JP2017512131A - 特異的アントラキノン染料リガンド構造の使用による抗体、抗体断片又はそれらの操作された変異体の精製方法 - Google Patents

特異的アントラキノン染料リガンド構造の使用による抗体、抗体断片又はそれらの操作された変異体の精製方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗体、抗体断片又はそれらの操作された変異体の分離又は精製方法に適用できる、アントラキノン染料リガンドを含む新規の吸着剤、対応する精製方法、及び対応する分析キット若しくは調製用分離キットに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、抗体、抗体断片又はそれらの操作された変異体の分離又は精製方法に適用できる、アントラキノン染料リガンドを含む新規の吸着剤、対応する精製方法、及び対応する分析用キット若しくは調製用分離キットに関する。
反応性染料は、十分確立された製品であり、繊維産業において、綿又はビスコースなどのセルロース繊維の着色に広く使用されている。このような反応性染料の分子は、各々が異なる機能を有する、連結された2個の単位から構成されると考えることができる。一方の単位は、発色団であり、その機能は、繊維に所望の色及び他の着色特性を付与することである。他方の単位は、繊維反応性基であり、これは、十分確立された適用条件下で、セルロースと化学的に反応して、染料分子を繊維に対して共有結合させ、洗濯工程に高い耐性を有する染色材料を生成する。
反応性染料は、当初、セルロース繊維材料の染色及び印刷で直面したある特定の問題を解決するために開発されたが、ここ数年、反応性染料は、これらを繊維染色分野以外で有用とする特性を有することが見出された。
例えば、米国特許第4,016,149号及び米国特許第4,546,161号より、これらの染料は、同様の技術により、炭水化物基質、例えばアガロース、デキストロース、デキストラン等に由来するポリマー及びコポリマーに結合し得ることが公知である。このような炭水化物基質とある特定の市販の反応性染料との反応生成物は、ある特定のタンパク性材料のクロマトグラフィーによる分離又は精製のための吸着剤として使用されている。タンパク質又は酵素分離のためのリガンドとして使用されている商業的な繊維染料には、モノクロロトリアジン部分を含むある特定の青色アントラキノン染料、例えばC.I. Reactive Blue 2(チバクロンブルー(Cibacron Blue)3GA)、C.I. Reactive Blue 5及びC.I. Reactive Blue 49がある。一般に、このような吸着剤は2つ以上の機能性、例えば疎水性相互作用及びイオン性相互作用又は親水性相互作用を含み、ミックスモードクロマトグラフィー(MMC)吸着剤としばしば呼ばれる。タンパク質とリガンドの1つの限定された相互作用モード(タンパク質の電荷及び疎水性それぞれに)を備えたイオン交換(IEX)クロマトグラフィー又は疎水性相互作用(HIC)クロマトグラフィーとは対照的に、タンパク質とミックスモードリガンドの相互作用は、複雑で、所定のpHにおけるタンパク質の電荷及び疎水性分布の双方、並びに溶媒及びリガンド官能基の立体配置に左右されるマルチ機能性相互作用である。
アフィニティークロマトグラフィーは、吸着剤の固定相上のリガンドに対するタンパク質又は酵素の強力な親和性の差異に基づいており、例えばWO2004/052870に記載されているように、生物医薬品及び診断のような高性能用途領域において非常に重要であることが益々証明されている。相互作用の性質とは、水素結合、静電気力、好適な形状から生じるスタッキング、又はリガンド-標的関係を促進する任意の他の局面であり得る。リガンド-標的相互作用は、他の夾雑分子を混合物から除去し得るが、リガンド-標的複合体を無傷で維持するように、即ち、リガンドに親和性を有するタンパク質は、マトリクスに結合するが、親和性を有さない他の分子は洗い流されるように、十分に強力である必要がある。結合したタンパク質は、例えば、P.D.G、Dean、W.S. Johnson及びF.A. Middle (編)、Affinity Chromatography: A Practical Approach、1982年に記載されているように、変動するpH、イオン強度及び緩衝液の条件下で、選択的に溶出され得る。タンパク質混合物は、振とう又は吸着剤を充填したカラムを通過させることによって、分離に付され得る。
免疫グロブリンは、2本の同一の軽鎖(重量約25kDa)及び2本の同一の重鎖(重量約50kDa)を有する少なくとも1つのY形基礎的要素からなる糖タンパク質である。各鎖は、それぞれのドメインに分かれている定常領域及び可変領域から構成される。免疫グロブリンの5つの異なる種(ある特定の重鎖アイソタイプα(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、μ(IgM)及びγ(IgG)に相応する)が、高等動物で観察される。これらの分子は、サイズ、電荷、生物学的特性、アミノ酸組成及び炭水化物含量の点で異なる。軽鎖は、カッパ及びラムダと名付けられている2つのアイソタイプのうち一方で存在し得る。
診断若しくは治療の分野において又は調製用及び分析的応用において免疫グロブリンの適用は十分確立されている。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体(Mab)は、単一の抗原に対して同一の特異性を有する抗体であり、生物医薬品業界において最も急速に成長しているセクターを構成している。生物医薬品としての特異的モノクローナル抗体の使用に加えて、様々な型の抗体断片又はそれらに由来する操作されたタンパク質変異体は、化学的にも機能的にも双方でポリクローナル免疫グロブリン調製物又はモノクローナル抗体とは異なりえるので、これらの使用への関心も高まっている。
断片抗体(fAb)のグループは、無傷の、特にモノクローナル抗体から入手可能な断片を包含し、モノクローナル抗体の断片は抗原結合特性を保持するが、無傷の全長免疫グロブリン分子に伴う欠点を回避する。具体的には、このような断片は、画像化及び治療に対して、無傷のタンパク質を超えるいくつかの利点を提供する。これらの断片は、患者の免疫系により異物として認識される、Fc(重鎖)領域又は分子の部分が欠如しているので、患者において副作用がより少なく、これらを改変して、治療上のペイロードを含むことができる。抗体断片にはいくつかの型がある。抗体断片は、特異的なエンドペプチダーゼ酵素消化により調製した免疫グロブリン断片又は遺伝子操作されており、対応する組換え宿主細胞により産生される免疫グロブリン断片のいずれかである。それらは、1つ以上の同一又は異なる抗原結合部位を有することができる。例えば、fAbには、Fab'、Fab及びscFvなどの一価の断片、F(ab')2ダイアボディ(diabody)及びミニボディ(minibody)などの二価断片、並びにトリアボディ(triabody)又はテトラボディ(tetrabody)、タンダブ(TandAbs)などの多価の断片が含まれる。
fAbの最も重要な製造法は組換え技術によるものである。そのような技術は、宿主細胞を使用して所望のfAbを発現させ、次いでそれを生成培地から分離し、精製するというものである。精製は一般的にクロマトグラフィーによって達成されるが、通常、複雑な多段階プロセスである。この複雑さが必然的に、得られるfAbの収量を制限し、製造プロセスを著しく緩徐化する。
多くの全長抗体は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いることによって精製されている。しかしながら、プロテインAは、乏しい安定性、変性、高コスト、及びプロテインA自体が生物起源材料であるという事実に由来する規制上の懸念など、いくつかの欠陥を有すると認識されている。そこで、プロテインAにアフィニティーを有する抗体の精製の代替手段として合成アフィニティーリガンドが開発されてきた。fAbは、プロテインAに対するアフィニティーを持たず、従って結合しないため、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって精製されない。
本出願者によるWO2006/108760には、アントラキノン染料リガンド、並びにペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ステロイド、脂質、ホルモン、及び特に酵素、タンパク質及びペプチドから選択される生物学的材料の分離へのそれらリガンドの使用が記載されている。
免疫グロブリン分子の親和性精製用のトリアジンをベースとする染料がWO97/10887、WO2004/035199及びWO2007/099374に開示されている。
WO2007/004954により、IgG及びそれの断片の親和性精製用の染料として、ある特定の[1,2,4]-トリアゾロ-[1,5-A]ピリミジン誘導体が示唆されている。
WO2009/138714により、fAbを精製するためのある特定のトリアジン染料の使用も示唆されている。
WO2010/102114では、有機ポリマーと組み合わせてfAbを精製するための青色染料吸着剤の使用が開示されている。
抗体、抗体断片又はそれらの操作された変異体の分離用に示唆されてきた方法は、今なお欠点を伴っているので、fAbのような抗体を分離するための改善された方法が必要である。さらに、特異性の高い結合能力が、医薬品精製プロセスにおける適用にとって不可欠である。
本発明者らは、抗体、抗体断片及びそれらの変異体の分離及び精製を改善するための吸着剤として、アントラキノン染料(青色染料)リガンドの多くの誘導体を試験した。驚くべきことに、下記でさらに定義されているアントラキノン染料誘導体を含む、アントラキノン染料誘導体(担体材料に結合した)の亜集団のみによって、免疫グロブリン分子に由来する断片を分離及び精製するための改善された方法が提供される。
IgGモノマー及びそれらから調製した凝集体(実験の部で明記した熱処理による)を用いて実施したa)分析用サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の結果及びb)SDS-PAGEを示す図である。 (a)ヒトポリクローナルIgG抗体の凝集体(Mu)とモノマー(Mo)とを分離する実験における、従来技術の樹脂Blue Sepharose(登録商標)について観察されたクロマトグラフィーによる分離プロファイル及び(b) SDS-PAGEの結果、並びに(c)プールしたA画分及びB画分のSECのクロマトグラフィーによる分離を示す図である(mAU=280nmでのミリ吸収単位、CV=カラム容積)。 ヒトポリクローナルIgG抗体の凝集体(Mu)とモノマー(Mo)とを分離する実験における、本発明によるBASF樹脂BR36、BR37、BR45、BR46及びBR47について観察されたクロマトグラフィーによる分離プロファイルを示す図である。 図2a及び図3に示した各クロマトグラフィーによる分離の単一画分のSDS-PAGEの結果を示す図である。 分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる、図3の(クロマトグラフィー分離した)Aのプール及びBのプールの分析結果を示す図である。 SDS PAGEによる、図3の(クロマトグラフィー分離した)Aのプール及びBのプールの分析結果を示す図である。
a)特定の実施形態
本発明は、以下の特定の実施形態に関する。
1.免疫グロブリン分子をクロマトグラフィーにより精製するための吸着剤であって、この吸着剤は、染料リガンドが共有結合する担体マトリクス(又は担体)を含み、ここで前記染料リガンドはアントラキノン染料から選択され、前記吸着剤のリガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり150μモルより大きく、例えば乾燥吸着剤1g当たり151〜500又は160〜500又は170〜400又は200〜350又は180〜350又は190〜330又は220〜330又は250〜300μモルであり、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモル範囲であることが最も好ましい。
2.前記吸着剤が、前記担体マトリクス(例えば、化学的に活性化されたもの、特に当分野でそれ自体が周知な方法で化学的に活性化されたようなもの、及び例えば実験の部で記載されているようなもの)、及び一般式1のアントラキノン化合物
Figure 2017512131
 のアントラキノン化合物
[式中、
Xはハロゲン、特にF、Cl又はBrであり、この基を介して担体への前記共有結合が化学反応により形成されており、
k及びmはそれぞれ互いに独立して0又は1であり、k+mの合計は1又は2であり、特に、kは0であり、mは1であり、
Bは芳香族基であり、1つ以上の、縮合した又は非縮合の、特に1つの、任意選択で一置換又は多置換の芳香環を含み、
Vは式
Figure 2017512131
 例えば、
Figure 2017512131
 の置換基である
(式中、
nはそれぞれ0又は1であり、ただし両方のnが同時に0ではないものとし、
Rは同一又は異なり、H、アルキル、NH2、NH-アルキル、NH-アリール、N(アルキル)2、NO2、OH、O-アルキル、CN、C(O)アルキル、C(O)アリール、C(O)NH2、C(O)N(H)アルキル、C(O)N(アルキル)2、C(O)N(H)アリール、又はハロゲンから選択され、特にRは水素であり、任意の上記の意味におけるアルキルは特にC1〜C4アルキルであり、及びアリールは特にフェニルであり、
R1は水素又は任意選択で置換されたC1〜C4アルキルであり、特にR1は水素であり、
Zは、化学結合、
n1が1から4の整数である-(CH2)n1-、
アリーレン、
-CH2-アリーレン、
-SO2-アリーレン、
-C(O)N(H)アリーレン、
-SO2N(H)アリーレン、
-CH=CH-、
-SO2-CH2-CH2-;
n2が1から4の整数である-C(O)NH-(CH2)n2-から選択され、特にZは化学結合又は-SO2-CH2-CH2-基であり、任意の上記の意味におけるアリーレンは特にフェニレンであり、
Yは-SO3H、-OSO3H、-CO2H、-P(O)(OH)2、-OP(O)(OH)2、OH及びSHから選択される同一又は異なる極性官能基であり、特にYは-SO3H、-OSO3H、及び-CO2Hから選択される)]
並びに、担体マトリクスとアントラキノン化合物との間に、好ましくは共有結合の結合基を形成する任意のリンカー分子の反応生成物含む、実施形態1の吸着剤。
特定の例は、Bが任意選択で置換されたフェニレン橋であり、前記N基がメタ位又はパラ位で芳香族環Bに結合している、式(1)の化合物である。
さらなる特定の例は、Vが式(2a)、特に式
Figure 2017512131
 例えば、
Figure 2017512131
 の置換基である、式(1)の化合物である。
好ましい吸着剤は、本実施形態に記載の上記の特定の染料の少なくとも1つが共有結合している担体マトリクスを含み、ここで、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり1700〜400μモルの範囲であることがより好ましく、乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモルの範囲であることが最も好ましい。
3.Bが、式
Figure 2017512131
 (式中、
Yは上に定義したとおりであり、
nは0又は1であり、
n3は0、1、2、3又は4であり、
Y1は、同一又は異なり、ハロゲン、特にCl、アルキル、特にC1〜C4アルキル、アルコキシ、特にC1〜C4アルコキシ、NO2又はYから選択され、ここでYは上に定義したとおりであり、
Wは化学結合であるか又は-C(O)N(H)-、-SO2N(H)-、-SO2-若しくは-N(H)-から選択され、
R2はH又はアルキルから、特にC1〜C4アルキルから選択される)
の置換基である、実施形態1又は2に記載の吸着剤。
特定の例は、Bがメタ位又はパラ位で前記N基に結合している、式3aの任意選択で置換されたフェニレン橋である、式(1)の化合物である。
さらなる特定の例は、Bがメタ位又はパラ位で前記N基に結合している、式3aのフェニレン橋であり、n3が1、2、3又は4であり、少なくとも1つのY1基がYであり、特に-SO3H、-OSO3H、又は-CO2Hである、式(1)の化合物である。例えば、n3は0若しくは1であり、Y1は-SO3Hであり、又はN3は4であり並びに1つのY1は-SO3Hであり、その他3つの残基は同一の若しくは異なる、メチルのような、C1〜C4アルキルである。
さらに好ましい吸着剤は、本実施形態に記載の上記の特定の染料の少なくとも1つが共有結合している担体マトリクスを含み、ここで、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモルの範囲であることが最も好ましい。
4.Bが式3aの芳香族基である、実施形態1〜3のいずれか1つに記載の吸着剤。
さらに好ましい吸着剤は、本実施形態に記載の上記の特定の染料の少なくとも1つが共有結合している担体マトリクスを含み、ここで、リガンド密度は、乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモルの範囲であることが最も好ましい。
5.Vが、2a'又は2a''のような式2aの置換基である、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の吸着剤。
さらに好ましい吸着剤は、本実施形態に記載の上記の特定の染料の少なくとも1つが共有結合している担体マトリクスを含み、ここで、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモル範囲であることが最も好ましい。
6.Bが式3aの芳香族基であり、n3が0、1、2、3又は4であり、Y1がC1〜C4アルキルのようなアルキル又は-SO3HのようなYである実施形態4に記載の吸着剤。例えば、Bは1,3-フェニレン基であって、2、4、及び5位にC1〜C4アルキル基、特にメチル基を有し、5位に-SO3HのようなY残基を有し得る。
さらに好ましい吸着剤は、本実施形態に記載の上記の特定の染料の少なくとも1つが共有結合している担体マトリクスを含み、ここで、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモルの範囲であることが最も好ましい。
7.Vが式2aの置換基であり、RがHであり、Zが化学結合又は-SO2-CH2-CH2-から選択され、特にZが化学結合であり、Yが-SO3H、-OSO3H、又は-CO2Hであり、例えば-SO3Hであり、特に式2a'又は2a''の置換基である、実施形態5に記載の吸着剤。
さらに好ましい吸着剤は、本実施形態に記載の上記の特定の染料の少なくとも1つが共有結合している担体マトリクスを含み、ここで、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモルの範囲であることが最も好ましい。
8.kが0であり、mが1である、実施形態1から7のいずれか1つに記載の吸着剤。
さらに好ましい吸着剤は、本実施形態に記載の上記の特定の染料の少なくとも1つが共有結合している担体マトリクスを含み、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、リガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモルの範囲であることが最も好ましい。
9.前記吸着剤が、リンカーを介して前記担体マトリクスに結合した前記アントラキノン化合物を含み、前記リンカーが、6-ジアミノヘキサン(DAH)、1,4-ジアミノブタン(DAB)、1,2-ジアミノエタン(DAE)、1,8-ジアミノオクタン(DAO)、1,10-ジアミノデカン、及び、特にトリ-2'-アミノエチルアミン(TREN)から選択される、実施形態1から8のいずれか1つに記載の吸着剤。
本実施形態のさらに好ましい吸着剤は、リガンド密度が乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度が乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモルの範囲であることが最も好ましいものである。
10.平均粒度が、D(0、5)又はD(4、3)として、特にD(4、3)として決定された、20〜180又は45〜165又は80〜120又は90〜110μmのような10〜200μmの範囲にある、実施形態1から9のいずれか1つに記載の吸着剤。
本実施形態のさらに好ましい吸着剤は、リガンド密度が乾燥吸着剤1g当たり160〜500μモルの範囲であることが好ましく、リガンド密度が乾燥吸着剤1g当たり170〜400μモルの範囲であることがより好ましく、乾燥吸着剤1g当たり190〜330μモルの範囲であることが最も好ましいものである。
11.免疫グロブリン分子のクロマトグラフィーによる精製方法であって、夾雑無機物質及び/又は夾雑有機物質と混合して少なくとも1つの所望の種類の免疫グロブリン分子を含有する試料を実施形態1から10のいずれか1つに記載の吸着剤と接触させるステップ、前記所望の種類の免疫グロブリン分子を前記吸着剤に吸着させるステップ、任意選択で前記吸着剤を洗浄液体で洗浄するステップ、及びその後、濃縮(すなわち、より純粋)形態で前記所望の免疫グロブリン分子を含有する溶出液を得るため吸着物質を溶出させるステップを含む、方法。
12.免疫グロブリン分子のクロマトグラフィーによる精製方法であって、夾雑無機物質及び/又は夾雑有機物質と混合して少なくとも1つの所望の種類の免疫グロブリン分子を含有する試料を実施形態1から10のいずれか1つに記載の吸着剤と接触させるステップ、前記夾雑無機物質及び/又は夾雑有機物質を(任意選択で、選択された条件下で)吸着させるステップ、及びより純粋な形態で前記所望の免疫グロブリン分子を含有するフロースルーを得るステップを含む、方法。
実施形態11及び12の方法は繰り返し実施することも可能であり、これらの方法が任意の順序で組み合わせることも可能であり、組み合わせた方法を任意の順序で繰り返すことも可能である。
13. 前記所望の種類の免疫グロブリン分子が、機能性抗体(Ab)又は断片抗体(fAb)である、実施形態11又は12に記載の方法。
14. Ab及びfAbが、化学的に、酵素的に又は組換え的に生産されたAb又はfAbから選択される、実施形態11から13の1つに記載の方法。
15．前記fAbが、Fab、F(ab')2(又はFab2)、Fab3、scFv、bis-scFv、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンダブ、並びにその単一抗体ドメイン及び断片から選択され、それらの多価断片が同一又は異なる抗原特異性を有し得る、実施形態14の方法。
16.前記抗体ドメインが、VH、VL、VhH及びV-NARドメインから選択される、実施形態15の方法。
17.前記ドメイン断片が、少なくとも1つのCDR、特に少なくとも1つのCDR1、CDR2及びCDR3を含む、実施形態16の方法。
18.精製すべき免疫グロブリン含有試料が、変性した及び/若しくは凝集した/多量化した(mulitimerized)免疫グロブリン、免疫グロブリン分解生成物若しくは抗体分解生成物、抗体の遊離軽鎖若しくは遊離重鎖、DNAのような他の生体分子又は宿主細胞タンパク質で汚染されている、実施形態11から17の1つに記載の方法。
19.前記Ab又はfAbが、pH4〜8で、吸着剤に結合する、実施形態11から18のいずれか1つに記載の方法。
20.前記試料を、実施形態1から10の1つに記載の同一又は異なる吸着剤と繰り返し接触させる、実施形態11から19の1つに記載の方法。
21.免疫グロブリン分子、特にAb及びfAbを分離するための、実施形態1から9のいずれか1つに記載の化合物の使用。
22.前記分離が、少なくとも1つのAb又はfAbの除去又は定性的若しくは定量的単離、定性的若しくは定量的検出、又は特性決定の目的で実施される、実施形態21に記載の使用。
23.実施形態1から10のいずれか1つに記載のアントラキノン化合物を有する少なくとも1つの吸着剤、及び少なくとも1つの分離したfAbを同定するためのさらなる材料を含む、調製用又は分析用キット。
24.任意選択で活性化された担体を、例えばトリ-2'-アミノエチルアミン(TREN)のような、適切なリンカーと反応させるステップ、その後、前記で得られた官能化吸着剤を実施形態1から9に記載のアントラキノン化合物と反応させるステップを含む、実施形態1から10の1つに記載の吸着剤の製造方法。
b)特定の定義
用語「分離」及び「精製」は、本発明の範疇では同一の意味を有し、様々な分子量及び種類のタンパク性物質及び/又は他の生物学的物質(例えば細胞構成成分を一般には形成している物質)の複雑な混合物を含む組成物の処理を記載するのに使用され、このような物質は、標的として少なくとも1つのfAb分子を1つの構成成分として含有し、このような物質の精製/分離によって濃縮形態の前記標的分子を含有する生成物がもたらされる。
用語「濃縮」とは、前記複雑な混合物からの前記標的分子以外の物質の部分的又は完全な除去を、特に、上記のタンパク性物質及び/又は他の生物学的物質の除去を意味する。
用語「リガンド密度」とは、吸着剤(担体及び直接又は共有結合している染料リガンド)の乾燥重量当たりのアントラキノン染料分子(式(1)の分子のような)のモル含量(例えばμモル/gとして)である。上記リガンド密度は、吸着剤を乾燥することにより、特に材料から残存液体を除去するために凍結乾燥により、標準条件下で決定される。乾燥粉末が得られる。吸着剤の総重量に基づいて、1重量%未満の割合の又はより特定すると0、1重量%未満の割合び余剰液体が残存し得る。次いで、所定量の前記乾燥吸着剤材料を6NHClのようなHClなどの酸に溶解させ、次いで1時間/40℃又は1時間/60℃などの温度を上げた状態でインキュベートする。それによって、染料が加水分解的開裂により遊離される。その後、染料含量の分光光学的決定(特定の染料のλmaxにて)を実施する。全体的な方法は、以下、本明細書の実験の部においてさらに明記されている。吸着剤の液体含量が比較的高いという事実からみて(市販のBlue Sepharose製品については、試料調製の方法に応じて、約60〜90重量%の範囲にある液体含量が観察された)、前記吸着剤の乾燥重量当たりでリガンド密度値を表すことは、吸着剤のリガンド含量を特徴づけるのに最適と考えられる。
用語「粒度」とは、平均粒度をいう。好ましくは、本発明による粒子は、狭い、特に本質的に単峰性である粒度分布又は単峰性である粒度分布を特徴とする。例えば粒度分布測定をMalvernのMastersizer装置に適用させることによるような、それ自体が周知な方法で粒度決定をしても良い。一般には、0.1MのNaOH中で測定し得る。本明細書で述べられている平均粒度値は、D(0.5)値又はD(4.3)値のいずれかであり、これらはわずかに異なりえるが、それにもかかわらず指定されたパラメーター範囲内にあり、D(0.5)は、分布のうち50%がより小さく及び粒度分布のうち50%がより大きい、μmでの平均粒度を表す。D(4、3)は容積平均径を表す。
B基又はV基における「C1〜C4アルキル」として、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、又はイソブチルが含まれ、詳細にはメチル又はエチル、特にメチルが含まれる。
B基又はV基における「C1〜C4アルコキシ」又は「-O-C1〜C4アルキル」として、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ及びイソブトキシが含まれ、詳細にはメトキシ又はエトキシ、特にメトキシが含まれる。
B基又はV基における「ハロゲン」として、例えば、フッ素、塩素及び臭素が含まれ、詳細には塩素又は臭素、特に塩素が含まれる。
B基又はV基における「アリーレン」として、ナフチレン、ビフェニレン又はフェニレンが含まれ、詳細にはフェニレン、より特定するとo-、m-フェニレン、より特定するとp-フェニレンが含まれる。
c)特定のB基及びV基
次の表1及び表2において、式1のB基及びV基の非限定的例が列記されている。
Figure 2017512131
Figure 2017512131
Figure 2017512131
Figure 2017512131
Figure 2017512131
d)特定の染料リガンド
本発明による特定の実施形態では、式(1)の化合物は式
Figure 2017512131
 (式中、
Bはフェニレン基であり、この基は非置換であるか又はスルホ(-SO3H)によって置換されてあり、C1〜C4アルキルによって任意選択でさらに置換されてあり、
例えば式
Figure 2017512131
 の残基であり、
Vはフェニルアミノ又はN-C1〜C4アルキル-N-フェニルアミノであり、これは、例えば-SO2OHでメタ若しくはパラ置換されたフェニルアミノのように、フェニル環内でスルホ又は-SO2-CH2-CH2-O-SO2OHによって置換されている。)
の化合物に対応する。
式(1)の化合物の構造的変化により、特定の分離上の問題又は精製上の問題を説明し得る。
式1aの特定の化合物の非限定例が下の表3に与えられている。
Figure 2017512131
Figure 2017512131
e)マトリクス材料(基質及びスペーサー)
本発明に従って適用される吸着剤の調製に使用される基質、担体又はマトリクスは、実質的に水不溶性であり得る。前記基質の例として、例えばポリアクリルアミド又はヒドロキシアルキルメタクリレートなどのアクリルポリマー、及びこれら材料のコポリマー、ジルコニア、チタニア又はアルミナなどの金属酸化物、シリカ又は多孔質ガラスが挙げられるが、好ましい水不溶性固体支持体は、式(1)の化合物が反応性基を介して結合され得る、複数の水酸基を有するポリマー基質である。特に適切な基質は、炭水化物及び修飾炭水化物である。適切な炭水化物基質の例は、アガロース、架橋アガロース、デキストロース、デキストラン及びそれらの修飾体であり、例えば「Sepharose」及び「Sephadex」ゲル(「Sepharose」及び「Sephadex」はGE Healthcareの商標である)として入手可能であり、GB1,540,165に記載されている。他のポリマー基質は、ポリアミドである。特に注目される基質は、アガロース及び架橋アガロースである。
本発明に従って適用される吸着剤は、標準的な方法により、例えば、式(1)の化合物を、例えばアルカリ金属水酸化物又は炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム又は炭酸ナトリウムなどの酸結合剤の存在下、式(1)の前記化合物の反応性基と反応して共有結合を形成可能な基を有する基質、例えば炭水化物基質と反応させることにより調製され、ここで可変部は、上記のように規定され、上記のように好ましい。
このような吸着剤、及びそれらを含有するクロマトグラフィーカラムの製造方法は、例えば、米国特許第4,016,149号及び米国特許第4,546,161号に詳細に記述されている。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
既に示したように、基質又はマトリクス、例えばアガロース、架橋アガロース、デキストロース又はデキストランは、様々な長さのスペーサーを、有利には、当該スペーサーに対して式(1)の化合物を共有結合させる前に導入することによって、さらに修飾することができる。スペーサーは、染料リガンドに対するアクセスを改善することから、染料リガンドと精製すべきタンパク性材料との相互作用を増大させ、それにより吸着剤の選択性及び効率を向上させることができる。特定の実施形態では、マトリクスはスペーサーによって修飾されている。
スペーサーの導入は、例えば、アルカリ金属水酸化物又は炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム又は炭酸ナトリウムなどの酸結合剤の存在下で、基質をエピクロルヒドリンで処理し、続いて例えば20〜80℃、具体的には20〜60℃の適切な温度下で、ポリアミンで処理することにより実施される。
スペーサーの導入に適切なポリアミン化合物は、直鎖又は分岐のいずれか、特に直鎖スペーサー基である。それらは、芳香族ポリアミン、脂肪族ポリアミン及び脂環式ポリアミンからなる群から選択され得る。一般的な例としては、ポリビニルアミン、ポリビニルイミン、1,2-エチレンジアミン、ヒドラジン、ヒドラジン-2-ビス-(3-アミノプロピル)-アミン、1,4-ジアミノシクロヘキサン、3-アミノ-1-メチルアミノプロパン、N-ヒドロキシエチルエチレンジアミン、N-メチル-ビス-(3-アミノプロピル)-アミン、テトラエチレンジアミン、1,4-ジアミノブタン、1,6-ヘキサメチレンジアミン、1,8-ジアミノオクタン、トリ-2'-アミノエチルアミン、1-アミノエチル-1,2-エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、フェニレンジアミン、トルイレンジアミン、2,4,6-トリアミノトルエン三塩酸塩、1,3,6-トリアミノナフタレン、イソホロンジアミン、キシレンジアミン、水素化キシレンジアミン、4,4'-ジ-ジアミノフェニルメタン、水素化4,4'-ジアミノジフェニルメタン、及びこれらポリアミンモノマーの誘導体、並びにトリ-2'-アミノエチルアミンなどの分枝スペーサーが挙げられる。
脂肪族及び/又は脂環式ポリアミンが特に注目される。脂肪族及び/又は脂環式ジアミンが特に注目される。特に、1,4-ジアミノブタン、1,6-ヘキサメチレンジアミン、1,8-ジアミノオクタン及び1,10-ジアミノデカンを挙げることができる。
ポリアミンは、個別に又は少なくとも2種のポリアミンの混合物として使用され得る。
固体支持体に結合した式(1)又は(1a)の化合物を含む吸着剤は、クロマトグラフィーによる分離目的のためのカラム形態、又は膜分離フォーマットで実行される分離を可能にする膜形態であり得る。
f)分離のための生物学的材料
吸着剤に適用する生物学的材料は、免疫グロブリン分子、例えば抗体断片抗体(fAb)物質を含有するか又はそれらを含有すると推測される。生物学的材料は、例えば、吸着剤上へ適用するのに適した、粗雑な若しくは前処理した細胞培養上清液、全細胞培養物、細胞ホモジネート、又はそれらの任意の画分の形態であり得る。適切なタンパク性試料材料の入手法は、例えばCooper、Biochemische Arbeitsweisen、Walter de Gruyter、1981年に記載のように、当分野で周知である。
本発明の方法によって精製可能なfAbは、免疫グロブリンドメイン又は免疫グロブリンドメインの集合を含む抗体部分であって、これは抗原に結合可能であり、多くの実施形態において、VHドメインとして一般に知られている1つの重鎖断片若しくはその機能性断片、及び/又はVLドメインとして一般に知られている軽鎖断片若しくはその機能性断片を、任意選択で、例えば1つ以上の定常ドメインなどの少なくとも1つの他のペプチド鎖と共に含む。
軽鎖由来定常ドメインは通常はCLと称される。
重鎖由来定常ドメインは、例えば、IgG分子のCH1、CH2及びCH3、IgM分子のCμ1、Cμ2、Cμ3若しくはCμ4、IgA分子のCα1、Cα2及びCα3、IgE分子のCε1、Cε2、Cε3若しくはCε4、又はIgD分子のCδ1、Cδ2及びCδ3である。
ある特定の実施形態では、fAbは、重鎖由来断片及び軽鎖由来断片を含み、それぞれの鎖断片は定常ドメイン及び可変ドメインで構成され、このような断片はFab断片として公知である。
他の実施形態では、fAbは、2つ以上のドメインを含み、一般には重鎖又は軽鎖いずれかの可変ドメイン及び定常ドメインいずれかの組み合わせ、2つの重鎖由来の可変ドメインの組み合わせ、2つの軽鎖由来の可変ドメインの組み合わせ、又は軽鎖由来の可変ドメイン及び重鎖由来の可変ドメインの組み合わせを含む。
一部の実施形態では、fAbは、解離を防止する柔軟なポリペプチドリンカーによって連結されたVHドメイン及びVLドメインを含む(一本鎖Fv、scFvとして公知)。
別のさらなる実施形態では、fAbは、単一ドメイン、又はその断片、一般には可変重鎖若しくはその断片、又は可変軽鎖若しくはその断片のいずれかを含む。
なおさらなる実施形態では、fAbは多量体形式、例えばビスscFv、Fab2、Fab3、ミニボディ(scFv-CH3など)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ(例えばHollinger等、Nature Biotechnology、2005年、23巻、9号、1126〜1136頁を参照)又はTandab(登録商標)である。
本発明の方法によって精製可能なfAbの例には、組み合わされた重鎖及び軽鎖を含むタンパク質構築物又はポリペプチド構築物が含まれ、各鎖は定常ドメイン及び可変ドメインで構成され、このような免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は相互作用して単一の機能性抗原結合部位を形成している。
さらなる例には、標的に結合可能であり、少なくとも1つの結合ドメインを含むポリペプチドである、VH鎖をベースとするドメイン抗体が含まれ、ここで、結合ドメインは、可変重鎖抗体又はその機能性断片の単一の可変ドメインである。
別のさらなる例には、標的に結合可能であり、少なくとも1つの結合ドメインを含むポリペプチドである、VL鎖をベースとしたドメイン抗体が含まれ、ここで、結合ドメインは、可変軽鎖抗体又はその機能性断片の単一の可変ドメインである。
上で特定されたfAbは、上で特定された任意の異なる免疫グロブリン種(IgA、IgD、IgE、IgM又はIgG、特にIgG)、及びそれらの任意のサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4など)に由来することもできる。
特定のfAbはscFv型及びFab型である。
本発明に従って精製すべき免疫グロブリン又は抗体は、任意のIg種(IgA、IgD、IgE、IgM又はIgG、特にIgG)、及びそれらの任意のサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4など)であることができる。
最も好ましくは、fAb若しくは抗体又はそれらの操作された変異体は、例えば宿主細胞で、例えば大腸菌(E. coli)などの原核宿主で若しくはピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの真核宿主で、又は哺乳動物細胞若しくは植物細胞で発現させることにより、組換えで生産される。
g)分離方法
本発明による分離又は精製方法は、式(1)の化合物を含む吸着剤の存在下で、適切なpH及びイオン強度の水性環境内で、生物学的材料を処理し、例えば振とうし、例えば濾過により吸着剤を分離し、pH及びイオン強度を適切に変更して、結合したタンパク質を吸着剤から溶出することによっても実施し得る。
本発明による分離又は精製方法は、
(a)生物学的材料を含有する混合物を、クロマトグラフィーカラム上に保持された、式(1)の化合物を含む吸着剤と接触させる接触工程、
(b)そこに洗浄溶液を通過させて、式(1)の化合物を含む吸着剤から非結合種を除去する洗浄工程、及び
(c)式(1)の化合物を含む吸着剤に溶出溶液を通過させて、留置された所望の生物学的材料をカラムから回収する溶出工程、
を含む、相互作用又はクロマトグラフィーによって実施されることが有利である。
本発明の別の実施態様によれば、上に定義した式(1)の化合物と、式(1)の前記化合物の反応性基と反応して共有結合を形成可能な基を有する基質との付加化合物を含む吸着剤が提供され、ここで可変部は、上記のように定義され、上記であるのが特に注目される。
本発明による吸着剤は、非常に純粋な物質であり、いかなる染料浸出挙動もなく、マトリクスに様々なレベルの染料リガンド濃度を含む。
さらに、本発明による吸着剤は、化学的及び熱的に安定であり、並びに抗体、抗体断片及びそれらの操作された変異体の結合及び分離について高度に選択性である。
染料リガンドは、当分野にて周知の手順と同様に調製し得る。
次に、以下の実施例を参照することによって、本発明をさらに詳細に説明する。温度は、摂氏で表す。別に示さない限り、部は重量部であり、百分率は重量百分率に関する。重量部は、キログラム対リットルの比において、容積部に関する。
実験の部
A. 一般手順
1. クロマトグラフィー樹脂性能の決定
1.1 抗体凝集体の生成
プロテインA Sepharoseで精製したヒトポリクローナルIgG分子(20ml、タンパク質含量15mg/ml)を、pH4.0の25mM酢酸ナトリウム緩衝液に対して2回透析(それぞれ4時間及び16)する。IgG試料を60℃にて20時間インキュベートして、IgG凝集体の形成を誘導する。次いで熱処理IgG試料を75mMNaCl及びpH5.0に調整し、緩衝液A1(25mmMES20%1,2プロパンジオールpH6.0)に対して透析する。未処理対照IgG試料を緩衝液A1に対して透析する。
図1は、IgGモノマー試料及び熱処理によって得たIgG凝集体に関する、分析的SEC(図1a)の結果及び非還元SDS-PAGE分析(図1b)の結果である(IgG=免疫グロブリン、HT=熱処理、Mu=タンパク質多量体、Mo=タンパク質モノマー)。
熱処理IgG試料及び未処理対照IgG試料のタンパク質含量は15mg/mlに調整する。
1.2 クロマトグラフィー条件
クロマトグラフィーカラム(径=0.5cm、長さ5、2cm)に、クロマトグラフィー樹脂約1.0mlを充填し、標準HPLCシステムに搭載する。
緩衝液
充填/平衡化緩衝液A1: 25mM MES pH 6.0、20% 1,2プロパンジオール
溶出緩衝液B1: 25mM MES pH 6.0、20% 1,2プロパンジオール、1.0M NaCl
溶出緩衝液B2: 25mM Tris/HCl pH8.5、10%イソプロパノール
CIP緩衝液A2:1.0M NaOH
試料の適用
試料(2.0ml、15mg/ml)を75cm/時間(0.25ml/分、保持時間 4分)で適用し、非結合タンパク質を緩衝液A1で洗い流す。結合タンパク質は、300cm/時間(1.0ml/分)にて20CVの100%B1への直線勾配で、その後7CVの緩衝液B2及び7CVの緩衝液A2を用いて完全に取り除くことによって溶出させる。タンパク質試料はUV280nmにて検出し、タンパク質画分を採取する。
SDS PAGE
試料10μg及び画分1mlのうち15μlを非還元化条件下でSDS-PAGE上にロードし、続いてクマシーブルー(Coomassie Blue)染色を行う。
ウィンドウ「A」及びウィンドウ「B」の画分をプールし、0.9mg/mlに調整し、pH4.0の25mM酢酸ナトリウム緩衝液に対して透析する。等量(10μg)を非還元化条件下でSDS-PAGE上にロードし、続いてクマシーブルー染色を行う。
分析的SEC
プールした画分「A」及び「B」の25μlを、30℃にて1.0ml/分でのランニング緩衝液(100mMリン酸ナトリウムpH 4.0緩衝液、300mMのNaCl)中のBioSep-SEC-S2000カラム(Phenomenex)上にロードする。
アイソクラティックタンパク質溶出をUV280nmにて検出する。
2. UV-Vis分光光度計による染料含量(リガンド密度)の決定
2.1 検量線の作製
標準液の調製
染料(25mg)を、まず振とうして次いで10分間超音波を使用して、100mlの容量フラスコ中で水(80ml)に溶解させる。容量フラスコを印まで水で満たす。
検量溶液の調製
濃度5、10、15、20及び25mg/lを有する5つの標準液を以下のとおり調製する。標準液(1、2、3、4及び5ml)を、HCl(6mol/l、40ml)が加えてある50ml容量フラスコにピペッティングする。この溶液を40℃にて1時間、振とう槽中で混合する。溶液は、60℃にて1時間など、さらに高温で振とう槽中で混合しても良い。溶液を室温に冷却し、容量フラスコを印までHCl(6mol/l)で満たす。
試料の調製及び測定
分析予定の染料試料から液体を除去するために、従来の凍結乾燥ステップを実施する。例えば、水性試料を乾燥するために、凍結乾燥を-15℃及び<1mbar減圧で実施することができる。前記凍結乾燥した樹脂試料の一分量(100mg)を50ml容量フラスコに入れ、HCl(6mol/l、40ml)を加える。この溶液を40℃にて1時間、振とう槽中で混合する。溶液は、60℃にて1時間など、さらに高温で振とう槽中で混合しても良い。溶液を室温に冷却し、メスフラスコを印までHCl(6mol/l)で満たす。
UV-Visスペクトルを1cmキュベット及び特定の染料のラムダマックス(λmax)を使用して測定する。6M HClを用いて、装置のブランクをセットする。
計算
R=検量線から読み取った試料中の染料量[mg/l]
50ml容量フラスコ中の染料量=R/1000*50[mg]
Figure 2017512131
B. 合成例
1. 染料リガンドの調製
次の一般式5
Figure 2017512131
 [X=ハロゲン
R=H又はメチル
n=1、2又は3]
の染料リガンドを、以下に本明細書に記載されている濃縮実験を実施するために合成する。
Figure 2017512131
Figure 2017512131
特定の染料はWO2006/108760に詳細に記載されているように調製することができ、その開示は参照により組み込まれる。
1,1 アントラキノン染料の調製
4-アミノアリール置換アントラキノン染料は、文献(例えばH.Zollinger、Color Chemistry、第3版、Wiley-VCH (2003年)、273〜278頁。)に従ってウルマンカップリングによって、出発物質ブロマミン酸及び対応する置換されたフェニレンジアミンから容易に調製することができる。
合成例D1:
構造B-2基を有するアントラキノン染料の合成:
Figure 2017512131
70℃で3時間、炭酸水素ナトリウム緩衝水溶液中で、1-アミノ-4-ブロモアントラキノン-2-スルホン酸をp-アミノアセトアニリドと塩化銅(I)触媒カップリング反応させることにより、次いで、室温にて10〜12%、発煙硫酸中でのスルホン化により、次いで75℃で6時間、希硫酸中での加水分解及び脱保護基により、当該染料を得た。
合成例D2:
構造B-3基を有するアントラキノン染料の合成:
Figure 2017512131
80℃で2時間、炭酸ナトリウム緩衝水溶液中で、1-アミノ-4-ブロモアントラキノン-2-スルホン酸をp-フェニレンジアミンスルホン酸と酢酸銅(II)触媒カップリング反応させることにより、当該染料を得た。
合成例D3:
構造B-4基を有するアントラキノン染料の合成:
Figure 2017512131
60℃で17時間、炭酸水素ナトリウム緩衝水溶液中で、1-アミノ-4-ブロモアントラキノン-2-スルホン酸を1,3-フェニレンジアミン-4-スルホン酸と銅触媒カップリング反応させることにより、当該染料を得た。
1.2 染料リガンドの調製
染料リガンドは異なる2つの方法で原理的には調製することができる(スキーム1も参照のこと):
手順b1) 対応するアントラキノン染料(B-2〜B-4)を、pH4〜5及び15℃にて90分間、青色ジクロロ中間体へと塩化シアヌルと結合させ、次いでpH7.5〜8.5及び60℃にて5時間、対応する置換されたアミン(V-1〜V-8)と結合させるか、又は
手順b2) 置換されたアミン(V-1〜V-8)を、pH3.5〜4及び5℃にて120分間、無色ジクロロ中間体へと塩化シアヌルと結合させ、次いでpH7.5〜8.5及び50℃にて16時間、対応するアントラキノン染料(B-2〜B-4)と結合させる。
Figure 2017512131
合成例L1:染料D15
Figure 2017512131
手順b1):
塩化シアヌル184.4g(1.0mol)を5℃にてエチルメチルケトン1870mlに溶解させ、氷水2240gを加えることにより析出させた。水2240g中のアントラキノン染料B-3の0、933molとpH7.5の炭酸ナトリウム溶液(20%)448gとの溶液を、5℃で、塩化シアヌル懸濁液に加えた。反応を15℃に加温させ、その温度にて90分間攪拌し、炭酸ナトリウム溶液(20%)112gをゆっくりと加えることによりpHを4〜5に保持した。反応終了後(HPLC対照)、水670g中のp-アミノベンゼンスルホン酸(V-8)194g(1、12mol)とpH7.5の炭酸ナトリウム溶液(20%)300gとの溶液を、15℃にてジクロロ中間体に加えた。炭酸ナトリウム溶液(20%)672gを加えることによりpHを7.5〜8.5に調整し、カップリングが完了するまでこのレベルを保った。混合物を60℃に加熱し、5時間攪拌した。
反応終了後(HPLC対照)、塩化ナトリウム1140gを反応混合物に加え、2時間以内で25℃に冷却し、この温度に別途16時間保つことによって、リガンド染料を析出させた。濾過し、濃塩化ナトリウム溶液1200gで洗浄後、プレスケーキを水中で再スラリー化し、逆浸透圧法により脱塩した。濃縮した、塩素フリーの染料溶液を噴霧乾燥して、暗青色微粉末(λmax.=622nm)として染料D15の三ナトリウム塩512g(収率61%)を得た。
手順b2)
p-アミノベンゼンスルホン酸(V-8)60.6g(0.35mol)を水160g及び水酸化ナトリウム溶液(30%)43.4gに溶解させた。第2の容器中で、塩化シアヌル65.9g(0.36mol)を氷370g及び水100g中で十分に懸濁させ、p-アミノベンゼンスルホン酸ナトリム溶液を加えた。水酸化ナトリウム溶液(10%)420mlでpHを2.5〜3.5に修正し、維持し、温度を5℃に保った。反応物を120分間攪拌し、次に40℃に加温し別途30分間攪拌した。水420ml及び水酸化ナトリウム溶液(30%)150ml中のアントラキノン染料B-3の0.25molの溶液を素早く加え、pHを水酸化ナトリウム溶液(10%)460mlで7.5〜8.5に保持し、次いで混合物を50℃にて16時間攪拌した。
反応終了後、塩化ナトリウム600gを反応混合物に加え、2時間以内で25℃に冷却し、この温度に別途16時間保つことによって、リガンド染料を析出させた。濾過し、塩化ナトリウム溶液(26%)530mlで洗浄した後、プレスケーキを水に再スラリー化し、逆浸透圧法により脱塩した。濃縮した、塩素フリーの染料溶液を噴霧乾燥して、暗青色微粉末(λmax.=622nm)として染料D15の三ナトリウム塩111g(収率52%)を得た。
合成例L2:染料D16
Figure 2017512131
例1の手順b2)に従い、pH2.5〜3.5及び0〜5℃にて120分間、塩化シアヌル0.082molをo-アミノベンゼンスルホン酸(V-6)0.080molとカップリングすることによりジクロロ中間体を得、pH7.5〜8.5及び50℃にて16時間、この中間体をアントラキノン染料B-2の0.057molと引き続いてカップリングすることにより、78%の収率(λmax.=605/619nm)で染料D16を得た。
合成例L3:染料D11
Figure 2017512131
例1の手順b1)に従い、pH4〜5及び15℃にて90分間、塩化シアヌル0.0315molをアントラキノン染料B-4の0.030molとカップリングすることによりジクロロ中間体を得、pH7.5〜8.5及び60℃にて5時間、この中間体をm-アミノベンゼンスルホン酸(V-7)0.0318molと引き続いてカップリングすることにより、64%の収率(λmax.=591/624nm)で染料D11を得た。
合成例L4:染料D01
Figure 2017512131
例1の手順b1)に従い、pH4〜5及び15℃にて90分間、塩化シアヌル1.0molをアントラキノン染料B-4の0.933molとカップリングすることによりジクロロ中間体を得、pH7.5〜8.5及び60℃にて5時間、この中間体をN-エチル-N-(m-(β-スルファートエチル)スルホニル-フェニル)アミン(V-4)1.12molと引き続いてカップリングすることにより、49%の収率(λmax.=623nm)で染料D01を得た。
合成例L5:染料D21
Figure 2017512131
例1の手順b2)に従い、pH2.5〜3.5及び0〜5℃にて120分間、塩化シアヌル0.057molをm-アミノベンゼンスルホン酸(V-7)0.056molとカップリングすることによりジクロロ中間体を得、pH7.5〜8.5及び50℃にて16時間、この中間体をアントラキノン染料B-2の0.040molと引き続いてカップリングすることにより、79%の収率(λmax.=609/629nm)で染料D21を得た。
合成例L6:染料D20
Figure 2017512131
例1の手順b1)に従い、pH4〜5及び15℃にて90分間、塩化シアヌル1.0molをアントラキノン染料B-3の0.933molとカップリングすることによりジクロロ中間体を得、pH7.5〜8.5及び60℃にて5時間、この中間体をm-アミノベンゼンスルホン酸(V-7)1.12molと引き続いてカップリングすることにより、63%の収率(λmax.=627nm)で染料D20を得た。
合成例L7:染料D10
Figure 2017512131
例1の手順b2)に従い、pH2.5〜3.5及び0〜5℃にて120分間、塩化シアヌル0.143molをp-アミノベンゼンスルホン酸(V-8)0.140molとカップリングすることによりジクロロ中間体を得、pH7.5〜8.5及び50℃にて16時間、この中間体をアントラキノン染料B-4の0.100molと引き続いてカップリングすることにより、50%の収率(λmax.=592/620nm)で染料D10を得た。
2.吸着剤(樹脂)の調製
その開示が参照により組み込まれるWO06/108760A2に記載されているようなポリアミンスペーサーを介した吸着剤合成の一般手順は、次のとおりであった。
2.1 特定の吸着剤
次の樹脂を調整した。
Figure 2017512131
合成例A1:
a)DAHリンカーを介した吸着剤の合成手順−樹脂BR36、37
アガロースゲル(6%架橋、225g)を水(4500ml)で洗浄し、2Lのジャケット式反応槽の水(900ml)に即座に懸濁させる。エピクロロヒドリン(37.5g、405mmol)を加えた後、当量のNaOH(16.2g、405mmol)を加え、反応塊を290rpmにて25℃で4時間振とうする。次に、懸濁液を濾過し、水(4500ml)で徹底的に洗浄し、水分を除去して、エポキシ活性化アガロースを得る。
エポキシ活性化アガロース(225g)を1,6-ジアミノヘキサン(12.55g、108mmol)の水(900ml)溶液に加える。反応混合物を45℃で4時間振とうし、濾過する。得られたアミノ官能化ゲルを水(4500ml)で徹底的に洗浄し、水分を除去する。
アミノ官能化アガロース(225g)を、75gの3部に分け、第1の部分を染料D10(2.32g、3mmol)の水(300ml)溶液に懸濁させ、混合物を290rpmにて45℃で16時間振とうする。懸濁液を濾過し、過剰の染料リガンドを水(2000ml)、1M NaCl(500ml)、NMP (1000 ml)、1:1v/vのNMP:水(500ml)、1M NaCl(300ml)、1M NaOH(300ml)、1M NaCl(300ml)及び最後に水(2000ml)で洗浄除去する。水分を除去した吸着剤BR36を20%v/vのエタノール中にて4℃で保管する。
アミノ官能化アガロースの第2の部分(75g)を、染料D11(2.32g、3mmol)の水(300ml)溶液に懸濁させ、混合物を290rpmにて45℃で16時間振とうする。懸濁液を濾過し、過剰の染料リガンドを水(2000ml)、1M NaCl(500ml)、NMP(1000 ml)、1:1v/vのNMP:水(500ml)、1M NaCl(300ml)、1M NaOH(300ml)、1M NaCl(300ml)及び最後に水(2000ml)で洗浄除去する。水分を除去した吸着剤BR37を20%v/vのエタノール中にて4℃で保管する。
b)吸着剤BR45、BR46、BR47の合成手順
アガロースゲル(6%架橋、225g)を水(4500ml)で洗浄し、2Lのジャケット式反応槽の水(900ml)に即座に懸濁させる。エピクロロヒドリン(37.5g、405mmol)を加えた後、当量のNaOH(16.2g、405mmol)を加え、反応塊を290rpmにて25℃で4時間振とうする。次に、懸濁液を濾過し、水(4500ml)で徹底的に洗浄し、水分を除去して、エポキシ活性化アガロースを得る。
エポキシ活性化アガロース(225g)を1,6-ジアミノヘキサン(12.55g、108mmol)の水(900ml)溶液に加える。反応混合物を45℃で4時間振とうし、濾過する。得られたアミノ官能化ゲルを水(4500ml)で徹底的に洗浄し、水分を除去する。
アミノ官能化アガロース(225g)を、75gの3つの部分に分け、第1の部分を染料D21(2.32g、3mmol)の水(300ml)溶液に懸濁させ、混合物を290rpmにて45℃で16時間振とうする。懸濁液を濾過し、過剰の染料リガンドを水(2000ml)、1M NaCl(500ml)、NMP(1000 ml)、1:1v/vのNMP:水(500ml)、1M NaCl(300ml)、1M NaOH(300ml)、1M NaCl(300ml)及び最後に水(2000ml)で洗浄除去する。水分を除去した吸着剤B45を20%v/vのエタノール中にて4℃で保管する。
アミノ官能化アガロースの第2の部分(75g)を、染料D19(2.32g、3mmol)の水(300ml)溶液に懸濁させ、混合物を290rpmにて45℃で16時間振とうする。懸濁液を濾過し、過剰の染料リガンドを水(2000ml)、1M NaCl(500ml)、NMP (1000 ml)、1:1v/vのNMP:水(500ml)、1M NaCl(300ml)、1M NaOH(300ml)、1M NaCl(300ml)及び最後に水(2000ml)で洗浄除去する。水分を除去した吸着剤BR46を20%v/vのエタノール中にて4℃で保管する。
アミノ官能化アガロースの第3の部分(75g)を、染料D16(2.32g、3mmol)の水(300ml)溶液に懸濁させ、混合物を290rpmにて45℃で16時間振とうする。懸濁液を濾過し、過剰の染料リガンドを水(2000ml)、1M NaCl(500ml)、NMP (1000 ml)、1:1v/vのNMP:水(500ml)、1M NaCl(300ml)、1M NaOH(300ml)、1M NaCl(300ml)及び最後に水(2000ml)で洗浄除去する。水分を除去した吸着剤BR47を20%v/vのエタノール中にて4℃で保管する。
C.試験例
例T1:モノマーIgG分子からのHMWA(高分子量凝集体)の不十分な分離(先行技術)
IgG抗体凝集体を方法セクション(A.1.1)に記載されているように調製する。
凝集体試料を、A.1.2に基づいて上記のように市販Blue Sepharose(登録商標)(BS)樹脂(染料リガンド密度137μmol/g)上で分析した。特に、図2aに示したようにカラム溶出液をプールした。プールA(BS-A)及びプールB(BS-B)をSDS-PAGE(図2b)及び分析用サイズ排除クロマトグラフィー(図2c)によりさらに分析した。
(L=ロード、Mu=タンパク質多量体、Mo=タンパク質モノマー；クマシーブリリアントブルー染色による非還元SDS-PAGE)
Mo及びMuの不十分な分離が、特にプールBにおいて明らかである。
例T2:本発明によるBASF樹脂の適用によるモノマーIgG分子からのHMWAの改善された分離
IgG抗体凝集体を方法セクション(A.1.1)に記載されているように調製する。
凝集体試料を、A.1.2に基づいて上記のようにBASF樹脂BR36、BR37、BR45、BR46及びBR47(染料リガンド密度284、281、280、307、256μmol/gをそれぞれ有する染料リガンドD10、D11、D21、D15、D16; C6リンカー)上で分析した(図3a及び図3bを参照のこと)。各クロマトグラフィー分離の単一画分をSDS-PAGEにより分析することで(図4)、改善された凝集体(Mu)除去が示された。BASF樹脂の優れた分離特性をさらに解析するために、カラム溶出液を図2a及び図3a、図3bに示したようにプールした。プールA及びプールBを分析用サイズ排除クロマトグラフィー(図5)及びSDS-PAGE(図6)によりさらに分析した。
(L=ロード、FT=フロースルー、Mu=タンパク質多量体、Mo=タンパク質モノマー；クマシーブリリアントブルー染色による非還元SDS-PAGE)
Mo及びMuの改善された分離が、特にプールBにおいて、市販のBlue sepharose(例T1)と比較すると、明らかである。
本明細書に引用の先行技術文献の開示は、参照により組み入れられる。

Claims (15)

  1. 免疫グロブリン分子をクロマトグラフィーにより精製するための吸着剤であって、前記吸着剤は、染料リガンドが共有結合した担体マトリクスを含み、前記染料リガンドはアントラキノン染料から選択され、前記吸着剤のリガンド密度は乾燥吸着剤1g当たり150μモルより大きい、吸着剤。
  2. 前記吸着剤が、前記担体マトリクス、任意のリンカー分子、及び一般式1
    Figure 2017512131
     [式中、
    Xはハロゲンであり、
    k及びmはそれぞれ互いに独立して0又は1であり、k+mの合計は1又は2であり、
    Bは芳香族基であり、1つ以上の、縮合した又は非縮合の、一置換又は多置換されていてもよい芳香環を含み、
    Vは式
    Figure 2017512131
     の置換基である
    (式中、
    nはそれぞれ0又は1であり、ただし両方のnが同時に0ではないものとし、
    Rは同一又は異なり、H、アルキル、NH2、NH-アルキル、NH-アリール、N(アルキル)2、NO2、OH、O-アルキル、CN、C(O)アルキル、C(O)アリール、C(O)NH2、C(O)N(H)アルキル、C(O)N(アルキル)2、C(O)N(H)アリール、ハロゲンから選択され、
    R1は水素又は置換されていてもよいC1〜C4アルキルであり、
    Zは、化学結合、
    n1が1から4の整数である-(CH2)n1-、
    アリーレン、
    -CH2-アリーレン、
    -SO2-アリーレン、
    -C(O)N(H)アリーレン、
    -SO2N(H)アリーレン、
    -CH=CH-、
    -SO2-CH2-CH2-;
    n2が1から4の整数である-C(O)NH-(CH2)n2-から選択され、
    Yは、-SO3H、-OSO3H、-CO2H、-P(O)(OH)2、-OP(O)(OH)2、OH及びSHから選択される同一又は異なる極性官能基である)]
    のアントラキノン化合物の反応生成物を含む、請求項1に記載の吸着剤。
  3. Bが式
    Figure 2017512131
    Figure 2017512131
    (式中、
    Yは上に定義したとおりであり、
    nは0又は1であり、
    n3は0、1、2、3又は4であり、
    Y1は、同一又は異なり、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、NO2又はYから選択され、ここでYは上に定義したとおりであり、
    Wは、化学結合であるか又は-C(O)N(H)-、-SO2N(H)-、-SO2-若しくは-N(H)-から選択され、
    R2はH又はアルキルから選択される)
    の置換基である、請求項1又は2に記載の吸着剤。
  4. Bが式3aの芳香族基である、請求項1から3のいずれか一項に記載の吸着剤。
  5. Vが式2aの置換基である、請求項1から4のいずれか一項に記載の吸着剤。
  6. Bが式3aの芳香族基であって、式中、n3が0、1、2、3又は4であり、Y1が独立してアルキル又はYである、請求項4に記載の吸着剤。
  7. Vが式2aの置換基であり、RがHであり、Zが化学結合又は-SO2-CH2-CH2-から選択される、請求項5に記載の吸着剤。
  8. kが0であり、mが1である、請求項1から7のいずれか一項に記載の吸着剤。
  9. 平均粒度が、20〜180又は45〜165又は80〜120又は90〜110μmのような10〜200μmの範囲にある、請求項1から8のいずれか一項に記載の吸着剤。
  10. 免疫グロブリン分子のクロマトグラフィーによる精製方法であって、
    夾雑無機物質及び/又は夾雑有機物質と混合して少なくとも1つの所望の種類の免疫グロブリン分子を含有する試料を請求項1から9のいずれか一項に記載の吸着剤と接触させるステップ、前記所望の種類の免疫グロブリン分子を前記吸着剤に吸着させるステップ、任意で、前記吸着剤を洗浄液体で洗浄するステップ、及びその後、濃縮形態で前記所望の免疫グロブリン分子を含有する溶出液を得るために吸着物質を溶出させるステップを含む;又は夾雑無機物質及び/又は夾雑有機物質と混合して少なくとも1つの所望の種類の免疫グロブリン分子を含有する試料を請求項1から9のいずれか一項に記載の吸着剤と接触させるステップ、前記夾雑無機物質及び/又は夾雑有機物質を(選択された条件下で)吸着させるステップ、より純粋な形態で前記所望の免疫グロブリン分子を含有するフロースルーを得るステップを含む、方法。
  11. 前記所望の種類の免疫グロブリン分子が機能性抗体(Ab)又は断片抗体(fAb)である、請求項10に記載の方法。
  12. 精製すべき免疫グロブリン含有試料が、変性した及び/又は凝集した/多量化した免疫グロブリンで汚染されている、請求項10又は11に記載の方法。
  13. 免疫グロブリン分子、特にAb及びfAbを分離するための、請求項1から8のいずれか一項に記載の化合物の使用。
  14. 請求項1から9のいずれか一項に記載のアントラキノン化合物を有する少なくとも1つの吸着剤、及び少なくとも1つの分離したfAbを同定するためのさらなる材料を含む、調製用又は分析用キット。
  15. 請求項1から9のいずれか一項に記載の吸着剤の製造方法であって、活性化されていてもよい担体を、例えばトリ-2'-アミノエチルアミン(TREN)のような、適切なリンカーと反応させるステップ、その後、前記で得られた官能化吸着剤を請求項1から8に記載のアントラキノン化合物と反応させるステップを含む、方法。
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