JP7449041B2 - 抗体精製 - Google Patents
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特に定義しない限り、本明細書で使用される当該分野の全ての用語、表記法および他の科学用語または用語法は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することを意図する。一部の例では、一般に理解される意味を有する用語は、明確さのためおよび/またはすぐに参照できるように本明細書で定義され、本明細書にかかる定義を含めることは、当該分野で一般的に理解される定義にまつわる実質的な差異を表すとかならずしも解釈すべきではない。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、単鎖(ScFv)およびドメイン抗体(例えば、サメおよびラクダ科動物(camelid)抗体を含む)、ディアボディ(diabody)、および抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置もまた包含する。用語「抗体」は、単一特異性、二重特異性および多特異性抗体を含む。抗体は、任意のクラス、例えば、IgG、IgAまたはIgM(またはそれらのサブクラス)の抗体を含み、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割当てられ得る。5つの主要なクラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2へとさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。
本明細書で提供される方法は、1つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。本明細書で提供される方法では、目的の抗体および1つまたは複数の不純物分子を含む抗体調製物(本明細書で「出発サンプル」とも呼ばれる)は、目的の抗体および任意選択により1つまたは複数の不純物分子に結合するヒドロキシアパタイト(HA)樹脂上にロードされる。次いで、このHA樹脂は、任意のゆるく結合した不純物を除去するために洗浄される(一部の実施形態では、全ての不純物分子がHA樹脂を通って流れ得、HA樹脂には結合しない)。次に、目的の抗体は、漸増するリン酸イオン濃度の勾配を介して、樹脂上に典型的には導入されるリン酸溶出緩衝液を使用してHA樹脂から溶出される。HA樹脂からの目的の抗体の溶出は、目的の抗体を含み、出発サンプル中に目的の抗体と共に存在した不純物をわずかに含む(または全く含まない)精製されたサンプルを生じる。HA樹脂からの目的の抗体の溶出の間に、HA樹脂に結合した任意の不純物分子もまた、漸増するリン酸イオン濃度の勾配の間のいくつかのポイントにおいて溶出し得る。しかし、目的の抗体が溶出プロセスの間に不純物分子から効率的に分離され得るように、不純物分子は、目的の抗体の溶出の条件とは十分に異なる条件下でHA樹脂から溶出する。上の方法ステップならびに関連する材料およびステップについてのさらなる詳細は、以下に提供される。
種々のヒドロキシアパタイト樹脂が市販されており、任意の入手可能な形態の材料が、本明細書で提供される方法で使用され得る。ヒドロキシアパタイトは、結晶形態にあってもよい。ヒドロキシアパタイトは、粒子を形成するように集塊化され、安定な多孔性セラミック塊へと高温で焼結してもよい。
一部の実施形態では、目的の抗体を含むサンプルをHAカラム上にロードするステップの前に、本明細書で提供される方法は、1つまたは複数の平衡化緩衝液(複数可)を用いてカラムを事前平衡化するステップを含み得る。これらの平衡化緩衝液は、例えば、方法の開始時にHA樹脂がきれいであることを確実にするため(即ち、樹脂が、樹脂に既に結合した不純物を有さないことを確実にするため)、および/またはHA樹脂を取り囲む溶液が、樹脂上にロードされるサンプルと適合性であることを確実にするために、カラム上に導入され得る。
HAカラムがタンパク質ロードに備えた状態になると、目的の抗体および不純物を含むサンプルがHAカラム上にロードされる。サンプルがその中でHAカラム上にロードされる緩衝液は、本明細書で「ロード緩衝液」と呼ばれ得る。一部の実施形態では、目的の抗体を含むサンプルが本明細書で提供される方法での使用のために最初に取得される場合、このサンプルは既に、サンプルをHAカラム上にロードするのに適切なロード緩衝液中にある。しかし、他の実施形態では、このサンプルがカラム上へのロードのために適切な緩衝液中にあるようにサンプルの緩衝液条件を改変するために、サンプルをHAカラム上にロードする前に、サンプルは処理(例えば、希釈、濃縮または緩衝液交換)され得る。例えば、本明細書で提供される方法を用いる場合、ロード緩衝液は、HA樹脂への目的の抗体の結合を妨害する高い濃度のリン酸イオンを有することができない。従って、目的の抗体を含む初期サンプルが高い濃度のリン酸イオンを含む場合、そのサンプルは、サンプル中のリン酸イオンの濃度が、HA樹脂への目的の抗体の結合を可能にする適切に低い濃度まで低減されるまで、例えば、希釈または緩衝液交換される必要がある。
目的の抗体および不純物を含むサンプルをHAカラム上にロードするステップの後であるが、目的の抗体の溶出の前に、本明細書で提供される方法は、例えば、非特異的に固定化された不純物を除去するため、または溶出ステップのためにカラムを他の方法で準備もしくは平衡化するために、ロードされたカラムを1つまたは複数の洗浄緩衝液(複数可)で洗浄するさらなるステップを含んでいてもよい。任意の洗浄緩衝液の特性は、当業者によって決定され得る。一実施形態では、この洗浄緩衝液は、例えばリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液であり、緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、約5~50mMである。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約10~40mMのリン酸イオンを含み得;他の実施形態では、約10、20、30、40または50mMのリン酸イオンを含んでいてもよい。洗浄緩衝液は、約1~50mMの濃度でHEPESをさらに含み得る。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約2~30mMのHEPESを含み得;他の実施形態では、約5、10、15、20または25mMのHEPESを含み得る。洗浄緩衝液は、約6.0~9.0のpHを有し得る。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約7.0~8.0のpHを有し得;他の実施形態では、約7.0、7.5または8.0のpHを有し得る。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約40mMのリン酸イオン、20mMのHEPESを含み、約7.5のpHを有する。
本明細書で提供される方法は、HA樹脂から結合した目的の抗体を溶出させるステップを含む。結合した目的の抗体は、1つまたは複数の溶出緩衝液によって溶出される。典型的には、この溶出緩衝液は、1種または複数種の塩またはイオンを含み、この塩またはイオンの濃度は、溶出の間に増加する。
本明細書で提供される方法は、1つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。例えば、この精製された抗体は、医薬として、または医薬の調製において使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、免疫グロブリンG(IgG)抗体である。当該分野で公知のように、IgG抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖を含み、おおまかに「Y」形状を有する。標準的なIgG分子では、2つの重鎖は同じアミノ酸配列を有し、2つの軽鎖は同じアミノ酸配列を有する。IgG抗体は、2つの「アーム」(即ち、「第1のアーム」および「第2のアーム」)を有すると記載され得、ここで、各アームは、ジスルフィド結合によって一緒に連結された1つの重鎖および1つの軽鎖を含む。標準的なIgG分子では、抗体の第1のアームは、抗体の第2のアームと同一である(それぞれ、他方のアーム中の重鎖および軽鎖と同じアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む各アームに起因する)。重鎖のN末端領域は、重鎖可変領域(VH)を含み、軽鎖のN末端領域は、軽鎖可変領域(VL)を含む。VHおよびVL領域は、抗原に特異的に結合する抗体の部分を含む。従って、IgG抗体の各アームは、抗原に特異的に結合できる。標準的なIgG分子では、IgG抗体の第1のアームおよび第2のアームは共に、同じ抗原に結合する(両方のアームが、同じそれぞれのアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含むという事実に起因する)。標準的なIgG抗体は、同じ2つのアームを有することに基づいて、「ホモダイマー性」であると言われ得る。本明細書で提供される方法に従って精製されるIgG抗体は、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のものであり得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、二重特異性IgG抗体である。二重特異性IgG抗体では、抗体の2つのアームの各々は、異なる抗原に特異的に結合する。さらに、二重特異性IgG抗体の第1のアーム中の重鎖のアミノ酸配列は、同じ二重特異性IgG抗体の第2のアーム中の重鎖のアミノ酸配列とは異なり、同様に、二重特異性IgG抗体の第1のアーム中の軽鎖のアミノ酸配列は、典型的には、同じ二重特異性IgG抗体の第2のアーム中の軽鎖のアミノ酸配列とは異なる。従って、二重特異性IgG抗体は、異なる2つのアームを有することに基づいて、「ヘテロダイマー性」であると言われ得る。二重特異性IgG抗体の第1のアームは、「第1の抗原」に対して特異的であると記述され得、二重特異性IgG抗体の第2のアームは、「第2の抗原」に対して特異的であると記述され得る。一部の実施形態では、この二重特異性抗体は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4アイソタイプを有する。一部の実施形態では、この二重特異性抗体は、免疫学的に不活性なFc領域を含む。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である(例えば、Sureshら、Methods in Enzymology 121:210、1986を参照のこと)。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の共発現に基づき、2つの重鎖は異なる特異性を有した(MillsteinおよびCuello、Nature 305、537~539、1983)。
1)第1のホモダイマー性抗体(本明細書で「第1の親抗体」とも呼ばれる)および第2のホモダイマー性抗体(本明細書で「第2の親抗体」とも呼ばれる)が個々に発現され、精製される。この第1のホモダイマー性抗体は、調製されている二重特異性抗体の第1の標的抗原に対して特異的であり、第2のホモダイマー性抗体は、調製されている二重特異性抗体の第2の標的抗原に対して特異的である。従って、例えば、BCMAおよびCD3に対する特異性を有する二重特異性抗体を調製することが目的である場合、モノクローナル抗BCMA抗体(「第1の親抗体」)およびモノクローナル抗CD3抗体(「第2の親抗体」)は、別々に発現され、精製される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、全長ヒト二重特異性IgG抗体であり、この二重特異性抗体の第1のアームの第1の抗体可変ドメインは、第1の抗原に結合することが可能であり、二重特異性抗体の第2のアームの第2の抗体可変ドメインは、第2の抗原に結合することが可能である。この第1の抗原および第2の抗原は、本明細書に記載される抗原の任意の特徴を有し得る。一部の実施形態では、第1の抗原は、第1の細胞型上に存在し、第2の抗原は、第2の細胞型上に存在する。
本明細書で提供される方法は、1つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。
「目的の抗体のクリップ型バージョン」、「クリップ型抗体」などは、抗体中の1つまたは複数のポリペプチド結合が目的の対応するインタクトな抗体と比較して切断された組換え抗体を指す。対照的に、「インタクトな」抗体とは、組換え抗体の予測されたペプチド結合およびアミノ酸(即ち、抗体のポリペプチド(複数可)をコードする核酸配列(複数可)に基づいて予測される)の全てを含む組換え抗体を指す。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に適切な不純物は、「高分子質量種」(HMMS)と呼ばれる。HMMSとは、任意の高分子質量の混入物または不純物を指すが、典型的には、凝集体を形成する少なくとも2つのタンパク質の連合である。例として、HMMSは、一緒に凝集した目的の抗体の複数の分子、および/または目的の抗体を産生するために使用した宿主細胞由来のタンパク質の凝集体を含み得る。凝集体は、例えば、分子の共有結合または非共有結合を含む任意のプロセスによって生じ得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に適切な不純物は、「親(parent)抗体」または「親(parental)抗体」などである。この型の不純物分子は、目的の抗体が、例えば図1に概説した2つの異なる親抗体から生成された二重特異性抗体である、本明細書で提供される方法に適切である。これらの親抗体は、単一特異性ホモダイマーである。親抗体は、例えば、i)一部の状況では、一部の親抗体分子は、別々の第1のアームおよび第2のアームへと親抗体を分離するための還元ステップの間に、第1のアームおよび第2のアームへと分離しない(従って、抗体は単一特異性ホモダイマーのままである);またはii)一部の状況では、同じ型の親抗体由来の分離された第1のアームおよび第2のアームが一緒に連結し、従って、これらは(ヘテロダイマー二重特異性抗体の形成に関与するのではなく)単一特異性ホモダイマーを形成するなどの複数の可能な機構に起因して、目的の二重特異性抗体と共に抗体調製物中に存在し得る。本明細書で使用する場合、「親抗体」とは、上記機構のいずれかによって生じるホモダイマー性分子を指す。さらに、本明細書で提供される抗体調製物は、不純物として、一方または両方の親種由来の親抗体を含み得る。
1つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するための方法が、本明細書で提供される。
本発明の実施は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内である分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Sambrookら、1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Methods in Molecular Biology、Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney編、1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.GriffithsおよびD.G.Newell編、1993~1998)J.Wiley and Sons;Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら編、1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら編、1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganら編、1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons、1999);Immunobiology(C.A.JanewayおよびP.Travers、1997);Antibodies(P.Finch、1997);Antibodies:a practical approach(D.Catty.編、IRL Press、1988~1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P.ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000);Using antibodies:a laboratory manual(E.HarlowおよびD.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra編、Harwood Academic Publishers、1995)などの文献中、ならびに該当する場合には、上記参考文献の引き続く版および対応するウェブサイト中に完全に説明されている。
cHA樹脂クロマトグラフィーによる抗BCMA/抗CD3二重特異性抗体の精製
目的:
この実施例では、種々の不純物から目的の全長二重特異性ヒトIgGを分離するための方法を試験した。目的の抗体は、ヘテロダイマー性二重特異性抗BCMA/抗CD3抗体であった(即ち、二重特異性抗体の一方のアームはBCMAに対して特異的であり、他方のアームはCD3に対して特異的であった)。精製の開始時に目的の二重特異性抗体と共に存在する不純物は、以下を含んだ:i)目的のインタクトな抗BCMA/抗CD3二重特異性抗体のクリップ型バージョン;ii)ホモダイマー性単一特異性抗BCMA親抗体;iii)ホモダイマー性単一特異性抗CD3抗体;およびiv)タンパク質凝集体/高分子質量種(HMMS)。
この作業のための出発材料は、目的の二重特異性IgG抗BCMA/CD3抗体ならびに種々の不純物、例えば、上に示されたものを含む抗体調製物であった。この二重特異性抗体のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列番号に示される:BCMA重鎖:配列番号6;BCMA軽鎖:配列番号8;CD3重鎖:配列番号2;CD3軽鎖:配列番号4。目的の二重特異性抗体は、本明細書で以前に記載したように、2つの別々の親抗体から調製されたものであった。より具体的には、親単一特異性抗CD3および抗BCMA抗体は、プロテインAクロマトグラフィーを介して精製されており、これらの精製された親単一特異性抗CD3および抗BCMA抗体を使用して、目的の二重特異性抗BCMA/CD3抗体を生成した。次いで、生成された二重特異性抗BCMA/CD3抗体は、イオン交換クロマトグラフィーを介して精製されていた。この実施例における精製作業のための出発材料として使用される抗体調製物は、目的の二重特異性抗体および種々の残存する不純物を含むイオン交換カラムからの溶出物であり、50mMのTrisおよび60mMのグリシンのおよその濃度、pH7.5で、緩衝液/塩を有した。この抗体調製物は、85質量%を超える目的のインタクトな二重特異性抗体を含んだ;これは、約8%のクリップ型二重特異性抗体、約1%の単一特異性抗BCMA親抗体、約1%の単一特異性抗CD3親抗体および約2%のタンパク質凝集体/高分子質量種(HMMS)もまた含んだ。従って、この方法において出発材料として使用される抗体調製物は、既に比較的純粋な目的のインタクトな二重特異性抗体を含んだが、この方法の目的は、このインタクトな二重特異性抗体の純度を増加させるための方法を開発することであった。
クリップ型二重特異性抗体、単一特異性親抗体およびタンパク質凝集体からの目的のインタクトな抗BCMA/CD3二重特異性抗体の効率的な精製を可能にする適切な樹脂および緩衝液条件を同定することを試みるために、複数の異なるクロマトグラフィー樹脂および条件を試験した。このプロセスの間に、例えば、複数の異なるイオン交換および疎水性相互作用樹脂、ならびに種々の緩衝液およびpH条件を試験した。広範な試験の後、ヒドロキシアパタイト樹脂は、クリップ型二重特異性抗体を含む種々の不純物からのインタクトな抗BCMA/CD3二重特異性抗体の効率的な精製を可能にできた唯一の同定された樹脂であった。
cHA樹脂クロマトグラフィーによる抗BCMA/抗CD3二重特異性抗体の精製-質量ローディングチャレンジ
目的:
この実施例における目的は、実施例1に記載される二重特異性抗体精製方法が、種々のcHA樹脂カラム質量ローディングチャレンジで効率的に使用できるかどうかを決定することであった。例えば、具体的な目的は、cHA樹脂カラム上での種々の質量ローディングチャレンジについて、これが、回収された精製された二重特異性抗体産物中に不純物として1%以下のクリップ型二重特異性抗体を同時に有しつつ、インプット二重特異性抗体の50%よりも多くを一貫して回収することが可能かどうかを決定することであった。
この実施例のための材料および方法は、cHA樹脂に、(異なるクロマトグラフィー実行において)8g/L、10g/Lまたは12g/LのcHA樹脂上タンパク質密度になるように抗体調製物サンプルをロードしたこと以外、実施例1と同じであった。
これらのクロマトグラフィー実行からの結果を、以下の表3にまとめる。3つ全てのクロマトグラフィー実行では、90%ポストピークApex材料(実施例1に記載されるとおり)を収集および分析した。表3に示されるように、8g/L、10g/Lおよび12g/Lの質量チャレンジの各々について、50%を超えるロードされたインタクトな二重特異性抗体が、精製された二重特異性抗体として回収され、回収された精製された二重特異性抗体産物は、不純物として1%未満のクリップ型二重特異性抗体を含んだ。
cHA樹脂クロマトグラフィーによる抗BCMA/抗CD3二重特異性抗体の精製-異なるpHチャレンジ
目的:
この実施例における目的は、実施例1に記載される二重特異性抗体精製方法が、異なるpH条件下で効率的に機能できるかどうかを決定することであった。
この実施例のための材料および方法は、この方法を通じて使用される緩衝液のpHが(異なるクロマトグラフィー実行において)pH7.0、pH7.5またはpH8.0であったこと以外、実施例1と同じであった。これらのクロマトグラフィー実行のために、cHA樹脂に、30g/LのcHA樹脂上タンパク質密度になるように、抗体調製物サンプルをロードした。
これらのクロマトグラフィー実行からの結果を、以下の表4にまとめる。3つ全てのクロマトグラフィー実行では、ピークApex材料(実施例1に記載されるとおり)を収集および分析した。表4に示されるように、目的のインタクトな二重特異性抗体タンパク質が、異なる試験したpH条件の各々について首尾よく回収され、pH7.5が、目的のタンパク質の最も高い回収を生じた(これらのクロマトグラフィー実行では、精製された材料中のクリップ型二重特異性抗体の量を別々に決定することはしなかった)。
cHA樹脂クロマトグラフィーによる抗FLT3/抗CD3二重特異性抗体の精製
目的:
この実施例の目的は、実施例1に記載される二重特異性抗体精製方法が、実施例1で使用されたものとは異なる二重特異性抗体を用いて効率的に実施できるかどうかを決定することであり、このとき、類似の質量の関連するクリップ型二重特異性抗体を含む種々の不純物から目的のインタクトな二重特異性抗体を分離することも必要であった。この実施例では、目的の抗体は、ヘテロダイマー性二重特異性抗FLT3/抗CD3抗体であった。
この実施例で使用したヘテロダイマー性二重特異性抗FLT3/抗CD3抗体は、実施例1と同じ抗CD3重鎖および軽鎖を含んだ。この二重特異性抗体のFLT3アーム中のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列番号に示される:FLT3重鎖:配列番号10;FLT3軽鎖:配列番号12。
図7は、cHA樹脂からの目的のインタクトな二重特異性抗FLT3/CD3抗体の回収、ならびにcHA樹脂からの種々の溶出した画分中のクリップ型二重特異性抗体の相対的な量についての情報を提供するグラフを示す。X軸は、左から右に、cHAカラムからの溶出物の順序を示す(即ち、低い塩から高い塩へ;各データポイントは、カラムから溶出した画分を示す)。垂直/Y軸に沿って、3つの異なる変数が各画分についてプロットされる:変数1)(菱形):%POI;変数2)(四角):%クリップ;および変数3)(三角):累積クリップ、これらの各々は、図6について実施例1に記載したように決定した。さらに、図7のグラフでは、左側のY軸は、%POIについての値を列挙し、右側のY軸は、%クリップについての値を列挙する。図7はまた、図7中の特定の異なる画分が、対応するクロマトグラフィープロファイル(示さず)中のUV吸光度における異なるポイントにどのように対応するかを示す情報を含む。「Apex」、「85%」および「60%」として示されるポイントは、図6について記載したのと同じ方法で決定した。
Claims (16)
- 二重特異性抗体を精製する方法であって、
A)ロード緩衝液中の抗体調製物を、ヒドロキシアパタイト(HA)樹脂上にロードするステップであって、
抗体調製物は、I)目的のインタクトな二重特異性抗体;およびII)目的のインタクトな二重特異性抗体からの分解産物であり、目的のインタクトな二重特異性抗体の質量とは1%未満異なる質量を有する目的の二重特異性抗体のクリップ型バージョンを含む、ステップ;
B)ロードされたHA樹脂を10から50mMの濃度のリン酸イオンを含む洗浄緩衝液で洗浄するステップ、ならびに
C)40から100mMの濃度のリン酸イオンを含む溶出緩衝液を用いてHA樹脂から目的のインタクトな二重特異性抗体を溶出させるステップであって、イオンの濃度は、洗浄緩衝液よりも増加している、
ステップ
を含む方法であって、ここでロード緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液のうち少なくとも一つの緩衝液のpHは7.0と8.0の間であり、
さらにここで二重特異性抗体が抗BCMAアームおよび抗CD3アームを含む抗BCMA/抗CD3二重特異性抗体でありかつIgG2アイソタイプであり、
(a)該抗CD3アームが、i)配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH領域)および配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL領域);またはii)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、のうち少なくとも1つを含み、
(b)該抗BCMAアームが、i)配列番号5に示されるアミノ酸配列を含むVH領域および配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むVL領域;またはiv)配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
のうち少なくとも1つを含み、
ここで、該クリップ型バージョンが、抗CD3重鎖のペプチド結合における切断を含み、ここで該切断は、抗CD3アームの、抗CD3重鎖可変領域および/または抗CD3重鎖の「RG」配列中のアミノ酸RとGとの間で生じるものである、
方法。 - 二重特異性抗体を精製する請求項1に記載の方法であって、抗体調製物中のクリップ型二重特異性抗体の分子対インタクトな二重特異性抗体の分子の比は1:50から1:5の間であるステップを含む方法。
- 二重特異性抗体を精製する請求項1または2に記載の方法であって、更に、HA樹脂から溶出された精製された画分を収集するステップであって、精製された画分は、目的のインタクトな二重特異性抗体を含む、ステップ
を含む方法。 - 抗体調製物が、5g/Lと20g/Lとの間の樹脂上密度になるように、HA樹脂上にロードされる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1グラムの抗体調製物がHA樹脂上にロードされる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体調製物が、少なくとも50質量%であるが95質量%未満の目的のインタクトな抗体を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 精製された画分が目的のインタクトな抗体を含み、少なくとも9 5 質量% 、9 6 質量% 、9 7 質量% 、9 8 質量% または9 9 質量% の目的のインタクトな抗体を含む、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
- 精製された画分が、インタクトな二重特異性抗体およびクリップ型二重特異性抗体を含み、さらに、精製された画分中のクリップ型二重特異性抗体分子対インタクトな二重特異性抗体分子の比が1 : 1 0 0 以下である、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
- クリップ型抗体が、抗体のポリペプチド鎖中に切断されたペプチド結合を有し、切断されたペプチド結合が、抗体の重鎖中にある、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- クリップ型抗体が、インタクトな抗体と同じ数のアミノ酸および同じアミノ酸配列を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- クリップ型抗体が、インタクトな抗体とは異なる数のアミノ酸を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- HA樹脂がセラミックヒドロキシアパタイト(cHA)樹脂である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- リン酸イオンの濃度が、溶出の間に40mMから100mMまで増加する、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体調製物が、i)プロテインA樹脂およびii)イオン交換樹脂のうち少なくとも1つ以上に以前にロードされそこから溶出されたタンパク質を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、医薬としての使用のためまたは医薬の調製における使用のために単離および/または精製される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の方法であって、抗BCMA/抗CD3二重特異性抗体の:
(a)該抗CD3アームが、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号4に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含み、
(b)該抗BCMAアームが、配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号8に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む
方法。
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