KR20240025526A - 이중특이적 항체를 분리하는 방법 - Google Patents
이중특이적 항체를 분리하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240025526A KR20240025526A KR1020237043799A KR20237043799A KR20240025526A KR 20240025526 A KR20240025526 A KR 20240025526A KR 1020237043799 A KR1020237043799 A KR 1020237043799A KR 20237043799 A KR20237043799 A KR 20237043799A KR 20240025526 A KR20240025526 A KR 20240025526A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- antibody
- domain
- protein
- buffer
- separation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 46
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 9
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 11
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 11
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 11
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 9
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 9
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 5
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 125000005518 carboxamido group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229950006925 emicizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003791 organic solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920005594 polymer fiber Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 102220002405 rs121908660 Human genes 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편을 분리하는 방법에 관한 것이다. 방법은 a) 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편을 포함하는 공급물을 제공하는 단계; b) 공급물을 지지체에 커플링된 친화성 리간드를 갖는 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계; c) 임의로, 분리 수지를 세척액으로 세척하는 단계; d) 분리 수지에 용출 완충액을 적용하여, 친화성 리간드에 결합된 항체 또는 항체 단편을 용출하는 단계를 포함하고, 여기서 단계 d)에서 pH 구배가 용출 완충액에 적용되고, 상기 pH 구배는 약 6에서 약 2로이다.
Description
본 발명은 생명공학 분야 및 항체 및 항체 단편의 분리, 특히 이중특이적 항체 및 이중특이적 항체 단편의 분리를 위한 신규 방법에 관한 것이다.
면역글로불린은 전 세계적으로 제조 또는 개발에서 가장 보급된 바이오의약품을 나타낸다. 항체에 대한 높은 상업적 수요 및 그에 따른 치료 시장의 가치는 제약 회사가 관련 비용을 제어하면서 그의 각각의 모노클로날 항체(mAb) 제조 공정의 생산성을 최대화하는 것에 중점을 두게 하였다.
친화성 크로마토그래피는 대부분의 경우에 면역글로불린 분자, 예컨대 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 정제에서 주요 단계 중 하나로 사용된다. 특히 흥미로운 친화성 시약 부류는 면역글로불린 분자의 불변 부분에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질이며, 이러한 상호작용은 항체의 항원 결합 특이성과 독립적이다. 이러한 시약은 비제한적으로 혈청이나 혈장 제제 또는 세포 배양 유래 공급 원료와 같은 상이한 샘플로부터의 면역글로불린의 친화성 크로마토그래피 회수에 널리 사용될 수 있다. 이러한 단백질의 예는 상이한 종으로부터의 IgG 면역글로불린의 Fc 및 Fab 부분에 결합할 수 있는 도메인을 함유하는 포도상구균 단백질 A이다. 이들 도메인은 통상적으로 E-, D-, A-, B- 및 C-도메인으로 표시된다.
포도상구균 단백질 A(SpA) 기반 시약은 그의 높은 친화성 및 선택성으로 인해 생명공학 분야, 예를 들어 항체의 포획 및 정제뿐만 아니라 검출 또는 정량화를 위한 친화성 크로마토그래피에서 널리 용도가 밝혀졌다. 현재, SpA 기반 친화성 배지는 아마도 산업용 세포 배양 상등액을 포함한 상이한 샘플로부터 모노클로날 항체 및 그의 단편의 단리를 위해 가장 널리 사용되는 친화성 크로마토그래피 수지일 것이다. 따라서, 단백질 A-리간드를 포함하는 다양한 매트릭스는, 예를 들어 천연 단백질 A(예를 들어, 단백질 A 세파로스(Sepharose)™, 씨티바(Cytiva), 스웨덴 웁살라)의 형태로 시판되고, 또한 재조합 단백질 A(예를 들어, r단백질 A 세파로스™, 씨티바)로 구성된다. 보다 구체적으로, 상업용 재조합 단백질 A 생성물에서 수행되는 유전자 조작은 지지체에 대한 그의 배향된 부착을 용이하게 하고 리간드의 생산성을 증가시키는 것을 목표로 한다.
모노클로날 항체(mAb)는 단일특이적 항체이며, 이는 이들이 한 가지 유형의 항원에 결합한다는 것을 의미한다. 이들은 하이브리도마 세포에 의해 생산되고, 하나의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모든 mAb는 동일하다.
이중특이적 항체(bsAb)는 생명공학 내에서 도구로서 보다 광범위하게 사용되는 조작된 항체이다. 이들은 또한 다수의 임상 시험이 진행 중인 치료 잠재력을 보유하고 있다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는, 예를 들어 동일한 항원 상의 또는 상이한 항원 상의 2개의 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다. 따라서, 이중특이적 항체는 잠재적으로 2개의 상이한 항원에 결합할 수 있다. 정의된 특이성을 갖는 이중특이적 항체는 인공 분자이며, 그 자체로는 자연에서 발견되지 않는다. 광범위한 이중특이적 항체는 문헌 [U. Brinkmann, et al. (Brinkmann. U., Kontermann, R.E., MAbs, 2017 FEB-Mar; 9(2):182-212)]에 보다 상세히 더 기술되어 있다.
이중특이적 IgG 분자의 생성은, 경쇄 및 중쇄의 쌍형성과, 결과적으로 그 안의 가변 도메인(VL; VH)이 혼재할 수 있기 때문에 어렵다. 2개의 상이한 경쇄 및 2개의 상이한 중쇄의 쌍형성은 상당히 많은 수의 쌍형성오류를 초래할 수 있는데, 이는 통상적으로 단지 1개의 특이적 비대칭 조합이 요구되고, 달성된 다수의 조합은 비기능적 또는 원치 않는 분자, 예컨대 예를 들어 단일특이적 동종이량체일 것이기 때문이다. 따라서, 이중특이적 항체를 단일특이적 항체로부터 분리할 뿐만 아니라, 미스매칭된 이중특이적 항체를 정확하게 매칭된 이중특이적 항체로부터 분리하기 위한 개선된 도구 및 방법에 대한 필요성이 증가하고 있다. 따라서, 본 발명자의 목적은 이에 따라 이중특이적 항체의 분리를 하게 하는 개선된 방법을 발견하는 것이었다.
가변 중쇄 클래스 3(VH3)은 다른 중쇄 서브클래스에 비해 개선된 발현 및 안정성을 나타내기 때문에, 생명공학 내에서 추가로 개발된 가변 중쇄(VH)의 서브클래스이다.
상기 언급된 목적을 해결하기 위해, 본 발명자는 VH3-쇄의 존재에 기초하여, 단일특이적 항체 또는 미스매칭된 항체로부터 이중특이적 항체를 분리하는 방법을 개발하였다. 모노클로날 항체는 2개의 동일한 VH-쇄를 갖는다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 VH-쇄를 포함하도록 설계될 수 있다. 이 분리 방법은 VH3 상호작용을 유지하면서 임의의 시판되는 단백질 A 리간드를 사용하여 수행될 수 있다. 분리는 단백질 A 리간드 크로마토그래피 매트릭스에서 이중특이적 항체를 용출할 때 pH 구배를 사용함으로써 수행된다.
따라서, 상기 목적은, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편을 분리하는 방법에 의해 달성되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편을 포함하는 공급물을 제공하는 단계;
b) 공급물을 지지체에 커플링된 친화성 리간드를 갖는 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계;
c) 임의로, 분리 수지를 세척액으로 세척하는 단계;
d) 분리 수지에 용출 완충액을 적용하여, 친화성 리간드에 결합된 항체 또는 항체 단편을 용출하는 단계.
단계 d)에서, pH 구배가 용출 완충액에 적용된다. 상기 pH 구배는 약 6에서 약 2로이다.
pH 구배는 약 5.5, 또는 약 5.2, 또는 약 5.0에서 약 2.0, 또는 약 2.5로일 수 있다.
친화성 리간드는 단백질 A 리간드일 수 있다. 단백질 A 리간드는 Z 도메인, A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인 및 E 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 또는 변이된 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 A 리간드는 천연 또는 변이된 Z 도메인 또는 천연 또는 변이된 C 도메인을 포함할 수 있다.
지지체는 가교 아가로스 비드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 지지체는 10-1000nm, 예컨대 200-800nm, 200-400nm 또는 300-400nm의 단면 직경을 갖는 섬유를 포함할 수 있다.
상기 방법에 사용되는 공급물은 정화된 세포 배양 상등액일 수 있다.
항체 단편은 2개의 상이한 VH-쇄를 포함하며 그 중 1개의 VH-쇄는 VH3인 임의의 항체 단편일 수 있다. 항체 단편은 디아바디, scFv-Fc, scFv-CH, Fab-scFv-Fc, 또는 scFv-지퍼로부터 선택될 수 있다.
항체는 2개의 상이한 VH-쇄를 가지며 그 중 1개의 VH-쇄는 VH3인 임의의 항체일 수 있다.
도 1은 IgG와 같은 항체의 개략도이다.
도 2는 씨티바의 상업용 제품 맵셀렉트 슈어(MabSelect™ SuRe)를 사용한, 2개의 VH3-영역을 갖는 항체로부터 1개의 VH3-영역을 갖는 항체의 분리의 결여를 보여주는 크로마토그램이다.
도 3은 씨티바의 상업용 제품 맵셀렉트 프리즘(Prism)A를 사용한, 2개의 VH3-영역을 갖는 항체로부터 1개의 VH3-영역을 갖는 항체의 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
도 4는 JSR의 상업용 제품 암스피어(Amsphere)™ A3을 사용한, 2개의 VH3-영역을 갖는 항체로부터 1개의 VH3-영역을 갖는 항체의 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
도 5는 푸롤라이트(Purolite)의 상업용 제품 프라에스토 제티드(Praesto® Jetted) A50을 사용한, 2개의 VH3-영역을 갖는 항체로부터 1개의 VH3-영역을 갖는 항체의 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
도 2는 씨티바의 상업용 제품 맵셀렉트 슈어(MabSelect™ SuRe)를 사용한, 2개의 VH3-영역을 갖는 항체로부터 1개의 VH3-영역을 갖는 항체의 분리의 결여를 보여주는 크로마토그램이다.
도 3은 씨티바의 상업용 제품 맵셀렉트 프리즘(Prism)A를 사용한, 2개의 VH3-영역을 갖는 항체로부터 1개의 VH3-영역을 갖는 항체의 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
도 4는 JSR의 상업용 제품 암스피어(Amsphere)™ A3을 사용한, 2개의 VH3-영역을 갖는 항체로부터 1개의 VH3-영역을 갖는 항체의 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
도 5는 푸롤라이트(Purolite)의 상업용 제품 프라에스토 제티드(Praesto® Jetted) A50을 사용한, 2개의 VH3-영역을 갖는 항체로부터 1개의 VH3-영역을 갖는 항체의 분리를 보여주는 크로마토그램이다.
정의
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 기본 4-폴리펩티드 쇄 구조를 갖는 항원-결합 단백질을 지칭하며, 상기 쇄는 쇄간 이황화 결합에 의해 안정된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭된다) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. 용어는 또한 항체의 단편, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 단백질 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 접합체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "단편"은 무손상 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄보다 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 쇄의 일부 또는 부분을 지칭한다. 단편은 무손상 또는 완전한 항체 또는 항체 쇄의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 얻어질 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단으로 얻어질 수 있다. 예시적인 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fabe 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 결합하거나 또한 이들이 유래된 무손상 항체와 특이적 항원 결합에 대해 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 지칭한다.
용어 "Fc-결합 폴리펩티드", "Fc-결합제" 및 "Fc-결합 단백질"은 항체의 결정화가능한 부분인 Fc-영역에 결합할 수 있는 폴리펩티드, 분자 또는 단백질을 각각 의미하고, 이는 예를 들어 단백질 A 및 단백질 G, 또는 상기 결합 특성을 유지한 그의 임의의 단편 또는 융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "Fc 영역"은 IgG 항체의 C-말단 영역, 특히 상기 IgG 항체의 중쇄(들)의 C-말단 영역을 지칭한다.
용어 "Fv 단편"은 단편 가변 영역을 지칭하고, 2개의 가변 도메인, VH 및 VL만을 함유한다. VH 및 VL은 비공유 상호작용에 의해 Fv 단편으로 함께 유지된다. 용어 "Fab 단편"은 단편 항원-결합 영역을 지칭하고, 중쇄 및 경쇄 모두의 불변 도메인 및 가변 도메인 모두를 포함한다. 용어 "F(ab) 단편"은 1개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 지칭한다. 용어 "(Fab')2 단편"은 이황화 결합으로 연결된 2개의 항원-결합 영역을 갖는 2가 단편을 지칭한다. F(ab')2 단편의 환원은 2개의 1가 Fab' 단편을 생성하는데, 이는 다른 분자와의 접합에 유용한 유리 술프히드릴 기를 갖는다.
중쇄 상의 "가변" 도메인은 상호교환가능하게 "중쇄 가변 영역", "중쇄 가변 도메인", "VH" 영역, "VH" 도메인 또는 "VH" 쇄로 지칭될 수 있다.
용어 "도메인" 및 "영역"은 본 개시내용에서 상호교환가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "공급물"은, 또한 존재하는 다른 물질로부터 정제하고자 하는 적어도 1종의 표적 물질을 함유하는 액체를 지칭한다. 공급물은, 예를 들어, 수용액, 유기 용매 시스템, 또는 수성/유기 용매 혼합물 또는 용액일 수 있다. 공급원 액체는 종종 많은 생물학적 분자(예컨대 단백질, 항체, 호르몬 및 바이러스), 소분자(예컨대 염, 당, 지질 등) 및 심지어 미립자 물질을 함유하는 복합 혼합물 또는 용액이다. 생물학적 기원의 전형적인 공급원 액체는 수용액 또는 현탁액으로 시작할 수 있지만, 이는 또한 용매 침전, 추출 등과 같은 초기 분리 단계에서 사용되는 유기 용매를 함유할 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태의 정제에 용이한 중요한 생물학적 물질을 함유할 수 있는 공급물의 예는 생물반응기로부터의 배양 상등액, 균질화된 세포 현탁액, 혈장, 혈장 분획 및 우유를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "고체 지지체"는 정제 동안 표적 물질과 상호작용하거나 Fe 결합제가 접착할 수 있는 비수성 매트릭스를 지칭한다. 적합한 고체 상 물질은 유리, 실리카(예를 들어, 실리카 겔), 다당류(예를 들어, 다당류 매트릭스), 예컨대 아가로스 및 셀룰로스, 유기 중합체, 예컨대 폴리아크릴아미드, 메틸메타크릴레이트, 및 폴리스티렌디비닐벤젠 공중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 고체 상은 다공성 또는 비다공성 특성을 가질 수 있고, 압축성 또는 비압축성일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 고체 상은 중합체 매트릭스 또는 아가로스 입자 또는 비드이다. 바람직한 고체 지지체 재료는 펌핑 및 직교류 여과, 및 온도, pH 및 사용되는 액체의 다른 측면을 포함하여 정제 공정에 사용되는 조건에 대해 물리적 및 화학적으로 탄력적일 것이다.
"친화성 리간드"는 성분의 결합 부위와의 특이적 상호작용을 통해 공급원 액체의 성분에 선택적으로 또는 우선적으로 결합하는 모이어티를 지칭한다. 본 발명에서, 친화성 리간드는 전형적으로 고체 상, 예컨대 수지에 고정된다. 본 발명의 공정에 유용한 크로마토그래피 수지를 제공하기 위해 수지 지지체에 결합될 수 있는 친화성 리간드의 예는 단백질 Fc 영역에 선택적으로 결합하는 단백질 A, 단백질 G 및 그의 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 친화성 리간드를 고체 지지체 재료에 결합하는 방법은 정제 기술분야에 널리 공지되어 있다.
"완충액"은 용액 중 그의 존재에 의해 pH의 단위 변화를 유발하기 위해 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질이다. 완충 용액은 그의 짝산-짝염기 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 저항한다. 생물학적 시약과 함께 사용하기 위한 완충 용액은 일반적으로 용액의 pH가 생리학적 범위 내에 있도록 수소 이온의 일정한 농도를 유지할 수 있다. 용어 "생리학적 pH"는 포유동물 혈액의 pH(즉, 7.38 또는 약 7.4)를 지칭한다. 따라서, 생리학적 pH 범위는 약 7.2 내지 7.6이다. 전통적인 완충액 성분은 유기 및 무기 염, 산 및 염기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 생물학적 분자(예를 들어, 단백질 분자)의 정제에 사용하기 위한 예시적인 완충액은 쯔비터이온성 또는 "Good" 완충액을 포함하며, 예를 들어, 문헌 [Good et al. (1966) Biochemistry 5:467 및 Good and Izawa (1972) Methods Enzymol. 24:62]을 참조한다.
본 명세서에서 "평형 완충액"은 표적 단백질을 함유하는 공급원 액체의 로딩을 위한 결합 시약, 고체 상 또는 둘 다를 제조하는 데 사용되는 완충액이다. 평형 완충액은 등장성인 것이 바람직하고 흔히 약 6 내지 약 8 범위의 pH를 갖는다. "로딩 완충액"은 단백질 및 불순물을 함유하는 결합 영역을 함유하는 공급원 액체를 결합제가 고정된 고체 상 상에 로딩하는 데 사용되는 완충액이다. 종종, 평형 완충액 및 로딩 완충액은 동일하다. "용출 완충액"은 고정된 결합제로부터 결합 영역 함유 단백질을 용출하는 데 사용된다. 용출 완충액은 낮은 pH를 가지어, Fc 결합제와 관심 단백질 사이의 상호작용을 붕괴하는 것이 바람직하다. 낮은 pH 용출 완충액은 약 2 내지 약 5 범위를 갖는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 약 3 내지 약 4 범위의 pH를 갖는다. 이 범위 내에서 pH를 제어할 완충액의 예는 글리신, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트 및 암모늄 완충액뿐 아니라 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 이러한 완충액은 시트레이트 및 아세테이트 완충액, 가장 바람직하게는 시트르산나트륨 또는 아세트산나트륨 완충액이다. 관심 단백질을 용출하기 위한 높은 pH 완충액(예를 들어, 9 이상의 pH를 갖는 것) 또는 MgCl2(2mM)와 같은 화합물 또는 조성물을 포함하는 완충액을 포함하는 다른 용출 완충액이 고려된다.
본 명세서에 사용된 "세척액" 또는 "세척 완충액"은 모두 본 명세서에서 표적 물질이 결합된 크로마토그래피 수지로부터 불순물을 운반해 가는 데 사용되는 액체를 지칭한다. 예를 들어, 연속 세척액이 크로마토그래피 수지와 비특이적으로 결합된 여러 유형의 불순물을 해리하고 제거하도록 설계된, pH, 전도성, 용매 농도 등과 같은 여러 특성을 가지므로, 1종 초과의 세척액이 순차적으로 사용될 수 있다.
"용출액" 또는 "용출 완충액"은 본 명세서에서 1종 이상의 세척액으로 세척된 후 크로마토그래피 수지로부터 표적 물질을 해리하는 데 사용되는 액체를 지칭한다. 용출액은 표적 물질을 비가역적으로 변성시키지 않고 이를 해리하기 위해 작용한다. 전형적인 용출액은 크로마토그래피 기술분야에 널리 공지되어 있고, 보다 높은 농도의 염, 유리 친화성 리간드 또는 유사체, 또는 크로마토그래피 수지로부터 표적 물질의 해리를 촉진하는 다른 물질을 가질 수 있다. "용출 조건"은 크로마토그래피 수지로부터 표적 물질을 해리하는 표적 물질-결합 크로마토그래피 수지에 부과되는 공정 조건, 예컨대 이러한 해리를 일으키기 위해 표적 물질-결합 크로마토그래피 수지를 용출액 또는 용출 완충액과 접촉시키는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하다", "포함하는", "함유하는", "갖는" 등은 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 가질 수 있고, "비롯하다", "비롯한" 등을 의미할 수 있다; "본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다"는 마찬가지로 미국 특허법에서 부여된 의미를 갖고, 용어는 제약을 두지 않으며, 기재된 것의 기본 또는 신규 특징이 기재된 것 초과의 존재에 의해 변화되지 않는 한, 기재된 것 초과의 존재를 허용하지만, 선행 기술 실시양태는 제외한다.
상세한 설명
인간에 의해 생성되는 가장 흔한 항체는 면역글로불린 G(IgG)이다. IgG는 4개의 상이한 폴리펩티드 쇄, 2개의 동일한 중쇄(HC) 및 2개의 동일한 경쇄(LC)로 이루어진다. 도 1은 IgG를 개략적으로 도시하고, 하기 상세한 설명에서 언급된다. HC는 둘 다 각각 VH(2)로 표시된 1개의 가변 도메인 및 CH1(3), CH2(4) 및 CH3(5)로 표시된 3개의 불변 도메인으로 이루어진다. 중쇄의 C-말단은 CH3 도메인(5)의 말단에 있다. 중쇄는 2개의 쇄 사이의 공유 결합에 관여하는 힌지 영역에서 함께 유지된다. 2개의 경쇄는 이황화 결합으로 중쇄에 공유 부착된다. 이들 경쇄는 VL(6)로 표시된 1개의 가변 도메인 및 CL(7)로 표시된 1개의 불변 도메인으로 이루어진다. 경쇄는 VH 및 CH1과 함께 단일 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 단편(Fab)을 형성한다. 모노클로날 항체는 대개 2개의 동일한 HC 및 LC를 갖는다. 특히, 모노클로날 항체는 단일특이적이기 때문에 대개 2개의 동일한 VH 도메인(2)를 갖는다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 가변 영역(Fv)(8, 9)을 갖고, 따라서 2개의 상이한 VH 도메인(2)을 포함할 수 있으며, 이는 도 1에서 2개의 VH 도메인(2)에 대해 상이한 패턴으로 나타난다.
2개의 중쇄가 공유 결합된 항체의 부분은 결정화가능한 단편(Fc)이라고 불리고, 따라서 중쇄 둘 다의 CH3(5) 및 CH2(4) 도메인으로 이루어진다. Fc는 다양한 Fc 수용체(FcR)에 결합하여 면역계 내의 이펙터 기능에 참여하거나 이를 매개할 수 있다. 모든 항체가 Fc 영역을 갖는 것은 아니며, 예를 들어 IgM에는 Fc 영역이 결여되어 있다.
단백질 A 리간드는 면역글로불린의 Fc 영역에 선택적으로 결합하고, 따라서 고도로 효율적인 포획 단계를 허용한다. 천연 단백질 A는 또한 면역글로불린의 VH3 영역에 결합한다는 점에서 여전히 유용할 수 있다. 그러나, 천연 단백질 A는 바이오프로세싱에 사용되는 알칼리성 세정 조건 하에서 안정하지 않고, 일부 알칼리-안정된 단백질 A 변이체는 VH3 상호작용을 억제하는 돌연변이를 갖는데, 예를 들어, US20060194950를 참조한다. 이 문헌은 단백질 A Fc-결합 B 도메인에서 G29A 돌연변이에 의한 VH3 상호작용의 억제를 논의하며, 이는 상업용 제품 맵셀렉트™ 슈어에 사용되는 Z 도메인을 생성한다.
본 발명자는 VH3 상호작용이 유지되는 임의의 시판되는 단백질 A 리간드를 사용하여, VH3-쇄에 기초하여 단일특이적 항체 또는 미스매칭된 항체로부터 이중특이적 항체를 분리할 수 있는 방법을 개발하였다. 대안적인 언어로, 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 친화성 리간드는 VH3 결합 단백질 A 리간드이다. 분리는 상기 VH3 결합 단백질 A 리간드를 포함하는 단백질 A 리간드 크로마토그래피 수지로부터 항체를 용출할 때 pH 구배를 사용함으로써 수행된다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편을 분리하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편을 포함하는 공급물을 제공하는 단계;
b) 공급물을 고체 지지체에 커플링된 친화성 리간드를 갖는 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계;
c) 임의로, 분리 수지를 세척액으로 세척하는 단계;
d) 분리 수지에 용출 완충액을 적용하여, 친화성 리간드에 결합된 항체 또는 항체 단편을 용출하는 단계.
단계 d)에서, pH 구배가 용출 완충액에 적용되고, 상기 pH 구배는 약 6에서 약 2로이다. 실시예 2-4 및 도 3-5로부터 알 수 있듯이, 이 방법은 1개의 VH3-쇄를 포함하는 항체와 2개의 VH3-쇄를 포함하는 항체 사이의 분리를 허용한다.
일 실시양태에 따르면, pH 구배는 약 5.5에서 약 2.0, 또는 약 2.5로이다. 또 다른 실시양태에서, pH 구배는 약 5.2에서 약 2.0, 또는 약 2.5로이다. 또 다른 실시양태에서, pH 구배는 약 5.0에서 약 2.0, 또는 약 2.5로이다.
방법의 pH 범위 내에서, 친화성 리간드에 대한 항체의 임의의 Fc-결합이 먼저 해제될 것인데, 이는 Fc-결합이 보다 높은 pH에서 파괴될 것이기 때문이다. Fc-결합이 pH를 낮춤으로써 중화되었을 시에, VH-상호작용은 여전히 활성이고, 분리 매트릭스 내에 mAb를 보유할 것이다. Fc-결합의 친화성은 여전히 VH 결합보다 더 강할 수 있지만, 본 방법에서 선택된 조건에서, 특히 pH와 관련하여, VH-상호작용은 보다 낮은 pH에서 유지될 것이다. 결과적으로, 적어도 1개의 VH3 영역을 갖지 않는 임의의 항체는 분리를 위한 pH 구배 범위에 도달하기 전에 용출할 것이다. 따라서, 분리 방법은 또한 하나의 HC 또는 둘 다의 HC들에서 Fc 결합 녹아웃을 갖는 항체에 대해 사용될 수 있다.
실시예에서 보이는 바와 같이, 방법은 친화성 리간드에 여전히 존재하는 Fc-결합 및 기존의 VH 상호작용을 갖는 리간드(실시예 2-4)에 잘 작동한다. 억제된 VH3 상호작용을 갖는 리간드의 경우, 분리가 관찰되지 않았다(참조 실시예 1).
본 발명의 방법의 한 가지 이점은 이미 시판되는 친화성 리간드가 사용될 수 있다는 것이다. 본 발명자는 통상적으로 무시되는 이미 존재하는 VH3-결합을 이용하였고, 이러한 VH3 결합에 기초한 분리 방법을 개발하였다.
본 방법으로 분리하기에 적합한 항체는 이들이 1 또는 2개의 결합 VH3 쇄를 갖는다는 점에 있어서 이중특이적인 항체이다. 따라서, 이는 2개의 VH3 쇄를 갖는 항체로부터 단지 1개의 VH3 쇄를 갖는 항체의 분리하는 것과 관련이 있을 수 있다. VH3 쇄가 결여된 항체 또한 상기 논의된 바와 같이 2가지 양태의 용출 단계에서 분리될 것이기 때문에 분리될 수 있다.
본 방법에 따른 분리는 지정된 용출 pH 구배에서 1개의 VH3-쇄를 갖는 항체가 2개의 VH3-쇄를 갖는 항체 이전에 용출할 것을 야기한다. VH3-쇄를 갖지 않는 항체는 1개의 VH3-쇄를 갖는 항체 이전에 용출할 것인데, 이는 이러한 항체가 Fc 부분을 통해 친화성 리간드에 결합하고, 결과적으로 Fc-결합이 파괴될 때 용출할 것으로 추정되기 때문이다.
본 발명의 방법에 사용되는 친화성 리간드는 단백질 A 리간드인 것이 바람직하다. 단백질 A 리간드는 Z 도메인, A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인 및 E 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 또는 변이된 도메인을 포함할 수 있다. 일 바람직한 실시양태에서, 리간드는 천연 또는 변이된 Z 도메인을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 리간드는 천연 또는 변이된 C 도메인을 포함한다. 본 방법에 사용될 수 있는 친화성 리간드를 갖는 분리 매트릭스는 맵셀렉트™(씨티바), 맵셀렉트™ 엑스트라(Xtra)(씨티바), 프로셉(ProSep)™ A(머크 밀리포어(Merck Millipore)), 프로셉™ 울트라 플러스(Ultra Plus)(머크 밀리포어), 압솔루트(AbSolute)™, 캡티바(CaptivA)™(레플리겐(Repligen)), 프리맙(PriMab)™(레플리겐) 및 단백질 A 다이아몬드(베스트크롬(Bestchrom)), 맵셀렉트™ 프리즘A(씨티바), 에슈무노(Eshmuno)™ A(머크 밀리포어), 토요펄(Toyopearl)™ AF-r단백질 A(토소(Tosoh)), 암스피어(Amsphere)™ A3(JSR), 및 프라에스토® 제티드 A50(푸롤라이트)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
분리 매트릭스의 고체 지지체는 다공성 지지체일 수 있다. 분리 매트릭스의 다공성 지지체는 임의의 적합한 널리 공지된 종류일 수 있다. 종래의 친화성 분리 매트릭스는 종종 유기적 성질을 갖고, 사용된 수성 매질에 친수성 표면을 노출시키는 중합체, 즉 그의 외부 및 존재하는 경우 또한 내부 표면 상의 노출된 히드록시(-OH), 카르복시(COOH), 카르복스아미도(-CONH2, 가능하다면 N-치환된 형태), 아미노(-NH2, 가능하다면 치환된 형태), 올리고- 또는 폴리에틸렌옥시 기를 기초로 한다.
특정 실시양태에서, 지지체는 폴리히드록시 중합체, 예컨대 다당류를 포함한다. 다당류의 예는 예를 들어 덱스트란, 전분, 셀룰로스, 풀루란, 한천, 아가로스 등을 포함한다. 다당류는 낮은 정도의 비특이적 상호작용으로 본질적으로 친수성이고, 이들은 높은 함량의 반응성(활성화가능한) 히드록실 기를 제공하고, 이들은 일반적으로 바이오프로세싱에 사용되는 알칼리성 세정 용액에 대해 안정하다.
일부 실시양태에서, 지지체는 한천 또는 아가로스를 포함한다. 지지체는 시판되는 제품, 예컨대 세파로스™ FF(씨티바)라는 명칭으로 판매되는 가교 아가로스 비드일 수 있다. 대규모 분리에 특히 유리한 일 실시양태에서, 지지체는 US6602990 또는 US7396467에 기술된 방법을 사용하여 그의 강성을 증가시키도록 구성되었고, 따라서 매트릭스를 높은 유속에 보다 적합하게 한다.
특정 실시양태에서, 지지체, 예컨대 중합체, 다당류 또는 아가로스 지지체는 가교된다. 가교는 지지체의 강성에 유리하고 화학적 안정성을 개선한다. 바람직한 실시양태에서, 지지체는 가교 아가로스 비드를 포함한다.
분리 매트릭스의 고체 지지체는 대류 기반 크로마토그래피 매트릭스일 수 있다. 상기 대류 기반 크로마토그래피 매트릭스는 섬유상 기재일 수 있다. 상기 섬유상 기재는 전기방사 중합체 섬유 또는 셀룰로스 섬유, 임의로 부직 섬유를 기초로 할 수 있다. 따라서, 섬유상 기재는 섬유상 부직 중합체 매트릭스일 수 있다. 섬유는 가교되는 것이 바람직하다. 상기 섬유 기재에 포함된 섬유는 10-1000nm, 예컨대 200-800nm, 200-400nm 또는 300-400nm의 단면 직경을 갖는다. 이러한 섬유상 기재는 씨티바의 하이트랩 피브로(HiTrap Fibro) 유닛에서 찾아볼 수 있다.
분리 매트릭스에 적용되는 공급물은 세포 배양 상등액일 수 있다. 세포 배양 상등액은 세포를 함유할 수 있거나 세포가 고갈될 수 있고/거나 정화될 수 있다.
공급물에 포함된 항체는 2개의 상이한 VH-쇄를 가지며 그 중 1개의 VH-쇄는 VH3인 임의의 항체이다. 노브-인투-홀(Knob-into-hole((Kih))은 이중특이적인 항체를 생성하는 것에 대해 잘 검증된 하나의 기술이다. 본 방법에 적합한 이중특이적 항체는 소위 공통 경쇄(Common Light Chain) Ab일 수 있다. 공통 경쇄 Ab는 2개의 동일한 경쇄를 갖고, 따라서 이중특이성은 상이한 VH 쇄에만 관련이 있다. 적합한 이중특이적 항체는 또한 상이한 VH 쇄에 추가로 상이한 경쇄를 가질 수 있다. 최근에는 또한 4개의 VH 쇄를 포함하는 테트라-VH IgG가 설계되었다. 이들 4가 IgG는 또한 본 방법으로 분리될 수 있다. 듀오바디는 2개의 상이한 VH-쇄를 포함하는 Fc-변형 IgG의 또 다른 예이다.
2개의 VH 쇄를 포함하며 그 중 하나가 VH3 쇄인 항체 단편이 또한 본 방법에 의해 분리될 수 있다. 결과적으로, 공급물에 포함된 항체 단편은 2개의 상이한 VH-쇄를 포함하며 그 중 1개의 VH-쇄는 VH3인 임의의 항체 단편일 수 있다. 상기 항체 단편은 디아바디, scFv-Fc, scFv-CH, Fab-scFv-Fc, 또는 scFv-지퍼로부터 선택될 수 있다. 단쇄 가변 단편(scFv)은 약 10-25개의 아미노산의 짧은 링커 펩티드로 연결된, 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 이러한 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 본래의 면역글로불린의 특이성을 보유한다. 디아바디는 2개의 가변 영역이 함께 폴딩하기에 너무 짧은(약 5개의 아미노산) 링커 펩티드로 연결된 2개의 scFv로, scFv가 이량체화되도록 한다. 디아바디는 상응하는 scFv보다 최대 40배 더 낮은 해리 상수를 갖는 것으로 보였으며, 이는 이들이 그의 표적에 대해 훨씬 더 높은 친화성을 갖는다는 것을 의미한다. 2개의 scFv는 또한 보다 긴 링커와 연결되어 scFv-이량체를 형성할 수 있다. 이들은 예를 들어 scFv-Fc 또는 scFv-CH, 또는 scFv-지퍼일 수 있다.
상기 이중특이적 항체 단편 및 이중특이적 항체의 목록은 단지 예를 든 것이며 완전한 것이 아니다. 통상의 기술자는 적어도 2개의 VH-쇄를 포함하며, 여기서 1개의 VH-쇄는 VH3-쇄인 임의의 항체 단편이 본 발명에 따른 방법에 적용된다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법은 하기 비제한적 실시예에 예시된다. 이들 실시예로부터, 청구항에 따른 방법이 광범위한 친화성 리간드 및 분리 매트릭스에 걸쳐 단일특이적 항체로부터 이중특이적 항체를 분리하게 한다는 것이 명백하다. 따라서, 본 발명의 방법의 개념적 원리는 다양한 친화성 리간드 및 분리 매트릭스에 적용되는 것으로 증명된다.
실시예
2개의 mAb를 실험에 사용하였다. 헴리브라(Hemlibra)®(항체 에미시주맙, 로슈(Roche))는 HC 이종이량체이며, 여기서 1개의 HC는 VH3-영역을 갖고 1개의 HC는 VH1-영역을 갖는다. 헤르셉틴(Herceptin)®(항체 트라스투주맙, 로슈)은 각각의 HC 상에 하나씩 2개의 VH3 도메인을 포함하는 동종이량체이다. 하기 실시예에서, 각각의 실시예에 지정된 분리 매트릭스를 함유한 크로마토그래피 컬럼에 적용하기 전에 2종의 mAb를 혼합하였다.
실시예 1 (참조)
이 실험은 씨티바의 맵셀렉트™ 슈어 분리 매트릭스를 사용하여, 상기 언급된 항체 혼합물로 수행하였다.
실행 조건:
샘플: 헤르셉틴® 및 헴리브라®, PBS 중 각각 농도 1.2 및 0.6mg/mL
컬럼: 트리콘(Tricorn) 5/100, Bh=10cm, Vt=2mL
수지: 맵셀렉트™ 슈어
완충액 A1: PBS
완충액 A2: 50mM 시트르산나트륨 pH=6.5
완충액 A3: 25mM NaOH
완충액 B1: 50mM 시트르산나트륨 pH=2.5
시스템: 악타(KTA)™퓨어(pure)
유속: 0.5mL/분
평형: 2CV 완충액 A1
샘플 적용: 200μL
세척 1: 2CV 완충액 A1
세척 2: 3CV 완충액 A2
용출: 10CV 중 30-100% 완충액 B1
결과는 도 2에 제시된다. 두 mAb 사이에 분리가 관찰되지 않는다. 이는 맵셀렉트™ 슈어가 상기 논의한 바와 같이 억제된 VH3 상호작용을 갖고, 리간드 상에서 Fc 결합만이 이용가능하다는 사실에 기인한다. 결과적으로, 수지에 대한 결합이 항체의 Fc 영역을 기초로 하기 때문에, VH3 쇄의 수가 상이한 단일특이적 항체와 이중특이적 항체 사이의 분리가 얻어지지 않는다.
실시예 2
이 실험은 프리즘A 분리 매트릭스를 사용하여 상기와 동일한 항체 혼합물로 수행하였다.
실행 조건:
샘플: 헤르셉틴® 및 헴리브라®, PBS 중 각각 농도 1.2 및 0.6mg/mL
컬럼: 트리콘 5/100, Bh=10cm, Vt=2mL
수지: 맵셀렉트™ 프리즘A
완충액 A1: PBS
완충액 A2: 50mM 시트르산나트륨 pH=6.5
완충액 A3: 25mM NaOH
완충액 B1: 50mM 시트르산나트륨 pH=2.5
시스템: 악타™퓨어
유속: 0.5mL/분
평형: 2CV 완충액 A1
샘플 적용: 200μL
세척 1: 2CV 완충액 A1
세척 2: 3CV 완충액 A2
용출: 10CV 중 30-100% 완충액 B1
결과는 도 3에 제시된다. 5.2에서 2.5로의 pH 구배에서, 2개의 mAb 사이의 분리가 관찰된다. 26 ml 주위의 제1 용출 피크는 헴리브라®에 상응하고, 27 ml 주위의 제2 용출 피크는 헤르셉틴®에 상응한다.
따라서, VH3 상호작용은 VH1 및 VH3 함유 중쇄의 분리에 관여하는 것으로 보인다.
실시예 3
이 실험은 JSR의 암스피어™ A3 분리 매트릭스를 사용하여, 상기와 동일한 항체 혼합물로 수행하였다.
실행 조건:
샘플: 헤르셉틴® 및 헴리브라®, PBS 중 각각 농도 1.2 및 0.6mg/mL
컬럼: 트리콘 5/100, Bh=10cm, Vt=2mL
수지: JSR 암스피어™ A3
완충액 A1: PBS
완충액 A2: 25mM 시트르산나트륨 pH=5.5
완충액 A3: 100mM NaOH
완충액 B1: 44mM 시트르산나트륨 pH=2.5
시스템: 악타™퓨어
유속: 0.5mL/분
평형: 2CV 완충액 A1
샘플 적용: 100μL
세척 1: 2CV 완충액 A1
세척 2: 3CV 완충액 A2
용출: 10CV 중 0-100% 완충액 B1
결과는 도 4에 제시된다. 5.2에서 2.5로의 pH 구배에서, 2개의 mAb 사이의 분리가 관찰된다. 37 ml 주위의 제1 용출 피크는 헴리브라®에 상응하고, 40 ml 주위의 제2 용출 피크는 헤르셉틴에 상응한다.
다시 말해, VH3 상호작용이 VH1 및 VH3 함유 중쇄의 분리에 관여하는 것으로 보인다.
실시예 4
이 실험은 푸롤라이트의 프라에스토® 제티드 A50 분리 매트릭스를 사용하여, 상기와 동일한 항체 혼합물로 수행하였다.
실행 조건:
샘플: 헤르셉틴® 및 헴리브라®, PBS 중 각각 농도 1.2 및 0.6mg/mL
컬럼: 트리콘 5/100, Bh=10cm, Vt=2mL
수지: 푸롤라이트 프라에스토® 제티드 A50
완충액 A1: PBS
완충액 A2: 25mM 시트르산나트륨 pH=5.5
완충액 A3: 100mM NaOH
완충액 B1: 44mM 시트르산나트륨 pH=2.5
시스템: 악타™퓨어
유속: 0.5mL/분
평형: 2CV 완충액 A1
샘플 적용: 100μL
세척 1: 2CV 완충액 A1
세척 2: 3CV 완충액 A2
용출: 10CV 중 0-100% 완충액 B1
결과는 도 5에 제시된다. 5.2에서 2.5로의 pH 구배에서, 2개의 mAb 사이의 분리가 관찰된다. 37 ml 주위의 제1 용출 피크는 헴리브라®에 상응하고, 40 ml 주위의 제2 용출 피크는 헤르셉틴®에 상응한다.
다시 말해, VH3 상호작용이 VH1 및 VH3 함유 중쇄의 분리에 관여하는 것으로 보인다.
이러한 서면으로 된 상세한 설명은 최상의 모드를 포함하여 본 발명을 개시하고, 또한 본 기술분야의 통상의 기술자가 임의의 장치 또는 시스템을 제조 및 사용하고 임의의 통합된 방법을 수행하는 것을 포함하여 본 발명을 실시하게 하기 위해 실시예를 사용한다. 본 발명의 특허를 받을 수 있는 범위는 청구항에 의해 정의되고, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 떠오르는 다른 실시예를 포함할 수 있다. 이러한 다른 실시예는, 이들이 청구항의 문자 그대로의 언어와 상이하지 않은 구조적 요소를 갖는 경우, 또는 이들이 청구항의 문자 그대로의 언어와 대단찮은 차이를 갖는 등가 구조적 요소를 포함하는 경우, 청구항의 범위 내에 있는 것으로 해석된다. 본문에 언급된 임의의 특허 또는 특허 출원은 개별적으로 포함된 것처럼 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.
Claims (11)
- 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편을 분리하는 방법으로서:
a) 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편을 포함하는 공급물을 제공하는 단계;
b) 공급물을 지지체에 커플링된 친화성 리간드를 갖는 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계;
c) 임의로, 분리 수지를 세척액으로 세척하는 단계;
d) 분리 수지에 용출 완충액을 적용하여, 친화성 리간드에 결합된 항체 또는 항체 단편을 용출하는 단계
를 포함하고,
여기서 단계 d)에서 pH 구배가 용출 완충액에 적용되고, 상기 pH 구배는 약 6에서 약 2로인,
방법. - 제1항에 있어서, pH 구배가 약 5.5, 또는 약 5.2, 또는 약 5.0에서 약 2.0, 또는 약 2.5로인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 친화성 리간드가 단백질 A 리간드인, 방법.
- 제3항에 있어서, 단백질 A 리간드가 Z 도메인, A 도메인, B 도메인, C 도메인, D 도메인 및 E 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 또는 변이된 도메인을 포함하는, 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 단백질 A 리간드가 천연 또는 변이된 Z 도메인 또는 천연 또는 변이된 C 도메인을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 가교 아가로스 비드를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 10-1000nm, 예컨대 200-800nm, 200-400nm 또는 300-400nm의 단면 직경을 갖는 섬유를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급물이 정화된 세포 배양 상등액인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 2개의 상이한 VH-쇄를 포함하며 그 중 1개의 VH-쇄는 VH3인 임의의 항체 단편인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 항체 단편이 디아바디, scFv-Fc, scFv-CH, Fab-scFv-Fc, 또는 scFv-지퍼로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 2개의 상이한 VH-쇄를 가지며 그 중 1개의 VH-쇄는 VH3인 임의의 항체인, 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB2109246.5 | 2021-06-28 | ||
| GBGB2109246.5A GB202109246D0 (en) | 2021-06-28 | 2021-06-28 | A method of separating bispecific antibodies |
| PCT/EP2022/067013 WO2023274809A1 (en) | 2021-06-28 | 2022-06-22 | A method of separating bispecific antibodies |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240025526A true KR20240025526A (ko) | 2024-02-27 |
Family
ID=77179465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237043799A KR20240025526A (ko) | 2021-06-28 | 2022-06-22 | 이중특이적 항체를 분리하는 방법 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240228530A1 (ko) |
| EP (1) | EP4363432A1 (ko) |
| JP (1) | JP2024522902A (ko) |
| KR (1) | KR20240025526A (ko) |
| CN (1) | CN117580850A (ko) |
| GB (1) | GB202109246D0 (ko) |
| WO (1) | WO2023274809A1 (ko) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9601368D0 (sv) | 1996-04-11 | 1996-04-11 | Pharmacia Biotech Ab | Process for the production of a porous cross-linked polysaccharide gel |
| SE0200943D0 (sv) | 2002-03-25 | 2002-03-25 | Amersham Biosciences Ab | Mutant protein |
| SE0402322D0 (sv) | 2004-09-22 | 2004-09-22 | Amersham Biosciences Ab | Method of preparing a chromatography matrix |
| AR101262A1 (es) * | 2014-07-26 | 2016-12-07 | Regeneron Pharma | Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos |
| GB201506868D0 (en) * | 2015-04-22 | 2015-06-03 | Ucb Biopharma Sprl | Method for protein purification |
| DK3962923T5 (da) * | 2019-04-29 | 2024-08-05 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Fremgangsmåde til separation af antistoffer eller antistoffragmenter uden en fc-region som kan binde til protein a |
-
2021
- 2021-06-28 GB GBGB2109246.5A patent/GB202109246D0/en not_active Ceased
-
2022
- 2022-06-22 US US18/562,092 patent/US20240228530A1/en active Pending
- 2022-06-22 EP EP22736230.8A patent/EP4363432A1/en active Pending
- 2022-06-22 KR KR1020237043799A patent/KR20240025526A/ko unknown
- 2022-06-22 CN CN202280045969.3A patent/CN117580850A/zh active Pending
- 2022-06-22 JP JP2023579839A patent/JP2024522902A/ja active Pending
- 2022-06-22 WO PCT/EP2022/067013 patent/WO2023274809A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117580850A (zh) | 2024-02-20 |
| US20240228530A1 (en) | 2024-07-11 |
| WO2023274809A1 (en) | 2023-01-05 |
| JP2024522902A (ja) | 2024-06-21 |
| EP4363432A1 (en) | 2024-05-08 |
| GB202109246D0 (en) | 2021-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2017221794B2 (en) | Methods of Purifying Antibodies | |
| KR101307614B1 (ko) | Ｆｃ 영역 포함 단백질의 정제 방법 | |
| EP2598514B1 (en) | Protein purification | |
| KR101838039B1 (ko) | 단백질 a 기반 크로마토그래피를 이용한 단백질 순도의 증가 방법 | |
| JP7084301B2 (ja) | 低伝導率洗浄緩衝液を用いたアフィニティークロマトグラフィー精製方法 | |
| KR20160044023A (ko) | 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항체 생산 부산물의 분리 | |
| KR20240025526A (ko) | 이중특이적 항체를 분리하는 방법 | |
| JP2018525408A (ja) | アフィニティークロマトグラフィーにおける宿主細胞タンパク質の低減方法 | |
| US20210017223A1 (en) | Separation Method | |
| US20230049176A1 (en) | Methods to decrease impurities from recombinant protein manufacturing processes | |
| JP7449041B2 (ja) | 抗体精製 | |
| WO2023247468A2 (en) | Kappa light chain-binding convection matrix | |
| JP2023548826A (ja) | 加水分解酵素活性速度が低下した医薬組成物を得るための精製プラットフォーム | |
| Kumar et al. | Industrial purification strategies for monoclonal antibodies | |
| Hermans et al. | Introducing CaptureSelect Affinity Ligands for Antibody Detection and Characterization |