CN117580850A - 分离双特异性抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离双特异性抗体或双特异性抗体片段的方法。该方法包括以下步骤：a)提供包含双特异性抗体或双特异性抗体片段的进料；b)使所述进料与具有与载体偶联的亲和配体的分离基质接触；c)任选地用洗涤液洗涤分离树脂；d)将洗脱缓冲液施加到分离树脂，以洗脱与亲和配体结合的抗体或抗体片段；其中在步骤d)中，对洗脱缓冲液施加pH梯度，所述pH梯度为从约6至约2。

Description

分离双特异性抗体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，以及一种分离抗体和抗体片段的新方法，特别是双特异性抗体和双特异性抗体片段的分离。
背景
免疫球蛋白代表了全球生产或开发中最普遍的生物制药产品。对抗体治疗市场的高商业需求及其由此的价值导致重点放在制药公司上，以使其各自的单克隆抗体(mAb)生产过程的生产率最大化，同时控制相关的成本。
在大多数情况下，使用亲和色谱作为免疫球蛋白分子(例如单克隆或多克隆抗体)纯化的关键步骤之一。一类特别令人感兴趣的亲和试剂是能够与免疫球蛋白分子的不变部分特异性结合的蛋白质，这种相互作用独立于抗体的抗原结合特异性。此类试剂可广泛用于从不同的样品(例如但不限于血清或血浆制备物，或细胞培养物衍生的原料)中亲和色谱回收免疫球蛋白。此类蛋白质的一个例子是葡萄球菌蛋白A，其含有能够结合来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的结构域。这些结构域通常表示为E、D、A、B和C结构域。
基于葡萄球菌蛋白A(SpA)的试剂由于其高亲和力和选择性而在生物技术领域中得到广泛应用，例如在亲和色谱中用于捕获和纯化抗体以及用于检测或定量。目前，基于SpA的亲和介质可能是最广泛使用的亲和色谱树脂，用于从不同的样品(包括工业细胞培养物上清液)中分离单克隆抗体及其片段。因此，包含蛋白A-配体的各种基质是可商购的，例如呈天然蛋白A的形式(例如Protein A SepharoseTM,Cytiva,Uppsala,Sweden)并且还包含重组蛋白A(例如rProtein A SepharoseTM,Cytiva)。更具体地，在商业重组蛋白A产品中进行的基因操作旨在促进其定向附着至载体以及提高配体的生产率。
单克隆抗体(mAb)是单特异性抗体，这意味着它们结合一种类型的抗原。它们由杂交瘤细胞产生，并且一种杂交瘤细胞系产生的所有mAb都是相同的。
双特异性抗体(bsAb)是工程化抗体，更广泛地用作生物技术中的工具。它们还具有治疗潜力，大量临床试验正在进行中。双特异性抗体是包含两个不同的抗原结合位点的抗体，例如，可以结合同一抗原或不同抗原上的两个表位。因此，双特异性抗体可以潜在地结合两种不同的抗原。具有明确特异性的双特异性抗体是人造分子，并且本身在自然界中不存在。U.Brinkmann等人(Brinkmann.U.,Kontermann,R.E.,MAbs,2017FEB-Mar；9(2):182-212)进一步更详细地描述了一系列双特异性抗体。
发明概述
双特异性IgG分子的生成很困难，因为轻链和重链以及因此其中的可变结构域(VL；VH)的配对可能是混杂的。两条不同的轻链和两条不同的重链的配对可能导致大量错配，因为通常只需要一个特定的不对称组合，并且实现的多数组合将是非功能性或不需要的分子，例如单特异性同二聚体。因此，越来越需要改进的工具和方法来将双特异性抗体与单特异性抗体分离，以及将错配的双特异性抗体与正确匹配的双特异性抗体分离。因此，本发明人的目标是找到一种能够相应地分离双特异性抗体的改进方法。
可变重链3(VH3)是可变重链(VH)的一个子类，其在生物技术中得到了进一步开发，因为它表现出比其它重链子类改进的表达和稳定性。
为了解决上述目标，本发明人开发了一种能够基于VH3链的存在将双特异性抗体与单特异性抗体或错配的抗体分离的方法。单克隆抗体具有两条相同的VH链。双特异性抗体可被设计为包含两条不同的VH链。这种分离方法可以使用任何市售的具有维持的VH3相互作用的蛋白A配体来进行。当从蛋白A配体色谱基质洗脱双特异性抗体时，通过使用pH梯度进行分离。
因此，上述目标通过分离双特异性抗体或双特异性抗体片段的方法来实现，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含双特异性抗体或双特异性抗体片段的进料；
b)使所述进料与具有与载体偶联的亲和配体的分离基质接触；
c)任选地用洗涤液洗涤分离树脂；
d)将洗脱缓冲液施加到分离树脂，以洗脱与亲和配体结合的抗体或抗体片段。
在步骤d)中，对洗脱缓冲液施加pH梯度。所述pH梯度为从约6至约2。
pH梯度可为从约5.5、或从约5.2、或从约5.0至约2.0、或至约2.5。
亲和配体可以是蛋白A配体。蛋白A配体可包含天然或突变的结构域，所述结构域选自Z结构域、A结构域、B结构域、C结构域、D结构域和E结构域。优选地，蛋白A配体可包含天然或突变的Z结构域，或者天然或突变的C结构域。
载体可以包含交联的琼脂糖珠。或者，载体可包含横截面直径为10-1000nm，例如200-800nm、200-400nm或300-400nm的纤维。
上述方法中使用的进料可以是澄清的细胞培养物上清液。
抗体片段可以是包含两条不同的VH链的任何抗体片段，其中一条VH链是VH3。抗体片段可以选自双抗体(diabody)、scFv-Fc、scFv-CH、Fab-scFv-Fc或scFv-拉链。
抗体可以是具有两条不同的VH链的任何抗体，其中一条VH链是VH3。
附图简述
图1是抗体(例如IgG)的示意图。
图2是色谱图，显示使用来自Cytiva的商业产品MabSelectTMSuRe未能将具有一个VH3区的抗体与具有两个VH3区的抗体分离。
图3是色谱图，显示使用来自Cytiva的商业产品MabSelectTMPrismA将具有一个VH3区的抗体与具有两个VH3区的抗体分离。
图4是色谱图，显示使用来自JSR的商业产品AmsphereTM A3将具有一个VH3区的抗体与具有两个VH3区的抗体分离。
图5是色谱图，显示使用来自Purolite的商业产品Jetted A50将具有一个VH3区的抗体与具有两个VH3区的抗体分离。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用，并且是指具有由两条重(H)链和两条轻(L)链组成的基本四多肽链结构的抗原结合蛋白，所述链通过链间二硫键稳定。每条重链包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。该术语应理解为还包括抗体片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白以及包含抗体或抗体片段的缀合物。
术语“片段”是指包含比完全或完整的抗体或抗体链更少的氨基酸残基的抗体或抗体链的一部分(part)或部分(portion)。片段可以通过完全或完整的抗体或抗体链的化学或酶处理来获得。片段也可以通过重组方法获得。示例性的片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabe和/或Fv片段。术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体的多肽片段，其结合抗原或与它们所源自的完全抗体竞争特异性抗原结合。
术语“Fc结合多肽”、“Fc结合剂”和“Fc结合蛋白”分别意指能够结合抗体的可结晶部分Fc区的多肽、分子或蛋白，并且包括但不限于，例如蛋白A和蛋白G，或其保持所述结合特性的任何片段或融合蛋白。
术语“Fc区”是指IgG抗体的C末端区域，特别是所述IgG抗体的重链的C末端区域。
术语“Fv片段”是指片段可变区并且仅包含两个可变结构域VH和VL。VH和VL通过非共价相互作用在Fv片段中保持在一起。术语“Fab片段”是指片段抗原结合区并且包括重链和轻链二者的恒定结构域和可变结构域。术语“F(ab)片段”是指具有1个抗原结合位点的片段。术语“(Fab')2片段”是指具有通过二硫键连接的两个抗原结合区的二价片段。F(ab')2片段的还原产生2个单价Fab'片段，其具有可用于与其它分子缀合的游离巯基。
重链上的“可变”结构域可互换地称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“VH”区、“VH”结构域或“VH”链。
术语“结构域”和“区”在本公开中可互换使用。
本文所用的术语“进料”是指含有至少一种目标物质的液体，所述目标物质寻求从还存在的其它物质纯化。进料可以例如是水性溶液、有机溶剂系统或水/有机溶剂混合物或溶液。源液体往往是复杂的混合物或溶液，其含有许多生物分子(如蛋白质、抗体、激素和病毒)、小分子(如盐、糖、脂质等)以及甚至颗粒物。虽然生物来源的典型源液体可以作为水性溶液或悬浮液开始，但它也可以包含在早期分离步骤(例如溶剂沉淀、提取等)中使用的有机溶剂。可以含有适合通过本发明的各种实施方案纯化的有价值的生物物质的进料的实例包括但不限于来自生物反应器的培养物上清液、匀浆的细胞悬浮液、血浆、血浆级分和奶。
如本文所用，术语“固体载体”是指在纯化过程中与目标物质相互作用或Fc结合剂可以附着的非水性基质。合适的固相材料包括但不限于玻璃、二氧化硅(例如硅胶)、多糖(例如多糖基质)例如琼脂糖和纤维素、有机聚合物例如聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物。固相可以具有多孔或无孔特性，并且可以是可压缩的或不可压缩的。在各种实施方案中，固相是聚合物基质或琼脂糖颗粒或珠。优选的固体载体材料对于纯化过程中所采用的条件(包括泵送和错流过滤，以及所用液体的温度、pH和其它方面)在物理和化学上具有弹性。
“亲和配体”是指通过与源液体的组分的结合位点的特异性相互作用而选择性地或优先地结合该组分的部分。在本发明中，亲和配体通常固定至固相，例如树脂。可以结合至树脂载体以提供可用于本发明的方法的色谱树脂的亲和配体的实例包括但不限于蛋白A、蛋白G及它们的类似物，其选择性地结合蛋白Fc区。将亲和配体结合至固体载体材料的方法是纯化领域众所周知的。
“缓冲液”是一种物质，其通过在溶液中的存在，增加必须添加以引起pH单位变化的酸或碱的量。缓冲溶液通过其酸-碱共轭组分的作用来抵抗pH的变化。与生物试剂一起使用的缓冲溶液通常能够维持恒定的氢离子浓度，使得溶液的pH在生理范围内。术语“生理pH”是指哺乳动物血液的pH(即7.38或约7.4)。因此，生理pH范围为从约7.2至7.6。传统的缓冲液组分包括但不限于有机和无机盐、酸和碱。用于纯化生物分子(例如，蛋白质分子)的示例性缓冲液包括两性离子或“Good”缓冲液，参见例如Good等人(1966)Biochemistry 5:467以及Good和Izawa(1972)Methods Enzymol.24:62。
本文中的“平衡缓冲液”是用于制备结合试剂、固相或两者的缓冲液，用于加载含有目标蛋白质的源液体。平衡缓冲液优选是等渗的，并且通常具有从约6至约8的范围内的pH。“加载缓冲液”是用于将含有含结合区的蛋白质和杂质的源液体加载到固定了结合剂的固相上的缓冲液。通常，平衡缓冲液和加载缓冲液是相同的。“洗脱缓冲液”用于从固定的结合剂洗脱含结合区的蛋白质。优选地，洗脱缓冲液具有低pH并由此破坏Fc结合剂和目的蛋白质之间的相互作用。优选地，低pH洗脱缓冲液的pH范围为从约2至约5，最优选范围为从约3至约4。将pH控制在该范围内的缓冲液的实例包括甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐和铵缓冲液，以及它们的组合。优选的此类缓冲液是柠檬酸盐和乙酸盐缓冲液，最优选柠檬酸钠或乙酸钠缓冲液。预期其它洗脱缓冲液包括高pH缓冲液(例如具有9或更高pH的那些)或包含化合物或组合物例如MgCl2(2mM)的缓冲液，用于洗脱目的蛋白质。
本文所用的“洗涤液”或“洗涤缓冲液”在本文均指用于从与目标物质结合的色谱树脂带走杂质的液体。可以序贯使用多于一种洗涤液，例如，连续的洗涤液具有不同的性质，例如pH、电导率、溶剂浓度等，旨在解离和去除与色谱树脂非特异性缔合的不同类型的杂质。
“洗脱液”或“洗脱缓冲液”在本文中是指在用一种或多种洗涤液洗涤色谱树脂之后用于将目标物质从色谱树脂解离的液体。洗脱液的作用是解离目标物质，而不使其发生不可逆的变性。典型的洗脱液是色谱领域众所周知的，并且可以具有较高浓度的盐、游离亲和配体或类似物、或促进目标物质从色谱树脂解离的其它物质。“洗脱条件”是指对目标物质结合的色谱树脂施加的过程条件，其使目标物质从色谱树脂解离，例如使目标物质结合的色谱树脂与洗脱液或洗脱缓冲液接触以产生这样的解离。
如本文所使用的，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”、“具有”等可以具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可以表示“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由......组成”或“基本上组成”同样具有美国专利法中所赋予的含义，并且该术语是开放式的，允许存在比所列举的内容更多的内容，只要所列举的内容的基本或新颖的特征不因比所列举的内容更多的内容的存在而改变，但排除现有技术实施方案。
详细描述
人类产生的最常见抗体是免疫球蛋白G(IgG)。IgG由四条不同的多肽链组成，即两条相同的重链(HC)和两条相同的轻链(LC)。图1示意性地描绘了IgG并且在以下描述中被提到。HC均由一个表示为VH 2的可变结构域和三个分别表示为CH13、CH24和CH35的恒定结构域组成。重链的C端位于CH3结构域5的末端。重链在负责两条链之间的共价连接的铰链区处保持在一起。两条轻链通过二硫键共价连接至重链。这些轻链由一个表示为VL 6的可变结构域和一个表示为CL 7的恒定结构域组成。轻链与VH和CH1一起形成可以结合单一抗原的抗原结合片段(Fab)。单克隆抗体通常有两条相同的HC和LC。特别地，单克隆抗体通常具有两个相同的VH结构域2，因为它是单特异性的。双特异性抗体具有两个不同的可变区(Fv)8、9，因此可以包含两个不同的VH结构域2，这在图1中以两个VH结构域2的不同图案进行说明。
抗体中两条重链共价连接的部分称为可结晶片段(Fc)，因此由两条重链的CH35和CH24结构域组成。Fc可以与各种Fc受体(FcR)结合，从而参与或介导免疫系统内的效应子功能。并非所有抗体都有Fc区，例如IgM就缺少Fc区。
蛋白A配体选择性结合免疫球蛋白的Fc区，从而允许高效的捕获步骤。天然的蛋白A仍然有用，因为它还结合免疫球蛋白的VH3区。然而，天然的蛋白A在生物加工中使用的碱性清洁条件下不稳定，并且一些碱稳定的蛋白A变体具有抑制VH3相互作用的突变，参见例如US20060194950。该文件讨论了蛋白AFc结合B结构域中的G29A突变对VH3相互作用的抑制，产生了商业产品MabSelectTMSuRe中使用的Z结构域。
本发明人开发了一种方法，该方法能够基于VH3链，使用任何市售的具有维持的VH3相互作用的蛋白A配体，将双特异性抗体与单特异性抗体或错配的抗体分离。换句话说，本文公开的方法中使用的亲和配体是VH3结合蛋白A配体。当从包含所述VH3结合蛋白A配体的蛋白A配体色谱树脂洗脱抗体时，通过使用pH梯度进行分离。
本发明的分离双特异性抗体或双特异性抗体片段的方法包括以下步骤：
a)提供包含双特异性抗体或双特异性抗体片段的进料；
b)使所述进料与具有与固体载体偶联的亲和配体的分离基质接触；
c)任选地用洗涤液洗涤分离树脂；
d)将洗脱缓冲液施加到分离树脂，以洗脱与亲和配体结合的抗体或抗体片段。
在步骤d)中，对洗脱缓冲液施加pH梯度，所述pH梯度为从约6至约2。如实施例2-4和图3-5中可见的，该方法允许在包含一条VH3链的抗体和包含两条VH3链的抗体之间进行分离。
根据一个实施方案，pH梯度为从约5.5至约2.0，或至约2.5。在另一个实施方案中，pH梯度为从约5.2至约2.0，或至约2.5。在又一个实施方案中，pH梯度为从约5.0至约2.0，或至约2.5。
在该方法的pH范围内，抗体与亲和配体的任何Fc结合将首先被释放，因为Fc结合将在较高pH下被消除。当Fc结合已被中和时，通过降低pH，VH相互作用仍然有效，并将mAb保留在分离基质内。Fc结合的亲和力仍然可以强于VH结合，但是在本方法中所选择的条件下，特别是与pH相关的条件下，VH相互作用将在较低的pH下保持。因此，任何不具有至少一个VH3区的抗体将在达到分离的pH梯度范围之前被洗脱。因此，该分离方法也可用于在一条HC或两条HC上敲除Fc结合的抗体。
如实施例中所示，该方法对于具有亲和配体上仍存在Fc结合(实施例2-4)和存在VH相互作用的配体效果良好。对于VH3相互作用被抑制的配体，没有观察到分离(参考实施例1)。
本发明的方法的一个优点是可以使用已经市售的亲和配体。本发明人利用了通常被忽视的已经存在的VH3结合，并且开发了基于该VH3结合的分离方法。
适合用本方法分离的抗体是双特异性的抗体，从某种意义上说，它们具有一条或两条结合VH3链。因此，它可能涉及仅具有一条VH3链的抗体与具有两条VH3链的抗体的分离。缺少VH3链的抗体也可以被分离，因为它们将在洗脱步骤中与上述两种形式分离。
根据本方法的分离导致在指定的洗脱pH梯度中具有一条VH3链的抗体将在具有两条VH3链的抗体之前洗脱。不具有VH3链的抗体将在具有一条VH3链的抗体之前洗脱，因为此类抗体据推测将通过Fc部分结合亲和配体，并因此在Fc结合被废除时洗脱。
本发明的方法中使用的亲和配体优选为蛋白A配体。蛋白A配体可包含天然或突变的结构域，所述结构域选自Z结构域、A结构域、B结构域、C结构域、D结构域和E结构域。在一个优选的实施方案中，配体包含天然或突变的Z结构域。在另一个优选的实施方案中，配体包含天然或突变的C结构域。具有可用于本方法的亲和配体的分离基质可选自MabSelectTM(Cytiva)、MabSelectTMXtra(Cytiva)、ProSepTMA(Merck Millipore)、ProSepTMUltra Plus(Merck Millipore)、AbSoluteTM、CaptivATM(Repligen)、PriMabTM(Repligen)和Protein ADiamond(Bestchrom)、MabSelectTMPrismA(Cytiva)、EshmunoTMA(Merck Millipore)、ToyopearlTMAF-rProtein A(Tosoh)、AmsphereTMA3(JSR)和Jetted A50(Purolite)。
分离基质的固体载体可以是多孔载体。分离基质的多孔载体可以具有任何合适的公知类型。传统的亲和分离基质通常具有有机性质并且基于将亲水表面暴露于所用水性介质的聚合物，即在其外部表面上，并且如果存在的话，也在内部表面上暴露的羟基(-OH)、羧基(COOH)、甲酰胺基(-CONH2，可能呈N-取代的形式)、氨基(-NH2，可能呈取代的形式)、寡聚或多聚乙烯氧基。
在某些实施方案中，载体包含多羟基聚合物，例如多糖。多糖的实例包括例如葡聚糖、淀粉、纤维素、支链淀粉、琼脂、琼脂糖等。多糖本质上是亲水性的，具有低程度的非特异性相互作用，它们提供高含量的反应性(可活化)羟基，并且它们通常对生物处理中使用的碱性清洁溶液稳定。
在一些实施方案中，载体包含琼脂或琼脂糖。载体可以是市售产品，例如以SepharoseTM FF(Cytiva)的名称出售的交联的琼脂糖珠。在对于大规模分离特别有利的实施方案中，载体已被修改为使用US6602990或US7396467中描述的方法来增加其刚性，并且因此使得基质更适合于高流速。
在某些实施方案中，载体，例如聚合物、多糖或琼脂糖载体，是交联的。交联有利于载体的刚性并提高化学稳定性。在一个优选的实施方案中，载体包含交联的琼脂糖珠。
分离基质的固体载体可以是基于对流的色谱基质。所述基于对流的色谱基质可以是纤维基材。所述纤维基材可以基于电纺聚合物纤维或纤维素纤维，任选地非织造纤维。因此，纤维基材可以是纤维非织造聚合物基质。纤维优选是交联的。所述纤维基材中包含的纤维具有10-1000nm，例如200-800nm、200-400nm或300-400nm的横截面直径。这种纤维基材可以在Cytiva的HiTrap Fibro装置中找到。
应用于分离基质的进料可以是细胞培养物上清液。细胞培养物上清液可以含有细胞或者可以去除细胞，和/或其可以是澄清的。
进料中包含的抗体是具有两条不同的VH链的任何抗体，其中一条VH链是VH3。旋钮入孔(Kih)是一种经过充分验证用于生产双特异性抗体的技术。适用于本方法的双特异性抗体可以是所谓的共同轻链Ab。共同轻链Ab有两条相同的轻链，因此双特异性仅与不同的VH链有关。除了不同的VH链之外，合适的双特异性抗体还可以具有不同的轻链。最近还已经改造了四VH IgG，其包含四条VH链。这些四价IgG也可以用本方法分离。Duobody是Fc修饰的IgG的另一个实例，其包含两条不同的VH链。
包含两条VH链(其中一条是VH3链)的抗体片段也可以通过本方法分离。因此，进料中包含的抗体片段可以是包含两条不同的VH链的任何抗体片段，其中一条VH链是VH3。所述抗体片段可以选自双抗体、scFv-Fc、scFv-CH、Fab-scFv-Fc或scFv-拉链。单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过约10-25个氨基酸的短接头肽连接的融合蛋白。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始免疫球蛋白的特异性。双抗体是通过接头肽连接的两个scFv，所述接头肽对于两个可变区折叠在一起而言太短(约5个氨基酸)，迫使scFv二聚化。双抗体已被证明具有相应scFv的至少1/40的解离常数，这意味着它们对其靶标具有更高的亲和力。两个scFv也可以用较长的接头连接，形成scFv二聚体。它们可以例如是scFv-Fc或scFv-CH，或scFv-拉链。
上述双特异性抗体片段和双特异性抗体的列表仅是示例性的而非详尽的。技术人员将理解，包含至少两条VH链(其中一条VH链是VH3链)的任何抗体片段都适用于根据本发明的方法。
在下面的非限制性实施例中说明本发明的方法。从这些实施例明显看出，根据权利要求的方法能够在一系列亲和配体和分离基质上将双特异性抗体与单特异性抗体分离。因此，本发明的方法的概念原理被证明适用于多种亲和配体和分离基质。
实施例
实验中使用了两种mAb。(来自Roche的抗体emicizumab)是一种HC异二聚体，其中一条HC具有VH3区，并且一条HC具有VH1区。/>(来自Roche的抗体曲妥珠单抗)是一种同二聚体，其包含两个VH3结构域，每条HC上一个。在以下实施例中，两种mAb在应用于具有每个实施例中指定的分离基质的色谱柱之前被混合。
实施例1(参考)
该实验使用来自Cytiva的MabSelectTMSuRe分离基质，使用上述抗体混合物进行。
运行条件：
样品：在PBS中浓度分别为1.2和0.6mg/mL
柱：Tricorn 5/100，Bh＝10cm，Vt＝2mL
树脂：MabSelectTMSuRe
缓冲液A1：PBS
缓冲液A2：50mM柠檬酸钠pH＝6.5
缓冲液A3：25mM NaOH
缓冲液B1：50mM柠檬酸钠pH＝2.5
系统：
流速：0.5mL/min
平衡：2个CV的缓冲液A1
样品施加：200μL
洗涤1：2个CV的缓冲液A1
洗涤2：3个CV的缓冲液A2
洗脱：10个CV中30-100％缓冲液B1
结果如图2所示。两种mAb之间没有观察到分离。这是因为如上所述，MabSelectTMSuRe的VH3相互作用受到抑制，配体上仅具有Fc结合。因此，由于与树脂的结合是基于抗体的Fc区，因此无法获得VH3链数量不同的双特异性抗体与单特异性抗体的分离。
实施例2
该实验使用PrismA分离基质，使用与上述相同的抗体混合物进行。
运行条件：
样品：的混合物，在PBS中浓度分别为1.2和0.6mg/mL
柱：Tricorn 5/100，Bh＝10cm，Vt＝2mL
树脂：MabselectTM PrismA
缓冲液A1：PBS
缓冲液A2：50mM柠檬酸钠pH＝6.5
缓冲液A3：25mM NaOH
缓冲液B1：50mM柠檬酸钠pH＝2.5
系统：
流速：0.5mL/min
平衡：2个CV的缓冲液A1
样品施加：200μL
洗涤1：2个CV的缓冲液A1
洗涤2：3个CV的缓冲液A2
洗脱：10个CV中30-100％缓冲液B1
结果如图3所示。在pH梯度从5.2到2.5的情况下，观察到两种mAb之间的分离。26ml左右的第一个洗脱峰对应于并且27ml左右的第二个洗脱峰对应于
因此，VH3相互作用似乎负责含有VH1和VH3的重链的分离。
实施例3
该实验使用来自JSR的AmsphereTMA3分离基质，使用与上述相同的抗体混合物进行。
运行条件：
样品：的混合物，在PBS中浓度分别为1.2和0.6mg/mL
柱：Tricorn 5/100，Bh＝10cm，Vt＝2mL
树脂：JSRAmsphereTMA3
缓冲液A1：PBS
缓冲液A2：25mM柠檬酸钠pH＝5.5
缓冲液A3：100mM NaOH
缓冲液B1：44mM柠檬酸钠pH＝2.5
系统：
流速：0.5mL/min
平衡：2个CV的缓冲液A1
样品施加：100μL
洗涤1：2个CV的缓冲液A1
洗涤2：3个CV的缓冲液A2
洗脱：10个CV中0-100％缓冲液B1
结果如图4所示。在pH梯度从5.2到2.5的情况下，观察到两种mAb之间的分离。37ml左右的第一个洗脱峰对应于并且40ml左右的第二个洗脱峰对应于Herceptin。
同样，VH3相互作用似乎负责包含VH1和VH3的重链的分离。
实施例4
该实验使用来自Purolite的Jetted A50分离基质，使用与上述相同的抗体混合物进行。
运行条件：
样品：的混合物，在PBS中浓度分别为1.2和0.6mg/mL
柱：Tricorn 5/100，Bh＝10cm，Vt＝2mL
树脂：PuroliteJetted A50
缓冲液A1：PBS
缓冲液A2：25mM柠檬酸钠pH＝5.5
缓冲液A3：100mM NaOH
缓冲液B1：44mM柠檬酸钠pH＝2.5
系统：
流速：0.5mL/min
平衡：2个CV的缓冲液A1
样品施加：100μL
洗涤1：2个CV的缓冲液A1
洗涤2：3个CV的缓冲液A2
洗脱：10个CV中0-100％缓冲液B1
结果如图5所示。在pH梯度从5.2到2.5的情况下，观察到两种mAb之间的分离。37ml左右的第一个洗脱峰对应于并且40ml左右的第二个洗脱峰对应于
再次，VH3相互作用似乎负责包含VH1和VH3的重链的分离。
本书面描述使用实施例来公开本发明，包括最佳模式，并且还使得本领域的任何技术人员能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统以及执行任何并入的方法。本发明的可专利范围由权利要求书限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其它实施例。如果这些其它实施例具有与权利要求的字面语言没有不同的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的字面语言没有实质差异的等效结构要素，则这些其它实施例旨在落入权利要求的范围内。本文中提及的任何专利或专利申请均通过引用整体并入本文，如同它们单独并入一样。

Claims (11)

1.一种分离双特异性抗体或双特异性抗体片段的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含双特异性抗体或双特异性抗体片段的进料；
b)使所述进料与具有与载体偶联的亲和配体的分离基质接触；
c)任选地用洗涤液洗涤分离树脂；
d)将洗脱缓冲液施加到分离树脂，以洗脱与亲和配体结合的抗体或抗体片段；
其中在步骤d)中，对洗脱缓冲液施加pH梯度，所述pH梯度为从约6至约2。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述pH梯度为从约5.5、或从约5.2、或从约5.0至约2.0、或至约2.5。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述亲和配体是蛋白A配体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述蛋白A配体包含天然或突变的结构域，所述结构域选自Z结构域、A结构域、B结构域、C结构域、D结构域和E结构域。
5.根据权利要求3或4中任一项所述的方法，其中所述蛋白A配体包含天然或突变的Z结构域，或者天然或突变的C结构域。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述载体包含交联的琼脂糖珠。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述载体包含横截面直径为10-1000nm，例如200-800nm、200-400nm或300-400nm的纤维。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述进料是澄清的细胞培养物上清液。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体片段是包含两条不同的VH链的任何抗体片段，其中一条VH链是VH3。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体片段选自双抗体、scFv-Fc、scFv-CH、Fab-scFv-Fc或scFv-拉链。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗体是具有两条不同的VH链的任何抗体，其中一条VH链是VH3。
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