradas em comparação com um anticorpo parental com as cadeias variáveis parentais conhecidas, incluindo CDRs parentais conhecidas. Este método pode compreender as etapas de: a) expressar uma biblioteca de polinucleotídeos codificantes da primeira cadeia variável de um anticorpo de acordo com a presente invenção em um sistema de transcrição/tradução; b) combinar a biblioteca expressa das primeiras cadeias variáveis do referido anticorpo com uma segunda cadeia variável do referido anticorpo; e c) selecionar anticorpos compreendendo uma primeira cadeia variável e uma segunda cadeia variável que têm características de ligação melhoradas.

[043] Os anticorpos selecionados podem exibir uma afinidade de ligação melhorada em comparação com um anticorpo possuindo CDRs parentais conhecidos tanto na cadeia H como na cadeia L.

[044] De acordo com este exemplo de realização, a primeira e a segunda cadeias variáveis podem ser selecionadas a partir de cadeias H variáveis e cadeias L variáveis, cada uma compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3. De acordo com alguns exemplos de realização, a primeira cadeia variável é uma cadeia H variável e a segunda cadeia variável é uma cadeia L variável. Em outros exemplos de realização, a primeira cadeia variável é uma cadeia L e a segunda cadeia variável é uma cadeia H. Frequentemente, a cadeia H variável de um anticorpo é conhecida por contribuir com a maior parte da ligação ao antígeno. Em tais casos, pode ser contemplado preparar uma biblioteca de polinucleotídeos que codificam uma cadeia H variável como um modelo de exibição que é combinado com uma única espécie ou um número limitado de espécies de cadeias L variáveis como molde de expressão.

Em um exemplo de realização, uma biblioteca de polinucleotídeos da cadeia H variável é combinada com a cadeia L variável parental e os anticorpos com propriedades de ligação melhoradas são selecionados.

[045] A presente invenção refere-se à maturação de afinidade de anticorpos e a anticorpos obtidos de acordo com este método. Um anticorpo pode compreender duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), conectadas por ligações de dissulfeto. As cadeias pesadas e as cadeias leves consistem, cada uma, em um domínio constante e um domínio variável. A especificidade de ligação a um antígeno é fornecida pelos domínios variáveis das cadeias leve e pesada que formam o anticorpo. Mais especificamente, as partes de anticorpos que determinam sua especificidade e fazem contato com um ligante específico são denominadas de regiões determinantes de complementaridade (CDRs). As CDR são a parte mais variável da molécula e contribuem com a diversidade destas moléculas. Existem três regiões CDR, a CDR1, CDR2 e CDR3, em cada domínio variável, incorporadas em quatro regiões estruturais/de arcabouço (frameworks (FWs)). Conforme utilizado na presente invenção, CDR-HC (ou CDR (HC)) representa uma região CDR de uma cadeia pesada variável e CDR-LC (ou CDR (LC)) refere-se a uma região CDR de uma cadeia leve variável. Da mesma forma, FW-HC (ou FW (HC)) representa uma região estrutural de uma cadeia pesada variável e FW-LC (ou FW (LC)) refere-se a uma região estrutural de uma cadeia leve variável.

[046] O termo “compreendendo”, conforme usado de acordo com a presente invenção, denota que outras sequências/componentes podem estar incluídos, além das sequências e/ou componentes especificamente recitados.

No entanto, este termo também abrange que a matéria reivindicada consiste exatamente nas sequências e/ou componentes recitados.

[047] Nestes exemplos de realização onde o anticorpo da invenção inclui mais do que a sequência de aminoácidos recitada, os aminoácidos adicionais podem estar presentes na extremidade N-terminal ou extremidade C-terminal ou em ambos. As sequências adicionais podem incluir, por exemplo, sequências introduzidas, por exemplo, para purificação ou detecção, tal como discutido em detalhes abaixo. Além disso, quando sequências individuais “compreendem” a sequência citada, elas também podem incluir aminoácidos adicionais na extremidade N-terminal ou na extremidade C-terminal ou em ambas as extremidades.

[048] De acordo com a presente invenção, um anticorpo pode ser caracterizado pela sua especificidade de ligação e/ou afinidade de ligação em relação ao seu antígeno alvo. O antígeno alvo pode compreender qualquer estrutura, por exemplo, peptídeo, proteína, carboidrato, ácido nucleico, etc., contra a qual um anticorpo pode ser gerado. Qualquer analito que é ligado por um anticorpo pode servir como antígeno alvo e o anticorpo que se liga ao mesmo pode ser submetido a maturação de afinidade tal como divulgado na presente invenção. Por exemplo, o antígeno alvo pode ser qualquer analito de interesse em procedimentos de diagnóstico. Em certos exemplos de realização, o antígeno alvo é a troponina T cardíaca humana (cTnT) de SEQ ID NO: 1.

Também será compreendido que nos casos em que o anticorpo da invenção compreende aminoácidos adicionais, tal como detalhado acima, o referido anticorpo tem necessariamente que se ligar especificamente ao seu antígeno alvo, por exemplo, cTnT.

[049] O termo “liga-se especificamente” (também referido na presente invenção como “interage especificamente”), de acordo com a presente invenção, significa que o anticorpo liga-se especificamente apenas ao seu antígeno alvo, por exemplo, cTnT, mas não ou essencialmente não apresenta reação cruzada com um antígeno alvo diferente, por exemplo, uma proteína, em particular uma proteína diferente de estrutura semelhante. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a cTnT não apresenta reação cruzada com a troponina I (SEQ ID NO: 33).

[050] A “afinidade de ligação” de um anticorpo mede a força de interação entre um epítopo no antígeno alvo e o sítio de ligação do anticorpo de acordo com a seguinte equação: - Kd = kd/ka - em que: - Kd = constante de equilíbrio de dissociação [M]; - kd: constante da velocidade de dissociação [s-1]; e - ka = constante de velocidade de associação [M-1 s-1].

[051] Outros parâmetros relevantes para a afinidade de ligação de um anticorpo são os seguintes: - t/2 = meia-vida da dissociação do complexo = ln2/kd/60 [min]; - Rmax = resposta máxima do analito [RU]; e - MR: Razão molar = razão de resposta máxima (Rmax) do analito.

[052] De acordo com a presente invenção, um anticorpo selecionado pelo método da invenção tem uma afinidade para o seu antígeno alvo que é maior do que a afinidade do anticorpo parental. Esta afinidade melhorada pode ser expressa por um aumento na t/2 de pelo menos 20%, em comparação com o anticorpo parental. A medição de t/2 pode ser realizada, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 6.

[053] Os métodos correspondentes para analisar a especificidade e afinidade de um anticorpo são descritos, por exemplo, em Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, e em Harlow & Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Exemplos não limitantes de estudos adequados são, por exemplo, estudos de ligação, estudos de bloqueio e competição com moléculas estruturalmente e/ou funcionalmente relacionadas. Esses estudos podem ser realizados por métodos como, por exemplo, análise FACS, análise de titulação por citometria de fluxo (titulação FACS), ressonância plasmônica de superfície (SPR, por exemplo, usando um instrumento BIAcore®), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), titulação de fluorescência ou por ensaios de ligação de ligante radiomarcado. Outros métodos incluem, por exemplo, ensaios de Western blots, ELISA (incluindo ELISA competitivo), RIA, ECL e IRMA.

[054] No contexto da presente invenção, o termo “anticorpo” refere-se a moléculas completas de imunoglobulina, bem como a seus fragmentos de ligação ao antígeno, como Fab, Fab’, F(ab’) 2, Fv. Além disso, o termo se refere a moléculas de anticorpo modificadas e/ou alteradas, bem como anticorpos gerados/sintetizados de forma recombinante ou sintética. O termo “anticorpo” também compreende anticorpos bifuncionais, anticorpos trifuncionais, anticorpos totalmente humanos, anticorpos quiméricos e construções de anticorpos, como Fvs de cadeia única (scFv) ou proteínas de fusão-anticorpo.

[055] Um “fragmento Fab”, tal como utilizado na presente invenção é constituído por uma cadeia leve e o CH1 e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula da cadeia pesada. Um fragmento “Fab” contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém o domínio VH e o domínio CH1, e também a região entre os domínios CH1 e CH2, de modo a que uma ligação de dissulfeto intercadeias possa ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab' para formar uma molécula F(ab')2. Um “fragmento F(ab')2” contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, de tal modo que uma ligação de dissulfeto intercadeias é formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F(ab')2 deste modo é constituído por dois fragmentos Fab' que são mantidos juntos por uma ponte de dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.

[056] Um fragmento Fab/c contém ambos os determinantes de Fc e Fab, em que uma região “Fc” contém dois fragmentos de cadeia pesada compreendendo os domínios CH2 e CH3 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos juntos por duas ou mais ligações de dissulfeto e por interações hidrofóbicas dos domínios CH3.

[057] A “região Fv” compreende as regiões variáveis de ambas as cadeias, pesada e leve, mas carece das regiões constantes. Fragmentos de anticorpo “Fv de cadeia única” (também abreviado com “scFv”) são fragmentos de anticorpos que possuem, no contexto da presente invenção, os domínios V H e VL de um anticorpo, no qual estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. De modo geral, o polipeptídeo scFv compreende ainda um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL, permitindo que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única encontram-se descritas, por exemplo, em Plückthun em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg & Moore Eds. Springer-Verlag, NY 113 (1994), 269-315.

[058] O termo “anticorpo totalmente humano”, tal como utilizado na presente invenção refere-se a um anticorpo que compreende apenas sequências de proteína da imunoglobulina humana. No entanto, um anticorpo totalmente humano pode conter cadeias de carboidratos murinas se produzido em um camundongo, em uma célula de camundongo ou em um hibridoma derivado de uma célula de camundongo ou pode conter cadeias de carboidratos de rato se produzido em um rato, em uma célula de rato ou um hibridoma derivado de uma célula de rato. Da mesma forma, um anticorpo totalmente humano pode conter cadeias de carboidratos de hamster se produzido em um hamster, em uma célula de hamster, como, por exemplo, em células CHO, ou em um hibridoma derivado de uma célula de hamster. Por outro lado, um “anticorpo de camundongo“ ou “anticorpo murino” é um anticorpo que compreende apenas sequências de proteínas de imunoglobulina de camundongo (murina), enquanto um “anticorpo de rato” ou um “anticorpo de coelho” é um anticorpo que compreende apenas sequências de imunoglobulina de rato ou coelho, respectivamente. Tal como acontece com os anticorpos totalmente humanos, esses anticorpos murinos, de rato ou coelho podem conter cadeias de carboidratos de outras espécies, se produzidas em tal animal ou célula desse animal. Por exemplo, os anticorpos totalmente humanos podem conter cadeias de carboidratos de hamster se produzidos em hamster, em uma célula de hamster, como, por exemplo, em células CHO, ou em um hibridoma derivado de uma célula de hamster. Os anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos, por exemplo, pela exibição por fagos, que é uma tecnologia amplamente utilizada de triagem que permite a produção e triagem de anticorpos totalmente humanos. Também anticorpos de fagos podem ser utilizados no contexto da presente invenção. Métodos de apresentação/exibição de fago são descritos, por exemplo, nas Patentes US

5.403.484. US 5.969,108 e US 5.885,793. Outra tecnologia que permite o desenvolvimento de anticorpos totalmente humanos envolve uma modificação da tecnologia de hibridoma de camundongo. Camundongos são tornados transgênicos para conter o locus da imunoglobulina humana em troca dos seus próprios genes de camundongo (vide, por exemplo, a patente US 5.877.397).

[059] O termo “anticorpos quiméricos” refere-se a anticorpos que compreendem uma região variável de uma espécie humana, ou não humana, fundida ou quimerizada com uma região de um anticorpo (por exemplo, região constante) de outra espécie, humana ou não humana (por exemplo, camundongo, cavalo, coelho, cachorro, vaca, frango).

[060] Como mencionado acima, o termo “anticorpo” também abrange construções de anticorpos, como proteínas de fusão de anticorpos, em que o anticorpo compreende domínio(s) adicional(ais), por exemplo, para o isolamento e/ou preparação de construções produzidas de forma recombinante, além dos domínios definidos na presente invenção por sequências específicas de aminoácidos.

[061] O anticorpo da presente invenção pode ser produzido de modo que seja um anticorpo recombinante, por exemplo, um anticorpo humano recombinante, ou um anticorpo hetero-híbrido, compreendendo ainda as CDRs conforme divulgadas e definidas na presente invenção.

[062] O termo “anticorpo recombinante” inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana; anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca combinatorial de anticorpos humanos recombinantes, ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção (splicing) de sequências de genes de imunoglobulina humana com outras sequências de DNA. Os anticorpos humanos recombinantes possuem regiões variáveis e constantes (se presentes) derivadas das sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Tais anticorpos podem, no entanto, ser submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando é usado um animal transgênico para sequências de Ig humana, mutagênese somática in vivo) e, portanto, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, apesar de derivadas e relacionadas com as sequências VH e VL da linhagem germinativa humana, pode não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[063] O termo “anticorpo hetero-híbrido” refere-se a um anticorpo possuindo cadeias leves e pesadas originadas de diferentes organismos. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada a uma cadeia leve murina é um anticorpo hetero-híbrido. Exemplos de anticorpos hetero-híbridos incluem anticorpos quiméricos e humanizados.

[064] O anticorpo de acordo com a presente invenção compreende as combinações recitadas de CDRs de cadeia leve e CDRs de cadeia pesada. A sequência da região estrutural circundante do respectivo domínio variável no qual as CDRs são incorporadas pode ser escolhida pelo técnico hábil no assunto sem esforços adicionais. Por exemplo, as sequências da região estrutural descritas abaixo ou a sequência da região estrutural específica empregada nos exemplos anexos podem ser usadas.

[065] De acordo com a presente invenção, as CDRs podem compreender a sequência especificamente citada ou podem diferir em pelo menos uma substituição de aminoácidos. Desse modo, um aminoácido em cada uma das CDRs pode ser substituído por um aminoácido diferente.

Compreende-se também que é abrangida a presença de uma substituição de aminoácidos em algumas, mas nem todas as CDRs, de uma cadeia ou de um anticorpo.

[066] O termo “substituição”, de acordo com a presente invenção, refere-se à substituição de um aminoácido por outro aminoácido. Assim, o número total de aminoácidos permanece o mesmo. A deleção de um aminoácido em uma determinada posição e a introdução de um (ou mais) aminoácido(s) em uma posição diferente não é explicitamente abrangida pelo termo “substituição”. As substituições, de acordo com a presente invenção, podem ser substituições conservadoras de aminoácidos ou substituições não conservadoras de aminoácidos. O termo “substituição conservadora de aminoácidos” é bem conhecido no estado da técnica e refere-se à substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente com propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. Tais semelhanças incluem, por exemplo, uma semelhança na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos envolvidos. A substituição de aminoácidos é uma substituição conservadora de aminoácidos, caso um aminoácido de um dos seguintes grupos seja substituído por outro aminoácido do mesmo grupo: aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano e metionina; aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, asparagina e glutamina; aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

[067] A presente invenção refere-se à geração de anticorpos que se ligam especificamente a qualquer antígeno alvo que exiba características de ligação melhoradas em comparação com os anticorpos originais (parentais).

Isto é exemplificado pela geração de anticorpos que se ligam especificamente à troponina T cardíaca que exibem características melhoradas em comparação com o anticorpo parental 12.1A11.11-7.

[068] Em um exemplo de realização, o anticorpo que se liga especificamente à troponina T cardíaca humana (SEQ ID NO: 1) é um anticorpo caracterizado por (i) a CDR no domínio variável de cadeia leve compreender uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, ou uma variante desta que difere em no máximo uma substituição de aminoácido por CDR; e (ii) a CDR no domínio variável de cadeia pesada compreender uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; ou de SEQ ID NO: 7, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou de SEQ ID NO: 9, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; SEQ ID Nº: 11; SEQ ID Nº: 12; ou de SEQ ID NO: 13, em que pelo menos duas das CDRs são selecionadas a partir de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6; ou SEQ ID NO: 7, uma CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma CDR3 de SEQ ID NO: 12, ou em que a CDR1 é de SEQ ID NO: 7, a CDR2 é de SEQ ID NO: 8 e a CDR3 é de SEQ ID nO: 11 ou de SEQ ID nO: 13, com a condição de que no caso de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 estar presente, então, a) a CDR3 não é de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13; ou b) a CDR2 e a CDR3 dentro deste anticorpo não são ao mesmo tempo de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 12, respectivamente.

[069] Em um exemplo de realização, a presente invenção divulga um anticorpo que se liga especificamente à troponina T cardíaca humana (SEQ ID NO: 1), sendo o anticorpo caracterizado pelas CDRs compreenderem as seguintes sequências de aminoácidos (i) no domínio variável de cadeia leve, uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e (ii) no domínio variável de cadeia pesada uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; ou de SEQ ID NO: 7, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou de SEQ ID NO: 9, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; de SEQ ID NO: 11; de SEQ ID NO: 12; ou de SEQ ID NO: 13, em que pelo menos duas das CDRs são selecionadas a partir de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, uma CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma CDR3 de SEQ ID NO: 12, ou em que a CDR1 é de SEQ ID NO: 7, a CDR2 é de SEQ ID NO: 8 e a CDR3 é de SEQ ID NO: 11 ou de SEQ ID NO: 13, com a condição de que no caso de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 estar presente, então ou a) a CDR3 não é SEQ ID NO: 11 nem SEQ ID NO: 13 ou b) a CDR2 e a CDR3 dentro deste anticorpo não são mesmo tempo de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 12, respectivamente.

[070] Além disso, a presente invenção também divulga um anticorpo que se liga especificamente à troponina T cardíaca humana (SEQ ID NO: 1), em que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve que consiste em regiões estruturais (FW) e CDRs, conforme representado na fórmula I: FW(LC)1 – CDR(LC)1 – FW(LC)2 – CDR(LC)2 – FW(LC)3 – CDR(LC)3 – FW(LC)4 (fórmula I); - e um domínio variável de cadeia pesada consistindo nas regiões estruturais (FWs) e CDRs, conforme representado na fórmula II: FW(HC)1 – CDR(HC)1 – FW(HC)2 – CDR(HC)2 – FW(HC)3 – CDR(HC)3 – FW(HC)4 (fórmula II); - em que as FWs compreendem as seguintes sequências de aminoácidos ou uma variante das mesmas que é pelo menos 85% idêntica a elas:

- na cadeia leve:

- FW(LC)1 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14;

- FW(LC)2 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15;

- FW(LC)3 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16;

- FW(LC)4 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17;

- e na cadeia pesada:

- FW(HC)1 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18;

- FW(HC)2 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19;

- FW(HC)3 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20;

- FW(HC)4 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21;

- e em que as CDRs compreendem as seguintes sequências de aminoácidos (i) no domínio variável de cadeia leve, uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e (ii) no domínio variável de cadeia pesada uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; ou de SEQ ID NO: 7, uma

CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou de

SEQ ID NO: 9, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 10; de SEQ ID NO: 11; de SEQ ID NO: 12; ou de SEQ ID NO: 13,

em que pelo menos duas das CDRs são selecionadas a partir de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, uma CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma CDR3 de SEQ ID NO: 12, ou em que a CDR1 é de SEQ ID NO: 7, a CDR2 é de SEQ

ID NO: 8 e a CDR3 é de SEQ ID NO: 11 ou de SEQ ID NO: 13, com a condição de que no caso de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 estar presente, então ou a) a CDR3 não é de SEQ ID NO: 11 nem de SEQ ID NO: 13 ou b) a CDR2 e a

CDR3 dentro deste anticorpo não são ao mesmo tempo de SEQ ID NO: 8 e

SEQ ID NO: 12, respectivamente, ou uma variante desta CDR que difere em no máximo uma substituição de aminoácido por CDR.

[071] Além disso, a presente invenção divulga um anticorpo anti- cTnT compreendendo um domínio variável de cadeia leve que consiste em regiões estruturais (FW) e CDRs conforme representado na fórmula I: FW(LC)1 – CDR(LC)1 – FW(LC)2 – CDR(LC)2 – FW(LC)3 – CDR(LC)3 – FW(LC)4 (fórmula I); - e um domínio variável de cadeia pesada consistindo nas regiões estruturais (FWs) e CDRs, conforme representado na fórmula II: FW(HC)1 – CDR(HC)1 – FW(HC)2 – CDR(HC)2 – FW(HC)3 – CDR(HC)3 – FW(HC)4 (fórmula II); - em que as FWs compreendem as seguintes sequências de aminoácidos ou uma variante das mesmas que é pelo menos 85% idêntica a elas: - na cadeia leve: - FW(LC)1 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; - FW(LC)2 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15; - FW(LC)3 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16; - FW(LC)4 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17; - e na cadeia pesada: - FW(HC)1 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; - FW(HC)2 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19; - FW(HC)3 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20; - FW(HC)4 a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21; - e em que as CDRs compreendem as seguintes sequências de aminoácidos (i) no domínio variável de cadeia leve, uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e (ii) no domínio variável de cadeia pesada uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; ou de SEQ ID NO: 7, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou de SEQ ID NO: 9, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; de SEQ ID NO: 11; de SEQ ID NO: 12; ou de SEQ ID NO: 13, em que pelo menos duas das CDRs são selecionadas a partir de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, uma CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma CDR3 de SEQ ID NO: 12, ou em que a CDR1 é de SEQ ID NO: 7, a CDR2 é de SEQ ID NO: 8 e a CDR3 é de SEQ ID NO: 11 ou de SEQ ID NO: 13, com a condição de que no caso de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 estar presente, então ou a) a CDR3 não é de SEQ ID NO: 11 nem de SEQ ID NO: 13 ou b) a CDR2 e a CDR3 dentro deste anticorpo não são ao mesmo tempo de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 12, respectivamente.

[072] A estrutura primária mostrada na fórmula I representa a ordem dos componentes do domínio variável de cadeia leve do anticorpo da presente invenção, representada da extremidade N-terminal para a C-terminal.

A estrutura primária mostrada na fórmula II representa a ordem dos componentes do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo da presente invenção, representada da extremidade N-terminal para a C-terminal. Em cada caso, a região estrutural (FW) 1 representa a parte mais N-terminal do respectivo domínio de cadeia variável, enquanto a FW 4 representa a parte mais C-terminal do respectivo domínio de cadeia variável.

[073] Conforme definido acima, as respectivas sequências FW e CDR “compreendem” as sequências de aminoácidos citadas. Em um exemplo de realização, as respectivas sequências FW e CDR consistem nas referidas sequências de aminoácidos, ou seja, o(s) domínio(s) variável(is) de cadeia leve e o(s) domínio(s) variável(is) de cadeia pesada do anticorpo anti- troponina T da invenção consistem nas FWs e CDRs representadas na fórmula I e fórmula II, respectivamente, em que as respectivas sequências FW e CDR consistem nas sequências de aminoácidos citadas.

[074] No que diz respeito às CDRs e suas variantes, as definições fornecidas acima e exemplos de realização especificamente exemplificados aplicam-se mutatis mutandis.

[075] No que diz respeito às regiões estruturais, também é contemplado certo grau de variabilidade, ou seja, os FWs individuais podem compreender ou consistir na sequência de aminoácidos citada especificamente ou podem compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica a ela. De preferência, a identidade é de pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 92,5%, mais preferencialmente pelo menos 95%, ainda mais preferencialmente a identidade é pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% e mais preferencialmente a identidade é pelo menos 99,5 %. Será compreendido que para diferentes FWs, um grau diferente de identidade de sequência pode ser permitido, dependendo da sequência real e, por exemplo, do comprimento da respectiva sequência FW, bem como sua localização dentro do respectivo domínio de cadeia variável.

[076] De acordo com a presente invenção, o termo “% de identidade de sequência” descreve o número de correspondências (“ocorrências” ou “hits”) de aminoácidos idênticos de duas ou mais sequências de aminoácidos alinhadas em comparação com o número de resíduos de aminoácidos que compõem o comprimento total das sequências de aminoácidos (ou a parte geral comparada). A porcentagem de identidade é determinada dividindo o número de resíduos idênticos pelo número total de resíduos e multiplicando o produto por 100. Em outros termos, usando um alinhamento, a porcentagem de resíduos de aminoácidos que são iguais (por exemplo, 85% de identidade) pode ser determinada para duas ou mais sequências ou subsequências quando essas (sub)sequências são comparadas e alinhadas para se obter a máxima correspondência em uma janela de comparação ou em uma região designada, medida usando um algoritmo de comparação de sequência conhecido no estado da técnica, ou quando alinhados manualmente e inspecionados visualmente.

[077] Os técnicos especialistas na matéria sabem como determinar a porcentagem de identidade de sequência entre sequências usando, por exemplo, algoritmos como aqueles baseados no algoritmo NCBI BLAST (Altschul, S.F. et al. [1997] Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), programa de computador CLUSTALW (Tompson, J.D. et al. [1994] Nucleic Acids Res.

22:4673-4680) ou FASTA (Pearson, W.R. & Lipman, D.J. [1988] Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448). Em um exemplo de realização, o algoritmo NCBI BLAST é empregado de acordo com a presente invenção. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um wordlength (W) de 3 e uma expectativa (E) de 10. A matriz de escore BLOSUM62 (Henikoff, S. & Henikoff, J.G. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

89:10915-10919) utiliza alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, e uma comparação de ambas as fitas. Consequentemente, nos exemplos de realização em que uma % de identidade de sequência é indicada, todas as sequências de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 85%, conforme determinado com o programa NCBI BLAST, caem no escopo dos referidos exemplos de realização.

[078] O grau de variação descrito acima nas regiões estruturais em comparação com a respectiva sequência de aminoácidos especificamente citada pode ser devido à substituição, inserção, adição ou deleção de (um) aminoácido(s).

[079] O termo “substituição” foi definido em outro lugar acima na presente invenção. Nos casos em que mais de um aminoácido deve ser substituído, cada aminoácido é substituído de maneira independente por outro aminoácido, ou seja, para cada aminoácido removido um aminoácido diferente é introduzido na mesma posição.

[080] O termo “inserção”, de acordo com a presente invenção, refere-se à adição de um ou mais aminoácidos à sequência de aminoácidos especificamente citada, em que a adição não ocorre na extremidade N ou C- terminal do polipeptídeo.

[081] O termo “adição”, de acordo com a presente invenção, refere-se à adição de um ou mais aminoácidos à sequência de aminoácidos especificamente citada, em que ocorre especificamente na extremidade N ou C-terminal do polipeptídeo, ou em ambas as extremidades.

[082] O termo “deleção”, conforme usado de acordo com a presente invenção, refere-se à perda de um ou mais aminoácidos a partir da sequência de aminoácidos especificamente citada.

[083] Em um exemplo de realização, a variação nas sequências de aminoácidos das regiões estruturais é devida à substituição de (um) aminoácido(s). As substituições, tal como definidas acima, podem ser substituições conservadoras de aminoácidos ou substituições não conservadoras de aminoácidos. As definições e exemplos de realização especificamente exemplificados fornecidos acima com relação ao termo “substituição” aplicam-se mutatis mutandis. Em um exemplo de realização, as substituições nas regiões estruturais são substituições conservadoras de aminoácidos.

[084] Em outro exemplo de realização, as CDRs consistem nas sequências específicas citadas acima (ou seja, sem quaisquer variações) e as regiões estruturais (FWs) citadas acima compreendem no máximo a seguinte quantidade de variações de aminoácidos dentro das sequências específicas citadas acima:

- FW(LC)1 no máximo 3 variações de aminoácidos; - FW(LC)2 no máximo 2 variações de aminoácidos; - FW(LC)3 no máximo 4 variações de aminoácidos; - FW(LC)4 no máximo 1 variação de aminoácido; e - FW(HC)1 no máximo 3 variações de aminoácidos; - FW(HC)2 no máximo 2 variações de aminoácidos; - FW(HC)3 no máximo 4 variações de aminoácido; e - FW(HC)4 no máximo 1 variação de aminoácido.

[085] Em outro exemplo de realização, as variações de aminoácidos nas FWs são substituições.

[086] Em outro exemplo de realização, a quantidade total de variações presentes nas regiões estruturais (framework) do domínio variável de cadeia leve ou pesada é no máximo 9 substituições de aminoácidos, tal como, por exemplo, no máximo 8 substituições de aminoácidos, por exemplo, no máximo 6 substituições de aminoácidos, tal como no máximo 4 substituições de aminoácidos, por exemplo, no máximo 3 substituições de aminoácidos, como no máximo 2 substituições de aminoácidos. Em outro exemplo de realização, há apenas 1 substituição de aminoácido presente nas regiões estruturais de 1 a 4 do domínio variável de cadeia leve em conjunto ou nas regiões estruturais de 1 a 4 do domínio variável de cadeia pesada em conjunto.

[087] Como as partes de fórmula I e fórmula II definidas na presente invenção como FWs são sequências de aminoácidos que fazem parte do quadro ou estrutura das regiões de cadeia variável, a substituição dentro das referidas sequências, em particular na forma de substituições de aminoácidos conservadoras, em muitos casos não afetará a capacidade de ligação do anticorpo anti-cTnT. Isso ocorre porque esses aminoácidos normalmente não estão diretamente envolvidos na ligação à cTnT, e sua substituição por aminoácidos alternativos adequados pode ser projetada de modo que não ocorra nenhuma alteração na estrutura tridimensional e no enovelamento da proteína. Por outro lado, tais substituições podem fornecer numerosos efeitos benéficos, tais como expressão melhorada em certos hospedeiros ou para estabilização da proteína pela introdução de, por exemplo, pontes de dissulfeto adicionais.

[088] Em um exemplo de realização, um anticorpo monoclonal para cTnT, conforme divulgado acima, liga-se à cTnT com uma t/2-diss à 37ºC de 10 minutos ou mais.

[089] A presente invenção divulga ainda um anticorpo que compreende: (i) um domínio variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (ii) um domínio variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada selecionado a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 3 0; SEQ ID NO: 31; e SEQ ID NO: 32; - em que o anticorpo liga-se especificamente à troponina T cardíaca humana e tem uma t/2-diss à 37ºC de 10 minutos ou mais.

[090] Também é divulgado na presente invenção um anticorpo que compreende: (i) um domínio variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (ii) um domínio variável de cadeia pesada de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ

ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 3 0; SEQ ID NO: 31; e SEQ ID NO: 32; - em que as CDRs compreendem as seguintes sequências de aminoácidos (i) no domínio variável de cadeia leve, uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, e (ii) no domínio variável de cadeia pesada uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; ou de SEQ ID NO: 7, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; ou de SEQ ID NO: 9, e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; de SEQ ID NO: 11; de SEQ ID NO: 12; ou de SEQ ID NO: 13, em que pelo menos duas das CDRs são selecionadas a partir de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, uma CDR2 de SEQ ID NO: 9 e uma CDR3 de SEQ ID NO: 12, ou em que a CDR1 é de SEQ ID NO: 7, a CDR2 é de SEQ ID NO: 8 e a CDR3 é de SEQ ID NO: 11 ou de SEQ ID NO: 13, com a condição de que no caso de uma CDR1 de SEQ ID NO: 6 estar presente, então ou a) a CDR3 não é de SEQ ID NO: 11 nem de SEQ ID NO: 13 ou b) a CDR2 e a CDR3 dentro deste anticorpo não são ao mesmo tempo de SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 12, respectivamente; - e em que o anticorpo liga-se especificamente à troponina T cardíaca humana e tem uma t/2-diss à 37ºC de 10 minutos ou mais.

[091] Em um exemplo de realização, a presente divulgação refere-se a um anticorpo compreendendo: (i) um domínio variável de cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; e (ii) um domínio variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 3 0; SEQ ID NO: 31; e SEQ ID NO: 32.

[092] Todas as definições e exemplos de realização especificamente exemplificados fornecidos acima com relação ao anticorpo anti-cTnT da invenção, em particular os graus e tipos de variações citados, aplicam-se mutatis mutandis.

[093] De acordo com a presente invenção, são fornecidos novos anticorpos, por exemplo, novos anticorpos anti-cTnT, que têm propriedades de ligação melhoradas aos seus respectivos antígenos alvo, por exemplo, cTnT (melhores valores de KD) e, assim, permitem a detecção do antígeno alvo, por exemplo, cTnT, com sensibilidade superior em comparação com os ensaios anteriores.

[094] O termo “KD” refere-se à constante de equilíbrio de dissociação (o recíproco da constante de equilíbrio de ligação) e é usado no presente documento de acordo com as definições fornecidas no estado da técnica. Os meios e métodos para determinar o valor de K D são fornecidos abaixo de maneira sucinta e descritos em detalhes nos Exemplos.

[095] As propriedades de ligação de um anticorpo, por exemplo, de um anticorpo anti-cTnT, são mais bem determinadas por medições de interação molecular com base em biossensores em tempo real, como a espectroscopia por ressonância plasmônica de superfície, para a qual a tecnologia Biacore tornou-se sinônimo. Os detalhes experimentais constam no Exemplo 5 e dados cinéticos são apresentados na Tabela 3. Por exemplo, o anticorpo marcado como combinação “12” na tabela 3 tem propriedades de ligação à TnT melhoradas, ou seja, uma constante de associação (ka) de 1,18E+06 1/Ms; uma constante de dissociação (kd) de 3,7 E-04 (traduzindo-se em meio-tempo para a dissociação de cerca de 31 min e, portanto, uma constante de afinidade geral (Kd) de 3,2E-10 M.

[096] Com base nestes resultados, os anticorpos mutados descritos e reivindicados na presente invenção, surpreendentemente, por um lado não influenciam negativamente a formação do complexo de anticorpo com TnT, a Ka de todos eles está no mesmo intervalo que para o anticorpo parental.

Por outro lado, uma melhora significativa no que diz respeito à estabilidade do complexo formado entre cTnT, traduzindo-se em melhores valores de Kd, pôde ser alcançada.

[097] Em um exemplo de realização, um anticorpo monoclonal de acordo com a presente invenção, conforme divulgado acima, liga-se à cTnT com uma t/2-diss à 37ºC de 10 minutos ou mais.

[098] Em geral, um valor KD mais baixo corresponde a uma afinidade superior ou melhorada, como é bem conhecido no estado da técnica.

Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-TnT mutante tem uma afinidade de ligação, que é igual ou menor do que a KD do anticorpo parental possuindo uma KD de 5,8 E-10 M.

[099] As sequências citadas acima para as regiões variáveis de cadeias leve e pesada são as sequências de aminoácidos que foram utilizadas nos exemplos anexos.

[100] A presente invenção refere-se ainda a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos da invenção definidos acima. Esta molécula de ácido nucleico é referida como a primeira molécula de ácido nucleico da invenção. Além disso, a presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos da invenção definidos acima. Esta molécula de ácido nucleico é referida como a segunda molécula de ácido nucleico da invenção.

[101] De acordo com a presente invenção, o termo “molécula de ácido nucleico”, também referida como sequência de ácido nucleico ou polinucleotídeo, inclui DNA, tal como cDNA ou DNA genômico.

[102] As moléculas de ácido nucleico da invenção podem, por exemplo, ser sintetizadas por métodos padrão de síntese química e/ou métodos recombinantes, ou podem ser produzidas semissinteticamente, por exemplo, combinando síntese química e métodos recombinantes. A ligação das sequências codificantes de elementos reguladores da transcrição e/ou a outras sequências codificantes de aminoácidos pode ser realizada usando métodos estabelecidos, tais como digestões de restrição, ligações e clonagem molecular.

[103] De acordo com a presente invenção, a primeira molécula de ácido nucleico da invenção codifica uma região variável de cadeia leve: (i) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (ii) consistindo em uma sequência de aminoácidos de fórmula I tal como definida acima; ou (iii) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia leve que consiste na sequência aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

[104] De forma similar, a segunda molécula de ácido nucleico da invenção codifica uma região variável de cadeia pesada: (i) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(ii) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(iii) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(iv) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(v) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(vi) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(vii) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(viii) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(ix) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(x) compreendendo uma CDR1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido, uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou uma variante da mesma que difere em no máximo uma substituição de aminoácido e uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 ou uma variante da mesma que difere no máximo em uma substituição de aminoácido;

(xi) consistindo em uma sequência de aminoácidos de fórmula

II, tal como definida acima;

(xii) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23;

(xiii) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;

(xiv) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;

(xv) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26;

(xvi) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; ou

(xvii) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; (xviii) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (xix) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (xx) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; ou (xxi) consistindo em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% idêntica ao domínio variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[105] A presente invenção refere-se ainda a um vetor compreendendo a primeira molécula de ácido nucleico da invenção, ou seja, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve de qualquer um dos anticorpos da invenção definidos acima. A presente invenção refere-se ainda a um vetor compreendendo a segunda molécula de ácido nucleico da invenção, ou seja, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada de qualquer um dos anticorpos da invenção definidos acima. Tais vetores também são referidos na presente invenção como “vetores individuais da invenção”.

[106] Muitos vetores adequados são conhecidos pelos especialistas na matéria de biologia molecular, cuja escolha depende da função desejada. Exemplos não limitantes de vetores incluem plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vetores convencionalmente utilizados, por exemplo, manipulados/modificados por engenharia genética. Os métodos que são bem conhecidos dos técnicos hábeis no assunto podem ser usados para construir diversos plasmídeos e vetores; vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook, et al. (cit. loc.) e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates & Wiley Interscience, NY (1989), (1994).

[107] Em um exemplo de realização, o vetor é um vetor de expressão. Um vetor de expressão de acordo com a invenção é capaz de direcionar a replicação e a expressão da molécula de ácido nucleico da invenção em um hospedeiro e, consequentemente, fornece a expressão dos domínios de cadeia variável de anticorpos anti-troponina T da presente invenção codificada desse modo no hospedeiro selecionado. Em um exemplo de realização adicional, o(s) vetor(es) compreende(m) sequências adicionais para garantir que não sejam expressos apenas os referidos domínios de cadeia variável da invenção, mas também os anticorpos IgG completos que compreendem os referidos domínios de cadeia variável da invenção.

[108] Os vetores de expressão podem, por exemplo, ser vetores de clonagem, vetores binários ou vetores de integração. A expressão compreende a transcrição da molécula de ácido nucleico, por exemplo, na forma de um mRNA traduzível. Em um exemplo de realização, o vetor é um plasmídeo de expressão eucariótica para a expressão recombinante transitória de cadeia pesada e/ou cadeia leve de anticorpos monoclonais de coelho. Tais vetores foram desenvolvidos especificamente para expressão de anticorpos, mas também produção de anticorpos por, por exemplo, transfecção transitória de células eucarióticas, por exemplo, HEK 293 ou seus derivados ou células CHO.

[109] Exemplos não limitantes de vetores incluem; pQE-12, os vetores da série pUC, pBluescript (Stratagene), os vetores de expressão da série pET (Novagen) ou pCRTOPO (Invitrogen), lambda gt11, pJOE, os vetores da série pBBR1-MCS, pJB861, pBSMuL, pBC2, pUCPKS, pTACT1, pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT, o sistema vetor E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a), pREP (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pIZD35, Okayama-Berg o vetor de expressão de cDNA pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pcDNA3.1, pSPORT1 (GIBCO BRL), pGEMHE (Promega), pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen) e pCINeo (Promega). Exemplos não limitantes de vetores plasmidiais adequados para Pichia pastoris compreendem, por exemplo, os plasmídeos pAO815, pPIC9K e pPIC3.5K (todos Invitrogen). Outro vetor adequado para expressar proteínas em embriões Xenopus, embriões de peixe- zebra, bem como uma grande variedade de células de mamíferos e aves, é o vetor de expressão multiuso pCS2+.

[110] Em geral, os vetores podem conter uma ou mais origens de replicação (ori) e sistemas de herança para clonagem ou expressão, um ou mais marcadores para seleção no hospedeiro, por exemplo, resistência a antibióticos e um ou mais cassetes de expressão. Além disso, as sequências codificantes compreendidas no vetor podem ser ligadas a elementos reguladores da transcrição e/ou a outras sequências de codificação de aminoácidos usando métodos estabelecidos. Tais sequências reguladoras são bem conhecidas pelos especialistas na matéria e incluem, sem ser limitantes do escopo da invenção, sequências reguladoras que garantem o início da transcrição, sítios de entrada ribossômica interna (IRES) (Owens, G.C. et al.

[2001] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1471-1476) e opcionalmente elementos reguladores que asseguram o término da transcrição e estabilização da transcrição. Exemplos não limitantes para esses elementos reguladores que garantem a iniciação da transcrição compreendem promotores, um códon de iniciação da tradução, intensificadores (enhancers), isoladores e/ou elementos reguladores que garantem o término da transcrição, que devem ser incluídos a jusante das moléculas de ácido nucleico da invenção. Outros exemplos incluem sequências Kozak e sequências intervenientes, flanqueadas por doadores e receptores para splicing de RNA, sequências nucleotídicas que codificam sinais de secreção ou, dependendo do sistema de expressão utilizado, sequências de sinais capazes de direcionar a proteína expressa para um compartimento celular ou para o meio de cultura. Os vetores também podem conter um polinucleotídeo que pode ser expresso adicional que codifica um ou mais chaperonas para facilitar o correto enovelamento de proteínas.

[111] Exemplos adicionais de origens de replicação adequadas incluem, por exemplo, as origens de replicação de ColE1 de comprimento total, um ColEI truncado, SV40 e M13 viral, enquanto exemplos adicionais de promotores adequados incluem, sem se limitar, o promotor de citomegalovírus (CMV), promotor SV40, promotor RSV-(vírus do sarcoma de Rous), promotor lacZ, promotor/operador de tetraciclina (tetp/o), promotor de β-actina de galinha, promotor CAG (uma combinação do promotor de β-actina de galinha e enhancer precoce imediato do citomegalovírus), promotor gai10, promotor 1α do fator de alongamento humano, promotor AOX1, promotor GAL1 promotor CaM-quinase, promotor lac, trp ou tac, promotor T7 ou T5, promotor lacUV5, promotor poliédrico do Nucleopoliedrovírus de Autographa californica (AcMNPV) ou um íntron de globina em células de mamíferos e outras células animais. Um exemplo de um facilitador/acentuador (enhancer) é, por exemplo, o enhancer-SV40. Exemplos adicionais não limitantes para elementos reguladores que garantem a terminação da transcrição incluem o sítio SV40- poli-A, o sítio tk-poly-A, o terminador lpp independente de rho ou os sinais de poliadenilação poliédrica AcMNPV. Outros exemplos não limitantes de marcadores selecionáveis incluem dhfr, que confere resistência ao metotrexato

(Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149), npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e higro, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Genes selecionáveis adicionais têm sido descritos, nomeadamente, o trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem hislinol no lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988). 8047); manose-6-fosfato isomerase, que permite que as células utilizem a manose (WO 94/20627) e ODC (ornitina-descarboxilase) que confere resistência ao inibidor da ornitina-descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO ( McConlogue, 1987. Em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) ou deaminase de Aspergillus terreus que confere resistência à Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

[112] Em outro exemplo de realização, o vetor é um plasmídeo de expressão eucariótico contendo um cassete de expressão que consiste em um promotor de 5' CMV incluindo um íntron A e uma sequência de poliadenilação 3’ BGH. Além do cassete de expressão, o plasmídeo pode conter uma origem de replicação derivada de pUC18 e um gene de beta- lactamase que confere resistência à ampicilina para amplificação do plasmídeo em E. coli. Para secreção dos anticorpos, uma sequência líder eucariótica pode ser clonada em 5' do gene do anticorpo.

[113] Hospedeiros de expressão bacteriana adequados compreendem, por exemplo, cepas derivadas de JM83, W3110, KS272, TG1, K12, BL21 (como BL21 (DE3), BL21 (DE3) PlysS, BL21 (DE3) RIL, BL21 (DE3) PRARE) ou Rosettaâ. Para modificação por vetor, amplificação por PCR e técnicas de ligação, consulte Sambrook & Russel [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

[114] As moléculas de ácido nucleico e/ou vetores da invenção podem ser projetados para introdução nas células por, por exemplo, métodos baseados em produtos químicos (polietilenoimina, fosfato de cálcio, lipossomas, DEAE-dextrano, nucleofecção), métodos não químicos (eletroporação, sonoporação, transfecção ótica, gene eletrotransferência, entrega hidrodinâmica ou transformação natural ao entrar em contato com células com a molécula de ácido nucleico da invenção), métodos baseados em partículas (arma de genes, magnetofecção, impalefecção) métodos baseados em vetores de fago e métodos virais. Por exemplo, os vetores de expressão derivados de vírus, como retrovírus, vírus vaccinia, vírus adenoassociado, herpesvírus, vírus da floresta de Semliki, ou vírus do papiloma bovino, podem ser utilizados para a entrega das moléculas de ácidos nucleicos a uma população de células alvo. Além disso, os sistemas baculovirais também podem ser utilizados como vetor no sistema de expressão eucariótica para as moléculas de ácido nucleico da invenção. Em um exemplo de realização, as moléculas de ácido nucleico e/ou vetores da invenção são projetadas para transformação química de E. coli competente por fosfato de cálcio e/ou para transfecção transitória de células HEK293 e CHO por transfecção por polietilenoimina ou lipofectamina.

[115] A presente invenção diz respeito ainda a um vetor compreendendo: (i) uma molécula de ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve de acordo com a opção (i) definida acima e um domínio variável de cadeia pesada de acordo com a opção (i) definida acima; (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve de acordo com a opção (ii) definida acima e um domínio variável de cadeia pesada de acordo com a opção (ii) definida acima; ou (iii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um domínio variável de cadeia leve de acordo com a opção (iii) definida acima e um domínio variável de cadeia pesada de acordo com a opção (iii) definida acima.

[116] Em um exemplo de realização, o vetor é um vetor de expressão.

[117] Todas as definições e exemplos de realização especificamente exemplificados fornecidos acima com relação ao vetor da invenção, em particular os tipos de vetor ou as sequências reguladoras aplicam-se mutatis mutandis Este segundo tipo de vetor refere-se a um vetor compreendendo pelo menos duas moléculas de ácido nucleico, a saber, uma que codifica um domínio variável da cadeia leve e uma que codifica um domínio variável de cadeia pesada. Como é evidente a partir das combinações acima, o domínio variável de cadeia leve e o domínio variável de cadeia pesada são combinados no vetor de modo que a expressão de um anticorpo funcional anti-cTnT da invenção seja permitida. Este segundo tipo de vetor também é referido aqui como “vetor combinado da invenção”.

[118] A presente invenção refere-se ainda a uma célula hospedeira ou hospedeiro não humano compreendendo: (i) o vetor combinado da invenção; ou (ii) o vetor individual da invenção compreendendo a primeira molécula de ácido nucleico da invenção, ou seja, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve de acordo com a invenção e o vetor individual da invenção compreendendo a segunda molécula de ácido nucleico da invenção, ou seja, uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada da invenção, em que esses dois vetores compreendem as moléculas de ácido nucleico que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada combinadas/pareadas, conforme definidas nas opções (i) a (iii) acima.

[119] A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. O termo “procariota” pretende incluir todas as bactérias que podem ser transformadas, transduzidas ou transfectadas com DNA ou moléculas de DNA ou RNA para a expressão de uma proteína da invenção. Os hospedeiros procariotas podem incluir bactérias gram-negativas bem como bactérias gram-positivas, tais como, por exemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, Corynebacterium (glutamicum), Pseudomonas (fluorescens), Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella e Bacillus subtilis.

[120] O termo “eucariótica” pretende incluir células de leveduras, plantas superiores, insetos e células de mamíferos. As células hospedeiras típicas de mamíferos incluem células Hela, HEK293, H9, Per.C6 e Jurkat, células NIH3T3 de rato, NS/0, SP2/0 e C127, células COS, por exemplo, células COS 1 ou COS 7, CV1, células QC1-3 de codorniz, células L de camundongo, células de sarcoma de camundongo, células de melanoma de Bowes e células de ovário de hamster chinês (CHO). As células hospedeiras de mamífero exemplares de acordo com a presente invenção são células CHO.

Outras células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem, mas não se limitam a, células de galinha, tais como, por exemplo, células DT40, ou células de levedura como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe e Kluyveromyces lactis. As células de insetos adequadas para expressão são, por exemplo, células S2 de Drosophila, Kc de Drosophila, Sf9 e Sf21 de Spodoptera ou Hi5 de Trichoplusia. As linhagens de células de peixe-zebra adequadas incluem, mas não se limitam a, ZFL, SJD ou ZF4.

[121] O(s) vetor(es) descrito(s) pode(m) se integrar ao genoma do hospedeiro ou pode(m) ser mantido(s) de maneira extracromossômica. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado ao hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para a expressão em alto nível das moléculas de ácidos nucleicos, e conforme desejado, a coleta e purificação do anticorpo da invenção podem ocorrer. Os meios de cultura e condições apropriados para as células hospedeiras descritas acima são conhecidos no estado da técnica.

[122] Em um exemplo de realização, o hospedeiro citado é uma célula de mamífero, tal como uma célula humana ou linhagem de células humanas. Em outro exemplo de realização, a célula hospedeira transformada com o(s) vetor(es) da invenção é a HEK293 ou CHO. Em outro exemplo de realização, a célula hospedeira transformada com o(s) vetor(es) da invenção é a CHO. Estas células hospedeiras, bem como meios adequados e condições de cultura das células, foram descritos no estado da técnica, vide, por exemplo, Baldi L. et al., Biotechnol Prog. 2005 Jan-Feb;21(1):148-53, Girard P. et al., Cytotechnology 2002 Jan;38(1-3):15-21 e Stettler M. et al., Biotechnol. Prog.

2007 Nov-Dec;23(6):1340-6.

[123] Com relação ao termo “vetor compreendendo” de acordo com a presente invenção, entende-se que outras sequências de ácidos nucleicos necessárias e/ou suficientes estão presentes nos vetores para que a célula hospedeira produza um anticorpo anti-cTnT da invenção. Tais sequências de ácido nucleico adicionais são, por exemplo, sequências de ácidos nucleicos que codificam o restante da cadeia leve, bem como sequências de ácidos nucleicos que codificam o restante da cadeia pesada.

[124] A célula hospedeira ou hospedeiro não humano, de acordo com a presente invenção, compreende um vetor que codifica as regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada, conforme definido acima, ou compreende dois vetores separados, em que um vetor carrega uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve de acordo com a presente invenção e o segundo vetor carrega uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada correspondente de acordo com a presente invenção. Assim, quando o primeiro vetor transporta uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve de acordo com a opção (i) acima na presente invenção, então o segundo vetor transporta uma molécula de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia pesada também de acordo com a opção (i) acima. O mesmo se aplica mutatis mutandis às opções (ii) e (iii).

[125] Consequentemente, em cada caso, a expressão dessas moléculas de ácido nucleico está ligada entre si que devem estar presentes dentro de uma molécula de anticorpo para garantir a produção de um anticorpo da invenção que consiste nas capacidades de ligação descritas acima.

[126] As células hospedeiras de acordo com este exemplo de realização podem, por exemplo, ser utilizadas para produzir grandes quantidades de anticorpos da presente invenção. As referidas células hospedeiras são produzidas através da introdução dos vetores descritos acima no hospedeiro. A presença do(s) referido(s) vetor(es) no hospedeiro medeia então a expressão das moléculas de ácido nucleico que codificam os domínios variáveis de cadeia leve descritos acima e os domínios variáveis de cadeia pesada dos anticorpos da invenção. Como descrito acima, o(s) vetor(es) da invenção podem compreender outras sequências que permitem a expressão de anticorpos IgG completos, resultando assim na produção de anticorpos IgG completos pelas células hospedeiras, em que os referidos anticorpos são caracterizados pela presença dos domínios variáveis de cadeia leve e/ou pesada de acordo com a presente invenção.

[127] A presente invenção refere-se ainda a um método para a produção de um anticorpo obtido conforme descrito acima, por exemplo, um anticorpo que liga-se especificamente à TnT de SEQ ID NO: 1, cujo método compreende o cultivo da célula hospedeira da invenção sob condições adequadas e isolamento do anticorpo produzido.

[128] De acordo com este exemplo de realização, o(s) vetor(es)

presente(s) no hospedeiro da invenção é(são) vetor(es) de expressão ou (um) vetor(es) que medeia (s) a integração estável da(s) molécula(s) de ácido nucleico da presente invenção no genoma da célula hospedeira de tal maneira que sua expressão seja assegurada. Os meios e métodos para seleção de uma célula hospedeira na qual as moléculas de ácido nucleico que codificam os respectivos domínios das cadeias leve e pesada do anticorpo anti-cTnT da presente invenção são introduzidas com sucesso, e de modo que a expressão do anticorpo seja garantida, são bem conhecidos no estado da técnica e foram descritos (Browne, S.M. & Al-Rubeai, M. [2007] Trends Biotechnol. 25:425-432; Matasci, M et al. [2008] Drug Discov. Today: Technol. 5:e37-e42; Wurm, F.M.

[2004] Nat. Biotechnol. 22:1393-1398).

[129] As condições adequadas para a cultura de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas são bem conhecidas pelos especialistas no assunto. Por exemplo, bactérias como, por exemplo, a E. coli podem ser cultivadas sob aeração em meio Luria Bertani (LB), tipicamente a uma temperatura de 4 a cerca de 37ºC. Para aumentar o rendimento e a solubilidade do produto de expressão, o meio pode ser tamponado ou suplementado com aditivos adequados conhecidos por melhorar ou facilitar ambos. Nos casos em que os promotores induzíveis controlam as moléculas de ácido nucleico da invenção nos vetores presentes na célula hospedeira, a expressão do polipeptídeo pode ser induzida pela adição de um agente indutor adequado, como, por exemplo, anidrotetraciclina. Os protocolos e estratégias de expressão adequados foram descritos no estado técnica (por exemplo, em Dyson, M.R., et al. (2004). BMC Biotechnol. 4, 32-49 e em Baldi, L. et al. (2007) Biotechnol. Lett. 29, 677-684) e pode ser adaptado às necessidades das células hospedeiras específicas e aos requisitos da proteína a ser expressa, se necessário.

[130] Dependendo do tipo de célula e seus requisitos específicos, a cultura de células de mamíferos pode, por exemplo, ser realizada em meio RPMI, Williams 'E ou DMEM contendo 10% (v/v) de SBF, L-glutamina a 2 mM e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. As células podem ser mantidas, por exemplo, a 37ºC ou a 41ºC para células de frango DT40, em uma atmosfera de 5% de CO2 saturada com água.

[131] Um meio adequado para a cultura de células de insetos é, por exemplo, o meio TNM+10% de SBF, SF900 ou meio HyClone SFX-Insect.

As células de insetos são geralmente cultivadas a 27ºC como culturas de adesão ou suspensão.

[132] Os protocolos de expressão adequados para células eucarióticas ou de vertebrados são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e podem ser recuperados, por exemplo, em Sambrook, J. & Russel, D.W. [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

[133] Em um exemplo de realização, o método é realizado usando células de mamífero, como, por exemplo, células CHO ou HEK293. Em um exemplo de realização adicional, o método é realizado usando células CHO.

[134] Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, o anticorpo expresso pode ser glicosilado ou pode não ser glicosilado. Em um exemplo de realização, é utilizado um plasmídeo ou vírus contendo a sequência codificante do polipeptídeo da invenção e geneticamente fundido a ela um marcador FLAG- tag N-terminal e/ou His-tag C-terminal. Em um exemplo de realização adicional, o comprimento do referido FLAG-tag é de cerca de 4 a 8 aminoácidos, tal como, por exemplo, exatamente 8 aminoácidos. Um vetor descrito acima pode ser utilizado para transformar ou transfectar o hospedeiro utilizando qualquer técnica normalmente conhecida pelos técnicos hábeis no assunto. Além disso, métodos para a preparação, dos genes operacionalmente ligados fundidos e expressando eles, por exemplo, em células de mamíferos e bactérias, são bem conhecidos no estado da técnica (Sambrook, loc cit).

[135] Os hospedeiros transformados podem ser cultivados em biorreatores e cultivados de acordo com técnicas conhecidas no estado da técnica para atingir um crescimento celular ótimo. O anticorpo da invenção pode então ser isolado a partir do meio de crescimento. O isolamento e a purificação, por exemplo, dos anticorpos da invenção expressos microbialmente podem ser realizados por qualquer meio convencional, como, por exemplo, cromatografia por afinidade (por exemplo, usando um marcador tag de fusão tal como Strep-tag II ou His-tag 6), filtração em gel (cromatografia de exclusão por tamanho), cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), HPLC de fase reversa ou imunoprecipitação. Estes métodos são bem conhecidos no estado da técnica e têm sido geralmente descritos, por exemplo, em Sambrook, J. & Russel, D.W. [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

[136] Será reconhecido que, de acordo com a presente invenção, o termo “isolar o anticorpo produzido” refere-se ao isolamento do anticorpo, por exemplo, o anticorpo anti-cTnT da presente invenção.

[137] A presente invenção refere-se ainda a uma composição compreendendo pelo menos um dentre: (i) o anticorpo da invenção; (ii) a molécula de ácido nucleico da invenção; (iii) o vetor da invenção; (iv) a célula hospedeira da invenção; e/ou (v) o anticorpo produzido pelo método da invenção.

[138] O termo “composição”, conforme usado de acordo com a presente invenção, refere-se a uma composição que compreende pelo menos um dos compostos citados. Ela pode, opcionalmente, compreender moléculas adicionais capazes de alterar as características dos compostos da invenção, desse modo, por exemplo, estabilizando, modulando e/ou melhorando sua função. A composição pode estar na forma sólida ou líquida e pode estar, entre outros, na forma de pó, comprimido ou solução.

[139] Os componentes terapêuticos da composição podem ser embalados em um recipiente ou em uma pluralidade de recipientes, por exemplo, ampolas ou frascos vedados, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para a reconstituição. Como exemplo de uma formulação liofilizada, frascos de 10 ml são preenchidos com 5 mL de solução aquosa estéril-filtrada a 1% (p/v) ou 10% (p/v), e a mistura resultante é liofilizada. Uma solução para uso é preparada reconstituindo o(s) composto(s) liofilizado usando, por exemplo, água para injeção para usos terapêuticos ou outro solvente desejado, por exemplo, um tampão, para fins de diagnóstico. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares.

[140] Os vários componentes da composição podem ser embalados como um kit com instruções de uso.

[141] Em um exemplo de realização, a composição da invenção é uma composição que permite ao especialista realizar métodos in vitro ou ex vivo bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, métodos como imunoensaios.

[142] Exemplos de imunoensaios que podem utilizar os anticorpos da invenção são imunoensaios em um formato direto ou indireto.

Exemplos de tais imunoensaios são; ensaio imunoadsorvente enzima- associado (ELISA), imunoensaio enzimático (EIA), radioimunoensaio (RIA), ou imunoensaios baseados na detecção de luminescência, fluorescência,

quimioluminescência ou eletroquimioluminescência.

[143] A seguir, a presente invenção é exemplificada pela detecção de troponina T cardíaca. Deve-se notar que os anticorpos da invenção direcionados contra outros antígenos alvo podem ser usados em ensaios modificados em conformidade.

[144] A troponina T cardíaca (cTnT) é melhor detectada por um imunoensaio em sanduíche como, por exemplo, divulgado nas Patentes US

6.333.397 e US 6.376.206, respectivamente, e confirmado essencialmente em todas as gerações subsequentes de ensaios para medição de cTnT. No ensaio cTnT de quinta geração, o ensaio de alta sensibilidade para cTnT (hs-cTnT) vendido pela Roche Diagnostics, Alemanha, ainda é empregado o princípio do imunoensaio em sanduíche. Este ensaio é um ensaio de alta sensibilidade, porque pode detectar a cTnT com um limite de detecção inferior (LOD) de 5 ng/mL. Este bom LOD é alcançado apesar de um tempo total de incubação muito curto de 9 ou 18 min, respectivamente, dependendo do protocolo de ensaio usado. Neste ensaio, um sanduíche é formado compreendendo um anticorpo de captura biotinilado e um anticorpo de detecção rutenilado. Este complexo é ligado a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina e os materiais não ligados são eliminados. Como é óbvio para o especialista na técnica é bastante crítico se a Kd não for excelente, pois alguma dissociação ocorrerá e levará a sinais reduzidos, traduzindo diretamente em um LOD reduzido.

[145] Como é óbvio para o especialista hábil na técnica, será vantajoso usar um anticorpo de acordo com a presente invenção em um método para detecção da cTnT.

[146] Em um exemplo de realização, a presente divulgação refere-se a um método de detecção de cTnT em uma amostra, cujo método compreende as etapas de: a) contatar a amostra com um anticorpo anti-cTnT de acordo com a presente divulgação por um tempo e sob condições suficientes para a formação de um complexo anticorpo anti-cTnT/cTnT; e b) medir o complexo anticorpo anti-cTnT/cTnT, de modo que a quantidade desse complexo é indicativa para a concentração de cTnT na amostra. A terminologia “/”, por exemplo, em “complexo anticorpo anti-cTnT/cTnT” é usada para indicar que um complexo não covalente é formado entre o anticorpo anti-cTnT por um lado e o analito cTnT por outro.

[147] Em um exemplo de realização, a presente invenção refere- se a um método de detecção de cTnT em uma amostra compreendendo as etapas de: a) contatar a amostra com um primeiro anticorpo para cTnT e um segundo anticorpo para cTnT, em que o segundo anticorpo é marcado de forma detectável, por um tempo e sob condições suficientes para formar um primeiro complexo anticorpo anti-cTnT/cTnT/segundo anticorpo anti-cTnT; e b) medir o complexo formado em (a), de modo que a quantidade desse complexo é indicativa da concentração de cTnT na amostra e em que o primeiro ou o segundo anticorpo é um anticorpo de acordo com a presente invenção.

[148] Tão óbvio para o especialista na técnica, a amostra pode ser contatada com o primeiro e o segundo anticorpo em qualquer ordem desejada, ou seja, primeiro o primeiro anticorpo, o segundo anticorpo; ou o segundo anticorpo antes do primeiro anticorpo; ou simultaneamente, por um tempo e sob condições suficientes para formar um complexo entre o primeiro anticorpo / cTnT / segundo anticorpo.

[149] Como o versado na técnica reconhecerá prontamente não mais do que uma experimentação de rotina é necessária para estabelecer o tempo e as condições que são apropriadas ou suficientes para a formação de um complexo entre o anticorpo anti-cTnT específico e o antígeno/analito cTnT (= complexo anticorpo anti-cTnT/cTnT) ou a formação do complexo secundário ou sanduíche compreendendo o complexo de primeiro anticorpo para cTnT, o cTnT (o analito) e o segundo de anticorpo anti-cTnT (= complexo ‘primeiro anticorpo anti-cTnT/cTnT/segundo anticorpo anti-cTnT’).

[150] A detecção do complexo anticorpo anti-cTnT/cTnT pode ser realizada por qualquer meio apropriado. O especialista na técnica está absolutamente familiarizado com esses meios/métodos.

[151] O termo “amostra” ou “amostra de interesse” ou “amostra de teste” é usado na presente invenção de forma intercambiável. A amostra é uma amostra in vitro, será analisada in vitro e não será transferida de volta para o corpo. Exemplos de amostras incluem, entre outras, amostras de fluidos, como sangue, soro, plasma; fluido sinovial; urina; saliva e fluido linfático; ou amostras sólidas, como extratos de tecido, cartilagem, osso, sinóvia e tecido conjuntivo. Em um exemplo de realização, a amostra é selecionada a partir de sangue, soro, plasma, fluido sinovial e urina. Em um exemplo de realização, a amostra é selecionada a partir de sangue, soro e plasma. Em um exemplo de realização, a amostra é soro ou plasma.

[152] O termo “amostra de referência”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a uma amostra que é analisada de maneira substancialmente idêntica à amostra de interesse e cujas informações são comparadas com as da amostra de interesse. Uma amostra de referência fornece, assim, um padrão que permite a avaliação das informações obtidas a partir da amostra de interesse. Uma amostra de referência pode ser derivada de um tecido, órgão ou indivíduo saudável ou normal, proporcionando assim um padrão do estado de saúde de um tecido, órgão ou indivíduo. As diferenças entre o estado da amostra de referência normal e o estado da amostra de interesse podem ser indicativas do risco de desenvolvimento da doença ou da presença ou progressão adicional dessa doença ou distúrbio. Uma amostra de referência pode ser derivada de um tecido, órgão ou indivíduo anormal ou doente, proporcionando assim um padrão do estado de doença de um tecido,

órgão ou indivíduo. As diferenças entre o estado da amostra de referência anormal e o estado da amostra de interesse podem ser indicativas de um risco reduzido de desenvolvimento da doença ou da ausência ou melhora de tal doença ou distúrbio.

[153] Os termos nível “elevado” ou “aumentado” de um indicador referem-se ao nível desse indicador na amostra ser maior em comparação com o nível desse indicador em uma referência ou amostra de referência. Por exemplo, uma proteína que é detectável em maiores quantidades em uma amostra de fluido de um indivíduo que sofre de uma determinada doença do que na mesma amostra de fluido de indivíduos que não sofrem da referida doença, tem um nível elevado.

[154] Em certos exemplos de realização, um sanduíche será formado compreendendo um primeiro anticorpo para cTnT, o cTnT (analito) e o segundo anticorpo para cTnT, em que o segundo anticorpo é marcado de forma detectável.

[155] Estão disponíveis vários marcadores (também conhecidos como corantes) que geralmente podem ser agrupados nas seguintes categorias, todas juntas e cada uma delas representando exemplos de realização de acordo com a presente divulgação: (A) CORANTES FLUORESCENTES

[156] Os corantes fluorescentes estão descritos, por exemplo, em Briggs et al. “Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids”, J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058).

[157] Marcadores fluorescentes ou fluoróforos incluem quelatos terrosos raros (quelato de európio), marcadores tipo fluoresceína incluindo FITC, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína; marcadores tipo rodamina incluindo TAMRA; dansil; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; Vermelho Texas

(Texas Red), e análogos desses. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados com um grupo aldeído compreendido na molécula alvo usando as técnicas divulgadas na presente invenção. Os corantes fluorescentes e reagentes marcadores fluorescentes incluem aqueles que estão comercialmente disponíveis pela Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon, EUA) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).

(B) CORANTES LUMINESCENTES

[158] Os corantes ou marcadores luminescentes podem ser subcategorizados em corantes quimioluminescentes e eletroquimioluminescentes.

[159] As diferentes classes de marcadores quimioluminogênicos incluem luminol, compostos de acridínio, coelenterazina e análogos, dioxetanos, sistemas baseados em ácido peroxioxiálico e seus derivados. Para procedimentos de imunodiagnóstico, são utilizados predominantemente marcadores baseados em acridínio (uma visão geral detalhada é fornecida em Dodeigne C. et al., Talanta 51 (2000) 415-439).

[160] Os marcadores de maior relevância usados como marcadores eletroquimioluminescentes são os complexos eletroquimioluminescentes baseados em rutênio e irídio, respectivamente. A eletroquimiluminescência (ECL) provou ser muito útil em aplicações analíticas como um método altamente sensível e seletivo. Ela combina vantagens analíticas da análise quimioluminescente (ausência de sinal óptico de fundo) com facilidade de controle da reação aplicando o potencial de eletrodo. Em geral, complexos de rutênio, especialmente [Ru (Bpy)3]2+ (que libera um fóton a ~ 620 nm) regenerando com TPA (Tripropilamina) na fase líquida ou na interface líquido-sólido, são usados como marcadores ECL. Recentemente, também foram descritos marcadores ECL baseados em Irídio (documento WO2012107419 (A1)).

[161] (c) Marcadores radioativos que utilizam radioisótopos (radionuclídeos); tal como H3, C11, C14, F18, P32, S35, Cu64, Gn68, Y86, Zr89, Tc99, In111, I123, I124, I125, I131, Xe133, Lu177, At211 ou Bi131.

[162] (d) Complexos de metal-quelato adequados como marcadores para fins de diagnóstico por imagem e terapêuticos são bem conhecidos no estado da técnica (US 2010/0111856; US 5.342.606; US

5.428.155; US 5.316.757; US 5.480.990; US 5.462.725; US 5.428.139; US

5.385.893; US 5.739.294; US 5.750.660; US 5.834.456; Hnatowich et al, J.

Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares et al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 59-65; Meares et al, J.

Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346- 350; Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera et al, Nucl. Med.

Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110; Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226; Verel et al, J. Nucl.

Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482; Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137; DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula et al J. Nucl.

Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36; Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65 - 74; Roselli et al, Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20).

[163] Em um exemplo de realização, um sanduíche será formado compreendendo um primeiro anticorpo para cTnT, o cTnT (analito) e o segundo anticorpo para cTnT, em que o segundo anticorpo é marcado de forma detectável e em que o primeiro anticorpo anti-cTnT é capaz de ligar-se a uma fase sólida ou está ligado a uma fase sólida.

[164] Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-cTnT divulgado na presente invenção é usado em um imunoensaio para medir a cTnT. Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-cTnT divulgado acima na presente invenção é usado em um imunoensaio do tipo sanduíche. Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-cTnT divulgado na presente invenção é usado como um anticorpo de detecção. Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-cTnT divulgado é marcado de forma detectável com um corante luminescente, especialmente um corante quimioluminescente ou um corante eletroquimioluminescente.

[165] Estes e outros exemplos de realização são descritos e abrangidas pela descrição e pelos Exemplos da presente invenção. A literatura relativa a qualquer um dos métodos, usos e compostos a serem empregados de acordo com a presente invenção pode ser recuperada a partir de bibliotecas e bases de dados públicas, utilizando, por exemplo, dispositivos eletrônicos.

Por exemplo, o banco de dados público “Medline”, disponível na Internet, pode ser utilizado, por exemplo, no endereço eletrônico da World Wide Web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Outros bancos de dados e endereços disponíveis na World Wide Web, como ncbi.nlm.nih.gov/, fmi.ch/biology/research_tools.html,tigr.org/, ou infobiogen.fr/, são conhecidos por aqueles versados na técnica e também podem ser obtidos através do endereço lycos.com na World Wide Web.

[166] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico versado no assunto ao qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, o relatório descritivo da patente, incluindo as definições, prevalecerá.

[167] Todas as sequências de aminoácidos fornecidas no presente documento são apresentadas começando com a maioria dos resíduos

N-terminais e terminando com a maioria dos resíduos C-terminais (N→C), como normalmente feito na técnica, e as abreviações de código de uma ou três letras utilizadas para identificar aminoácidos ao longo da presente invenção correspondem às abreviações de código comumente usadas para aminoácidos.

[168] Em relação aos exemplos de realização caracterizados neste relatório descritivo, em particular nas reivindicações, pretende-se que cada exemplo de realização mencionado em uma reivindicação dependente seja combinada com cada exemplo de realização de cada reivindicação (independente ou dependente) da referida reivindicação dependente. Por exemplo, no caso de uma reivindicação independente 1 citando 3 alternativas A, B e C, uma reivindicação dependente 2 citando 3 alternativas D, E e F e uma reivindicação 3 dependente das reivindicações 1 e 2 e citando 3 alternativas G, H e I, deve ser entendido que o relatório descritivo divulga inequivocamente exemplos de realização correspondentes às combinações A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, a menos que especificamente mencionado de outra forma.

[169] De forma similar, e também nos casos em que as reivindicações independentes e/ou dependentes não recitam alternativas, entende-se que, se as reivindicações dependentes se referirem a uma pluralidade de reivindicações anteriores, qualquer combinação de objeto coberto por ela é considerada explicitamente divulgada. Por exemplo, no caso de uma reivindicação independente 1, uma reivindicação dependente 2 referindo-se à reivindicação 1 e uma reivindicação dependente 3 referindo-se a ambas as reivindicações 2 e 1, segue-se que a combinação da matéria objeto das reivindicações 3 e 1 é clara e inequivocamente divulgada como é a combinação da matéria das reivindicações 3, 2 e 1. No caso de outra reivindicação dependente 4 estar presente, que se refere a qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, segue-se que a combinação da matéria das reivindicações 4 e 1, das reivindicações 4, 2 e 1, das reivindicações 4, 3 e 1, bem como das reivindicações 4, 3, 2 e 1 é divulgada de forma clara e inequívoca.

[170] As considerações acima se aplicam mutatis mutandis a todas as reivindicações anexas. Para dar um exemplo não limitante, a combinação das reivindicações 13, 12 e 1 (i) é clara e inequivocamente considerada em vista da estrutura da reivindicação. O mesmo se aplica, por exemplo, à combinação das reivindicações 13, 11 e 4 (ii), etc.

[171] Alguns aspectos da invenção também são ilustrados pelas figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[172] Figura 1: Construção de uma biblioteca compreendendo substituições aleatórias de aminoácidos em uma ou mais das CDRs de cadeia pesada.

[173] Figura 1A: Produção dos fragmentos da cadeia pesada necessários na construção da biblioteca mutante (etapa 1).

[174] Na primeira rodada (PCR 1), três fragmentos de cadeia pesada diferentes correspondentes aos fragmentos 1, 3 e 4, respectivamente, foram gerados com a ajuda de conjuntos de iniciadores correspondentes. Os trechos em cinza claro indicam as CDRs. A sequência da cadeia principal (backbone) é fornecida em preto. As setas horizontais indicam os iniciadores usados. As setas verticais apontam para os resultados da PCR. O oligonucleotídeo curto de 42 pb (pares de bases) (fragmento 2) que está riscado na Figura não foi obtido por PCR, mas foi sintetizado quimicamente de maneira separada.

[175] Figura 1B: síntese da biblioteca de HC por aleatorização de um único aminoácido da CDR.

[176] Na segunda etapa da PCR 2, os quatro fragmentos obtidos conforme descrito na Figura 1A serviram como moldes (linhas pretas). As setas horizontais com uma cruz indicam as bibliotecas de polinucleotídeos, cada uma compreendendo um códon NNK degenerado para cada posição de códon da CDR. Além disso, estas bibliotecas de polinucleotídeos compreendem extensões de sequência capazes de hibridizar com um ou dois dos fragmentos da etapa 1, conforme necessário e indicado. Os iniciadores direto (forward) e reverso (reverse), respectivamente, (setas pequenas) foram usados para realizar as respectivas PCRs.

[177] Figura 1C: Etapa final de síntese da biblioteca.

[178] Os trechos de sequência adicionais capazes de hibridizar com um ou dois dos fragmentos da etapa 1 são necessários para realizar a etapa final na produção da biblioteca de HC, ou seja, uma PCR de sobreposição usando todos os quatro produtos da PCR 2. Os iniciadores terminais (F1A; R1A) são usados e os próprios fragmentos atuam como mega iniciadores nesta PCR de sobreposição.

[179] Figura 2: Mapa de vetor para expressão periplasmática de Fab.

[180] A descrição na Figura fornecida é considerada autoexplicativa.

[181] Figura 3: Configuração de ELISA para a triagem de fragmentos Fab de ligação à cTnT.

[182] Uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina (placa SA) é usada para ligar a troponina T cardíaca biotinilada (bi-cTnT) à fase sólida. Os fragmentos Fab compreendendo cadeias pesadas anti-cTnT recombinantes (<cTnT>-Fab) se ligam à TnT e são detectados por meio de anticorpos anti-Fab humano marcados com peroxidase (POD) (Anti huFab- POD).

[183] Figura 4: Ensaio tipo sanduíche Elecsys.

[184] É ilustrado um esquema mostrando a configuração do ensaio. O anticorpo de captura biotinilado (bi) é ligado às esferas revestidas com estreptavidina (SA). Vários anticorpos anti-cTnT com afinidade maturada foram rutenilados (Ru) e o efeito das maturações de afinidade foi investigado por análises ECL.

[185] Figura 5: Contagens de sinal ECL para o especificador genuíno e especificador derivado.

[186] São fornecidas contagens para o anticorpo anti-cTnT genuíno e um anticorpo mutante (combinação 12, respectivamente, referem-se ao identificador de fragmento Fab usado na Tabela 2). As barras cinza claro mostram os valores em branco do ensaio (ruído) no reagente do Diluent Multi Assay, as barras cinza escuro mostram as contagens obtidas com o Calibrador 1 do ensaio comercial cTnT Elecsys® (sinal). A combinação de anticorpos 12 mostra uma relação sinal-ruído melhorada.

EXEMPLOS QUE ILUSTRAM A INVENÇÃO EXEMPLO 1

MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[187] Métodos padronizados foram usados para manipular o DNA conforme descrito em Sambrook, J. et al, “Molecular cloning: A laboratory manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Os reagentes para a biologia molecular foram utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes.

DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE DNA

[188] As sequências de DNA foram determinadas pelo sequenciamento de dupla fita realizado na Microsynth AG (Balgach, Suíça).

ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DE DNA E DE PROTEÍNA E GESTÃO DOS DADOS DE SEQUÊNCIA

[189] A suíte de programas Vector NT1 Advance versão 11.5.0, foi usada para a criação, mapeamento, análise, anotações e ilustração das sequências.

QUÍMICA DE PROTEÍNAS E TÉCNICAS DE MARCAÇÃO (ROTULAGEM)

[190] As técnicas de marcação e química de proteínas padrão são fornecidas, por exemplo, em Hermanson, G. “Bioconjugate Techniques” 3ª Edição (2013) Academic Press.

BIOINFORMÁTICA

[191] Os métodos de bioinformática são fornecidos, por exemplo, em Keith J.M. (ed.) “Bioinformatics” Vol. I e Vol. II, Methods in Molecular Biology Vol. 1525 e Vol. 1526 (2017) Springer, e em Martin, A.C.R. & Allen, J.

“Bioinformatics Tools for Analysis of Antibodies” em : Dübel S. & Reichert J.M.

(eds.) “Handbook of Therapeutic Antibodies” Wiley-VCH (2014).

IMUNOENSAIOS ELETROQUIMIOLUMINESCENTES

[192] Os imunoensaios e métodos relacionados são fornecidos, por exemplo, em Wild D. (ed.) “The Immunoassay Handbook” 4ª Edição (2013) Elsevier. Complexos de rutênio como marcadores eletroquimiluminescentes são fornecidos, por exemplo, em Staffilani M. et al. Inorg. Chem. 42 (2003) 7789–7798. Normalmente, para o desempenho de imunoensaios baseados em eletroquimiluminescência (ECL), foi utilizado um analisador Elecsys 2010 ou um sistema sucessor, por exemplo, um analisador Roche (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Alemanha), como E170, Cobas e 601, Cobas e 602, Cobas módulo e 801, e Cobas e 411, e ensaios da Roche Elecsys projetados para esses analisadores, cada um usado em condições padrão, se não indicado de outra forma.

EXEMPLO 2

CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA

[193] A cadeia pesada variável do anticorpo parental é de origem murina (SEQ ID NO: 34). Foi construída uma biblioteca compreendendo HC CDRs mutadas com o objetivo de uma aleatorização de um único aminoácido na HCCDR1, HCCDR2 e/ou HCCDR3, respectivamente.

Em uma primeira etapa, quatro fragmentos de DNA foram gerados, cada um codificando uma das quatro diferentes regiões de estrutura do anticorpo parental. As regiões estruturais 1, 3 e 4 foram obtidas por reação em cadeia da polimerase realizada internamente, o fragmento curto 2 (42 pb), representando a região estrutural 2, foi encomendado na Metabion international AG (cf. Figura 1A). Os fragmentos foram purificados em gel e quantificados. 100 ng de um destes fragmentos de DNA foram usados como um molde de polinucleotídeo em cada uma das quatro misturas de reação de PCR adicionais. As regiões CDR foram adicionadas pelo uso de uma biblioteca de polinucleotídeos compreendendo o mesmo número de códons que a CDR parental, em que os membros da referida biblioteca foram projetados para compreender membros da biblioteca com um códon NNK para cada uma das respectivas posições de códons na respectiva HCCDR.

Além disso, os polinucleotídeos na biblioteca de CDR compreendiam sequências capazes de hibridizar com a região estrutural vizinha à respectiva CDR. Os iniciadores terminais foram usados para amplificação por PCR aninhada (nested PCR). Assim (cf. Figura 1B) foram gerados quatro fragmentos de DNA com sequências parcialmente sobrepostas. A PCR de sobreposição, com iniciadores terminais que hibridizam com a extremidade 3' da sequência FW1 e com a extremidade 5' da sequência FW4, foi realizada para conectar os quatro fragmentos a uma construção de biblioteca de DNA linear (cf. Figura 1C). Uma reação de PCR típica foi preenchida com água de grau de PCR para uma mistura de reação de 100 µL contendo 10 µL de tampão de PCR 10x com MgSO 4, 200 µM de mistura de dNTP, 0,5 µM de iniciador direto e iniciador reverso, 250 ng de DNA molde, 5 unidades de DNA polimerase Pwo. Uma PCR típica começou com desnaturação inicial do molde a 94ºC por 5 min, e empregou 30 ciclos (94ºC por 2 min, 60ºC por 45 seg, 72ºC por 1 min) e uma etapa de alongamento final a 72ºC por 5 min. Os iniciadores, moldes e sequências de fragmentos estão listados na Tabela 1.

Os fragmentos da biblioteca continham todas as sequências regulatórias necessárias para uma transcrição e tradução bem-sucedidas em um sistema livre de células. O profissional versado na técnica é capaz de gerar essa biblioteca seguindo os métodos do estado da técnica, vide, por exemplo, Hanes, J. & Pluckthun, A. (1997), “In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display”, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 94, 4937-42.

250 ng da biblioteca de DNA assim gerada, cobrindo as três HCCDRs e correspondendo a cerca de 5 1011 membros da biblioteca, foram usados para a abordagem de exibição in vitro.

TABELA 1 SEQUÊNCIAS USADAS NA GERAÇÃO DA BIBLIOTECA DE FRAGMENTOS FAB ANTI-

CTNT

SEQ ID PCR 1 NO:

CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGT F1A TTCCC 35 1-fr.1rv GGTAAAGGTATAGCCGCTCG 36 1-fr.3fw CCAGAAATTTAAGGATAAAGCGACCC 37 1-fr.3rv GGTCGCGCAATAATACACCG 38 1-fr.4fw CGGTGTATTATTGCGCGACC 39

AACCCCCGCATAGGCTGGGGGTTGGAAAGCCTCTGAGGA R1A CCAGCACG 40 PCR 2 Fragmento 1

GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTT Frt TAACTTTAAGAAGGAGATATACAT 41 2-H1 rv mix

SEQ ID PCR 1 NO:

GCTCTGTTTCACCCATTTCATATAATAMNNGGTAAAGGT 2-H1 rv1 ATAGC 42

GCTCTGTTTCACCCATTTCATATAMNNATCGGTAAAGGT 2-H1 rv2 ATAGC 43

GCTCTGTTTCACCCATTTCAMNNAATAATCGGTAAAGGT 2-H1 rv3 ATAGC 44

GCTCTGTTTCACCCATTTMNNATAATAATCGGTAAAGGT 2-H1 rv4 ATAGC 45

GCTCTGTTTCACCCAMNNCATATAATAATCGGTAAAGGT 2-H1 rv5 ATAGC 46 2-fr.1 rv CCATGGCTCTGTTTCACCC 47 Fragmento 2 2-fr.2 fw CGAGCGGCTATACCTTTACC 48 2-H1 fw mix

GCTATACCTTTACCNNKTATTATATGAAATGGGTGAAAC 2-H1 fw1 AGAGC 49

GCTATACCTTTACCGATNNKTATATGAAATGGGTGAAAC 2-H1 fw2 AGAGC 50

GCTATACCTTTACCGATTATNNKATGAAATGGGTGAAAC 2-H1 fw3 AGAGC 51

GCTATACCTTTACCGATTATTATNNKAAATGGGTGAAAC 2-H1 fw4 AGAGC 52

GCTATACCTTTACCGATTATTATATGNNKTGGGTGAAAC 2-H1 fw5 AGAGC 53 2-H2 rv mix

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAGGTTTCGCCGTTGTTCG 2-H2 rv1 GATTAATMNNGCCAATCCATTCCAGG 54

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAGGTTTCGCCGTTGTTCG 2-H2 rv2 GATTMNNATCGCCAATCCATTCCAGG 55

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAGGTTTCGCCGTTGTTCG 2-H2 rv3 GMNNAATATCGCCAATCCATTCCAGG 56

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAGGTTTCGCCGTTGTTMN 2-H2 rv4 NATTAATATCGCCAATCCATTCCAGG 57

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAGGTTTCGCCGTTMNNCG 2-H2 rv5 GATTAATATCGCCAATCCATTCCAGG 58

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAGGTTTCGCCMNNGTTCG 2-H2 rv6 GATTAATATCGCCAATCCATTCCAGG 59

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAGGTTTCMNNGTTGTTCG 2-H2 rv7 GATTAATATCGCCAATCCATTCCAGG 60

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAGGTMNNGCCGTTGTTCG 2-H2 rv8 GATTAATATCGCCAATCCATTCCAGG 61

CCTTAAATTTCTGGTTATAAAAMNNTTCGCCGTTGTTCG 2-H2 rv9 GATTAATATCGCCAATCCATTCCAGG 62

CCTTAAATTTCTGGTTATAMNNGGTTTCGCCGTTGTTCG 2-H2 rv10 GATTAATATCGCCAATCCATTCCAGG 63

SEQ ID PCR 1 NO: 2-fr.2 rv GGGTCGCTTTATCCTTAAATTTCTGG 64 Fragmento 3 2-fr.3 fw GCAAAAGCCTGGAATGGATTGGC 65 2-H2 fw mix

CCTGGAATGGATTGGCNNKATTAATCCGAACAACGGCG 2-H2 fw1 AAACCTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 66

CCTGGAATGGATTGGCGATNNKAATCCGAACAACGGCG 2-H2 fw2 AAACCTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 67

CCTGGAATGGATTGGCGATATTNNKCCGAACAACGGCG 2-H2 fw3 AAACCTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 68

CCTGGAATGGATTGGCGATATTAATNNKAACAACGGCG 2-H2 fw4 AAACCTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 69

CCTGGAATGGATTGGCGATATTAATCCGNNKAACGGCG 2-H2 fw5 AAACCTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 70

CCTGGAATGGATTGGCGATATTAATCCGAACNNKGGCG 2-H2 fw6 AAACCTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 71

CCTGGAATGGATTGGCGATATTAATCCGAACAACNNKG 2-H2 fw7 AAACCTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 72

CCTGGAATGGATTGGCGATATTAATCCGAACAACGGCN 2-H2 fw8 NKACCTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 73

CCTGGAATGGATTGGCGATATTAATCCGAACAACGGCG 2-H2 fw9 AANNKTTTTATAACCAGAAATTTAAGG 74

CCTGGAATGGATTGGCGATATTAATCCGAACAACGGCG 2-H2 fw10 AAACCNNKTATAACCAGAAATTTAAGG 75 2-H3 rv mix

GGTACCCTGGCCCCAATAATCAAACACMNNGGTCGCGC 2-H3 rv1 AATAATACACC 76

GGTACCCTGGCCCCAATAATCAAAMNNGCGGGTCGCGC 2-H3 rv2 AATAATACACC 77

GGTACCCTGGCCCCAATAATCMNNCACGCGGGTCGCGC 2-H3 rv3 AATAATACACC 78

GGTACCCTGGCCCCAATAMNNAAACACGCGGGTCGCGC 2-H3 rv4 AATAATACACC 79

GGTACCCTGGCCCCAMNNATCAAACACGCGGGTCGCGC 2-H3 rv5 AATAATACACC 80 2-fr.3 rv CGGTCAGGGTGGTACCCTGGC 81 Fragmento 4 2-fr.4 fw CGGTGTATTATTGCGCGACC 82 2-H3 fw mix 2-H3 fw1 GGTGTATTATTGCGCGACCNNKGTGTTTGATTATTGGG 83

GCCAGGGTACC

GGTGTATTATTGCGCGACCCGCNNKTTTGATTATTGGG 2-H3 fw2 GCCAGGGTACC 84

GGTGTATTATTGCGCGACCCGCGTGNNKGATTATTGGG 2-H3 fw3 GCCAGGGTACC 85

GGTGTATTATTGCGCGACCCGCGTGTTTNNKTATTGGG 2-H3 fw4 GCCAGGGTACC 86

GGTGTATTATTGCGCGACCCGCGTGTTTGATNNKTGGG 2-H3 fw5 GCCAGGGTACC 87 Rrt GGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACGGATGCCCTGTGC 88 PCR de sobreposição

CGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG F1A TTTCCC 89

AACCCCCGCATAGGCTGGGGGTTGGAAAGCCTCTGAGG R1A ACCAGCACG 90 gggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgt ttaactttaagaaggagatatacatatggaagtgcagc PCR tgcagcagagcggcccggaactggtgaaaccgggcgcg agcgtgaaaatgagctgcaaagcgagcggctatacctt 91 fragmento 1 taccGATTATTATATGAAAtgggtgaaacagagccatg g cgagcggctatacctttaccGATTATTATATGAAAtgg PCR gtgaaacagagccatggcaaaagcctggaatggattgg cGATATTAATCCGAACAACGGCGAAACCTTTtataacc 92 fragmento 2 agaaatttaaggataaagcgaccc GcaaaagcctggaatggattggcGATATTAATCCGAAC AACGGCGAAACCTTTtataaccagaaatttaaggataa PCR agcgaccctgaccgtggataaaagcagcagcaccgcgt atatgcagctgaacagcctgaccagcgaagatagcgcg 93 fragmento 3 gtgtattattgcgcgaccCGCGTGTTTGATTATtgggg ccagggtaccaccctgaccg cggtgtattattgcgcgaccCGCGTGTTTGATTATtgg ggccagggtaccaccctgaccgtgagcagcgcgaaaac caccccgccgagcgtgtatccgctg gcgccgggcagcgcggcgcagaccaacagcatggtgac cctgggctgcctggtgaaaggctattttccggaaccgg tgaccgtgacctggaacagcggcagcctgagcagcggc PCR gtgcatacctttccggcggtgctgcagagcgatctgta taccctgagcagcagcgtgaccgtgccgagcagcacct 94 fragmento 4 ggccgagcgaaaccgtgacctgcaacgtggcgcatccg gcgagcagcaccaaagtggataaaaaaattggagctgg tgcaggctctggtgctggcgcaggttctccagcagcgg tgccggcagcagttcctgctgcggtgggcgaaggcgag ggagagttcagtacgccagtttggatctcgcaggcaca gggcatccgtgctggtcctcagaggctttcc iniciador GCTACAAACGCGTACGCTATGGAAGTGCAGCTGCAGCA direto para GAGCG 95 clonagem

EXEMPLO 3

EXIBIÇÃO IN VITRO

[194] Os tampões para exibição de Fab foram preparados e incubados durante a noite a 4ºC com rotação contínua. O tampão de lavagem, WB, (60 mM de Tris; pH 7,5 ajustado com AcOH, 180 mM de NaCl, 60 mM de acetato de magnésio, BSA bloqueador a 5%, 33 mM de KCl, 200 µg de t-RNA, Tween 20 a 0,05%); Tampão de lavagem das esferas, BWB (100 mM de PBS, Tween 20 a 0,1%); Tampão de parada, SB (50 mM de Tris, pH 7,5 ajustado com AcOH, 150 mM de NaCl, 50 mM de acetato de magnésio, BSA de bloq. a 5% (Pierce), 33 mM de KCl, Tween 20 a 0,5%, 8,2 mM de ox. glutationa); Tampão de eluição (55 mM de Tris, pH 7,5 ajustado com AcOH, 165 mM de NaCl, 22 mM de EDTA, 1 mg de BSA, 5000 U de rRNA (5000 U), 50 µg de tRNA).

[195] O volume necessário de esferas magnéticas (esferas revestidas com estreptavidina) foi bloqueado com 100 μL de tampão de lavagem (WB) por 10 μL de suspensão inicial com rotação contínua a 4ºC durante a noite. 25 µL das esferas foram usados para a etapa de pré-seleção (prepanning) e 20 µL para o processo de isolamento/seleção (denominado de panning) de amostra alvo/fundo. Para remover a azida sódica do tampão de armazenamento de esferas, as esferas foram lavadas por quatro vezes com tampão de lavagem de esferas (BWB) e três vezes com WB. Essas etapas foram realizadas aplicando-se um campo magnético para a coleta das esferas por dois minutos e, posteriormente, o descarte do sobrenadante. Após a etapa final de lavagem, as esferas foram ressuspensas em WB até seu volume inicial.

[196] O PUREfrex® DS 2.0 foi usado de acordo com as instruções do fabricante para executar a transcrição e tradução in vitro. Foram preparados tubos de reação de 1,5 mL para o alvo (T) e um para o fundo (BG).

[197] A entrada de DNA do molde de expressão (LC) e o molde de exibição (HC) foram aplicados em uma proporção molecular de 2:1. As quantidades de DNA, codificante para molde de exibição e de expressão, foram mantidas constantes em todos os ciclos de exibição de Fab.

A mistura de reação de transcrição/tradução in vitro foi incubada a 37ºC durante 1 h.

Após a incubação, a reação foi interrompida pela adição de 100 µL de tampão de parada, seguido por uma etapa de centrifugação a 14.000 rpm por 15 minutos a 1ºC.

Salvo quando indicado de outra forma, as etapas subsequentes foram realizadas a 4ºC.

O sobrenadante a partir da reação interrompida da mistura de tradução foi adicionado à suspensão de esferas preparada e incubado por 30 minutos em uma plataforma oscilante.

Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 13.000 rpm a 1ºC por 10 minutos para separar os esferas com as moléculas de ligação inespecíficas do sobrenadante com os complexos ternários restantes.

O sobrenadante pré-selecionado (300 µL) foi transferido para um novo tubo de reação de 2 mL, previamente bloqueado com WB, e mantido em gelo até o uso.

O alvo (cTnT biotinilado recombinante) foi adicionado a 300 µL de sobrenadante pré-selecionado em uma concentração final variando de 10 nM a 50 nM.

A concentração de cTnT biotinilada foi diminuída a cada ciclo a fim de aumentar a pressão de seleção.

A suspensão foi incubada por 30 minutos em plataforma oscilante.

A etapa de panning de solução permitiu a ligação específica entre a cTnT biotinilada e o complexo ternário.

Os complexos ternários que se ligam à cTnT alvo foram capturados com esferas de estreptavidina em uma etapa de incubação de 20 minutos.

Um aumento adicional da pressão de seleção foi alcançado no ciclo III de duas maneiras: Ou diminuindo a concentração de antígeno para 2 nM ou usando um competidor não biotinilado.

Na última etapa, a etapa de isolamento e seleção (panning) foi implementada com uma baixa concentração de cTnT biotinilada e um excesso do competidor cTnT durante a noite.

[198] As etapas de lavagem compreendem a captura das esferas com os complexos ternários alvo ligados em um campo magnético, seguido pela remoção do sobrenadante. As esferas foram lavadas com 500 µL de WB gelado. A pressão de seleção foi aumentada em ciclos de exibição subsequentes, estendendo a duração das etapas de lavagem de 5 minutos para 1 hora. A etapa de lavagem final foi usada para transferir as esferas para um novo tubo de reação bloqueado de 2 mL. Posteriormente, as esferas foram capturadas com um campo magnético e o sobrenadante foi removido. A etapa de eluição seguinte foi realizada adicionando 100 µL de EB 1x contendo EDTA e incubando durante 10 minutos sob agitação. O mRNA foi liberado dos complexos ternários. Em seguida, a mistura de eluição foi centrifugada a

14.000 rpm por 10 minutos a 1ºC. O kit de limpeza RNeasy MinElute cleanup kit (Qiagen) foi usado de acordo com as instruções do fabricante para isolar e purificar o RNA enriquecido. O RNA foi eluído com 16 µL de água livre de RNase. A fim de digerir qualquer DNA remanescente a partir da etapa de seleção, o kit Ambion DNA free® foi usado de acordo com as instruções do fabricante. O DNA restante não pôde ser amplificado em reações de PCR subsequentes. Após a desativação da DNase, a suspensão foi centrifugada por dois minutos a 13.000 rpm e à temperatura ambiente. O sobrenadante (50 µL) foi transferido para um novo tubo de reação de 1,5 mL em gelo. O RNA purificado foi imediatamente utilizado para a transcrição reversa (RT). Qualquer sobrenadante remanescente foi armazenado a -20ºC.

[199] O mRNA eluído foi transcrito reversamente em cDNA. Duas reações foram preparadas para a amostra T, contendo o alvo na etapa de panning. Outras duas reações foram preparadas para a amostra BG e um controle negativo continha água. De acordo com o número de amostras, uma mistura-mãe (master mix) foi preparada e a pré-mistura foi distribuída em tubos de reação de 0,2 mL em gelo. Cada reação foi inoculada com 12 µL do RNA eluído e 0,5 µL da transcriptase reversa. O controle negativo foi implementado com 12 µL de água livre de RNase em vez de RNA. A transcrição reversa foi realizada por 45 minutos a 65ºC em um termociclador de PCR. Em seguida, as amostras de cDNA foram incubadas durante 5 minutos em gelo e amplificadas nas etapas seguintes. A amostra restante foi armazenada a -20ºC. Duas reações de PCR foram implementadas: A primeira PCR “PCR on RT” foi realizada com os iniciadores Frt e Rrt para amplificar o cDNA do pool de seleção. A segunda PCR “PCR on RT-PCR” utilizando os iniciadores F1A e R1A foi aplicada com o objetivo de religar os elementos reguladores para a transcrição/tradução in vitro. Ambas as reações foram realizadas com a DNA polimerase Pwo.

[200] A fim de fornecer uma concentração de DNA suficiente do pool de seleção, quatro reações foram configuradas para cada uma das amostras T e BG.

[201] Além disso, quatro amostras de controle foram preparadas.

As duas primeiras amostras foram derivadas da digestão de DNA após o isolamento do mRNA das amostras T e BG e foram verificadas por PCR para amplificar o DNA potencialmente remanescente. O terceiro e o quarto foram o controle negativo de RT e um controle negativo de “PCR em RT” usando água grau de PCR.

[202] O produto da PCR de T foi purificado a partir de um gel de agarose 1% preparativo com o kit de extração de gel QIAquick, e posteriormente quantificado e usado como molde para a “PCR em RT-PCR”.

Foram preparadas três reações do pool de seleção e um controle negativo com água de qualidade para PCR em vez do molde de DNA. Para cada reação, foram usados 250 ng do “PCR em RT” previamente purificado. Os produtos da PCR foram purificados a partir de um gel de agarose preparativo a 1% com o kit de extração de gel QIAquick e foram posteriormente modificados para subsequente subclonagem em um sistema de expressão apropriado.

EXEMPLO 4

EXPRESSÃO PERIPLASMÁTICA DE LIGANTES ENRIQUECIDOS

[203] A fim de isolar ligantes Fab enriquecidos, as HCs variáveis murinas foram clonadas no vetor de expressão phoATIR3-9bi Fab TN-T M7chim (veja a Figura 2), contendo o domínio CH1 humano, domínio VL murino e domínio CL humano do Fab. Cada conjunto de seleção foi fornecido com um sítio de restrição BsiWI localizado na sequência líder Tir9 para permitir a clonagem no vetor de expressão.

[204] O segundo sítio de restrição KpnI ocorre no final da região variável da HC e, portanto, não precisa ser anexado. Portanto, foi realizada uma PCR usando o iniciador direto 5' GCTACAAACGCGTACGCTATGGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCG-3' (SED ID NO: 95), contendo o sítio de restrição BsiWI e o iniciador reverso Rrt 5’- GGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACGGATGCCCTGTGC-3’ (SEQ ID NO:88).

A expressão periplasmática foi realizada em blocos de poços profundos de 96 poços (DWBs). Os DWBs da pré-cultura (“master”) foram preenchidos com 1 mL de LB (100 µg/mL de ampicilina) por poço usando o Integra VIAFlo96 e foram inoculados com os clones isolados da subclonagem e transformação previamente implementada. Cerca de 300 colônias por pool de seleção foram coletadas. Um poço foi deixado sem inoculação e foi utilizado como controle negativo; outro poço foi inoculado com um vetor de expressão Fab TnT M-7 (tipo selvagem) transformado com XL1 blue como controle positivo. Os DWBs foram selados com membranas permeáveis ao ar e incubados em uma incubadora de agitação orbital (750 rpm) durante a noite a 30ºC.

Posteriormente, 50 µL de cada poço dos DWBs master foram transferidos para novos DWBs de “expressão”, preparados com 1150 mL de meio C.R.A.P. (100 µg/mL de ampicilina) por poço, conforme descrito por Simmons, L. C., Reilly,

D., Klimowski, L., Raju, T. S., Meng, G., Sims, P., Hong, K., Shields, R. L., Damico, L. A., Rancatore, P. & Yansura, D. G. (2002) “Expression of full length immunoglobulins in Escherichia coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies”, J Immunol Methods 263, 133-47. Os DWBs foram selados com membrana permeável ao ar e incubados em uma incubadora de agitação orbital a 30ºC. A indução da expressão de Fab é baseada no promotor phoA com o meio C.R.A.P limitador de fosfato. Após 24 horas, as células com os Fabs expressos foram coletadas por centrifugação a 4000 rpm durante 10 minutos e armazenadas a -20ºC até utilização posterior.

[205] Os DWBs das pré-culturas principais (master) foram usados para “estoques de glicerol”, adicionando 950 µL de glicerol a 40% e armazenando essa pré-culturas a -80ºC. Os sedimentos celulares foram ressuspensos em 50 µL de Reagente de Extração de Proteína Bacteriana B- PERII (Thermo Fisher Scientific) submetendo os DWBs selados à agitação vigorosa em vortex por 5 minutos e agitação por mais 10 minutos em temperatura ambiente. Os lisados celulares foram diluídos em 950 µL de tampão Tris (20 mM de Tris, pH 7,5, 150 mM de NaCl) e incubados durante 10 minutos antes da centrifugação (10 minutos, 4000 rpm). Os blocos de expressão contendo o extrato celular bruto foram mantidos a 4ºC até posterior utilização em investigações cinéticas de SPR.

EXEMPLO 5

TRIAGEM POR ELISA

[206] Para descobrir os melhores ligantes de Fab mutantes para análises Biacore detalhadas, foi implementado um ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) anterior. A configuração do ensaio ELISA é ilustrada na Figura 3. A troponina T cardíaca recombinante biotinilada (100 nM) foi capturada em uma placa de estreptavidina - MTP de 96 poços por 1 h em temperatura ambiente por agitação em um agitador orbital. O antígeno troponina T foi diluído em 100 µL de tampão IP (PBS, pH 7,3, 1% de BSA).

Subsequentemente, os poços foram lavados três vezes com 300 µL de tampão de lavagem 1x (NaCl 150 mM, Tween20 a 0,05%, Bronidox a 0,2%) utilizando o lavador de microplacas BioTek ELx405 Select. Após a lavagem, os extratos celulares brutos contendo os ligantes Fab anti-cTnT mutados foram diluídos 1:2 em tampão IP e transferidos para os poços capturados pela troponina T.

Novamente, os poços foram lavados por três vezes com 300 µL de tampão de lavagem 1x. O anticorpo anti-IgG humana (específico para Fab) -marcado com peroxidase (anticorpo de detecção) produzido em cabra foi usado na diluição de 1:40.000 (em tampão IP) para detectar os fragmentos Fab mutados ligados à troponina T. Os poços foram novamente lavados três vezes com 300 µL de tampão de lavagem 1x para remover o anticorpo de detecção não ligado. As microplacas foram incubadas com 100 µL de ABTS por poço por 30 minutos à temperatura ambiente. A densidade óptica foi medida com o leitor de microplacas BioTek Power wave XS ajustado para 405 nm. O Fab tipo selvagem do anticorpo anti-cTnT parental foi usado como um controle positivo.

Os primeiros hits foram identificados e o extrato celular bruto dos mesmos foi submetido à análise cinética.

EXEMPLO 6

ANÁLISES FUNCIONAIS BASEADAS EM SPR

[207] As investigações cinéticas detalhadas foram realizadas a 37ºC em um instrumento T200 da GE Healthcare. O chip sensor BIAcore CM5 serie S foi montado dentro do instrumento e foi pré-condicionado de acordo com as instruções do fabricante. O sistema tampão do instrumento foi HBS-ET (10 mM de HEPES (pH 7,4), 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e 0,05 % de Tween® 20(p/v)). O tampão de amostra foi o sistema tampão suplementado com 1 mg/ml de CMD (carboximetildextrano, Fluka). Em um exemplo de realização, um sistema de captura antianticorpo humano foi estabelecido no biossensor CM5. Um anticorpo GAHF(ab')2, (de cabra anti-F(ab')2 humano) (Código Nº: 109-005-097, lote nº 13.12.2005, Jackson Immuno Research) foi imobilizado de acordo com as instruções do fabricante utilizando química NHS/EDC. 30 µg/mL de GAHF(ab')2 em tampão acetato de sódio a 10 mM (pH 5,0) foram pré-concentrados nas células de fluxo 1, 2, 3 e 4 e imobilizados com

10.000 RU de GAHF(ab')2. O sensor foi subsequentemente saturado com etanolamina 1 M, pH 8,5.

[208] Os fragmentos de anticorpos quiméricos anti-TnT foram expressos periplasmaticamente em células de E. coli conforme descrito e foram lisados por métodos conhecidos (para obter detalhes técnicos, consulte: Andersen, D. C. & Reilly, D. E. (2004); Production technologies for monoclonal antibodies and their fragments. Curr Opin Biotechnol 15, 456-62). Os lisados foram diluídos 1:20 em tampão de amostra. Os fragmentos Fab foram capturados através de suas regiões estruturais humanizadas a partir dos lisados de expressão no biossensor a uma taxa de fluxo de 10 µL/min por 1 min seguido por uma etapa de lavagem de 2 min com tampão HBS-EP concentrado 10 vezes a 30 µL/min. O nível de captura de fragmentos Fab (CL) em unidades de resposta (RU) foi monitorado. A TnT humana recombinante (Roche, 37 kDa) foi diluída em tampão de amostra a 90 nM e uma série de concentrações foi produzida com concentração de TnT de 0 nM, 30 nM, 11 nM, 3,3 nM, 1,1 nM, 0 nM, 3,3 nM. As concentrações seriadas de analito foram de 80 µL/min para a fase de associação de 3 min e a fase de dissociação foi monitorada por 3 min.

[209] No final da fase de associação do analito, um ponto de relatório, “ligação tardia” (BL) em unidades de resposta (RU) foi monitorado.

Após cada ciclo de determinação das taxas cinéticas, o sistema de captura foi regenerado por uma injeção de 15 segundos de glicina a 10 mM, pH 1,5, seguida por duas injeções de 1 min de glicina a 10 mM, pH 1,7 a uma velocidade de fluxo de 20 µL/min.

[210] Os parâmetros cinéticos ka [1/Ms], kd [1/s], t1/2 diss. [min], KD [M] e a estequiometria de ligação (Razão molar) (para obter detalhes, consulte: Schraeml, M. & Biehl, M. (2012); Kinetic screening in the antibody development process. Methods Mol Biol 901, 171-81) do analito cTnT foram determinados para cada fragmento Fab mutante com o software Biaevaluation (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. Os parâmetros cinéticos foram correlacionados aos sítios de mutação da CDR e estão listados na Tabela 3 de acordo com suas estabilidades do complexo de antígeno (t1/2 diss).

[211] Os parâmetros cinéticos foram correlacionados com as mutações identificadas nas CDRs correspondentes. Todos os mutantes obtidos nesta triagem continham mais do que uma substituição de aminoácido. Os fragmentos Fab mutantes compreendendo substituições simples, bem como várias combinações/variações de todas as substituições identificadas na triagem foram então feitas e testadas. Todas as mutações/combinações testadas estão listadas na Tabela 2.

TABELA 2

[212] Visão geral de todos os mutantes (com as substituições de aminoácidos correspondentes) que foram interpretados e analisados Numeração de mutantes CDR1 CDR2 CDR3 1 Y34F 2 Y34F F60W 3 Y34F F60W V101Y 4 Y34F F60W Y104F 5 Y34F F60W V101Y + Y104F 6 Y34F V101Y 7 Y34F Y104F 8 Y34F V101Y + Y104F 9 Y34I 10 Y34I F60W

Numeração de mutantes CDR1 CDR2 CDR3 11 Y34I F60W V101Y 12 Y34I F60W Y104F 13 Y34I F60W V101Y + Y104F 14 Y34I V101Y 15 Y34I Y104F 16 Y34I V101Y + Y104F 17 F60W 18 V101Y 19 Y104F 20 V101Y + Y104F 21 F60W V101Y 22 F60W Y104F 23 F60W V101Y + Y104F

[213] Todos os mutantes acima foram analisados por SPR e classificados de acordo com a estabilidade do complexo de antígeno (t1/2 diss), (consulte a Tabela 3).

TABELA 3

DADOS CINÉTICOS DE FRAGMENTOS FAB DE ANTICORPO CTNT MATURADO POR

AFINIDADE Posições do Fab combinações RU de ka kd t2-diss KD Rmax

MR de CDR Fab captura 1/MS 1/s min M RU CDR1 CDR2 CDR3 12 77 1,18E+06 3,7E-04 31 3,2E-10 39 0,5 Y34I F60W Y104F V101Y + 5 76 2,4E+06 5,7E-04 20 2,3E-10 40 0,7 Y34F F60W Y104F V101Y + 8 75 2,7E+06 5,2E-04 22 2,0E-10 41 0,7 Y34F Y104F 4 71 2,7E+06 7,2E-04 16 2,7E-10 38 0,7 Y34F F60W Y104F 3 88 2,1E+06 7,9E-04 15 3,7E-10 49 0,7 Y34F F60W V101Y 7 64 2,4E+06 1,1E-03 11 4,5E-10 35 0,7 Y34F Y104F 2 101 2,2E+06 1,0E-03 11 4,6E-10 53 0,7 Y34F F60W 22 47 3,0E+06 1,1E-03 10 3,8E-10 28 0,7 F60W Y104F

Posições do Fab combinações RU de ka kd t2-diss KD Rmax

MR de CDR Fab captura 1/MS 1/s min M RU CDR1 CDR2 CDR3 19 49 2,9E+06 1,4E-03 8 4,8E-10 29 0,8 Y104F 1 105 2,3E+06 1,4E-03 8 6,1E-10 57 0,7 Y34F parental 119 2,5E+06 1,4E-03 8 5,8E-10 59 0,6 17 47 2,9E+06 1,6E-03 7 5,4E-10 27 0,7 F60W V101Y + 13 42 3,0E+06 1,9E-03 6 6,2E-10 22 0,7 Y34I F60W Y104F 9 74 2,0E+06 2,3E-03 5 1 2E-09 35 0,6 Y34I 11 59 2,2E+06 2,2E-03 5 1,0E-09 32 0,7 Y34I F60W V101Y 15 45 2,2E+06 2,3E-03 5 1,1E-09 23 0,7 Y34I Y104F V101Y + 23 42 2,8E+06 3,4E-03 3 1 2E-09 20 0,6 F60W Y104F V101Y + 20 33 3,1E+06 3,4E-03 3 1,1E-09 16 0,6 Y104F 21 42 2,7E+06 4,3E-03 3 1,6E-09 17 0,5 F60W V101Y 18 45 2,9E+06 4,7E-03 2 1,6E-09 19 0,5 V101Y V101Y + 16 35 1,7E+06 5,9E-03 2 3,4E-09 17 0,6 Y34I Y104F * Abreviações na Tabela 3: ka: constante de taxa de associação [M-1s-1], kd: constante de taxa de dissociação [s -1], KD: constante de equilíbrio de dissociação KD [M], t/2-diss: meia-vida do complexo, ln(2)/kd*60 [min], Rmax: Resposta máxima do analito [RU], MR: Razão molar = Razão de resposta máxima (Rmax) do analito.

[214] Ao analisar separadamente as substituições individuais compreendidas na combinação de anticorpos 12, ou seja, as mutações compreendidas nos números, 9, 17 e 19 (vide a Tabela 3), torna-se claro que há um efeito sinérgico dos três sítios de mutação que melhora a afinidade, estabilidade do complexo e desempenho de ensaio ECL deste anticorpo mutado. Isso também demonstra o efeito sinérgico das mutações nele compreendidas.

EXEMPLO 7

EXPRESSÃO DE ANTICORPOS QUIMÉRICOS EM CÉLULAS HEK

[215] Os anticorpos quiméricos humanos/camundongos foram obtidos de acordo com procedimentos padrão. O vetor correspondente e os processos de clonagem estão descritos em Norderhaug et al. J Immunol Methods. 12 de maio de 1997; 204 (1): 77-87.

[216] A partir de vários fragmentos Fab selecionados por SPR, foram construídos e produzidos anticorpos quiméricos murinos/humanos de comprimento total, isto é, anticorpos com domínios IgG CH1, CH2 e CH3 humanos. Os cDNAs que codificam as cadeias pesadas e leves foram obtidos a partir do clone de hibridoma 7.1 A 12.2-22 (ECACC 89060901) por RT-PCR e foram clonados em vetores separados a jusante de uma região promotora/facilitador precoce-precoce de citomegalovírus humano (CMV) e seguido por um sinal de poliadenilação BGH.

[217] A linhagem de células de rim embrionário humano FreeStyle 293-F adaptada à suspensão (Thermo Fisher Scientific) foi usada para a expressão gênica transitória (TGE) do anticorpo: As células foram transfectadas a aproximadamente 2 x 10E6 células viáveis/mL com quantidades iguais de ambos os plasmídeos de expressão (no total de 0,7 mg/L de cultura de células) complexados pelo reagente de transfecção PEIpro (Polyplus-transfection SA, Strasbourg) de acordo com as diretrizes do fabricante. Três horas após a transfecção, ácido valpróico, um inibidor de HDAC, foi adicionado (concentração final: 4 mM) a fim de aumentar a expressão. A cada dia, a cultura foi suplementada com 6% (v/v) de suplementação à base de hidrolisado de peptona de soja. Sete dias após a transfecção, o sobrenadante da cultura foi coletado por centrifugação e os anticorpos foram purificados a partir desse sobrenadante de acordo com procedimentos padrão.

EXEMPLO 8

MEDIÇÕES POR ECL

[218] Os anticorpos produzidos de acordo com o Exemplo 7 foram testados em um imunoensaio sanduíche (vide a Figura 4). Conjugados de IgG - rutênio foram gerados e usados no lugar de e em comparação com o conjugado rutenilado padrão original compreendido no ensaio Roche Elecsys genuíno, número de catálogo 05092744190 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), a fim de comparar o desempenho do Anticorpo parental anti-cTnT com os anticorpos anti-cTnT mutados. Os mAbs mutados foram conjugados com rutênio em diferentes estequiometrias de marcação. Em um exemplo de realização, a razão molar de marcação de rutênio foi de 1:10 anticorpo IgG:marcador. Os conjugados de rutênio dos anticorpos anti-cTnT variantes foram diluídos no reagente Elecsys R2 e as medições foram realizadas em um Módulo Cobas E170 usando o protocolo de ensaio para Troponina ‘Troponin T hs’ com um controle em branco (Diluent Universal, Id.

11732277122, Diluent Multi Assay, Id. 03609987170, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), Cal1 e Cal2 do kit de ensaio para Troponina T Troponin T hs CalSet (Id. 05092752190, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha) usando as especificações do ensaio para Troponina T ‘Troponin T hs’. Os resultados são fornecidos na Figura 5. Os anticorpos que compreendem as mutações presentes nas combinações números 11 e 12, respectivamente, mostram uma razão sinal/ruído melhorada em comparação com o anticorpo parental (não mutado).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA GERAR UMA BIBLIOTECA DE POLINUCLEOTÍDEOS, cada um codificando uma região estrutural (framework) e pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) adjacente de um anticorpo de interesse compreendendo uma CDR parental conhecida, em que a CDR parental é codificada por uma sequência polinucleotídica da CDR parental conhecida, cujo método é caracterizado pelo: i) fornecimento de um polinucleotídeo que codifica uma primeira região estrutural do anticorpo; ii) fornecimento de um primeiro iniciador (primer) de PCR para o polinucleotídeo de (i); iii) fornecimento de uma mistura de polinucleotídeos, cada um consistindo de elementos A-B-C; - em que: - A) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar com uma primeira região estrutural; - cada B) é um membro de uma biblioteca de polinucleotídeos compreendendo o mesmo número de códons que a sequência polinucleotídica da CDR parental, em que os membros da referida biblioteca são projetados para compreender pelo menos um códon aleatorizado; e - C) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar com uma segunda região estrutural; iv) fornecimento de um segundo iniciador de PCR para o elemento C); v) realização de uma PCR com base nos polinucleotídeos de (i) a (iv), obtendo assim a biblioteca de polinucleotídeos; - e em que tal PCR é realizada na ausência da sequência polinucleotídica da CDR parental.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela primeira região estrutural ser FW1 ou FW4, em que a referida segunda região estrutural é FW2 se a primeira for FW1, ou é FW3 se a primeira for FW4, e em que a referida CDR é CDR1 se a primeira região estrutural for FW1 ou é CDR3 se a primeira região estrutural for FW4.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela referida primeira região estrutural ser FW1, em que a referida segunda região estrutural é FW2, em que o referido primeiro iniciador é um iniciador direto para FW1 e em que o referido segundo iniciador é um iniciador reverso para FW2, e em que a referida CDR é CDR1.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela referida primeira região estrutural ser FW4, em que a referida segunda região estrutural é FW3, aqui o referido primeiro iniciador é um iniciador reverso para FW4 e em que o referido segundo iniciador é um iniciador direto para FW3, e em que a referida CDR parental é CDR3.

5. MÉTODO PARA GERAR UMA BIBLIOTECA DE POLINUCLEOTÍDEOS, cada um codificando uma região estrutural e duas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) adjacentes de um anticorpo de interesse, compreendendo uma primeira e uma segunda CDR parental conhecida, em que a primeira e a segunda CDRs parentais são codificadas pela primeira e segunda sequências de polinucleotídeos de CDRs conhecidas, cujo método é caracterizado pelo: i) fornecimento de um polinucleotídeo que codifica uma primeira região estrutural do anticorpo; ii) fornecimento de uma primeira mistura de polinucleotídeos, cada um consistindo de elementos A-B-C; - em que: - A) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar à primeira região estrutural;

- cada B) é um membro de uma biblioteca do primeiro polinucleotídeo compreendendo o mesmo número de códons que a primeira sequência polinucleotídica da CDR parental, em que os membros da referida biblioteca são projetados para compreender pelo menos um códon aleatorizado; e

- C) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar a uma segunda região estrutural;

iii) fornecimento de um primeiro iniciador de PCR para o elemento C);

iv) fornecimento de uma segunda mistura de polinucleotídeos,

cada um consistindo de elementos A’-B’-C’;

- em que:

- cada B’) é um membro de uma biblioteca do segundo polinucleotídeo compreendendo o mesmo número de códons que a segunda sequência polinucleotídica da CDR parental, em que os membros da referida biblioteca são projetados para compreender pelo menos um códon aleatorizado;

- C’) é um polinucleotídeo capaz de hibridizar com uma terceira região estrutural;

v) fornecimento de um segundo iniciador de PCR para o elemento C’);

vi) realização de uma PCR baseada nos polinucleotídeos de

(i) a (v), obtendo assim a biblioteca de polinucleotídeos; - e em que tal PCR é realizada na ausência de qualquer sequência polinucleotídica da CDR parental.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela referida primeira região estrutural ser FW2, em que a referida segunda região estrutural é FW1, em que a referida terceira região estrutural é FW3, em que a primeira CDR parental é CDR1, em que a segunda CDR parental é CDR2, em que o referido primeiro iniciador para o elemento C) é um iniciador direto para FW1, em que o referido segundo iniciador para o elemento C') é um iniciador reverso para FW3.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela referida primeira região estrutural ser FW3, em que a referida segunda região estrutural é FW2, em que a referida terceira região estrutural é FW4, em que a primeira CDR parental é CDR2, em que a segunda CDR parental é CDR3, em que o referido primeiro iniciador para o elemento C) é um iniciador direto para FW2, em que o referido segundo iniciador para o elemento C') é um iniciador reverso para FW4.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado por no elemento B) um códon ou dois códons de uma sequência de polinucleotídeos da CDR parental são aleatorizados.

9. BIBLIOTECA DE POLINUCLEOTÍDEOS, obtenível de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada por codificar uma CDR aleatorizada ou duas CDR aleatorizadas adjacentes de uma cadeia variável de um anticorpo, em que na biblioteca obtida a relação de sequência polinucleotídica parental para outras sequências polinucleotídicas (aleatorizadas) é de 1:106 ou menos no caso de uma CDR ser aleatorizada e de 1:107 ou menos no caso de duas CDRs serem aleatorizadas.

10. USO DE UMA BIBLIOTECA de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo uso ser para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos que codifica a cadeia variável de um anticorpo em que a cadeia variável é selecionada a partir de uma cadeia H variável ou uma cadeia L variável.

11. MÉTODO PARA GERAR UMA BIBLIOTECA DE POLINUCLEOTÍDEOS caracterizado por codificarem cadeias variáveis de um anticorpo pela realização de uma PCR de sobreposição com base nas bibliotecas geradas de acordo com as reivindicações 3, 4, 6 e 7.

12. BIBLIOTECA DE POLINUCLEOTÍDEOS codificantes de uma cadeia variável de um anticorpo que pode ser obtida de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela cadeia variável compreender uma CDR1 aleatorizada, uma CDR2 aleatorizada e uma CDR3 aleatorizada e em que na biblioteca obtida, a proporção da sequência polinucleotídica parental para outras sequências polinucleotídicas na biblioteca é de 1:5x10 7 ou menos.

13. MÉTODO PARA GERAR UMA BIBLIOTECA DE ANTICORPOS, caracterizado pelo anticorpo compreender uma primeira cadeia variável e uma segunda cadeia variável, em que uma biblioteca de polinucleotídeos codificantes da primeira cadeia variável do referido anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, é expressa e combinada com a segunda cadeia variável do referido anticorpo.

14. MÉTODO DE SELEÇÃO DE UM ANTICORPO que compreende uma primeira cadeia variável e uma segunda cadeia variável a partir de uma biblioteca gerada de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo anticorpo selecionado ter características de ligação melhoradas em comparação com um anticorpo parental que possui as CDRs parentais conhecidas.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo anticorpo selecionado exibir um aumento selecionado da t/2 meia-vida da dissociação do complexo de pelo menos 20% em comparação com o anticorpo parental.