JP2010531656A - 改善した免疫グロブリン配列を提供する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
単一ドメインだけが高い親和性及び高い選択性で抗原と結合することを要求されるので、2つの分離したドメインを存在させる必要がなく、これらの2つのドメインが正しい空間配座及び構造で存在することを確認する(すなわち特別に設計されたリンカー(scFv等)の使用によって)必要もない。
VHHドメイン及びナノボディは単一遺伝子から発現することができ、翻訳後のフォールディング又は修飾の必要がない。
VHHドメイン及びナノボディは、(本明細書でさらに考察されるように)多価及び多重特異性のフォーマットに容易に操作することができる。
VHHドメイン及びナノボディは、溶解性が高く、凝集しにくい(非特許文献2で説明されるマウス由来の「dAb」等)。
VHHドメイン及びナノボディは、熱、pH、プロテアーゼ及び他の変性剤又は条件に対する安定性が高い(例えばEwert et al(同上)を参照されたい)。
VHHドメイン及びナノボディは、製造で要求される規模であっても、容易且つ比較的安価に調製できる。例えば、VHHドメイン、ナノボディ、及びこれを含有するタンパク質/ポリペプチドは、微生物発酵を使用して(例えば以下でさらに記載されるように)製造することができ、例えば従来の抗体断片のように、哺乳動物の発現系を使用する必要がない。
VHHドメイン及びナノボディは、従来の4鎖抗体及びその抗原結合断片と比較して比較的低分子(約15kDa、すなわち従来のIgGの10分の1)であるため、このような従来の4鎖抗体及びその抗原結合断片よりも高い組織(充実性腫瘍及び他の高密度組織を含むが、これらに限定されない)への浸透性を示す。
VHHドメイン及びナノボディは、(特に従来のVHドメインと比較して伸長したCDR3ループのために)いわゆるキャビティ結合(cavity-binding)特性を示すことができ、したがって従来の4鎖抗体及びその抗原結合断片に接近することができない標的及びエピトープに接近することもできる。例えば、VHHドメイン及びナノボディは酵素を阻害することができることが分かっている(例えば特許文献34、非特許文献3、非特許文献4を参照されたい)。
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性フォーマット(例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかにおける目的の標的又は抗原に対する親和性及び/又は結合活性の増大、
多価フォーマット(例えば二価フォーマット)にフォーマット化するのにより良好な適合性、
多重特異性フォーマット(例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)にフォーマット化するのにより良好な適合性、
「ヒト化」置換(本明細書中で規定)に対する適合性又は感受性の改善、
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性フォーマット(例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかにおける免疫原性の低下、
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性フォーマット(例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかにおける安定性の増大、
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性フォーマット(例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかにおける目的の標的又は抗原に対する特異性の増大、
異なる種由来の目的の標的又は抗原との交差反応性の減少又は(望まれる場合は)増大
及び/又は
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性フォーマット(例えば本明細書中の以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかにおける薬学的使用(予防的使用及び/又は治療的使用を含む)及び/又は診断的使用(画像化目的のための使用を含むが、これに限定されない)に望ましい、1つ又は複数の他の特性の改善、
の1つ又は複数を含む。
i)以下を含むオリゴヌクレオチドのプールを用意する工程
(i)PCRアセンブリによって単一抗原結合ドメインとして使用することができる(及び/又はこれとしての使用を意図する)アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸へと集合化することができる、一連の少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、さらに
(ii)少なくとも1つの変異体が、1つ又は複数の所定の位置での1つ又は複数の所定のアミノ酸残基の存在において(すなわち、1つ又は複数の「特異的変異」の存在において)異なるアミノ酸配列をコードするという点で、上記オリゴヌクレオチド(及びまた存在する場合にはプールに存在する上記オリゴヌクレオチドの他の変異体)と異なる、一連のオリゴヌクレオチドの一部分を形成する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つの変異体、ならびに
ii)オリゴヌクレオチドのプールをPCRアセンブリに供する工程
とを含む、方法に関する。
KはRにより置換され、
RはKにより置換され、
AはS又はTにより置換され、
SはA又はTにより置換され、
TはA又はSにより置換され、
IはL又はVにより置換され、
LはI又はVにより置換され、
VはI又はLにより置換され、
FはYにより置換され、
YはFにより置換され、
NはDにより置換され、
DはNにより置換され、
QはEにより置換され、
EはQにより置換され、
GはAにより置換され、
MはLにより置換され、
H、C、W及びPは一定のままである。
27位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、F;G;R;S;F、G、R、Sのうち2つ;F、G、R、Sのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
28位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、A;I;S;T;A、I、S、Tのうち2つ;A、I、S、Tのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
29位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、F;G;L;S;F、G、L、Sのうち2つ;F、G、L、Sのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
30位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;G;S;T;D、G、S、Tのうち2つ;D、G、S、Tのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
31位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;I;N;S;T;D、I、N、S、Tのうち2つ;D、I、N、S、Tのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
32位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;N;Y;D、N、Yのうち2つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
33位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、A;G;T;V;A、G、T、Vのうち2つ;A、G、T、Vのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
34位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、I;M;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
35位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、A;G;S;A、G、Sのうち2つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
また、元のアミノ酸配列が52a位(カバットナンバリングを使用)にアミノ酸配列を有する場合、50位〜58位については:
50位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、A;C;G;S;T;A、C、G、S、Tのうち2つ;A、C、G、S、Tのうち3つ;A、C、G、S、Tのうち4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
51位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、Iにより置換され、
52位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、N;R;S;T;N、R、S、Tのうち2つ;N、R、S、Tのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
52a位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、R;S;T;W;R、S、T、Wのうち2つ;R、S、T、Wのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
53位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;G;N;S;T;D、G、N、S、Tのうち2つ;D、G、N、S、Tのうち3つ;D、G、N、S、Tのうち4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
54位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;G;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
55位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;G;S;D、G、Sのうち2つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
56位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、I;N;R;S;T;I、N、R、S、Tのうち2つ;I、N、R、S、Tのうち3つ;I、N、R、S、Tのうち4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
57位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、Tにより置換され、
58位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;H;N;S;Y;D、H、N、S、Yのうち2つ;D、H、N、S、Yのうち3つ;D、H、N、S、Yのうち4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
また、元のアミノ酸配列が52a位(カバットナンバリングを使用)にアミノ酸配列を有しない場合、50位〜58位については:
50位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、A;G;R;S;T;A、G、R、S、Tのうち2つ;A、G、R、S、Tのうち3つ;A、G、R、S、Tのうち4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
51位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、Iにより置換され、
52位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、N;S;T;N、S、Tのうち2つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
53位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、N;R;S;T;Y;N、R、S、T、Yのうち2つ;N、R、S、T、Yのうち3つ;N、R、S、T、Yのうち4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
54位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;G;R;S;D、G、R、Sのうち2つ;D、G、R、Sのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
55位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、Gにより置換され、
56位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、G;N;R;S;T;D、N、R、S、Tのうち2つ;D、N、R、S、Tのうち3つ;D、N、R、S、Tのうち4つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換され、
57位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、Tにより置換され、
58位(カバットナンバリングを使用)の元のアミノ酸残基は、D;N;T;Y;D、N、T、Yのうち2つ;D、N、T、Yのうち3つ;又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てにより置換される。
iii)1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸について、工程a)及び工程b)を通して得られるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、任意で上記1つ又は複数の所望の特性を有するアミノ酸配列をコードする、1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸を単離する工程とをさらに含む、上記のような方法に関する。
c)工程a)及び工程b)を通して得られるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリ由来の1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸を、それらが1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列をコードするかどうかについて試験する工程をさらに含む、上記のような方法にも関する。
a)(i)PCRアセンブリによって単一抗原結合ドメインとして使用することができる(及び/又はこれとしての使用を意図する)アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列へと集合化することができる、一連の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含み、さらに(ii)その一連のオリゴヌクレオチドの一部分を形成する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方の少なくとも1つの変異体を含む、オリゴヌクレオチドのプールを用意する工程であって、上記少なくとも1つの変異体が、1つ又は複数の特異的変異の存在において異なるアミノ酸配列をコードするという点で、上記オリゴヌクレオチド(及びまた存在する場合にはプールに存在する上記オリゴヌクレオチドの他の変異体)と異なる、用意する工程と、
b)オリゴヌクレオチドのプールをPCRアセンブリに供する工程と、
c)それ自体が既知の好適な方法で、このようにして得られた集合化したオリゴヌクレオチド配列を翻訳及び/又は発現させる工程とを含む、方法に関する。
iv)1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列について、工程a)〜工程c)を通して得られるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、任意で上記1つ又は複数の所望の特性を有する、1つ又は複数のアミノ酸配列を単離する工程とをさらに含む、上記のような方法に関する。
d)工程a)〜工程c)を通して得られるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリ由来の1つ又は複数のアミノ酸配列を、それらが1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するかどうかについて試験する工程をさらに含む、上記のような方法にも関する。
本明細書、実施例及び特許請求の範囲において:
a)特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は、当業者にとって明らかな、当該技術分野における通常の意味を有する。例えば標準的なハンドブック(例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)、F.Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York(1987)、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,(1985)、Old et al., "Principles of GeneManipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition,University of California Press, Berkeley, CA(1981)、Roitt et al., "Immunology"(6th.Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh(2001)、Roitt et al., Roitt's EssentialImmunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK(2001)、及びJaneway et al., "Immunobiology"(6th Ed.), Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone, New York(2005))、並びに本明細書で引用される一般的な背景技術を参照する。
VH/VL界面を形成するアミノ酸残基)を形成する位置に、導入されることが通常である。このような位置、並びにこれらの位置で導入及び試験され得る残基は、本明細書における開示と引用した従来技術とに基づき、当業者には明らかである(例えば、VHH配列又はナノボディについては、1つ又は複数の特徴的な(Hallmark)残基で、及び/又は1つ又は複数の他の位置で、特異的変異が導入及び試験され得る)。この非限定的な態様により、本発明の方法を、いわゆる「ラクダ化」置換(本明細書でさらに説明される)を導入及び試験するために使用することができることも明らかである。このような特異的変異が、所望の宿主又は宿主細胞における発現レベルを修正又は改善するために導入及び試験され得ることも、当業者には明らかである。
i)10−5モル/L〜10−12モル/L以下、及び好ましくは10−7モル/L〜10−12モル/L以下、及びより好ましくは10−8モル/L〜10−12モル/Lの解離定数(KD)で(すなわち105L/モル〜1012L/モル以上、及び好ましくは107L/モル〜1012L/モル以上、及びより好ましくは108L/モル〜1012L/モルの結合定数(KA)で)目的の又は所望の標的と結合するようなもの、及び/又は
ii)102M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1〜107M−1s−1、例えば105M−1s−1〜107M−1s−1のkon速度で目的の又は所望の標的と結合するようなもの、及び/又は
iii)1s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−2s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−3s−1〜10−6s−1、例えば10−4s−1〜10−6s−1のkoff速度で目的の又は所望の標的と結合するようなものであり得る。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表し、1つ又は複数の特徴的な残基は本明細書にさらに規定されるようなものであり、フレームワーク配列は本明細書にさらに規定されるようなものである)を有するアミノ酸配列として定義することができる。
a)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQである)、及び/又は
b)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸(本明細書中で規定)又はシステイン残基であり、好ましくは44位のアミノ酸残基はEである)、及び/又は
c)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択される)を含む、ポリペプチドと定義することができる。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
を有し得る;ここで
FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表し、ここで
a)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであり、及び/又は
b)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は荷電アミノ酸又はシステインであり、カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は好ましくはEであり、及び/又はここで
c)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、及びここで
d)CDR1、CDR2及びCDR3は、ナノボディが目的の又は所望の標的と
i)10−5モル/L〜10−12モル/L以下、及び好ましくは10−7モル/L〜10−12モル/L以下、及びより好ましくは10−8モル/L〜10−12モル/Lの解離定数(KD)で(すなわち105L/モル〜1012L/モル以上、及び好ましくは107L/モル〜1012L/モル以上、及びより好ましくは108L/モル〜1012L/モルの結合定数(KA)で)
ii)及び/又は
iii)102M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1〜107M−1s−1、例えば105M−1s−1〜107M−1s−1のkon速度で
iv)及び/又は
v)1s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−2s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−3s−1〜10−6s−1、例えば10−4s−1〜10−6s−1のkoff速度で結合するようなものである。
a)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQである)、及び/又は
b)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基はEであり、カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRである)、及び/又は
c)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択される)を含む、ポリペプチドと定義することができる。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有し得る;ここで
a)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであり、及び/又は
b)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基はEであり、カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRであり、及び/又は
c)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有し得る;ここで
a)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであり、及び/又は
b)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基はEであり、カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRであり、及び/又は
c)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものである。
a−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、A、G、E、D、G、Q、R、S、Lから成る群から選択され、好ましくはG、E若しくはQから成る群から選択され、
a−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、L、R若しくはCから成る群から選択され、好ましくはL若しくはRから成る群から選択され、
a−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、W、R若しくはSから成る群から選択され、好ましくはW若しくはRであり、最も好ましくはWであり、
a−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであるか、又は
b−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、E及びQから成る群から選択され、
b−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRであり、
b−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、W、R及びSから成る群から選択され、好ましくはWであり、
b−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQであるか、又は
c−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、A、G、E、D、Q、R、S及びLから成る群から選択され、好ましくはG、E及びQから成る群から選択され、
c−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、L、R及びCから成る群から選択され、好ましくはL及びRから成る群から選択され、
c−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、P、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
c−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQであり、且つ
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有し得る;ここで
a−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、A、G、E、D、G、Q、R、S、Lから成る群から選択され、好ましくはG、E若しくはQから成る群から選択され、
a−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、L、R若しくはCから成る群から選択され、好ましくはL若しくはRから成る群から選択され、
a−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、W、R若しくはSから成る群から選択され、好ましくはW若しくはRであり、最も好ましくはWであり、
a−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであり、且つ
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有し得る;ここで
b−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、E及びQから成る群から選択され、
b−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRであり、
b−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、W、R及びSから成る群から選択され、好ましくはWであり、
b−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQであり、且つ
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有し得る;ここで
c−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、A、G、E、D、Q、R、S及びLから成る群から選択され、好ましくはG、E及びQから成る群から選択され、
c−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、L、R及びCから成る群から選択され、好ましくはL及びRから成る群から選択され、
c−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、P、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
c−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQであり、且つ
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものである。
i)カバットナンバリングによる44位〜47位のアミノ酸残基は配列GLEW(又は本明細書に記載のGLEW様配列)を形成し、108位のアミノ酸残基はQであるか、又は
ii)カバットナンバリングによる43位〜46位のアミノ酸残基は配列KERE又はKQRE(又は記載されるようなKERE様配列)を形成し、108位のアミノ酸残基はQ又はLであり、好ましくはQである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有し得る;ここで
i)カバットナンバリングによる44位〜47位のアミノ酸残基は配列GLEW(又は本明細書に記載のGLEW様配列)を形成し、108位のアミノ酸残基はQであり、且つ
ii)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有し得る;ここで
i)カバットナンバリングによる43位〜46位のアミノ酸残基は配列KERE又はKQRE(又はKERE様配列)を形成し、108位のアミノ酸残基はQ又はLであり、好ましくはQであり、且つ
ii)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものである。
i)「GLEW群」:カバットナンバリングによる44位〜47位にアミノ酸配列GLEW、及びカバットナンバリングによる108位にQを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、37位にVを有し、103位にW、P、R又はSを有することができ、好ましくは103位にWを有する。GLEW群は、以下の表A−3で言及されるもののような幾つかのGLEW様配列も含む。より一般的には、これに限定されないが、GLEW群に属するナノボディは、44位にG、及び/又は47位にWを有し、46位は通常Eであり、好ましくは45位が荷電アミノ酸残基でもシステインでもないナノボディと定義することができる。
ii)「KERE群」:カバットナンバリングによる43位〜46位にアミノ酸配列KERE又はKQRE(又は別のKERE様配列)、及びカバットナンバリングによる108位にQ又はLを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、37位にF、及び47位にL又はFを有し、103位にW、P、R又はSを有することができ、好ましくは103位にWを有する。より一般的には、これに限定されないが、KERE群に属するナノボディは、44位にK、Q又はR(通常K)を有し、45位が荷電アミノ酸残基又はシステインであり、47位が本明細書でさらに規定されるようなものであるナノボディと定義することができる。
iii)「103P、R、S群」:103位にP、R又はSを有するナノボディ。これらのナノボディは、カバットナンバリングによる44位〜47位にアミノ酸配列GLEW、又はカバットナンバリングによる43位〜46位にアミノ酸配列KERE又はKQREのいずれかを有することができ(後者は、(KERE群について規定のように)37位のFと、47位のL又はFと組合せるのが最も好ましい)、カバットナンバリングによる108位にQ又はLを有することができ、好ましくはQを有する。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有するアミノ酸配列として規定することができ、ここで
i)カバットナンバリングによる11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位のアミノ酸残基の1つ又は複数が、表A−3で言及される特徴的な残基から選択され、
ii)CDR1、CDR2及びCDR3が、本明細書中で規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表す)を有するアミノ酸配列である可能性があり、ここで
i)カバットナンバリングによる11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位のアミノ酸残基の好ましくは1つ又は複数が、以下の表A−3で言及される特徴的な残基から選択され、
ii)上記アミノ酸配列が、配列番号1〜配列番号22のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し(アミノ酸同一性の程度を求めるために、CDR配列を形成するアミノ酸残基(配列番号1〜配列番号22の配列においてXで示す)は無視する)、
iii)CDR1、CDR2及びCDR3が、本明細書中で規定されるようなものである。
i)好適な宿主細胞若しくは宿主生物(本明細書中では「本発明の宿主」とも称する)において、又は本発明の上記アミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸(本明細書中では「本発明の核酸」とも称する)の別の好適な発現系において、発現する工程と、場合によってはその後、
ii)このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び/又は精製する工程とを含む。
i)本発明の上記宿主が少なくとも1つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び/又はポリペプチドを発現及び/又は産生するような条件下で、本発明の宿主を培養及び/又は維持する工程と、場合によってはその後、
ii)このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを
単離及び/又は精製する工程とを含み得る。
1. 単一抗原結合ドメインとして使用することができる(及び/又はこれとしての使用を意図する)アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリを提供する方法であって、少なくとも
a)(i)PCRアセンブリによって単一抗原結合ドメインとして使用することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸へと集合化することができる、一連の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含み、さらに(ii)その一連のオリゴヌクレオチドの一部分を形成する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方の少なくとも1つの変異体を含む、オリゴヌクレオチドのプールを用意する工程であって、上記少なくとも1つの変異体が、1つ又は複数の特異的変異の存在において異なるアミノ酸配列をコードするという点で、上記オリゴヌクレオチド(及びまた存在する場合にはプールに存在する上記オリゴヌクレオチドの他の変異体)と異なる、用意する工程と、
b)オリゴヌクレオチドのプールをPCRアセンブリに供する工程とを含む、方法。
2. 提供されるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸配列をそれぞれコードするヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリである(また任意でセット、コレクション又はライブラリが所定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有し得る)、態様1に記載の方法。
3. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、免疫グロブリンフォールドを含有するか、又は免疫グロブリンフォールドを形成することが可能なアミノ酸配列をコードするようなものである、態様1又は2に記載の方法。
4. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものである、態様1又は2に記載の方法。
5. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なる、アミノ酸配列をコードするようなものである、態様4に記載の方法。
6. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つ相補性決定領域中の若しくはこれに近接した1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なる、アミノ酸配列をコードするようなものであり(CDR1、CDR2及び/又はCDR3中の又はこれに近接したアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド及びその変異体が全て変異しているのが好ましい)、
c)任意で工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、i)又はii)に記載の規則に従って生成される、相補性決定領域中に若しくはこれに近接して、少なくとも1つの特異的変異、より好ましくは特異的変異の90%、又は最も好ましくは1つ又は複数の特異的変異全てを含むか、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものであり、ここで
i)相補性決定領域(CDR)中の又はこれに近接した1つ又は複数の特異的変異が、以下の所定のアミノ酸残基(複数可)を有するアミノ酸残基を生成するように、元のヌクレオチド配列を置換することによって生成される:
元のアミノ酸残基がKである場合、Rで置換し、
元のアミノ酸残基がRである場合、Kで置換し、
元のアミノ酸残基がAである場合、S若しくはT若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がSである場合、A若しくはT若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がTである場合、A若しくはS若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がIである場合、L若しくはV若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がLである場合、I若しくはV若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がVである場合、I若しくはL若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がFである場合、Yで置換し、
元のアミノ酸残基がYである場合、Fで置換し、
元のアミノ酸残基がNである場合、Dで置換し、
元のアミノ酸残基がDである場合、Nで置換し、
元のアミノ酸残基がQである場合、Eで置換し、
元のアミノ酸残基がEである場合、Qで置換し、
元のアミノ酸残基がGである場合、Aで置換し、
元のアミノ酸残基がMである場合、Lで置換し、又は
元のアミノ酸残基がH、C、W若しくはPである場合、元のアミノ酸残基は置換せず、ここで
ii)CDR3における1つ又は複数の特異的変異は、i)で上記の規則を用いて生成され、CDR1及びCDR2中の又はこれに近接した1つ又は複数の特異的変異は、以下の所定のアミノ酸残基(複数可)を有するアミノ酸残基を生成するように、元のヌクレオチド配列を置換することによって生成される:
27位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをF、G、R及びSのいずれかで置換し、
28位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、I、S、Tのいずれかで置換し、
29位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをF、G、L、Sのいずれかで置換し、
30位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、S、Tのいずれかで置換し、
31位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、I、N、S、Tのいずれかで置換し、
32位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、N、Yのいずれかで置換し、
33位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、T、Vのいずれかで置換し、
34位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをI、Mのいずれかで置換し、
35位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、Sのいずれかで置換し、
元のアミノ酸配列がCDR2において52a位にアミノ酸配列を有する場合、以下の規則を用いる:
50位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、C、G、S、Tのいずれかで置換し、
51位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをIで置換し、
52位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、R、S、Tのいずれかで置換し、
52a位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをR、S、T、Wのいずれかで置換し、
53位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、N、S、Tのいずれかで置換し、
54位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、Gのいずれかで置換し、
55位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、Sのいずれかで置換し、
56位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをI、N、R、S、Tのいずれかで置換し、
57位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをTで置換し、
58位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、H、N、S、Yのいずれかで置換し、又は
元のアミノ酸配列がCDR2において52a位にアミノ酸配列を有しない場合、以下の規則を用いる:
50位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、R、S、Tのいずれかで置換し、
51位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをIで置換し、
52位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、S、Tのいずれかで置換し、
53位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、R、S、T、Yのいずれかで置換し、
54位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、R、Sのいずれかで置換し、
55位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをGのいずれかで置換し、
56位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをG、N、R、S、Tのいずれかで置換し、
57位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをTで置換し、
58位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、N、T、Yのいずれかで置換する、態様4に記載の方法。
7. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異及び相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なる、アミノ酸配列をコードするようなものであり、
c)任意で工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、i)又はii)に記載の規則に従って生成される、相補性決定領域における、少なくとも1つの特異的変異、より好ましくは特異的変異の90%、又は最も好ましくは1つ又は複数の特異的変異全てを含むか、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものであり、ここで
i)相補性決定領域(CDR)における1つ又は複数の特異的変異が、以下の所定のアミノ酸残基(複数可)を有するアミノ酸残基を生成するように、元のヌクレオチド配列を置換することによって生成される:
元のアミノ酸残基がKである場合、Rで置換し、
元のアミノ酸残基がRである場合、Kで置換し、
元のアミノ酸残基がAである場合、S若しくはT若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がSである場合、A若しくはT若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がTである場合、A若しくはS若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がIである場合、L若しくはV若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がLである場合、I若しくはV若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がVである場合、I若しくはL若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がFである場合、Yで置換し、
元のアミノ酸残基がYである場合、Fで置換し、
元のアミノ酸残基がNである場合、Dで置換し、
元のアミノ酸残基がDである場合、Nで置換し、
元のアミノ酸残基がQである場合、Eで置換し、
元のアミノ酸残基がEである場合、Qで置換し、
元のアミノ酸残基がGである場合、Aで置換し、
元のアミノ酸残基がMである場合、Lで置換し、又は
元のアミノ酸残基がH、C、W若しくはPである場合、元のアミノ酸残基は置換せず、ここで
ii)CDR3における1つ又は複数の特異的変異は、i)で上記の規則を用いて生成され、CDR1及びCDR2における1つ又は複数の特異的変異は、以下の所定のアミノ酸残基(複数可)を有するアミノ酸残基を生成するように、元のヌクレオチド配列を置換することによって生成される:
27位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをF、G、R及びSのいずれかで置換し、
28位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、I、S、Tのいずれかで置換し、
29位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをF、G、L、Sのいずれかで置換し、
30位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、S、Tのいずれかで置換し、
31位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、I、N、S、Tのいずれかで置換し、
32位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、N、Yのいずれかで置換し、
33位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、T、Vのいずれかで置換し、
34位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをI、Mのいずれかで置換し、
35位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、Sのいずれかで置換し、
元のアミノ酸配列がCDR2において52a位にアミノ酸配列を有する場合、以下の規則を用いる:
50位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、C、G、S、Tのいずれかで置換し、
51位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをIで置換し、
52位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、R、S、Tのいずれかで置換し、
52a位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをR、S、T、Wのいずれかで置換し、
53位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、N、S、Tのいずれかで置換し、
54位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、Gのいずれかで置換し、
55位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、Sのいずれかで置換し、
56位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをI、N、R、S、Tのいずれかで置換し、
57位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをTで置換し、
58位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、H、N、S、Yのいずれかで置換し、又は
元のアミノ酸配列がCDR2において52a位にアミノ酸配列を有しない場合、以下の規則を用いる:
50位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、R、S、Tのいずれかで置換し、
51位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをIで置換し、
52位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、S、Tのいずれかで置換し、
53位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、R、S、T、Yのいずれかで置換し、
54位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、R、Sのいずれかで置換し、
55位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをGのいずれかで置換し、
56位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをG、N、R、S、Tのいずれかで置換し、
57位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをTで置換し、
58位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、N、T、Yのいずれかで置換する、態様4に記載の方法。
8. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、免疫グロブリン可変ドメイン配列又はその好適な断片を含むか、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものである、態様4〜7のいずれか1つに記載の方法。
9. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、ドメイン抗体若しくはドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、「dAb」若しくはdAbとしての使用に適したアミノ酸配列又はナノボディ(商標)、又はその任意の好適な断片を含むか、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものである、態様8に記載の方法。
10. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、ナノボディ(商標)を含むか、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものである、態様9に記載の方法。
11. 態様1〜10のいずれか1つに記載の方法を用いて得ることができる、ヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリ。
12. 単一抗原結合ドメインとして使用することができる(及び/又はこれとしての使用を意図する)アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリを生成する方法であって、態様11に記載の、及び/又は態様1〜10のいずれか1つに記載の方法を用いて得られる、ヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリを翻訳及び/又は発現させることを含む、方法。
13. 態様12に記載の方法を用いて得ることができるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリ。
14. 態様1〜10のいずれか1つに記載の方法を用いて、及び/又は態様11に記載のセット、コレクション又はライブラリから得ることができるヌクレオチド配列又は核酸。
15. 態様14に記載のヌクレオチド配列又は核酸を発現することによって得ることができるアミノ酸配列。
16. c)1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸について、工程a)及び工程b)を通して得られるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、任意で上記1つ又は複数の所望の特性を有するアミノ酸配列をコードする、1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸を単離する工程とをさらに含む、態様1〜10のいずれか1つに記載の方法。
17. スクリーニングされるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリをコードし、またヌクレオチド配列又は核酸の上記セット、コレクション又はライブラリが任意で所定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸を含む、態様16に記載の方法。
18. スクリーニングされるヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列と比較して、1つ又は複数の特性が改善した類似体をコードするヌクレオチド配列又は核酸についてスクリーニングされる、態様17に記載の方法。
19. c)工程a)及び工程b)を通して得られるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリ由来の1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸を、それらが1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列をコードするかどうかについて試験する工程をさらに含む、態様1〜10のいずれか1つに記載の方法。
20. 試験される1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸が、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸配列をコードし、また任意で所定のアミノ酸配列をコードする、態様19に記載の方法。
21. 試験される1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸が、所定のアミノ酸配列と比較して、1つ又は複数の特性が改善した類似体をコードするヌクレオチド配列又は核酸を同定及び/又は提示するために試験される、態様20に記載の方法。
22. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列の以下の特性の1つ又は複数である、態様16〜21のいずれか1つに記載の方法:目的の抗原に対する親和性又は特異性、有効性又は活性、選択性、溶解性、安定性、凝集しやすさ、「粘り」、アミノ酸配列のフォールディング、最も近縁なヒト生殖系列配列との配列同一性の程度、ヒト免疫系によって認識され得るエピトープの存在、潜在的免疫原性、アミノ酸配列が目的の抗原との相互作用以外の1つ又は複数の相互作用の対象となることを可能にする1つ又は複数のアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチの存在、所望の宿主又は宿主細胞における発現レベル、半減期、修飾し得る部位の有無、酸化を受け得る部位又はアミノ酸残基の有無、ジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基の有無、及び/又は生体膜又は生体障壁の透過能、又は上記のいずれかの任意の所望の組合せ。
23. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様22に記載の方法:目的の抗原に対する親和性又は特異性、有効性又は活性、及び/又は選択性。
24. 1つ又は複数の特性がスクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の目的の抗原に対する親和性又は特異性を少なくとも含む、態様23に記載の方法。
25. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列又は核酸が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つ相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なる、アミノ酸配列をコードするようなものである、態様22又は23に記載の方法。
26. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様22に記載の方法:安定性、凝集しやすさ、「粘り」、アミノ酸配列のフォールディング、及び/又は所望の宿主又は宿主細胞における発現レベル。
27. 1つ又は複数の特性が、ヌクレオチド配列又は核酸によってコードされるアミノ酸配列の安定性、凝集しやすさ、及び/又は「粘り」を少なくとも含む、態様27に記載の方法。
28. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列又は核酸が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なる、アミノ酸配列をコードするようなものである、態様26又は27に記載の方法。
29. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の最も近縁なヒト生殖系列配列との配列同一性の程度を少なくとも含む、態様22に記載の方法。
30. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列又は核酸が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なる、アミノ酸配列をコードするようなものである、態様29に記載の方法。
31. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)においてヒト免疫系によって認識され得るエピトープの存在を少なくとも含み、及び/又はスクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の潜在的免疫原性(存在する場合には)を少なくとも含む、態様22に記載の方法。
32. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列又は核酸が、ヒト免疫系によって認識され得るエピトープに対応するアミノ酸残基において1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードするようなものである、態様31に記載の方法。
33. 態様16〜32のいずれか1つに記載の方法によって得ることができるヌクレオチド配列又は核酸。
34. 態様33に記載のヌクレオチド配列又は核酸を発現することによって得ることができるアミノ酸配列。
35. 単一抗原結合ドメインとして使用することができ(及び/又はこれとしての使用を意図し)、且つ1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列をコードする、1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸を提供する方法であって、上記1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列について、態様11に記載のヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングすること、並びに任意で上記1つ又は複数の所望の特性を有するアミノ酸配列をコードする、1つ又は複数のヌクレオチド配列を単離することを含む、方法。
36. スクリーニングされるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリをコードし、またヌクレオチド配列又は核酸の上記セット、コレクション又はライブラリが任意で所定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸を含む、態様35に記載の方法。
37. スクリーニングされるヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列と比較して、1つ又は複数の特性が改善した類似体をコードするヌクレオチド配列又は核酸についてスクリーニングされる、態様36に記載の方法。
38. 単一抗原結合ドメインとして使用することができ(及び/又はこれとしての使用を意図し)、且つ1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列をコードする、1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸を提供する方法であって、態様11に記載のヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリ由来のヌクレオチド配列又は核酸の1つ又は複数、及び/又は態様12に記載の1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸が、上記1つ又は複数の所望の特性を有するアミノ酸配列をコードするかどうかについて試験することを含む、方法。
39. 試験される1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸が、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸配列をコードし、また任意で所定のアミノ酸配列をコードする、態様38に記載の方法。
40. 試験される1つ又は複数のヌクレオチド配列又は核酸が、所定のアミノ酸配列と比較して、1つ又は複数の特性が改善した類似体をコードするヌクレオチド配列又は核酸を同定及び/又は提示するために試験される、態様39に記載の方法。
41. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様35〜40のいずれか1つに記載の方法:目的の抗原に対する親和性又は特異性、有効性又は活性、選択性、溶解性、安定性、凝集しやすさ、「粘り」、アミノ酸配列のフォールディング、最も近縁なヒト生殖系列配列との配列同一性の程度、ヒト免疫系によって認識され得るエピトープの存在、潜在的免疫原性、アミノ酸配列が目的の抗原との相互作用以外の1つ又は複数の相互作用の対象となることを可能にする、1つ又は複数のアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチの存在、所望の宿主又は宿主細胞における発現レベル、半減期、修飾し得る部位の有無、酸化を受け得る部位又はアミノ酸残基の有無、ジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基の有無、及び/又は生体膜又は生体障壁の透過能、又は上記のいずれかの任意の所望の組合せ。
42. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様41に記載の方法:目的の抗原に対する親和性又は特異性、有効性又は活性、及び/又は選択性。
43. 1つ又は複数の特性がスクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の目的の抗原に対する親和性又は特異性を少なくとも含む、態様42に記載の方法。
44. スクリーニングされるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つ相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードし、及び/又は試験されるヌクレオチド配列又は核酸が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つ相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードする、態様42又は43に記載の方法。
45. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様41に記載の方法:安定性、凝集しやすさ、「粘り」、アミノ酸配列のフォールディング、及び/又は所望の宿主又は宿主細胞における発現レベル。
46. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の安定性、凝集しやすさ、及び/又は「粘り」を少なくとも含む、態様45に記載の方法。
47. スクリーニングされるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードし、及び/又は試験されるヌクレオチド配列又は核酸が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードする、態様45又は46に記載の方法。
48. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の最も近縁なヒト生殖系列配列との配列同一性の程度を少なくとも含む、態様41に記載の方法。
49. スクリーニングされるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードし、及び/又は試験されるヌクレオチド配列又は核酸が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードする、態様48に記載の方法。
50. 1つ又は複数の特性が、ヒト免疫系によって認識され得るエピトープの存在、及び/又はスクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の潜在的免疫原性(存在する場合には)を少なくとも含む、態様41に記載の方法。
51. スクリーニングされるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つヒト免疫系によって認識され得るエピトープに対応するアミノ酸残基における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードし、及び/又は試験されるヌクレオチド配列又は核酸が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つヒト免疫系によって認識され得るエピトープに対応するアミノ酸残基における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードする、態様48に記載の方法。
52. 態様35〜51のいずれか1つに記載の方法を用いて得ることができるヌクレオチド配列又は核酸。
53. 態様52に記載のヌクレオチド配列又は核酸を発現することによって得ることができるアミノ酸配列。
54. 単一抗原結合ドメインとして使用することができる(及び/又はこれとしての使用を意図する)アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリを提供する方法であって、少なくとも
a)(i)PCRアセンブリによって単一抗原結合ドメインとして使用することができる(又は単一抗原結合ドメインとしての使用を目的とする)アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列へと集合化することができる、一連の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含み、さらに(ii)その一連のオリゴヌクレオチドの一部分を形成する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一方の少なくとも1つの変異体を含む、オリゴヌクレオチドのプールを用意する工程であって、上記少なくとも1つの変異体が、1つ又は複数の特異的変異の存在において異なるアミノ酸配列をコードするという点で、上記オリゴヌクレオチド(及びまた存在する場合にはプールに存在する上記オリゴヌクレオチドの他の変異体)と異なる、用意する工程と、
b)オリゴヌクレオチドのプールをPCRアセンブリに供する工程と、
c)それ自体が既知の好適な方法で、このようにして得られた(2つ以上の)集合化したオリゴヌクレオチド配列を翻訳及び/又は発現させる工程とを含む、方法。
55. 工程c)の後に与えられるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列の類似体のセット、コレクション又はライブラリである(セット、コレクション又はライブラリはまた任意で所定のアミノ酸配列も含有し得る)態様54に記載の方法。
56. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後に与えられるアミノ酸配列が、免疫グロブリンフォールドを含有するか、又は免疫グロブリンフォールドを形成することが可能であるようなものである、態様1又は2に記載の方法。
57. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後に与えられるアミノ酸配列が4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成るようなものである、態様1又は2に記載の方法。
58. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後に与えられるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるようなものである、態様4に記載の方法。
59. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後に与えられるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つ相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるようなものである、態様4に記載の方法。
60. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後に与えられるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異及び相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるようなものである、態様4に記載の方法。
61. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後に与えられるアミノ酸配列が、免疫グロブリン可変ドメイン配列又はその好適な断片を含むか、又は本質的にこれらから成るようなものである、態様4〜7のいずれか1つに記載の方法。
62. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後に与えられるアミノ酸配列が、ドメイン抗体若しくはドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、「dAb」若しくはdAbとしての使用に適したアミノ酸配列又はナノボディ(商標)、又はその任意の好適な断片を含むか、又は本質的にこれらから成るようなものである、態様8に記載の方法。
63. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後に与えられるアミノ酸配列がナノボディ(商標)を含むか、又は本質的にこれらから成るようなものである、態様9に記載の方法。
64. 態様54〜63のいずれか1つに記載の方法を用いて得ることができるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリ。
65. 態様54〜63のいずれか1つに記載の方法を用いて、及び/又は態様64に記載のセット、コレクション又はライブラリから得ることができるアミノ酸配列。
66. d)1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列について、工程a)〜工程c)を通して得られるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、任意で上記1つ又は複数の所望の特性を有する、1つ又は複数のアミノ酸配列を単離する工程とをさらに含む、態様54〜63のいずれか1つに記載の方法。
67. スクリーニングされるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり、また上記セット、コレクション又はライブラリが任意で所定のアミノ酸配列を含む、態様66に記載の方法。
68. スクリーニングされるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列と比較して、1つ又は複数の特性が改善した類似体についてスクリーニングされる、態様67に記載の方法。
69. d)工程a)〜工程c)を通して得られるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリ由来の1つ又は複数のアミノ酸配列を、それらが1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するかどうかについて試験する工程をさらに含む、態様54〜63のいずれか1つに記載の方法。
70. 試験される1つ又は複数のアミノ酸配列が、任意で所定のアミノ酸配列と共に、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸である、態様69に記載の方法。
71. 試験される1つ又は複数のアミノ酸配列が、所定のアミノ酸配列と比較して、1つ又は複数の特性が改善した類似体を同定及び/又は提示するために試験される、態様70に記載の方法。
72. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様66〜71のいずれか1つに記載の方法:目的の抗原に対する親和性又は特異性、有効性又は活性、選択性、溶解性、安定性、凝集しやすさ、「粘り」、アミノ酸配列のフォールディング、最も近縁なヒト生殖系列配列との配列同一性の程度、ヒト免疫系によって認識され得るエピトープの存在、潜在的免疫原性、アミノ酸配列が目的の抗原との相互作用以外の1つ又は複数の相互作用の対象となることを可能にする、1つ又は複数のアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチの存在、所望の宿主又は宿主細胞における発現レベル、半減期、修飾し得る部位の有無、酸化を受け得る部位又はアミノ酸残基の有無、ジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基の有無、及び/又は生体膜又は生体障壁の透過能、又は上記のいずれかの任意の所望の組合せ。
73. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様72に記載の方法:目的の抗原に対する親和性又は特異性、有効性又は活性、及び/又は選択性。
74. 1つ又は複数の特性がスクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の目的の抗原に対する親和性又は特異性を少なくとも含む、態様73に記載の方法。
75. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後で得られるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つ相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるようなものである、態様72又は73に記載の方法。
76. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるヌクレオチド配列(複数可)又は核酸(複数可)によってコードされるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様72に記載の方法:安定性、凝集しやすさ、「粘り」、アミノ酸配列のフォールディング、及び/又は所望の宿主又は宿主細胞における発現レベル。
77. 1つ又は複数の特性が、ヌクレオチド配列又は核酸によってコードされるアミノ酸配列の安定性、凝集しやすさ、及び/又は「粘り」を少なくとも含む、態様27に記載の方法。
78. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後で得られるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるようなものである、態様26又は27に記載の方法。
79. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の最も近縁なヒト生殖系列配列との配列同一性の程度を少なくとも含む、態様72に記載の方法。
80. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後で得られるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるようなものである、態様79に記載の方法。
81. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)においてヒト免疫系によって認識され得るエピトープの存在を少なくとも含み、及び/又はスクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の潜在的免疫原性(存在する場合には)を少なくとも含む、態様72に記載の方法。
82. 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程c)の後で得られるアミノ酸配列が、ヒト免疫系によって認識され得るエピトープに対応するアミノ酸残基における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるようなものである、態様81に記載の方法。
83. 態様66〜82のいずれか1つに記載の方法によって得ることができるアミノ酸配列。
84. 単一抗原結合ドメインとして使用することができ(及び/又はこれとしての使用を意図し)、且つ1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有する、1つ又は複数のアミノ酸配列を提供する方法であって、上記1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列について、態様64に記載のアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングすること、及び任意で上記1つ又は複数の所望の特性を有するアミノ酸配列をコードする、1つ又は複数のヌクレオチド配列を単離することを含む、方法。
85. スクリーニングされるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり、また上記セット、コレクション又はライブラリが任意で所定のアミノ酸配列を含む、態様84に記載の方法。
86. スクリーニングされるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリが、所定のアミノ酸配列と比較して、1つ又は複数の特性が改善した類似体についてスクリーニングされる、態様85に記載の方法。
87. 単一抗原結合ドメインとして使用することができ(及び/又はこれとしての使用を意図し)、且つ1つ又は複数の所望の特性(又は所望の特性の組合せ)を有する、1つ又は複数のアミノ酸配列を提供する方法であって、態様64に記載のヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリ由来のアミノ酸配列の1つ又は複数、及び/又は態様65に記載のアミノ酸配列の1つ又は複数が、上記1つ又は複数の所望の特性を有するかどうかについて試験することを含む、方法。
88. 試験される1つ又は複数のアミノ酸配列が、所定のアミノ酸配列の類似体であり、また任意で所定のアミノ酸配列を含む、態様87に記載の方法。
89. 試験される1つ又は複数のアミノ酸配列が、所定のアミノ酸配列と比較して、1つ又は複数の特性が改善した類似体を同定及び/又は提示するために試験される、態様88に記載の方法。
90. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様84〜89のいずれか1つに記載の方法:目的の抗原に対する親和性又は特異性、有効性又は活性、選択性、溶解性、安定性、凝集しやすさ、「粘り」、アミノ酸配列のフォールディング、最も近縁なヒト生殖系列配列との配列同一性の程度、ヒト免疫系によって認識され得るエピトープの存在、潜在的免疫原性、アミノ酸配列が目的の抗原との相互作用以外の1つ又は複数の相互作用の対象となることを可能にする、1つ又は複数のアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチの存在、所望の宿主又は宿主細胞における発現レベル、半減期、修飾し得る部位の有無、酸化を受け得る部位又はアミノ酸残基の有無、ジスルフィド架橋を形成し得るシステイン残基の有無、及び/又は生体膜又は生体障壁の透過能、又は上記のいずれかの任意の所望の組合せ。
91. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様90に記載の方法:目的の抗原に対する親和性又は特異性、有効性又は活性、及び/又は選択性。
92. 1つ又は複数の特性がスクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の目的の抗原に対する親和性又は特異性を少なくとも含む、態様91に記載の方法。
93. スクリーニングされるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリが、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つ相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり、及び/又は試験されるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つ相補性決定領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列である、態様91又は92に記載の方法。
94. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の以下の特性の1つ又は複数である、態様90に記載の方法:安定性、凝集しやすさ、「粘り」、アミノ酸配列のフォールディング、及び/又は所望の宿主又は宿主細胞における発現レベル。
95. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の安定性、凝集しやすさ、及び/又は「粘り」を少なくとも含む、態様94に記載の方法。
96. スクリーニングされるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリが、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり、及び/又は試験されるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードする、態様94又は95に記載の方法。
97. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の最も近縁なヒト生殖系列配列との配列同一性の程度を少なくとも含む、態様90に記載の方法。
98. スクリーニングされるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり、及び/又は試験されるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つフレームワーク領域における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードする、態様91に記載の方法。
99. 1つ又は複数の特性が、スクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)におけるヒト免疫系によって認識され得るエピトープの存在、及び/又はスクリーニング又は試験されるアミノ酸配列(複数可)の潜在的免疫原性(存在する場合には)を少なくとも含む、態様90に記載の方法。
100. スクリーニングされるヌクレオチド配列又は核酸のセット、コレクション又はライブラリが、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つヒト免疫系によって認識され得るエピトープに対応するアミノ酸残基における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり、及び/又は試験されるアミノ酸配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むか、又は本質的にこれらから成り、且つヒト免疫系によって認識され得るエピトープに対応するアミノ酸残基における1つ又は複数の特異的変異の存在において互いに異なる、態様48に記載の方法。
101. 態様84〜100のいずれか1つに記載の方法を用いて得ることができるアミノ酸配列。
102. 配列番号50〜配列番号121で示される配列を有するアミノ酸配列と、配列番号123〜配列番号176で示される配列を有するアミノ酸配列とから成る群から選択されるアミノ酸配列。
103. 配列番号50〜配列番号121で示される配列を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列。
104. 配列番号74、配列番号93、配列番号94、配列番号104、配列番号105、配列番号116〜配列番号120で示される配列を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列。
105. 配列番号123〜配列番号176で示される配列を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列。
106. 配列番号123、配列番号149、配列番号152、配列番号156、配列番号169で示される配列を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列。
実施例1:ナノボディ32C9(国際公開第2008020079号パンフレットではIL6R04及び配列番号440とも称される)のライブラリベースのヒト化
26個の重複オリゴヌクレオチド(図2で示される、配列番号23〜配列番号48)のセットを、ナノボディ32C9(IL6R04、配列番号49)のヒト化変異体のライブラリのアセンブリに使用した。
先頭に示される数字はカバットに従っている。ナノボディ32C9野生型を太字で示す。「N.d」は解離速度を測定しなかったことを示している。
ライブラリ設計
ナノボディIL6R65(配列番号121)と、その標的となるヒトIL6Rとの親和性を改善するために、抗原結合CDR領域において1つ又は複数の置換を含有するIL6R65変異体から成るライブラリを作製した。CDRが多様であるので、2つの異なる戦略を使用した:
i.以下のスキームに従った、同様の側鎖化学構造を有するアミノ酸によるそれぞれのCDR残基の置換:
a.K⇔R
b.A⇔S⇔T
c.I⇔L⇔V
d.F⇔Y
e.N⇔D
f.Q⇔E
g.G→A
h.M→L
i.H、C、W、Pは一定のままである。
ii.所定の位置における天然のアミノ酸のパネルによるそれぞれのCDR残基の置換。27位〜35位(CDR1)及び50位〜58位(CDR2)のナノボディで最も頻繁に発生するアミノ酸を表B−2に列挙する(カバットに従ったナンバリング)。それぞれの位置での実際の組成は、単一縮重コドンによってコードされ得る残基の種類によって逸脱し得る。ライブラリの全体的な多様性を制限するために、1つの位置当たりの異なるアミノ酸の数を減らしてもよい。
変異したCDR領域をコードするDNA断片を、縮重オリゴヌクレオチドを用いたPCR重複伸長によって生成した。XmaI/XbaI(ライブラリa及びライブラリb)又はBspeI/NotI(ライブラリc)(New England Biolabs製の酵素)のいずれかによる消化の後、断片を特注の(tailored)pAX50ファージ提示ベクターの対応する制限部位にクローン化した。これらのベクターは既に、IL6R65の部分的な且つフレームシフトした遺伝子断片を含有しており、クローン化することで、リーディングフレームを復元し、全長のIL6R65遺伝子を生成するように設計した。3つ全てのライブラリの実際の大きさは約1×108であった(100×理論的多様性)。
低減濃度(10nM→1pM)のビオチン化IL6R(Peprotech)の溶液を用いて、最大3回、ファージライブラリを処理した(panned)。ファージとバイオIL6Rとの間の複合体を1分間、電磁ストレプトアビジンビーズ(Invitrogen)で捕捉し、その後PBS−Tweenで5回洗浄した。結合ファージを、37℃で30分間の、1mg/mlのトリプシンとのインキュベーションによって溶出した。様々な希釈率の溶出ファージを大腸菌TG1細胞(対数期)(TG1電気穿孔コンピテント細胞:Stratagene製の細胞、カタログ番号200123、5×0.1ml)に感染させることよって、ファージ力価を求めた。対照サンプル(ビオチン化IL6Rを有しない)よりも高いファージ力価が得られるセレクション条件を、さらなる解析のために選択した。
個々のコロニーを取り出し、それらを1mlの2×YT(Yeast Tryptone)培地+100μg/mlのカルベニシリン中、37℃で一晩培養することによって、セレクション結果を解析した。ペリプラズム抽出物を含有するナノボディを調製し、PBSで10倍に希釈した後、ELISAにおいて抗原結合について試験した。ELISAシグナルが最も高いクローンをシークエンシングし、ビアコアで解析した。ELISAにおける上位50個のクローンは、1.4×10−3s−1〜1.2×10−4s−1の解離速度を示した。CDR3ライブラリ由来の最良のクローンの解離速度は7×10−4s−1であった。ナノボディ配列及び解離速度は表B−3に列挙する。
2.6×10−4s−1〜4.4×10−4s−1の範囲に解離速度が改善した、ライブラリb由来の5つのナノボディを大腸菌で発現させ、IMACクロマトグラフィで精製した。様々な濃度の精製ナノボディでの結合曲線をビアコアで読み取り、ka、kd及びKdの値を算出するのに使用した(表B−4)。これら5つのクローンのKd値は0.34nM〜0.95nMであり、最良の変異体では、親分子と比較して13倍の改善に相当する。
Claims (19)
- 単一抗原結合ドメインとして使用することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のライブラリを提供する方法であって、
a)以下を含むオリゴヌクレオチドのプールを用意する工程
(i)PCRアセンブリによって単一抗原結合ドメインとして使用することができるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列又は核酸へと集合化することができる、一連の少なくとも2つのオリゴヌクレオチド、及びさらに
(ii)少なくとも1つの変異体が、1つ又は複数の特異的変異が存在するアミノ酸配列をコードするという点で、前記オリゴヌクレオチド(及びまた存在する場合には該プールに存在する前記オリゴヌクレオチドの他の変異体)と異なる、一連のオリゴヌクレオチドの一部分を形成する少なくとも2つのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1つの変異体、ならびに
b)該オリゴヌクレオチドのプールをPCRアセンブリに供する工程
を少なくとも含む、ライブラリを提供する方法。 - 提供されるヌクレオチド配列又は核酸の該ライブラリが、所定のアミノ酸配列の類似体であるアミノ酸配列をそれぞれコードするヌクレオチド配列のライブラリである(また任意で該セット、コレクション又はライブラリが該所定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有し得る)、請求項1に記載の方法。
- 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、免疫グロブリンフォールドを含有するアミノ酸配列か、又は免疫グロブリンフォールドを形成することが可能なアミノ酸配列をコードするようなものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域を含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成り、及び該フレームワーク領域における1つ若しくは複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードするようなものである、請求項4に記載の方法。
- 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成り、及び該相補性決定領域における1つ若しくは複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードするようなものであり、
c)任意で工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、i)又はii)に記載の規則に従って生成される、該相補性決定領域中に若しくはこれに近接して、該1つ若しくは複数の特異的変異を含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものであり、ここで
i)該相補性決定領域(CDR)中の又はこれに近接した、該1つ又は複数の特異的変異が、以下の所定のアミノ酸残基(複数可)を有するアミノ酸残基を生成するように、元のヌクレオチド配列を置換することによって生成される:
元のアミノ酸残基がKである場合、Rで置換し、
元のアミノ酸残基がRである場合、Kで置換し、
元のアミノ酸残基がAである場合、S若しくはT若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がSである場合、A若しくはT若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がTである場合、A若しくはS若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がIである場合、L若しくはV若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がLである場合、I若しくはV若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がVである場合、I若しくはL若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がFである場合、Yで置換し、
元のアミノ酸残基がYである場合、Fで置換し、
元のアミノ酸残基がNである場合、Dで置換し、
元のアミノ酸残基がDである場合、Nで置換し、
元のアミノ酸残基がQである場合、Eで置換し、
元のアミノ酸残基がEである場合、Qで置換し、
元のアミノ酸残基がGである場合、Aで置換し、
元のアミノ酸残基がMである場合、Lで置換し、又は
元のアミノ酸残基がH、C、W若しくはPである場合、元のアミノ酸残基は置換せず、ここで
ii)CDR3中の又はこれに近接した、該1つ又は複数の特異的変異は、i)で上述の規則を用いて生成され、CDR1及びCDR2中の又はこれに近接した該1つ又は複数の特異的変異は、以下の所定のアミノ酸残基を有するアミノ酸残基を生成するように、該元のヌクレオチド配列を置換することによって生成される:
27位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをF、G、R及びSのいずれかで置換し、
28位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、I、S、Tのいずれかで置換し、
29位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをF、G、L、Sのいずれかで置換し、
30位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、S、Tのいずれかで置換し、
31位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、I、N、S、Tのいずれかで置換し、
32位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、N、Yのいずれかで置換し、
33位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、T、Vのいずれかで置換し、
34位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをI、Mのいずれかで置換し、
35位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、Sのいずれかで置換し、
元のアミノ酸配列がCDR2において52a位にアミノ酸配列を有する場合、以下の規則を用いる:
50位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、C、G、S、Tのいずれかで置換し、
51位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをIで置換し、
52位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、R、S、Tのいずれかで置換し、
52a位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをR、S、T、Wのいずれかで置換し、
53位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、N、S、Tのいずれかで置換し、
54位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、Gのいずれかで置換し、
55位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、Sのいずれかで置換し、
56位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをI、N、R、S、Tのいずれかで置換し、
57位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをTで置換し、
58位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、H、N、S、Yのいずれかで置換し、又は
元のアミノ酸配列がCDR2において52a位にアミノ酸配列を有しない場合、以下の規則を用いる:
50位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、R、S、Tのいずれかで置換し、
51位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをIで置換し、
52位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、S、Tのいずれかで置換し、
53位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、R、S、T、Yのいずれかで置換し、
54位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、R、Sのいずれかで置換し、
55位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをGのいずれかで置換し、
56位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをG、N、R、S、Tのいずれかで置換し、
57位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをTで置換し、
58位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、N、T、Yのいずれかで置換する、請求項4に記載の方法。 - 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、4つのフレームワーク領域と3つの相補性決定領域とを含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成り、及び該フレームワーク領域における1つ若しくは複数の特異的変異及び該相補性決定領域中の又はこれに近接した1つ若しくは複数の特異的変異の存在において互いに異なるアミノ酸配列をコードするようなものであり、
c)任意で工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、i)又はii)に記載の規則に従って生成される、該相補性決定領域中に又はこれに近接して、該1つ若しくは複数の特異的変異を含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものであり、ここで
i)該相補性決定領域(CDR)中の又はこれに近接した、該1つ又は複数の特異的変異が、以下の所定のアミノ酸残基(複数可)を有するアミノ酸残基を生成するように、該元のヌクレオチド配列を置換することによって生成される:
元のアミノ酸残基がKである場合、Rで置換し、
元のアミノ酸残基がRである場合、Kで置換し、
元のアミノ酸残基がAである場合、S若しくはT若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がSである場合、A若しくはT若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がTである場合、A若しくはS若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がIである場合、L若しくはV若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がLである場合、I若しくはV若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がVである場合、I若しくはL若しくはその両方で置換し、
元のアミノ酸残基がFである場合、Yで置換し、
元のアミノ酸残基がYである場合、Fで置換し、
元のアミノ酸残基がNである場合、Dで置換し、
元のアミノ酸残基がDである場合、Nで置換し、
元のアミノ酸残基がQである場合、Eで置換し、
元のアミノ酸残基がEである場合、Qで置換し、
元のアミノ酸残基がGである場合、Aで置換し、
元のアミノ酸残基がMである場合、Lで置換し、又は
元のアミノ酸残基がH、C、W若しくはPである場合、元のアミノ酸残基は置換せず、ここで
ii)CDR3における1つ又は複数の特異的変異は、i)で上述の規則を用いて生成され、CDR1及びCDR2における1つ又は複数の特異的変異は、以下の所定のアミノ酸残基(複数可)を有するアミノ酸残基を生成するように、元のヌクレオチド配列を置換することによって生成される:
27位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをF、G、R及びSのいずれかで置換し、
28位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、I、S、Tのいずれかで置換し、
29位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをF、G、L、Sのいずれかで置換し、
30位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、S、Tのいずれかで置換し、
31位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、I、N、S、Tのいずれかで置換し、
32位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、N、Yのいずれかで置換し、
33位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、T、Vのいずれかで置換し、
34位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをI、Mのいずれかで置換し、
35位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、Sのいずれかで置換し、
元のアミノ酸配列がCDR2において52a位にアミノ酸配列を有する場合、以下の規則を用いる:
50位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、C、G、S、Tのいずれかで置換し、
51位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをIで置換し、
52位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、R、S、Tのいずれかで置換し、
52a位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをR、S、T、Wのいずれかで置換し、
53位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、N、S、Tのいずれかで置換し、
54位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、Gのいずれかで置換し、
55位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、Sのいずれかで置換し、
56位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをI、N、R、S、Tのいずれかで置換し、
57位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをTで置換し、
58位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、H、N、S、Yのいずれかで置換し、又は
元のアミノ酸配列がCDR2において52a位にアミノ酸配列を有しない場合、以下の規則を用いる:
50位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをA、G、R、S、Tのいずれかで置換し、
51位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをIで置換し、
52位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、S、Tのいずれかで置換し、
53位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをN、R、S、T、Yのいずれかで置換し、
54位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、G、R、Sのいずれかで置換し、
55位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをGのいずれかで置換し、
56位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをG、N、R、S、Tのいずれかで置換し、
57位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをTで置換し、
58位で元のアミノ酸残基が変異する場合、これをD、N、T、Yのいずれかで置換する、請求項4に記載の方法。 - 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、免疫グロブリン可変ドメイン配列若しくはその好適な断片を含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものである、請求項4〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、ドメイン抗体若しくはドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、単一ドメイン抗体若しくは単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列、「dAb」若しくはdAbとしての使用に適したアミノ酸配列若しくはナノボディ、若しくはその任意の好適な断片を含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものである、請求項8に記載の方法。
- 工程a)で使用するオリゴヌクレオチド及びその変異体は、工程b)におけるPCRアセンブリの結果として得られるヌクレオチド配列が、ナノボディを含むアミノ酸配列か、又は本質的にこれらから成るアミノ酸配列をコードするようなものである、請求項9に記載の方法。
- c)が強制的なものである、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 該オリゴヌクレオチドがCDR1、CDR2若しくはCDR3中に又はこれに近接して変異を有するアミノ酸配列をコードする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法を用いて得ることができるヌクレオチド配列のライブラリ。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法を用いて得ることができるアミノ酸配列。
- 配列番号50〜配列番号121で示される配列を有するアミノ酸配列と、配列番号123〜配列番号176で示される配列を有するアミノ酸配列とから成る群から選択されるアミノ酸配列。
- 配列番号50〜配列番号121で示される配列を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列。
- 配列番号74、配列番号93、配列番号94、配列番号104、配列番号105、配列番号116〜配列番号120で示される配列を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列。
- 配列番号123〜配列番号176で示される配列を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列。
- 配列番号123、配列番号149、配列番号152、配列番号156、配列番号169で示される配列を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列。
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