PT1233987E - Imobilização de moléculas de ligação ao antigénio de um domínio - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
IMOBILIZAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTIGÉNIO DE UM DOMÍNIO CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à imobilização dos domínios de ligação de antigénios (VHH) de anticorpos naturalmente desprovidos de cadeias leves ou os seus equivalentes funcionais nas superfícies sólidas com retenção da actividade de ligação. Mais particularmente, a invenção refere-se à preparação e uso de materiais imuno-activos que compreendem um domínio VHH, sem nenhuma extensão peptídica, imobilizados numa superfície sólida mediante interacções covalentes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os processos direccionada para a imobilização das proteínas numa superfície sólida são de um considerável interesse comercial. A funcionalidade das superfícies com materiais imunológicos, como por exemplo os anticorpos ou em particular os fragmentos de anticorpos, forma a base das técnicas de imunoadsorção tais como os processos de purificação de imunoafinidade que mais frequentemente são aplicadas para a recuperação ou para a purificação de uma gama de materiais comercialmente importantes.
Comummente, a fixação das proteínas às superfícies sólidas, tais como os meios de cromatografia, foi realizada expondo a superfície a uma solução da proteína de maneira a que a proteína fosse adsorvida na superfície sólida via mecanismos de ligação não específicos. Os métodos para imobilizar as proteínas nos meios de cromatografia estão bem estabelecidos na bibliografia, ver por exemplo, em Protein Immobilisation, R.F. Taylor ed.,
Mareei Dekker, Inc., New York, 1991. Se a superfície sólida está provida com um material hidrofóbico como por exemplo o poliestireno, então a fixação é geralmente realizada pela 1/23 adsorção das regiões hidrofóbicas da proteína na superfície hidrofóbica.
Normalmente, a adsorção na superfície sólida é acompanhada por ruptura conformacional significativa com desdobramento e desnaturação parcial da respectiva proteína. A perda concomitante da actividade da proteína reduz a utilidade global do processo. Comummente, por exemplo, a adsorção dos anticorpos numa superfície hidrofóbica é acompanhada da perda na ordem de mais de 95% da actividade de ligação assim como uma especificidade de ligação diminuída. Se há fragmentos de anticorpos mais pequenos envolvidos, o grau de afinidade da ligação específica conservada após a adsorção numa superfície sólida pode ainda ser inferior, como o descrito por Molina-Bolivar et al, J. Biomaterials Science-Polymer Edition, 9, 1103- 1113, 1998.
Na preparação das superfícies com proteínas imobilizadas foram consideradas alternativas ou aperfeiçoamentos ao método de adsorção das proteínas.
Um procedimento alternativo é o de usar a reticulação química de resíduos na proteína para a fixação covalente a uma superfície sólida activada usando químicas de acoplamento convencional, por exemplo como as descritas em Bioconjugate Techniques, G.T.
Hermanson, ed. Academic Press, Inc., San Diego, CA, USA. Os resíduos de aminoácidos que incorporam grupos sulfidrilo, tais como a cisteína, podem ser fixados de maneira covalente usando um reagente bi-específico como por exemplo succinimidil- maleimidofenilbutirato (SMPB). De forma alternativa, os grupos de lisina localizados na superfície das proteínas podem ser acopladas a grupos carboxil activados na superfície sólida por acoplamento de carbodiimida convencional usando l,etil-3-[3- dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) . Uma desvantagem deste procedimento é que os resíduos da reticulação na proteína podem interferir na funcionalidade da 2/23 proteína. Quanto mais pequeno é o fragmento de anticorpo a ser imobilizado, maior é a probabilidade de que a reticulação envolva um resíduo no, ou perto do sítio de ligação do antigénio e, consequentemente, que interfira na actividade de ligação. Isto tem sido especificamente observado para o caso dos domínios VH clássicos isolados, em que foi descoberto que a reticulação produzia perdas substanciais na afinidade e especificidade da ligação (ver, por exemplo, Berry et al, Journal of
Chromatography, 597, 239-245 (1992), que sugere que os domínios VH clássicos são mais facilmente inactivados do que os fragmentos Fv durante a imobilização). Como o mostrado por Spitznagel et al, Bio/Technology, 11, 825-829, (1993), além das actividades específicas reduzidas, os anticorpos imobilizados geralmente exibem afinidades de ligação mais baixas do que as dos seus homólogos solúveis.
Subministrando o fragmento do anticorpo com uma extensão em forma de uma cauda peptídica ou um domínio de proteína adicional, a fixação da proteína à superfície pode ser ocasionada pela adsorção não covalente ou usando agentes de reticulação químicos convencionais num sítio remoto do corpo principal da proteína. Desta maneira, é menos provável que o próprio processo de imobilização interfira na funcionalidade da proteína.
Podem também ser empregues procedimentos de acoplamento racional para controlar a orientação do fragmento do anticorpo (Rao et al, Mikrochimica Acta, 128 (3-4), 127-143, 1998). Além disso, o aumento do comprimento do ligador químico usado para fixar a molécula imobilizada ao suporte sólido pode reduzir as tensões conformacionais na proteína, permitindo que ela exista numa conformação mais natural. 0 Pedido de Patente europeia EP 0434317 (Joseph Crosfield &
Sons) descreve o uso de meios de purificação de afinidade melhorada que emprega agentes de ligação específicos pequenos, 3/23 especialmente fragmentos de anticorpos Fv. Estes opcionalmente têm uma cauda hidrofóbica, com um grupo de ligação particularmente preferido sendo o epitopo myc (Munro, S., & Pelham, H.R. (1986) Cell 46, 291-300) . Esta cauda está destinada principalmente a facilitar a imobilização do agente de ligação por fixação não covalente numa superfície hidrofóbica, apesar de que o grupo myc contenha um resíduo de lisina, ele poderá ser também usado para a fixação covalente nas superfícies. O Pedido de Patente WO 91/08482 (Unilever) descreve no exemplo 6 uma anti-lisozima VH sem cauda, imobilizada numa fase sólida; dos resultados apresentados é evidente que a actividade de ligação dos anticorpos é adversa e severamente afectada quando comparada com os fragmentos imobilizados VH numa superfície sólida via uma cauda peptídica.
No entanto, mantêm-se a necessidade de melhorar a capacidade para preparar superfícies imuno-activas com a imobilização de fragmentos de anticorpos conservando estes a sua afinidade e a sua especificidade de ligação, preferencialmente sem que seja necessária a sua elaboração com sequências de cauda.
Uma classe de anticorpos de interesse particular relacionada com as aplicações biotecnológicas compreende os anticorpos de cadeia pesada como os que se encontram nos camelídeos, como o camelo ou a lama. Os elementos de ligação destes anticorpos consistem num único domínio de polipeptídeo, isto é a região variável do polipeptídeo de cadeia pesada (VHH). Estes anticorpos estão naturalmente desprovidos de cadeias leves com o domínio variável de cadeia pesada formando o sítio de ligação do antigénio completo. Pelo contrário, os anticorpos clássicos (murinos, humanos, etc...), têm elementos de ligação que compreendem dois domínios de polipeptídeo (as regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e de cadeia leve (VL)). A falta de dependência na interacção com um domínio variável de cadeia leve para manter a integridade estrutural e funcional dá a estes domínios VHH uma 4/23 vantagem substancial sobre outros fragmentos de anticorpo pequenos, enquanto à facilidade de produção e de comportamento em solução. Em particular, os fragmentos VHH são os tipos preferidos das moléculas para a purificação por imunoafinidade, devido à sua estabilidade pouco comum e à sua capacidade de eficazmente de redobrar após a sua completa desnaturação, que frequentemente se dá durante a eluiçao do antigénio. M. Arbabi-Ghahroudi et al, FEBS Letters, vol 414 no 3, 15 September 1997, pages 521-526 descreve a selecção e a identificação de fragmentos de anticorpos de dominio único dos anticorpos de cadeia pesada de camelo (domínio VHH) .
Os procedimentos para obter imunoglobulinas de cadeia pesada de camelídeos, ou os seus fragmentos (funcionalizados) , foram descritos no Pedido de Patente WO 94/04678 (Casterman et al) e no Pedido de Patente WO 94/25591 (Frenken et al) . Os fragmentos VHH podem ser produzidos através da tecnologia de ADN recombinante em vários hospedeiros microbianos, (bacterianos, levedura, molde), como o descrito no Pedido de Patente WO 94/29457 (Frenken et al). De forma alternativa, os domínios da ligação podem ser obtidos por modificação dos fragmentos VH de anticorpos tradicionais por um procedimento denominado "camelização", descrito por Davies et al, Bio/Technology, 13, 475-479 (1995) . Por este meio o fragmento VH clássico é mutado, substituindo um número de aminoácidos presentes na interface VH/LV, num fragmento tipo VHH, pelo qual as suas propriedades de ligação são mantidas.
A imobilização de um fragmento VHH com uma cauda His numa camada de dextrano carboxilado usando química de acoplamento EDC/NHS foi descrita por Muyldermans et al, EMBO Journal, 17 (13) , P3512-3520, 1998 A imobilização mediada com cauda de polipeptídeo de fragmentos VHH nas superfícies sólidas foi também proposta no Pedido de Patente WO 99/23221 (Unilever). 5/23
RESUMO DA INVENÇÃO A invenção descreve a imobilização de fragmentos de ligação do antigénio dominio único de anticorpos desprovidos naturalmente de cadeias leves (VHH), ou dominios de proteína funcionalmente equivalentes a eles, numa superfície sólida através da reticulação covalente enquanto continua a conservar a suficiente actividade biológica para permitir que os fragmentos funcionem (por exemplo como numa matriz de purificação de afinidade). Os próprios fragmentos são imobilizados directamente na superfície sólida; estes estão desprovidos de qualquer grupo polipeptídeo agregado através do qual a imobilização poderá ser mediada de qualquer outro modo. Os fragmentos VHH descritos são normalmente inferiores a 20 kDa em peso molecular e só contêm a sequência de aminoácidos necessária para formar um fragmento VHH funcional completo ou uma proporção deles (fragmento truncado). A presente invenção pode ser melhor entendida com referência à descrição seguinte quando lida em conjunto com os desenhos anexos em que: A figura 1 mostra uma análise por SDS-PAGE do acoplamento dos fragmentos de anticorpos VHH a CNBr-sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech). As proteínas foram tingidas usando o azul brilhante de Coomassie. O set marcador de peso molecular foi o de GibcoBRL (BenchMark Lot. N°.: 1080925). A figura 2 mostra os cromatogramas obtidos durante a purificação do IgG de rato do soro por cromatograf ia de imunoaf inidade usando a versão marcada imobilizada (codificada IA) e a versão não marcada (codificada 3) de VHH#1. A figura 3 representa amostras de purificação de IgG de rato do soro por cromatografia de imunoafinidade, analisadas num gel SDS-PAGE tingido com azul brilhante de Coomassie. 6/23
Painel esquerdo: purificação usando VHH#1 imobilizado não marcado. (linha 1: marcadores de peso molecular; linha 2: soro de rato; linha 3: fluxo (fracção 3 - ver figura 2); linha 4: eluição (fracção 10 - ver figura 2).
Painel direito: purificação usando VHH#1 imobilizado marcado, (linha 1: marcadores de peso molecular; linha 2: soro de rato; linha 3: fluxo (fracção 3); linha 4: eluição (fracção 10).
Marcadores de peso molecular: marcador GibcoBRL BenchMark (Lot. No.: 1080925) A figura 4 representa amostras de purificação de IgG de soro do rato analisada por Western blot.
Linha 1,5,9: marcadores
Linhas 2-4: purificação usando VHH#1 imobilizado não marcado (linha 2: soro de rato; linha 3: fluxo (fracção 3 - ver figura 2); linha 4: eluição (fracção 10 - ver figura 2).
Linhas 6-8: purificação usando VHH#1 imobilizado marcado (linha 6: soro de rato; linha 7: fluxo (fracção 3 - ver figura 2); linha 8: eluição (fracção 10 - ver figura 2)
Marcadores de peso molecular: Marcador GibcoBRL BenchMark (Lot. No.: 1080925). A figura 5 mostra um cromatograma obtido durante a purificação da erva AFP de caldo por cromatografia de imunoafinidade usando a versão de VHH#2 imobilizado não marcado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 7/23 A invenção tem como base o descobrimento de que os fragmentos VHH clonados podem ser fixados a uma superficie de matriz de fase sólida (e ao mesmo tempo conservar a suficiente actividade para funcionar como ligando de afinidade de uma matriz de purificação) na ausência de qualquer grupo polipeptídeo agregado tal como caudas peptidicas ou dominios de proteína extras (domínio pesado não variável).
Surpreendentemente, isto contrasta com a situação dos fragmentos VH clássicos em que, para conservar a actividade de ligação, foi descoberto que era necessário prover o fragmento com uma cauda de polipeptídeo através da qual a imobilização podia ser mediada, de forma a que se desse a fixação à superfície sólida num lugar afastado do sítio de ligação ao antigénio. As razões convencionais do referido é que todos os resíduos nesse domínio de ligação pequeno são igualmente importantes para a ligação ao antigénio assim como para assegurar a integridade estrutural e portanto que a reticulação em qualquer ponto da molécula tenha tendência a produzir a sua inactivação. Supondo que os domínios VHH e VH têm um tamanho similar, geralmente seria de esperar que os dois fossem submetidos a perturbações de inactivação idênticas após a imobilização numa superfície.
Os presentes inventores mostraram claramente que a imobilização dos domínios VHH, desprovidos de qualquer extensão peptídica, numa superfície através da reticulação covalente não destrói a sua capacidade de ligação aos antigénios com alta afinidade e selectividade. Também, foi demonstrado que a provisão de uma extensão de peptídeo reticulável não melhoria a eficiência da reacção de reticulação nem a capacidade de ligação ao antigénio ou a selectividade dos domínios VHH ligados. A capacidade de fixar os fragmentos dos anticorpos funcionais directamente a uma superfície, melhor do que via uma sequência marcadora fundida, é extremamente vantajosa porque é bem conhecido que as proteínas de fusão deste tipo são altamente 8/23 susceptíveis de proteólise, com a consequente perda do anticorpo imobilizado da superfície; ver por exemplo McCafferty, J. et al (1990) Nature 348, 552-554.
Um domínio VHH é um domínio variável de cadeia pesada derivado de uma imunoglobulina naturalmente desprovida de cadeias leves, como o que pode ser obtido de camelídeos como foi descrito anteriormente. A capacidade de ligação e a especificidade do antigénio está localizada natural e exclusivamente no domínio variável da cadeia pesada; isto é, o domínio variável da cadeia pesada forma o sítio da ligação ao antigénio completo.
Os termos "imunoglobulina" e "anticorpo" são utilizados como sinónimos em toda esta especificação a não ser que seja indicado o contrário.
Uma vantagem do uso das imunoglobulinas ou dos domínios variáveis de cadeia pesada naturalmente desprovidos de cadeias leves é que podem ser fácil e convenientemente produzidas de forma económica em grande escala, por exemplo, usando um hospedeiro eucariótico inferior transformado como o descrito no Pedido de Patente WO 94/25591, acima mencionado. Também, como o acima mencionado, a ausência de dependência de uma cadeia leve para assegurar a integridade estrutural e funcional faz com que os domínios VHH isolados sejam mais estáveis e mais fáceis de manusear que outros fragmentos de anticorpos pequenos tais como os domínios VH clássicos. Isto é especialmente vantajoso para a preparação de matrizes de afinidade reutilizáveis.
Por funcionalmente equivalente entender-se-á qualquer proteína que tenha as mesmas ou propriedades de ligação de antigénio similares localizadas num único domínio de ligação. Será apreciado que também de maneira adequada de acordo com a invenção podem ser usadas proteínas modificadas que possam funcionar como domínios de ligação da mesma maneira que os domínios variáveis de imunoglobulina de cadeia pesada dos 9/23 camelídeos (ver Davies et al, Bio Technology, 13, 475-479; (1995)).
De acordo com uma forma de realizar a invenção, o domínio VHH ou a proteína funcionalmente equivalente é fixada a uma superfície sólida por reticulação covalente usando químicas de acoplamento convencional.
Será apreciado que desde que o domínio VHH ou funcional equivalente seja fixado a uma superfície sólida por acoplamento covalente, a superfície deverá ser capaz de se acoplar de maneira covalente ao domínio VHH. Naturalmente, que a superfície sólida pode compreender resíduos reticuláveis adequados para a fixação covalente ou pode ser revestida ou derivatizada para introduzir grupos adequados reticuláveis de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. A superfície sólida sobre a qual imobilização de acordo com a invenção é desenvolvida pode ser provida com uma variedade de materiais e pode de maneira adequada ser qualquer material de suporte de fase sólida habitualmente usado na imobilização das proteínas. A invenção é aplicável a qualquer material de fase sólida que possa ser receptivo à imobilização de proteínas ou fragmentos de proteína, tanto directamente como depois de um tratamento prévio. Os materiais de suporte podem ser granulosos (por exemplo pérolas ou grânulos, geralmente utilizados em colunas de extracção) ou em forma de folha (por exemplo membranas ou filtros, placas de vidro ou de plástico, placas de ensaio de microtitulação, tira reactiva, dispositivos de enchimento capilar, ou outros), que podem ser planos, com dobras, ou fibras ocas ou tubos. As matrizes seguintes são dadas como exemplos e não são exaustivas, estes exemplos poderão incluir sílica (sílica amorfa porosa), isto é as séries FLASH de cartuchos que 10/23 contêm sílica irregular 60A (32-63 μιη ou 35-70 μπι) fornecidos por Biotage (uma divisão de Dyax Corp.), suportes de agarose ou poliacrilamida, por exemplo a gama de Sepharose dos produtos fornecidos por Amersham Pharmacia Biotech, ou os suportes Affi-gel fornecidos por Bio-Rad. Adicionalmente há polímeros macroporosos, tais como os suportes Affi-Prep estáveis à pressão fornecidos por Bio-Rad. Outros suportes que poderão ser utilizados incluem; dextrano, colagénio, poliestireno, metacrilato, alginato de cálcio, vidro de poro controlado, alumínio, titânio e cerâmicas porosas. De forma alternativa, a superfície sólida pode compreender parte de um sensor dependente da massa, por exemplo, um detector de ressonância do plasmão de superfície. Outros exemplos de suportes comercialmente disponíveis são discutidos por Taylor, R.F. (1991), acima referido. Convenientemente é provido um vector que compreende um conjunto de fragmentos de ligação ao antigénio individual ligados a uma superfície sólida.
Os avanços em biologia molecular, particularmente através da mutagénese sítio dirigida, permitem a mutação dos resíduos dos aminoácidos específicos numa sequência de proteína. A mutação de um aminoácido particular numa proteína com estrutura conhecida ou inferida) a uma lisina ou cisteína (ou outro aminoácido desejado) podem por exemplo prover um sítio específico para o acoplamento covalente. Também é possível voltar a desenhar uma proteína específica para alterar a distribuição dos aminoácidos disponíveis na superfície envolvida no acoplamento químico (Kallwass et al, Biotechnol. Lett., 15 (1), 29 34, 1993), controlando efectivamente a orientação da proteína acoplada. Uma abordagem similar pode ser aplicada aos fragmentos de anticorpos, especificamente aos fragmentos VHH, provendo assim meios de imobilização orientados sem a adição de caudas de peptídeo VHH extra ou domínios que contenham aminoácidos sejam estes naturais ou artificiais. É preferido que a introdução de mutações seja efectuada na região tipo do fragmento de 11/23 anticorpo, minimizando a ruptura da actividade de ligação ao antigénio do fragmento VHH. Uma região particular do fragmento VHH adequada para a mutagénese é o da parte da molécula que está perto do domínio pesado constante, que se dá nos anticorpos de cadeia pesada produzidos naturalmente.
Uma vantagem particular da invenção é que uma actividade biológica suficiente do domínio do anticorpo, mais especificamente do fragmento VHH é conservada depois da imobilização para permitir que o fragmento acoplado funcione como um ligando de afinidade. Numa forma particular de realizar a invenção, a suficiente funcionalidade é mantida após o acoplamento covalente directo à matriz desejada via fracção reactiva que não contém um braço separador químico.
Os materiais preparados de acordo com a invenção podem ser usados em qualquer processo em que seja necessário ligar uma molécula a um fragmento de anticorpo imobilizado. As aplicações adequadas sugerirão naturalmente a um técnico especializado. Convenientemente, os materiais imobilizados podem ser utilizados nos processos de imunoadsorção tal como imunoensaios, por exemplo ELISA, ou processos de purificação de imunoafinidade pondo em contacto um material de acordo com a invenção com uma amostra de teste de acordo com os métodos standards convencionais da técnica. De forma alternativa pode ser usado um ensaio que compreenda vários fragmentos de ligação ao antigénio individuais ligados a uma superfície sólida de acordo com a invenção, por exemplo, para testar a presença de um ou mais associados de ligação específica.
EXEMPLOS
Os exemplos seguintes são somente providos a título ilustrativo, não são exaustivos e não deverão ser considerados como limitativos do âmbito da invenção. As técnicas usadas para a manipulação e para a análise dos materiais de ácido nucleico 12/23 podem ser executadas como os descritos por Sambrook et al, (1989), a não ser que seja indicado o contrário. EXEMPLO 1: Isolamento dos fragmentos VHH de peptideos Anti-rato Fc e Anti-anti Congelamento.
Foi tomado como exemplo o protocolo seguinte de como os fragmentos VHH específicos podem ser isolados, clonados, expressos, seguidamente acoplados na matriz desejada:
Apesar de que os fragmentos VHH particulares descritos neste exemplo foram derivados de um repertório imunológico, poderão também ter sido seleccionados de uma biblioteca VHH nativa sintética/semi-sintética (ver Pedido de Patente WO 00/43507,
Unilever).
Uma lama foi imunizada com fragmentos Fc preparados do IgG policlonal a partir do soro de rato ou com um peptídeo Anti-congelamento (AFP) de Lolium perenne (erva AFP) (Sidebottom et al. (2000), Nature 406, 256). A lama foi sobre-alimentada várias vezes depois da imunização inicial (um mês entre injecções) para aumentar a especificidade da resposta imunitária. Seguidamente podemos isolar os fragmentos de VHH específicos que codificam o ADN usando métodos idênticos aos descritos no Pedido de Patente WO 94/04678 (Casterman et al). Se necessário podemos seleccionar um repertório imunológico dos fragmentos VHH contra o antigénio desejado como o descrito no Pedido de Patente WO 94/18330 (Frenken et al). De forma alternativa podem ser usados métodos de selecção baseados na exposição ao fago para isolar o VHH anti-Fc ou VHH anti-AFP produzindo clones de produção de repertórios imunológicos. A sequência do aminoácido codificada do fragmento VHH anti-Fc isolado usado neste exemplo é abaixo apresentado: VHH#1 13/23 (clonado em E. coli como um VHH marcado com MYC-His6 em plasmídeo de produção pUR1490 e como VHH não marcado em plasmídeo de produção pUR1491):
QVQLQDSGG GLVQAGGSL RLSCAVSGR TDSNYVMGW SRQAPGKGR EFIAAIHWS EGGTHYADS VKDRFTIFRD SAKNIMYLQ MNGLKPEDT AVYHCAHNS GTGAFDYWG QGTQVTVSS A sequência de aminoácidos do VHH anti-AFP usada neste exemplo é como segue: VHH#2 (clonado em E. coli como um VHH marcado com MYC-His6 no plasmídeo de produção pUR1492 e como VHH não marcado no plasmídeo de produção pURl493):
QVQLQESGG GLVETGGSL RLSCAASGR TISSYTIGW FRQAPGKER EFVSHHFAS GGVTDYADS VKGRFTISR DNAKNTVYL EMNSLKPED TAVYYCAAS TFTISGYRA LKAAYEYDY WGQGTQVTV SS
As marcas usadas são C-MYC (mostrados abaixo em negrito), reconhecidas por anticorpo monoclonal 9E10 (Munro, S., e Pelham, H.R. (1986) Cell 46, 291-300), seguidas de um peptideo 12-mer que codifica um sinal de biotinilação in vivo (mostrada em negrito e sublinhado) e a cauda de hexahistidina (mostrada em cursivo) para a purificação com IMAC (Hochuli, E., Bannwart, W., Dõbeli, H., Gentz, R., & Stuber, D. (1988) Biotechnology 6, 1321-1325); a sequência completa fundida ao terminal de carboxi do VHH é abaixo apresentado:
EQKLISEEDLN GAA LRSIFEAQKMEW HHHHHH EXEMPLO 2: Produção e purificação dos fragmentos VHH. 14/23
Para a expressão em Escherichia coli usando os plasmídeos de produção indicados no exemplo 1, os transformantes foram cultivados em 400 ml de meio 2TY e induzidos com isopropil-β-Ο-thiogalactopiranoside como o descrito (Skerra & Pluckthun (1991) Prot. Eng. 4, 971-979). As células foram colhidas por centrifugação e lisadas numa Prensa Francesa. A proteina insolúvel foi removida por centrifugação e da fracção de proteina solúvel o VHH marcado foi purificado.
Os fragmentos de VHH isolados podem de forma alternativa ser expressos numa eucariota inferior transformada tal como Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris como o descrito no Pedido de Patente WO 94/25591 (Frenken et al) . O VHH marcado pode ser purificado por IMAC usando material de coluna TALON de acordo com as instruções do provedor (Clontech). Os fragmentos VHH expressos sem marcas podem ser isolados por cromatografia de afinidade com a proteina G ou com proteina A por exemplo usando colunas HiTrap proteina A (Pharmacia Biotech) de acordo com as instruções do fabricante.
De forma alternativa, se os fragmentos VHH não podem ser purificados pela proteina G ou pela proteina A então pode ser usada cromatografia de troca iónica como alternativa, por exemplo usando um sistema de cromatografia AKTAexplorer (Pharmacia Biotech) de acordo com as instruções do fabricante. Também poderão ser usadas matrizes que contenham antigénio unido para purificar os fragmentos. A purificação dos fragmentos dos anticorpos VHH não marcados (AFP anti-erva e Fc anti-rato) usando um concentrador Centriplus de 50 voltas (Amicon); o concentrador foi centrifugado a 3,000 g (Sorvall RCSB). A purificação do fragmento VHH marcado foi realizado com anti-rato Fc com IMAC usando material de coluna TALON de acordo com as instruções do provedor (Clontech). 15/23 EXEMPLO 3: Acoplamento de VHH à sepharose 4B activada com CNBr.
Entre 200 μρ e 2 mg de fragmento VHH foram acoplados à sepharose 4B activada com CNBr (aproximadamente 0.3 g, Amersham Pharmacia Biotech, código de produto 17-0430-01) seguindo as instruções do fabricante. Antes do acoplamento foi realizada uma troca de tampão por filtração em gel em colunas PD10 (Amersham Pharmacia Biotech), de forma a que os fragmentos VHH estivessem num tampão compatível com o procedimento de imobilização. O material acoplado foi cheio numa coluna de 1 cm de diâmetro, para dar um volume de leito de aproximadamente 1.5 ml. A coluna foi seguidamente lavada com tampão A (10 mM Na2HP04/NaH2PC>4 150 mM NaCl pH 7.4) e eluída previamente com tampão de eluição B (10 mM Na2HP04/NaH2P04 150 mM NaCl pH 2.1), seguidamente lavado com aproximadamente 5 volumes de coluna de tampão A.
Quatro fragmentos diferentes foram acoplados a uma matriz activada com CNBr desta maneira, o VHH#1 anti-rato Fc e o VHH#2 anti-erva AFP; tanto a versão marcada como a não marcada. A análise das fracções antes e depois do acoplamento num gel tingido com Coomassie mostrou que o grau de acoplamento da versão marcada assim como da não marcada dos dois fragmentos VHH diferentes foi alto e não revelou nenhuma diferença na eficiência de acoplamento entre o VHH marcado e o VHH não marcado (ver figura 1).
Este resultado demonstra que os fragmentos VHH podem ser eficazmente unidos a uma superfície sólida via ligações covalentes mesmo quando não há nenhuma cauda peptídica para prover sítios adicionais para a reticulação. EXEMPLO 4: Purificação de IgG monoclonais e policlonais com as colunas de afinidade de VHH anti-Fc. 16/23
Para analisar a performance das matrizes preparadas de acordo com o exemplo 3, diferentes purificações foram executadas. Depois de acoplar o VHH Anti-rato Fc marcado e o não marcado, o soro de rato completo foi carregado nas colunas. Os tampões para a purificação foram tampão A: 10 mM Na2HP04/NaH2P04 150 mM NaCl pH 7.4, e tampão de eluição B: 10 mM Na2HP04/NaH2P04 150 mM NaCl com uma adição de 12 mM HC1, pH 2 final. A recolha da fracção foi feita manualmente, as fracções foram imediatamente neutralizadas com 10 % (v/v) 0.2 M tampão Tris.HCl, sem ajustar o pH. Na figura 2 um cromatograma é mostrado do sinal de 280 nm das fracções recolhidas.
As fracções eluidas foram analisadas em gel tingido com Coomassie e Western blot usando conjugado de fosfatase alcalina Ig anti-rato para a detecção de acordo com as instruções do provedor (Promega) (ver figura 3).
Quando o soro de rato completo é usado para a purificação de afinidade uma fracção grande dos anticorpos policlonais são ligados e eluidos, enquanto que não foi encontrada nenhuma proteina contaminante como por exemplo albumina de soro nas fracções eluidas. Só uma pequena proporção de anticorpos foi encontrada na fracção não ligada, que são provavelmente derivados de outros isotipos de Ig (tais como IgM, IgD ou outros) .
Os resultados obtidos com VHH imobilizado marcado e VHH imobilizado não marcado são essencialmente os mesmos, o que demonstra que não é necessária a administração de uma extensão peptidica para assegurar que o VHH imobilizado mantenha a sua capacidade de ligação ao antigénio. EXEMPLO 5: Purificação do peptideo anti-congelamento com colunas de afinidade de VHH. 17/23
Depois do acoplamento do VHH AFP anti-erva, um caldo que continha erva AFP foi carregado na coluna. Os tampões para a purificação foram tampão A: 10 mM Na2 HP04/NaH2P04, 150 mM NaCl pH 7.4, e tampão de eluição B: 10 mM Na2HP04/NaH2 P04, 150 mM NaCl com uma adição de 12 mM HC1, pH 2 final. A recolha das fracções foi realizada manualmente; as fracções foram imediatamente neutralizadas com 10 % (v/v) 0.2 M de tampão Tris.HCl, sem ajustar o pH. Na figura 5 é mostrado um cromatograma do sinal de 280 nm da purificação de erva AFP com a versão não marcada de VHH#2. A identidade do valor máximo eluido (fracção 11) foi verificada usando a análise de sequência dos aminoácidos N-terminal. Esta foi executada usando a degradação de Edman num sequenciador de proteínas LF 3000 (Beckman) de acordo com o protocolo do provedor. A sequência N-terminal encontrada foi Asp-Glu-Gln-Pro-Asn-Thr-Ile-Ser-Gly-, por outras palavras, os nove primeiros resíduos do N-terminal da sequência conhecida de AFP de Lolium perenne. A versão não marcada de VHH#2 foi purificada da mesma maneira que a versão marcada.
Este exemplo demonstra que a ausência de uma cauda peptídica não afecta a capacidade do VHH unido à superfície para ligar os antigénios. 18/23
LISTA DE SEQUÊNCIAS
<110> Unilever plc Unilever NV <120> Imobilização da proteína <130> T3082 <160> 4 <170> Patentln versão 3.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Lama <4 0 0> 1 19/23
Gin Vai Gin Leu Gin Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Asp Ser Asn Tyr 20 25 30 Vai Met Gly Trp Ser Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Ile 35 40 45 Ala Ala Ile His Trp Ser Glu Gly Gly Thr His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Ser Ala Lys Asn Ile Met Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys 85 90 95 Ala His Asn Ser Gly Thr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Gin val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 128 <212> PRT <213> Lama <4Ο0> 2
Gin 1 Vai Gin Leu Gin 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Vai Glu Thr Gly 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Arg Thr Ile Ser 30 Ser Tyr Thr Ile Gly Trp 35 Phe Arg Gin Ala . 40 Pro Gly Lys Glu Arg 45 Glu Phe Vai Ser His His Phe Ala Ser Gly Gly Vai Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Vai Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Thr Phe Thr Ile Ser Gly Tyr Arg Ala Leu Lys Ala Ala 100 105 110 Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sequência marcada para VHH <400> 3 20/23
Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala Leu Arg 15 10 15
Ser Ile Phe Glu Ala Gin Lys Met Glu Trp His His His His His His 20 25 30
<210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Lolium perenne <400> 4
Asp Glu Gin Pro Asn Thr Ile Ser Gly 1 5
Lisboa, 30 de Outubro de 2009 21/23
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração foi tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a este respeito a EPO declina qualquer responsabilidade.
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Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Material imuno-activo que compreende um único fragmento de união de antigénio de único dominio de uma imunoglobulina naturalmente desprovida de cadeias leves, ou uma proteína que tem as mesmas ou idênticas propriedades de ligação aos antigénios localizada num único domínio, cujo fragmento está desprovido de qualquer grupo polipeptídeo agregado, imobilizado por meio de ligações covalentes numa superfície sólida.
  2. 2. Um material de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fragmento de ligação ao antigénio de um domínio ser o de uma imunoglobulina de camelídeo.
  3. 3. Um material de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por um ou mais resíduos de aminoácidos na região tipo do fragmento ser substituído por um aminoácido diferente para facilitar a imobilização na superfície sólida.
  4. 4. Um material de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por a superfície sólida ser seleccionada de poliestireno, polipropileno, cloreto de polivinilo, poliacrilamida, celuloses, dextranos, polímeros sintéticos e copolimeros, látex, sílica, agarose, metal, vidro, carbono.
  5. 5. Um material de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado por este constituir toda ou parte de uma placa de microtitulação, uma tira reactiva, uma lâmina, uma coluna ou pérolas poliméricas.
  6. 6. Uso de um material de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 num processo de imunoadsorção.
  7. 7. Uso de acordo com a reivindicação 6, num processo de purificação de imunoensaios ou de imunoafinidade. 1/2
  8. 8. Um método para imunoensaios ou para a purificação, caracterizado por este compreender pôr em contacto uma amostra de teste com um material de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.
  9. 9. Um vector que compreende vários fragmentos de ligação aos antigénios individuais de um só dominio de uma imunoglobulina naturalmente desprovida de cadeias leves, ou várias proteínas que têm as mesmas ou idênticas propriedades de ligação ao antigénio localizadas num único domínio, cujos fragmentos estão desprovidos de qualquer grupo polipeptídeo agregado, imobilizado numa superfície sólida, por meio de ligações covalentes. Lisboa, 30 de Outubro de 2009 2/2
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