CN111801351A - 抗体亲和力成熟的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种产生编码目标抗体的框架区和至少一个相邻互补性决定区（CDR）的多核苷酸的文库的新颖方法。这些文库适合用于亲和力成熟程序，以便获得与亲本抗体相比具有改进特性的成熟抗体。

Description

抗体亲和力成熟的方法
本发明涉及一种产生编码目标抗体的框架区和至少一个相邻互补性决定区（CDR）的多核苷酸的文库的新颖方法。这些文库适合用于亲和力成熟程序，以便获得与亲本抗体相比具有改善特性的成熟抗体。
在本说明书中，引用了许多文件，包括专利申请和生产商的手册。这些文件的公开内容尽管不被认为与本发明的专利性有关，但是一并通过引用整体并入。更具体地，所有参考文件通过引用并入，达到如同明确地且单独地指出每篇单独文件通过引用并入相同的程度。
抗体被广泛用于诊断和治疗应用。这已经导致在开发用于优化此类抗体的性质（例如增加对靶抗原的亲和力）的程序方面的巨大努力。由于在降低的抗体和/或抗原浓度下改善的特异性，预期增加抗体的亲和力会增强抗体的性能。已知用于体外亲和力成熟的不同方法，包括基于细胞的展示，例如酵母细胞表面展示、噬菌体展示或无细胞展示（诸如核糖体展示）。这些方法允许进行阴性和阳性选择，以消除非特异性结合剂并以高亲和力鉴定特异性结合剂。
但是，已知的亲和力成熟方法的一个缺点是大量未诱变的亲本序列在多核苷酸文库中的频繁发生，这使得改善的抗体的选择和鉴定既费时又费力。在某些情况下，甚至不可能通过亲和力成熟程序鉴定改善的抗体。本发明的发明人现在已发现一种通过提供不包含不希望的大量亲本序列的文库来克服与现有技术有关的缺点的方法。
本发明以针对心肌肌钙蛋白T (cTnT)的抗体为例，但是考虑到该方法可以转移到针对其它抗原的抗体。
心肌肌钙蛋白T是在心脏病患者中广泛使用的生物标志物。Westermann等人最近已经综述了它在心脏病患者中的效用。(Nature Reviews / Cardiology, vol 14 (2017)473-483。在怀疑患有急性心肌梗塞(AMI)的患者中，cTnT的使用已得到很好的确立，但是肌钙蛋白测量也用于其它急性和非急性场合。对于具有疑似AMI的患者，早期决策对于快速治疗和进一步诊断评价是至关重要的。
肌钙蛋白的更新高灵敏度测定法能够检测明显更低的浓度。使用这些测定法和非常低的截止浓度，已经报道了几种快速诊断策略会改善急性心脏护理中的诊断。此外，肌钙蛋白测定的非冠脉和非急性应用（例如作为具有心力衰竭、肺栓塞或稳定冠状动脉疾病的患者中的生物标志物）即将出现，并可能改善个体风险分级。
通常在夹心型免疫测定法中测量心肌肌钙蛋白T，其中至少一种抗体用于捕获cTnT，且至少第二种（经标记的）抗体用于检测样品中的cTnT。德国Roche Diagnostics公司出售的cTnT的第五代测定也是如此。由欧洲动物细胞培养物保藏中心（GB）保藏的杂交瘤克隆7.1 A 12.2-22 (ECACC 89060901)所产生的单克隆抗体12.1A11.11-7自从将近三十年来一直在cTnT的测定中被用作最佳检测抗体。自从该抗体于1989年产生以来，没有出现用于检测cTnT的更好的单克隆抗体。
在过去的几年中，已经开发了用于测量各种肌钙蛋白的更灵敏的测定法，例如基于标记在此类测定中使用的检测抗体的先进技术。
许多研究已经评价了肌钙蛋白的各种高灵敏度测定，这是由于它们改善对疑似AMI患者的分诊的潜力以及它们在临床诊断的其它领域中的实用性。
已经报道，即使最灵敏的肌钙蛋白测定也无法在一定百分比的健康个体中测量肌钙蛋白(参见例如Westermann等人, 以上)。显而易见，测定灵敏度是最重要的，例如在cTnT的检测中，并且为此目的的改善将是非常合乎需要的。
现在已经非常令人惊讶地发现，基于如本文权利要求中限定的用于亲和力成熟的新颖方法，可以选择和鉴定抗体，其携带在抗体12.1A11.11-7的互补性决定区(CDR)中的某些突变，这一方面不会对抗体与cTnT的复合物形成产生负面影响，但关于cTnT与此类突变抗体之间形成的复合物的稳定性代表了显著的改善。通过这些令人惊讶的特性，对cTnT进行超灵敏的测定是可行的。
基于本公开内容，已经成功应用于抗体12.1A11.11-7的亲和力成熟方法可以转移到不同的抗体，包括诊断和治疗抗体。
因此，本发明涉及通过进行一系列扩增反应来产生编码抗体可变链的多核苷酸的文库的新颖方法。这些多核苷酸文库可用于选择程序中以鉴定具有改善的性质（诸如增加的对靶抗原的亲和力）的抗体。
本发明的目的是产生与具有可变链的亲本抗体相比具有改善的特性的抗体，所述亲本抗体具有已知的亲本互补决定区（CDR），其中这些已知的CDR由已知的CDR多核苷酸序列编码。
在第一步中，产生多个多核苷酸文库，其编码所述亲本抗体的可变链的一个随机化CDR或所述亲本抗体的可变链的两个相邻的随机化CDR。这些文库的大小可以为约107至约1011个成员，或约108至约1010个成员，取决于CDR的各自随机化程度。
通过组合这些文库，产生了另一个多核苷酸文库。该文库的成员编码所述亲本抗体的可变链的随机化可变链，即随机化CDR1、随机化CDR2和随机化CDR3。此外，文库的成员可以编码可变链的框架区FW1、FW2、FW3和FW4，特别是亲本抗体的可变链的框架区FW1、FW2、FW3和FW4。该文库的大小可以为约106至约1022个成员，或约1011至约1013个成员，或约2x1011至5x1012个成员，取决于CDR的各自随机化程度。
本发明的多核苷酸文库基本上不含有亲本CDR多核苷酸序列。这可以通过在不存在任何亲本CDR多核苷酸序列的情况下产生文库来实现。因此，文库中包含亲本CDR多核苷酸序列的单个文库成员的量为约1: 106或更小、1:5x105或更小或1: 105或更小（对于包含一个随机化CDR多核苷酸序列的文库）、或1: 107或更小（对于包含两个随机化CDR多核苷酸序列的文库）或约1:5x107或更小、或1:108或更小（对于包含三个随机化CDR多核苷酸序列的文库）。
在一个实施方案中，将一个CDR随机化，并且所获得的文库中的亲本多核苷酸序列与其它（随机化的）多核苷酸序列的比率为1: 106或更小。在一个实施方案中，将两个CDR随机化，并且所获得的文库中的亲本多核苷酸序列与其它（随机化的）多核苷酸序列的比率为1: 107或更小。在一个实施方案中，将三个CDR随机化，并且所获得的文库中的亲本多核苷酸序列与其它多核苷酸序列的比率为1:5x107或更小。
编码随机化可变链的多核苷酸文库可以根据已知方法用于产生抗体文库。从这些抗体文库中，可以有效地选择与亲本抗体相比具有改善的特性的单个抗体。
因而，本发明的第一方面涉及一种产生多核苷酸文库的方法，所述多核苷酸各自编码目标抗体的框架区和至少一个相邻互补性决定区(CDR)，其中所述抗体包含由已知亲本CDR多核苷酸序列编码的已知亲本CDR，该方法的特征在于
i) 提供编码所述抗体的第一框架区的多核苷酸，
ii) 提供(i)的多核苷酸的第一PCR引物，
iii) 提供多核苷酸的混合物，每个多核苷酸由元件A-B-C组成，
其中
A) 是能够与第一框架区杂交的多核苷酸，
每个B)是包含与亲本CDR多核苷酸序列相同数目的密码子的多核苷酸文库的成员，其中所述文库的成员被设计为包含至少一个随机化密码子，例如一个随机化密码子或两个随机化密码子，和
C) 是能够与第二框架区杂交的多核苷酸，
iv) 提供元件C)的第二PCR引物，
v) 基于多核苷酸(i)至(iv)进行PCR，从而获得多核苷酸文库，并且其中在没有亲本CDR多核苷酸序列存在下进行这样的PCR。
根据该方面，所述第一框架区是FW1或FW4，其中如果所述第一框架区是FW1，则所述第二框架区是FW2，或如果所述第一框架区是FW4，则所述第二框架区是FW3，且其中如果所述第一框架区是FW1，则所述CDR是CDR1，或如果所述第一框架区是FW4，则所述CDR是CDR3。
因而，在一个具体实施方案中，所述第一框架区是FW1，其中所述第二框架区是FW2，其中所述第一引物是FW1的正向引物且其中所述第二引物是FW2的反向引物，且其中所述CDR是CDR1。
在该方面的另一个具体实施方案中，所述第一框架区是FW4，其中所述第二框架区是FW3，其中所述第一引物是FW4的反向引物且其中所述第二引物是FW3的正向引物，且其中所述亲本CDR是CDR3。
本发明的另一个方面涉及一种产生多核苷酸文库的方法，所述多核苷酸各自编码目标抗体的框架区和两个相邻互补性决定区(CDR)，其中所述抗体包含由第一和第二已知亲本CDR多核苷酸序列编码的已知第一和第二亲本CDR，所述方法的特征在于：
i) 提供编码所述抗体的第一框架区的多核苷酸，
ii) 提供多核苷酸的第一混合物，每个多核苷酸由元件A-B-C组成，
其中
A) 是能够与第一框架区杂交的多核苷酸，
每个B)是包含与第一亲本CDR多核苷酸序列相同数目的密码子的第一多核苷酸的文库的成员，其中所述文库的成员被设计为包含至少一个随机化密码子，例如一个随机化密码子或两个随机化密码子，和
C) 是能够与第二框架区杂交的多核苷酸，
iii) 提供元件C)的第一PCR引物，
iv) 提供多核苷酸的第二混合物，每个多核苷酸由元件A’-B’-C’组成，
其中
A’) 是能够与所述第一框架区杂交的多核苷酸，
每个B’)是包含与第二亲本CDR多核苷酸序列相同数目的密码子的第二多核苷酸文库的成员，其中所述文库的成员被设计为包含至少一个随机化密码子，例如一个随机化密码子或两个随机化密码子，和
C’) 是能够与第三框架区杂交的多核苷酸，
v) 提供元件C’)的第二PCR引物，
vi) 基于多核苷酸(i)至(v)执行PCR，从而获得多核苷酸文库，且其中在没有任何亲本CDR多核苷酸序列存在下执行这样的PCR。
在该方面的一个具体实施方案中，所述第一框架区是FW2，其中所述第二框架区是FW1，其中所述第三框架区是FW3，其中所述第一亲本CDR是CDR1，其中所述第二亲本CDR是CDR2，其中所述元件C)的第一引物是FW1的正向引物，其中所述元件C’)的第二引物是FW3的反向引物。
在该方面的另一个具体实施方案中，所述第一框架区是FW3，其中所述第二框架区是FW2，其中所述第三框架区是FW4，其中所述第一亲本CDR是CDR2，其中所述第二亲本CDR是CDR3，其中所述元件C)的第一引物是FW2的正向引物，其中所述元件C’)的第二引物是FW4的反向引物。
使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”分别表示已知的或未修饰的抗体。如在本公开内容中说明的，编码亲本抗体的多核苷酸序列的某些部分用于产生多核苷酸文库。
“亲本CDR”是已知抗体、未修饰抗体或亲本抗体的CDR-序列。“亲本CDR多核苷酸序列”是编码亲本抗体的CDR的多核苷酸序列。
本文中使用的术语“多核苷酸”包括包含多个核苷酸（经常至少约10个核苷酸）的分子，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物。在某些实施方案中，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸。
术语“能够杂交”在本领域中理解为，在适当的条件（例如温度、离子强度和温育时间的适当条件）下，单链多核苷酸与互补多核苷酸退火从而形成双链多核苷酸。根据本发明，术语“能够杂交”特别指示，在扩增反应的条件（例如如本文中所述的PCR的条件）下，单链多核苷酸与互补多核苷酸退火从而形成双链多核苷酸。适合在扩增反应（例如PCR）中链退火的条件是本领域众所周知的。
如上所述的方法包括使用由元件A-B-C或A’-B’-C’组成的多核苷酸混合物。元件B包含与待随机化的特定亲本CDR多核苷酸序列相同数目的密码子，并被设计成包含至少一个随机化密码子，例如一个随机化密码子或两个随机化密码子。在某些实施方案中，元件B包含一个随机化密码子。这些多核苷酸混合物可以根据已知方法通过化学多核苷酸合成来提供。
在某些实施方案中，元件B的混合物由多个亚集构成，所述亚集被设计为包含具有一个CDR多核苷酸序列的不同随机化密码子。因此，在CDR多核苷酸序列包含10个密码子（即30个核苷酸）的情况下，元件B的相应混合物可以由多达10个亚集构成，每个亚集被设计为包含一个不同的随机化密码子。因此，在某些实施方案中，将元件B的混合物设计为包含多个亚集，每个亚集被设计为包含一个随机化密码子或两个随机化密码子，从而涵盖CDR多核苷酸序列的所有密码子的随机化。
多核苷酸混合物A-B-C或A’-B’-C’的元件B被设计为包含至少一个随机化密码子。随机化密码子可以选自任何合适的随机化密码子，包括、但不限于NNN，其中N是指A/C/G/T，NNB，其中N是指A/C/G/T且B是指C/G/T，NNK，其中N是指A/C/G/T且K是指G/T，或NNS，其中N是指A/C/G/T且S是指C/G。在某些实施方案中，所述随机化密码子是NNK密码子。但是，应当指出，将随机化设计为不产生亲本CDR多核苷酸序列。
本发明的再另一个方面是可根据上述方法获得的多核苷酸文库，其中所述多核苷酸编码可变抗体链（例如可变H链或可变L链）的一个随机化CDR或两个随机化CDR。本发明的发明人已经发现，这样的文库基本上不含有亲本CDR多核苷酸序列。该文库可以包含编码一个随机化CDR（例如CDR1或CDR3）的多核苷酸，或编码两个相邻随机化CDR（例如CDR1和CDR2，或CDR2和CDR3）的组合的多核苷酸。这些文库可以组合，例如借助于重叠PCR或等效的扩增反应，以产生编码具有三个随机化CDR（即CDR1、CDR2和CDR3）的可变抗体链的多核苷酸文库。因此，如上所述的文库，特别是几个文库的组合，它们各自编码抗体的一个CDR或两个相邻CDR的随机化变体，可以用于产生编码抗体的可变链的随机化变体（例如随机化可变H-链或随机化可变L-链）的多核苷酸文库。在一个具体实施方案中，所述可变链是随机化可变H-链。
本发明的再另一个方面涉及一种方法，其通过基于如上所述产生的文库进行重叠PCR或等效扩增反应来产生编码抗体的可变链的多核苷酸文库。在一个实施方案中，例如，使用包含随机化CDR1的文库、包含随机化CDR1和随机化CDR2的文库、包含随机化CDR2和随机化CDR3的文库以及包含随机化CDR3的文库作为起始原料。
多核苷酸序列文库的成员是编码目标抗体的可变链的多核苷酸序列的变体，所述目标抗体具有已知的亲本CDR多核苷酸序列，特别是已知的CDR1多核苷酸序列、已知的CDR2多核苷酸序列和已知的CDR3多核苷酸序列。在某些实施方案中，该文库基本上不含有包含任何亲本CDR多核苷酸序列的多核苷酸，例如亲本CDR1多核苷酸序列、亲本CDR2多核苷酸序列和/或亲本CDR3多核苷酸序列。
因此，本发明的另一个方面涉及编码可根据如上所述的方法获得的抗体的可变链的多核苷酸文库，其中所述可变链包含随机化CDR1、随机化CDR2和随机化CDR，并且其中所述文库基本上不含有亲本CDR多核苷酸序列。
在某些实施方案中，该文库编码可变链，例如抗体的H链或抗体的L链，其中所述抗体是由已知亲本多核苷酸序列（包括已知亲本CDR1多核苷酸序列、已知亲本CDR2多核苷酸序列和已知亲本CDR3多核苷酸序列）编码的目标抗体，且其中所述文库基本上不含有该已知的亲本CDR多核苷酸序列。
本发明的再另一个方面涉及一种产生抗体文库的方法，其中所述抗体包含第一可变链和第二可变链，其中在转录/翻译系统（例如基于细胞的系统、噬菌体系统或体外系统）中表达编码如上所述的所述抗体的第一可变链的多核苷酸文库，并与所述抗体的第二可变链组合，例如通过共表达编码第二可变链的多核苷酸或通过添加第二可变链作为蛋白质。用于产生抗体文库的合适系统是本领域已知的。一个特别合适的系统是核糖体体外翻译/转录系统，例如如Stafford等人, Protein Eng Des Sel., 2014, 27 (4): 97-109中所述。
本发明的再另一个方面涉及一种从如上所述的抗体文库中选择包含第一可变链和第二可变链的抗体的方法，其中与具有已知亲本可变链（包括已知亲本CDR）的亲本抗体相比，所选择的抗体具有改善的结合特性。该方法可以包括以下步骤：
a) 在转录/翻译系统中表达编码根据本发明的抗体的第一可变链的多核苷酸文库，
b) 将所述抗体的第一可变链的表达文库与所述抗体的第二可变链组合，和
c) 选择具有改善的结合特性的包含第一可变链和第二可变链的抗体。
与在H链和L链中具有已知亲本CDR的抗体相比，所选择的抗体可以表现出改善的结合亲和力。
根据该实施方案，第一可变链和第二可变链可以选自各自包含CDR1、CDR2和CDR3的可变H链和可变L链。根据一些实施方案，第一可变链是可变H链且第二可变链是可变L链。在其它实施方案中，第一可变链是L链且第二可变链是H链。经常地，已知抗体的可变H链构成抗原结合的主要部分。在这样的情况下，可以考虑制备编码可变H链作为展示模板的多核苷酸文库，该展示模板与作为表达模板的单一种类或有限种类的可变L链组合。在一个实施方案中，将来自可变H链的多核苷酸文库与亲本可变L链组合，并选择具有改善的结合特性的抗体。
本发明涉及抗体的亲和力成熟以及根据该方法获得的抗体。抗体可以包含通过二硫键连接的两条重（H）链和两条轻（L）链。重链和轻链各自由一个恒定结构域和一个可变结构域组成。对抗原的结合特异性由形成抗体的轻链和重链的可变结构域提供。更具体地说，决定其特异性并与特定配体接触的抗体部分被称作互补性决定区(CDR)。CDR是分子的最可变部分，并且促成这些分子的多样性。每个可变结构域中有三个CDR区域CDR1、CDR2和CDR3，它们嵌入四个框架区（FW）。本文中使用的CDR-HC (或CDR(HC))描绘了可变重链的CDR区域，而CDR-LC (或CDR(LC))涉及可变轻链的CDR区域。类似地，FW-HC (或FW(HC))描绘了可变重链的框架区，而FW-LC (或FW(LC))涉及可变轻链的框架区。
根据本发明使用的术语“包括/包含”表示，除特别列举的序列和/或组分之外还可以包括其它序列/组分。但是，该术语还涵盖所要求保护的主题刚好由所列举的序列和/或组分组成。
在其中本发明的抗体包括不止所列举的氨基酸序列的那些实施方案中，其它氨基酸可以存在于N-末端或C-末端，或两者。其它序列可以包括例如引入的序列例如用于纯化或检测，如以下在本文中详细讨论的。此外，在单个序列“包括”所列举的序列的情况下，它们还可以在N-末端或C-末端或两者处包括另外的氨基酸。
根据本发明，抗体的特征在于其对靶抗原的结合特异性和/或结合亲和力。靶抗原可以包含可以针对它产生抗体的任何结构，例如肽、蛋白、碳水化合物、核酸等。抗体结合的任何分析物都可以充当靶抗原，并且与其结合的抗体可以进行本文中公开的亲和力成熟。例如，靶抗原可以是诊断程序中感兴趣的任何分析物。在某些实施方案中，靶抗原是SEQ IDNO:1的人心肌肌钙蛋白T (cTnT)。应当理解，在本发明的抗体包含另外氨基酸的情况下，如上所详述的，所述抗体一定必须特异性地结合其靶抗原，例如cTnT。
根据本发明，术语“特异性地结合”（在本文中也被称作“特异性地相互作用”）是指，该抗体仅特异性地结合其靶抗原，例如cTnT，但不会或基本上不会与不同的靶抗原（例如蛋白，特别是相似结构的不同蛋白）交叉反应。例如，特异性地结合cTnT的抗体不会与肌钙蛋白I (SEQ ID NO:33)交叉反应。
抗体的“结合亲和力”根据以下方程式测量靶抗原上的表位与抗体的结合位点之间的相互作用的强度：
Kd = kd/ka
其中：
Kd = 解离平衡常数[M]
kd = 解离速率常数[s-1]
ka = 结合速率常数[M-1 s-1]
抗体的结合亲和力的其它相关参数如下：
t/2 = 解离复合物半衰期= ln2/kd/60 [min]
Rmax = 分析物最大应答[RU]
MR: 摩尔比=分析物的最大应答(Rmax)的比率。
根据本发明，通过本发明的方法选择的抗体对其靶抗原的亲和力高于亲本抗体的亲和力。与亲本抗体相比，这种改善的亲和力可以通过至少20%的t/2增加来表达。可以进行t/2的测量，例如如实施例6中所述。
例如，在Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press和Harlow & Lane (1999) Using Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述了用于分析抗体的特异性和亲和力的相应方法。合适研究的非限制性例子是例如在结构上和/或在功能上密切相关的分子的结合研究、阻断和竞争研究。这些研究可以通过例如以下方法进行：FACS分析、流式细胞计数滴定分析(FACS滴定)、表面等离子体共振(SPR，例如用BIAcore®)、等温滴定量热法(ITC)、荧光滴定或通过放射性地标记的配体结合测定。其它方法包括例如蛋白质印迹、ELISA (包括竞争ELISA)-、RIA-、ECL-和IRMA-测试。
在本发明的上下文中，术语“抗体”涉及完整的免疫球蛋白分子及其抗原结合片段，如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv。此外，该术语涉及修饰的和/或改变的抗体分子，以及重组地或合成地产生的/合成的抗体。术语“抗体”也包含双功能抗体、三功能抗体、全人抗体、嵌合抗体和抗体构建体，如单链Fv (scFv)或抗体-融合蛋白。
本文中使用的“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不可与另一个重链分子形成二硫键。“Fab' 片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，该部分含有VH结构域和C H1结构域以及在CH1和C H2结构域之间的区域，使得可以在两个Fab' 片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab' 片段组成，它们通过两条重链之间的二硫键保持在一起。
Fab/c片段含有Fc和Fab决定簇，其中“Fc”区域含有两个重链片段，其包含抗体的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fv区域”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺乏恒定区。“单链Fv”(也缩写为“scFv”)是在本发明的上下文中具有抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成期望的结构用于抗原结合。例如Plückthun在The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, Rosenburg和Moore编.Springer-Verlag, N.Y.113 (1994), 269-315中描述了用于产生单链抗体的技术。
本文中使用的术语“全人抗体”表示仅包含人免疫球蛋白蛋白序列的抗体。尽管如此，如果在小鼠、小鼠细胞或衍生自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则全人抗体可能含有鼠碳水化合物链，或者如果在大鼠、大鼠细胞或衍生自大鼠细胞的杂交瘤中产生，则其可能含有大鼠碳水化合物链。类似地，如果在仓鼠、仓鼠细胞（例如CHO细胞）或衍生自仓鼠细胞的杂交瘤中产生，则全人抗体可能含有仓鼠碳水化合物链。另一方面，“小鼠抗体”或“鼠抗体”是仅包含小鼠(鼠)免疫球蛋白蛋白序列的抗体，而“大鼠抗体”或“兔抗体”分别是仅包含大鼠或兔免疫球蛋白序列的抗体。与全人抗体一样，如果在这样的动物或这样的动物的细胞中产生，这样的鼠、大鼠或兔抗体可能含有来自其它物种的碳水化合物链。例如，如果在仓鼠细胞（例如CHO细胞）或源自仓鼠细胞的杂交瘤中产生抗体，则抗体可以包含仓鼠碳水化合物链。全人抗体可以例如通过噬菌体展示来产生，其是广泛使用的筛选技术，其使得能够产生和筛选全人抗体。噬菌体抗体也可用于本发明的上下文中。噬菌体展示方法描述于例如US5,403,484、US 5,969,108和US 5,885,793中。能够开发全人抗体的另一项技术涉及对小鼠杂交瘤技术的改善。使小鼠转基因以包含人免疫球蛋白基因座，以交换其自身的小鼠基因(参见，例如，US 5,877,397)。
术语“嵌合抗体”表示包含人类或非人类物种的可变区的抗体，所述可变区与来自另一人类或非人类（例如，小鼠、马、兔、狗、牛、鸡）物种的抗体区域（例如，恒定区）融合或嵌合。
如上所述，术语“抗体”也包括抗体构建体，诸如抗体-融合蛋白，其中除了本文中由特定氨基酸序列定义的结构域以外，所述抗体包含一个或多个另外的结构域，例如用于分离和/或制备重组产生的构建体。
可以产生本发明的抗体，使得它是重组抗体，例如重组人抗体或杂合抗体，但仍包含本发明所公开和定义的CDR。
术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有抗体，诸如从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体, 使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、建立或分离的抗体。重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)。但是，这样的抗体可以进行体外诱变（或，当使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变），且因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列：其尽管源自人种系VH和VL序列和与人种系VH和VL序列有关，但是不可能天然存在于体内人抗体种系谱系内。
术语“杂合抗体”表示具有源自不同生物的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链结合的人重链的抗体是杂合抗体。杂合抗体的例子包括嵌合的和人源化的抗体。
根据本发明的抗体包含所述的轻链CDR和重链CDR的组合。技术人员可以不费周折地选择在其中掺入CDR的各个可变结构域的周围框架序列。例如，可以使用在下面进一步描述的框架序列或在所附实施例中采用的特定框架序列。
根据本发明，CDR可以包含具体列举的序列，或者可以在至多一个氨基酸置换上与之不同。这样，每个CDR中的一个氨基酸可以被不同的氨基酸替换。应当理解，还包括氨基酸置换存在于一条链或一种抗体的一些但不是全部CDR中。
根据本发明，术语“置换”表示氨基酸被另一种氨基酸替换。因此，氨基酸的总数保持不变。术语“置换”明确地不包括在特定位置的氨基酸的缺失和在不同位置的一个（或多个）氨基酸的引入。根据本发明，置换可以是保守的氨基酸置换或非保守的氨基酸置换。术语“保守的氨基酸置换”是本领域众所周知的，并且表示用具有相似结构和/或化学性质的不同氨基酸替换一个氨基酸。这样的相似性包括例如所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性。如果下述组之一的一种氨基酸被同一组的另一种氨基酸置换，则该氨基酸置换是保守的氨基酸置换：非极性（疏水的）氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的（碱性的）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电荷的（酸性的）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
本发明涉及特异性地结合任何靶抗原的抗体的产生，与亲本抗体相比，所述抗体表现出改善的结合特性。这通过特异性地结合心肌肌钙蛋白T的抗体的产生来举例说明，与亲本抗体12.1A11.11-7相比，所述抗体表现出改善的特性。
在一个实施方案中，特异性地结合人心肌肌钙蛋白T (SEQ ID NO:1)的抗体是具有以下特征的抗体：(i)轻链可变结构域中的CDR包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3、或其每个CDR相差至多一个氨基酸置换的变体，和(ii)重链可变结构域中的CDR包含含有SEQID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:13的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR中的至少两个选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ ID NO:9的CDR2和SEQ ID NO:12的CDR3，或其中CDR1具有SEQ ID NO:7，CDR2具有SEQ ID NO:8，且CDR3具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13，前提条件是，在SEQ ID NO:6的CDR1存在的情况下，a) CDR3既不是SEQ ID NO:11也不是SEQ ID NO:13或b)在该抗体内的CDR2和CDR3不同时分别是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。
在一个实施方案中，本发明公开了特异性地结合人心肌肌钙蛋白T (SEQ ID NO:1)的抗体，所述抗体的特征在于，所述CDR包含下述氨基酸序列：(i)在轻链可变结构域中，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和含有SEQID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和(ii)在重链可变结构域中，含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR中的至少两个选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ ID NO:9的CDR2、和SEQ ID NO:12的CDR3，或其中CDR1具有SEQ ID NO:7，CDR2具有SEQ ID NO:8，且CDR3具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13，前提条件是，在SEQ ID NO:6的CDR1存在的情况下，a) CDR3既不是SEQ ID NO:11也不是SEQ ID NO:13或b)在该抗体内的CDR2和CDR3不同时分别是SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。
此外，本发明也公开了特异性地结合人心肌肌钙蛋白T (SEQ ID NO:1)的抗体，
其中所述抗体包含由式I表示的由框架区(FW)和CDR组成的轻链可变结构域：
FW(LC)1 - CDR(LC)1 - FW(LC)2 - CDR(LC)2 - FW(LC)3 - CDR(LC)3 - FW(LC)4(式I)
和由式II表示的由FW和CDR组成的重链可变结构域：
FW(HC)1 - CDR(HC)1 - FW(HC)2 - CDR(HC)2 - FW(HC)3 - CDR(HC)3 - FW(HC)4(式II),
其中所述FW包含与其具有至少85%同一性的下述氨基酸序列或其变体：
在轻链中
FW(LC)1 SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
FW(LC)2 SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
FW(LC)3 SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
FW(LC)4 SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
和在重链中
FW(HC)1 SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
FW(HC)2 SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
FW(HC)3 SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
FW(HC)4 SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
且其中所述CDR包含下述氨基酸序列：(i)在轻链可变结构域中，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和(ii)在重链可变结构域中，含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR中的至少两个选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ ID NO:9的CDR2、和SEQ ID NO:12的CDR3，或其中CDR1具有SEQ ID NO:7，CDR2具有SEQ ID NO:8，且CDR3具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13，前提条件是，在SEQ ID NO:6的CDR1存在的情况下，a) CDR3既不是SEQ IDNO:11也不是SEQ ID NO:13或b)在该抗体内的CDR2和CDR3不同时分别是SEQ ID NO:8和SEQID NO:12，或每个CDR相差至多一个氨基酸置换的这些CDR的变体。
此外，本发明公开了抗-cTnT抗体，其包含
由式I表示的由框架区(FW)和CDR组成的轻链可变结构域：
FW(LC)1 - CDR(LC)1 - FW(LC)2 - CDR(LC)2 - FW(LC)3 - CDR(LC)3 - FW(LC)4(式I)
和由式II表示的由FW和CDR组成的重链可变结构域：
FW(HC)1 - CDR(HC)1 - FW(HC)2 - CDR(HC)2 - FW(HC)3 - CDR(HC)3 - FW(HC)4(式II),
其中所述FW包含与其具有至少85%同一性的下述氨基酸序列或其变体：
在轻链中
FW(LC)1 SEQ ID NO:14的氨基酸序列；
FW(LC)2 SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
FW(LC)3 SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
FW(LC)4 SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
和在重链中
FW(HC)1 SEQ ID NO:18的氨基酸序列；
FW(HC)2 SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
FW(HC)3 SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
FW(HC)4 SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
且其中所述CDR包含下述氨基酸序列：(i)在轻链可变结构域中，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和(ii)在重链可变结构域中，含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR中的至少两个选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ ID NO:9的CDR2、和SEQ ID NO:12的CDR3，或其中CDR1具有SEQ ID NO:7，CDR2具有SEQ ID NO:8，且CDR3具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13，前提条件是，在SEQ ID NO:6的CDR1存在的情况下，a) CDR3既不是SEQ IDNO:11也不是SEQ ID NO:13或b)在该抗体内的CDR2和CDR3不同时分别是SEQ ID NO:8和SEQID NO:12。
式I中所示的一级结构代表本发明的抗体的轻链可变结构域的组分从N末端到C末端的顺序。式II中所示的一级结构代表本发明的抗体的重链可变结构域的组分从N末端到C末端的顺序。在每种情况下，框架区(FW) 1代表相应的可变链结构域的最N端部分，而FW 4代表相应的可变链结构域的最C端部分。
如上文所定义，相应的FW和CDR序列“包含”所列举的氨基酸序列。在一个实施方案中，相应的FW和CDR序列由所述氨基酸序列组成，即本发明的抗-肌钙蛋白T抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域分别由式I和式II所示的FW和CDR组成，其中各个FW和CDR序列由所列举的氨基酸序列组成。
关于CDR及其变体，以上提供的定义和具体示例的实施方案在细节上做必要的修正后适用。
关于框架区，本文中还设想了某种程度的变异性，即，各个FW可以包含特别列举的氨基酸序列或与其具有至少85%同一性的氨基酸序列，或由它们组成。优选地，同一性为至少90%，更优选至少92.5%，更优选至少95%，甚至更优选同一性为至少98%，诸如至少99%，最优选同一性为至少99.5%。应当理解，对于不同的FW，取决于实际的序列和例如各个FW序列的长度以及其在相应可变链结构域内的位置，可以允许不同程度的序列同一性。
根据本发明，术语“%序列同一性”描述了与构成氨基酸序列的总长度的氨基酸残基的数目相比，两个或更多个比对的氨基酸序列的相同氨基酸的匹配（“命中”）的数目（或整体相对于其部分）。通过将相同残基的数目除以残基的总数并将结果乘以100来确定同一性百分比。换句话说，当在对比窗口中或在指定的区域上关于最大对应而对比和比对这些(子)序列时，如使用本领域已知的序列对比算法所测量的，或者当手工比对和目视检查时，使用比对，可以为2个或多个序列或子序列确定相同的氨基酸残基的百分比（例如，85%同一性）。
本领域技术人员知道如何确定序列之间的序列同一性百分比，例如使用算法诸如基于NCBI BLAST算法(Altschul, S.F. 等人. [1997] Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)、CLUSTALW计算机程序(Tompson, J.D. 等人. [1994] Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)或FASTA (Pearson, W.R. & Lipman, D.J. [1988] Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 85:2444-2448)的那些。在一个实施方案中，根据本发明采用NCBI BLAST算法。用于氨基酸序列的BLASTP程序使用3的词长度(W)和10的期望值(E)作为默认值。BLOSUM62评分矩阵(Henikoff, S. & Henikoff, J.G. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)使用50的比对（B），10的期望值（E），M=5，N=4，以及两条链的对比。因此，在指出%序列同一性的那些实施方案中，用NCBI BLAST程序测定的具有至少85％的序列同一性的所有氨基酸序列都落入所述实施方案的范围内。
与各个明确列举的氨基酸序列相比框架区中的上述变异程度可以归因于一个或多个氨基酸的置换、插入、添加或缺失。
上文已经定义了术语“置换”。在其中要置换超过一个氨基酸的那些情况下，每个氨基酸独立地被另一个氨基酸替换，即，对于每个被除去的氨基酸，在相同位置引入不同的氨基酸。
根据本发明，术语“插入”表示向明确列举的氨基酸序列添加一个或多个氨基酸，其中所述添加不是向多肽的N-或C-末端。
根据本发明，术语“添加”表示向多肽的N-或C-末端或两者给明确列举的氨基酸序列添加一个或多个氨基酸。
根据本发明使用的术语“缺失”表示从明确列举的氨基酸序列丢失一个或多个氨基酸。
在一个实施方案中，框架区的氨基酸序列中的变异归因于一个或多个氨基酸的置换。如上文定义的置换可以是保守的氨基酸置换或非保守的氨基酸置换。上面关于术语“置换”提供的定义和明确示例的实施方案在细节上做必要的修正后适用。在一个实施方案中，框架区中的置换是保守的氨基酸置换。
在另一个实施方案中，CDR由上面列举的特定序列（即没有任何变化）组成，并且上面列举的框架区（FW）在上面列举的特定序列内包含至多下述量的氨基酸变异：
FW(LC)1 至多3个氨基酸变异；
FW(LC)2 至多2个氨基酸变异；
FW(LC)3 至多4个氨基酸变异；
FW(LC)4 至多1个氨基酸变异；和
FW(HC)1 至多3个氨基酸变异；
FW(HC)2 至多2个氨基酸变异；
FW(HC)3 至多4个氨基酸变异；和
FW(HC)4 至多1个氨基酸变异。
在另一个实施方案中，FW中的氨基酸变异是置换。
在另一个实施方案中，存在于轻链或重链可变结构域框架区中的变异的总量为至多9个氨基酸置换，至多8个氨基酸置换，例如至多6个氨基酸置换，诸如至多4个氨基酸置换，例如至多3个氨基酸置换，诸如至多2个氨基酸置换。在另一个实施方案中，在轻链可变结构域的框架区1-4中一共或在重链可变结构域的框架区1-4中一共存在仅1个氨基酸置换。
因为在本文中被定义为FW的式I和式II的部分是形成可变链区域的框架或支架的一部分的氨基酸序列，所以在许多情况下，在所述序列内的置换，特别是以保守氨基酸置换的形式，不会影响抗-cTnT抗体的结合能力。这是因为，这些氨基酸通常不直接参与结合cTnT，并且可以设计它们对合适的替代氨基酸的置换，使得蛋白质的三维结构和折叠都不会发生改变。另一方面，这样的置换可以提供众多有益效果，例如用于改善在某些宿主中的表达或通过引入例如额外的二硫桥来稳定蛋白质。
在一个实施方案中，如上文公开的针对cTnT的单克隆抗体在37℃以10分钟或更长时间的t/2-diss结合cTnT。
本发明进一步公开了一种抗体，其包含
(i) 由氨基酸序列组成的轻链可变结构域，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链可变结构域具有至少85%同一性，和
(ii) 由氨基酸序列组成的重链可变结构域，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变结构域具有至少85%同一性，
其中所述抗体特异性地结合人心肌肌钙蛋白T且具有在37℃为10分钟或更长的t/2-diss。
本发明还公开了一种抗体，其包含
(i) 由氨基酸序列组成的轻链可变结构域，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链可变结构域具有至少85%同一性，和
(ii) 选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的氨基酸序列的重链可变结构域，
其中所述CDR包含下述氨基酸序列：(i)在轻链可变结构域中，含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，和(ii)在重链可变结构域中，含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR中的至少两个选自SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的CDR1、SEQ ID NO:9的CDR2、和SEQ ID NO:12的CDR3，或其中CDR1具有SEQ ID NO:7，CDR2具有SEQ ID NO:8，且CDR3具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13，前提条件是，在SEQ ID NO:6的CDR1存在的情况下，a) CDR3既不是SEQ IDNO:11也不是SEQ ID NO:13或b)在该抗体内的CDR2和CDR3不同时分别是SEQ ID NO:8和SEQID NO:12，
且其中所述抗体特异性地结合人心肌肌钙蛋白T且具有在37℃为10分钟或更长的t/2-diss。
在一个实施方案中，本公开内容涉及一种抗体，其包含
(i) 由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链可变结构域，和
(ii) 由选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的氨基酸序列的氨基酸序列组成的重链可变结构域。
以上关于本发明的抗-cTnT抗体在本文中提供的所有定义和具体例举的实施方案，特别是所引用的变异程度和类型在细节上做必要的修正后适用。
根据本发明，提供了新颖的抗体，例如新颖的抗-cTnT抗体，其对它们各自的靶抗原（例如cTnT）具有改善的结合特性（更好的KD值），且因此使得能够与以前的测定相比以优良灵敏度检测靶抗原，例如cTnT。术语“KD”表示平衡解离常数（平衡结合常数的倒数），并且根据本领域提供的定义在本文中使用。用于确定KD值的手段和方法在下面简要给出，并在给出的实施例中详细描述。
最好通过实时的基于生物传感器的分子相互作用测量（如表面等离子体共振光谱法）来确定抗体（例如，抗-cTnT抗体）的结合特性，Biacore技术已成为其同义词。实验细节在实施例5中给出，动力学数据在表3中给出。例如，在表3中标记为组合“12”的抗体具有改善的与cTnT的结合特性，即1.18E+06 1/Ms的缔合常数(ka)；3.7 E-04的解离常数(kd)（转换成解离半衰期为约31 min，因此总亲和常数(KD)为3.2E-10 M。
基于这些结果，本发明令人惊讶地公开和要求保护的突变抗体一方面不会不利地影响抗体与cTnT的复合物形成，它们的Ka都在与亲本抗体相同的范围内。另一方面，可以实现转化为更好的KD值的在cTnT之间形成的复合物的稳定性的显著改善。
在一个实施方案中，如上文公开的根据本发明的单克隆抗体在37℃以10分钟或更长时间的t/2-diss结合cTnT。
通常，较低的KD值对应于较高的或改善的亲和力，如本领域众所周知的。在一个实施方案中，突变体抗-cTnT抗体具有结合亲和力，其等于或低于具有5.8 E-10 M的KD的亲本抗体的KD。
上面列举的可变轻链和重链区域的序列是在所附实施例中已经采用的氨基酸序列。
本发明进一步涉及一种核酸分子，其编码上文定义的本发明的任何一种抗体的轻链可变区。该核酸分子在本文中被称作本发明的第一核酸分子。此外，本发明也涉及一种核酸分子，其编码上文定义的本发明的任何一种抗体的重链可变区。该核酸分子在本文中被称作本发明的第二核酸分子。
根据本发明，术语“核酸分子”（在本文中也被称作核酸序列或多核苷酸）包括DNA，诸如cDNA或基因组DNA。
本发明的核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调节元件和/或与其它氨基酸编码序列的连接，可以使用已确立的方法进行，诸如限制酶切消化、连接和分子克隆。
根据本发明，本发明的第一核酸分子编码轻链可变区：
(i) 其包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3；
(ii) 其由如上文定义的式I的氨基酸序列组成；或者
(iii) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成的轻链可变结构域具有至少85%同一性。
类似地，本发明的第二核酸分子编码重链可变区：
(i) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(ii) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(iii) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(iv) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(v) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(vi) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(vii) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(viii) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(ix) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(x) 其包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR2含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体，所述CDR3含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列或其相差至多一个氨基酸置换的变体；
(xi) 其由如上文定义的式II的氨基酸序列组成；
(xii) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；
(xiii) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；或者
(xiv) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；
(xv) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；
(xvi) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；或者
(xvii) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:28的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；
(xviii) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；
(xix) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；
(xx) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:31的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性；或者
(xxi) 其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成的重链可变结构域具有至少85%同一性。
本发明进一步涉及一种载体，其包含本发明的第一核酸分子，即编码上文定义的本发明的任何一种抗体的轻链可变区的核酸分子。本发明进一步涉及一种载体，其包含本发明的第二核酸分子，即编码上文定义的本发明的任何一种抗体的重链可变区的核酸分子。这样的载体在本文中也被称作“本发明的各种载体”。
分子生物学领域的技术人员已知许多合适的载体，其选择取决于期望的功能。载体的非限制性例子包括质粒、粘粒、病毒、细菌噬菌体和其它常规用于例如基因工程的的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建各种质粒和载体；参见，例如，在Sambrook等人(在上述引文中)和Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.(1989), (1994)中描述的技术。
在一个实施方案中，所述载体是表达载体。根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达，并因此提供由此编码的本发明的抗-肌钙蛋白T抗体的结构域的可变链结构域在所选宿主中的表达。在另一个实施方案中，所述载体包含另外的序列以确保不仅表达本发明的所述可变链结构域，而且表达包含本发明的所述可变链结构域的全长IgG抗体。
表达载体可以例如是克隆载体、二元载体或整合载体。表达包括核酸分子的转录，例如转录成可翻译的mRNA。在一个实施方案中，所述载体是用于瞬时重组表达单克隆兔抗体的重链和/或轻链的真核表达质粒。这样的载体已被专门开发用于抗体表达，而且还通过例如真核细胞例如HEK 293或其衍生物或CHO细胞的瞬时转染来生产抗体。
载体的非限制性例子包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript (Stratagene)、pET-系列的表达载体(Novagen)或pCRTOPO (Invitrogen)、λ gt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a)载体系统、pREP (Invitrogen)、pCEP4 (Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1 (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3 (Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1 (GIBCO BRL)、pGEMHE (Promega)、pLXIN、pSIR (Clontech)、pIRES-EGFP (Clontech)、pEAK-10 (EdgeBiosystems) pTriEx-Hygro (Novagen)和pCINeo (Promega)。适合用于巴斯德毕赤酵母的质粒载体的非限制性例子包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K (都来自Invitrogen)。适合用于在爪蟾胚胎、斑马鱼胚胎以及多种哺乳动物和禽细胞中表达蛋白的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。
通常，载体可以含有一个或多个用于克隆或表达的复制起点(ori)和遗传系统，一个或多个用于在宿主中选择的标志物（例如，抗生素抗性），和一个或多个表达盒。另外，可以使用已确立的方法将载体中包含的编码序列与转录调节元件和/或与其它氨基酸编码序列连接。这样的调节序列是本领域技术人员众所周知的，并且包括、但不限于，确保转录起始的调节序列、内核糖体进入位点(IRES) (Owens, G.C. 等人. [2001] Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 98:1471-1476)和任选的确保转录终止和转录物稳定的调节元件。确保转录起始的这种调节元件的非限制性例子包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调节元件，它们被包括在本发明的核酸分子的下游。其它例子包括Kozak序列和侧接用于RNA剪接的供体和受体位点的插入序列，编码分泌信号的核苷酸序列，或取决于所用的表达系统，能够将表达的蛋白质引导至细胞区室或培养基的信号序列。所述载体还可以含有额外的可表达的多核苷酸，其编码一种或多种伴侣蛋白以促进正确的蛋白折叠。
合适的复制起点的其它例子包括，例如，全长ColE1、截短的ColEI、SV40病毒和M13复制起点，而合适的启动子的其它例子包括、但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、lacZ启动子、四环素启动子/操纵基因(tetp/o)、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG-启动子(鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒立即早期增强子的组合)、gai10启动子、人延伸因子1α-启动子、AOX1启动子、GAL1启动子CaM-激酶启动子、lac、trp或tac启动子、T7或T5启动子、lacUV5启动子、苜蓿银纹夜蛾（Autographa californica）多核型多角体病毒(AcMNPV)多面体启动子或哺乳动物和其它动物细胞中的珠蛋白内含子。增强子的一个例子是例如SV40-增强子。确保转录终止的调节元件的非限制性其它例子包括SV40-聚腺苷酸位点、tk-聚腺苷酸位点、不依赖ρ的lpp终止子或AcMNPV多面体多腺苷酸化信号。选择标记的其它非限制性例子包括：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Reiss, PlantPhysiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149)，npt，其赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素的抗性(Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995)，和hygro，其赋予对潮霉素的抗性（Marsh, Gene 32 (1984), 481-485）。已经描述了另外的选择基因，即trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇（histinol）代替组氨酸(Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047)；甘露糖-6-磷酸异构酶，其允许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)，和ODC（鸟氨酸脱羧酶），其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性(McConlogue, 1987，见：CurrentCommunications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.)或赋予对杀稻瘟素S的抗性的来自土曲霉（Aspergillus terreus）的脱氨酶(Tamura, Biosci.Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338)。
在另一个实施方案中，所述载体是真核表达质粒，其含有由包括内含子A的5' CMV启动子和3' BGH多腺苷酸化序列组成的表达盒。除所述表达盒以外，质粒还可以含有pUC18-衍生的复制起点和赋予氨苄西林抗性的β-内酰胺酶基因，所述氨苄西林抗性用于在大肠杆菌（E. coli）中的质粒扩增。为了分泌抗体，可以将真核前导序列克隆到抗体基因的5'。
合适的细菌表达宿主包含例如衍生自JM83、W3110、KS272、TG1、K12、BL21 (诸如BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS、BL21(DE3)RIL、BL21(DE3)PRARE)或Rosettaâ的菌株。关于载体修饰、PCR扩增和连接技术，参见Sambrook & Russel [2001] (Cold Spring HarborLaboratory, NY)。
可以设计本发明的核酸分子和/或载体以通过例如基于化学的方法（聚乙烯亚胺、磷酸钙、脂质体、DEAE-葡聚糖、核转染）、非化学方法（电穿孔、声致穿孔、光转染（opticaltransfection）、基因电转移、流体动力学递送或细胞与本发明的核酸分子接触时自然发生的转化）、基于颗粒的方法（基因枪、磁转染、穿刺转染）、基于噬菌体载体的方法和病毒方法引入细胞。例如，衍生自病毒诸如逆转录病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、西门利克森林病毒或牛乳头状瘤病毒的表达载体可用于将核酸分子递送进靶向的细胞群体中。另外，杆状病毒系统也可以用作本发明的核酸分子的真核表达系统中的载体。在一个实施方案中，本发明的核酸分子和/或载体被设计用于通过磷酸钙转化化学感受态大肠杆菌和/或用于通过聚乙烯亚胺-或脂质体-转染瞬时转染HEK293和CHO。
本发明进一步涉及一种载体，其包含：
(i) 核酸分子，其编码根据上文定义的选项(i)的轻链可变结构域和根据上文定义的选项(i)的重链可变结构域；
(ii) 核酸分子，其编码根据上文定义的选项(ii)的轻链可变结构域和根据上文定义的选项(ii)的重链可变结构域；或者
(iii) 核酸分子，其编码根据上文定义的选项(iii)的轻链可变结构域和根据上文定义的选项(iii)的重链可变结构域。
在一个实施方案中，所述载体是表达载体。
以上关于本发明的载体、特别是载体类型或调节序列在本文中提供的所有定义和具体例举的实施方案在细节上做必要的修正后适用。载体的该第二类型涉及一种载体，其包含至少两个核酸分子，即编码轻链可变结构域的一个核酸分子和编码重链可变结构域的一个核酸分子。如从上述组合可明显看出的，轻链可变结构域和重链可变结构域在载体中组合，使得能够表达本发明的功能性抗-cTnT抗体。载体的该第二类型在本文中也被称作“本发明的组合载体”。
本发明进一步涉及一种宿主细胞或非人宿主，其包含：
(i) 本发明的组合载体；或者
(ii) 包含本发明的第一核酸分子（即编码根据本发明的轻链可变区的核酸分子）的本发明的单一载体，和包含本发明的第二核酸分子（即编码本发明的重链可变区的核酸分子）的本发明的单一载体，其中这两种载体包含编码在以上选项(i)至(iii)中所定义的匹配轻链和重链可变区的核酸分子。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。术语“原核生物”意欲包括可用DNA或DNA或RNA分子转化、转导或转染以表达本发明的蛋白的所有细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性细菌以及革兰氏阳性细菌，例如，大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、棒杆菌属（Corynebacterium）（谷氨酸棒杆菌（glutamicum））、假单胞菌属（Pseudomonas）（荧光假单胞菌（fluorescens））、乳杆菌属（Lactobacillus）、链霉菌属（Streptomyces）、沙门氏菌属（Salmonella）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
术语“真核”意欲包括酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。通常的哺乳动物宿主细胞包括Hela、HEK293、H9、Per.C6和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3、NS/0、SP2/0和C127细胞、COS细胞，例如COS 1或COS 7、CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞、小鼠肉瘤细胞、Bowes黑素瘤细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。根据本发明的示例性哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。其它合适的真核宿主细胞包括、但不限于，鸡细胞，例如DT40细胞，或酵母，诸如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）。适合用于表达的昆虫细胞是例如果蝇属（Drosophila）S2，果蝇属Kc，灰翅夜蛾属（Spodoptera）Sf9和Sf21或粉夜蛾属（Trichoplusia）Hi5细胞。合适的斑马鱼细胞系包括、但不限于ZFL、SJD或ZF4。
所描述的载体可以整合进宿主的基因组中，或者可以维持在染色体外。一旦载体已经整合进合适的宿主中，就将宿主维持在适合于核酸分子的高水平表达的条件下，并且如所期望的，可以接着进行本发明的抗体的收集和纯化。对于上述宿主细胞而言适当的培养基和条件是本领域已知的。
在一个实施方案中，所述宿主是哺乳动物细胞，诸如人细胞或人细胞系。在另一个实施方案中，用本发明的载体转化的宿主细胞是HEK293或CHO。在另一个实施方案中，用本发明的载体转化的宿主细胞是CHO。在本领域中已经描述了这些宿主细胞以及适合的培养基和细胞培养条件，参见例如Baldi L. 等人, Biotechnol Prog. 2005年1-2月; 21(1):148-53, Girard P. 等人, Cytotechnology. 2002年1月; 38(1-3):15-21和Stettler M.等人, Biotechnol Prog. 2007年11-12月; 23(6):1340-6。
关于根据本发明的术语“包含……的载体”，应当理解，载体中存在其它核酸序列，其对于宿主细胞产生本发明的抗-cTnT抗体而言是必需的和/或足够的。这样的其它核酸序列是例如编码轻链的剩余部分的核酸序列以及编码重链的剩余部分的核酸序列。
根据本发明，宿主细胞或非人宿主包含编码如上文所定义的轻链和重链可变区的一种载体，或其包含两种单独的载体，其中一种载体携带编码根据本发明的轻链可变区的核酸分子，且第二载体携带编码根据本发明的匹配重链可变区的核酸分子。因此，在第一载体携带编码根据上文选项(i)的轻链可变区的核酸分子的场合，第二载体携带编码也根据上文选项(i)的重链可变区的核酸分子。上述情况在细节上做必要的修正后适用于选项(ii)和(iii)。
因此，在每种情况下，需要在一个抗体分子中存在的那些核酸分子的表达彼此关联，以确保产生由上文所述的结合能力组成的本发明的抗体。
根据这个实施方案的宿主细胞可以例如被应用于产生大量本发明的抗体。通过将上述载体引入宿主中产生所述宿主细胞。所述载体在宿主中的存在然后介导编码本发明的抗体的上述轻链可变结构域和重链可变结构域的核酸分子的表达。如上文所述的，本发明的载体可以包含使得能够表达全长IgG抗体的其它序列，从而导致宿主细胞产生全长IgG抗体，其中所述抗体的特征在于根据本发明的可变轻链和/或重链结构域的存在。
本发明进一步涉及一种产生如上所述得到的抗体（例如特异性地结合SEQ ID NO:1的cTnT的抗体）的方法，所述方法包括在适合的条件下培养本发明的宿主细胞和分离产生的抗体。
根据该实施方案，存在于本发明的宿主中的载体是表达载体，或所述载体介导本发明的核酸分子以确保其表达的方式稳定整合进宿主细胞的基因组中。用于选择已经向其中成功地引入了编码本发明的抗-cTnT抗体的相应轻链和重链结构域的核酸分子从而使得确保抗体表达的宿主细胞的手段和方法是本领域众所周知的且已经被描述(Browne,S.M.& Al-Rubeai, M.[2007] Trends Biotechnol.25:425-432; Matasci, M等人.[2008]Drug Discov.Today: Technol.5:e37-e42; Wurm, F.M.[2004] Nat.Biotechnol.22:1393-1398)。
用于培养原核或真核宿主细胞的合适条件是本领域技术人员众所周知的。例如，细菌例如大肠杆菌可以在Luria Bertani（LB）培养基中通气培养，一般在4至约37℃的温度。为了增加表达产物的收率和可溶性，可以用已知会增强或促进二者的合适添加剂缓冲或补充所述培养基。在诱导型启动子控制存在于宿主细胞内的载体中的本发明核酸分子的那些情况下，通过添加适当的诱导剂（例如失水四环素）可以诱导多肽的表达。在本领域中已经描述了合适的表达方案和策略(例如在Dyson, M.R., 等人(2004). BMCBiotechnol.4, 32-49中和在Baldi, L.等人(2007). Biotechnol.Lett.29, 677-684中)，并且可以适应特定宿主细胞的需要和要表达的蛋白质的要求（如果需要的话）。
取决于细胞类型和它的具体要求，哺乳动物细胞培养可以例如在含有10%(v/v)FCS、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/ml青霉素/链霉素的RPMI、Williams’E或DMEM培养基中进行。对于DT40鸡细胞，可以将细胞保持在例如37℃或41℃，在5%CO2、水饱和的气氛中。
用于昆虫细胞培养的合适培养基是例如TNM + 10%FCS、SF900或HyClone SFX-Insect培养基。昆虫细胞通常在27℃作为黏附或悬浮培养物生长。
用于真核或脊椎动物细胞的合适表达方案是技术人员众所周知的，并且可以例如从Sambrook, J & Russel, D.W. [2001] (Cold Spring Harbor Laboratory, NY)查找。
在一个实施方案中，使用哺乳动物细胞，例如CHO或HEK293细胞，进行所述方法。在另一个实施方案中，使用CHO细胞进行所述方法。
取决于在重组生产程序中采用的宿主，表达的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的。在一个实施方案中，使用含有本发明抗体的编码序列和与其遗传融合的N-端FLAG-标签和/或C-端His-标签的质粒或病毒。在另一个实施方案中，所述FLAG-标签的长度为约4-8个氨基酸，例如刚好8个氨基酸。使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术，可以将上述载体用于转化或转染宿主。此外，用于制备融合的、可操作地连接的基因并在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法是本领域众所周知的(Sambrook, 在上述引文中)。
转化的宿主可以根据本领域已知的技术在生物反应器中生长和培养以实现最佳的细胞生长。然后可以从生长培养基中分离本发明的抗体。本发明的例如微生物表达的抗体的分离和纯化可以通过任何常规方式进行，例如，亲和色谱法(例如使用融合-标签诸如Strep-标签II或His6标签)、凝胶过滤(尺寸排阻色谱法)、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、高压液相色谱法(HPLC)、反相HPLC或免疫沉淀。这些方法是本领域众所周知的，并且已被普遍地描述于例如Sambrook, J & Russel, D.W. [2001](Cold Spring Harbor Laboratory, NY)中。
应当理解，根据本发明，术语“分离产生的抗体”表示分离抗体，例如本发明的抗-cTnT抗体。
本发明进一步涉及一种组合物，其包含以下至少一种：
（i）本发明的抗体，
（ii）本发明的核酸分子，
（iii）本发明的载体，
（iv）本发明的宿主细胞，和/或
（v）通过本发明的方法产生的抗体。
根据本发明使用的术语“组合物”是指包含列举的化合物中的至少一种的组合物。它可以任选地包含其它分子，所述其它分子能够改变本发明的化合物的特征，例如，稳定、调节和/或增强它们的功能。所述组合物可以呈固体或液体形式，且可以尤其是呈粉末、片剂或溶液的形式。
所述组合物的组分可以包装在一个容器或多个容器（例如密封的安瓿或管形瓶）中，作为水溶液或作为用于重构的低压冻干制剂。作为低压冻干制剂的一个例子，在10-ml管形瓶中填充5 ml的1%(w/v)或10%(w/v)水溶液，且将所得混合物低压冻干。通过使用例如用于治疗用途的注射用水或用于诊断目的的另一种所期望的溶剂（例如缓冲液）重构低压冻干的化合物，制备供使用的溶液。也可以存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
所述组合物的各种组分可以包装为具有使用说明书的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明的组合物是使技术人员能够进行本领域众所周知的体外或离体方法（例如诸如免疫测定的方法）的组合物。
可以利用本发明的抗体的免疫测定的例子是直接或间接形式的免疫测定。这样的免疫测定的例子是酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光的检测的免疫测定。
在下文中，以心肌肌钙蛋白T的检测为例来说明本发明。应当指出，针对其它靶抗原的本发明的抗体可以相应地用于改善的测定中。
分别通过例如US 6,333,397和US 6,376,206所公开的夹心免疫测定法最好地检测心肌肌钙蛋白T (cTnT)，并且基本上在随后的用于测定cTnT的所有测定世代中都得到了证实。在第五代cTnT-测定中，德国Roche Diagnostics出售的cTnT高灵敏度测定(hs-cTnT)仍然采用了夹心免疫测定原理。此测定法是高灵敏度测定法，因为它可以以5ng/ml的检测下限(LOD)检测cTnT。尽管总体上非常短的温育时间分别为9或18分钟（取决于所使用的检测方案），但是仍达到该好的LOD。在该测定中，形成了包含生物素化的捕获抗体和钌基化的检测抗体的三明治。该复合物与抗生蛋白链菌素包被的磁珠结合，未结合的物质被洗掉。熟练的技术人员显而易见，如果Kd不突出，则它是非常关键的，因为会发生一些离解并导致信号减小，这直接转化为降低的LOD。
熟练的技术人员显而易见，在检测cTnT的方法中使用根据本发明的抗体将是有利的。
在一个实施方案中，本公开内容涉及一种检测样品中的cTnT的方法，所述方法包括下述步骤：a）在足以形成抗-cTnT抗体/cTnT复合物的时间和条件下使该样品与根据本公开内容的抗-cTnT抗体接触；和b）测量抗-cTnT抗体/cTnT复合物，其中该复合物的量指示样品中cTnT的浓度。使用术语“/”例如在“抗-cTnT抗体/cTnT复合物”中来指示，在作为一方面的抗-cTnT抗体和作为另一方面的cTnT之间形成非共价复合物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种检测样品中的cTnT的方法，所述方法包括下述步骤: a）在足以形成第一抗-cTnT抗体/cTnT/第二抗-cTnT抗体复合物的时间和条件下使样品与针对cTnT的第一抗体和针对cTnT的第二抗体接触，其中所述第二抗体被可检测地标记；和b）测量在(a)中形成的复合物，其中该复合物的量指示样品中cTnT的浓度，并且其中第一或第二抗体是根据本发明的抗体。
熟练的技术人员显而易见，可以在足以形成第一抗-cTnT抗体/cTnT/第二抗-cTnT抗体复合物的时间和条件下使样品以任何期望的顺序与第一抗体和第二抗体接触，即先接触第一抗体，再接触第二抗体；第二抗体早于第一抗体；或同时。
熟练的技术人员容易理解，仅通过例行实验来确定适合或足以在特异性抗cTnT抗体和cTnT抗原/分析物之间形成复合物(=抗-cTnT抗体/cTnT复合物)或者形成包含针对cTnT的第一抗体、cTnT (分析物)和第二抗-cTnT抗体复合物的第二或夹心复合物(=第一抗-cTnT抗体/cTnT/第二抗-cTnT抗体复合物)的时间和条件。
抗-cTnT抗体/cTnT复合物的检测可以通过任何适当的手段进行。本领域技术人员绝对熟悉这样的手段/方法。
术语“样品”或“目标样品”或“测试样品”在本文中可互换地使用。所述样品是体外样品，其将在体外进行分析，且不转移回体内。样品的例子包括、但不限于流体样品，诸如血液、血清、血浆、滑液、尿、唾液和淋巴液，或固体样品，诸如组织提取物、软骨、骨、滑膜和结缔组织。在一个实施方案中，所述样品选自血液、血清、血浆、滑液和尿。在一个实施方案中，所述样品选自血液、血清和血浆。在一个实施方案中，所述样品是血清或血浆。
本文中使用的术语“参考样品”表示以与目标样品基本相同的方式进行分析并且将其信息与目标样品的信息进行对比的样品。因此，参考样品提供了一种标准，其允许评价从目标样品获得的信息。参考样品可以衍生自健康的或正常的组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的健康状态的标准。正常参考样品的状态与目标样品的状态之间的差异可能指示疾病发展的风险或这样的疾病或病症的存在或进一步进展。参考样品可以衍生自异常的或患病的组织、器官或个体，从而提供组织、器官或个体的患病状态的标准。异常参考样品的状态与目标样品的状态之间的差异可能指示疾病发展的低风险或这种疾病或病症的不存在或改善。
术语“升高的”或“增加的”指示剂水平表示样品中的这种指示剂的水平与参考或参考样品中这种指示剂的水平相比更高。例如，与未患有所述疾病的个体的相同流体样品相比，在患有给定疾病的一个个体的流体样品中以更高的量可检测的蛋白质具有升高的水平。
在某些实施方案中，形成包含针对cTnT的第一抗体、cTnT (分析物)和针对cTnT的第二抗体的三明治，其中所述第二抗体被检测地标记。
通常可以分为以下类别的众多标记（也被称作染料）是可利用的，它们一起以及它们的每一种代表根据本公开内容的实施方案：
(a) 荧光染料
例如Briggs等人“Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyes and TheirCoupling to Amines and Amino Acids,”J.Chem.Soc., Perkin-Trans.1 (1997) 1051-1058)描述了荧光染料。
荧光标记或荧光团包括稀土螯合物(铕螯合物)，荧光素类型标记，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类型标记，包括TAMRA；丹磺酰基；丽丝胺；花菁；藻红蛋白；德克萨斯红；及其类似物。荧光标记可以使用本文公开的技术缀合至在靶分子中包含的醛基。荧光染料和荧光标记试剂包括可从Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oregon,USA)和Pierce Biotechnology, Inc.(Rockford, Ill.)商购获得的那些。
(b) 发光染料
发光染料或标记可以进一步细分为化学发光的和电化学发光的染料。
致化学发光的标记的不同类别包括鲁米诺、吖啶鎓化合物、腔肠素和类似物、二氧杂环丁烷、基于过氧草酸的系统及其衍生物。对于免疫诊断程序，主要使用基于吖啶鎓的标记（详细综述在Dodeigne C. 等人, Talanta 51 (2000) 415-439中给出）。
用作电化学发光标记的具有较重要关系的标记分别是基于钌和铱的电化学发光复合物。电化学发光（ECL）作为高灵敏度和选择性的方法在分析应用中被证明是非常有用的。它组合了化学发光分析（不存在背景光信号）的分析优点和通过施加电极电位对反应的容易控制。通常，将在液相或液-固界面中用TPA (三丙胺)再生的钌复合物，尤其是[Ru(Bpy)3]2+（其在~620 nm释放光子）用作ECL-标记。最近，还已经描述了基于铱的ECL-标记(WO2012107419(A1))。
(c) 放射性标记利用放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。
(d) 适合作为用于成像和治疗目的的标记的金属螯合物复合物是本领域众所周知的(US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990;US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US 5,834,456; Hnatowich等人, J.Immunol.Methods 65 (1983) 147-157; Meares等人,Anal.Biochem.142 (1984) 68-78; Mirzadeh等人, Bioconjugate Chem.1 (1990) 59-65; Meares等人, J.Cancer (1990), Suppl.10:21-26; Izard等人, BioconjugateChem.3 (1992) 346-350; Nikula等人, Nucl.Med.Biol.22 (1995) 387-90; Camera等人, Nucl.Med.Biol.20 (1993) 955-62; Kukis等人, J.Nucl.Med.39 (1998) 2105-2110; Verel等人, J.Nucl.Med.44 (2003) 1663-1670; Camera等人, J.Nucl.Med.21(1994) 640-646; Ruegg等人, Cancer Res.50 (1990) 4221-4226; Verel等人,J.Nucl.Med.44 (2003) 1663-1670; Lee等人, Cancer Res.61 (2001) 4474-4482;Mitchell, 等人, J.Nucl.Med.44 (2003) 1105-1112; Kobayashi等人BioconjugateChem.10 (1999) 103-111; Miederer等人, J.Nucl.Med.45 (2004) 129-137; DeNardo等人, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend等人, Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula等人J.Nucl.Med.40 (1999) 166-76; Kobayashi等人, J.Nucl.Med.39 (1998) 829-36; Mardirossian等人,Nucl.Med.Biol.20 (1993) 65-74; Roselli等人, Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20)。
在一个实施方案中，将形成包含针对cTnT的第一抗体、cTnT (分析物)和针对cTnT的第二抗体的三明治，其中所述第二抗体被可检测地标记，并且其中第一抗-cTnT抗体能够结合固相或结合至固相。
在一个实施方案中，本发明公开的抗-cTnT抗体用于免疫测定中以测量cTnT。在一个实施方案中，上文公开的抗-cTnT抗体用于夹心型免疫测定中。在一个实施方案中，本发明公开的抗-cTnT抗体被用作检测抗体。在一个实施方案中，本文公开的抗-cTnT抗体被发光染料（尤其是化学发光染料或电化学发光染料）可检测地标记。
本发明的描述和实施例公开并涵盖了这些和其它实施方案。使用例如电子设备，可以从公共图书馆和数据库中检索与根据本发明要使用的方法、用途和化合物中的任一种有关的其它文献。例如，可以利用在因特网上可得到的公共数据库“Medline”，例如在万维网中在ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html下。本领域技术人员已知在万维网中可得到的其它数据库和地址，诸如ncbi.nlm.nih.gov/、fmi.ch/biology/research_tools.html、tigr.org/或infobiogen.fr/，并且也可以使用万维网中的地址在lycos.com下获得。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以专利说明书（包括定义）为准。
如在本领域中通常进行的，本文提供的所有氨基酸序列的呈现均从最N-末端残基开始并以最C-末端残基(N→C)结束，并且贯穿本发明用来鉴定氨基酸的的单字母或三字母代码缩写对应于通常用于氨基酸的那些。
关于在本说明书中、特别是在权利要求中表征的实施方案，在从属权利要求中提及的每个实施方案意图与所述从属权利要求所依附的每个权利要求(独立或从属权利要求)的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1叙述3个替代方案A、B和C、从属权利要求2叙述3个替代方案D、E和F、且权利要求3依赖于权利要求1和2并叙述3个替代方案G、H和I的情况下，应当理解，说明书明白地公开了与以下组合对应的实施方案：A、D、G；A，D，H；A，D，I；A，E，G；A，E，H；A，E，I；A，F，G；A，F，H；A，F，I；B，D，G；B，D，H；B，D，I；B，E，G；B，E，H；B，E，I；B，F，G；B，F，H；B，F，I；C，D，G；C，D，H；C，D，I；C，E，G；C，E，H；C，E，I；C，F，G；C，F，H；C，F，I，除非另外特别提及。
类似地，且也在独立权利要求和/或从属权利要求没有叙述替代方案的那些情况下，应当理解，如果从属权利要求回引多个前述权利要求，由其覆盖的主题的任意组合被视作明确地公开。例如，在独立权利要求1、从属权利要求2回引权利要求1且从属权利要求3回引权利要求2和1二者的情况下，权利要求3和1的主题的组合被清楚地且明白地公开，权利要求3、2和1的主题的组合也是如此。在引用权利要求1-3中的任一项的另一个从属权利要求4存在的情况下，权利要求4和1的主题、权利要求4、2和1的主题、权利要求4、3和1的主题、以及权利要求4、3、2和1的主题的组合被清楚地且明白地公开。
以上考虑在细节上做必要的修正后适用于所有所附权利要求。为了给出一个非限制性示例，考虑到权利要求结构，清楚且明确地设想了权利要求13、12和1(i)的组合。这适用于例如权利要求13、11和4(ii)的组合等。
还通过附图示出了本发明的某些方面。
附图说明
图1：包含在一个或多个重链CDR内的随机氨基酸置换的文库的构建
图1A：在突变体文库的构建中需要的重链片段的产生（步骤1）
在第一轮（PCR 1）中，借助于相应的引物集合分别产生了与片段1、3和4对应的三种不同重链片段。浅灰色区段表示CDR。主链序列以黑色给出。水平箭头表示使用的引物。垂直箭头指向PCR的结果。在图中划掉的短42bp寡核苷酸（片段2）不是通过PCR获得，而是单独化学合成。
图1B：通过CDR单氨基酸随机化合成HC文库.
在第二步PCR 2中，按图1A中所述获得的四种片段用作模板（黑线）。带有叉的水平箭头指示多核苷酸文库，每个文库包含每个CDR密码子位置的简并NNK密码子。这些多核苷酸文库另外包含能够根据需要和指示与步骤1的一个或两个片段杂交的序列区段。正向和反向引物（小箭头）分别用于进行相应的PCR。
图1C：文库合成的最后一步
需要能够与步骤1的一个或两个片段杂交的其它序列区段，以执行HC文库生产的最后一步，即使用PCR 2的所有四种产物进行重叠PCR。使用末端引物(F1A; R1A)，并且片段本身在该重叠PCR中充当巨型引物。
图2：周质Fab表达的载体图
给出的图中的描述被认为是意义自明的。
图3：用于筛选与cTnT结合的Fab片段的ELISA设置
使用涂有抗生蛋白链菌素的微孔滴定板（SA板）将生物素化的心肌肌钙蛋白T (bi-cTnT)结合至固相。包含重组抗-cTnT重链的Fab片段(<cTnT>-Fab)与TnT结合，并通过过氧化物酶(POD)-标记的抗-人Fab抗体(抗huFab-POD)进行检测。
图4: Elecsys夹心测定
描绘了显示测定设置的方案。将生物素化的(bi)捕获抗体附着于抗生蛋白链菌素(SA)包被的珠子。对各种亲和力成熟的抗-cTnT抗体进行钌化（Ru）处理，并通过ECL分析研究了亲和力成熟的效果。
图5：真正的区分符和区分符衍生物的ECL信号计数.
给出了真正的抗-cTnT抗体和突变抗体的计数（组合12分别表示表2中使用的Fab片段标识符）。浅灰色条显示了Diluent Multi Assay试剂中的测定空白值(噪音)，深灰色条显示了用商业cTnT Elecsys®测定的校准品1获得的计数（信号）。抗体组合12显示出改善的信噪比。
下述实施例例证了本发明：
实施例1: 材料和一般方法
重组DNA技术
使用在Sambrook, J.等人, Molecular Cloning: A laboratory manual; ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中描述的标准方法操作DNA。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。
DNA序列确定
通过在Microsynth AG (Balgach, 瑞士)进行的双链测序来确定DNA序列。
DNA和蛋白序列分析和序列数据管理
将Vector NT1 Advance套装11.5.0版用于序列建立、映射、分析、注解和说明。
蛋白化学和标记技术
标准的蛋白质化学和标记技术提供在例如Hermanson, G.“BioconjugateTechniques”第3版(2013) Academic Press。
生物信息学
生物信息学方法提供在例如Keith J.M.(编)“Bioinformatics”Vol.I和Vol.II,Methods in Molecular Biology第1525卷和第1526卷(2017) Springer, 以及Martin,A.C.R.& Allen, J.“Bioinformatics Tools for Analysis of Antibodies”in: DübelS.& Reichert J.M.(编)“Handbook of Therapeutic Antibodies”Wiley-VCH (2014)。
电化学发光免疫测定
免疫测定和有关的方法提供在例如Wild D. (编)“The Immunoassay Handbook”第4版(2013) Elsevier。作为电化学发光标记的钌复合物提供在例如Staffilani M. 等人.Inorg. Chem. 42 (2003) 7789-7798。通常地，关于基于电化学发光(ECL)的免疫测定的性能，使用Elecsys 2010分析仪或后继系统，例如Roche分析仪(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim德国)，诸如E170、cobas e 601模块、cobas e 602模块、cobas e 801模块和cobase 411，和为这些分析仪设计的Roche Elecsys测定，如果没有另外指出的话，每种在标准条件下使用。
实施例2: 文库构建
亲本抗体可变重链具有鼠起源(SEQ ID NO:34)。以分别在HCCDR1、HCCDR2和/或HCCDR3中进行单个氨基酸随机化为目标，构建了包含突变HCCDR的文库。在第一步中，产生了四种DNA片段，每种编码四种不同的亲本抗体框架区之一。框架区1、3和4通过自有聚合酶链式反应获得，在Metabion international AG订购代表框架区2的短片段2（42碱基对）(参见图1A)。片段经凝胶纯化和定量。在四种加端PCR反应混合物的每一种中，将100 ng这些DNA片段之一用作多核苷酸模板。通过使用包含与亲本CDR相同数目的密码子的多核苷酸文库来添加CDR区域，其中所述文库的成员被设计为包含对于各个HCCDR中的每个相应密码子位置具有一个NNK密码子的文库成员。CDR文库中的多核苷酸另外包含能够与邻近相应CDR的框架区杂交的序列。末端引物用于嵌套PCR扩增。从而（参见图1B）产生了四种DNA片段，它们具有部分重叠的序列。利用与FW1序列的3'端和FW4序列的5'端杂交的末端引物，进行重叠PCR，以将四个片段连接至线性DNA文库构建体（参见图1C）。给通常的PCR反应填充PCR级水至100µl反应混合物，其包含10µl 10 x PCR缓冲液（含有MgSO4）、200µM dNTP混合物、0.5µM正向引物和反向引物、250 ng DNA模板、5单位Pwo DNA聚合酶。通常的PCR开始于在94℃进行初始模板变性5分钟，采用30个循环（94℃ 2分钟，60℃ 45秒，72℃ 1分钟），并包含在72℃进行5分钟的最终延伸步骤。引物、模板和片段序列列于表1中。文库片段包含在无细胞系统中成功转录和翻译所需的所有必需调节序列。熟练的技术人员能够通过遵循现有技术水平的方法来生成这种文库，参见例如Hanes, J.和Pluckthun, A.(1997), “In vitroselection and evolution of functional proteins by using ribosome display”,Proc Natl Acad Sci U.S.A.94, 4937-42。如此产生的250ng的DNA文库（覆盖了三种HCCDR，并对应于约5·1011个文库成员）用于体外展示方案。
Figure 135006DEST_PATH_IMAGE001
Figure 317726DEST_PATH_IMAGE002
Figure 769567DEST_PATH_IMAGE003
实施例3: 体外展示
制备用于Fab展示的缓冲液，并在4℃翻滚旋转下温育过夜。洗涤缓冲液WB (60 mMTris；用AcOH调至pH 7.5, 180 mM NaCl, 60 mM醋酸镁, 5%阻滞剂BSA, 33 mM KCl,200µgt-RNA, 0,05%吐温20)；珠子洗涤缓冲液BWB(100 mM PBS,0,1%吐温20)；停止缓冲液SB (50mM Tris，用AcOH调至pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM醋酸镁, 5%阻滞剂BSA (Pierce), 33mMKCl, 0,5%吐温20, 8.2 mM氧化型谷胱甘肽)；洗脱缓冲液(55 mM Tris，用AcOH调至pH7.5, 165 mM NaCl, 22 mM EDTA, 1 mg BSA, 5000 U rRNA (5000 U), 50µg tRNA)。
每10µL初始悬浮液用100µL洗涤缓冲液(WB)封闭所需体积的磁珠（抗生蛋白链菌素包被的珠子），并在4℃翻滚旋转过夜。使用25µL珠子进行预淘洗步骤，淘洗用20µL（每个靶标/背景样品）。为了除去珠子存储缓冲液中的叠氮化钠，将珠子用珠子洗涤缓冲液(BWB)洗涤4次，并用WB洗涤3次。通过施加磁场以收集珠子2分钟并随后丢弃上清液来执行这些步骤。在最后的洗涤步骤之后，将珠子重新悬浮在WB中至其初始体积。
根据生产商的说明书使用PUREfrexTM DS 2.0进行体外转录和翻译。准备了用于靶标（T）的1.5 mL反应管和用于背景（BG）的反应管。
以2:1分子比例应用表达模板（LC）和展示模板（HC）的DNA输入。在所有Fab展示周期中，编码展示模板和表达模板的DNA量保持恒定。将体外转录/翻译反应混合物在37℃温育1小时。温育后，通过添加100µL停止缓冲液停止反应，然后在1℃在14 000 rpm离心15分钟。除非另有说明，否则后续步骤均在4℃进行。将停止的翻译混合物的上清液加入制备的珠悬浮液中，并在摇动平台上温育30分钟。然后，将悬浮液在13000 rpm和1℃离心10分钟，以将具有非特异性结合分子的珠子与含有剩余三元复合物的上清液分离。将预淘洗的上清液(300µL)转移进新的2 mL反应管中，预先用WB封闭，并保持在冰上直至进一步使用。将靶标(重组生物素化的cTnT)以10 nM至50 nM的终浓度添加到300µL预淘洗的上清液中。在每个循环中降低生物素化的cTnT浓度以改善选择压力。将悬浮液在摇动平台上温育30分钟。溶液淘洗步骤允许生物素化的cTnT和三元复合物之间的特异性结合。在20分钟的温育步骤中，用抗生蛋白链菌素珠子捕获了与靶cTnT结合的三元复合物。在周期III中通过两种方式实现选择压力的进一步增加：通过将抗原浓度降低至2 nM或使用非生物素化的竞争剂。在后者中，用低生物素化的cTnT浓度和过量的竞争剂cTnT进行淘洗步骤过夜。
洗涤步骤包括在磁场中用结合的靶标-三元复合物捕获珠子，然后除去上清液。用500µL冰冷的WB洗涤珠子。通过将洗涤步骤的持续时间从5分钟延长到1小时，在随后的显示周期中改善选择压力。最后的洗涤步骤用于将珠子转移至新的封闭的2 mL反应管。随后，用磁场捕获珠子并除去上清液。通过添加100µL含EDTA的1x EB并振荡温育10分钟，进行以下洗脱步骤。mRNA从三元复合物释放。之后，将洗脱混合物在1℃在14 000 rpm离心10分钟。根据生产商的说明书使用RNeasy MinElute净化试剂盒(Qiagen)，以分离和纯化富集的RNA。用16µL不含RNA酶的水洗脱RNA。为了消化来自选择步骤的任何残留DNA，根据生产商的说明书使用Ambion DNA-free TM试剂盒。剩余的DNA无法在后续的PCR反应中扩增。DNA酶灭活后，将悬浮液在13 000 rpm和在室温离心2分钟。将上清液(50µL)转移至在冰上的新鲜1.5 mL反应管。纯化的RNA立即用于反转录(RT)。将任何剩余的上清液在-20℃储存。
将洗脱的mRNA反转录为cDNA。对于样品T，建立了两个反应，其在淘选步骤中包含靶标。为样品BG制备了另外两个反应，阴性对照含有水。根据样品的数量，制备主混合物，并将预混合物分配到在冰上的0.2 mL反应管。给每个反应接种12µL洗脱的RNA和0.5µL逆转录酶。阴性对照使用12µL不含RNA酶的水代替RNA进行。在PCR热循环仪中在65℃进行反转录45分钟。随后将cDNA样品在冰上温育5分钟，并按照以下步骤进行扩增。将剩余的样品在-20℃储存。进行了两个PCR反应：使用引物Frt和Rrt进行第一个PCR“PCR on RT”以扩增选择库的cDNA。为了重新连接体外转录/翻译的调节元件，应用了使用引物F1A和R1A的第二个PCR“PCR on RT-PCR”。两个反应均用Pwo DNA聚合酶进行。
为了提供选择池的足够DNA浓度，对样品T和BG中的每一个设置了四个反应。
另外，设置了四个对照样品。前两个样品来自样品T和BG的mRNA分离后的DNA消化，并通过PCR进行了验证以扩增可能残留的DNA。第三个和第四个是RT的阴性对照和使用PCR级水的“PCR on RT”的阴性对照。
使用QIAquick凝胶提取试剂盒从制备的1％琼脂糖凝胶中纯化T的PCR产物，随后进行定量，并用作“PCR on RT-PCR”的模板。用PCR级水代替DNA模板制备了三个选择池的反应和一个阴性对照。对于每个反应，使用250 ng先前纯化的“PCR on RT”。使用QIAquick凝胶提取试剂盒从1％制备型琼脂糖凝胶纯化PCR产物，并对其进行进一步修饰用于随后亚克隆到适当的表达系统中。
实施例4: 富集的结合剂的周质表达
为了分离富集的Fab结合剂，将鼠可变HC克隆进phoATIR3-9bi Fab TN-T M7chim表达 载体(参见图2)，其包含Fab的人CH1结构域、鼠VL结构域和人CL结构域。每个选择池都具有位于前导序列Tir9中的BsiWI限制位点，以能够克隆到表达载体中。
第二限制位点KpnI出现在HC的可变区的末端，因此不必连接。因此，使用含有BsiWI限制位点的正向引物5’GCTACAAACGCGTACGCTATGGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCG-3’(SEDID NO: 95)和反向引物Rrt 5’-GGAAAGCCTCTGAGGACCAGCACGGATGCCCTGTGC-3’(SEQ ID NO:88)进行PCR。在96孔深孔块（DWB）中进行周质表达。通过使用Integra VIAFlo96，给预培养(“主”) DWB填充1 mL LB (100µg/mL氨苄西林)/孔，并接种先前实施的亚克隆和转化的分离克隆。每个选择池选择了约300个菌落。留下一孔不接种作为阴性对照；给另一个孔接种XL1蓝转化的TnT M-7 (野生型) Fab表达载体作为阳性对照。将DWB用透气膜密封，并在定轨摇床培养箱(750 rpm)中在30℃温育过夜。随后，将主DWB的每个孔中的50µL转移到新的“表达”DWB，该DWB用每孔1150 mL C.R.A.P培养基(100µg/mL氨苄西林)制备，如Simmons,L.C., Reilly, D., Klimowski, L., Raju, T.S., Meng, G., Sims, P., Hong, K.,Shields, R.L., Damico, L.A., Rancatore, P.& Yansura, D.G.(2002)“Expression offull-length immunoglobulins in Escherichia coli: rapid and efficientproduction of aglycosylated antibodies”, J Immunol Methods 263, 133-47所述。将DWB用透气膜密封，并在定轨摇床培养箱中在30℃温育。Fab表达的诱导是基于具有磷酸盐限制的C.R.A.P培养基的phoA启动子。24小时后，通过在4000 rpm离心10分钟，收获具有表达的Fab的细胞，并在-20℃保存直至进一步使用。
通过添加950µL 40%甘油并在-80℃储存，将预培养主DWB用于“甘油储备”。通过将密封的DWB剧烈涡旋5分钟然后在室温摇动10分钟，将细胞沉淀物重新悬浮于50µL B-PERII细菌蛋白提取试剂（Thermo Fisher Scientific）中。将细胞裂解物在950µL Tris缓冲液(20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl)中稀释，并在离心(10分钟, 4000 rpm)之前温育10分钟。将含有粗细胞提取物的表达块保持在4℃，直到进一步用于SPR动力学研究。
实施例5: ELISA筛选
为了发现用于详细Biacore分析的最佳突变Fab结合剂，实施了先前的酶联免疫吸附测定（ELISA）。ELISA设置如图3所示。通过在定轨摇床上摇动，在抗生蛋白链菌素- MTP 96孔板上在室温捕获生物素化的重组心肌肌钙蛋白T (100 nM) 1小时。将抗原肌钙蛋白T在100µL IP缓冲液(PBS pH 7.3, 1%BSA)中稀释。随后，将孔使用微量培养板清洗机BioTekELx405 Select用300µL 1x洗涤缓冲液(150 mM NaCl, 0.05%吐温20, 0.2%Bronidox)洗涤3次。洗涤后，将含有突变的抗-cTnT Fab结合剂的粗细胞提取物在IP缓冲液中1:2稀释，并转移至肌钙蛋白T捕获的孔。再次，将孔用300µL 1x洗涤缓冲液洗涤3次。使用在山羊中产生的抗-人IgG（Fab特异性的）- 过氧化物酶-标记的抗体(检测抗体)以1:40 000稀释度（在IP缓冲液中）检测肌钙蛋白T结合的突变Fab片段。将孔再次用300µL 1x洗涤缓冲液洗涤3次以除去未结合的检测抗体。将微量培养板与100µL ABTS/孔一起在室温温育30分钟。用设置为405 nm的微量培养板读数器BioTek Power wave XS测量光密度。亲本抗-cTnT抗体的野生型Fab用作阳性对照。鉴定出首次命中，并将其粗细胞提取物进行动力学分析。
实施例6: 基于SPR的功能分析
在GE Healthcare T200仪器上在37℃进行了详细的动力学研究。将Biacore CM-5系列S传感器安装到仪器中，并根据生产商的说明书进行了预处理。系统缓冲液为HBS-ET (10mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05%(w/v)吐温®20)。样品缓冲液是补充了1 mg/ml CMD (羧甲基葡聚糖, Fluka)的系统缓冲液。在一个实施方案中，在CM5生物传感器上建立了抗-人抗体捕获系统。根据生产商的说明书，使用NHS/EDC化学固定化GAHF(ab')2, (山羊抗人F(ab')2) (代码号: 109-005-097, 批号13.12.2005, JacksonImmuno Research)。将在10 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中的30µg/ml GAHF(ab')2预浓缩到流动池1、2、3和4，并用10.000 RU GAHF(ab')2固定化。随后将传感器用1 M乙醇胺pH 8.5饱和。
如所述的，嵌合的抗-TnT抗体片段在大肠杆菌细胞周质中表达，并通过已知的方法进行裂解（技术细节参见：Andersen, D.C.& Reilly, D.E.(2004); Productiontechnologies for monoclonal antibodies and their fragments.Curr OpinBiotechnol 15, 456-62）。将裂解物在样品缓冲液中以1:20稀释。将Fab片段通过其人源化的框架区从生物传感器上的表达裂解物中以10µl/min的流速捕获1分钟，然后用10倍浓缩的HBS-EP缓冲液以30µl/min洗涤2分钟。监测响应单位（RU）中的Fab片段捕获水平（CL）。将重组人TnT (Roche, 37 kDa)在样品缓冲液中以90 nM稀释，并产生0 nM、30 nM、11 nM、3.3nM、1.1 nM、0 nM、3.3 nM TnT浓度的浓度系列。对于3分钟结合阶段，分析物浓度系列为80µl/min，并监测解离阶段3分钟。
在分析物结合阶段结束时，监测报告点，即响应单位（RU）中的“后期结合（bindinglate）”（BL）。在测定动力学速率的每个循环之后，通过10 mM甘氨酸pH 1.5的15秒注射和随后在20µl/min的10 mM甘氨酸pH 1.7的2次1 min注射，再生捕获系统。
根据生产商的说明书，使用Biaevaluation软件（GE Healthcare）针对每种Fab片段突变体确定cTnT分析物的动力学参数ka [1/Ms]、kd [1/s]、t1/2 diss [min]、KD [M]和结合化学计量（摩尔比）（细节参见：Schraeml, M.& Biehl, M.(2012); Kineticscreening in the antibody development process.Methods Mol Biol 901, 171-81.）。动力学参数与CDR突变位点相关，并根据其抗原复合物稳定性(t1/2 diss)列于表3中。
动力学参数与在相应的CDR中鉴定的突变相关。在该筛选中获得的突变体都包含超过一个氨基酸置换。然后制备并测试了包含单个置换以及在筛选中鉴定的所有置换的各种组合/变体的突变Fab片段。表2列出了所有测试的突变/组合。
Figure 430355DEST_PATH_IMAGE004
已经通过SPR分析了以上所有突变体，并根据它们的抗原复合物稳定性(t1/2diss)进行了排序（参见表3）。
Figure 244728DEST_PATH_IMAGE005
表3中的缩写：ka：结合速率常数[M-1s-1]，kd：解离速率常数[s-1]，KD：解离平衡常数KD [M]，t/2-diss：复合物半衰期，ln(2)/kd*60[min]，Rmax：分析物的最大响应[RU]，MR：摩尔比= 分析物的最大响应(Rmax)之比。
当分别分析抗体组合12中包含的单个置换（即在编号9、17和19中包含的突变（参见表3））时，显而易见，所述三个突变位点具有协同作用，改善了该突变抗体的亲和力、复合物稳定性和ECL测定性能。这也证实了其中包含的突变的协同作用。
实施例7：嵌合抗体在HEK细胞中的表达
根据标准程序获得嵌合的人/小鼠抗体。相应的载体和克隆过程描述于Norderhaug等人. J Immunol Methods. 1997年5月12日;204(1):77-87。
从通过SPR选择的几个Fab片段中，已经构建和生产全长鼠/人嵌合抗体，即具有人IgG CH1、CH2和CH3结构域的抗体。通过RT-PCR从杂交瘤克隆7.1 A 12.2-22 (ECACC89060901)获得编码重链和轻链的cDNA，并将其克隆进人巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子/启动子区域下游的单独载体中，然后是BGH多腺苷酸化信号。
将悬浮适应的人胚胎肾FreeStyle 293-F细胞系（Thermo Fisher Scientific）用于抗体的瞬时基因表达（TGE）：根据生产商的指南，用与PEIpro (Polyplus-transfectionSA, Strasbourg)转染试剂形成复合物的等量两种表达质粒(共0.7 mg/L细胞培养物)以大约2 x 10E6活细胞/ml转染细胞。转染后3小时，为了增强表达加入丙戊酸，一种HDAC抑制剂(终浓度: 4 mM)。每天，给培养物补充6%(v/v)的基于大豆蛋白胨水解物的饲料。转染后7天，通过离心收集培养物上清液，并根据标准程序从中纯化抗体。
实施例8: ECL测量
在夹心免疫测定中测试了根据实施例7产生的抗体（参见图4）。生成IgG钌缀合物，并用于替代在真正的Roche Elecsys测定（目录号05092744190，Roche Diagnostics GmbH,Mannheim, 德国）中所含的原始标准钌化缀合物）和与其对比，以便将亲本抗-cTnT抗体的性能与突变的抗-cTnT抗体对比。将突变的mAb以不同的标记化学计量与钌缀合。在一个实施方案中，钌标记摩尔比为1:10抗体IgG:标记。将来自抗-cTnT抗体变体的钌缀合物在Elecsys R2试剂中稀释，并使用肌钙蛋白T hs测定方案和空白对照, 来自肌钙蛋白T hsCalSet的Cal1和Cal2(Id.05092752190, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany)，使用肌钙蛋白T hs测定说明书在Cobas E170 Module上进行测量(DiluentUniversal, Id.11732277122, Diluent Multi Assay, Id.03609987170, RocheDiagnostics GmbH, Mannheim, Germany)。结果如图5所示。与亲本（非突变）抗体相比，包含分别存在于组合编号11和12中的突变的抗体显示出改善的信噪比。
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Claims (15)

1.一种产生多核苷酸文库的方法，所述多核苷酸各自编码包含已知亲本互补性决定区(CDR)的目标抗体的框架区和至少一个相邻CDR，其中所述亲本CDR由已知亲本CDR多核苷酸序列编码，该方法的特征在于
i)提供编码所述抗体的第一框架区的多核苷酸，
ii)提供(i)的多核苷酸的第一PCR引物，
iii)提供多核苷酸的混合物，每个多核苷酸由元件A-B-C组成，
其中
A)是能够与第一框架区杂交的多核苷酸，
每个B)是包含与亲本CDR多核苷酸序列相同数目的密码子的多核苷酸文库的成员，其中所述文库的成员被设计为包含至少一个随机化密码子和
C)是能够与第二框架区杂交的多核苷酸，
iv)提供元件C)的第二PCR引物，
v)基于多核苷酸(i)至(iv)进行PCR，从而获得多核苷酸文库，
并且其中在没有亲本CDR多核苷酸序列存在下进行这样的PCR。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一框架区是FW1或FW4，其中如果所述第一框架区是FW1，则所述第二框架区是FW2，或如果所述第一框架区是FW4，则所述第二框架区是FW3，且其中如果所述第一框架区是FW1，则所述CDR是CDR1，或如果所述第一框架区是FW4，则所述CDR是CDR3。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一框架区是FW1，其中所述第二框架区是FW2，其中所述第一引物是FW1的正向引物且其中所述第二引物是FW2的反向引物，且其中所述CDR是CDR1。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一框架区是FW4，其中所述第二框架区是FW3，其中所述第一引物是FW4的反向引物且其中所述第二引物是FW3的正向引物，且其中所述亲本CDR是CDR3。
5.一种产生多核苷酸文库的方法，所述多核苷酸各自编码目标抗体的框架区和两个相邻互补性决定区(CDR)，所述目标抗体包含第一和第二已知亲本CDR，其中所述第一和第二亲本CDR由第一和第二已知CDR多核苷酸序列编码，所述方法的特征在于：
i)提供编码所述抗体的第一框架区的多核苷酸，
ii)提供多核苷酸的第一混合物，每个多核苷酸由元件A-B-C组成，
其中
A)是能够与第一框架区杂交的多核苷酸，
每个B)是包含与第一亲本CDR相同数目的密码子的第一多核苷酸的文库的成员，其中所述文库的成员被设计为包含至少一个随机化密码子，和
C)是能够与第二框架区杂交的多核苷酸，
iii)提供元件C)的第一PCR引物，
iv)提供多核苷酸的第二混合物，每个多核苷酸由元件A’-B’-C’组成，
其中
A’)是能够与所述第一框架区杂交的多核苷酸，
每个B’)是包含与第二亲本CDR多核苷酸序列相同数目的密码子的第二多核苷酸文库的成员，其中所述文库的成员被设计为包含至少一个随机化密码子，和
C’)是能够与第三框架区杂交的多核苷酸，
v)提供元件C’)的第二PCR引物，
vi)基于多核苷酸(i)至(v)执行PCR，从而获得多核苷酸文库，
且其中在没有任何亲本CDR多核苷酸序列存在下执行这样的PCR。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述所述第一框架区是FW2，其中所述第二框架区是FW1，其中所述第三框架区是FW3，其中所述第一亲本CDR是CDR1，其中所述第二亲本CDR是CDR2，其中所述元件C)的第一引物是FW1的正向引物，其中所述元件C’)的第二引物是FW3的反向引物。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一框架区是FW3，其中所述第二框架区是FW2，其中所述第三框架区是FW4，其中所述第一亲本CDR是CDR2，其中所述第二亲本CDR是CDR3，其中所述元件C)的第一引物是FW2的正向引物，其中所述元件C’)的第二引物是FW4的反向引物。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中在元件B)中，亲本CDR多核苷酸序列的一个密码子或两个密码子被随机化。
9.可根据权利要求1-8中的任一项得到的多核苷酸文库，其编码抗体的可变链的一个随机化CDR或两个相邻随机化CDR，其中在得到的文库中，在一个CDR被随机化的情况下，亲本多核苷酸序列与其它（随机化的）多核苷酸序列的比率为1: 106或更小，且在两个CDR被随机化的情况下为1: 107或更小。
10.根据权利要求9所述的文库用于产生编码文库的可变链的多核苷酸文库的用途，其中所述可变链选自可变H链或可变L链。
11.通过基于根据权利要求3、4、6和7产生的文库执行重叠PCR来产生编码抗体可变链的多核苷酸文库的方法。
12.可根据权利要求11得到的编码抗体可变链的多核苷酸文库，其中所述可变链包含随机化CDR1、随机化CDR2和随机化CDR3，且其中在得到的文库中，所述文库中亲本多核苷酸序列与其它多核苷酸序列之比为1:5x107或更小。
13.一种产生抗体文库的方法，其中所述抗体包含第一可变链和第二可变链，其中表达根据权利要求12的编码所述抗体的第一可变链的多核苷酸文库，并与所述抗体的第二可变链组合。
14.一种从根据权利要求13产生的文库中选择包含第一可变链和第二可变链的抗体的方法，其中与具有已知亲本CDR的亲本抗体相比，选择的抗体具有改善的结合特性。
15.根据权利要求14所述的方法，其中与所述亲本抗体相比，选择的抗体表现出至少20%的解离复合物半衰期t/2的选定增加。
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