TWI839347B

TWI839347B - 抗體純化

Info

Publication number: TWI839347B
Application number: TW108106273A
Authority: TW
Inventors: 提摩西埃斯卡拉; 艾希里瑪格瑞特沙卡拉莫
Original assignee: 美商輝瑞大藥廠
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2024-04-21

Abstract

本發明提供用於純化抗體之方法。所提供之純化方法涉及使用羥基磷灰石樹脂(HA)以使所關注之抗體與一或多種雜質分開。

Description

抗體純化

本發明係關於用於從雜質(諸如抗體降解產物)純化抗體之方法。本文所揭示的純化方法涉及使用羥基磷灰石樹脂。

抗體係用於醫學、診斷、工業及其他用途之重要生物分子。雖然許多方法及試劑可用於抗體之重組產生，但由於抗體之(例如)大小及分子複雜性，通常，特別是在大規模/工業規模生產水平下，仍難以有效地產生及純化所關注的重組抗體。

例如，在所關注重組抗體之生產中，有時可能出現與所關注抗體相關之降解產物；該降解產物係不想要的雜質。該降解產物具有極類似於所關注抗體之一些分子性質(例如相同或幾乎相同的胺基酸序列或質量)。由於所關注的完整抗體與抗體之降解形式之間之分子相似性，可能極難有效地將完整抗體與經降解之抗體分離。

因此，需要用於從雜質純化抗體之新穎且改進之方法。

本文提供用於從一或多種雜質純化所關注抗體之方法。

在一些實施例中，本文提供純化抗體之方法，該方法包括：A)將加載緩衝液中之抗體製劑加載至羥基磷灰石(HA)樹脂上，其中：該抗體製劑包含：I)所關注的完整抗體及II)所關注抗體之修剪形式，其中所關注抗體之該修剪形式為所關注的完整抗體之降解產物，且其質量與所關注的完整雙特異性抗體之質量相差小於10%；及B)用洗脫緩衝液從HA樹脂洗脫所關注的完整抗體。

在一些實施例中，本文提供純化雙特異性抗體之方法，該方法包括：A)將加載緩衝液中之抗體製劑加載至羥基磷灰石(HA)樹脂上，其中：該抗體製劑包含：I)所關注的完整雙特異性抗體；及II)至少一種雜質，其中該種雜質係選自由如下組成之群：a)所關注雙特異性抗體之修剪形式，其中所關注雙特異性抗體之該修剪形式為所關注完整雙特異性抗體之降解產物，且其質量與所關注的完整雙特異性抗體之質量相差小於10%；b)第一親本抗體，其中該第一親本抗體為具有如完整雙特異性抗體之第一臂之相同抗原特異性之單特異性抗體；c)第二親本抗體，其中該第二親本抗體為具有如完整雙特異性抗體之第二臂之相同抗原特異性之單特異性抗體；及d)高分子質量物質(HMMS)；及B)用洗脫緩衝液從HA樹脂洗脫所關注的完整雙特異性抗體。

在一些實施例中，本文提供純化雙特異性抗體之方法，該方法包括：A)將加載緩衝液中之抗體製劑加載至羥基磷灰石(HA)樹脂上，其中：I)該抗體製劑包含：a)所關注的完整雙特異性抗體及b)所關注雙特異性抗體之修剪形式，其中所關注抗體之該修剪形式為所關注的完整雙特異性抗體之降解產物，且其質量與所關注的完整雙特異性抗體之質量相差小於10%；及II)該抗體製劑中修剪型雙特異性抗體之分子與完整雙特異性抗體分子之比率係在至少1:50與不大於1:5之間；B)用洗脫緩衝液從HA樹脂洗脫完整雙特異性抗體。在一些實施例中，該方法進一步包括以下步驟：C)收集從HA樹脂洗脫之純化流份，其中該經純化之流份包含完整雙特異性抗體。

在一些實施例中，本文提供純化抗體之方法，該方法包括：A)將加載緩衝液中之抗體製劑加載至羥基磷灰石(HA)樹脂上，其中：I)該抗體製劑包含：a)所關注的完整抗體及b)所關注抗體之修剪形式，其中所關注抗體之該修剪形式為所關注的完整抗體之降解產物，且其質量與所關注的完整抗體之質量相差小於10%；及II)抗體之該修剪形式佔該抗體製劑之至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%或20%(以質量計)；B)用洗脫緩衝液從HA樹脂洗脫完整抗體，及C)收集從HA樹脂洗脫之經純化之流份，其中該經純化之流份包含完整抗體，且包含以修剪型抗體質量計少於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7 %、8 %、9 %、10 %、15 %或20 %，其中該經純化之流份包含比抗體製劑更低的質量百分比之修剪型抗體。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及用洗脫緩衝液從HA樹脂洗脫所關注抗體的方法中，該洗脫緩衝液包含離子。視需要地，在洗脫期間增加緩衝液中離子之濃度。視需要地，在洗脫期間增加HA樹脂周圍緩衝液中離子之濃度。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及抗體之方法中，該抗體為異源二聚體雙特異性抗體。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及收集從HA樹脂洗脫之經純化之流份之方法中，其中該經純化之流份包含所關注的完整抗體，該經純化之流份包含以所關注的完整抗體質量計至少80 %、90 %、95%、96 %、97 %、98 %或99 %。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及包含完整雙特異性抗體及修剪型雙特異性抗體之經純化之流份之方法中，該經純化之流份中修剪型雙特異性抗體分子與完整雙特異性抗體分子之比率係不大於1:400、1:200、1:100或1:50。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及所關注抗體為抗-CD3抗體或為包含抗-CD3臂之雙特異性抗體之方法中，該抗體包含以下中之至少一者：i)包含如SEQ ID NO: 1所示胺基酸序列之VH區；ii)包含如SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列之重鏈；iii)包含如SEQ ID NO: 1所示胺基酸序列之VH區及包含如SEQ ID NO: 3所示胺基酸序列之VL區；或iv)包含如SEQ ID NO: 2所示胺基酸序列之重鏈及包含如SEQ ID NO: 4所示胺基酸序列之輕鏈。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及雙特異性抗體之方法中，該雙特異性抗體為：i)包含抗-BCMA臂及抗-CD3臂之抗-BCMA/抗-CD3雙特異性抗體，或ii)包含抗-FLT3臂及抗-CD3臂之抗-FLT3/抗-CD3雙特異性抗體。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及包含抗-BCMA臂之雙特異性抗體之方法中，該抗-BCMA臂包含以下中之至少一者：i)包含如SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列之VH區；ii)包含如SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列之重鏈；iii)包含如SEQ ID NO: 5所示胺基酸序列之VH區及包含如SEQ ID NO: 7所示胺基酸序列之VL區；或iv)包含如SEQ ID NO: 6所示胺基酸序列之重鏈及包含如SEQ ID NO: 8所示胺基酸序列之輕鏈。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及包含抗-FLT3臂之雙特異性抗體之方法中，該抗-FLT3臂包含以下中之至少一者：i)包含如SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列之VH區；ii)包含如SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列之重鏈；iii)包含如SEQ ID NO: 9所示胺基酸序列之VH區及包含如SEQ ID NO: 11所示胺基酸序列之VL區；或iv)包含如SEQ ID NO: 10所示胺基酸序列之重鏈及包含如SEQ ID NO: 12所示胺基酸序列之輕鏈。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及將抗體製劑加載至HA樹脂上之方法中，將抗體製劑加載至HA樹脂上，以使樹脂上之密度在2、3、4或5 g/L至8、9、10、12、15或20 g/L之間。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及將抗體製劑加載至HA樹脂上之方法中，將至少1、5、10、50、100、500、1000或5000公克抗體製劑加載至HA樹脂上。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及抗體製劑之方法中，該抗體製劑包含所關注的完整抗體質量計至少50 %、60 %、70 %或80 %且小於90 %、95 %、97 %、98 %或99 %。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及修剪型抗體之方法中，該修剪型抗體之質量與完整抗體之質量相差小於0.1%、0.5%、1%或2%。在一些實施例中，在本文所提供的涉及修剪型抗體之方法中，該修剪型抗體之質量為比完整抗體之質量大約5至100道耳頓之間。在一些實施例中，在本文所提供的涉及修剪型抗體之方法中，該修剪型抗體之質量比完整抗體之質量大約18道耳頓。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及修剪型抗體之方法中，該修剪型抗體在抗體之多肽鏈中具有經裂解之肽鍵，且其中該經裂解之肽鍵係在抗體之重鏈中。在一些實施例中，在本文所提供的涉及修剪型抗體之方法中，該修剪型抗體在抗體之多肽鏈中具有經裂解之肽鍵，且其中該經裂解之肽鍵係在抗體之輕鏈中。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及修剪型抗體之方法中，該修剪型抗體包含與完整抗體相同數量之胺基酸及相同之胺基酸序列。或者，在一些實施例中，修剪型抗體包含與完整抗體不同數量之胺基酸。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及包含特異性結合至CD3之VH及VL域之所關注抗體之方法中，對應之修剪型抗體包含特異性結合至CD3之VH域中之經裂解之肽鍵。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及HA樹脂之方法中，該HA樹脂為陶瓷羥基磷灰石(cHA)樹脂。

在一些實施例中，在本文提供的方法中，在將抗體製劑加載到HA樹脂上之後但在從樹脂洗脫完整的雙特異性抗體之前，用包含磷酸根離子的洗滌緩衝液洗滌HA樹脂。視需要地，洗滌緩衝液包含濃度在約5、10、15、20 mM與30、40或50 mM之間之磷酸根離子。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及包含離子之洗脫緩衝液之方法中，該離子為磷酸根。在一些實施例中，洗脫期間磷酸根離子之濃度可從約30、40或50 mM增加至約60、70、80、100、150或200 mM。

在一些實施例中，在本文所提供的方法中，加載緩衝液、洗滌緩衝液及洗脫緩衝液中之至少一者之pH為約pH 7.0及8.0或係在約pH 7.0與8.0之間。

在一些實施例中，在本文所提供的涉及抗體製劑之方法中，該抗體製劑包含預先加載至以下中之至少一者上並從中洗脫之蛋白質：i)蛋白質A樹脂及ii)離子交換樹脂。視需要地，該抗體製劑包含預先加載至以下兩者上並從中洗脫之蛋白質：i)蛋白質A樹脂及ii)離子交換樹脂。

在一些實施例中，使用如本文所述之方法製備的抗體係經分離及/或純化以用作藥物或用於製備藥物。

在一些實施例中，提供使用如本文所述之方法純化的抗體。

本申請案主張2018年2月27日申請之美國臨時申請案第62/635,943號之權益，該案之全部內容係以引用的方式併入本文中。

本文提供用於從一或多種雜質純化所關注抗體之方法。本文所提供的方法涉及使用羥基磷灰石樹脂從雜質分離所關注抗體。在一些實施例中，所關注抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，雜質為與所關注抗體相關之抗體(即，其具有與所關注抗體相似或相同之胺基酸序列)，但相比所關注抗體以一或多種方式改變，且其質量不同於所關注抗體。視需要地，抗體雜質物質之質量與所關注抗體之質量極相似。例如，在一些實施例中，抗體雜質物質之質量與所關注抗體之質量相差小於5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.02%或0.01%。視需要地，本文所提供的方法可用於從一或多種雜質大規模純化所關注抗體。

定義除非另外定義，否則本文所使用的所有技術術語、符號及其他科學術語或術語學意欲具有通常為本發明所屬領域之技藝者所瞭解之含義。在一些情況中，為清晰起見及/或為便於參考而在本文中定義具有通常所瞭解含義之術語，且本文中包含此等定義不一定要被解釋為表示與本技藝通常所瞭解之實質性差異。

除非另有說明，否則以下術語應理解為具有以下含義：「抗體」為能夠藉由位於免疫球蛋白分子之可變區中的至少一個抗原識別位點特異性結合至標靶(諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等)之免疫球蛋白分子。如本文所用，該術語不僅包括完整多株或單株抗體，而且包括其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv)、單鏈(ScFv)及域抗體(包括(例如)鯊魚及駱駝科抗體)、雙功能抗體及包含抗體之融合蛋白、及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他修飾組態。術語「抗體」包括單特異性、雙特異性及多特異性抗體。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，且該抗體不需要係任何特定類別。取決於其重鏈之恆定區之抗體胺基酸序列，可將免疫球蛋白分配至不同類別。有五大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中的幾種可進一步分為亞類(同型物)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類免疫球蛋白之次單元結構及三維組態係熟知的。

如本文所用，術語「重鏈」、「輕鏈」、「可變區」或「可變域」、「框架區」、「恆定域」及類似術語在免疫學技藝中具有其尋常含義且係指天然生成之免疫球蛋白中之域及重組結合蛋白(例如人類化抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體、嵌合抗體等)之對應域。天然生成之免疫球蛋白之基本結構單元為具有兩條輕鏈及兩條重鏈之四聚物，通常以約150,000 Da之醣蛋白表示。每條鏈之胺基端(N端)部分包含主要負責抗原識別的約100-110個或更多個胺基酸之可變區。每條鏈之羧基端(C端)部分限定恆定區。每條輕鏈包含輕鏈可變域(VL)及輕鏈恆定域(CL)。每條重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區，其具有CH1、鉸鏈、CH2及CH3域。IgG分子之可變區包含具有超變性之區域(稱為互補決定區(CDR)，其包含與抗原接觸之殘基)及非-CDR區段(稱為框架區(FR)，其一般維持結構且確定CDR環之定位(儘管某些框架殘基亦可接觸抗原))。每個VH及VL包含從胺基端至羧基端以如下結構配置之三個CDR及四個FR：n-FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4-c。免疫球蛋白分子可係任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)及類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。

「雙特異性」或「雙重特異性」為具有兩個不同抗原結合位點之雜合抗體。雙特異性抗體之兩個抗原結合位點結合至兩個不同抗原決定基，其可位於相同或不同蛋白質靶標上。

「完整」抗體係指重組抗體，其包含重組抗體之所有預期肽鍵及胺基酸(即，基於編碼該抗體之多肽之核酸序列所預期的)。相反地，「修剪型」抗體係指與對應之「完整」抗體相比缺失至少一個肽鍵之對應之「完整」抗體之形式。除非上下文另有明確規定，否則本文提及「所關注抗體」時一般係指所關注的完整抗體。

本文中提及「約」某一值或參數時包括針對於該值或參數本身之實施例以及針對於可比該參數之規定數值低10%或高10%之值或參數之實施例。例如，提及「約5 mg」時包括5 mg亦及介於4.5 mg與5.5 mg之間之任何值。

方法本文所提供的方法可用於從一或多種雜質純化所關注抗體。在本文所提供的方法中，將包含所關注抗體及一或多種雜質分子之抗體製劑(在本文中亦稱為「起始樣品」)加載至羥基磷灰石(HA)樹脂上，該羥基磷灰石(HA)樹脂係結合至所關注抗體及視需要結合至一或多種雜質分子。然後洗滌該HA樹脂以除去任何鬆散結合的雜質。(在一些實施例中，所有雜質分子可流過但不結合至該HA樹脂。)接下來，使用磷酸鹽洗脫緩衝液從HA樹脂洗脫所關注抗體，該磷酸鹽洗脫緩衝液通常係藉由磷酸根離子濃度遞增梯度引入至該樹脂上。從HA樹脂洗脫所關注抗體產生包含所關注抗體之純化樣品，且相比起始樣品中與所關注抗體一起存在的，雜質更少(或沒有)。在從HA樹脂洗脫所關注抗體期間，結合至HA樹脂之任何雜質分子亦可在磷酸根離子濃度遞增梯度期間的某一點洗脫。然而，雜質分子在與所關注抗體之洗脫條件顯著不同的條件下從HA樹脂洗脫，使得在洗脫過程中可有效地從雜質分子分離所關注抗體。以下提供關於上述方法步驟及相關材料及步驟之其他細節。

羥基磷灰石樹脂 各種羥基磷灰石樹脂可商業上購得，且任何可用形式之材料可與本文所提供的方法一起使用。視需要地，羥基磷灰石係呈結晶形式。視需要地，羥基磷灰石係經聚結以形成顆粒且在高溫下燒結成穩定之多孔陶瓷塊。

在一些實施例中，本文所提供的HA樹脂為陶瓷羥基磷灰石(cHA)樹脂。「陶瓷羥基磷灰石」/「cHA」係指式Ca₁₀ (PO₄ )₆ (OH)₂ 之不溶性羥基化磷酸鈣，其已在高溫下經過燒結形成球形大孔陶瓷形式。除非另有說明，否則如本文所用「陶瓷羥基磷灰石」/「cHA」包括(但不限於) I型及II型陶瓷羥基磷灰石，且亦包括任何適宜之粒度。可與本文所提供的方法一起使用的典型cHA粒度包括(例如)直徑在1至100 μm或1至1000 μm之間之粒度，諸如20 μm、40 μm或80 μm。可與本文所提供的方法一起使用的示例性cHA樹脂包括CHT™ I型及II型樹脂(Bio-Rad)。本文中針對「HA樹脂」或類似之任何提及均包括cHA樹脂。

通常，在本文所提供的方法中，該HA樹脂係提供於一或多個層析柱中。管柱性質(例如管柱直徑、長度及填充密度)可根據各種因素來選擇，包括特定純化項目之需求(即意欲純化之蛋白質的量)及與欲用於管柱中之HA樹脂相關之因素(諸如其孔徑、粒度、可壓縮性、加載能力及動態結合能力)。此外，本文所提供的方法通常相關地描述層析柱中之HA樹脂；然而，不排除樹脂之其他適宜之相關組態。此外，本文提及「HA柱」或類似時係指填充有HA樹脂之層析柱。

在蛋白質加載之前平衡 HA 柱在一些實施例中，在將包含所關注抗體之樣品加載至HA柱之前，本文所提供的方法可包括用一或多種平衡緩衝液預平衡管柱之步驟。可將平衡緩衝液引入至管柱上例如以確保HA樹脂在方法開始時係清潔的(即，確保樹脂沒有已經結合至樹脂之雜質)及/或確保HA樹脂周圍的溶液與欲加載至樹脂上之樣品相容。

在一些實施例中，平衡緩衝液為磷酸鹽緩衝液，其包含(例如)磷酸鈉，其中該緩衝液中磷酸根離子之濃度為約100至500 mM。此等平衡緩衝液在本文中亦可稱為「高磷酸鹽平衡緩衝液」或類似術語。例如，在一個實施例中，高磷酸鹽平衡緩衝液可包含約250至450 mM磷酸根離子；在其他實施例中，其可包含約200、250、300、350、400或450 mM磷酸根離子。該平衡緩衝液包含在緩衝液中之相對高濃度之磷酸根離子，以洗脫已經存在於HA樹脂上之任何污染物/雜質(即在將包含所關注蛋白質之樣品加載到樹脂上之前存在之污染物/雜質；此等雜質可能係存在的，例如，若HA樹脂先前已用於純化方法中，及在先前使用後未完全清除樹脂)。高磷酸鹽平衡緩衝液可具有約6.0至9.0之pH。例如，在一個實施例中，高磷酸鹽平衡緩衝液可具有約7.0至8.0之pH；在其他實施例中，其可具有約7.0、7.5或8.0之pH。在一個實施例中，高磷酸鹽平衡緩衝液包含約400 mM磷酸根離子，且具有約7.5之pH。在一些實施例中，高磷酸鹽平衡緩衝液在本文中亦可稱為「平衡緩衝液1」。

在一些實施例中，平衡緩衝液為磷酸鹽緩衝液，其包含(例如)磷酸鈉，其中該緩衝液中磷酸根離子之濃度為約1至20 mM。此等平衡緩衝液在本文中亦可稱為「低磷酸鹽平衡緩衝液」或類似術語。例如，在一個實施例中，低磷酸鹽平衡緩衝液可包含約1至10 mM磷酸根離子；在其他實施例中，其可包含約1、2、3、4、5或10 mM磷酸根離子。該平衡緩衝液包含在緩衝液中之相對低濃度之磷酸根離子，以在HA樹脂周圍產生有助於所關注蛋白質結合至樹脂之條件。視需要地，低磷酸鹽平衡緩衝液可另外包含濃度為約1至50 mM之HEPES。例如，在一個實施例中，低磷酸鹽平衡緩衝液可包含約2至30 mM HEPES；在其他實施例中，其可包含約5、10、15、20或25 mM HEPES。低磷酸鹽平衡緩衝液可具有約6.0至9.0之pH。例如，在一個實施例中，低磷酸鹽平衡緩衝液可具有約7.0至8.0之pH；在其他實施例中，其可具有約7.0、7.5或8.0之pH。在一個實施例中，低磷酸鹽平衡緩衝液包含約2 mM磷酸根離子、20 mM HEPES，且具有約7.5之pH。在一些實施例中，低磷酸鹽平衡緩衝液在本文中亦可稱為「平衡緩衝液2」。然而，重要的是，利用本文所提供的方法，可使用低磷酸鹽平衡緩衝液來預平衡樹脂，而無需在該方法期間預先使用高磷酸鹽平衡緩衝液。

用包含所關注抗體之樣品加載 HA 柱一旦HA柱準備好加載蛋白質，立刻將包含所關注抗體及雜質之樣品加載至HA柱上。於其中加載樣品至HA柱上之緩衝液在本文中可稱為「加載緩衝液」。在一些實施例中，當一開始時獲得包含所關注抗體之樣品以與如本文所提供的方法一起使用時，該樣品已經含在適宜之加載緩衝液中以用於加載該樣品至HA柱上。然而，在其他實施例中，在將樣品加載至HA柱上之前，可處理該樣品(例如稀釋、濃縮或緩衝液交換)以改變樣品之緩衝條件，使得該樣品含在適合之緩衝液中以用於加載至管柱上。例如，利用本文所提供的方法，加載緩衝液不能具有高濃度之磷酸根離子，其會阻礙所關注抗體結合至HA樹脂。因此，若包含所關注抗體之初始樣品包含高濃度之磷酸根離子，則該樣品需要進行(例如)稀釋或緩衝液交換，直至該樣品中磷酸根離子之濃度降低至適當低的濃度，允許所關注抗體結合至HA樹脂。

在一些實施例中，加載緩衝液包含不超過約10 mM之磷酸根離子。例如，在一些實施例中，加載緩衝液包含少於約10 mM、5 mM、4 mM、3 mM、2 mM或1 mM之磷酸根離子。在一些實施例中，加載緩衝液包含0 mM磷酸根離子。視需要地，加載緩衝液可包含各種其他鹽或緩衝組分(例如Tris、甘胺酸)。加載緩衝液可具有約6.0至9.0之pH。例如，在一個實施例中，加載緩衝液可具有約7.0至8.0之pH；在其他實施例中，其可具有約7.0、7.5或8.0之pH。

在一些實施例中，可將包含所關注抗體之樣品加載至HA樹脂上，使在樹脂上之密度為至少1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L、12 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L或30 g/L。在一些實施例中，可將包含所關注抗體之樣品加載至HA樹脂上，使在樹脂上之密度為至少1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L、12 g/L、15 g/L、20 g/L或25 g/L且不大於2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L、12 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L或30 g/L，其中第二值係大於第一值。

洗滌 HA 柱在將包含所關注抗體及雜質之樣品加載至HA柱上之後，但在洗脫所關注抗體之前，本文所提供的方法可視需要包括用一或多種洗滌緩衝液洗滌經加載之管柱之另一步驟，例如，以除去非特異性固定之雜質或以其他方式製備或平衡管柱以用於洗脫步驟。任何洗滌緩衝液之性質可由一般技術者確定。在一個實施例中，洗滌緩衝液為磷酸鹽緩衝液，其包含(例如)磷酸鈉，且該緩衝液中磷酸根離子之濃度為約5至50 mM。例如，在一個實施例中，洗滌緩衝液可包含約10至40 mM磷酸根離子；在其他實施例中，其可包含約10、20、30、40或50 mM磷酸根離子。視需要地，洗滌緩衝液可另外包含濃度為約1至50 mM之HEPES。例如，在一個實施例中，洗滌緩衝液可包含約2至30 mM HEPES；在其他實施例中，其可包含約5、10、15、20或25 mM HEPES。洗滌緩衝液可具有約6.0至9.0之pH。例如，在一個實施例中，洗滌緩衝液可具有約7.0至8.0之pH；在其他實施例中，其可具有約7.0、7.5或8.0之pH。在一個實施例中，洗滌緩衝液包含約40 mM磷酸根離子、20 mM HEPES，且具有約7.5之pH。

自 HA 柱洗脫所關注抗體 本文所提供的方法包括從HA樹脂中洗脫結合的所關注抗體之步驟。結合的所關注抗體係藉由一或多種洗脫緩衝液來洗脫。通常，洗脫緩衝液包含一或多種鹽或離子，且在洗脫期間鹽或離子之濃度增加。

在一些實施例中，本文所提供的洗脫緩衝液包含磷酸根離子。視需要地，洗脫緩衝液中磷酸根離子之濃度在洗脫期間從約20 mM之初始濃度增加至約200 mM。例如，在一個實施例中，洗脫緩衝液中磷酸根離子之濃度在洗脫期間從約40 mM之初始濃度增加至約80 mM或從約40 mM之初始濃度增加至約100 mM。增加洗脫緩衝液中磷酸根離子之濃度之特定方法及速率可確定為適於所關注抗體，且考慮到亦結合至HA樹脂之雜質分子之類型。例如，洗脫緩衝液中磷酸根離子之濃度可以逐漸/淺線性梯度升高。使用淺梯度可允許在類似但不同的條件下有效地分離從HA樹脂洗脫之一或多種分子。或者，在一些實施例中，洗脫緩衝液中磷酸根離子之濃度可以陡梯度升高，或可逐步地升高。視需要地，洗脫緩衝液可另外包含濃度為約1至50 mM之HEPES。例如，在一個實施例中，洗脫緩衝液可包含約2至30 mM HEPES；在其他實施例中，其可包含約5、10、15、20或25 mM HEPES。洗脫緩衝液可具有約6.0至9.0之pH。例如，在一個實施例中，洗脫緩衝液可具有約7.0至8.0之pH；在其他實施例中，其可具有約7.0、7.5或8.0之pH。在一個實施例中，洗脫緩衝液包含約40-80 mM磷酸根離子(在梯度上增加)、20 mM HEPES，且具有約7.5之pH。

洗脫條件包括(但不限於)適於與HA樹脂一起使用之洗脫緩衝液之性質(諸如緩衝液組成、pH、濃度、離子強度及類似性質)；洗脫緩衝液之性質之任何必要步驟或梯度變化；欲使用之洗脫緩衝液之管柱體積數；流速及類似可經確定以最佳化自HA柱洗脫所關注抗體、以及從雜質分子分離所關注抗體。

洗脫後，視需要單獨或分別收集包含所關注抗體之一或多個峰值流份並視需要組併，視需要調整pH，視需要過濾且然後視需要在額外加工之前視需要地儲存。收集的峰值流份可藉由任何適宜方法鑑定，諸如使用在A280下之紫外線進行鑑定且當紫外線信號高於所需量時及/或當處在洗脫條件中之所需點時開始收集。

從HA樹脂洗脫且包含所關注抗體之材料在本文中可視需要地稱為「經純化之流份」或類似術語。經純化之流份可包含來自從HA樹脂洗脫之單一流份之物質，或其可係已經組併在一起的從HA樹脂洗脫之多個流份之組合。通常，製備經純化之流份，使得在收集大量所關注抗體與少量雜質分子之間進行平衡。必須常平衡此等競爭目標，例如，因為當所關注抗體從HA樹脂洗脫時，及當一種雜質分子從HA樹脂洗脫時，條件之間可能存在至少流份重疊。

用於本文所提供方法之任何緩衝液(例如平衡緩衝液、加載緩衝液、洗滌緩衝液或洗脫緩衝液)亦可包含額外或替代之適宜組分，諸如乙酸鹽、琥珀酸鹽、MES、ACES、MOPSO、PIPES、BES、TAPSO、AMPSO、TRICINE、EPPS、二羥乙甘胺酸(Bicine)、DIPSO、HEPPSO、咪唑、Tris、Bis-tris、TAPS、精胺酸、甘胺酸、乙腈、乙醇、甲醇、1%月桂基硫酸鈉(SDS)或其他表面活性劑及類似物。

在一些實施例中，本文所提供的任何緩衝液可具有約6.0至9.0之pH。在其他實施例中，本文所提供之任何緩沖劑可具有約5.0至9.0、5.5至9.0、6.5至9.0、7.0至9.0、7.5至9.0、7.0至8.0或6.5至8.5之pH。

在本文所提供的描述為包含「磷酸根離子」之緩衝液中，磷酸根離子可在緩衝液中由任何適宜磷酸鹽(諸如磷酸鈉或磷酸鉀)產生。此外，本文所提供的描述為用「磷酸鈉」製備的溶液可用任何適宜磷酸鈉鹽(例如磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉)製備。

在已自HA柱洗脫所關注抗體後，視需要清洗HA柱以除去雜質及降解管柱樹脂之其他組分並準備用於後續儲存使用。在一個實施例中，首先使用緩衝液(諸如濃度為約0.4 M且pH為約7.5的包含磷酸鈉之緩衝液)再生管柱；接著使用清潔溶液(諸如約1 M NaOH及約0.5 M磷酸鉀)進行可選消毒步驟，且然後使用儲存溶液(諸如約0.1 M NaOH)製備儲存。

抗體本文所提供的方法可用於從一或多種雜質純化所關注抗體。例如，經純化之抗體可用作藥物或用於製備藥物。

在一些實施例中，根據本文所提供方法純化之抗體為本文所提供抗體之任何類型。例如，根據本文所提供方法純化之抗體可為全長抗體或抗體片段(例如scFv或Fab)，且其可係單特異性的或雙特異性的。通常，根據本文所提供方法純化之所關注抗體為重組抗體。

IgG 抗體在一些實施例中，根據本文所提供方法所純化之抗體為免疫球蛋白G (IgG)抗體。如本技術中已知，IgG抗體包含兩條重鏈及兩條輕鏈，且具有一般的「Y」形狀。在標準IgG分子中，該兩條重鏈具有相同胺基酸序列，且該兩條輕鏈具有相同胺基酸序列。IgG抗體可描述成具有兩個「臂」(即「第一臂」及「第二臂」)，其中每個臂包含經二硫鍵連接在一起的一條重鏈及一條輕鏈。在標準IgG分子中，抗體之第一臂與抗體之第二臂相同(歸因於每個臂包含重鏈及輕鏈，其分別具有與另一臂中之重鏈及輕鏈相同之胺基酸序列)。重鏈的N端區包含重鏈可變區(VH)，及輕鏈的N端區包含輕鏈可變區(VL)。該VH及VL區包含抗體之特異性結合至抗原之部分。因此，IgG抗體之每個臂可特異性結合至抗原。在標準IgG分子中，IgG抗體之第一臂及第二臂均結合至相同抗原(歸因於兩個臂均包含具有相同各自胺基酸序列之重鏈及輕鏈的事實)。基於具有相同的2個臂，標準IgG抗體可稱為係「同型二聚」的。根據本文所提供方法純化之IgG抗體可係亞類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

雙特異性 IgG 抗體在一些實施例中，根據本文所提供方法所純化之抗體為雙特異性IgG抗體。在雙特異性IgG抗體中，抗體之兩個臂中之每一個臂均特異性結合至不同抗原。另外，雙特異性IgG抗體之第一臂中之重鏈之胺基酸序列係不同於相同雙特異性IgG抗體之第二臂中之重鏈之胺基酸序列，及類似地，雙特異性IgG抗體之第一臂中之輕鏈之胺基酸序列通常係不同於相同雙特異性IgG抗體之第二臂中之輕鏈之胺基酸序列。因此，基於具有不同的2個臂，雙特異性IgG抗體可稱為係「異源二聚體」的。雙特異性IgG抗體之第一臂可描述為係對「第一抗原」具有特異性，及雙特異性IgG抗體之第二臂可描述為係對「第二抗原」具有特異性。在一些實施例中，雙特異性抗體具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型物。在一些實施例中，雙特異性抗體包含免疫學上惰性Fc區。

雙特異性 IgG 抗體 - 製備方法 本技術中已知用於製備雙特異性抗體之方法(參見，例如，Suresh等人，Methods in Enzymology 121:210，1986)。傳統上，重組產生雙特異性抗體係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩條重鏈具有不同特異性(Millstein及Cuello，Nature 305，537-539，1983)。

最近，已開發採取以下一般步驟來製備雙特異性異源二聚體抗體之方法： 1)單獨表現第一同源二聚體抗體(在本文中亦稱為「第一親本抗體」)及第二同源二聚體抗體(在本文中亦稱為「第二親本抗體」)並純化。第一同源二聚體抗體對所製備的雙特異性抗體之第一靶抗原具有特異性，及第二同源二聚體抗體對所製備的雙特異性抗體之第二靶抗原具有特異性。因此，例如，若目標係欲製備對BCMA及CD3具有特異性之雙特異性抗體，則單獨表現單株抗-BCMA抗體(「第一親本抗體」)及單株抗-CD3抗體(「第二親本抗體」)並純化。

2)接下來，將經純化之第一同源二聚體/親本抗體及經純化之第二同源二聚體/親本抗體混合且在促進抗體臂交換之條件下一起培養，使得形成包含來自第一親本抗體之第一臂及來自第二親本抗體之第二臂之異源二聚體雙特異性抗體。此等條件通常涉及一系列還原條件，接著係氧化條件。還原條件促進將同源二聚體抗體之兩條重鏈連接在一起的二硫鍵裂解，且藉此允許第一親本抗體及第二親本抗體之間的抗體臂交換。隨後的氧化條件則會形成新的二硫鍵，該二硫鍵將新形成的雙特異性抗體穩定化。用於產生雙特異性抗體之此種一般方法概述於圖1中。在圖1中，描繪第一親本抗體(「親本抗體A」；灰色)及第二親本抗體(「親本抗體B」；黑色)，其各為單特異性同源二聚體，且包含第一臂及第二臂。通常，第一親本抗體及第二親本抗體對不同抗原具有特異性。然後，將第一親本抗體及第二親本抗體混合在一起且暴露至還原及氧化步驟，從而導致形成所關注雙特異性抗體，該所關注雙特異性抗體包含來自親本抗體A之第一臂及來自親本抗體B之第二臂、及兩個臂之各自的特異性。

視需要地，抗體重鏈之胺基酸序列可以一或多種方式修飾以促進雙特異性抗體之形成。例如，雙特異性抗體之一個臂之重鏈可在第一鉸鏈區中包含胺基酸修飾，使得該第一鉸鏈區中之經取代/置換之胺基酸具有與所形成的雙特異性抗體之另一臂之鉸鏈區中之對應胺基酸相反的電荷。此描述於(例如)國際專利申請案第PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)號中。在另一方法中，所需異源多聚體或異源二聚體蛋白(例如，雙特異性抗體)之形成係藉由改變或改造第一及第二免疫球蛋白樣Fc區(例如，鉸鏈區及/或CH3區)之間的界面來增進。在該方法中，雙特異性抗體可包含CH3區，其中該CH3區包含第一CH3多肽及第二CH3多肽，其等一起相互作用形成CH3界面，其中該CH3界面內的一或多個胺基酸使同源二聚體之形成不穩定且對同源二聚體之形成並非係靜電不利的。該方法亦描述於國際專利申請案第PCT/US2011/036419 (WO2011/143545)號中。

用於製備雙特異性抗體之上述方法及其他方法進一步描述於(例如)：國際專利申請案第PCT/IB2011/054899號(WO2012/059882)、第PCT/US2011/036419號(WO2011/143545)、及Giese等人，Biotechnology Progress，「Bispecific Antibody Process Development: Assembly and Purification of Knob and Hole Bispecific Antibodies」，2018年1月17日、及引述於其中之參考文獻，出於所有目的，其中各案均係以引用的方式併入本文中。本文所提供的用於純化抗體之方法可用於純化藉由任何適宜方法製備的雙特異性抗體。

雙特異性 IgG 抗體 - 特異性 在一些實施例中，可根據本文所提供的方法純化之抗體為全長人類雙特異性IgG抗體，其中該雙特異性抗體之第一臂之第一抗體可變域能夠結合至第一抗原，及該雙特異性抗體之第二臂之第二抗體可變域能夠結合至第二抗原。該第一抗原及第二抗原可具有如本文所述的抗原之任何特徵。在一些實施例中，該第一抗原出現在第一細胞類型上，及該第二抗原出現在第二細胞類型上。

在一些實施例中，可根據本文所提供的方法純化之抗體為全長人類雙特異性IgG抗體，其中該抗體之第一抗體可變域能夠藉由特異性結合至位於人類免疫效應細胞上之效應抗原募集人類免疫效應細胞之活性，且其中該抗體之第二抗體可變域能夠特異性結合至靶抗原。

可被本文所提供的抗體結合的人類免疫效應細胞可係本技術中已知的多種免疫效應細胞中之任何一種。例如，免疫效應細胞可係人類淋巴細胞譜系之成員，包括(但不限於) T細胞(例如，細胞毒性T細胞)、B細胞及天然殺手(NK)細胞。免疫效應細胞亦可係(例如)人類骨髓譜系之成員，包括(但不限於)單核細胞、嗜中性粒細胞及樹突細胞。此類免疫效應細胞可對靶細胞具有細胞毒性或凋亡作用或在藉由效應抗原之結合活化後具有其他所需效應。該效應抗原為表現於人類免疫效應細胞上之抗原(例如，蛋白質或多肽)。可被本文所提供的抗體結合之效應抗原之實例包括(但不限於)人類CD3 (或CD3 (分化簇)複合物)、CD16、NKG2D、NKp46、CD2、CD28、CD25、CD64及CD89。

靶抗原係表現在患病條件(例如，發炎性疾病、增生性疾病(例如，癌症)、免疫疾病、神經疾病、神經退化性疾病、自體免疫疾病、傳染病(例如，病毒感染或寄生蟲感染、過敏反應、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病)中之靶細胞上。靶抗原不為效應抗原。靶抗原之實例包括(但不限於) BCMA、EpCAM (上皮細胞黏附分子)、CCR5 (5型趨化因子受體)、CD19、HER (人類表皮生長因子受體)-2/neu、HER-3、HER-4、EGFR (表皮生長因子受體)、FLT3 (Fms樣酪胺酸激酶3)、PSMA、CEA、MUC-1 (黏蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、CIhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神經節苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、Globo H、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、碳酸酐酶IX (MN/CA IX)、CD44v6、Shh (Sonic Hedgehog)、Wue-1、漿細胞抗原、(膜結合的)IgE、MCSP (黑色素瘤硫酸軟骨素蛋白多糖)、CCR8、TNF-α前驅體、STEAP、間皮素、A33抗原、PSCA(前列腺幹細胞抗原)、Ly-6；橋體芯蛋白4、E-鈣黏素新抗原決定基、胎兒乙醯膽鹼受體、CD25、CA19-9標記物、CA-125標記物及II型MIS (Muellerian抑制物質)受體、sTn (唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP (纖維母細胞活化抗原)、內皮唾液酸蛋白(endosialin)、EGFRvIII、LG、SAS及CD63。

在一些實施例中，根據本文所提供的方法純化之抗體可為如2016年3月30日提交之美國申請案第15/085,644號(公開號第US20160297885號)或2018年5月31日提交之美國申請案第15/993,874號(公開案第US20180346601號)中所述之任何抗體，該等案件之全文係針對所有目的以引用的方式併入本文中。

在一些實施例中，根據本文所提供的方法純化之抗體可為雙特異性IgG抗體，其中抗體之一個臂特異性結合至分化簇3 (CD3)。關於CD3之資訊係例如藉由UniProtKB ID # P07766提供。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3結合臂之重鏈之VH區具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3結合臂之重鏈具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcrvrcprcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysrltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 1中所示VH序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3-結合臂之輕鏈之VL區具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3-結合臂之輕鏈具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 3中所示VL序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3-結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 1中所示胺基酸序列之胺基酸序列，及CD3-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 3中所示胺基酸序列之胺基酸序列。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3-結合臂之重鏈具有包含SEQ ID NO: 2中所示胺基酸序列之胺基酸序列，及CD3-結合臂之輕鏈具有包含SEQ ID NO: 4中所示胺基酸序列之胺基酸序列。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至CD3之雙特異性IgG抗體中，CD3-結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 1中所示VH序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列，及CD3-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 3中所示VL序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，根據本文所提供的方法純化之抗體可為雙特異性IgG抗體，其中抗體之一個臂特異性結合至B-細胞突變抗原(BCMA)。關於BCMA之資訊係藉由(例如)UniProtKB ID # Q02223提供。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之重鏈之VH區具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 5)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之重鏈具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkcevecpecpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvavshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpssiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltcevkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 6)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 5中所示VH序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之輕鏈之VL區具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQSWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之輕鏈具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQSWPLTFGQGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec (SEQ ID NO: 8)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 7中所示VL序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 5中所示胺基酸序列之胺基酸序列，及BCMA-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 7中所示胺基酸序列之胺基酸序列。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之重鏈具有包含SEQ ID NO: 6中所示胺基酸序列之胺基酸序列，及BCMA-結合臂之輕鏈具有包含SEQ ID NO: 8中所示胺基酸序列之胺基酸序列。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 5中所示VH序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列，及BCMA-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 7中所示VL序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之重鏈之VH區具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGgSGGSLPYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至BCMA之雙特異性IgG抗體中，BCMA-結合臂之輕鏈之VL區具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQEWPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)。在一些實施例中，在本文任何提及抗體包含具有包含SEQ ID NO: 5中所示胺基酸序列之胺基酸序列之VH區之情況下，該抗體可替代性地包含含有SEQ ID NO: 13中所示胺基酸序列之VH區。在一些實施例中，在本文任何提及抗體包含具有包含SEQ ID NO: 7中所示胺基酸序列之胺基酸序列之VL區之情況下，該抗體可替代性地包含含有SEQ ID NO: 14中所示胺基酸序列之VL區。類似地，本文亦包括分別含有SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14之VH及VL序列之抗-BCMA重鏈及輕鏈。

在一些實施例中，根據本文所提供的方法純化之抗體可為雙特異性IgG抗體，其中該抗體之一個臂特異性結合至fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)。關於FLT3之資訊係藉由(例如) UniProtKB ID # P36888提供。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體中，FLT3-結合臂之重鏈之VH區具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 9)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體中，FLT3-結合臂之重鏈具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCEVECPECPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 10)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體中，FLT3-結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 9中所示VH序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體中，FLT3-結合臂之輕鏈之VL區具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO:11)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體中，FLT3-結合臂之輕鏈具有包含以下胺基酸序列之胺基酸序列：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:12)。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體中，FLT3-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 11中所示VL序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體中，FLT3-結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 9中所示胺基酸序列之胺基酸序列，及FLT3-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 11中所示胺基酸序列之胺基酸序列。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體，FLT3-結合臂之重鏈具有包含SEQ ID NO: 10中所示胺基酸序列之胺基酸序列，及FLT3-結合臂之輕鏈具有包含SEQ ID NO: 12中所示胺基酸序列之胺基酸序列。在一些實施例中，在其中抗體之一個臂特異性結合至FLT3之雙特異性IgG抗體中，FLT3-結合臂之重鏈之VH區具有包含SEQ ID NO: 9中所示VH序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列，及FLT3-結合臂之輕鏈之VL區具有包含SEQ ID NO: 11中所示VL序列之CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。

在一些實施例中，本文提供雙特異性抗-BCMA/抗-CD3抗體，其中抗體之抗-BCMA臂具有以上針對抗-BCMA臂所述之任何特徵，及抗體之抗CD3臂具有以上針對抗-CD3臂所述之任何特徵。在一些實施例中，本文提供雙特異性抗-FLT3/抗-CD3抗體，其中抗體之抗-FLT3臂具有以上針對抗-FLT3臂所述之任何特徵，及抗體之抗-CD3臂具有以上針對抗-CD3臂所述之任何特徵。

本文亦提供純化對任何上述抗原具有親和力及/或包含上述任何胺基酸序列之單特異性抗體之方法。例如，本文亦提供包含SEQ ID NO: 1中所示VH胺基酸序列之單特異性、同源二聚體抗-CD3抗體之純化。

雜質本文所提供的方法可用於從一或多種雜質純化所關注抗體。

雜質包括(例如)所關注抗體之修剪形式、蛋白質聚集體，且就所關注雙特異性抗體而言，親本單特異性抗體與所關注雙特異性抗體之形成有關。此等不同雜質在本文中亦可稱為不同「雜質種類」、「雜質分子」或類似術語。

所關注抗體之修剪形式 「所關注抗體之修剪形式」、「修剪型抗體」或類似術語係指其中與對應之所關注的完整抗體相比抗體中之一或多個多肽鍵已經裂解之重組抗體。相反地，「完整」抗體係指重組抗體，其包含重組抗體之所有預期肽鍵及胺基酸(即，基於編碼抗體之多肽之核酸序列所預期的)。

因此，修剪型抗體可被認為係與所關注抗體相關之降解產物。抗體中肽鍵之裂解可(例如)藉由酶促(例如蛋白酶介導之)或非酶活性發生。

在一些實施例中，當裂解抗體多肽中之肽鍵時，在裂解後，多肽鏈之裂解部分可能不再與抗體之其餘部分共價連接；在該情況中，多肽鏈之經裂解之部分可與抗體之其餘部分解離。此最通常發生在裂解位於α多肽鏈的N或C端附近之肽鍵中之時，且與對應之完整抗體相比其產生已失去一或多個胺基酸之修剪型抗體。由於抗體中一或多個胺基酸之失去，此等修剪型抗體具有比對應之完整抗體更少的質量。

或者，在一些其他實施例中，當抗體多肽中之肽鍵被裂解時，在裂解後，多肽鏈之經裂解之部分可能仍然保持與抗體之其餘部分共價連接(例如，藉由鏈內-或鏈間二硫鍵)。在此情況中，即使抗體之肽鍵裂解，多肽鏈之經裂解之部分仍將藉由連接多肽鏈之經裂解之部分至抗體之其餘部分之完整共價鍵保持栓繫至抗體之其餘部分。在此情況中，與完整抗體相比，修剪型抗體仍將具有相同數量之胺基酸及胺基酸序列。另外，在至少一些實施例中，此種類型之修剪型抗體可具有比對應之完整抗體略大的質量。此種質量增加可能係(例如)在肽鍵斷裂時發生的一或多種化學反應之結果。在此等反應中，一或多個原子(例如H、O)可與抗體多肽鏈之原子反應且與抗體鏈共價連接，與對應之完整抗體相比，此導致修剪型抗體質量增加。

由於「修剪型」抗體係由對應之「完整」抗體產生，因此抗體之「修剪」形式具有與抗體之對應「完整」形式相同之胺基酸序列(由於肽鍵裂解，抗體中沒有失去胺基酸的情況)或幾乎相同之胺基酸序列(由於肽鍵裂解，抗體中失去一或多個胺基酸序列的情況)。

通常，抗體之修剪形式具有與對應之完整抗體的質量相似的質量。如上所述，在一些實施例中，修剪型抗體可具有小於對應之完整抗體的質量(例如，在修剪導致抗體失去一或多個胺基酸之情況中)。或者，在一些實施例中，修剪型抗體可具有大於對應之完整抗體的質量(在修剪不導致抗體失去任何胺基酸，而是導致抗體經由一或多個由於肽鍵裂解而發生的反應獲得至少一個原子的情況中)。

在一些實施例中，抗體之修剪形式的質量與對應之完整所關注抗體的質量相差不超過50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%。換言之，在一些實施例中，所關注抗體之修剪形式的質量與對應之所關注的完整抗體的質量相差不超過50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%或0.01%。

如上所述，在一些實施例中，所關注抗體之修剪形式具有小於對應之所關注的完整抗體之質量。例如，在一些實施例中，抗體之修剪形式的質量比對應之所關注的完整抗體的質量小不超過50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%。換言之，若抗體之修剪形式的質量比對應之所關注的完整抗體的質量小不超過10%，則例如若所關注的完整抗體的質量為100,000 Da，則抗體之修剪形式的質量比100,000 Da小不超過10,000 Da (100,000之10%為10,000)-即其具有在90,000 Da與100,000 Da之間之質量。

亦如上所述，在一些實施例中，所關注抗體之修剪形式具有大於對應之所關注的完整抗體之質量。例如，在一些實施例中，抗體之修剪形式的質量比對應之所關注的完整抗體的質量大不超過5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%或0.01%。換言之，若抗體之修剪形式的質量比對應之所關注的完整抗體的質量大不超過1%，則例如若所關注的完整抗體的質量為100,000 Da，則抗體之修剪形式的質量比100,000 Da大不超過1,000 Da(100,000之1%為1,000)-即其具有在100,000 Da與101,000 Da之間之質量。

高分子質量物質 (HMMS)/ 蛋白質聚集體 在一些實施例中，與本文所提供的方法相關之雜質稱為「高分子質量物質」(HMMS)。HMMS係指任何高分子質量污染物或雜質，但通常係形成聚集體之至少兩種蛋白質之締合。舉例來說，HMMS可包括已聚集在一起的所關注抗體之多個分子及/或來自用於產生所關注抗體之宿主細胞之蛋白質之聚集體。聚集體可藉由任何方法包括(例如)分子之共價或非共價連接來產生。

親本抗體 在一些實施例中，與本文所提供的方法相關之雜質為「親本抗體或類似術語。此種類型之雜質分子與本文所提供的方法相關，其中所關注的抗體為由兩種不同親本抗體產生的雙特異性抗體，例如，如圖1中所概述。此等親本抗體為單特異性、同源二聚體。由於多種可能的機制，親本抗體可存在於具有所關注的雙特異性抗體之抗體製劑中，諸如：i)在一些情形中，一些親本抗體分子在還原步驟期間不分離成第一臂及第二臂，將親本抗體分離成單一的第一臂及第二臂(且因此，該等抗體保持為單特異性同源二聚體)；或ii)在一些情形中，來自相同類型之親本抗體之分離的第一臂及第二臂連接在一起，如此其等形成單特異性同源二聚體(而不是參與形成異源二聚體雙特異性抗體)。如本文所用，「親本抗體」係指藉由任何上述機制產生的同源二聚體分子。另外，如本文所提供的抗體製劑可包含來自一種或兩種親本之親本抗體作為雜質。

從雜質純化所關注抗體 本文提供用於從一或多種雜質純化所關注抗體之方法。

在一些實施例中，在本文所提供的方法中，所關注的抗體係呈包含所關注抗體以及一或多種雜質分子之抗體製劑(本文中亦稱為「起始樣品」)。在用於如本文所提供的方法之該起始物質中，所關注的抗體可佔(例如)抗體製劑中蛋白質之至少約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %或95 %(以質量計)。然後，在本文所提供的方法之一些實施例中，收集經純化之流份(在本文中亦稱為「經純化之樣品」)作為來自HA樹脂之洗脫物。該經純化之流份包含所關注的抗體，及在一些實施例中，仍包含一或多種雜質分子。在一些實施例中，在本文所提供的經純化之流份中，所關注的抗體可佔(例如)經純化之流份中蛋白質之至少約20%、30%、40%、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %(以質量計)。

在一些實施例中，在本文所提供的方法中，起始樣品以所關注抗體質量計為至少約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、或95 %，及在相同方法中隨後的經純化之樣品以所關注抗體質量計為至少約20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99%，其中第二值係大於第一值。

在一些實施例中，在本文所提供的方法中，起始樣品包含以所關注抗體之修剪形式質量計至少約0.1 %、0.5 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10 %、15 %、20 %或25 %。在一些實施例中，在本文所提供的方法中，經純化之樣品包含以所關注抗體之修剪形式質量計不超過約0.01 %、0.05 %、0.1 %、0.5 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10 %、15 %或20 %。在一些實施例中，在本文所提供的方法中，起始樣品包含以所關注抗體之修剪形式質量計至少約0.1 %、0.5 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10 %、15 %、20 %或25 %，及在相同方法中隨後的經純化之樣品包含以所關注抗體之修剪形式質量計不超過約0.01 %、0.05 %、0.1 %、0.5 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10 %、15 %或20 %，其中第二值係小於第一值。

在一些實施例中，在本文所提供的方法中，起始樣品包含所關注的完整抗體及所關注抗體之修剪形式，其中修剪型抗體與完整抗體之比率為至少約1:100、1:50、1:25、1:20、1:10、1:5、1:4或1:3。在一些實施例中，在本文所提供的方法中，經純化之樣品包含所關注的完整抗體及所關注抗體之修剪形式，其中修剪型抗體與完整抗體之比率不超過約1:100、1:50、1:25、1:20或1:10。在一些實施例中，在本文所提供的方法中，起始樣品包含所關注的完整抗體及所關注抗體之修剪形式，其中起始樣品中修剪型抗體與完整抗體之比率為至少約1:100、1:50、1:25、1:20、1:10、1:5、1:4或1:3且其中在相同方法中隨後的經純化之樣品中修剪型抗體與完整抗體之比率不超過約1:200、1:100、1:50、1:25、1:20或1:10，其中第二比率係小於第一比率。在一些實施例中，在本文所提供的方法中，起始樣品包含所關注的完整抗體及所關注抗體之修剪形式，其中起始樣品中修剪型抗體與完整抗體之比率在組A(組A比率：1:100、1:50、1:25、1:20、1:10、1:5或1:4)中之約一個比率與組B(組B比率：1:50、1:25、1:20、1:10、1:5、1:4或1:3)中之一個比率之間且其中在相同方法中隨後的經純化之樣品中修剪型抗體與完整抗體之比率不超過約1:200、1:100、1:50、1:25、1:20或1:10，其中在經純化之樣品中之該比率係小於在起始樣品中的。

在一些實施例中，根據本文所提供的方法提供之起始樣品包含至少1、5、10、15、20、25、50、100、200、500、1000、2000、5000或10,000公克所關注完整抗體。在一些實施例中，根據本文所提供的方法提供之經純化之樣品包含至少1、5、10、15、20、25、50、100、200、500、1000、2000、5000或10,000公克所關注的完整抗體。在一些實施例中，根據本文所提供的方法提供之起始樣品包含至少5、10、15、20、25、50、100、200、500、1000、2000、5000或10,000公克所關注的完整抗體。在相同方法中隨後的經純化之樣品包含至少1、5、10、15、20、25、50、100、200、500、1000、2000或5000公克所關注的完整抗體，其中第一值係大於第二值。

另外，關於a)起始樣品或經純化之樣品中所關注抗體的量或b)純度之任何以上描述可參考相同樣品一起使用。例如，如上所述，起始樣品可包含以所關注抗體質量計至少約80 %；另外，亦如以上所述，起始樣品可包含至少約10公克所關注抗體。因此，本文亦提供起始樣品，其包含以所關注抗體質量計至少約80 %及至少10公克所關注抗體等。

一般技術 除非另有指示，否則本發明之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，此等技術係在本技術範圍內。此類技術充分闡釋於文獻中，諸如，Molecular Cloning：實驗室手冊，第二版(Sambrook等人，1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology，Humana Press；Cell Biology：實驗室筆記本 (J.E. Cellis編，1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts，1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture：實驗室程序 (A. Doyle、J.B. Griffiths及D.G. Newell編，1993-1998) J. Wiley及Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及C.C. Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編，1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編，1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis等人編，1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等人編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及Sons，1999)；Immunobiology (C.A. Janeway及P. Travers，1997)；Antibodies (P. Finch，1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty.編，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd及C. Dean編，Oxford University Press，2000)；Using antibodies：實驗室手冊 (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；The Antibodies (M. Zanetti及J.D. Capra編，Harwood Academic Publishers，1995)以及以上參考文獻之隨後的版本及對應之網站(若適用的話)。

提供以下實施例僅用於說明目的，而無意以任何方式限制本發明之範圍。事實上，除了彼等本文所示及所述者之外，本發明之各種改變對於熟習此項技術者而言從前述描述將變得顯而易見且落在隨附申請專利範圍的範圍內。

實例實例 1 ：藉由 cHA 樹脂層析純化抗 -BCMA/ 抗 -CD3 雙特異性抗體 目標： 在該實例中，檢查用於從各種雜質分離所關注的全長雙特異性人類IgG之方法。所關注抗體為異源二聚體雙特異性抗-BCMA/抗-CD3抗體(即雙特異性抗體之一個臂對BCMA具有特異性，及另一臂對CD3具有特異性)。在純化開始時與所關注雙特異性抗體一起存在的雜質包括：i)所關注完整抗-BCMA/抗-CD3雙特異性抗體之修剪形式；ii)同源二聚體、單特異性抗-BCMA親本抗體；iii)同源二聚體、單特異性抗-CD3抗體；及iv)蛋白質聚集體/高分子質量物質(HMMS)。

從雙特異性抗體之修剪形式純化所關注的完整雙特異性抗體呈現特別的挑戰，因為雙特異性抗體之修剪形式包含與所關注的完整雙特異性抗體相同數量之胺基酸及相同胺基酸序列，且與完整雙特異性抗體之質量相差僅18道耳頓(Da)。具體言之，完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體的質量為148095.5 Da，而雙特異性抗體之對應修剪形式的質量為148113.5(藉由質譜法測定)。因此，修剪型雙特異性抗體的質量與完整雙特異性抗體的質量相差小於0.1% (甚至小於0.02%)(即148095 Da之0.1%為148 Da； 148095 Da之0.02%為29.6 Da)。換言之，修剪型雙特異性抗體的質量為所關注的完整雙特異性抗體的質量之100.01%。因此，修剪型雙特異性抗體的質量係與所關注的完整雙特異性抗體的質量極相似。

雙特異性抗體之修剪形式在抗-CD3重鏈之肽鍵中(在重鏈之第56位及第57位胺基酸之間)含有裂解。該抗-CD3重鏈具有如SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列，且因此，在SEQ ID NO: 2之「RG」序列中的胺基酸R與G之間發生裂解(「RG」僅在SEQ ID NO: 2中出現一次)。據信，與完整雙特異性抗體相比，該裂解導致修剪型雙特異性抗體中增加1個氧原子及2個氫原子(此將相當於質量增加18 Da)。此外，儘管在抗-CD3重鏈中存在經裂解之肽鍵，但重鏈之經裂解之56個胺基酸部分(即鏈之頭56個胺基酸)仍然藉由完整、保留之鏈內二硫鍵結合至抗體之其餘部分。鏈內二硫鍵位於抗-CD3重鏈之C22與C98 (即SEQ ID NO: 2中所示序列之C22與C98)之間。藉由鏈內肽鍵將經裂解之56個胺基酸部分連續地繫栓至抗體之其餘部分示意性地顯示於圖2中。

在圖2中，左邊的示意圖描繪所關注的完整雙特異性抗體，其包含雙特異性抗體之抗-CD3及抗-BCMA臂之完整重鏈及輕鏈(在該圖中，較長的鏈代表抗體之重鏈，及較短的鏈代表輕鏈)。另外，圖2亦顯示各種抗體內二硫鍵，包括鏈內二硫鍵(例如，連接相同輕鏈或重鏈中之不同胺基酸)、以及鏈間二硫鍵(例如連接抗-BCMA臂之重鏈至抗-CD3臂之重鏈，或連接抗-CD3臂之輕鏈至抗-CD3臂之輕鏈)。

在開發從各種雜質純化所關注的完整雙特異性抗體之方法中提出的另一個挑戰係開發可在純化相對大量之所關注雙特異性抗體時有效地從雜質分離所關注雙特異性抗體之方法之目標。例如，與該實例相關的工作之一個目標係欲開發用於純化雙特異性抗體之方法，該方法對於欲純化至少1公克雙特異性抗體之方法而言將係有效的。如本技術中已知的，大規模純化蛋白質通常存在在小規模純化相同蛋白質期間不存在(或明顯不太成問題)的許多困難，此歸因於(例如)難以實現在大規模進行層析時在不同蛋白質之間獲得明顯層析解析度。

材料及方法： 用於該工作之起始材料為包含所關注的雙特異性IgG抗-BCMA/CD3抗體以及各種雜質(諸如彼等上述雜質)之抗體製劑。雙特異性抗體之多肽之胺基酸序列係顯示於如下SEQ ID NO: BCMA重鏈：SEQ ID NO: 6；BCMA輕鏈：SEQ ID NO:8；CD3重鏈：SEQ ID NO:2；CD3輕鏈：SEQ ID NO:4中。如本文前面所述，所關注的雙特異性抗體已自兩種單獨的親本抗體製備。更具體而言，已藉由蛋白質-A層析純化親本單特異性抗-CD3及抗-BCMA抗體，且此等經純化之親本單特異性抗-CD3及抗-BCMA抗體已被用於產生所關注的雙特異性抗-BCMA/CD3抗體。然後，已藉由離子交換層析純化產生的雙特異性抗-BCMA/CD3抗體。從包含所關注雙特異性抗體及各種殘留雜質之離子交換柱中洗脫用作該實例中純化工作之起始材料的抗體製劑，且其具有濃度大致為：50 mM Tris及60 mM甘胺酸(pH 7.5)之緩衝液/鹽。該抗體製劑包含超過85 %(以質量計)之所關注的完整雙特異性抗體；其亦包含約8%修剪型雙特異性抗體、約1%單特異性抗-BCMA親本抗體、約1%單特異性抗-CD3親本抗體及約2%蛋白質聚集體/高分子質量物質(HMMS)。因此，雖然用作該方法中起始材料的抗體製劑包含已經相對純的所關注的完整雙特異性抗體，但該方法之目標係開發提高完整雙特異性抗體之純度之方法。

結果： 測試多種不同層析樹脂及條件，以試圖鑑定適宜之樹脂及緩衝液條件，該等條件允許從修剪型雙特異性抗體、單特異性親本抗體及蛋白質聚集體中有效地純化所關注的完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體。在此過程中，例如，測試多種不同離子交換及疏水性相互作用樹脂、以及各種緩衝液及pH條件。經過大量測試後，羥基磷灰石樹脂係可允許從各種雜質(包括修剪型雙特異性抗體)有效地純化完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體之唯一的樹脂。

圖3顯示從陶瓷羥基磷灰石(「cHA」)樹脂柱洗脫所關注雙特異性抗體及從多種不同雜質同時分離所關注的抗-BCMA/CD3雙特異性抗體(包括雙特異性抗體之修剪形式、兩種親本抗體及高分子質量蛋白質物質)之層析曲線。就描繪於圖3中之層析運行而言，加載至cHA樹脂上之抗體製劑外加額外的親本抗-BCMA及親本抗-CD3抗體，以便更清楚地鑑定此等分子從cHA柱洗脫的位置(然而，未加入額外的完整或修剪型雙特異性抗體)。在圖3中，X軸從左到右描繪來自cHA柱之洗脫物之序列(即，左邊的材料早於右邊的材料/在更低的鹽下從cHA柱洗脫)。通常，從管柱中以連續流份形式收集洗脫物；因此，X軸亦可被認為描繪來自cHA樹脂柱之洗脫物流份之順序。Y軸描繪UV吸光度(在280 nM下)及電導率，如圖中單獨指出的。UV吸光度對應於洗脫的蛋白質之存在，及電導率對應於洗脫材料中之鹽濃度。因此，圖3描繪隨著流過cHA樹脂的洗脫緩衝液中之鹽濃度增加，來自cHA樹脂柱之不同蛋白質之洗脫曲線。遵循圖3中之UV圖(從左到右)，該圖顯示各個峰及肩峰，其對應於所關注的完整雙特異性抗-BCMA/CD3抗體或各種雜質。具體而言，從左到右，第一UV峰對應於第一親本抗體(「親本1」；單特異性抗-BCMA同源二聚體)之洗脫。下一個主峰之早期流份(及圖中之最大峰)對應於所關注的完整雙特異性抗體蛋白(「POI」)。該相同主峰之後端/尾端對應於雙特異性抗體之修剪形式(「修剪型」)。雖然完整雙特異性抗體之洗脫曲線與修剪型雙特異性抗體之洗脫曲線之間存在一些重疊，但此兩種抗體類型在足夠不同的鹽條件及流份下均從cHA柱洗脫，以便從雙特異性抗體之修剪形式顯著分離完整雙特異性抗體。最後，在雙特異性抗體之修剪形式洗脫後，cHA柱之最後一個主峰/肩峰對應於第二親本抗體(單特異性抗-CD3同源二聚體)以及高分子質量物質(「HMMS」)(亦稱為蛋白質聚集體)從cHA柱中之洗脫。因此，圖3的圖顯示可藉由cHA樹脂層析從多種雜質(包括相關的修剪型及親本抗體物質)有效地純化完整抗-BCMA/CD3抗體。

圖4提供顯示關於來自cHA樹脂柱的依序洗脫之流份中存在的不同分子物質之更詳細資訊的圖，根據描繪於圖3中之cHA洗脫曲線。具體而言，圖4提供關於以下物質之相對量之詳細資訊：i)所關注的完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體蛋白質(「POI」)；ii)雙特異性抗體之修剪形式；iii)第一親本抗體/單特異性抗-BCMA抗體；iv)第二親本抗體/單特異性抗-CD3抗體；及v)從cHA柱洗脫的不同流份中之高分子質量物質(「HMMS」)。圖4的X軸從左到右描繪來自cHA柱之洗脫物之順序(即從低鹽至高鹽；每個數據點指示從管柱洗脫的流份)。圖4的Y軸在左側描繪以下各者的百分比：i)所關注的完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體蛋白質(「POI」)；ii)雙特異性抗體之修剪形式；iii)第一親本抗體/單特異性抗-BCMA抗體；及iv)各流份中之第二親本抗體/單特異性抗-CD3抗體。圖4中的Y軸在右側描繪每個流份中之HMMS%。

用於生成圖3中的數據之方法亦與尚未外加任何額外抗體之抗體製劑一起使用；該色譜運行之數據顯示於圖5中。因此，圖5中的數據反映在製備抗-BCMA/CD3雙特異性抗體期間藉由cHA樹脂純化從離子交換柱洗脫的典型抗體製劑，其主要包含所關注的完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體以及各種雜質(包括雙特異性抗體之修剪形式)。在圖5中，X軸從左到右描繪來自cHA柱之經洗脫之材料之順序。Y軸描繪UV吸光度(在280 nM下)及電導率，如圖中單獨指出的。親本1及親本2峰在圖5中比在圖3中小，因為就圖5而言加載於cHA柱上的樣品未外加額外的親本1及親本2抗體(而就圖3而言，樣品外加額外的親本1及親本2抗體)。

圖6提供顯示關於從cHA樹脂回收所關注的完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體以及來自cHA樹脂的各種經洗脫之流份中修剪型雙特異性抗體的相對量之額外資訊的圖。X軸從左到右描繪來自cHA柱之洗脫物之順序(即從低鹽至高鹽；每個數據點指示從管柱洗脫的流份)。沿垂直軸/Y軸，繪製每個流份之三個不同變量：變量1)(菱形)：完整雙特異性抗體累積回收率(「POI%」)，其係在層析運行中藉由該流份從cHA柱中回收的完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體(即所關注的蛋白質)的總量(換言之，就好像係收集在運行期間從cHA柱洗脫且包括該流份之所有物質並組併在一起，且然後測定該經組併之物質中完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體之總量)；此外，「POI%」值表示為加載至cHA柱上的已回收之所關注的完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體/蛋白質的總量之百分比(即，不是表示為以公克計的值)。變量2)(正方形)：各個流份中蛋白質之%，該蛋白質為修剪型雙特異性抗體(「修剪型%」)。變量3)(三角形)：修剪型雙特異性抗體累積回收率(「累積修剪型」)，其係在層析運行中藉由該流份從cHA柱回收的修剪型雙特異性抗體之總量。另外，在圖6的圖中，左側Y軸列出POI%值，及右側Y軸列出修剪型%值。

圖6亦包含顯示圖6中之某些不同流份對應於如圖5中所所示層析曲線中之不同UV吸光度點之程度之資訊。因此，例如，圖5顯示來自cHA樹脂之UV吸光度/蛋白質洗脫之最大峰對應於所關注蛋白質/完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體。來自cHA柱之UV吸光度/蛋白質洗脫之該大峰之頂部亦被稱為運行之「頂點」；對應於該頂點之層析流份峰標註於圖6中。然後，圖6中亦標註在頂點峰之後的各個點。此等點為「90%」、「80%」、「70%」、「60%」及「50%」，且其等可如下計算得。將在頂點下之UV吸光度值設為額外計算之起點。然後，確定為頂點UV值之90%的UV值。在層析運行期間實現頂點UV值之後(即，朝峰尾端)發生的90%頂點UV值記為「90%」流份；其在本文中亦可稱為「頂點後後90%」流份或類似術語。重複該過程以得到80%、70%、60%及50%值(即，此等值中的每一個均從峰尾端進一步向下，且因此代表所收集材料的量越來越大)。如圖6所顯示，隨著頂點值之%減小，流份中之修剪型%增加。此與修剪型雙特異性抗體相比完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體在更晚的時間/在更高的鹽條件下從cHA柱洗脫之過程一致。因此，若收集具頂點峰值之更多流份(即，至更低的峰值頂點後流份%)，由於完整雙特異性抗體及修剪型雙特異性抗體之洗脫曲線之間的部分重疊，則亦將收集更多的修剪型雙特異性抗體。

來自圖6之各個值亦提供於下表1中。如表1中所顯示，根據本文所提供的cHA純化方法，例如，若收集來自cHA柱的峰值頂點後90%洗脫物(即藉由「峰值頂點後90%」流份之POI%回收率)，則回收加載至cHA柱上的所關注的完整雙特異性抗體/蛋白質之54%，且該回收的蛋白質池包含0%修剪型雙特異性抗體。在另一個實例中，若收集來自cHA柱的峰值頂點後50%洗脫物(即藉由「峰值頂點後50%」流份之POI%回收率)，則回收加載至cHA柱上的所關注的完整雙特異性抗體/蛋白質之74%，且該回收的蛋白質池包含0.2 %修剪型雙特異性抗體。因此，如圖6及表1中所顯示，可藉由cHA樹脂有效地實現從修剪型雙特異性抗體穩健純化所關注的完整雙特異性抗體。表1

就如圖3至6中所所示cHA層析結果而言，可如下進行cHA層析。將包含所關注雙特異性抗-BCMA/CD3抗體及各種雜質之抗體製劑加載至包含cHA樹脂之層析柱上。cHA樹脂為1型cHA，40 μm珠粒尺寸(Bio-Rad)。就描繪於圖3及4中之層析運行而言，將cHA樹脂加載樣品至cHA樹脂上之蛋白質密度為30 g/L。就描繪於圖5及6中之層析運行而言，將cHA樹脂加載樣品至cHA樹脂上之蛋白質密度為10 g/L。在將樣品加載至cHA樹脂上之前，用5柱體積之平衡緩衝液1預平衡該樹脂，然後用5柱體積之平衡緩衝液2預平衡。該方法中所描述的各種緩衝液之組成列於下表2中。將包含經部分純化之所關注雙特異性抗-BCMA/CD3抗體之抗體製劑於包含約50 mM Tris及60 mM甘胺酸之加載緩衝液(pH7.5)中加載至cHA樹脂柱上。將抗體製劑加載至cHA樹脂柱上後，接著用3柱體積之洗滌緩衝液洗滌該管柱。然後，使用20柱體積之洗脫緩衝液從cHA樹脂洗脫所關注雙特異性抗體(即完整雙特異性抗體)，其中在洗脫過程中洗脫緩衝液中之磷酸鈉濃度從40 mM增加至80 mM。如圖3至6中所顯示，與所關注雙特異性抗體一起存在於抗體製劑中的各種雜質亦應洗脫緩衝液而從cHA柱洗脫，但其等在與所關注的完整抗-BCMA/CD3雙特異性抗體完全不同之鹽濃度下洗脫，使得該完整雙特異性抗體可有效地從各種雜質(包括完整雙特異性抗體之修剪形式)分離。

在根據上述方案藉由洗脫緩衝液從cHA樹脂柱洗脫所關注蛋白質後，可接著用5柱體積之剝離緩衝液剝離cHA樹脂，接著用5柱體積之消毒緩衝液消毒，然後係5柱體積之存儲緩衝液。

就從cHA柱洗脫之不同材料之每種上述分析物而言，藉由分析型陽離子交換(CEX)分析確定各個流份/池中不同分子物質之類型及量。表2

實例 2 ：藉由 cHA 樹脂層析 ( 質量加載挑戰 ) 純化抗 -BCMA/ 抗 -CD3 雙特異性抗體 目標該實例之目標係欲確定實例1中所述之雙特異性抗體純化方法是否可有效地結合各種cHA樹脂柱質量加載挑戰使用。例如，一個特定目標係欲確定就cHA樹脂柱上之各種質量加載挑戰而言是否可持續回收輸入雙特異性抗體超過50%，同時所回收的經純化之雙特異性抗體產物中作為雜質之修剪型雙特異性抗體不超過1%。

材料及方法： 用於該實例之材料及方法係與實例1中的相同，不同之處在於cHA樹脂加載有抗體製劑樣品至cHA樹脂上之蛋白質密度(在不同層析運行中)為8 g/L、10 g/L或12 g/L。

結果： 此等層析運行之結果概述於下表3中。就所有3次層析運行而言，收集峰值頂點後90%材料(如實例1中所述)並分析。如表3中所顯示，就8 g/L、10 g/L及12 g/L質量挑戰中的每一者而言，回收經加載之完整雙特異性抗體之超過50%作為經純化之雙特異性抗體，且所回收的經純化之雙特異性抗體產物包含少於1%之修剪型雙特異性抗體作為雜質。

因此，此等實驗顯示在各種cHA樹脂質量加載挑戰下，可藉由cHA樹脂層析始終有效地從修剪型雙特異性抗體分離所關注的完整雙特異性抗體。表3

實例 3 ：藉由 cHA 樹脂層析 ( 不同 pH 挑戰 ) 純化抗 -BCMA/ 抗 -CD3 雙特異性抗體 目標：該實例之目標係欲確定實例1中所述之雙特異性抗體純化方法是否可在不同pH條件下有效地進行。

材料及方法： 用於該實例之材料及方法係與實例1中的相同，不同之處在於整個方法中所使用的緩衝液之pH為pH 7.0、pH 7.5或pH 8.0 (在不同層析運行中)。就此等層析運行而言，將cHA樹脂加載抗體製劑樣品至cHA樹脂上之蛋白質密度為30 g/L。

結果： 此等層析運行之結果概述於下表4中。就所有3次層析運行而言，收集峰值頂點材料(如實例1中所述)並分析。如表4中所顯示，針對於每種不同所測試pH條件成功地回收所關注的完整雙特異性抗體蛋白，且pH 7.5產生所關注蛋白之最高回收率。(就此等層析運行而言，未單獨確定經純化之材料中修剪型雙特異性抗體的量。)

因此，此等實驗顯示可在不同pH條件下藉由cHA樹脂層析有效地純化所關注的完整雙特異性抗體。表4

實例 4 ：藉由 cHA 樹脂層析純化抗 -FLT3/ 抗 -CD3 雙特異性抗體 目標： 該實例之目標係欲確定實例1中所述之雙特異性抗體純化方法是否可利用與實例1中所使用不同的雙特異性抗體有效地進行，其中亦需要從各種雜質(包括具有相似質量之相關修剪型雙特異性抗體)分離所關注的完整雙特異性抗體。在該實例中，所關注抗體為異源二聚體雙特異性抗-FLT3/抗-CD3抗體。

材料及方法： 用於該實例中的異源二聚體雙特異性抗-FLT3/抗-CD3抗體包含與實例1中相同之抗-CD3重鏈及輕鏈。雙特異性抗體之FLT3臂中之多肽之胺基酸序列係顯示於如下SEQ ID NO: FLT3重鏈：SEQ ID NO:10；FLT3輕鏈：SEQ ID NO: 12中。

該實例中之雙特異性抗體之修剪形式在與實例1中所述之抗-CD3重鏈相同之位置中具有修剪。

用於該實例之材料及方法係與實例1中的相同，不同之處在於，如以上所述，抗體製劑樣品包含雙特異性抗-FLT3/抗-CD3抗體。將cHA樹脂加載抗體製劑樣品至cHA樹脂上之蛋白質密度為10 g/L。

結果： 圖7顯示提供關於從cHA樹脂回收所關注的完整雙特異性抗-FLT3/CD3抗體以及來自cHA樹脂的各種經洗脫之流份中修剪型雙特異性抗體的相對量之資訊的圖。X軸從左到右描繪來自cHA柱之洗脫物之順序(即從低鹽至高鹽；每個數據點指示從管柱洗脫的流份)。沿垂直軸/Y軸，繪製每個流份之三個不同變量：變量1)(菱形)：POI%；變量2)(正方形)：修剪型%；及變量3)(三角形)，其各係如實例1中針對圖6所述確定。另外，在圖7的圖中，左側Y軸列出POI%值，及右側Y軸列出修剪型%值。圖7亦包含顯示圖7中之某些不同流份對應於對應之層析曲線中之不同UV吸光度點(未顯示)之程度之資訊。標記為「頂點」、「85%」及「60%」之點係以如針對圖6所述之相同方式確定。

來自圖7之多個值亦提供於下表5中。如表5中所顯示，本文所提供之cHA樹脂純化方法允許(例如)回收超過80%之所關注的完整雙鏈特異性抗-FLT3/CD3抗體，同時在經純化之抗體產物中具有少於1%之修剪型雙特異性抗體。

因此，如圖7及表5中所顯示，可藉由cHA樹脂有效地實現從修剪型雙特異性抗體純化完整雙特異性抗-FLT3/CD3。表5

雖然已參考各種應用、方法、套組及組合物描述所揭示的教示，但應瞭解，在不脫離本文教示及以下所主張的發明之情況下，可進行各種改變及修改。提供前述實例以更好地說明所揭示的教示，而無意限制本文所呈現教示之範圍。雖然已根據此等示例性實施例描述本發明教示，但熟習此項技術者將容易理解，此等示例性實施例之許多變化及修改係可能的，而無需過度的實驗。所有此等變化及修改均在當前教示之範圍內。

本文引述的所有參考文獻(包括專利、專利申請案、論文、教科書及類似物)及其中引述的參考文獻在其等尚沒有的程度上係以全文引用的方式併入本文中。假如所併入的文獻及類似材料中之一或多者與本申請案(包括(但不限於)所定義之術語、術語用法、所描述之技術或類似)不同或相矛盾，則以本申請案為準。

前述描述及實例詳述本發明之某些特定實施例並描述發明人設想的最佳模式。然而，應瞭解，不論前述內容可如何詳細地出現在文本中，本發明可以多種方式實施且應根據隨附申請專利範圍及其任何等效物來解釋本發明。

應瞭解，在本文中用語句「包含」描述任何實施例時，亦提供以「由...組成」及/或「基本上由...組成」描述之其他類似實施例。

在根據Markush組或其他替代物組描述本發明之態樣或實施例之情況中，本發明不僅包括作為整體列出的整個組，且包括該組中的每個獨立的成員及主要組的所有可能的子組，而且包括缺少一或多個組成員的主要組。本發明亦設想明確排除所主張發明中的任何組成員中之一或多者。

除非另外定義，否則本文所使用的所有技術及科學術語具有如熟習本發明所屬技術者通常所理解之相同含義。假如發生衝突，將以本說明書(包括定義)為準。在本說明書及申請專利範圍中，詞語「包括(comprise)」或變化形式(諸如「包括(comprises/comprising)」)將被理解為意指包括所述整數或整數組，但不排除任何其他整數或整數組。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數及複數術語應包括單數。在術語「例如(e.g./for example)」之後的任何實例並不意味著窮舉或限制。除非上下文清楚地另作指明，否則術語「或」在用於多個選項(例如「A、B或C」)列表之上下文中時應解釋為包括該等選項中之任何一者或多者。

本文描述示例性方法及材料，然而，與彼等本文所述者類似或等效之方法及材料亦可用於本發明之實踐或測試中。該等材料、方法及實例僅係說明性的而無意限制性的。

圖1描繪製備雙特異性抗體之方法之概視圖，該雙特異性抗體可根據本文所提供之方法進行純化。

圖2描繪示例性i)完整雙特異性抗體(左側圖)及ii)雙特異性抗體之修剪形式(右側圖)之概視圖，其中該修剪型雙特異性抗體為可與完整雙特異性抗體一起存在於抗體製劑中之雜質。

圖3描繪顯示藉由從HA樹脂洗脫從多種不同雜質分離所關注的抗-BCMA/抗-CD3雙特異性抗體(「POI」)之層析圖。

圖4描繪顯示根據如圖3之層析圖中所描繪的HA層析運行從HA樹脂洗脫的不同流份中之不同種蛋白質(包括所關注抗體及各種雜質)之相對量的圖。

圖5描繪顯示藉由從HA樹脂洗脫從多種不同雜質分離所關注的抗-BCMA/抗-CD3雙特異性抗體(「POI」)之層析圖。

圖6描繪顯示根據如圖5之層析圖中所描繪的HA層析運行從HA樹脂洗脫的不同流份中之不同種蛋白質(包括所關注抗體及各種雜質)之相對量的圖，其中所關注的抗-BCMA/抗-CD3雙特異性抗體(「POI」)係藉由從HA樹脂洗脫從多種不同雜質分離。

圖7描繪顯示根據HA層析運行從HA樹脂洗脫的不同流份中之不同種蛋白質(包括所關注抗體及各種雜質)之相對量的圖，其中所關注的抗-FLT3/抗-CD3雙特異性抗體係藉由從HA樹脂洗脫從多種不同雜質分離。

<110> 美商輝瑞大藥廠(Pfizer Inc.)

<120> 抗體純化

<140> TW 108106273

<141> 2019-02-25

<150> US 62/635,943

<151> 2018-02-27

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 1

<210> 2

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 2

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 3

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 4

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 5

<210> 6

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 6

<210> 7

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 7

<210> 8

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 8

<210> 9

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 9

<210> 10

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 10

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 11

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

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Claims

一種純化雙特異性抗體之方法，該方法包括：A)將加載緩衝液中之抗體製劑加載至陶瓷羥基磷灰石(cHA)樹脂上，其中：該抗體製劑包含：I)所關注的完整雙特異性抗體；及II)至少一種雜質，其中該雜質係選自由如下組成之群：a)所關注雙特異性抗體之修剪形式，其中該所關注雙特異性抗體之該修剪形式為該所關注完整雙特異性抗體之降解產物、與該所關注完整抗體相比缺失至少一個肽鍵，且其質量與該所關注的完整雙特異性抗體之質量相差小於1%；b)第一親本抗體，其中該第一親本抗體為具有與該完整雙特異性抗體之第一臂相同之抗原特異性之單特異性抗體；c)第二親本抗體，其中該第二親本抗體為具有與該完整雙特異性抗體之第二臂相同之抗原特異性之單特異性抗體；及d)高分子質量物質(HMMS)；B)以洗滌緩衝液洗滌該經加載之HA樹脂；及C)用包含離子之洗脫緩衝液從該cHA樹脂洗脫該所關注的完整雙特異性抗體，其中該洗脫緩衝液中離子為磷酸根，使得該所關注的完整雙特異性抗體與該至少一種雜質分離；其中該雙特異性抗體係抗-BCMA/抗-CD3雙特異性抗體，其包含抗-BCMA臂及抗-CD3臂，其中：(a)該抗-CD3臂包含(i)包含如SEQ ID NO：1中所示胺基酸序列之VH區及包含如SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列之VL區；或(ii)包含如SEQ ID NO：2中所示胺基酸序列之重鏈及包含如SEQ ID NO：4中所示胺基酸序列之輕鏈；以及(b)該抗-BCMA臂包含(i)包含如SEQ ID NO：5中所示胺基酸序列之VH區及包含如SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列之VL區；或(ii)包含如SEQ ID NO：6中所示胺基酸序列之重鏈及如SEQ ID NO：8中所示胺基酸序列之輕鏈。
如請求項1之方法，其中該抗體製劑中該修剪型雙特異性抗體之分子與該完整雙特異性抗體之分子之比率係在至少1：50與不大於1：5之間；其中該方法包含收集從該cHA樹脂洗脫的經純化之流份，其中該經純化之流份包含該完整雙特異性抗體。
如請求項1或2之方法，其中該抗體為異源二聚體雙特異性抗體。
如請求項1或2之方法，其進一步包括收集從該cHA樹脂洗脫的經純化之流份，其中該經純化之流份包含該所關注的完整抗體，且其中該經純化之流份包含以所關注的完整抗體質量計至少95%、96%、97%、98%、或99%。
如請求項2之方法，其中該經純化之流份包含該完整雙特異性抗體及該修剪型雙特異性抗體，此外，其中該經純化之流份中修剪型雙特異性抗體分子與完整雙特異性抗體分子之比率係不大於1：100。
如請求項1或2之方法，其中將該抗體製劑加載至該cHA樹脂上，使在該樹脂上之密度為5g/L至20g/L。
如請求項1或2之方法，其中將至少1公克抗體製劑加載至該cHA樹脂上。
如請求項1或2之方法，其中該抗體製劑包含以所關注的完整抗體質量計至少50%但小於95%。
如請求項1或2之方法，其中該修剪型抗體之質量比該完整抗體之質量大5至100道耳頓。
如請求項1或2之方法，其中該修剪型抗體在該抗體之多肽鏈中具有經裂解之肽鍵，且其中該經裂解之肽鍵係在該抗體之重鏈中。
如請求項1或2之方法，其中該修剪型抗體包含與該完整抗體相同數量之胺基酸及相同胺基酸序列。
如請求項1或2之方法，其中該修剪型抗體包含與該完整抗體不同數量之胺基酸。
如請求項1或2之方法，其中該所關注抗體包含特異性結合至CD3之VH及VL域，且其中該修剪型抗體在特異性結合至CD3之VH域中包含經裂解之肽鍵。
如請求項1或2之方法，其中該洗滌緩衝液包含濃度為10-50mM之磷酸根離子。
如請求項1或2之方法，其中該磷酸根離子之濃度在該洗脫期間係從約40mM增加至100mM。
如請求項1或2之方法，其中該加載緩衝液、洗滌緩衝液及洗脫緩衝液中之至少一者的pH為pH7.0或8.0或在pH 7.0與8.0之間。
如請求項1或2之方法，其中該抗體製劑包含蛋白質，該蛋白質預先加載至如下中之至少一者上並從中洗脫：i)蛋白質A樹脂及ii)離子交換樹脂。
如請求項1或2之方法，其中該抗體係經分離及/或純化以用作藥物或用於製備藥物。