KR102665277B1 - 항체 정제 - Google Patents
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Abstract
항체의 정제를 위한 방법이 제공된다. 제공된 정제 방법은 1종 이상의 불순물로부터 관심의 항체를 분리하기 위한 히드록시아파타이트 수지 (HA)의 사용을 수반한다. 불순물은 VH 도메인 내에 절단된 펩티드 결합을 포함하는 클리핑된 항체일 수 있다.
Description
본 출원은 2018년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/635,943의 우선권을 주장하며, 그의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 발명은 불순물, 예컨대 항체 분해 산물로부터 항체를 정제하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 정제 방법은 히드록시아파타이트 수지의 사용을 수반한다.
항체는 의학적, 진단적, 산업적, 및 다른 용도에 중요한 생물학적 분자이다. 많은 방법 및 시약이 항체의 재조합 생산에 이용가능하지만, 예를 들어, 항체의 크기 및 분자적 복잡성으로 인해, 특히 대규모 / 공업적 규모 생산 수준에서 관심의 재조합 항체를 효율적으로 생산하고 정제하는 것은 빈번히 곤란한 일로 남는다.
예를 들어, 관심의 재조합 항체의 생산 동안, 때로는, 관심의 항체와 관련된 분해 산물이 발생할 수 있으며; 분해 산물은 원하지 않는 불순물이다. 이러한 분해 산물은 관심의 항체와 매우 유사한 일부 분자적 특성 (예를 들어 동일하거나 거의 동일한 아미노산 서열 또는 질량)을 가질 수 있다. 관심의 무손상 항체 및 항체의 분해된 버전 사이의 분자적 유사성 때문에, 분해된 항체로부터 무손상 항체를 효과적으로 분리하는 것은 매우 곤란할 수 있다.
따라서, 불순물로부터의 항체의 정제를 위한 새롭고 개선된 방법에 대한 필요가 있다.
1종 이상의 불순물로부터 관심의 항체를 정제하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체를 정제하는 방법으로서, A) 로드 완충액 중 항체 제제를 히드록시아파타이트 (HA) 수지 상에 로딩하며, 여기서: 항체 제제는 I) 관심의 무손상 항체 및 II) 관심의 항체의 클리핑된 버전을 포함하며, 여기서 관심의 항체의 클리핑된 버전은 관심의 무손상 항체로부터의 분해 산물이고, 관심의 무손상 항체의 질량과 10% 미만 상이한 질량을 갖는 것인 단계; 및 B) 용리 완충액으로 관심의 무손상 항체를 HA 수지로부터 용리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 정제하는 방법으로서, A) 로드 완충액 중 항체 제제를 히드록시아파타이트 (HA) 수지 상에 로딩하며, 여기서: 항체 제제는 I) 관심의 무손상 이중특이적 항체; 및 II) 적어도 1종의 불순물 종을 포함하며, 여기서 불순물 종은 a) 관심의 이중특이적 항체의 클리핑된 버전으로서, 관심의 무손상 이중특이적 항체로부터의 분해 산물이고, 관심의 무손상 이중특이적 항체의 질량과 10% 미만 상이한 질량을 갖는, 관심의 이중특이적 항체의 클리핑된 버전; b) 제1 모체 항체로서, 무손상 이중특이적 항체의 제1 아암과 동일한 항원 특이성을 갖는 단일특이적 항체인 제1 모체 항체; c) 제2 모체 항체로서, 무손상 이중특이적 항체의 제2 아암과 동일한 항원 특이성을 갖는 단일특이적 항체인 제2 모체 항체; 및 d) 고분자 질량 종 (HMMS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 및 B) 용리 완충액으로 관심의 무손상 이중특이적 항체를 HA 수지로부터 용리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 정제하는 방법으로서, A) 로드 완충액 중 항체 제제를 히드록시아파타이트 (HA) 수지 상에 로딩하며, 여기서: I) 항체 제제는 a) 관심의 무손상 이중특이적 항체 및 b) 관심의 이중특이적 항체의 클리핑된 버전을 포함하며, 여기서 관심의 항체의 클리핑된 버전은 관심의 무손상 이중특이적 항체로부터의 분해 산물이고, 관심의 무손상 이중특이적 항체의 질량과 10% 미만 상이한 질량을 갖고; II) 항체 제제 중 클리핑된 이중특이적 항체의 분자 대 무손상 이중특이적 항체의 분자의 비는 적어도 1:50 내지 1:5 이하인 단계; 및 B) 용리 완충액으로 무손상 이중특이적 항체를 HA 수지로부터 용리하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 C) HA 수지로부터 용리된 정제된 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 정제된 분획은 무손상 이중특이적 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체를 정제하는 방법으로서, A) 로드 완충액 중 항체 제제를 히드록시아파타이트 (HA) 수지 상에 로딩하며, 여기서: I) 항체 제제는 a) 관심의 무손상 항체 및 b) 관심의 항체의 클리핑된 버전을 포함하며, 여기서 관심의 항체의 클리핑된 버전은 관심의 무손상 항체로부터의 분해 산물이고, 관심의 무손상 항체의 질량과 10% 미만 상이한 질량을 갖고; II) 항체의 클리핑된 버전은 질량 기준으로 항체 제제의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 또는 20%를 구성하는 것인 단계; B) 용리 완충액으로 무손상 항체를 HA 수지로부터 용리하는 단계; 및 C) HA 수지로부터 용리된 정제된 분획을 수집하며, 여기서 정제된 분획은 무손상 항체를 포함하고, 질량 기준으로 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 또는 20% 미만의 클리핑된 항체를 함유하고, 여기서 정제된 분획은 항체 제제보다 질량 기준으로 더 낮은 %의 클리핑된 항체를 함유하는 것인 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 용리 완충액으로 관심의 항체를 HA 수지로부터 용리하는 단계를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 용리 완충액은 이온을 포함한다. 임의로, 완충액 중 이온의 농도는 용리 동안 증가된다. 임의로, HA 수지 주위의 완충액 중 이온의 농도는 용리 동안 증가된다.
일부 실시양태에서, 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 항체는 이종이량체성 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, HA 수지로부터 용리된 정제된 분획을 수집하는 단계를 수반하며, 여기서 정제된 분획은 관심의 무손상 항체를 포함하는 것인 본원에 제공된 방법에서, 정제된 분획은 질량 기준으로 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 관심의 무손상 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 무손상 이중특이적 항체 및 클리핑된 이중특이적 항체를 포함하는 정제된 분획을 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 정제된 분획 중 클리핑된 이중특이적 항체 분자 대 무손상 이중특이적 항체 분자의 비는 1:400, 1:200, 1:100, 또는 1:50 이하이다.
일부 실시양태에서, 항-CD3 항체이거나, 또는 항-CD3 아암을 함유하는 이중특이적 항체인 관심의 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 항체는 하기: i) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; ii) 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; iii) 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; 또는 iv) 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 이중특이적 항체는 i) 항-BCMA 아암 및 항-CD3 아암을 포함하는 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체, 또는 ii) 항-FLT3 아암 및 항-CD3 아암을 포함하는 항-FLT3 / 항-CD3 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 항-BCMA 아암을 포함하는 이중특이적 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 항-BCMA 아암은 하기: i) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; ii) 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; iii) 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 7에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; 또는 iv) 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 8에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-FLT3 아암을 포함하는 이중특이적 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 항-FLT3 아암은 하기: i) 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역; ii) 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; iii) 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역; 또는 iv) 서열식별번호: 10에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 제제를 HA 수지 상에 로딩하는 단계를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 항체 제제는 2, 3, 4, 또는 5 g/L 내지 8, 9, 10, 12, 15, 또는 20 g/L의 수지에 대한 밀도로 HA 수지 상에 로딩된다.
일부 실시양태에서, 항체 제제를 HA 수지 상에 로딩하는 단계를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 적어도 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 또는 5000 그램의 항체 제제가 HA 수지 상에 로딩된다.
일부 실시양태에서, 항체 제제를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 항체 제제는 질량 기준으로 적어도 50%, 60%, 70%, 또는 80% 그러나 90%, 95%, 97%, 98%, 또는 99% 미만의 관심의 무손상 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 클리핑된 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 클리핑된 항체는 무손상 항체의 질량과 0.1%, 0.5%, 1%, 또는 2% 미만 상이한 질량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 클리핑된 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 클리핑된 항체는 무손상 항체의 질량보다 약 5 내지 100 달톤 더 큰 질량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 클리핑된 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 클리핑된 항체는 무손상 항체의 질량보다 약 18 달톤 더 큰 질량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 클리핑된 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 클리핑된 항체는 항체의 폴리펩티드 쇄 내에 절단된 펩티드 결합을 가지며, 여기서 절단된 펩티드 결합은 항체의 중쇄 내에 있다. 일부 실시양태에서, 클리핑된 항체와 관련된 본원에 제공된 방법에서, 클리핑된 항체는 항체의 폴리펩티드 쇄 내에 절단된 펩티드 결합을 가지며, 여기서 절단된 펩티드 결합은 항체의 경쇄 내에 있다.
일부 실시양태에서, 클리핑된 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 클리핑된 항체는 무손상 항체와 동일한 수의 아미노산 및 동일한 아미노산 서열을 함유한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 클리핑된 항체는 무손상 항체와 상이한 수의 아미노산을 함유한다.
일부 실시양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 VH 및 VL 도메인을 포함하는 관심의 항체를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 상응하는 클리핑된 항체는 CD3에 특이적으로 결합하는 VH 도메인 내에 절단된 펩티드 결합을 포함한다.
일부 실시양태에서, HA 수지를 수반하는 본원에 제공된 방법에서, HA 수지는 세라믹 히드록시아파타이트 (cHA) 수지이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, HA 수지는, 항체 제제를 HA 수지 상에 로딩한 후에 그러나 무손상 이중특이적 항체를 수지로부터 용리하기 전에, 포스페이트 이온을 포함하는 세척 완충액으로 세척된다. 임의로, 세척 완충액은 약 5, 10, 15, 20, 내지 30, 40, 또는 50 mM의 농도의 포스페이트 이온을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온을 함유하는 용리 완충액을 수반하는 본원에 제공된 방법에서, 이온은 포스페이트이다. 일부 실시양태에서, 용리 동안 포스페이트 이온의 농도는 약 30, 40, 또는 50 mM에서 약 60, 70, 80, 100, 150, 또는 200 mM로 증가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 로드 완충액, 세척 완충액, 및 용리 완충액 중 적어도 1종의 pH는 약 pH 7.0 내지 8.0이다.
일부 실시양태에서, 항체 제제와 관련된 본원에 제공된 방법에서, 항체 제제는 i) 단백질 A 수지 및 ii) 이온 교환 수지 중 적어도 1종 상에 이전에 로딩되고 그로부터 용리된 단백질을 함유한다. 임의로, 항체 제제는 i) 단백질 A 수지 및 ii) 이온 교환 수지 둘 다 상에 이전에 로딩되고 그로부터 용리된 단백질을 함유한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 제조된 항체는 제약으로서 또는 제약의 제조에 사용하기 위해 단리되고/거나 정제된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 정제된 항체가 제공된다.
도 1은 본원에 제공된 방법에 따라 정제될 수 있는 이중특이적 항체를 제조하는 방법의 개략적 제시를 도시한다.
도 2는 예시적인 i) 무손상 이중특이적 항체 (좌측 패널) 및 ii) 이중특이적 항체의 클리핑된 버전 (우측 패널)의 개략적 제시를 도시하며, 여기서 클리핑된 이중특이적 항체는 무손상 이중특이적 항체를 갖는 항체 제제에 존재할 수 있는 불순물이다.
도 3은 HA 수지로부터의 용리를 통한 다수의 상이한 불순물로부터의 관심의 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체 ("POI")의 분리를 제시하는 크로마토그램을 도시한다.
도 4는 도 3의 크로마토그램에 도시된 바와 같은 HA 크로마토그래피 실행에 따라 HA 수지로부터 용리된 상이한 분획 중 상이한 단백질 종 (관심의 항체 및 다양한 불순물을 포함함)의 상대량을 제시하는 그래프를 도시한다.
도 5는 HA 수지로부터의 용리를 통한 다수의 상이한 불순물로부터의 관심의 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체 ("POI")의 분리를 제시하는 크로마토그램을 도시한다.
도 6은 도 5의 크로마토그램에 도시된 바와 같은 HA 크로마토그래피 실행에 따라 HA 수지로부터 용리된 상이한 분획 중 상이한 단백질 종 (관심의 항체 및 다양한 불순물을 포함함)의 상대량을 제시하는 그래프를 도시하며, 여기서 관심의 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체는 HA 수지로부터의 용리를 통해 다수의 상이한 불순물로부터 분리된다.
도 7은 HA 크로마토그래피 실행에 따라 HA 수지로부터 용리된 상이한 분획 중 상이한 단백질 종 (관심의 항체 및 다양한 불순물을 포함함)의 상대량을 제시하는 그래프를 도시하며, 여기서 관심의 항-FLT3 / 항-CD3 이중특이적 항체는 HA 수지로부터의 용리를 통해 다수의 상이한 불순물로부터 분리된다.
도 2는 예시적인 i) 무손상 이중특이적 항체 (좌측 패널) 및 ii) 이중특이적 항체의 클리핑된 버전 (우측 패널)의 개략적 제시를 도시하며, 여기서 클리핑된 이중특이적 항체는 무손상 이중특이적 항체를 갖는 항체 제제에 존재할 수 있는 불순물이다.
도 3은 HA 수지로부터의 용리를 통한 다수의 상이한 불순물로부터의 관심의 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체 ("POI")의 분리를 제시하는 크로마토그램을 도시한다.
도 4는 도 3의 크로마토그램에 도시된 바와 같은 HA 크로마토그래피 실행에 따라 HA 수지로부터 용리된 상이한 분획 중 상이한 단백질 종 (관심의 항체 및 다양한 불순물을 포함함)의 상대량을 제시하는 그래프를 도시한다.
도 5는 HA 수지로부터의 용리를 통한 다수의 상이한 불순물로부터의 관심의 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체 ("POI")의 분리를 제시하는 크로마토그램을 도시한다.
도 6은 도 5의 크로마토그램에 도시된 바와 같은 HA 크로마토그래피 실행에 따라 HA 수지로부터 용리된 상이한 분획 중 상이한 단백질 종 (관심의 항체 및 다양한 불순물을 포함함)의 상대량을 제시하는 그래프를 도시하며, 여기서 관심의 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체는 HA 수지로부터의 용리를 통해 다수의 상이한 불순물로부터 분리된다.
도 7은 HA 크로마토그래피 실행에 따라 HA 수지로부터 용리된 상이한 분획 중 상이한 단백질 종 (관심의 항체 및 다양한 불순물을 포함함)의 상대량을 제시하는 그래프를 도시하며, 여기서 관심의 항-FLT3 / 항-CD3 이중특이적 항체는 HA 수지로부터의 용리를 통해 다수의 상이한 불순물로부터 분리된다.
1종 이상의 불순물로부터 관심의 항체를 정제하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 방법은 불순물로부터 관심의 항체를 분리하기 위한 히드록시아파타이트 수지의 사용을 수반한다. 일부 실시양태에서, 관심의 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 불순물은 관심의 항체와 관련된 항체이지만 (즉, 이는 관심의 항체와 유사하거나 동일한 아미노산 서열(들)을 가짐), 이는 관심의 항체에 비해 하나 이상의 방식으로 변형되고, 이는 관심의 항체와는 상이한 질량을 갖는다. 임의로, 항체 불순물 종의 질량은 관심의 항체의 질량과 매우 유사하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 불순물 종의 질량은 관심의 항체의 질량과 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.02%, 또는 0.01% 미만 상이하다. 임의로, 본원에 제공된 방법은 1종 이상의 불순물로부터의 관심의 항체의 대규모 정제에 사용될 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 관련 기술분야의 모든 용어, 기호 및 다른 과학 용어 또는 용어들은 본 발명이 관련되는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부의 경우, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에 정의되며, 본원에서의 이러한 정의의 포함은 반드시 관련 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것에 비해 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되지는 않아야 한다.
하기 용어는 달리 지시되지 않는다면 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:
"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 그의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (ScFv) 및 도메인 항체 (예를 들어, 상어 및 낙타류 항체를 포함함), 디아바디, 및 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형태를 포괄한다. 용어 "항체"는 단일특이적, 이중특이적, 및 다중특이적 항체를 포함한다. 항체는 임의의 부류, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 하위부류)의 항체를 포함하며, 항체는 임의의 특정한 부류의 것일 필요는 없다. 그의 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 할당될 수 있다. 이뮤노글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "중쇄", "경쇄", "가변 영역" 또는 "가변 도메인", "프레임워크 영역", "불변 도메인" 등은 면역학 분야에서의 그들의 통상적인 의미를 가지며, 천연 발생 이뮤노글로불린에서의 도메인 및 재조합 결합 단백질 (예를 들어 인간화 항체, 이중특이적 항체, 단일 쇄 항체, 키메라 항체 등)의 상응하는 도메인을 지칭한다. 천연 발생 이뮤노글로불린의 기본적 구조 단위는 통상적으로 약 150,000 Da의 당단백질로서 표현되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 사량체이다. 각각의 쇄의 아미노-말단 (N-말단) 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카르복시-말단 (C-말단) 부분은 불변 영역을 한정한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 경쇄 불변 도메인 (CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 갖는 중쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG 분자의 가변 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 용어화되는 초가변성의 영역을 포함하며, 이는 항원과 접촉하는 잔기, 및 일반적으로 구조를 유지하고, CDR 루프의 위치화를 결정하는 프레임워크 영역 (FR)으로 용어화되는 비-CDR 절편을 함유한다 (특정 프레임워크 잔기는 또한 항원과 접촉할 수 있지만). 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 구조로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: n-FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c. 이뮤노글로불린 분자는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 및 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
"이중특이적" 또는 "이중-특이적"은 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체의 2개의 항원 결합 부위는 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 있을 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합한다.
"무손상" 항체는 재조합 항체의 모든 예상된 펩티드 결합 및 아미노산을 함유하는 (즉, 항체의 폴리펩티드(들)를 코딩하는 핵산 서열(들)에 기반하여 예상될 것인) 재조합 항체를 지칭한다. 대조적으로, "클리핑된" 항체는 상응하는 "무손상" 항체에 비해 적어도 1개의 펩티드 결합을 상실하고 있는 상응하는 "무손상" 항체의 버전을 지칭한다. 본원에서 "관심의 항체"에 대한 언급은 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 일반적으로 관심의 무손상 항체를 지칭한다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체, 뿐만 아니라 그 파라미터에 대한 언급된 수치 값 아래 또는 위로 10%만큼일 수 있는 값 또는 파라미터에 관한 것인 실시양태를 포함한다. 예를 들어, "약 5 mg"에 대한 언급은 5 mg 및 또한 4.5 mg 내지 5.5 mg의 임의의 값을 포함한다.
방법
본원에 제공된 방법은 1종 이상의 불순물로부터 관심의 항체를 정제하는데 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법에서, 관심의 항체 및 1종 이상의 불순물 분자를 함유하는 항체 제제 (또한 본원에서 "출발 샘플"로 지칭됨)는 관심의 항체 및 임의로 1종 이상의 불순물 분자에 결합하는 히드록시아파타이트 (HA) 수지 상에 로딩된다. 그 후, HA 수지를 세척하여 임의의 느슨하게 결합된 불순물을 제거한다. (일부 실시양태에서, 모든 불순물 분자는 통과하고, HA 수지에 결합하지 않을 수 있다.) 다음으로, 관심의 항체는 전형적으로 증가하는 포스페이트 이온 농도의 구배를 통해 수지 상에 도입되는 포스페이트 용리 완충액을 사용하여 HA 수지로부터 용리된다. HA 수지로부터의 관심의 항체의 용리는 관심의 항체, 및 출발 샘플에 관심의 항체와 함께 존재하였던 보다 적은 불순물을 함유하는 (또는 함유하지 않는) 정제된 샘플을 산출한다. HA 수지로부터의 관심의 항체의 용리 동안, HA 수지에 결합된 임의의 불순물 분자는 또한 증가하는 포스페이트 이온 농도의 구배 동안 일부 시점에서 용리할 수 있다. 그러나, 불순물 분자는 관심의 항체의 용리의 조건과는 충분히 상이한 조건 하에서 HA 수지로부터 용리하므로, 관심의 항체는 용리 프로세스 동안 불순물 분자로부터 효과적으로 분리될 수 있다. 상기 방법 단계 및 관련된 물질 및 단계에 관한 추가의 상세사항은 하기에 제공된다.
히드록시아파타이트 수지
다양한 히드록시아파타이트 수지는 시판되며, 임의의 이용가능한 형태의 물질은 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있다. 임의로, 히드록시아파타이트는 결정질 형태이다. 임의로, 히드록시아파타이트는 응집되어 입자를 형성하며 고온에서 안정한 다공성 세라믹 매스로 소결된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 HA 수지는 세라믹 히드록시아파타이트 (cHA) 수지이다. "세라믹 히드록시아파타이트" / "cHA"는 고온에서 구형의 마크로다공성 세라믹 형태로 소결된 화학식 Ca10(PO4)6(OH)2의 불용성 히드록실화 인산칼슘을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "세라믹 히드록시아파타이트" / "cHA"는 유형 I 및 유형 II 세라믹 히드록시아파타이트를 포괄하나, 이에 제한되지는 않으며, 달리 특정되지 않는다면, 임의의 적합한 입자 크기를 또한 포괄한다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 전형적인 cHA 입자 크기는, 예를 들어, 직경으로 1-100 μm 또는 1-1000 μm, 예컨대 20 μm, 40 μm 또는 80 μm의 입자 크기를 포함한다. 본원에 제공된 방법과 함께 사용될 수 있는 예시적인 cHA 수지는 CHT™ 유형 I 및 유형 II 수지 (바이오-라드(Bio-Rad))를 포함한다. "HA 수지" 등에 대한 본원에서의 임의의 언급은 cHA 수지를 포괄한다.
전형적으로, 본원에 제공된 방법에서, HA 수지는 1개 이상의 크로마토그래피 칼럼에 제공된다. 칼럼 특성, 예컨대 칼럼의 직경, 길이, 및 패킹 밀도는 특정한 정제 프로젝트의 필요 (즉, 정제되는 단백질의 양), 및 칼럼에 사용되는 HA 수지와 관련된 인자, 예컨대 그의 기공 크기, 입자 크기, 압축성, 로드 용량, 및 동적 결합 용량을 비롯한 다양한 인자에 기반하여 선택될 수 있다. 또한, 본원에 제공된 방법은 빈번히 크로마토그래피 칼럼에서의 HA 수지와 관련하여 기재되지만; 그러나, 수지에 대한 다른 적합한 관련된 형태는 배제되지 않는다. 또한, "HA 칼럼" 등에 대한 본원에서의 언급은 HA 수지로 패킹되는 크로마토그래피 칼럼을 지칭한다.
단백질 로딩 전에 HA 칼럼을 평형화하기
일부 실시양태에서, 관심의 항체를 함유하는 샘플을 HA 칼럼 상에 로딩하기 전에, 본원에 제공된 방법은 칼럼을 1종 이상의 평형화 완충액(들)으로 사전-평형화하는 단계를 포함할 수 있다. 평형화 완충액은, 예를 들어, HA 수지가 방법의 시작 시에 깨끗한 것을 보장하기 위해 (즉, 수지가 수지에 이미 결합된 불순물을 갖지 않음을 보장하기 위해) 및/또는 HA 수지 주위의 용액이 수지 상에 로딩되는 샘플과 혼화성임을 보장하기 위해 칼럼 상에 도입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 평형화 완충액은, 예를 들어, 인산나트륨을 포함하는 포스페이트 완충액이며, 여기서 완충액 중 포스페이트 이온의 농도는 약 100 내지 500 mM이다. 이러한 평형화 완충액은 또한 본원에서 "고 포스페이트 평형화 완충액" 등으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 고 포스페이트 평형화 완충액은 약 250 내지 450 mM 포스페이트 이온을 함유할 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 200, 250, 300, 350, 400, 또는 450 mM 포스페이트 이온을 함유할 수 있다. 이러한 평형화 완충액은 HA 수지 상에 이미 존재하는 (즉, 관심의 단백질을 함유하는 샘플이 수지 상에 로딩되기 전에 거기에 있는; 이러한 불순물은, 예를 들어, HA 수지가 정제 방법에 이전에 사용되었고, 수지가 이전의 사용 후에 완전히 청소되지 않은 경우, 존재할 수 있음) 임의의 오염물 / 불순물을 용리하기 위해 완충액 중 상대적으로 높은 농도의 포스페이트 이온을 함유한다. 고 포스페이트 평형화 완충액은 약 6.0 내지 9.0의 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 고 포스페이트 평형화 완충액은 약 7.0 내지 8.0의 pH를 가질 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 7.0, 7.5, 또는 8.0의 pH를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 고 포스페이트 평형화 완충액은 약 400 mM 포스페이트 이온을 함유하며, 약 7.5의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 고 포스페이트 평형화 완충액은 또한 본원에서 "평형화 완충액 1"로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 평형화 완충액은, 예를 들어, 인산나트륨을 포함하는 포스페이트 완충액이며, 여기서 완충액 중 포스페이트 이온의 농도는 약 1 내지 20 mM이다. 이러한 평형화 완충액은 또한 본원에서 "저 포스페이트 평형화 완충액" 등으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 저 포스페이트 평형화 완충액은 약 1 내지 10 mM 포스페이트 이온을 함유할 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10 mM 포스페이트 이온을 함유할 수 있다. 이러한 평형화 완충액은 수지에 결합하는 관심의 단백질에 대해 전도성인 HA 수지 주위의 조건을 생성하기 위해 완충액 중 상대적으로 낮은 농도의 포스페이트 이온을 함유한다. 임의로, 저 포스페이트 평형화 완충액은 추가적으로 약 1 내지 50 mM의 농도로 HEPES를 함유할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 저 포스페이트 평형화 완충액은 약 2 내지 30 mM HEPES를 함유할 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 5, 10, 15, 20, 또는 25 mM HEPES를 함유할 수 있다. 저 포스페이트 평형화 완충액은 약 6.0 내지 9.0의 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 저 포스페이트 평형화 완충액은 약 7.0 내지 8.0의 pH를 가질 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 7.0, 7.5, 또는 8.0의 pH를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 저 포스페이트 평형화 완충액은 약 2 mM 포스페이트 이온, 20 mM HEPES를 함유하고, 약 7.5의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 저 포스페이트 평형화 완충액은 또한 본원에서 "평형화 완충액 2"로 지칭될 수 있다. 그러나, 중요하게는, 본원에 제공된 방법으로, 저 포스페이트 평형화 완충액은 방법 동안 고 포스페이트 평형화 완충액의 사전 사용 없이 수지를 사전-평형화하는데 사용될 수 있다.
HA 칼럼을 관심의 항체를 함유하는 샘플로 로딩하기
HA 칼럼이 단백질 로딩을 위해 준비되면, 관심의 항체 및 불순물을 함유하는 샘플을 HA 칼럼 상에 로딩한다. 샘플이 HA 칼럼 상에 로딩된 완충액은 본원에서 "로드 완충액"으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심의 항체를 함유하는 샘플이 초기에 본원에 제공된 바와 같은 방법과 함께 사용하기 위해 얻어지는 경우, 샘플은 이미 샘플을 HA 칼럼 상에 로딩하기 위한 적합한 로드 완충액 중에 있다. 그러나, 다른 실시양태에서, 샘플을 HA 칼럼 상에 로딩하기 전에, 샘플은 샘플이 칼럼 상에 로딩하기 위해 적합한 완충액 중에 있도록, 샘플의 완충액 조건을 변형시키기 위해 처리될 (예를 들어, 희석될, 농축될, 또는 완충액 교환될) 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법으로, 로드 완충액은 HA 수지에의 관심의 항체의 결합을 방해할 높은 농도의 포스페이트 이온을 가질 수 없다. 따라서, 관심의 항체를 함유하는 초기 샘플이 높은 농도의 포스페이트 이온을 함유하는 경우, 그 샘플은 샘플 중 포스페이트 이온의 농도가 HA 수지에의 관심의 항체의 결합을 허용하는 적합하게 낮은 농도로 감소될 때까지, 예를 들어 희석되거나 완충액 교환될 필요가 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 로드 완충액은 약 10 mM 이하의 포스페이트 이온을 함유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 로드 완충액은 약 10 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 또는 1 mM 미만의 포스페이트 이온을 함유한다. 일부 실시양태에서, 로드 완충액은 0 mM 포스페이트 이온을 함유한다. 임의로, 로드 완충액은 다양한 다른 염 또는 완충액 성분 (예를 들어 트리스, 글리신)을 함유할 수 있다. 로드 완충액은 약 6.0 내지 9.0의 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 로드 완충액은 약 7.0 내지 8.0의 pH를 가질 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 7.0, 7.5, 또는 8.0의 pH를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심의 항체를 함유하는 샘플은 적어도 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 12 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 또는 30 g/L의 수지에 대한 밀도로 HA 수지 상에 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심의 항체를 함유하는 샘플은 적어도 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 12 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 또는 25 g/L 내지 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 6 g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 12 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 또는 30 g/L 이하의 수지에 대한 밀도로 HA 수지 상에 로딩될 수 있으며, 여기서 두번째 값은 첫번째 값보다 더 크다.
HA 칼럼을 세척하기
관심의 항체 및 불순물을 함유하는 샘플을 HA 칼럼 상에 로딩한 후에 그러나 관심의 항체의 용리 전에, 본원에 제공된 방법은 로딩된 칼럼을 1종 이상의 세척 완충액(들)으로 세척하여, 예를 들어, 비-특이적으로 부동화된 불순물을 제거하거나, 다르게는 용리 단계를 위해 칼럼을 준비하거나 평형화하는 추가의 단계를 임의로 포함할 수 있다. 임의의 세척 완충액의 특성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 세척 완충액은, 예를 들어, 인산나트륨을 포함하는 포스페이트 완충액이며, 완충액 중 포스페이트 이온의 농도는 약 5 내지 50 mM이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 세척 완충액은 약 10 내지 40 mM 포스페이트 이온을 함유할 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 10, 20, 30, 40, 또는 50 mM 포스페이트 이온을 함유할 수 있다. 임의로, 세척 완충액은 추가적으로 약 1 내지 50 mM의 농도로 HEPES를 함유할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 세척 완충액은 약 2 내지 30 mM HEPES를 함유할 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 5, 10, 15, 20, 또는 25 mM HEPES를 함유할 수 있다. 세척 완충액은 약 6.0 내지 9.0의 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 세척 완충액은 약 7.0 내지 8.0의 pH를 가질 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 7.0, 7.5, 또는 8.0의 pH를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 세척 완충액은 약 40 mM 포스페이트 이온, 20 mM HEPES를 함유하며, 약 7.5의 pH를 갖는다.
관심의 항체를 HA 칼럼으로부터 용리하기
본원에 제공된 방법은 관심의 결합된 항체를 HA 수지로부터 용리하는 단계를 포함한다. 관심의 결합된 항체는 1종 이상의 용리 완충액에 의해 용리된다. 전형적으로, 용리 완충액은 1종 이상의 염 또는 이온을 함유하며, 염 또는 이온의 농도는 용리 동안 증가된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 용리 완충액은 포스페이트 이온을 포함한다. 임의로, 용리 완충액 중 포스페이트 이온의 농도는 용리 동안 약 20 mM의 초기 농도로부터 약 200 mM로 증가된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 용리 완충액 중 포스페이트 이온의 농도는 용리 동안 약 40 mM의 초기 농도로부터 약 80 mM로 또는 약 40 mM로부터 약 100 mM로 증가된다. 용리 완충액 중 포스페이트 이온의 농도를 증가시키는 구체적인 방식 및 속도는 관심의 항체에 적합한 바와 같이, 및 HA 수지에 또한 결합된 불순물 분자의 유형을 고려하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 용리 완충액 중 포스페이트 이온의 농도는 점진적 / 얕은 선형 구배로 상승될 수 있다. 얕은 구배의 사용은 유사하지만, 상이한 조건 하에서 HA 수지로부터 용리하는 1종 이상의 분자의 효과적인 분리를 허용할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 용리 완충액 중 포스페이트 이온의 농도는 급격한 구배로 상승될 수 있거나, 이는 단계적으로 상승될 수 있다. 임의로, 용리 완충액은 추가적으로 약 1 내지 50 mM의 농도로 HEPES를 함유할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 용리 완충액은 약 2 내지 30 mM HEPES를 함유할 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 5, 10, 15, 20, 또는 25 mM HEPES를 함유할 수 있다. 용리 완충액은 약 6.0 내지 9.0의 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 용리 완충액은 약 7.0 내지 8.0의 pH를 가질 수 있고; 다른 실시양태에서, 이는 약 7.0, 7.5, 또는 8.0의 pH를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 용리 완충액은 약 40 내지 80 mM 포스페이트 이온 (구배에 걸쳐 증가함), 20 mM HEPES를 함유하고, 약 7.5의 pH를 갖는다.
HA 수지와 함께 사용하기에 적합한 용리 완충액의 특성 (예컨대 완충액 조성, pH, 농도, 이온 강도 등)을 비롯한 용리 조건; 임의의 필요한 단계 또는 용리 완충액의 특성의 구배 변화; 사용되는 용리 완충액의 칼럼 부피의 수; 유속 등은 HA 칼럼으로부터의 관심의 항체의 용리, 뿐만 아니라 불순물 분자로부터의 관심의 항체의 분리를 최적화하도록 결정될 수 있다.
용리 후, 관심의 항체를 함유하는 1종 이상의 피크 분획을 임의로 개별적으로 또는 별개로 수집하고, 임의로 풀링하고, pH를 임의로 조정하고, 임의로 여과한 후, 목적하는 바에 따라 추가의 프로세싱 전에 임의로 저장한다. 수집을 위한 피크 분획은 임의의 적합한 수단, 예컨대 A280에서의 자외선을 사용하고, 자외선 신호가 목적하는 양 초과로 상승하는 경우 및/또는 용리 조건에서의 목적하는 시점에서 수집을 시작하는 확인에 의해 확인될 수 있다.
HA 수지로부터 용리되고 관심의 항체를 함유하는 물질은 임의로 본원에서 "정제된 분획" 등으로 지칭될 수 있다. 정제된 분획은 HA 수지로부터 용리된 단일 분획으로부터의 물질을 함유할 수 있거나, 이는 함께 풀링된 HA 수지로부터 용리된 다수의 분획의 조합일 수 있다. 전형적으로, 정제된 분획은 그것이 다량의 관심의 항체, 그러나 소량의 불순물 분자를 수집하는 것 사이에 균형화되도록 제조된다. 이들 경쟁 목표는, 예를 들어, 관심의 항체가 HA 수지로부터 용리하는 경우, 및 불순물 분자의 종이 HA 수지로부터 용리하는 경우의 조건 사이의 적어도 부분적 중첩이 있을 수 있기 때문에, 종종 균형화되어야 한다.
본원에 제공된 방법을 위한 완충액 중 임의의 것 (예를 들어 평형화 완충액, 로드 완충액, 세척 완충액, 또는 용리 완충액)은 또한 추가의 또는 대안적인 적합한 성분, 예컨대 아세테이트, 숙시네이트, MES, ACES, MOPSO, PIPES, BES, TAPSO, AMPSO, TRICINE, EPPS, 비신, DIPSO, HEPPSO, 이미다졸, 트리스, 비스-트리스, TAPS, 아르기닌, 글리신, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, 1% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 또는 다른 계면활성제 등을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 완충액 중 임의의 것은 약 6.0 내지 9.0의 pH를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 완충액 중 임의의 것은 약 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 9.0, 6.5 내지 9.0, 7.0 내지 9.0, 7.5 내지 9.0, 7.0 내지 8.0, 또는 6.5 내지 8.5의 pH를 가질 수 있다.
"포스페이트 이온"을 함유하는 것으로서 기재된 본원에 제공된 완충액에서, 포스페이트 이온은 임의의 적합한 포스페이트 염, 예컨대 인산나트륨 또는 인산칼륨으로부터의 완충액에서 생성될 수 있다. 또한, "인산나트륨"으로 제조된 것으로서 기재된 본원에 제공된 용액은 임의의 적합한 인산나트륨 염 (예를 들어 1염기성 또는 이염기성)으로 제조될 수 있다.
관심의 항체를 HA 칼럼으로부터 용리한 후, HA 칼럼을 임의로 청소하여 칼럼 수지를 열화시키는 불순물 및 다른 성분을 제거하고, 저장 후속 사용을 위해 이를 준비한다. 한 실시양태에서, 칼럼은 먼저 완충액, 예컨대 약 0.4 M의 농도 및 약 7.5의 pH의 인산나트륨을 함유하는 것을 사용하여 재생되고; 이어서 세정 용액, 예컨대 약 1 M NaOH 및 약 0.5 M 인산칼륨을 사용한 임의적 위생화 단계가 이어지고, 그 후 저장 용액, 예컨대 약 0.1 M NaOH을 사용하여 저장을 위해 준비된다.
항체
본원에 제공된 방법은 1종 이상의 불순물로부터 관심의 항체를 정제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 정제된 항체는 제약으로서 또는 제약의 제조에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제된 항체는 본원에 제공된 임의의 유형의 항체이다. 예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라 정제된 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 scFv 또는 Fab)일 수 있으며, 이는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 전형적으로, 본원에 제공된 방법에 따라 정제된 관심의 항체는 재조합 항체이다.
IgG 항체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제될 수 있는 항체는 이뮤노글로불린 G (IgG) 항체이다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, IgG 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하며, 일반적인 "Y" 형상을 갖는다. 표준 IgG 분자에서, 2개의 중쇄는 동일한 아미노산 서열을 갖고, 2개의 경쇄는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. IgG 항체는 2개의 "아암" (즉, "제1 아암" 및 "제2 아암")을 갖는 것으로서 기재될 수 있으며, 여기서 각각의 아암은 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 함유한다. 표준 IgG 분자에서, 항체의 제1 아암은 항체의 제2 아암과 동일하다 (다른 아암에서의 중쇄 및 경쇄와 각각 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 함유하는 각각의 아암으로 인해). 중쇄의 N-말단 영역은 중쇄 가변 영역 (VH)을 함유하고, 경쇄의 N-말단 영역은 경쇄 가변 영역 (VL)을 함유한다. VH 및 VL 영역은 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 부분을 함유한다. 따라서, IgG 항체의 각각의 아암은 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 표준 IgG 분자에서, IgG 항체의 제1 아암 및 제2 아암 둘 다는 동일한 항원에 결합한다 (둘 다의 아암이 동일한 각각의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 함유한다는 사실로 인해). 표준 IgG 항체는 동일한 2개의 아암을 갖는 것에 기반하여 "동종이량체성"인 것으로 지칭될 수 있다. 본원에 제공된 방법에 따라 정제된 IgG 항체는 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 것일 수 있다.
이중특이적 IgG 항체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제될 수 있는 항체는 이중특이적 IgG 항체이다. 이중특이적 IgG 항체에서, 항체의 2개의 아암의 각각은 상이한 항원에 특이적으로 결합한다. 또한, 이중특이적 IgG 항체의 제1 아암에서의 중쇄의 아미노산 서열은 동일한 이중특이적 IgG 항체의 제2 아암에서의 중쇄의 아미노산 서열과 상이하며, 유사하게, 이중특이적 IgG 항체의 제1 아암에서의 경쇄의 아미노산 서열은 동일한 이중특이적 IgG 항체의 제2 아암에서의 경쇄의 아미노산 서열과 전형적으로 상이하다. 따라서, 이중특이적 IgG 항체는 상이한 2개의 아암을 갖는 것에 기반하여 "이종이량체성"인 것으로 지칭될 수 있다. 이중특이적 IgG 항체의 제1 아암은 "제1 항원"에 대해 특이적인 것으로서 기재될 수 있고, 이중특이적 IgG 항체의 제2 아암은 "제2 항원"에 대해 특이적인 것으로서 기재될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소타입을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 면역학적으로 불활성인 Fc 영역을 포함한다.
이중특이적 IgG 항체 - 제조 방법
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986] 참조). 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기반하며, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539, 1983).
보다 최근, 하기 일반적 단계가 이중특이적 이종이량체성 항체를 제조하기 위해 취해지는 방법이 개발되었다:
1) 제1 동종이량체성 항체 (또한 본원에서 "제1 모체 항체"로 지칭됨) 및 제2 동종이량체성 항체 (또한 본원에서 "제2 모체 항체"로 지칭됨)를 개별적으로 발현하고 정제한다. 제1 동종이량체성 항체는 제조되는 이중특이적 항체의 제1 표적 항원에 대해 특이적이고, 제2 동종이량체성 항체는 제조되는 이중특이적 항체의 제2 표적 항원에 대해 특이적이다. 따라서, 예를 들어, BCMA 및 CD3에 대한 특이성을 갖는 이중특이적 항체를 제조하는 것이 목적인 경우, 모노클로날 항-BCMA 항체 ("제1 모체 항체") 및 모노클로날 항-CD3 항체 ("제2 모체 항체")를 별개로 발현하고 정제한다.
2) 다음으로, 정제된 제1 동종이량체성 / 모체 항체 및 정제된 제2 동종이량체성 / 모체 항체를, 제1 모체 항체로부터의 제1 아암 및 제2 모체 항체로부터의 제2 아암을 함유하는 이종이량체성 이중특이적 항체가 형성되도록, 항체 아암 교환을 촉진시키는 조건 하에서 함께 혼합하고 인큐베이션한다. 이들 조건은 전형적으로 환원 조건, 이어서 산화 조건의 순서를 수반한다. 환원 조건은 동종이량체성 항체의 2개의 중쇄를 함께 보유하는 디술피드 결합의 절단을 촉진시키고, 그에 의해 제1 모체 항체 및 제2 모체 항체 사이의 항체 아암의 스위칭을 허용한다. 그 후, 후속 산화 조건은 새롭게 형성된 이중특이적 항체를 안정화시키는 새로운 디술피드 브릿지를 형성한다. 이중특이적 항체를 생성하기 위한 이러한 일반적 접근법은 도 1에 개요되어 있다. 도 1에서, 제1 모체 항체 ("모체 항체 A"; 회색) 및 제2 모체 항체 ("모체 항체 B"; 흑색)가 도시되며, 이들의 각각은 단일특이적 동종이량체이고, 제1 아암 및 제2 아암을 함유한다. 전형적으로, 제1 모체 항체 및 제2 모체 항체는 상이한 항원에 대해 특이적이다. 그 후, 제1 모체 항체 및 제2 모체 항체를 함께 혼합하고, 환원 및 산화 단계에 노출시키며, 이는 모체 항체 A로부터의 제1 아암, 및 모체 항체 B로부터의 제2 아암, 및 둘 다의 아암의 각각의 특이성을 함유하는 관심의 이중특이적 항체의 형성을 초래한다.
임의로, 항체 중쇄의 아미노산 서열은 이중특이적 항체의 형성을 촉진시키는 하나 이상의 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 하나의 아암의 중쇄는, 제1 힌지 영역에서의 치환된/대체된 아미노산이 형성된 이중특이적 항체의 다른 아암의 힌지 영역에서의 상응하는 아미노산과 반대 전하를 갖도록, 제1 힌지 영역에 아미노산 변형을 함유할 수 있다. 이는, 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)에 기재되어 있다. 또 다른 접근법에서, 목적하는 이종다량체성 또는 이종이량체성 단백질 (예를 들어, 이중특이적 항체)의 형성은 제1 및 제2 이뮤노글로불린-유사 Fc 영역 (예를 들어, 힌지 영역 및/또는 CH3 영역) 사이의 계면을 변경시키거나 조작함으로써 향상된다. 이러한 접근법에서, 이중특이적 항체는 CH3 영역을 함유할 수 있으며, 여기서 CH3 영역은 함께 상호작용하여 CH3 계면을 형성하는 제1 CH3 폴리펩티드 및 제2 CH3 폴리펩티드를 포함하고, CH3 계면 내의 1개 이상의 아미노산은 동종이량체 형성을 불안정화시키며, 동종이량체 형성에 정전기적으로 불리하지 않다. 이러한 접근법은 또한 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)에 기재되어 있다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 상기 방법 및 다른 방법은 추가로 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882), PCT/US2011/036419 (WO2011/143545), 및 문헌 [Giese et al., Biotechnology Progress, "Bispecific Antibody Process Development: Assembly and Purification of Knob and Hole Bispecific Antibodies", 17 Jan 2018], 및 그 안에 인용된 참고문헌에 기재되어 있으며, 이들의 각각은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 항체의 정제를 위한 본원에 제공된 방법은 임의의 적합한 방법에 의해 제조된 이중특이적 항체를 정제하는데 사용될 수 있다.
이중특이적 IgG 항체 - 특이성
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제될 수 있는 항체는 전장 인간 이중특이적 IgG 항체이며, 여기서 이중특이적 항체의 제1 아암의 제1 항체 가변 도메인은 제1 항원에 결합할 수 있고, 이중특이적 항체의 제2 아암의 제2 항체 가변 도메인은 제2 항원에 결합할 수 있다. 제1 항원 및 제2 항원은 본원에 기재된 바와 같은 항원의 임의의 특징을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 항원은 제1 세포 유형 상에 발생하고, 제2 항원은 제2 세포 유형 상에 발생한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제될 수 있는 항체는 전장 인간 이중특이적 IgG 항체이며, 여기서 항체의 제1 항체 가변 도메인은 인간 면역 이펙터 세포 상에 위치한 이펙터 항원에 특이적으로 결합함으로써 인간 면역 이펙터 세포의 활성을 동원할 수 있고, 항체의 제2 항체 가변 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에 제공된 항체에 의해 결합될 수 있는 인간 면역 이펙터 세포는 관련 기술분야에 공지된 다양한 면역 이펙터 세포 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포), B 세포, 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 림프 세포 계통의 구성원일 수 있다. 면역 이펙터 세포는 또한 예를 들어, 단핵구, 호중성 과립구, 및 수지상 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 인간 골수 계통의 구성원일 수 있다. 이러한 면역 이펙터 세포는 표적 세포에 대한 세포독성 또는 세포자멸사 효과 또는 이펙터 항원의 결합에 의한 활성화에 대한 다른 목적하는 효과를 가질 수 있다. 이펙터 항원은 인간 면역 이펙터 세포 상에 발현되는 항원 (예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드)이다. 본원에 제공된 항체에 의해 결합될 수 있는 이펙터 항원의 예는 인간 CD3 (또는 CD3 (분화의 클러스터) 복합체), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64, 및 CD89를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
표적 항원은 질환 상태 (예를 들어, 염증성 질환, 증식성 질환 (예를 들어, 암), 면역학적 장애, 신경학적 질환, 신경변성 질환, 자가면역 질환, 감염성 질환 (예를 들어, 바이러스 감염 또는 기생충 감염), 알레르기 반응, 이식편-대-숙주 질환 또는 숙주-대-이식편 질환)에서의 표적 세포 상에 발현된다. 표적 항원은 이펙터 항원이 아니다. 표적 항원의 예는 BCMA, EpCAM (상피 세포 부착 분자), CCR5 (케모카인 수용체 유형 5), CD19, HER (인간 표피 성장 인자 수용체)-2/neu, HER-3, HER-4, EGFR (표피 성장 인자 수용체), FLT3 (Fms-유사 티로신 키나제 3), PSMA, CEA, MUC-1 (뮤신), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, CIhCG, 루이스-Y, CD20, CD33, CD30, 강글리오시드 GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보 H, 푸코실 GM1, 폴리 SA, GD2, 카르보안히드라제 IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog)), Wue-1, 형질 세포 항원, (막-결합된) IgE, MCSP (흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸), CCR8, TNF-알파 전구체, STEAP, 메소텔린, A33 항원, PSCA (전립선 줄기 세포 항원), Ly-6; 데스모글레인 4, E-카드헤린 네오에피토프, 태아 아세틸콜린 수용체, CD25, CA19-9 마커, CA-125 마커 및 MIS (뮬러관 억제 물질) 수용체 유형 II, sTn (시알릴화 Tn 항원; TAG-72), FAP (섬유모세포 활성화 항원), 엔도시알린, EGFRvIII, LG, SAS 및 CD63을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제된 항체는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 2016년 3월 30일에 출원된 미국 출원 번호 15/085,644 (공개 번호 US20160297885), 또는 2018년 5월 31일에 출원된 미국 출원 번호 15/993,874 (공개 번호 US20180346601)에 기재된 바와 같은 임의의 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제된 항체는 항체의 하나의 아암이 분화의 클러스터 3 (CD3)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체일 수 있다. CD3에 관한 정보는, 예를 들어, 유니프롯KB(UniProtKB) ID # P07766을 통해 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 아미노산 서열: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (서열식별번호: 1)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 중쇄는 아미노산 서열: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCRVRCPRCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열식별번호: 2)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 1에 제시된 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 아미노산 서열: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIK (서열식별번호: 3)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 경쇄는 아미노산 서열: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 4)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 3에 제시된 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CD3-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 중쇄는 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CD3-결합 아암의 경쇄는 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, CD3-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 1에 제시된 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CD3-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 3에 제시된 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제된 항체는 항체의 하나의 아암이 B-세포 성숙 항원 (BCMA)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체일 수 있다. BCMA에 관한 정보는, 예를 들어, 유니프롯KB ID # Q02223을 통해 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 아미노산 서열: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 5)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 중쇄는 아미노산 서열: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCEVECPECPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열식별번호: 6)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 5에 제시된 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 아미노산 서열: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQSWPLTFGQGTKVEIK (서열식별번호: 7)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 경쇄는 아미노산 서열: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQSWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 8)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 7에 제시된 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, BCMA-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 중쇄는 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, BCMA-결합 아암의 경쇄는 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 5에 제시된 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, BCMA-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 7에 제시된 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 아미노산 서열: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 13)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 BCMA에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, BCMA-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 아미노산 서열: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQEWPLTFGQGTKVEIK (서열식별번호: 14)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 항체에 대한 본원에서의 임의의 언급에서, 항체는 대안적으로 서열식별번호: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 항체에 대한 본원에서의 임의의 언급에서, 항체는 대안적으로 서열식별번호: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함할 수 있다. 유사하게, 또한 각각 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14의 VH 및 VL 서열을 함유하는 항-BCMA 중쇄 및 경쇄가 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 정제된 항체는 항체의 하나의 아암이 fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3)에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체일 수 있다. FLT3에 관한 정보는, 예를 들어, 유니프롯KB ID # P36888을 통해 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 아미노산 서열: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 9)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 중쇄는 아미노산 서열: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCEVECPECPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열식별번호: 10)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 9에 제시된 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 아미노산 서열: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIK (서열식별번호: 11)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 경쇄는 아미노산 서열: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 12)를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 11에 제시된 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, FLT3-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 중쇄는 서열식별번호: 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, FLT3-결합 아암의 경쇄는 서열식별번호: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 하나의 아암이 FLT3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 IgG 항체에서, FLT3-결합 아암의 중쇄의 VH 영역은 서열식별번호: 9에 제시된 VH 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, FLT3-결합 아암의 경쇄의 VL 영역은 서열식별번호: 11에 제시된 VL 서열의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항체의 항-BCMA 아암이 항-BCMA 아암에 대해 상기 기재된 특징 중 임의의 것을 갖고, 항체의 항-CD3 아암이 항-CD3 아암에 대해 상기 기재된 특징 중 임의의 것을 갖는 이중특이적 항-BCMA / 항-CD3 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체의 항-FLT3 아암이 항-FLT3 아암에 대해 상기 기재된 특징 중 임의의 것을 갖고, 항체의 항-CD3 아암이 항-CD3 아암에 대해 상기 기재된 특징 중 임의의 것을 갖는 이중특이적 항-FLT3 / 항-CD3 항체가 본원에 제공된다.
또한, 상기 항원 중 임의의 것에 대한 친화성을 갖고/거나, 상기 기재된 아미노산 서열 중 임의의 것을 함유하는 단일특이적 항체를 정제하는 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 또한, 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 VH 아미노산 서열을 포함하는 단일특이적, 동종이량체성 항-CD3 항체의 정제가 본원에 제공된다.
불순물
본원에 제공된 방법은 1종 이상의 불순물로부터 관심의 항체를 정제하는데 사용될 수 있다.
불순물은, 예를 들어, 관심의 항체의 클리핑된 버전, 단백질 응집체, 및 관심의 이중특이적 항체의 경우, 관심의 이중특이적 항체의 형성과 관련된 모 단일특이적 항체를 포함한다. 이들 상이한 불순물은 또한 본원에서 상이한 "불순물의 종", "불순물 분자" 등으로 지칭될 수 있다.
관심의 항체의 클리핑된 버전
"관심의 항체의 클리핑된 버전", "클리핑된 항체" 등은 상응하는 관심의 무손상 항체에 비해 항체에서의 1개 이상의 폴리펩티드 결합이 절단된 재조합 항체를 지칭한다. 대조적으로, "무손상" 항체는 재조합 항체의 모든 예상된 펩티드 결합 및 아미노산을 함유하는 (즉, 항체의 폴리펩티드(들)를 코딩하는 핵산 서열(들)에 기반하여 예상될 것인) 재조합 항체를 지칭한다.
따라서, 클리핑된 항체는 관심의 항체와 관련된 분해 산물인 것으로 간주될 수 있다. 항체에서의 펩티드 결합의 절단은, 예를 들어, 효소적 (예를 들어 프로테아제-매개된) 또는 비-효소적 활성을 통해 일어날 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체의 폴리펩티드에서의 펩티드 결합이 절단되는 경우, 절단 후, 폴리펩티드 쇄의 절단된 부분은 항체의 나머지에 더 이상 공유적으로 연결되지 않을 수 있으며; 그 경우, 폴리펩티드 쇄의 절단된 부분은 항체의 나머지로부터 해리될 수 있다. 이는 가장 통상적으로 절단이 폴리펩티드 쇄의 N 또는 C 말단 부근의 펩티드 결합에 있는 경우 발생하며, 이는 상응하는 무손상 항체에 비해 1개 이상의 아미노산을 소실한 클리핑된 항체를 초래한다. 이들 클리핑된 항체는 항체로부터의 1개 이상의 아미노산의 소실로 인해 상응하는 무손상 항체보다 더 적은 질량을 갖는다.
대안적으로, 일부 다른 실시양태에서, 항체의 폴리펩티드에서의 펩티드 결합이 절단되는 경우, 절단 후, 폴리펩티드 쇄의 절단된 부분은 항체의 나머지에 여전히 공유적으로 연결되어 잔류할 수 있다 (예를 들어, 쇄내 또는 쇄간 디술피드 결합에 의해). 이러한 경우, 항체의 펩티드 결합의 절단이 있더라도, 폴리펩티드 쇄의 절단된 부분은 폴리펩티드 쇄의 절단된 부분을 항체의 나머지에 연결하는 잔류 무손상 공유 결합(들)을 통해, 항체의 나머지에 테더링되어 잔류할 것이다. 이러한 상황에서, 클리핑된 항체는 무손상 항체에 비해 여전히 동일한 수의 아미노산 및 아미노산 서열을 가질 것이다. 또한, 적어도 일부 실시양태에서, 이러한 유형의 클리핑된 항체는 상응하는 무손상 항체보다 약간 더 큰 질량을 가질 수 있다. 이러한 질량의 획득은, 예를 들어, 펩티드 결합의 절단 시 일어나는 하나 이상의 화학 반응의 결과일 수 있다. 이러한 반응 동안, 1개 이상의 원자 (예를 들어 H, O)는 항체 폴리펩티드 쇄의 원자와 반응할 수 있고, 항체 쇄에 공유적으로 연결되며, 이는 상응하는 무손상 항체에 비해 클리핑된 항체에 의한 질량의 획득을 초래한다.
"클리핑된" 항체는 상응하는 "무손상" 항체로부터 생성되기 때문에, 항체의 "클리핑된" 버전은 항체의 상응하는 "무손상" 버전과 동일한 아미노산 서열 (펩티드 결합 절단의 결과로서 항체로부터의 아미노산의 소실이 없는 경우) 또는 거의 동일한 아미노산 서열 (펩티드 결합 절단의 결과로서 항체로부터의 1개 이상의 아미노산 서열의 소실의 경우)을 갖는다.
전형적으로, 항체의 클리핑된 버전은 상응하는 무손상 항체의 질량과 유사한 질량을 갖는다. 상기 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 클리핑된 항체는 상응하는 무손상 항체보다 더 적은 질량을 가질 수 있다 (예를 들어, 클리핑이 항체로부터의 1개 이상의 아미노산의 소실을 초래하는 경우). 대안적으로, 일부 실시양태에서, 클리핑된 항체는 상응하는 무손상 항체보다 더 큰 질량을 가질 수 있다 (클리핑이 항체로부터의 임의의 아미노산의 소실을 초래하지 않고, 대신, 펩티드 결합의 절단의 결과로서 일어나는 하나 이상의 반응을 통해 항체에 의한 적어도 원자의 획득을 초래하는 경우).
일부 실시양태에서, 항체의 클리핑된 버전은 상응하는 관심의 무손상 항체의 질량과 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01% 이하 상이한 질량을 갖는다. 달리 말하면, 일부 실시양태에서, 관심의 항체의 클리핑된 버전은 상응하는 관심의 무손상 항체의 질량과 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 이하 상이한 질량을 갖는다.
상기 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 관심의 항체의 클리핑된 버전은 상응하는 관심의 무손상 항체보다 더 적은 질량을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체의 클리핑된 버전은 상응하는 관심의 무손상 항체의 질량보다 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01% 이하 더 적은 질량을 갖는다. 다시 말해서, 항체의 클리핑된 버전이 상응하는 관심의 무손상 항체의 질량보다 10% 이하 더 적은 질량을 갖는 경우, 예를 들어, 관심의 무손상 항체가 100,000 Da의 질량을 갖는 경우, 항체의 클리핑된 버전은 그보다 10,000 Da (100,000의 10%는 10,000임) 이하 더 적은 질량을 갖는다 - 즉, 이는 90,000 내지 100,000 Da의 질량을 갖는다.
또한 상기 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 관심의 항체의 클리핑된 버전은 상응하는 관심의 무손상 항체보다 더 큰 질량을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체의 클리핑된 버전은 상응하는 관심의 무손상 항체의 질량보다 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 이하 더 큰 질량을 갖는다. 다시 말해서, 항체의 클리핑된 버전이 상응하는 관심의 무손상 항체의 질량보다 1% 이하 더 큰 질량을 갖는 경우, 예를 들어, 관심의 무손상 항체가 100,000 Da의 질량을 갖는 경우, 항체의 클리핑된 버전은 그보다 1,000 Da (100,000의 1%는 1,000임) 이하 더 큰 질량을 갖는다 - 즉, 이는 100,000 내지 101,000 Da의 질량을 갖는다.
고분자 질량 종 (HMMS) / 단백질 응집체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법과 관련된 불순물은 "고분자 질량 종" (HMMS)으로 지칭된다. HMMS는 임의의 고분자 질량 오염물 또는 불순물을 지칭하지만, 전형적으로 응집체를 형성하는 적어도 2종의 단백질의 회합물이다. 예로서, HMMS는 함께 응집된 관심의 항체의 다수의 분자 및/또는 관심의 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포로부터의 단백질의 응집체를 포함할 수 있다. 응집체는, 예를 들어, 분자의 공유 또는 비-공유 연결을 비롯한 임의의 프로세스에 의해 발생할 수 있다.
모 항체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법과 관련된 불순물은 "모체 항체", 또는 "모 항체" 등이다. 이러한 유형의 불순물 분자는 관심의 항체가 예를 들어, 도 1에 개요된 바와 같은 2종의 상이한 모체 항체로부터 생성된 이중특이적 항체인 본원에 제공된 방법과 관련된다. 이들 모체 항체는 단일특이적, 동종이량체이다. 모체 항체는 다수의 가능한 메커니즘으로 인해 관심의 이중특이적 항체를 갖는 항체 제제에 존재할 수 있으며, 예컨대: i) 일부 상황에서, 일부 모체 항체 분자는 모체 항체를 별개의 제1 아암 및 제2 아암으로 분리하는 환원 단계 동안 제1 아암 및 제2 아암으로 분리되지 않거나 (그리고 따라서, 항체는 단일특이적 동종이량체로서 잔류함); ii) 일부 상황에서, 동일한 유형의 모체 항체로부터의 분리된 제1 아암 및 제2 아암은, 이들이 단일특이적 동종이량체를 형성하도록 함께 연결된다 (이종이량체 이중특이적 항체를 형성하는데 수반되기보다는). 본원에 사용된 바와 같은 "모체 항체"는 상기 메커니즘 중 임의의 것에 의해 발생하는 동종이량체성 분자를 지칭한다. 또한, 본원에 제공된 바와 같은 항체 제제는 하나 또는 둘 다의 모체 종으로부터의 모체 항체를 불순물로서 함유할 수 있다.
불순물로부터의 관심의 항체의 정제
1종 이상의 불순물로부터 관심의 항체를 정제하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 관심의 항체는 관심의 항체, 뿐만 아니라 불순물 분자의 1종 이상의 종을 함유하는 항체 제제 (또한 본원에서 "출발 샘플"로 지칭됨) 중에 있다. 본원에 제공된 바와 같은 방법을 위한 이러한 출발 물질에서, 관심의 항체는, 예를 들어, 질량 기준으로 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 항체 제제 중 단백질을 구성할 수 있다. 그 후, 본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 정제된 분획 (또한 본원에서 "정제된 샘플"로 지칭됨)은 HA 수지로부터의 용리액으로서 수집된다. 이러한 정제된 분획은 관심의 항체를 함유하고, 일부 실시양태에서, 여전히 1종 이상의 불순물 분자를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 정제된 분획에서, 관심의 항체는, 예를 들어, 질량 기준으로 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 정제된 분획 중 단백질을 구성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 출발 샘플은 질량 기준으로 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 관심의 항체이고, 동일한 방법에서 후속 정제된 샘플은 질량 기준으로 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 관심의 항체이며, 여기서 두번째 값은 첫번째 값보다 더 크다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 출발 샘플은 질량 기준으로 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%의 관심의 항체의 클리핑된 버전을 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 정제된 샘플은 질량 기준으로 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 또는 20% 이하의 관심의 항체의 클리핑된 버전을 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 출발 샘플은 질량 기준으로 적어도 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%의 관심의 항체의 클리핑된 버전을 함유하고, 동일한 방법에서 후속 정제된 샘플은 질량 기준으로 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 또는 20% 이하의 관심의 항체의 클리핑된 버전을 함유하며, 여기서 두번째 값은 첫번째 값보다 더 작다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 출발 샘플은 관심의 무손상 항체 및 관심의 항체의 클리핑된 버전을 함유하며, 여기서 클리핑된 항체 대 무손상 항체의 비는 적어도 약 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 1:10, 1:5, 1:4, 또는 1:3이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 정제된 샘플은 관심의 무손상 항체 및 관심의 항체의 클리핑된 버전을 함유하며, 여기서 클리핑된 항체 대 무손상 항체의 비는 약 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 또는 1:10 이하이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 출발 샘플은 관심의 무손상 항체 및 관심의 항체의 클리핑된 버전을 함유하며, 여기서 출발 샘플 중 클리핑된 항체 대 무손상 항체의 비는 적어도 약 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 1:10, 1:5, 1:4, 또는 1:3이고, 여기서 후속 정제된 샘플 중 클리핑된 항체 대 무손상 항체의 비는 동일한 방법에서 약 1:200, 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 또는 1:10 이하이고, 두번째 비는 첫번째 비보다 더 작다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에서, 출발 샘플은 관심의 무손상 항체 및 관심의 항체의 클리핑된 버전을 함유하며, 여기서 출발 샘플 중 클리핑된 항체 대 무손상 항체의 비는 약 군 A에서의 비 중 하나 (군 A 비: 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 1:10, 1:5, 또는 1:4) 내지 군 B에서의 비 중 하나 (군 B 비: 1:50, 1:25, 1:20, 1:10, 1:5, 1:4 또는 1:3)이고, 여기서 동일한 방법에서 후속 정제된 샘플 중 클리핑된 항체 대 무손상 항체의 비는 약 1:200, 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 또는 1:10 이하이고, 정제된 샘플 중의 비는 출발 샘플 중에서보다 더 작다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 제공된 출발 샘플은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 또는 10,000 그램의 관심의 무손상 항체를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 제공된 정제된 샘플은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 또는 10,000 그램의 관심의 무손상 항체를 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법에 따라 제공된 출발 샘플은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 또는 10,000 그램의 관심의 무손상 항체를 함유하고, 동일한 방법에서 후속 정제된 샘플은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 또는 5000 그램의 관심의 무손상 항체를 함유하며, 여기서 첫번째 값은 두번째 값보다 더 크다.
또한, 출발 샘플 또는 정제된 샘플에서의 관심의 항체의 a) 양 또는 b) 순도에 관한 임의의 상기 설명은 동일한 샘플을 참조로 함께 취해질 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이, 출발 샘플은 질량 기준으로 적어도 약 80%의 관심의 항체를 함유할 수 있고; 또한, 상기 또한 언급된 바와 같이, 출발 샘플은 적어도 약 10 그램의 관심의 항체를 함유할 수 있다. 따라서, 또한, 질량 기준으로 적어도 약 80%의 관심의 항체, 및 적어도 10 그램의 관심의 항체 등을 함유하는 출발 샘플이 본원에 제공된다.
일반적 기법
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면 관련 기술분야의 기술 내인 분자 생물학 (재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 채용할 것이다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)] 뿐만 아니라 적용가능한 바에 따라 상기 참고문헌의 후속 판 및 상응하는 웹사이트에 충분히 설명되어 있다.
하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사실, 본원에 제시되고 기재된 것들 외에도 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이며, 첨부된 청구범위의 범위 내에 해당된다.
실시예
실시예 1: cHA 수지 크로마토그래피에 의한 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체의 정제
목적:
이 실시예에서, 다양한 불순물로부터 관심의 전장 이중특이적 인간 IgG를 분리하는 방법을 조사하였다. 관심의 항체는 이종이량체성 이중특이적 항-BCMA / 항-CD3 항체였다 (즉, 이중특이적 항체의 하나의 아암은 BCMA에 대해 특이적이고, 다른 아암은 CD3에 대해 특이적이었음). 정제의 시작 시에 관심의 이중특이적 항체와 함께 존재하는 불순물은 i) 관심의 무손상 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체의 클리핑된 버전; ii) 동종이량체성, 단일특이적 항-BCMA 모체 항체; iii) 동종이량체성, 단일특이적 항-CD3 항체; 및 iv) 단백질 응집체 / 고분자 질량 종 (HMMS)을 포함하였다.
이중특이적 항체의 클리핑된 버전으로부터의 관심의 무손상 이중특이적 항체의 정제는 특별한 도전을 제시하였는데, 이는 이중특이적 항체의 클리핑된 버전이 관심의 무손상 이중특이적 항체와 동일한 수의 아미노산 및 동일한 아미노산 서열을 함유하였고, 무손상 이중특이적 항체의 질량과 단지 18 달톤 (Da) 상이하였기 때문이다. 구체적으로, 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체의 질량은 148095.5 Da인 반면, 이중특이적 항체의 상응하는 클리핑된 버전의 질량은 148113.5이다 (질량 분광법에 의해 측정됨). 따라서, 클리핑된 이중특이적 항체는 무손상 이중특이적 항체의 질량에 비해 0.1% 미만 (심지어 0.02% 미만)의 질량의 차이를 갖는다 (즉, 148095 Da의 0.1%는 148 Da이고; 148095 Da의 0.02%는 29.6 Da임). 달리 말하면, 클리핑된 이중특이적 항체의 질량은 관심의 무손상 이중특이적 항체의 약 100.01%이다. 따라서, 클리핑된 이중특이적 항체의 질량은 관심의 무손상 이중특이적 항체의 그것과 매우 유사하다.
이중특이적 항체의 클리핑된 버전은 중쇄 내의 제56 및 제57 아미노산 사이에 항-CD3 중쇄의 펩티드 결합에서의 절단을 함유한다. 항-CD3 중쇄는 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 따라서, 절단은 서열식별번호: 2의 "RG" 서열에서의 아미노산 R 및 G 사이에서 일어난다 ("RG"는 단지 서열식별번호: 2에서 1회 발생함). 이러한 절단은 무손상 이중특이적 항체에 비해 (18 Da의 질량의 획득에 상응할) 클리핑된 이중특이적 항체에서의 1개의 산소 원자 및 2개의 수소 원자의 획득을 초래한다고 믿어진다. 또한, 항-CD3 중쇄 내에 절단된 펩티드 결합이 있지만, 중쇄의 절단된 56-아미노산 부분 (즉, 쇄의 최초 56개의 아미노산)은 무손상, 잔류 쇄내 디술피드 결합을 통해 항체의 나머지에 결합하여 잔류한다. 쇄내 디술피드 결합은 항-CD3 중쇄의 C22 및 C98 (즉, 서열식별번호: 2에 제시된 서열의 C22 및 C98) 사이이다. 쇄내 펩티드 결합에 의한 항체의 나머지에의 절단된 56-아미노산 부분의 계속된 테더링을 도 2에 개략적으로 제시되어 있다.
도 2에서, 좌측 상의 개략도는 이중특이적 항체의 항-CD3 및 항-BCMA 아암 둘 다에 대한 무손상 중쇄 및 경쇄를 함유하는 관심의 무손상 이중특이적 항체를 도시한다 (도면에서, 보다 긴 쇄는 항체의 중쇄를 나타내고, 보다 짧은 쇄는 경쇄를 나타냄). 또한, 도 2는 또한 쇄내 디술피드 결합 (예를 들어 동일한 경쇄 또는 중쇄 내의 상이한 아미노산을 연결함), 뿐만 아니라 쇄간 디술피드 결합 (예를 들어 항-BCMA 아암의 중쇄를 항-CD3 아암의 중쇄에 연결하거나, 항-CD3 아암의 경쇄를 항-CD3 아암의 중쇄에 연결함)을 비롯한 다양한 항체내 디술피드 결합을 제시한다.
다양한 불순물로부터 관심의 무손상 이중특이적 항체를 정제하는 방법을 개발하는데 있어서 제시된 또 다른 도전은 상대적으로 다량의 관심의 이중특이적 항체가 정제되어야 했던 경우 불순물로부터 관심의 이중특이적 항체를 효과적으로 분리할 방법을 개발하는 목적이었다. 예를 들어, 본 실시예와 관련된 작업의 하나의 목적은 적어도 1 그램의 이중특이적 항체가 정제되어야 했던 방법에 효과적일 이중특이적 항체의 정제를 위한 방법을 개발하는 것이었다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 대규모로의 단백질의 정제는, 예를 들어, 대규모로 크로마토그래피를 수행하는 경우 상이한 단백질 사이의 샤프한 크로마토그래피 분해를 얻는데 있어서의 곤란함으로 인해, 소규모로의 동일한 단백질의 정제 동안 존재하지 않는 (또는 상당히 덜 문제가 되는) 다수의 곤란함을 빈번히 나타낸다.
물질 및 방법:
이 작업을 위한 출발 물질은 관심의 이중특이적 IgG 항-BCMA/CD3 항체, 뿐만 아니라 다양한 불순물, 예컨대 상기 언급된 것들을 함유하는 항체 제제였다. 이중특이적 항체의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기 서열식별번호에 제시된다: BCMA 중쇄: 서열식별번호: 6; BCMA 경쇄: 서열식별번호: 8; CD3 중쇄: 서열식별번호: 2; CD3 경쇄: 서열식별번호: 4. 관심의 이중특이적 항체를 본원에서 이전에 기재된 바와 같이 2가지 별개의 모체 항체로부터 제조하였다. 보다 구체적으로, 모체 단일특이적 항-CD3 및 항-BCMA 항체를 단백질-A 크로마토그래피를 통해 정제하고, 이들 정제된 모체 단일특이적 항-CD3 및 항-BCMA 항체를 사용하여 관심의 이중특이적 항-BCMA/CD3 항체를 생성하였다. 그 후, 생성된 이중특이적 항-BCMA/CD3 항체를 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 본 실시예에서 정제 작업을 위한 출발 물질로서 사용된 항체 제제를 이온 교환 칼럼으로부터 용리하였으며, 이는 관심의 이중특이적 항체 및 다양한 잔류 불순물을 함유하였고, 이는 50 mM 트리스 및 60 mM 글리신, pH 7.5의 대략적 농도의 완충액 / 염을 가졌다. 항체 제제는 질량 기준으로 85% 초과의 관심의 무손상 이중특이적 항체를 함유하였으며; 이는 또한 약 8% 클리핑된 이중특이적 항체, 약 1% 단일특이적 항-BCMA 모체 항체, 약 1% 단일특이적 항-CD3 모체 항체, 및 약 2% 단백질 응집체 / 고분자 질량 종 (HMMS)을 함유하였다. 따라서, 이러한 방법에서 출발 물질로서 사용된 항체 제제는 이미 상대적으로 순수한 관심의 무손상 이중특이적 항체를 함유하였지만, 이러한 방법의 목적은 무손상 이중특이적 항체의 순도를 증가시키는 방법을 개발하는 것이었다.
결과:
클리핑된 이중특이적 항체, 단일특이적 모체 항체, 및 단백질 응집체로부터 관심의 무손상 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 효과적인 정제를 허용할 적합한 수지 및 완충액 조건을 확인하려고 시도하기 위해, 다수의 상이한 크로마토그래피 수지 및 조건을 시험하였다. 이러한 프로세스 동안, 예를 들어, 다수의 상이한 이온-교환 및 소수성 상호작용 수지, 뿐만 아니라 다양한 완충액 및 pH 조건을 시험하였다. 광범위한 시험 후, 히드록시아파타이트 수지는 클리핑된 이중특이적 항체를 비롯한 다양한 불순물로부터 무손상 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 효과적인 정제를 허용할 수 있는 유일한 확인된 수지였다.
도 3은 세라믹 히드록시아파타이트 ("cHA") 수지 칼럼으로부터의 관심의 이중특이적 항체의 용리, 및 이중특이적 항체의 클리핑된 버전, 둘 다의 모체 항체 종, 및 고분자 질량 단백질 종을 비롯한 다수의 상이한 불순물로부터의 관심의 항-BCMA/CD3 이중특이적 항체의 공동 분리의 크로마토그래피 프로파일을 제시한다. 도 3에 도시된 크로마토그래피 실행을 위해, cHA 수지 상에 로딩된 항체 제제를, cHA 칼럼으로부터의 이들 분자의 용리의 위치를 보다 명확히 확인하기 위해, 가외의 모체 항-BCMA 및 모체 항-CD3 항체로 스파이킹하였다 (그러나, 가외의 무손상 또는 클리핑된 이중특이적 항체는 첨가하지 않았음). 도 3에서, X-축은 좌측에서 우측으로 cHA 칼럼으로부터의 용리액의 순서를 나타낸다 (즉, 좌측의 물질은 우측의 물질보다 더 빨리 / 더 낮은 염에서 cHA 칼럼으로부터 용리됨). 전형적으로, 용리액은 칼럼으로부터 순차적 분획에서 수집되며; 따라서, X-축은 또한 cHA 수지 칼럼으로부터의 용리액 분획의 순서를 나타내는 것으로 간주될 수 있다. Y-축은 그래프에서 별개로 언급된 바와 같은 UV 흡광도 (280 nM에서) 및 전도율 둘 다를 나타낸다. UV 흡광도는 용리된 단백질의 존재에 상응하고, 전도율은 용리된 물질 중의 염 농도에 상응한다. 따라서, 도 3은 cHA 수지를 통해 유동하는 용리 완충액 중 염 농도가 증가함에 따라, cHA 수지 칼럼으로부터의 상이한 단백질의 용리의 프로파일을 도시한다. 좌측에서 우측으로 도 3에서의 UV 그래프 다음에, 그래프는 관심의 무손상 이중특이적 항-BCMA / CD3 항체, 또는 다양한 불순물 중 어느 하나에 상응하는 다양한 피크 및 숄더를 제시한다. 구체적으로, 좌측에서 우측으로, 제1 UV 피크는 제1 모체 항체 ("모체 1"; 단일특이적 항-BCMA 동종이량체)의 용리에 상응한다. 후속 주요 피크 (및 그래프에서 가장 큰 피크)의 초기 부분은 관심의 무손상 이중특이적 항체 단백질 ("POI")에 상응한다. 그 동일한 주요 피크의 나중 / 꼬리 단부는 이중특이적 항체의 클리핑된 버전 ("클립")에 상응한다. 클리핑된 이중특이적 항체에 비해 무손상 이중특이적 항체의 용리 프로파일 사이에 일부 중첩이 있지만, 이들 2가지 항체 유형은 이중특이적 항체의 클리핑된 버전으로부터 무손상 이중특이적 항체를 유의하게 분리하기 위해, 충분히 상이한 염 조건 및 분획 하에서 cHA 칼럼으로부터 용리한다. 마지막으로, 이중특이적 항체의 클리핑된 버전이 용리한 후, cHA 칼럼으로부터의 마지막 주요 피크 / 숄더는 cHA 칼럼으로부터의 제2 모체 항체 (단일특이적 항-CD3 동종이량체), 뿐만 아니라 고분자 질량 종 ("HMMS")(또한 단백질 응집체로 지칭됨)의 용리에 상응한다. 따라서, 도 3의 그래프는 무손상 항-BCMA / CD3 항체가 cHA 수지 크로마토그래피에 의해 관련된 클리핑된 및 모 항체 종을 비롯한 다수의 불순물로부터 효과적으로 정제될 수 있음을 제시한다.
도 4는 도 3에 도시된 cHA 용리 프로파일에 따라 cHA 수지 칼럼으로부터의 순차적으로 용리된 분획에 존재하는 상이한 분자 종에 관한 보다 상세한 정보를 제시하는 그래프를 제공한다. 구체적으로, 도 4는 cHA 칼럼으로부터 용리된 상이한 분획 중의 i) 관심의 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체 단백질 ("POI"); ii) 이중특이적 항체의 클리핑된 버전; iii) 제1 모체 항체 / 단일특이적 항-BCMA 항체; iv) 제2 모체 항체 / 단일특이적 항-CD3 항체; 및 v) 고분자 질량 종 ("HMMS")의 상대량에 관한 상세한 정보를 제공한다. 도 4의 X-축은 좌측에서 우측으로 cHA 칼럼으로부터의 용리액의 순서를 나타낸다 (즉, 낮은 염에서 높은 염으로; 각각의 데이터 포인트는 칼럼으로부터 용리된 분획을 지시함). 도 4의 Y-축은 좌측 상에 각각의 분획에서의 i) 관심의 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체 단백질 ("POI"); ii) 이중특이적 항체의 클리핑된 버전; iii) 제1 모체 항체 / 단일특이적 항-BCMA 항체; 및 iv) 제2 모체 항체 / 단일특이적 항-CD3 항체의 각각의 백분율을 나타낸다. 도 4의 Y-축은 우측 상에 각각의 분획에서의 % HMMS를 나타낸다.
도 3에서의 데이터를 생성하는데 사용된 바와 같은 방법을 또한 임의의 추가의 항체로 스파이킹되지 않은 항체 제제와 함께 사용하였으며; 이러한 크로마토그래피 실행으로부터의 데이터를 도 5에 제시한다. 따라서, 도 5에서의 데이터는 주로 관심의 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체, 뿐만 아니라 이중특이적 항체의 클리핑된 버전을 비롯한 다양한 불순물을 함유하는, 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체의 제조 동안 이온 교환 칼럼으로부터 용리된 전형적인 항체 제제의 cHA 수지를 통한 정제를 반영한다. 도 5에서, X-축은 좌측에서 우측으로 cHA 칼럼으로부터의 용리된 물질의 순서를 나타낸다. Y-축은 그래프에서 개별적으로 언급된 바와 같은 UV 흡광도 (280 nM에서) 및 전도율 둘 다를 나타낸다. 모체 1 및 모체 2 피크는 도 3에서보다 도 5에서 더 작은데, 이는 도 5에 대해 cHA 칼럼 상에 로딩된 샘플이 추가의 모체 1 및 모체 2 항체로 스파이킹되지 않았기 때문이다 (반면 도 3에 대해, 샘플은 추가의 모체 1 및 모체 2 항체로 스파이킹되었음).
도 6은 cHA 수지로부터의 관심의 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체의 회수율, 뿐만 아니라 cHA 수지로부터의 다양한 용리된 분획 중의 클리핑된 이중특이적 항체의 상대량에 관한 추가의 정보를 제시하는 그래프를 제공한다. X-축은 좌측에서 우측으로 cHA 칼럼으로부터의 용리액의 순서를 나타낸다 (즉, 낮은 염에서 높은 염으로; 각각의 데이터 포인트는 칼럼으로부터 용리된 분획을 지시함). 수직 / Y-축을 따라, 3개의 상이한 변수가 각각의 분획에 대해 플롯팅된다: 변수 1)(마름모): 크로마토그래피 실행에서 그 분획을 통해 cHA 칼럼으로부터 회수된 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체 (즉, 관심의 단백질)의 총량인 누적 무손상 이중특이적 항체 회수율 ("% POI") (달리 말하면, 이는 그 분획을 포함하여 그 이하의 실행 동안 cHA 칼럼으로부터 용리된 모든 물질이 수집되고 풀링되고, 그 후 그 풀링된 물질 중의 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체의 총량이 측정되는 것과 같음); 또한 "% POI" 값은 회수된 cHA 칼럼 상에 로딩된 관심의 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체 / 단백질의 총량의 백분율로서 제시됨 (즉, 그램으로의 값으로서 제시된다기보다는). 변수 2)(정사각형): 클리핑된 이중특이적 항체인 각각의 분획 중의 단백질의 % ("% 클립"). 변수 3)(삼각형): 크로마토그래피 실행에서 그 분획을 통해 cHA 칼럼으로부터 회수된 클리핑된 이중특이적 항체의 총량인 누적 클리핑된 이중특이적 항체 회수율 ("누적 클립"). 또한, 도 6 그래프에서, 좌측 Y-축은 % POI에 대한 값을 열거하고, 우측 Y-축은 % 클립에 대한 값을 열거한다.
도 6은 또한 도 6에서의 특정 상이한 분획이 도 5에 제시된 바와 같은 크로마토그래피 프로파일에서 UV 흡광도에서의 상이한 포인트에 얼마나 상응하는지를 제시하는 정보를 함유한다. 따라서, 예를 들어, 도 5는 cHA 수지로부터의 UV 흡광도 / 단백질 용리의 가장 큰 피크가 관심의 단백질 / 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체에 상응함을 제시한다. cHA 칼럼으로부터의 UV 흡광도 / 단백질 용리의 이러한 큰 피크의 상부는 또한 실행의 "정점"으로 지칭되며; 이러한 정점 포인트에 상응하는 크로마토그래피 분획 피크는 도 6 상에 언급된다. 그 후, 정점 피크 뒤의 다양한 포인트는 또한 도 6에 표시된다. 이들 포인트는 "90%", "80%", "70%", "60%", 및 "50%"이며, 이들은 하기와 같이 계산된다. 정점에서의 UV 흡광도 값을 추가의 계산을 위한 시작 포인트로서 설정한다. 그 후, 정점 UV 값의 90%인 UV 값을 측정한다. 정점 UV 값이 크로마토그래피 실행 동안 달성된 후에 (즉, 피크의 꼬리 단부를 향해) 발생하는 90% 정점 UV 값은 "90%" 분획으로서 언급되며; 이는 또한 본원에서 "90% 피크 정점 후" 분획 등으로 지칭될 수 있다. 이러한 프로세스를 80%, 70%, 60%, 및 50% 값에 대해 반복한다 (즉, 이들 값의 각각은 피크로부터의 꼬리 단부 더 아래에 있으며, 따라서 수집된 물질의 점점 더 많은 양을 나타냄). 도 6이 제시된 바와 같이, 정점 값의 %가 감소함에 따라, 분획에서의 % 클립은 증가한다. 이는 클리핑된 이중특이적 항체가 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체보다 더 나중에 / 더 높은 염 조건 하에서 cHA 칼럼으로부터 용리하는 프로세스와 일치한다. 따라서, 정점 피크의 보다 큰 분획이 수집되는 경우 (즉, 보다 낮은 % 피크 정점 후 분획에 대해), 무손상 이중특이적 항체 및 클리핑된 이중특이적 항체의 용리 프로파일 사이의 부분적 중첩으로 인해 보다 많은 클리핑된 이중특이적 항체가 또한 수집될 것이다.
도 6으로부터의 다양한 값을 또한 하기 표 1에 제공한다. 표 1에 제시된 바와 같이, 본원에 제공된 cHA 정제 방법에 따라, 예를 들어, cHA 칼럼으로부터의 90% 피크 정점 후 용리액이 수집되는 경우 (즉, "90% 피크 정점 후" 분획을 통한 POI % 회수), cHA 칼럼 상에 로딩된 관심의 무손상 이중특이적 항체 / 단백질의 54%가 회수되고, 이러한 회수된 단백질 풀은 0% 클리핑된 이중특이적 항체를 함유한다. 또 다른 예에서, cHA 칼럼으로부터의 50% 피크 정점 후 용리액이 수집되는 경우 (즉, "50% 피크 정점 후" 분획을 통한 POI % 회수), cHA 칼럼 상에 로딩된 관심의 무손상 이중특이적 항체 / 단백질의 74%가 회수되고, 이러한 회수된 단백질 풀은 0.2% 클리핑된 이중특이적 항체를 함유한다. 따라서, 도 6 및 표 1에 제시된 바와 같이, 클리핑된 이중특이적 항체로부터의 관심의 무손상 이중특이적 항체의 왕성한 정제는 cHA 수지를 통해 효과적으로 달성될 수 있다.
표 1
도 3-6에 제시된 바와 같은 cHA 크로마토그래피 결과에 대해, cHA 크로마토그래피를 하기와 같이 수행하였다. 관심의 이중특이적 항-BCMA / CD3 항체 및 다양한 불순물을 함유하는 항체 제제를 cHA 수지를 함유하는 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩하였다. cHA 수지는 cHA 유형 1, 40 μM 비드 크기 (바이오-라드)였다. 도 3 및 4에 도시된 크로마토그래피 실행을 위해, cHA 수지를 30 g/L의 cHA 수지에 대한 단백질 밀도로 샘플로 로딩하였다. 도 5 및 6에 도시된 크로마토그래피 실행을 위해, cHA 수지를 10 g/L의 cHA 수지에 대한 단백질 밀도로 샘플로 로딩하였다. 샘플을 cHA 수지 상에 로딩하기 전에, 수지를 5 칼럼 부피의 평형화 완충액 1, 이어서 5 칼럼 부피의 평형화 완충액 2로 사전-평형화하였다. 이러한 방법에 기재된 다양한 완충액의 조성을 하기 표 2에 열거한다. 부분적으로 정제된 관심의 이중특이적 항-BCMA / CD3 항체를 함유하는 항체 제제를 대략 50 mM 트리스 및 60 mM 글리신, pH 7.5를 함유하는 로드 완충액 중 cHA 수지 칼럼 상에 로딩하였다. 항체 제제를 cHA 수지 칼럼 상에 로딩한 후, 칼럼을 그 후 3 칼럼 부피의 세척 완충액으로 세척하였다. 그 후, 관심의 이중특이적 항체 (즉, 무손상 이중특이적 항체)를 용리 완충액 중 인산나트륨 농도가 용리의 과정에 걸쳐 40 mM에서 80 mM로 증가된 20 칼럼 부피의 용리 완충액을 사용하여 cHA 수지로부터 용리하였다. 도 3-6에 제시된 바와 같이, 관심의 이중특이적 항체를 갖는 항체 제제에 존재하였던 다양한 불순물은 또한 용리 완충액에 반응하여 cHA 칼럼으로부터 용리하였지만, 이들은 무손상 이중특이적 항체가 무손상 이중특이적 항체의 클리핑된 버전을 비롯한 다양한 불순물로부터 효과적으로 분리될 수 있도록, 관심의 무손상 항-BCMA / CD3 이중특이적 항체로부터 충분히 상이한 염 농도 하에서 그렇게 한다.
관심의 단백질을 상기 기재된 프로토콜에 따라 용리 완충액에 의해 cHA 수지 칼럼으로부터 용리한 후, cHA 수지를 그 후 5 칼럼 부피 스트립 완충액으로 스트리핑하고, 이어서 5 칼럼 부피 위생화 완충액, 이어서 5 칼럼 부피의 저장 완충액으로 위생화하였다.
cHA 칼럼으로부터 용리된 상이한 물질의 각각의 상기 분석을 위해, 다양한 분획 / 풀 중의 상이한 분자 종의 유형 및 양을 분석적 양이온 교환 (CEX) 분석에 의해 측정하였다.
표 2
실시예 2: cHA 수지 크로마토그래피에 의한 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체의 정제 - 질량 로딩 챌린지
목적:
이 실시예에서의 목적은 실시예 1에 기재된 이중특이적 항체 정제 방법이 다양한 cHA 수지 칼럼 질량 로딩 챌린지와 함께 효과적으로 사용될 수 있는지 여부를 측정하는 것이었다. 예를 들어, 구체적인 목적은 cHA 수지 칼럼 상의 다양한 질량 로딩 챌린지에 대해, 투입 이중특이적 항체의 50% 초과를 일관되게 회수하면서, 동시에 회수된 정제된 이중특이적 항체 산물에서 불순물로서 1% 이하의 클리핑된 이중특이적 항체를 갖는 것이 가능할 것인지 여부를 측정하는 것이었다.
물질 및 방법:
이 실시예에 대한 물질 및 방법은, cHA 수지를 8 g/L, 10 g/L, 또는 12 g/L의 cHA 수지에 대한 단백질 밀도로 (상이한 크로마토그래피 실행에서) 항체 제제 샘플로 로딩한 것을 제외하고는, 실시예 1에서와 동일하였다.
결과:
이들 크로마토그래피 실행으로부터의 결과를 하기 표 3에 요약한다. 모든 3개의 크로마토그래피 실행에 대해, 90% 피크 정점 후 물질 (실시예 1에 기재된 바와 같음)을 수집하고, 분석하였다. 표 3에 제시된 바와 같이, 8 g/L, 10 g/L, 및 12 g/L 질량 챌린지의 각각에 대해, 로딩된 무손상 이중특이적 항체의 50% 초과가 정제된 이중특이적 항체로서 회수되었으며, 회수된 정제된 이중특이적 항체 산물은 불순물로서 1% 미만의 클리핑된 이중특이적 항체를 함유하였다.
따라서, 이들 실험은 관심의 무손상 이중특이적 항체가 다양한 cHA 수지 질량 로딩 챌린지에서 cHA 수지 크로마토그래피에 의해 클리핑된 이중특이적 항체로부터 일관되게 효과적으로 분리될 수 있음을 제시한다.
표 3
실시예 3: cHA 수지 크로마토그래피에 의한 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체의 정제 - 상이한 pH 챌린지
목적:
이 실시예에서의 목적은 실시예 1에 기재된 이중특이적 항체 정제 방법이 상이한 pH 조건 하에서 효과적으로 수행될 수 있는지 여부를 측정하는 것이었다.
물질 및 방법:
이 실시예에 대한 물질 및 방법은, 방법 전반에 걸쳐 사용된 완충액의 pH가 pH 7.0, pH 7.5, 또는 pH 8.0 (상이한 크로마토그래피 실행에서)인 것을 제외하고는, 실시예 1에서와 동일하였다. 이들 크로마토그래피 실행을 위해, cHA 수지를 cHA 수지에 대한 30 g/L의 단백질 밀도로 항체 제제 샘플로 로딩하였다.
결과:
이들 크로마토그래피 실행으로부터의 결과를 하기 표 4에 요약한다. 모든 3개의 크로마토그래피 실행에 대해, 피크 정점 물질 (실시예 1에 기재된 바와 같음)을 수집하고, 분석하였다. 표 4에 제시된 바와 같이, 관심의 무손상 이중특이적 항체 단백질은 상이한 시험된 pH 조건의 각각에 대해 성공적으로 회수되었으며, pH 7.5는 관심의 단백질의 가장 높은 회수율을 산출하였다. (정제된 물질 중 클리핑된 이중특이적 항체의 양은 이들 크로마토그래피 실행에 대해 개별적으로 측정되지 않았음.)
따라서, 이들 실험은 관심의 무손상 이중특이적 항체가 상이한 pH 조건에서 cHA 수지 크로마토그래피에 의해 효과적으로 정제될 수 있음을 제시한다.
표 4
실시예 4: cHA 수지 크로마토그래피에 의한 항-FLT3 / 항-CD3 이중특이적 항체의 정제
목적:
이 실시예의 목적은 실시예 1에 기재된 이중특이적 항체 정제 방법이 실시예 1에서 사용된 것과는 상이한 이중특이적 항체로 효과적으로 수행될 수 있는지 여부를 측정하는 것이었으며, 여기서 유사한 질량의 관련된 클리핑된 이중특이적 항체를 비롯한 다양한 불순물로부터 관심의 무손상 이중특이적 항체를 분리할 필요가 또한 있었다. 본 실시예에서, 관심의 항체는 이종이량체성 이중특이적 항-FLT3 / 항-CD3 항체였다.
물질 및 방법:
이 실시예에서 사용된 이종이량체성 이중특이적 항-FLT3 / 항-CD3 항체는 실시예 1에서와 동일한 항-CD3 중쇄 및 경쇄를 함유하였다. 이중특이적 항체의 FLT3 아암에서의 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기 서열식별번호에 제시된다: FLT3 중쇄: 서열식별번호: 10; FLT3 경쇄: 서열식별번호: 12.
실시예에서의 이중특이적 항체의 클리핑된 버전은 실시예 1에 기재된 것과 동일한 항-CD3 중쇄의 위치에 클립을 가졌다.
이 실시예에 대한 물질 및 방법은, 상기 기재된 바와 같이, 항체 제제 샘플이 이중특이적 항-FLT3 / 항-CD3 항체를 함유한 것을 제외하고는, 실시예 1에서와 동일하였다. cHA 수지를 10 g/L의 cHA 수지에 대한 단백질 밀도로 항체 제제 샘플로 로딩하였다.
결과:
도 7은 cHA 수지로부터의 관심의 무손상 이중특이적 항-FLT3 / CD3 항체의 회수율, 뿐만 아니라 cHA 수지로부터의 다양한 용리된 분획 중의 클리핑된 이중특이적 항체의 상대량에 관한 정보를 제공하는 그래프를 제시한다. X-축은 좌측에서 우측으로 cHA 칼럼으로부터의 용리액의 순서를 나타낸다 (즉, 낮은 염에서 높은 염으로; 각각의 데이터 포인트는 칼럼으로부터 용리된 분획을 지시함). 수직 / Y-축을 따라, 3개의 상이한 변수가 각각의 분획에 대해 플롯팅된다: 변수 1)(마름모): % POI; 변수 2)(정사각형): % 클립; 및 변수 3)(삼각형), 이들의 각각은 도 6에 대해 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정되었다. 또한, 도 7 그래프에서, 좌측 Y-축은 % POI에 대한 값을 열거하고, 우측 Y-축은 % 클립에 대한 값을 열거한다. 도 7은 또한 도 7에서의 특정 상이한 분획이 상응하는 크로마토그래피 프로파일에서 UV 흡광도에서의 상이한 포인트에 얼마나 상응하는지를 제시하는 정보 (제시되지 않음)를 나타낸다. "정점", "85%", 및 "60%"로 표시된 포인트는 도 6에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 측정되었다.
도 7로부터의 다양한 값을 또한 하기 표 5에 제공한다. 표 5에 제시된 바와 같이, 본원에 제공된 cHA 수지 정제 방법은, 예를 들어, 80% 초과의 관심의 무손상 이중특이적 항-FLT3 / CD3 항체의 회수율을 허용하면서, 정제된 항체 산물 중 1% 미만의 클리핑된 이중특이적 항체를 갖는다.
따라서, 도 7 및 표 5에 제시된 바와 같이, 클리핑된 이중특이적 항체로부터의 무손상 이중특이적 항-FLT3 / CD3의 정제는 cHA 수지를 통해 효과적으로 달성될 수 있다.
표 5
개시된 교시사항은 다양한 적용, 방법, 키트, 및 조성물을 참조로 기재되었지만, 다양한 변화 및 변형이 본원의 교시내용 및 하기 청구된 발명으로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 인식될 것이다. 상기 실시예는 개시된 교시내용을 보다 잘 예시하기 위해 제공되며, 본원에 제시된 교시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 교시내용은 이들 예시적인 실시양태의 관점에서 기재되었지만, 통상의 기술자는 이들 예시적인 실시양태의 다수의 변화 및 변형이 과도한 실험 없이 가능함을 용이하게 이해할 것이다. 모든 이러한 변화 및 변형은 본 교시내용의 범위 내에 있다.
특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌, 및 그 안에 인용된 참고문헌은 그들이 아직 그렇지 않은 정도까지 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 정의된 용어, 용어 용법, 기재된 기법 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 포함된 문헌 및 유사한 물질 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선한다.
상기 설명 및 실시예는 본 발명의 특정 구체적인 실시양태를 상세화하며, 본 발명자들에 의해 고려된 최적의 방식을 기재한다. 그러나, 상기가 아무리 본문에서 상세하게 나타날 수 있더라도, 본 발명은 많은 방식으로 실시될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 함이 인식될 것이다.
언어 "포함하는"과 함께 본원에 기재된 실시양태 어디에나, 다르게는 "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"의 용어로 기재된 유사한 실시양태가 또한 제공됨이 이해된다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠시 군 또는 대안의 다른 군의 용어로 기재된 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 군 뿐만 아니라, 개별적으로 군의 각각의 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 뿐만 아니라 군 구성원 중 하나 이상이 부재하는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에서 군 구성원 중 임의의 것 중 하나 이상의 명백한 배제를 상정한다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 충돌의 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 이 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다", 또는 파생어, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 군의 포함을 암시하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수의 군의 배제를 암시하지 않음이 이해될 것이다. 맥락에 의해 달리 요구되지 않는다면, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 용어 "예를 들어" 또는 "예를 들면" 뒤의 임의의 예(들)는 완전하거나 제한적인 것으로 의미되지 않는다. 다수의 선택안의 열거 (예를 들어 "A, B, 또는 C")의 맥락에서 사용되는 경우 용어 "또는"은 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는다면 선택안 중 임의의 하나 이상을 포함하는 것으로 해석될 것이다.
예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되지만, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법, 및 예는 단지 예시적이며, 제한인 것으로 의도되지 않는다.
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Arg
210 215 220
Val Arg Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 3
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Contruct
<400> 3
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val
20 25 30
Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ile Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ile Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Glu Val Glu Cys Pro Glu Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 7
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 9
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg
210 215 220
Lys Cys Glu Val Glu Cys Pro Glu Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (27)
- 이중특이적 항체를 정제하는 방법으로서,
A) 로드 완충액 중 항체 제제를 히드록시아파타이트 (HA) 수지 상에 로딩하며, 여기서:
항체 제제는 I) 관심의 무손상 이중특이적 항체 및 II) 관심의 이중특이적 항체의 클리핑된 버전을 포함하며, 여기서 관심의 이중특이적 항체의 클리핑된 버전은 관심의 무손상 이중특이적 항체로부터의 분해 산물이고, 관심의 무손상 이중특이적 항체의 질량과 1% 미만 상이한 질량을 갖는 것인
단계;
B) 10 내지 50 mM 농도의 포스페이트 이온을 포함하는 세척 완충액으로 상기 수지를 세척하는 단계; 및
C) 40 내지 100 mM 농도의 포스페이트 이온을 포함하는 용리 완충액으로 관심의 무손상 이중특이적 항체를 HA 수지로부터 용리하며, 여기서 포스페이트 이온의 농도는 세척 완충액에 비해 증가된 것이고,
여기서 로드 완충액, 세척 완충액, 및 용리 완충액 중 적어도 1종의 pH는 pH 7.0 내지 8.0이고;
여기서 이중특이적 항체는
(a) (i) 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는 (ii) 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-CD3 아암; 및
(b) (i) 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열식별번호: 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는 (ii) 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-BCMA 아암
의 항-BCMA 아암 및 항-CD3 아암을 포함하고 IgG2 이소타입인 항-BCMA / 항-CD3 이중특이적 항체인
단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 항체 제제 중 클리핑된 이중특이적 항체의 분자 대 무손상 이중특이적 항체의 분자의 비는 적어도 1:50 내지 1:5 이하인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, HA 수지로부터 용리된 정제된 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 정제된 분획은 관심의 무손상 항체를 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 정제된 분획은 질량 기준으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 관심의 무손상 항체를 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 정제된 분획이 무손상 이중특이적 항체 및 클리핑된 이중특이적 항체를 포함하고, 추가로, 정제된 분획 중 클리핑된 이중특이적 항체 분자 대 무손상 이중특이적 항체 분자의 비가 1:100 이하인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 클리핑된 항체가 무손상 항체의 질량보다 5 내지 100 달톤 더 큰 질량을 갖는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 클리핑된 항체가 항체의 폴리펩티드 쇄 내에 절단된 펩티드 결합을 갖고, 절단된 펩티드 결합이 항체의 중쇄 내에 있는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 클리핑된 항체가 무손상 항체와 동일한 수의 아미노산 및 동일한 아미노산 서열을 함유하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 클리핑된 항체가 무손상 항체와 상이한 수의 아미노산을 함유하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, HA 수지가 세라믹 히드록시아파타이트 (cHA) 수지인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 포스페이트 이온의 농도가 용리 동안 40 mM에서 100 mM로 증가되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 제제가 i) 단백질 A 수지 및 ii) 이온 교환 수지 중 적어도 1종 상에 이전에 로딩되고 그로부터 용리된 단백질을 함유하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 항체가 제약으로서 또는 제약의 제조에 사용하기 위해 단리되고 정제된 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
(a) 항-CD3 아암은 서열식별번호: 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하고;
(b) 항-BCMA 아암은 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 것인
방법. - 삭제
- 삭제
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