BR112020015603A2

BR112020015603A2 - Purificação de anticorpo

Info

Publication number: BR112020015603A2
Application number: BR112020015603-5A
Authority: BR
Inventors: Timothy Iskra; Ashley Margaret SACRAMO
Original assignee: Pfizer Inc.
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2021-01-05
Also published as: KR20200115569A; AU2019228377A1; JP7449041B2; IL276816A; RU2020128326A3; KR102665277B1; AU2023203205A1; RU2020128326A; TW201936644A; KR20240067985A; MX2020008931A; SG11202007222RA; WO2019166932A1; US20240158473A1; US20210017254A1; JP2024042088A; TWI839347B; JP2019147793A; AU2019228377B2; CA3034795A1

Abstract

a presente invenção refere-se a métodos para a purificação de anticorpos são fornecidos. os métodos de purificação fornecidos envolvem o uso de resina hidroxiapatita (ha) para separar um anticorpo de interesse de uma ou mais impurezas. a impureza pode ser um anticorpo grampeado que compreende uma ligação peptídica clivada no domínio vh.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PURIFI- CAÇÃO DE ANTICORPO".

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Nor- te-americano No. 62/635.943, depositado em 27 de fevereiro de 2018, cujo conteúdo está no presente documento incorporado por referência em sua totalidade. Campo

[002] A presente invenção refere-se a métodos para purificar an- ticorpos de impurezas, tais como produtos de degradação de anticor- pos. Os métodos de purificação no presente documento descritos en- volvem o uso de resinas hidroxiapatita. Antecedente

[003] Os anticorpos são moléculas biológicas importantes para usos médicos, diagnósticos, industriais e outros. Embora muitos méto- dos e reagentes estejam disponíveis para a produção recombinante de anticorpos, devido, por exemplo, ao tamanho e complexidade molecu- lar dos anticorpos, frequentemente permanece difícil produzir e purifi- car eficientemente um anticorpo recombinante de interesse, particu- larmente em níveis produção em larga escala/industrial.

[004] Por exemplo, durante a produção de um anticorpo recombi- nante de interesse, às vezes, um produto de degradação relacionado ao anticorpo de interesse pode surgir; o produto de degradação é uma impureza indesejada. Este produto de degradação pode ter algumas propriedades moleculares muito similares ao anticorpo de interesse (por exemplo, sequências ou massa de aminoácidos idênticos ou qua- se idênticos). Devido às semelhanças moleculares entre o anticorpo intacto de interesse e a versão degradada do anticorpo, pode ser mui- to difícil separar efetivamente o anticorpo intacto do anticorpo degra- dado.

[005] Por conseguinte, são necessários métodos novos e melho-

rados para a purificação de anticorpos contra impurezas. Sumário

[006] São no presente documento fornecidos métodos para puri- ficar um anticorpo de interesse de uma ou mais impurezas.

[007] Em algumas modalidades, é no presente documento forne- cido um método para purificar um anticorpo compreendendo: A) carre- gar uma preparação de anticorpo em um tampão de carga em uma resina hidroxiapatita (HA), em que: a preparação de anticorpo compre- ende: I) um anticorpo intacto de interesse e II) uma versão grampeada do anticorpo de interesse, em que a versão grampeada do anticorpo de interesse é uma produção de degradação do anticorpo intacto de interesse e tem uma massa que é menos de 10 % diferente da massa do anticorpo intacto de interesse; e B) eluir o anticorpo intacto de inte- resse da resina HA com um tampão de eluição.

[008] Em algumas modalidades, é no presente documento forne- cido um método para purificar um anticorpo biespecífico compreen- dendo: A) carregar uma preparação de anticorpo em um tampão de carga em uma resina hidroxiapatita (HA), em que: a preparação de an- ticorpo compreende: I) um anticorpo biespecífico intacto de interesse; e II) pelo menos uma espécie de impureza, em que as espécies de impureza são selecionadas do grupo que consiste em: a) uma versão grampeada do anticorpo biespecífico de interesse, em que a versão grampeada do anticorpo biespecífico de interesse é uma produção de degradação do anticorpo biespecífico intacto de interesse, e tem uma massa que é menos de 10 % diferente da massa do anticorpo biespe- cífico intacto de interesse; b) um primeiro anticorpo origem, em que o primeiro anticorpo origem é um anticorpo monoespecífico com a mes- ma especificidade de antígeno que uma primeira subdivisão do anti- corpo biespecífico intacto; c) um segundo anticorpo origem, em que o segundo anticorpo origem é um anticorpo monoespecífico com a mesma especificidade de antígeno que uma segunda subdivisão do anticorpo biespecífico intacto; e d) espécies de massa molecular ele- vada (HMMS); e B) eluir o anticorpo biespecífico intacto de interesse da resina HA com um tampão de eluição.

[009] Em algumas modalidades, é no presente documento forne- cido um método para purificar um anticorpo biespecífico compreen- dendo: A) carregar uma preparação de anticorpo em um tampão de carga em uma resina hidroxiapatita (HA), em que: I) a preparação de anticorpo compreende: a) um anticorpo biespecífico intacto de interes- se e b) uma versão grampeada do anticorpo biespecífico de interesse, em que a versão grampeada do anticorpo de interesse é uma produ- ção de degradação do anticorpo biespecífico intacto de interesse e tem uma massa que é menos de 10 % diferente da massa do anticor- po biespecífico intacto de interesse; e II) a relação de moléculas do anticorpo biespecífico grampeado para moléculas do anticorpo biespe- cífico intacto na preparação de anticorpos está entre pelo menos 1:50 e não maior que 1:5; B) eluir o anticorpo biespecífico intacto da resina HA com um tampão de eluição. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de C) coletar uma fração purificada eluída da resina HA, em que a fração purificada compreende o anticorpo bi- específico intacto.

[0010] Em algumas modalidades, é no presente documento forne- cido um método para purificar um anticorpo compreendendo: A) carre- gar uma preparação de anticorpo em um tampão de carga em uma resina hidroxiapatita (HA), em que: I) a preparação de anticorpo com- preende: a) um anticorpo intacto de interesse e b) uma versão gram- peada do anticorpo de interesse, em que a versão grampeada do anti- corpo de interesse é uma produção de degradação do anticorpo intac- to de interesse e tem uma massa que é menos de 10 % diferente da massa do anticorpo intacto de interesse; e II) a versão grampeada do anticorpo compreende pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 % ou 20 % da preparação de anticorpo em massa; B) eluir o anticorpo intacto da resina HA com um tampão de eluição e C) coletar uma fração purificada eluída da resina HA, em que a fração purificada compreende o anticorpo intacto e contém menos de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 % ou 20 % por anti- corpo grampeado em massa, em que a fração purificada contém um % menor por anticorpo grampeado em massa do que a preparação do anticorpo.

[0011] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo a eluição de um anticorpo de interesse de uma resina HA com um tampão de eluição, o tampão de eluição compreende um íon. Opcionalmente, a concentração do íon no tam- pão é aumentada durante a eluição. Opcionalmente, a concentração do íon no tampão ao redor da resina HA é aumentada durante a elui- ção.

[0012] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo, o anticorpo é um anticor- po biespecífico heterodimérico.

[0013] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo a coleta de uma fração purificada eluí- da da resina HA, em que a fração purificada compreende o anticorpo intacto de interesse, a fração purificada compreende pelo menos 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % em massa de anticorpo intacto de interesse.

[0014] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo uma fração purificada compreendendo um anticorpo biespecífico intacto e um anticorpo biespecífico grampe- ado, a relação de moléculas de anticorpo biespecífico grampeadas pa- ra moléculas de anticorpo biespecíficas intactas na fração purificada não é maior que 1:400, 1:200, 1:100 ou 1:50.

[0015] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo de interesse que é um anticorpo anti-CD3 ou que é um anticorpo biespecífico que contém uma subdivisão anti-CD3, o anticorpo compreende pelo menos um dos seguintes itens: i) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1; ii) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2; iii) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1 e uma região VL com- preendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 3; ou iv) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 4.

[0016] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo biespecífico, o anticorpo biespecífico é: i) um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti-CD3 com- preendendo uma subdivisão anti-BCMA e uma subdivisão anti-CD3, ou ii) um anticorpo biespecífico anti-FLT3/anti-CD3 compreendendo uma subdivisão anti-FLT3 e uma subdivisão anti-CD3.

[0017] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo biespecífico compreen- dendo uma subdivisão anti-BCMA, a subdivisão anti-BCMA compre- ende pelo menos um dos seguintes: i) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 5; ii) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 6; iii) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 5 e uma região VL compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 7; ou iv) uma cadeia pesada compreenden- do uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 6 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos co- mo mostrado na SEQ ID NO: 8.

[0018] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo biespecífico compreen- dendo uma subdivisão anti-FLT3, a subdivisão anti-FLT3 compreende pelo menos um dos seguintes: i) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 9; ii) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 10; iii) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 9 e uma região VL compreendendo uma sequência de aminoácidos como mos- trado na SEQ ID NO: 11; ou iv) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos co- mo mostrado na SEQ ID NO: 12.

[0019] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo o carregamento de uma preparação de anticorpo em uma resina HA, a preparação de anticorpo é carregada na resina HA até uma densidade na resina entre 2, 3, 4 ou 5 g/L e 8, 9, 10, 12, 15 ou 20 g/L.

[0020] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo o carregamento de uma preparação de anticorpo em uma resina HA, pelo menos 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ou 5000 gramas de preparação de anticorpo são carregados na resina HA.

[0021] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo uma preparação de anticorpos, a pre- paração de anticorpos compreende pelo menos 50 %, 60 %, 70 % ou

80 %, mas menos de 90 % 95 %, 97 %, 98 % ou 99 % em massa de anticorpo intacto de interesse.

[0022] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo grampeado, o anticorpo grampeado tem uma massa que é inferior a 0,1 %, 0,5 %, 1 % ou 2 % diferente da massa do anticorpo intacto. Em algumas modalidades, em um método no presente documento fornecido envolvendo um anticor- po grampeado, o anticorpo grampeado tem uma massa que está entre cerca de 5 e 100 Daltons maiores que a massa do anticorpo intacto. Em algumas modalidades, em um método no presente documento for- necido envolvendo um anticorpo grampeado, o anticorpo grampeado tem uma massa que é cerca de 18 Daltons maior que a massa do an- ticorpo intacto.

[0023] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo grampeado, o anticorpo grampeado possui uma ligação peptídica clivada em uma cadeia poli- peptídica do anticorpo e em que a ligação peptídica clivada está em uma cadeia pesada do anticorpo. Em algumas modalidades, em um método no presente documento fornecido envolvendo um anticorpo grampeado, o anticorpo grampeado tem uma ligação peptídica clivada em uma cadeia polipeptídica do anticorpo, e em que a ligação peptídi- ca clivada está em uma cadeia leve do anticorpo.

[0024] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo grampeado, o anticorpo grampeado contém o mesmo número de aminoácidos e as mesmas sequências de aminoácidos que o anticorpo intacto. Alternativamente, em algumas modalidades, o anticorpo grampeado contém um número diferente de aminoácidos que o anticorpo intacto.

[0025] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um anticorpo de interesse que compre-

ende um domínio VH e VL que se liga especificamente a CD3, um an- ticorpo grampeado correspondente compreende uma ligação peptídica clivada no domínio VH que se liga especificamente a CD3.

[0026] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo uma resina HA, a resina HA é uma re- sina hidroxiapatita cerâmica (cHA).

[0027] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido, uma resina HA é lavada com um tampão de lava- gem compreendendo íons fosfato após carregar a preparação de anti- corpo na resina HA, mas antes de eluir o anticorpo biespecífico intacto da resina. Opcionalmente, o tampão de lavagem compreende íons fos- fato na concentração entre cerca de 5, 10, 15, 20 e 30, 40 ou 50 mM.

[0028] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo um tampão de eluição contendo um íon, o íon é fosfato. Em algumas modalidades, a concentração de íons fosfato durante a eluição pode aumentar de cerca de 30, 40 ou 50 mM para cerca de 60, 70, 80, 100, 150 ou 200 mM.

[0029] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido, o pH de pelo menos um dos tampões de carga, tampão de lavagem e tampão de eluição é igual ou próximo a pH 7,0 e 8,0.

[0030] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido envolvendo uma preparação de anticorpos, a pre- paração de anticorpos contém proteínas que foram previamente carre- gadas e eluídas de pelo menos uma dentre: i) uma resina de proteína A e ii) uma resina de permuta de íons. Opcionalmente, a preparação de anticorpos contém proteínas que foram previamente carregadas e eluídas de ambas: i) uma resina de proteína A e ii) uma resina de per- muta de íons.

[0031] Em algumas modalidades, o anticorpo preparado usando o método no presente documento descrito é isolado e/ou purificado para uso como ou na preparação de produtos farmacêuticos.

[0032] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo purifi- cado usando os métodos como no presente documento descritos. Breve Descrição das Figuras/Desenhos

[0033] A FIG. 1 representa uma representação esquemática de um método de preparação de um anticorpo biespecífico que pode ser puri- ficado de acordo com os métodos no presente documento fornecidos.

[0034] A FIG. 2 representa uma representação esquemática de um i) anticorpo biespecífico intacto exemplar (painel do lado esquerdo) e ii) versão grampeada do anticorpo biespecífico (painel do lado direito), na qual o anticorpo biespecífico grampeado é uma impureza que pode estar presente em uma preparação de anticorpos com o anticorpo bi- específico intacto.

[0035] A FIG. 3 representa um cromatograma mostrando a sepa- ração de um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti-CD3 de interesse ("POI") de várias impurezas diferentes por eluição de uma resina HA.

[0036] A FIG. 4 representa um gráfico que mostra as quantidades relativas de diferentes espécies de proteínas (incluindo o anticorpo de interesse e várias impurezas) em diferentes frações eluídas de uma resina HA de acordo com um ciclo de cromatografia de HA como re- presentado no cromatograma da FIG. 3)

[0037] A FIG. 5 representa um cromatograma mostrando a sepa- ração de um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti-CD3 de interesse ("POI") de várias impurezas diferentes por eluição de uma resina HA.

[0038] A FIG. 6 representa um gráfico que mostra as quantidades relativas de diferentes espécies de proteínas (incluindo o anticorpo de interesse e várias impurezas) em diferentes frações eluídas de uma resina HA de acordo com um ciclo de cromatografia de HA como re- presentado no cromatograma da FIG. 5, em que um anticorpo biespe-

cífico anti-BCMA/anti-CD3 de interesse é separado de várias impure- zas diferentes por eluição de uma resina HA

[0039] A FIG. 7 mostra um gráfico mostrando as quantidades rela- tivas de diferentes espécies de proteínas (incluindo o anticorpo de inte- resse e várias impurezas) em diferentes frações eluídas de uma resina HA de acordo com um ciclo de cromatografia em HA, na qual um anti- corpo biespecífico anti-FLT3/anti-CD3 do interesse é separado de vá- rias impurezas diferentes via eluição de uma resina HA. Descrição Detalhada

[0040] São fornecidos no presente documento métodos para puri- ficar um anticorpo de interesse de uma ou mais impurezas. Os méto- dos no presente documento fornecidos envolvem o uso de uma resina hidroxiapatita para separar o anticorpo de interesse das impurezas. Em algumas modalidades, o anticorpo de interesse é um anticorpo bi- específico. Em algumas modalidades, uma impureza é um anticorpo relacionado ao anticorpo de interesse (isto é, tem uma sequência de aminoácidos similar ou a mesma que o anticorpo de interesse), mas é modificado de uma ou mais maneiras em comparação ao anticorpo de interesse e tem uma massa diferente do anticorpo de interesse. Opci- onalmente, a massa de uma espécie de impureza de anticorpo é muito similar à massa do anticorpo de interesse. Por exemplo, em algumas modalidades, a massa de uma espécie de impureza de anticorpo é inferior a 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,02 % ou 0,01 % diferente da massa do anticorpo de interesse. Opcionalmente, os métodos no presente documento fornecidos podem ser utilizados para a purificação em larga escala de um anticorpo de interesse de uma ou mais impurezas. Definições

[0041] A menos que definido de outra forma, todos os termos da arte, notações e outros termos ou terminologia científica usados no presente documento têm o significado comumente entendido pelos versados na técnica a que esta invenção se refere. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são no presente do- cumento definidos para maior clareza e/ou referência imediata, e a in- clusão de tais definições no presente documento não deve necessari- amente ser interpretada para representar uma diferença substancial em relação ao que geralmente é entendido na técnica.

[0042] Os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados:

[0043] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, como carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhe- cimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Quando no presente documento usado, o termo abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também fragmentos dos mesmos (como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadeia única (ScFv) e anticorpos de domínio (incluindo, por exemplo, anticorpos de tubarão e camelídeos), diabetes e proteínas de fusão compreendendo um anticorpo e qualquer outra configuração modifica- da da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reco- nhecimento de antígeno. O termo "anticorpo" inclui anticorpos mono- específicos, biespecíficos e multiespecíficos. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, como IgG, IgA ou IgM (ou subclasse do mesmo), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe específica. Dependendo da sequência de aminoácidos do anticorpo da região constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que cor-

respondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas das subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[0044] Quando no presente documento usados, os termos "cadeia pesada", "cadeia leve", "região variável" ou "domínio variável", "região de estrutura", "domínio constante" e similares têm seu significado co- mum na técnica da imunologia e referem-se a domínios em imunoglo- bulinas de ocorrência natural e os domínios correspondentes de prote- ínas de ligação recombinantes (por exemplo, anticorpos humanizados, anticorpos biespecíficos, anticorpos de cadeia única, anticorpos qui- méricos, etc.). A unidade estrutural básica das imunoglobulinas de ocorrência natural é um tetrâmero com duas cadeias leves e duas ca- deias pesadas, geralmente expressas como uma glicoproteína de cer- ca de 150.000 Da. A porção terminal amino (terminal N) de cada ca- deia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoá- cidos, principalmente responsáveis pelo reconhecimento do antígeno. A porção do terminal carboxi (terminal C) de cada cadeia define uma região constante. Cada cadeia leve é composta por um domínio variá- vel da cadeia leve (VL) e um domínio constante da cadeia leve (CL). Cada cadeia pesada é composta por uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada, possuindo domínios CH1, articulação, CH2 e CH3. As regiões variáveis de uma molécula de IgG compreendem regiões de hipervariabilidade, denomi- nadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que con- têm os resíduos em contato com antígeno e segmentos não CDR, de- nominadas regiões de estrutura (FR), que geralmente mantêm a estru- tura e determinam o posicionamento das alças da CDR (embora certos resíduos da estrutura também possam entrar em contato com o antí- geno). Cada VH e VL compreende três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte estrutura: n-FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c. As moléculas de imunoglobu- lina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) e classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasse.

[0045] Um "biespecífico" ou "específico dual" é um anticorpo híbri- do com dois sítios diferentes de ligação ao antígeno. Os dois anticor- pos biespecíficos de ligação ao antígeno se ligam a dois epítopos dife- rentes, que podem residir no mesmo ou em diferentes alvos proteicos.

[0046] Um anticorpo "intacto" refere-se a um anticorpo recombi- nante que contém todas as ligações peptídicas e aminoácidos espera- dos do anticorpo recombinante (isto é, o que seria esperado com base na (s) sequência (s) de ácido nucleico que codifica o (s) polipeptídeo (s) do anticorpo). Em contraste, um anticorpo "cortado" refere-se a uma versão do anticorpo "intacto" correspondente que está faltando pelo menos uma ligação peptídica, em comparação com o anticorpo "intacto" correspondente. As referências no presente documento a um "anticorpo de interesse" geralmente se referem a um anticorpo intacto de interesse, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0047] A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro no presen- te documento inclui modalidades direcionadas a esse valor ou parâme- tro per se, bem como a valores ou parâmetros que podem estar até 10 % abaixo ou acima do valor numérico indicado para esse parâmetro. Por exemplo, uma referência a "cerca de 5 mg" inclui 5 mg e também qualquer valor entre 4,5 mg e 5,5 mg. Métodos

[0048] Os métodos no presente documento fornecidos podem ser usados para purificar um anticorpo de interesse longe de uma ou mais impurezas. Nos métodos no presente documento fornecidos, uma pre- paração de anticorpo (também referida no presente documento como uma "amostra de partida") contendo o anticorpo de interesse e uma ou mais moléculas de impureza são carregadas em uma resina hidroxia- patita (HA), que se liga ao anticorpo de interesse e, opcionalmente, uma ou mais moléculas de impureza. A resina HA é então lavada para remover quaisquer impurezas frouxamente ligadas. (Em algumas mo- dalidades, todas as moléculas de impureza podem fluir através e não se ligar à resina HA.) Em seguida, o anticorpo de interesse é eluído da resina HA usando um tampão de eluição de fosfato, que normalmente é introduzido na resina por meio de um gradiente de concentração de íons de fosfato crescente. A eluição do anticorpo de interesse da resi- na HA produz uma amostra purificada contendo o anticorpo de inte- resse e menos (ou nenhuma) impurezas do que estavam presentes com o anticorpo de interesse na amostra de partida. Durante a eluição do anticorpo de interesse da resina HA, quaisquer moléculas de impu- reza ligadas à resina HA também podem eluir em algum momento du- rante o gradiente de concentração de íons de fosfato crescente. No entanto, as moléculas de impureza eluem da resina HA sob condições suficientemente diferentes das condições de eluição do anticorpo de interesse, de modo que o anticorpo de interesse possa ser efetivamen- te separado das moléculas de impureza durante o processo de elui- ção. Detalhes adicionais sobre as etapas do método acima e materiais e etapas relacionados são fornecidos abaixo. Resina de hidroxiapatita

[0049] Várias resinas hidroxiapatita estão disponíveis comercial- mente, e qualquer forma disponível do material pode ser usada com os métodos no presente documento fornecidos. Opcionalmente, uma hi- droxiapatita está na forma cristalina. Opcionalmente, uma hidroxiapati- ta é aglomerada para formar partículas e sinterizada a altas temperatu- ras em uma massa cerâmica porosa estável.

[0050] Em algumas modalidades, uma resina HA no presente do-

cumento fornecida é uma resina hidroxiapatita cerâmica (cHA). "Hidro- xiapatita cerâmica"/"cHA" refere-se a um fosfato de cálcio hidroxilado insolúvel da fórmula Ca10(PO4)6(OH)2, que foi sinterizado a altas tem- peraturas em uma forma cerâmica esférica e macroporosa. Quando no presente documento usado, "hidroxiapatita cerâmica"/"cHA" abrange, mas não se limita a, hidroxiapatita cerâmica Tipo I e Tipo II, e também abrange qualquer tamanho de partícula adequado, a menos que espe- cificado de outra forma. Os tamanhos típicos de partículas de cHA que podem ser utilizados com os métodos no presente documento forneci- dos incluem, por exemplo, um tamanho de partícula entre 1-100 µm ou 1-1000 µm de diâmetro, como 20 µm, 40 µm ou 80 µm. Resinas de cHA exemplares que podem ser usadas com os métodos no presente documento fornecidos incluem resinas CHT™ Tipo I e Tipo II (Bio- Rad). Qualquer referência no presente documento contida a uma "re- sina HA" ou similar abrange a resina cHA.

[0051] Tipicamente, em um método no presente documento forne- cido, a resina HA é fornecida em uma ou mais colunas de cromatogra- fia. As propriedades da coluna, como o diâmetro, o comprimento e a densidade da embalagem da coluna podem ser selecionados com ba- se em vários fatores, incluindo as necessidades de um projeto de puri- ficação específico (isto é, a quantidade de proteína a ser purificada) e os fatores relacionados à resina HA para ser usado na coluna, como tamanho de poro, tamanho de partícula, compressibilidade, capacida- de de carga e capacidade de ligação dinâmica. Além disso, os méto- dos no presente documento fornecidos são frequentemente descritos em relação à resina HA em uma coluna de cromatografia; no entanto, outras configurações relacionadas adequadas para a resina não são excluídas. Além disso, a referência no presente documento a uma "co- luna de HA", ou similar, refere-se a uma coluna de cromatografia que é embalada com uma resina HA.

Equilibrando uma coluna de HA antes do carregamento de proteínas

[0052] Em algumas modalidades, antes de carregar uma amostra contendo um anticorpo de interesse em uma coluna de HA, os méto- dos no presente documento fornecidos podem compreender uma eta- pa de pré-equilíbrio da coluna com um ou mais tampões de equilíbrio. Os tampões de equilíbrio podem coluna, por exemplo, para garantir que a resina HA esteja limpa no início do método (isto é, para garantir que a resina não possua impurezas já ligadas à resina) e/ou para ga- rantir que a solução ao redor da resina HA seja compatível com a amostra a ser carregada na resina.

[0053] Em algumas modalidades, um tampão de equilíbrio é um tampão de fosfato compreendendo, por exemplo, fosfato de sódio, em que a concentração dos íons fosfato no tampão é de cerca de 100 a 500 mM. Tais tampões de equilíbrio também podem ser referidos no presente documento como "tampões de alto equilíbrio de fosfato" ou similares. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de alto equi- líbrio de fosfato pode conter cerca de 250 a 450 mM de íons fosfato; em outras modalidades, ele pode conter cerca de 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 mM de íons fosfato. Esse tampão de equilíbrio contém uma concentração relativamente alta de íons fosfato no tampão para eluir quaisquer contaminantes/impurezas que já estão presentes na resina HA (isto é, existem antes que a amostra que contém a proteína de interesse seja carregada na resina; essas impurezas podem estar presentes, por exemplo, se a resina HA tiver sido usada precedente- mente para um método de purificação e a resina não tiver sido total- mente limpa após o uso precedente). Um tampão de equilíbrio de fos- fato alto pode ter um pH de cerca de 6,0 a 9,0. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de alto equilíbrio de fosfato pode ter um pH de cerca de 7,0 a 8,0; em outras modalidades, pode ter um pH de cerca de 7,0, 7,5 ou 8,0. Em uma modalidade, um tampão de alto equilíbrio de fosfato contém cerca de 400 mM de íons fosfato e tem um pH de cerca de 7,5. Em algumas modalidades, um tampão de equilíbrio de alto fosfato também pode ser referido no presente documento como "Tampão de Equilíbrio 1".

[0054] Em algumas modalidades, um tampão de equilíbrio é um tampão de fosfato compreendendo, por exemplo, fosfato de sódio, em que a concentração dos íons fosfato no tampão é de cerca de 1 a 20 mM. Tais tampões de equilíbrio também podem ser referidos no pre- sente documento como "tampões de equilíbrio com baixo teor de fosfa- to" ou similares. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de equilíbrio com baixo teor de fosfato pode conter cerca de 1 a 10 mM de íons fosfato; em outras modalidades, pode conter cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou 10 mM de íons fosfato. Este tampão de equilíbrio contém uma concentração relativamente baixa de íons fosfato no tampão, a fim de gerar condições em torno da resina HA propícia para a proteína de in- teresse se ligar à resina. Opcionalmente, um tampão de equilíbrio com baixo teor de fosfato pode adicionalmente conter HEPES em uma con- centração de cerca de 1 a 50 mM. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de equilíbrio com baixo teor de fosfato pode conter cerca de 2 a 30 mM de HEPES; em outras modalidades, pode conter cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25 mM de HEPES. Um tampão de equilíbrio com baixo teor de fosfato pode ter um pH de cerca de 6,0 a 9,0. Por exem- plo, em uma modalidade, um tampão de equilíbrio com baixo teor de fosfato pode ter um pH de cerca de 7,0 a 8,0; em outras modalidades, pode ter um pH de cerca de 7,0, 7,5 ou 8,0. Em uma modalidade, um tampão de equilíbrio com baixo teor de fosfato contém cerca de 2 mM de íons fosfato, 20 mM de HEPES e tem um pH de cerca de 7,5. Em algumas modalidades, um tampão de equilíbrio com baixo teor de fos- fato também pode ser referido no presente documento como "Tampão de Equilíbrio 2". É importante ressaltar, no entanto, com os métodos no presente documento fornecidos, um tampão de equilíbrio com baixo teor de fosfato pode ser usado para pré-equilibrar a resina sem o uso precedente de um tampão de alto equilíbrio de fosfato durante o méto- do. Carregando uma coluna de HA com a amostra contendo o anticorpo de interesse

[0055] Quando uma coluna de HA está pronta para o carregamen- to de proteínas, a amostra contendo o anticorpo de interesse e impu- rezas é carregada na coluna de HA. O tampão no qual a amostra car- regada na coluna de HA pode ser referida no presente documento co- mo o "tampão de carga". Em algumas modalidades, quando uma amostra contendo um anticorpo de interesse é inicialmente obtida para uso com um método como no presente documento fornecido, a amos- tra já está em um tampão de carga adequado para carregar a amostra na coluna de HA. Em outras modalidades, no entanto, antes de carre- gar uma amostra na coluna de HA, a amostra pode ser tratada (por exemplo, diluída, concentrada ou trocada de tampão) a fim de modifi- car as condições de tampão da amostra, de modo que a amostra este- ja em um tampão adequado para carregar na coluna. Por exemplo, com os métodos no presente documento fornecidos, um tampão de carga não pode ter uma alta concentração de íons fosfato que impedi- ria a ligação do anticorpo de interesse à resina HA. Por conseguinte, se uma amostra de partida contendo o anticorpo de interesse contiver uma alta concentração de íons fosfato, essa amostra precisará ser, por exemplo, diluída ou trocada de tampão, até que a concentração de íons fosfato na amostra seja reduzida a uma concentração adequada- mente baixa que permite a ligação do anticorpo de interesse à resina HA.

[0056] Em algumas modalidades, um tampão de carga contém não mais do que cerca de 10 mM de íons fosfato. Por exemplo, em algumas modalidades, um tampão de carga contém íons fosfato inferi- ores a cerca de 10 mM, 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM ou 1 mM. Em al- gumas modalidades, um tampão de carga contém 0 mM de íons fosfa- to. Opcionalmente, um tampão de carga pode conter vários outros sais ou componentes de tampão (por exemplo, Tris, glicina). Um tampão de carga pode ter um pH de cerca de 6,0 a 9,0. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de carga pode ter um pH de cerca de 7,0 a 8,0; em outras modalidades, pode ter um pH de cerca de 7,0, 7,5 ou 8,0.

[0057] Em algumas modalidades, uma amostra contendo o anti- corpo de interesse pode ser carregada em uma resina HA até uma densidade na resina de pelo menos 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 6g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 12 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L ou 30 g/L. Em algumas modalidades, uma amostra contendo o anticorpo de interesse pode ser carregada em uma resina HA com uma densidade na resina entre pelo menos 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 6g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 12 g/L, 15 g/L, 20 g/L ou 25 g/L e não mais que que 2 g/L, 3 g/L, 4 g/L, 5 g/L, 6g/L, 7 g/L, 8 g/L, 9 g/L, 10 g/L, 12 g/L, 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L ou 30 g/L, em que o segundo valor é maior que o primeiro valor. Lavando a coluna de HA

[0058] Após carregar a amostra contendo o anticorpo de interesse e as impurezas na coluna de HA, mas antes da eluição do anticorpo de interesse, os métodos no presente documento fornecidos podem opcionalmente compreender uma etapa adicional de lavagem da colu- na carregada com um ou mais tampões de lavagem para, por exem- plo, remover impurezas imobilizadas não especificamente ou preparar ou equilibrar a coluna para a etapa de eluição. As propriedades de qualquer tampão de lavagem podem ser determinadas por alguém versado na técnica. Em uma modalidade, o tampão de lavagem é um tampão de fosfato compreendendo, por exemplo, fosfato de sódio, e a concentração dos íons fosfato no tampão é de cerca de 5 a 50 mM. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de lavagem pode con- ter cerca de 10 a 40 mM de íons fosfato; em outras modalidades, pode conter cerca de 10, 20, 30, 40 ou 50 mM de íons fosfato. Opcional- mente, um tampão de lavagem pode adicionalmente conter HEPES em uma concentração de cerca de 1 a 50 mM. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de lavagem pode conter cerca de 2 a 30 mM de HEPES; em outras modalidades, pode conter cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25 mM de HEPES. Um tampão de lavagem pode ter um pH de cer- ca de 6,0 a 9,0. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de la- vagem pode ter um pH de cerca de 7,0 a 8,0; em outras modalidades, pode ter um pH de cerca de 7,0, 7,5 ou 8,0. Em uma modalidade, um tampão de lavagem contém cerca de 40 mM de íons fosfato, 20 mM de HEPES e tem um pH de cerca de 7,5. Eluindo o anticorpo de interesse da coluna de HA

[0059] Os métodos no presente documento fornecidos compreen- dem a etapa de eluir o anticorpo ligado de interesse da resina HA. O anticorpo ligado de interesse é eluído por um ou mais tampões de eluição. Tipicamente, o tampão de eluição contém um ou mais sais ou íons, e a concentração dos sais ou íons é aumentada durante a elui- ção.

[0060] Em algumas modalidades, um tampão de eluição no pre- sente documento fornecido compreende íons fosfato. Opcionalmente, a concentração de íons fosfato no tampão de eluição é aumentada de uma concentração inicial de cerca de 20 mM para cerca de 200 mM durante a eluição. Por exemplo, em uma modalidade, a concentração de íons fosfato no tampão de eluição é aumentada de uma concentra- ção inicial de cerca de 40 mM a cerca de 80 mM ou cerca de 40 mM a cerca de 100 mM durante a eluição. A maneira específica e a taxa de concentração de íons de fosfato crescente no tampão de eluição po- dem ser determinadas como é adequada para o anticorpo de interes- se, e isso leva em consideração os tipos de moléculas de impureza que também estão ligadas à resina HA. Por exemplo, a concentração de íons fosfato no tampão de eluição pode ser aumentada em um gra- diente linear gradual/superficial. O uso de um gradiente superficial po- de permitir a separação eficaz de uma ou mais moléculas que eluem da resina HA sob condições similares, mas diferentes. Alternativamen- te, em algumas modalidades, a concentração de íons fosfato no tam- pão de eluição pode ser aumentada em um gradiente íngreme ou pode ser aumentada gradualmente. Opcionalmente, um tampão de eluição pode adicionalmente conter HEPES em uma concentração de cerca de 1 a 50 mM. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de elui- ção pode conter cerca de 2 a 30 mM de HEPES; em outras modalida- des, pode conter cerca de 5, 10, 15, 20 ou 25 mM de HEPES. Um tampão de eluição pode ter um pH de cerca de 6,0 a 9,0. Por exemplo, em uma modalidade, um tampão de eluição pode ter um pH de cerca de 7,0 a 8,0; em outras modalidades, pode ter um pH de cerca de 7,0, 7,5 ou 8,0. Em uma modalidade, um tampão de eluição contém cerca de 40-80 mM de íons fosfato (aumentando em um gradiente), 20 mM de HEPES e tem um pH de cerca de 7,5.

[0061] As condições de eluição, incluindo, entre outras, as propri- edades do tampão de eluição adequado para uso com uma resina HA (como a composição do tampão, pH, concentração, força iônica e simi- lares); qualquer etapa necessária ou alteração de gradiente nas pro- priedades do tampão de eluição; número de volumes da coluna do tampão de eluição a ser usado; a taxa de fluxo e similares podem ser determinados para otimizar a eluição do anticorpo de interesse da co- luna de HA, bem como a separação do anticorpo de interesse das mo- léculas de impureza.

[0062] Após a eluição, as uma ou mais frações de pico que con- têm o anticorpo de interesse são opcionalmente coletadas individual- mente ou separadamente e opcionalmente reunidas, o pH opcional- mente ajustado, opcionalmente filtrado e opcionalmente armazenado antes do processamento adicional, conforme desejado. As frações de pico para coleta podem ser identificadas por qualquer meio adequado, como identificação usando ultravioleta em A280 e iniciando a coleta quando o sinal ultravioleta sobe acima de uma quantidade desejada e/ou em um ponto desejado nas condições de eluição.

[0063] O material eluído da resina HA e contendo o anticorpo de interesse pode ser opcionalmente referido no presente documento como uma "fração purificada" ou similar. A fração purificada pode con- ter material de uma única fração eluída da resina HA, ou pode ser a combinação de várias frações eluídas da resina HA que foram reuni- das. Tipicamente, a fração purificada é preparada de modo que seja equilibrada entre a coleta de uma quantidade alta do anticorpo de inte- resse, mas uma quantidade baixa de moléculas de impureza. Esses objetivos concorrentes geralmente devem ser equilibrados, por exem- plo, porque pode haver uma sobreposição pelo menos parcial entre as condições em que o anticorpo de interesse elui da resina HA e quando uma espécie de molécula de impureza elui da resina HA.

[0064] Qualquer um dos tampões para os métodos no presente documento fornecidos (por exemplo, um tampão de equilíbrio, um tampão de carga, um tampão de lavagem ou um tampão de eluição) também pode compreender componentes adequados adicionais ou alternativos, como acetato, succinato, MES, ACES, MOPSO, PIPES, BES, TAPSO, AMPSO, TRICINE, EPPS, Bicina, DIPSO, HEPPSO, imidazol, Tris, Bis-tris, TAPS, arginina, glicina, acetonitrila, etanol, me- tanol, dodecilsulfato de sódio a 1 % (SDS) ou outros tensoativos e si- milares.

[0065] Em algumas modalidades, qualquer um dos tampões no presente documento fornecidos pode ter um pH de cerca de 6,0 a 9,0. Em outras modalidades, qualquer um dos tampões no presente docu- mento fornecidos pode ter um pH de cerca de 5,0 a 9,0, 5,5 a 9,0, 6,5 a 9,0, 7,0 a 9,0, 7,5 a 9,0, 7,0 a 8,0 ou 6,5 a 8,5.

[0066] Nos tampões no presente documento fornecidos descritos como contendo "íons fosfato", os íons fosfato podem ser gerados no tampão a partir de qualquer sal de fosfato adequado, como fosfato de sódio ou fosfato de potássio. Além disso, as soluções no presente do- cumento fornecidas que são descritas como sendo preparadas com "fosfato de sódio" podem ser preparadas com qualquer sal adequado de fosfato de sódio (por exemplo, monobásico ou dibásico).

[0067] Após a eluição do anticorpo de interesse da coluna de HA, a coluna de HA é opcionalmente limpa para remover impurezas e ou- tros componentes que degradam a resina da coluna e a preparam pa- ra armazenamento posterior. Em uma modalidade, a coluna é regene- rada primeiro usando um tampão como um contendo fosfato de sódio a uma concentração de cerca de 0,4 M e a um pH de cerca de 7,5; se- guido por uma etapa de higienização opcional usando uma solução de limpeza como NaOH 1 M e fosfato de potássio 0,5 M e depois prepa- rada para armazenamento usando uma solução de armazenamento como NaOH 0,1 M. Anticorpos

[0068] Os métodos no presente documento fornecidos podem ser utilizados para purificar um anticorpo de interesse de uma ou mais im- purezas. Por exemplo, o anticorpo purificado pode ser usado como ou na preparação de produtos farmacêuticos.

[0069] Em algumas modalidades, um anticorpo purificado de acor- do com um método no presente documento fornecido é qualquer tipo de anticorpo no presente documento fornecido. Por exemplo, um anti-

corpo purificado de acordo com um método no presente documento fornecido pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de anti- corpo (por exemplo, um scFv ou Fab) e pode ser monoespecífico ou biespecífico. Tipicamente, um anticorpo de interesse purificado de acordo com um método no presente documento fornecido é um anti- corpo recombinante. Anticorpos IgG

[0070] Em algumas modalidades, um anticorpo que pode ser puri- ficado de acordo com um método no presente documento fornecido é um anticorpo de imunoglobulina G (IgG). Como é conhecido na técni- ca, um anticorpo IgG contém duas cadeias pesadas e duas cadeias leves e tem uma forma geral de "Y". Nas moléculas de IgG padrão, as duas cadeias pesadas têm a mesma sequência de aminoácidos e as duas cadeias leves têm a mesma sequência de aminoácidos. Um anti- corpo IgG pode ser descrito como tendo duas "subdivisões" (isto é, uma "primeira subdivisão" e uma "segunda subdivisão"), nos quais ca- da subdivisão contém uma cadeia pesada e uma cadeia leve, ligadas entre si por uma ligação dissulfeto. Nas moléculas IgG padrão, a pri- meira subdivisão do anticorpo é idêntica à segunda subdivisão do anti- corpo (devido a cada subdivisão conter uma cadeia pesada e uma ca- deia leve que possuem a mesma sequência de aminoácidos que a ca- deia pesada e a cadeia leve da outra subdivisão, respectivamente). A região de terminal N da cadeia pesada contém a região variável da cadeia pesada (VH) e a região de terminal N da cadeia leve contém a região variável da cadeia leve (VL). As regiões VH e VL contêm a por- ção do anticorpo que se liga especificamente a um antígeno. Assim, cada subdivisão de um anticorpo IgG pode se ligar especificamente a um antígeno. Nas moléculas de IgG padrão, tanto a primeira subdivi- são quanto a segunda subdivisão do anticorpo IgG se ligam ao mesmo antígeno (devido ao fato de que ambas as subdivisões contêm cadeias pesadas e cadeias leves com a mesma respectiva sequência de ami- noácidos). Um anticorpo IgG padrão pode ser chamado de "homodi- mérico", com base em ter duas subdivisões iguais. Um anticorpo IgG purificado de acordo com um método no presente documento forneci- do pode ser da subclasse IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Anticorpos IgG biespecíficos

[0071] Em algumas modalidades, um anticorpo que pode ser puri- ficado de acordo com um método no presente documento fornecido é um anticorpo IgG biespecífico. Em um anticorpo IgG biespecífico, cada uma das duas subdivisões do anticorpo se liga especificamente a um antígeno diferente. Além disso, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada na primeira subdivisão do anticorpo IgG biespecífico é diferen- te da sequência de aminoácidos da cadeia pesada na segunda subdi- visão do mesmo anticorpo IgG biespecífico e, similarmente, a sequên- cia de aminoácidos da cadeia leve na primeira subdivisão do anticorpo IgG biespecífico é tipicamente diferente da sequência de aminoácidos da cadeia leve na segunda subdivisão do mesmo anticorpo IgG bies- pecífico. Um anticorpo IgG biespecífico pode, portanto, ser chamado de "heterodimérico", com base em ter 2 subdivisões diferentes. A pri- meira subdivisão de um anticorpo IgG biespecífico pode ser descrita como sendo específica para um "primeiro antígeno" e a segunda sub- divisão de um anticorpo IgG biespecífico pode ser descrita como sen- do específica para um "segundo antígeno". Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico tem um isótipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico compreende uma regi- ão Fc imunologicamente inerte. Anticorpos IgG biespecíficos - métodos de preparação

[0072] Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são co- nhecidos na técnica (veja, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986). Tradicionalmente, a produção recombi-

nante de anticorpos biespecíficos baseava-se na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, com as duas cadeias pesadas possuindo especificidades diferentes (Millstein e Cu- ello, Nature 305, 537-539, 1983).

[0073] Mais recentemente, foram desenvolvidos métodos nos quais são aplicadas as seguintes etapas gerais para preparar anticor- pos heterodiméricos biespecíficos: 1) Um primeiro anticorpo homodimérico (também no pre- sente documento referido como um "primeiro anticorpo origem") e um segundo anticorpo homodimérico (também referido no presente docu- mento como um "segundo anticorpo origem") são expressos e purifi- cados individualmente. O primeiro anticorpo homodimérico é específi- co para um primeiro antígeno alvo do anticorpo biespecífico sendo preparado e o segundo anticorpo homodimérico é específico para um segundo antígeno alvo do anticorpo biespecífico sendo preparado. As- sim, por exemplo, se o objetivo é preparar um anticorpo biespecífico com especificidade para BCMA e CD3, um anticorpo monoclonal anti- BCMA (o "primeiro anticorpo origem") e um anticorpo monoclonal anti- CD3 (o "segundo anticorpo origem") são expressos e purificados sepa- radamente. 2) Em seguida, o primeiro anticorpo homodimérico/origem purificado e o segundo anticorpo homodimérico/origem purificado são misturados e incubados juntos sob condições que promovem a troca de subdivisão de anticorpo, de modo que os anticorpos biespecíficos heterodiméricos são formados, os quais contêm uma primeira subdivi- são do primeiro anticorpo origem e uma segunda subdivisão do se- gundo anticorpo origem. Estas condições envolvem tipicamente uma sequência de condições redutoras seguidas por condições oxidantes. As condições redutoras promovem a clivagem das ligações dissulfeto que mantêm juntas as duas cadeias pesadas dos anticorpos homodi-

méricos e, assim, permitem a troca das subdivisões do anticorpo entre o primeiro anticorpo origem e o segundo anticorpo origem. As condi- ções oxidantes subsequentes formam então novas pontes dissulfeto que estabilizam os anticorpos biespecíficos recém-formados. Este mé- todo geral para gerar anticorpos biespecíficos está descrito na FIG. 1. Na FIG. 1, um primeiro anticorpo origem ("Anticorpo origem A"; cor cinza) e um segundo anticorpo origem ("Anticorpo origem B"; cor pre- ta) são representados, cada um dos quais é um homodímero monoes- pecífico e contém uma primeira subdivisão e uma segunda subdivisão. Tipicamente, o primeiro anticorpo origem e o segundo anticorpo ori- gem são específicos para diferentes antígenos. Em seguida, o primeiro anticorpo origem e o segundo anticorpo origem são misturados e ex- postos a etapas de redução e oxidação que resultam na formação do anticorpo biespecífico de interesse, que contém a primeira subdivisão do anticorpo origem A e uma segunda subdivisão do anticorpo origem B e as respectivas especificidades de ambas as subdivisões.

[0074] Opcionalmente, a sequência de aminoácidos de uma ca- deia pesada de anticorpo pode ser modificada de uma ou mais manei- ras para promover a formação de anticorpos biespecíficos. Por exem- plo, a cadeia pesada de uma subdivisão de um anticorpo biespecífico pode conter uma modificação de aminoácidos na primeira região de articulação, de modo que o aminoácido substituído/trocado na primeira região de articulação tem uma carga oposta ao aminoácido correspon- dente na região de articulação da outra subdivisão do anticorpo bies- pecífico formado. Isto é descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2011/036419 (WO2011/143545). Em outro método, a formação de uma proteína heteromultimérica ou heterodi- mérica desejada (por exemplo, anticorpo biespecífico) é realçada alte- rando ou modificando uma interface entre uma primeira e uma segun- da região Fc do tipo imunoglobulina (por exemplo, uma região articula-

da e/ou uma região CH3) Neste método, o anticorpo biespecífico pode conter uma região CH3, em que a região CH3 compreende um primei- ro polipeptídeo CH3 e um segundo polipeptídeo CH3 que interagem juntos para formar uma interface CH3, em que um ou mais aminoáci- dos na interface CH3 desestabilizam a formação de homodímeros e não são eletrostaticamente desfavoráveis à formação do homodímero. Este método também é descrita no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2011/036419 (WO2011/143545).

[0075] O método acima e outros métodos para a preparação de anticorpos biespecíficos são ainda descritos, por exemplo, em: Pedido de Patente Internacional No. PCT/IB2011/054899 (WO2012/059882), PCT/US2011/036419 (WO2011/143545) e Giese et al, Biotechnology Progress, "Bispecific Antibody Process Development: Assembly and Purification of Knob and Hole Bispecific Antibodies", 17 de janeiro de 2018, e referências citadas nos mesmos, cada um dos quais são in- corporados por referência no presente documento para todos os fins. Os métodos no presente documento fornecidos para a purificação de anticorpos podem ser usados para purificar anticorpos biespecíficos que foram preparados por qualquer método adequado. Anticorpos IgG biespecíficos - especificidade

[0076] Em algumas modalidades, um anticorpo que pode ser puri- ficado de acordo com um método no presente documento fornecido é um anticorpo IgG biespecífico humano de tamanho natural, em que um primeiro domínio variável de anticorpo da primeira subdivisão do anti- corpo biespecífico é capaz de se ligar a um primeiro antígeno, e um segundo domínio variável de anticorpo do segundo subdivisão do anti- corpo biespecífico é capaz de se ligar a um segundo antígeno. O pri- meiro antígeno e o segundo antígeno podem ter quaisquer caracterís- ticas de um antígeno, como no presente documento descrito. Em al- gumas modalidades, o primeiro antígeno ocorre em um primeiro tipo de célula e o segundo antígeno em um segundo tipo de célula.

[0077] Em algumas modalidades, um anticorpo que pode ser puri- ficado de acordo com um método no presente documento fornecido é um anticorpo IgG biespecífico humano de tamanho natural, em que um primeiro domínio variável de anticorpo do anticorpo é capaz de recru- tar a atividade de uma célula efetiva do imune humano por ligação es- pecífica a um antígeno efetor localizado na célula efetora imune hu- mana, e em que um segundo domínio variável do anticorpo do anticor- po é capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo.

[0078] Uma célula efetora imune humana que pode ser ligada por um anticorpo no presente documento fornecido pode ser qualquer uma de uma variedade de células efetoras imunes conhecidas na técnica. Por exemplo, a célula efetora imune pode ser um membro da linhagem de células linfoides humanas, incluindo, mas não se limitando a, uma célula T (por exemplo, uma célula T citotóxica), uma célula B e uma célula exterminadora natural (NK). A célula efetora imune também po- de ser, por exemplo, um membro da linhagem mieloide humana, inclu- indo, mas não se limitando a, um monócito, um granulócito neutrofílico e uma célula dendrítica. Tais células efetoras imunes podem ter um efeito citotóxico ou apoptótico em uma célula alvo ou outro efeito dese- jado após a ativação pela ligação de um antígeno efetor. O antígeno efetor é um antígeno (por exemplo, uma proteína ou um polipeptídeo) que é expresso na célula efetora imune humana. Exemplos de antíge- nos efetores que podem ser ligados por um anticorpo no presente do- cumento fornecido incluem, mas não estão limitados ao CD3 humano (ou complexo CD3 (Cluster de Diferenciação)), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 e CD89 .

[0079] O antígeno alvo é expresso em uma célula alvo em uma condição doente (por exemplo, uma doença inflamatória, uma doença proliferativa (por exemplo, câncer), um distúrbio imunológico, uma do-

ença neurológica, uma doença neurodegenerativa, uma doença au- toimune, uma doença infecciosa (por exemplo, uma infecção viral ou uma infecção parasitária), uma reação alérgica, uma doença do enxer- to versus hospedeiro ou uma doença do hospedeiro versus enxerto). Um antígeno alvo não é antígeno efetor. Exemplos dos antígenos alvo incluem, entre outros, BCMA, EpCAM (Molécula de Adesão de Células Epiteliais), CCR5 (Receptor de Quimiocina Tipo 5), CD19, HER (Re- ceptor do Fator de Crescimento Epidérmico Humano)-2/neu, HER-3, HER-4, EGFR (Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico), FLT3 (Tirosina Cinase 3 similar a Fms), PSMA, CEA, MUC-1 (Mucina), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, CIhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliosídeo GD3, 9-O-acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GM1, Poly SA, GD2, Carboanidrase IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue- 1, antígeno de célula plasmática, IgE (ligada à membrana), MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina de melanoma), CCR8, precursor de TNF-alfa, STEAP, mesotelina, an- tígeno A33, PSCA (antígeno de célula tronco da próstata), Ly-6;, Neo- epítopo E-caderina, Receptor de Acetilcolina Fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 e Receptor MIS (Substância Inibitória Muel- leriana) tipo II, sTn (antígeno Tn sialilado; TAG-72), FAP (antígeno de ativação de fibroblastos), endosialina, EGFRvIII, LG, SAS e CD63.

[0080] Em algumas modalidades, um anticorpo purificado de acor- do com um método no presente documento fornecido pode ser qual- quer anticorpo conforme descrito no Pedido US 15/085.644, deposita- do em 30 de Março de 2016 (Publicação No. US20160297885), ou Pedido US 15/993.874, depositado em 31 de Maio de 2018 (Publica- ção US20180346601), que são incorporados por referência na íntegra para todos os fins.

[0081] Em algumas modalidades, um anticorpo purificado de acor- do com um método no presente documento fornecido pode ser um an-

ticorpo IgG biespecífico, no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao Cluster de Diferenciação 3 (CD3). As informações sobre CD3 são fornecidas, por exemplo, através do UniProtKB ID # P07766.

[0082] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a CD3, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYM- TWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRD-

NAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG bi- específico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamen- te a CD3, a cadeia pesada da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoáci- dos: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVR- QAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNS- LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSAST- KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL- TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT- KVDKTVERKCRVRCPRCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST- FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPRE- PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivi- são do anticorpo se liga especificamente a CD3, a região VH da ca- deia pesada da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VH mostrada na SEQ ID NO: 1.

[0083] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a CD3, a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de ami- noácidos:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPG

QPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC KQSYDLFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a CD3, a cadeia leve da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoáci- dos compreendendo a sequência de aminoácidos:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPG QPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC KQSYDLFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN

NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a CD3, a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VL mostrada na SEQ ID NO: 3.

[0084] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a CD3, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, e a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID

NO: 3. Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a CD3, a cadeia pesada da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, e a cadeia leve da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a CD3, a região VH da cadeia pesada da subdivi- são de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreen- dendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VH mostra- da na SEQ ID NO: 1 e a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação a CD3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VL mostrada na SEQ ID NO: 3.

[0085] Em algumas modalidades, um anticorpo purificado de acor- do com um método no presente documento fornecido pode ser um an- ticorpo IgG biespecífico, no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao antígeno de maturação de células B (BCMA). In- formações sobre o BCMA são fornecidas, por exemplo, através do UniProtKB ID # Q02223.

[0086] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequên- cia de aminoácidos:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGL

EWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a ca- deia pesada da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGL EWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCEVECPECPAPPVAG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPS SIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a regi- ão VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VH mostrada na SEQ ID NO: 5.

[0087] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRL

LMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQS WPLTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a ca- deia leve da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRL LMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQS WPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP

REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a regi- ão VL da cadeia leve da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma se- quência de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VL mostrada na SEQ ID NO: 7.

[0088] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5, e a região VL da ca- deia leve da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG bi- específico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamen- te ao BCMA, a cadeia pesada da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 6, e a cadeia leve da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivi- são do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VH mostrada na SEQ ID NO: 5 e a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de amino-

ácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da se- quência VL mostrada na SEQ ID NO : 7

[0089] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequên- cia de aminoácidos: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFT- FSSYPMSWVRQQGGGWWLSVGSGSGNSLSVGSLSVGH: 13). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente ao BCMA, a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação ao BCMA tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos: EIVLT- QSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQQKQQRLRLG- MYGSGTGSGDGD: 14). Em algumas modalidades, em qualquer refe- rência no presente documento a um anticorpo compreendendo a regi- ão VH que tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5, o anticorpo pode alternativamente compreender uma região VH compreendendo a se- quência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, em qualquer referência no presente documento a um anticorpo compreendendo a região VL que tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 7, o anticorpo pode alternativamente compreender uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14. Da mesma forma, também estão incluídas no pre- sente documento cadeias leves e pesadas anti-BCMA contendo as sequências VH e VL da SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, respectiva- mente.

[0090] Em algumas modalidades, um anticorpo purificado de acor- do com um método no presente documento fornecido pode ser um an-

ticorpo IgG biespecífico, no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente à tirosina cinase 3 do tipo fms (FLT3). Informações sobre FLT3 são fornecidas, por exemplo, através do UniProtKB ID # P36888.

[0091] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL

EWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a cadeia pesada da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de ami- noácidos compreendendo a sequência de aminoácidos:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL EWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPC SRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCEVECPE CPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKC KVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCE

VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 10). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma se- quência de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VH mostrada na SEQ ID NO: 9.

[0092] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de ami- noácidos:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLL

IYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSP PTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a cadeia leve da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoá- cidos compreendendo a sequência de aminoácidos:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLL IYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSP PTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE

AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequên- cia de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VL mostrada na SEQ ID NO: 11.

[0093] Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífi- co no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9, e a região VL da cadeia leve da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID

NO: 11. Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a cadeia pesada da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, e a cadeia leve da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, em um anticorpo IgG biespecífico no qual uma subdivisão do anticorpo se liga especificamente a FLT3, a região VH da cadeia pesada da subdivisão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoácidos compreendendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VH mostrada na SEQ ID NO: 9, e a região VL da cadeia leve da subdi- visão de ligação a FLT3 tem uma sequência de aminoácidos compre- endendo uma CDR1, uma CDR2 e uma CDR3 da sequência VL mos- trada na SEQ ID NÃO: 11.

[0094] Em algumas modalidades, é no presente documento forne- cido um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti-CD3, no qual a subdivi- são anti-BCMA do anticorpo tem qualquer uma das características descritas acima para uma subdivisão anti-BCMA e a subdivisão anti- CD3 do anticorpo tem qualquer uma das características descritas aci- ma para uma subdivisão anti-CD3. Em algumas modalidades, é no presente documento fornecido um anticorpo biespecífico anti- FLT3/anti-CD3, no qual a subdivisão anti-FLT3 do anticorpo tem qual- quer uma das características descritas acima para uma subdivisão an- ti-FLT3 e a subdivisão anti-CD3 do anticorpo tem qualquer uma das características descritas acima para uma subdivisão anti-CD3.

[0095] Também são no presente documento fornecidos métodos de purificação de um anticorpo monoespecífico tendo afinidade por qualquer um dos antígenos acima e/ou que contenham qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas acima. Por exemplo, tam-

bém é no presente documento fornecido a purificação de um anticorpo anti-CD3 monoespecífico, homodimérico compreendendo a sequência de aminoácidos VH, como mostrado na SEQ ID NO: 1. Impurezas

[0096] Os métodos no presente documento fornecidos podem ser utilizados para purificar um anticorpo de interesse de uma ou mais im- purezas.

[0097] As impurezas incluem, por exemplo, versões grampeadas do anticorpo de interesse, agregados de proteínas e, no caso de um anticorpo biespecífico de interesse, anticorpos monoespecíficos paren- tais relacionados à formação do anticorpo biespecífico de interesse. Essas diferentes impurezas também podem ser no presente documen- to referidas como diferentes "espécies de impureza", "moléculas de impureza" ou similares. Versões grampeadas de um Anticorpo de Interesse

[0098] "Versões grampeadas de um anticorpo de interesse", "anti- corpos grampeados" ou similares se referem a um anticorpo recombi- nante no qual uma ou mais ligações polipeptídicas no anticorpo foram clivadas, em comparação com um anticorpo intacto correspondente de interesse. Por outro lado, um anticorpo "intacto" refere-se a um anti- corpo recombinante que contém todas as ligações peptídicas e amino- ácidos esperados do anticorpo recombinante (isto é, o que seria espe- rado com base na(s) sequência(s) de ácido nucleico que codifica(m) o(s) polipeptídeo(s) do anticorpo).

[0099] Como tais, os anticorpos grampeados podem ser conside- rados produtos de degradação relacionados ao anticorpo de interesse. A clivagem de uma ligação peptídica em um anticorpo pode ocorrer, por exemplo, através de atividades enzimáticas (por exemplo, media- das por protease) ou não enzimáticas.

[00100] Em algumas modalidades, quando uma ligação peptídica em um polipeptídeo de um anticorpo é clivada, após a clivagem, uma porção clivada da cadeia polipeptídica pode não estar mais covalen- temente ligada ao restante do anticorpo; nesse caso, a porção clivada da cadeia polipeptídica pode dissociar-se do restante do anticorpo. Is- so ocorre mais comumente quando a clivagem ocorre em uma ligação peptídica próxima a um terminal N ou C da cadeia polipeptídica e re- sulta em um anticorpo grampeado que perdeu um ou mais aminoáci- dos em comparação com o anticorpo intacto correspondente. Esses anticorpos grampeados têm menos massa que o anticorpo intacto cor- respondente, devido à perda de um ou mais aminoácidos do anticorpo.

[00101] Alternativamente, em algumas outras modalidades, quando uma ligação peptídica em um polipeptídeo de um anticorpo é clivada, após a clivagem, uma porção clivada da cadeia polipeptídica ainda pode permanecer covalentemente ligada ao restante do anticorpo (por exemplo, por uma ligação de dissulfeto intracadeia ou intercadeia). Nesse caso, embora exista uma ligação de peptídeo do anticorpo por clivagem, a porção clivada da cadeia polipeptídica permanecerá amar- rada ao restante do anticorpo, através das ligações covalentes intactas restantes que ligam a porção clivada da cadeia polipeptídica ao restan- te do anticorpo. Nesta circunstância, o anticorpo grampeado ainda terá o mesmo número de aminoácidos e sequências de aminoácidos em comparação com o anticorpo intacto. Além disso, em pelo menos al- gumas modalidades, este tipo de anticorpo grampeado pode ter uma massa ligeiramente maior que o anticorpo intacto correspondente. Es- te ganho de massa pode ser o resultado, por exemplo, de uma ou mais reações químicas que ocorrem após a clivagem da ligação peptí- dica. Durante essas reações, um ou mais átomos (por exemplo, H, O) podem reagir com átomos da cadeia polipeptídica do anticorpo e tor- narem-se covalentemente ligados à cadeia de anticorpo, o que resulta em ganho de massa pelo anticorpo grampeado, em comparação com o anticorpo intacto correspondente.

[00102] Como um anticorpo "cortado" é gerado a partir de um anti- corpo "intacto" correspondente, a versão "cortada" do anticorpo tem a mesma sequência de aminoácidos (no caso de não haver perda de aminoácidos do anticorpo como resultado da clivagem de ligação pep- tídica) ou quase a mesma sequência de aminoácidos (no caso da per- da de uma ou mais sequências de aminoácidos do anticorpo como re- sultado da clivagem da ligação peptídica) que a versão "intacta" cor- respondente do anticorpo.

[00103] Normalmente, uma versão grampeada de um anticorpo tem uma massa similar à massa do anticorpo intacto correspondente. Co- mo descrito acima, em algumas modalidades, um anticorpo grampea- do pode ter uma massa menor que o anticorpo intacto correspondente (por exemplo, no caso em que o corte resulta na perda de um ou mais aminoácidos do anticorpo). Alternativamente, em algumas modalida- des, um anticorpo grampeado pode ter uma massa maior que o anti- corpo intacto correspondente (no caso em que o corte não resulta na perda de aminoácidos do anticorpo e, em vez disso, resulta no ganho de pelo menos um átomo pelo anticorpo através de uma ou mais rea- ções que ocorrem como resultado da clivagem da ligação peptídica).

[00104] Em algumas modalidades, uma versão grampeada de um anticorpo tem uma massa que não excede 50 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, 0,01 % diferente da massa do anticorpo intacto correspondente de interesse. Dito de outra forma, em algumas modalidades, uma versão grampeada de um anticorpo de interesse tem uma massa que difere da massa do anticorpo intacto correspondente de interesse em não mais que 50 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 % ou 0,01 %

[00105] Como descrito acima, em algumas modalidades, uma ver- são grampeada de um anticorpo de interesse tem uma massa que é menor que o anticorpo intacto correspondente de interesse. Por exem- plo, em algumas modalidades, uma versão grampeada de um anticor- po tem uma massa que não excede 50 %, 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 %, 0,01 % menor que a massa do anti- corpo intacto correspondente de interesse. Por exemplo, se uma ver- são grampeada de um anticorpo possui uma massa que não é mais do que 10 % menor que a massa do anticorpo intacto correspondente de interesse, então, por exemplo, se o anticorpo intacto de interesse tem uma massa de 100.000 Da, a versão grampeada do anticorpo possui uma massa que não é superior a 10.000 Da inferior a essa (10 % de

100.000 é 10.000) - ou seja, possui uma massa entre 90.000 e

100.000 Da.

[00106] Como também descrito acima, em algumas modalidades, uma versão grampeada de um anticorpo de interesse tem uma massa que é maior que o anticorpo intacto correspondente de interesse. Por exemplo, em algumas modalidades, uma versão grampeada de um anticorpo tem uma massa que não excede 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,04 %, 0,03 %, 0,02 % ou 0,01 % maior que a massa do anticorpo intacto correspondente de in- teresse. Em outras palavras, se uma versão grampeada de um anti- corpo tiver uma massa que não seja mais de 1 % maior que a massa do anticorpo intacto correspondente de interesse, então, por exemplo, se o anticorpo intacto interessante tiver uma massa de 100.000 Da, a versão grampeada do anticorpo possui uma massa que não excede

1.000 Da a mais que isso (1 % de 100.000 é 1.000) - ou seja, possui uma massa entre 100.000 e 101.000 Da. Espécies de Massa Molecular Elevada (HMMS)/Agregados de Proteí-

nas

[00107] Em algumas modalidades, uma impureza relevante para um método no presente documento fornecido é referida como "espécie de massa molecular elevada" (HMMS). HMMS refere-se a qualquer contaminante ou impureza de massa molecular elevada, mas normal- mente é uma associação de pelo menos duas proteínas formando um agregado. A título de exemplo, a HMMS pode incluir múltiplas molécu- las de um anticorpo de interesse que se agregaram e/ou agregados de proteínas de células hospedeiras que foram usadas para produzir um anticorpo de interesse. Os agregados podem surgir por qualquer pro- cesso, incluindo, por exemplo, ligação covalente ou não covalente de moléculas. Anticorpos Parentais

[00108] Em algumas modalidades, uma impureza relevante para um método no presente documento fornecido é um "anticorpo origem" ou "anticorpo parental" ou similar. Este tipo de molécula de impureza é relevante para os métodos no presente documento fornecidos, nos quais o anticorpo de interesse é um anticorpo biespecífico que é gera- do a partir de dois anticorpos parentais diferentes, por exemplo, con- forme descrito na FIG. 1. Esses anticorpos origem são monoespecífi- cos, homodímeros. Os anticorpos origem podem estar presentes em uma preparação de anticorpos com um anticorpo biespecífico de inte- resse devido a múltiplos mecanismos possíveis, como: i) em algumas situações, algumas moléculas de anticorpos parentais não se separam em uma subdivisão e uma segunda subdivisão durante a etapa de re- dução para separar os anticorpos origem em uma primeira subdivisão e uma segunda subdivisão separados (e, portanto, os anticorpos per- manecem como homodímeros monoespecíficos); ou ii) em algumas situações, uma primeira subdivisão separado e uma segunda subdivi- são do mesmo tipo de anticorpo origem se unem, formando um homo-

dímero monoespecífico (em vez de estar envolvido na formação de um anticorpo biespecífico heterodímero). Quando no presente documento usado, "anticorpo origem" refere-se a moléculas homodiméricas que ocorrem por qualquer um dos mecanismos acima. Além disso, uma preparação de anticorpo como no presente documento fornecida pode conter como impureza um anticorpo origem de uma ou de ambas as espécies origem. Purificação de um anticorpo de interesse de impurezas

[00109] São no presente documento fornecidos métodos para puri- ficar um anticorpo de interesse de uma ou mais impurezas.

[00110] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido, um anticorpo de interesse está em uma prepara- ção de anticorpo (também referida no presente documento como uma "amostra de partida") que contém o anticorpo de interesse, bem como uma ou mais espécies de moléculas de impureza. Neste material de partida para um método como no presente documento fornecido, o an- ticorpo de interesse pode compreender, por exemplo, pelo menos cer- ca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % em massa da proteína na preparação de anticorpos. Então, em algumas modalidades de um método no presente documen- to fornecido, uma fração purificada (também referida no presente do- cumento como uma "amostra purificada") é coletada como eluato da resina HA. Essa fração purificada contém o anticorpo de interesse e, em algumas modalidades, ainda contém uma ou mais moléculas de impureza. Em algumas modalidades, em uma fração purificada no presente documento fornecida, o anticorpo de interesse pode compre- ender, por exemplo, pelo menos cerca de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % em massa da proteína na fração purificada.

[00111] Em algumas modalidades, em um método no presente do-

cumento fornecido, uma amostra de partida é de pelo menos cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, ou 95 % em massa de anticorpo de interesse e uma amostra purificada subsequente no mesmo método é de pelo menos cerca de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % em massa de anticorpos de interesse, em que o segundo valor é maior que o primeiro valor.

[00112] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido, uma amostra de partida contém pelo menos cerca de 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 % ou 25 % em massa da versão grampeada de um anticorpo de interesse. Em algumas modalidades, em um método no presente documento fornecido, uma amostra purificada não contém mais que cerca de 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 % ou 20 % em massa da versão grampeada de um anticorpo de interesse. Em algumas modalidades, em um mé- todo no presente documento fornecido, uma amostra de partida con- tém pelo menos cerca de 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 % ou 25 % em massa da versão gram- peada de um anticorpo de interesse e uma amostra purificada subse- quente no mesmo método não contém mais que 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 % ou 20 % em massa da versão grampeada de um anticorpo de interesse, em que o segundo valor é menor que o primeiro valor.

[00113] Em algumas modalidades, em um método no presente do- cumento fornecido, uma amostra de partida contém um anticorpo in- tacto de interesse e uma versão grampeada do anticorpo de interesse, em que a relação de anticorpo grampeado para anticorpo intacto é de pelo menos cerca de 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 1:10, 1:5, 1:4 ou 1:3. Em algumas modalidades, em um método no presente documento forneci-

do, uma amostra purificada contém um anticorpo intacto de interesse e uma versão grampeada do anticorpo de interesse, em que a relação de anticorpo grampeado para anticorpo intacto não é mais do que cer- ca de 1:100, 1:50 1:25, 1:20 ou 1:10. Em algumas modalidades, em um método no presente documento fornecido, uma amostra de partida contém um anticorpo intacto de interesse e uma versão grampeada do anticorpo de interesse, em que a relação de anticorpo grampeado para anticorpo intacto na amostra de partida é de pelo menos cerca de 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 1:10, 1:5, 1:4 ou 1:3 e em que a relação de an- ticorpo grampeado para anticorpo intacto em uma amostra purificada subsequente no mesmo método não é maior do que cerca de 1:200, 1:100, 1:50, 1:25, 1:20 ou 1:10, em que a segunda relação é menor que a primeira. Em algumas modalidades, em um método no presente documento fornecido, uma amostra de partida contém um anticorpo intacto de interesse e uma versão grampeada do anticorpo de interes- se, em que a relação de anticorpo grampeado para anticorpo intacto na amostra de partida está entre cerca de uma das relações no grupo A (relações do grupo A: 1:100, 1:50, 1:25, 1:20, 1:20, 1:10, 1:5 ou 1:4) e uma das relações do grupo B (relações do grupo B: 1:50, 1:25, 1:20, 1:10, 1:5, 1:4 ou 1:3) e em que a relação de anticorpo grampeado para anticorpo intacto em uma amostra purificada subsequente no mesmo método não é mais que cerca de 1:200, 1:100, 1:50, 1:25, 1:25, 1:20 ou 1:10, em que a relação na amostra purificada é menor que na amostra de partida.

[00114] Em algumas modalidades, uma amostra de partida forneci- da de acordo com um método no presente documento fornecido con- tém pelo menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ou 10.000 gramas do anticorpo intacto de interesse. Em algumas modalidades, uma amostra purificada fornecida de acordo com um método no presente documento fornecido contém pelo menos 1, 5, 10,

15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ou 10.000 gramas do anticorpo intacto de interesse. Em algumas modalidades, uma amostra de partida fornecida de acordo com um método no presente documen- to fornecido contém pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ou 10.000 gramas do anticorpo intacto de interesse e uma amostra purificada subsequente no mesmo método contém pelo menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ou 5000 gramas do anticorpo intacto de interesse, em que o primeiro valor é maior que o segundo valor.

[00115] Além disso, quaisquer descrições acima relacionadas a) a quantidade ou b) pureza de um anticorpo de interesse em uma amos- tra de partida ou amostra purificada podem ser usadas em conjunto em referência à mesma amostra. Por exemplo, como indicado acima, uma amostra de partida pode conter pelo menos cerca de 80 % em massa de anticorpos de interesse; além disso, como também indicado acima, uma amostra de partida pode conter pelo menos cerca de 10 gramas de anticorpo de interesse. Por conseguinte, também é no pre- sente documento fornecida uma amostra de partida que contém pelo menos cerca de 80 % em massa de anticorpos de interesse e pelo menos 10 gramas de anticorpos de interesse, etc. Técnicas Gerais

[00116] A prática da presente invenção usará, a menos que de ou- tra maneira indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (in- cluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bio- química e imunologia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, como, Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal

Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymo- logy (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Pro- tocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Proto- cols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodi- es: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Mono- clonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Aca- demic Publishers, 1995), bem como nas edições subsequentes e web- sites correspondentes das referências acima, conforme aplicável.

[00117] Os exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilus- trativos e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de forma alguma. De fato, várias modificações da invenção, além das mostradas e descritas no presente documento, tornar-se-ão evidentes àqueles versados na técnica a partir da descrição precedente e se in- cluirão no escopo das reivindicações anexas. Exemplos Exemplo 1: Purificação de um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti- CD3 por cromatografia em resina cHA Objetivo:

[00118] Neste exemplo, métodos para separar uma IgG humana biespecífica de tamanho natural de interesse de várias impurezas fo- ram examinados. O anticorpo de interesse foi um anticorpo anti- BCMA/anti-CD3 biespecífico heterodimérico (isto é, uma subdivisão do anticorpo biespecífico era específica para BCMA e o outra subdivisão era específica para CD3). As impurezas presentes no anticorpo bies- pecífico de interesse no início da purificação incluíram: i) uma versão grampeada do anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti-CD3 intacto de interesse; ii) anticorpos parentais anti-BCMA monoespecíficos, homo- diméricos; iii) anticorpos anti-CD3 monoespecíficos, homodiméricos; e iv) agregados de proteínas/espécies de massa molecular elevada (HMMS).

[00119] A purificação do anticorpo biespecífico intacto de interesse a partir da versão grampeada do anticorpo biespecífico apresentou um desafio particular, pois a versão grampeada do anticorpo biespecífico continha o mesmo número de aminoácidos e as mesmas sequências de aminoácidos que o anticorpo biespecífico intacto, e diferiram da massa do anticorpo biespecífico intacto em apenas 18 Daltons (Da). Especificamente, a massa do anticorpo biespecífico anti-BCMA/CD3 intacto é 148095,5 Da, enquanto a massa da versão grampeada cor- respondente do anticorpo biespecífico é 148113.5 (determinada por espectrometria de massa). Assim, o anticorpo biespecífico grampeado tem uma diferença em massa menor que 0,1 % (mesmo menor que 0,02 %) em comparação com a massa do anticorpo biespecífico intac- to (isto é, 0,1 % de 148095 Da é 148 Da; 0,02 % de 148095 Da é 29,6 Da). Em outras palavras, a massa do anticorpo biespecífico grampea- do é de cerca de 100,01 % da massa do anticorpo biespecífico intacto de interesse. Por conseguinte, a massa do anticorpo biespecífico grampeado é muito similar à do anticorpo biespecífico intacto de inte- resse.

[00120] A versão grampeada do anticorpo biespecífico contém uma clivagem em uma ligação peptídica da cadeia pesada anti-CD3, entre o 56º e o 57º aminoácido na cadeia pesada. A cadeia pesada anti-CD3 tem uma sequência de aminoácidos conforme mostrado na SEQ ID NO: 2 e, portanto, a clivagem ocorre entre os aminoácidos R e G na sequência "RG" da SEQ ID NO: 2 ("RG" apenas ocorre uma vez na SEQ ID NO: 2). Acredita-se que essa clivagem resulte no ganho de 1 átomo de oxigênio e 2 átomos de hidrogênio no anticorpo biespecífico grampeado (o que corresponderia ao ganho de massa de 18 Da), em comparação com o anticorpo biespecífico intacto. Da mesma forma, há uma ligação peptídica clivada na cadeia pesada anti-CD3, a porção de 56 aminoácidos clivada da cadeia pesada (isto é, os primeiros 56 ami- noácidos da cadeia) permanece ligada ao restante do anticorpo atra- vés de uma ligação dissulfeto intracadeia restante, intacta. A ligação dissulfeto intracadeia está entre C22 e C98 da cadeia pesada anti-CD3 (isto é, C22 e C98 da sequência mostrada na SEQ ID NO: 2). A liga- ção continuada da porção de 56 aminoácidos clivada ao restante do anticorpo pela ligação peptídica de intracadeia é mostrada esquemati- camente na FIG. 2)

[00121] Na FIG. 2, o esquema à esquerda representa um anticorpo biespecífico intacto de interesse, que contém cadeias pesada e leve intactas para as subdivisões anti-CD3 e anti-BCMA do anticorpo bies- pecífico (na figura, as cadeias mais longas representam as cadeias pesadas do anticorpo e as cadeias mais curtas representam as cadei- as leves). Além disso, a FIG. 2 também mostra várias ligações de dis- sulfeto intra-anticorpo, incluindo ligações dissulfeto intracadeia (por exemplo, ligando diferentes aminoácidos na mesma cadeia leve ou cadeia pesada) e também ligações dissulfeto intercadeia (por exemplo, ligando a cadeia pesada da subdivisão anti-BCMA à cadeia pesada da subdivisão anti-CD3 ou ligando a cadeia leve da subdivisão anti-CD3 à cadeia pesada da subdivisão anti-CD3).

[00122] Outro desafio apresentado no desenvolvimento de um mé- todo para purificar o anticorpo biespecífico intacto de interesse das vá- rias impurezas foi o objetivo de desenvolver um método que separasse efetivamente o anticorpo biespecífico de interesse das impurezas quando quantidades relativamente grandes de anticorpo biespecífico de interesse fossem purificadas. Por exemplo, um objetivo do trabalho relacionado a este Exemplo era desenvolver um método para purifica- ção de um anticorpo biespecífico que seria eficaz para métodos nos quais pelo menos 1 grama de anticorpo biespecífico deveria ser purifi- cado. Como é conhecido na técnica, a purificação de proteínas em lar- ga escala frequentemente apresenta numerosas dificuldades que não estão presentes (ou são significativamente menos problemáticas) du- rante a purificação das mesmas proteínas em pequena escala, devido, por exemplo, a dificuldades em obter uma resolução cromatográfica precisa entre proteínas diferentes ao realizar a cromatografia em larga escala. Materiais e Métodos:

[00123] O material de partida para este trabalho foi uma preparação de anticorpos contendo o anticorpo IgG anti-BCMA/CD3 biespecífico de interesse, bem como várias impurezas, como as mencionadas aci- ma. As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos do anticorpo bi- específico são mostradas nas seguintes SEQ ID NOs: cadeia pesada de BCMA: SEQ ID NO: 6; cadeia leve de BCMA: SEQ ID NO: 8; ca- deia pesada de CD3: SEQ ID NO: 2; cadeia leve de CD3: SEQ ID NO:

4. O anticorpo biespecífico de interesse foi preparado a partir de dois anticorpos origem separados, como descrito precedentemente no pre- sente documento. Mais especificamente, os anticorpos monoespecífi- cos anti-CD3 e anti-BCMA origem foram purificados por cromatografia em Proteína-A e esses anticorpos anti-CD3 e anti-BCMA monoespecí- ficos origem purificados foram usados para gerar o anticorpo anti-

BCMA/CD3 biespecífico de interesse. O anticorpo anti-BCMA/CD3 bi- específico gerado foi, então, purificado por cromatografia de permuta de íons. A preparação de anticorpo usada como material de partida para o trabalho de purificação neste Exemplo foi o eluato da coluna de permuta de íons, que continha o anticorpo biespecífico de interesse e várias impurezas restantes, e possuía tampões/sais a uma concentra- ção aproximada de: 50 mM de Tris e 60 mM de glicina, pH 7,5. A pre- paração de anticorpos continha mais de 85 % em massa de anticorpo biespecífico intacto de interesse; também continha cerca de 8 % de anticorpo biespecífico grampeado, cerca de 1 % de anticorpos origem anti-BCMA monoespecíficos, cerca de 1 % de anticorpos origem anti- CD3 monoespecíficos e cerca de 2 % de agregados de proteí- na/espécies de massa molecular elevada (HMMS). Assim, enquanto a preparação de anticorpos usada como material de partida neste méto- do continha anticorpo biespecífico intacto que já era relativamente pu- ro, um objetivo deste método era desenvolver um método para aumen- tar a pureza do anticorpo biespecífico intacto. Resultados:

[00124] Múltiplas resinas e condições diferentes de cromatografia foram testadas, a fim de tentar identificar uma resina adequada e con- dições de tampão que permitissem a purificação eficaz do anticorpo biespecífico anti-BCMA/CD3 intacto de interesse do anticorpo biespe- cífico grampeado, os anticorpos origem monoespecíficos, e proteína agregam-se. Durante este processo, por exemplo, várias resinas de permuta de íons e interação hidrofóbica diferentes foram testadas, bem como várias condições de tampão e pH. Após testes extensivos, a resina hidroxiapatita foi a única resina identificada que poderia per- mitir a purificação eficaz do anticorpo biespecífico anti-BCMA/CD3 in- tacto de várias impurezas, incluindo o anticorpo biespecífico grampea- do.

[00125] A FIG. 3 mostra um perfil cromatográfico da eluição do anti- corpo biespecífico de interesse de uma coluna de resina hidroxiapatita cerâmica ("cHA") e a separação simultânea do anticorpo biespecífico anti-BCMA/CD3 de interesse de várias impurezas diferentes, incluindo a versão grampeada do anticorpo biespecífico, ambas as espécies de anticorpos origem e espécies de proteínas de massa molecular eleva- da.

Para o ciclo de cromatografia representado na FIG. 3, a prepara- ção de anticorpo que foi carregada na resina cHA foi reforçada com anticorpos anti-BCMA origem e anti-CD3 parental extras, a fim de identificar mais claramente a posição da eluição dessas moléculas da coluna de cHA (no entanto, nenhum anticorpo biespecíficos intacto ou grampeado extra foi adicionado). Na FIG. 3, o eixo X representa, da esquerda para a direita, a sequência do eluato da coluna de cHA (isto é, o material para a esquerda é eluído da coluna de cHA mais ce- do/com sal inferior ao do material à direita). Tipicamente, o eluato é coletado em frações sequenciais da coluna; assim, o eixo X também pode ser considerado para representar a sequência de frações de eluato da coluna de resina cHA.

O eixo Y representa igualmente a ab- sorvência UV (em 280 nM) e a condutividade, conforme observado se- paradamente no gráfico.

A absorvência UV corresponde à presença de proteína eluída e a condutividade corresponde à concentração de sal no material eluído.

Assim, a FIG. 3 representa o perfil da eluição de diferentes proteínas da coluna de resina cHA, visto que a concentra- ção de sal no tampão de eluição que flui através da resina cHA au- menta.

Seguindo o gráfico UV na FIG. 3 da esquerda para a direita, o gráfico mostra vários picos e rebaixos, que correspondem ao anticorpo biespecífico anti-BCMA/CD3 intacto de interesse ou várias impurezas.

Especificamente, da esquerda para a direita, o primeiro pico de UV corresponde à eluição do primeiro anticorpo origem ("progenitor 1"; o homodímero monoespecífico anti-BCMA). A porção inicial do próximo pico principal (e o maior pico no gráfico) corresponde à proteína de anticorpo biespecífica intacta de interesse ("POI"). A extremidade pos- terior/cauda desse mesmo pico principal corresponde à versão gram- peada do anticorpo biespecífico ("Grampo"). Embora exista alguma sobreposição entre o perfil de eluição do anticorpo biespecífico intacto em comparação com o anticorpo biespecífico grampeado, esses dois tipos de anticorpos são eluídos da coluna de cHA sob condições e fra- ções de sal suficientemente diferentes para separar significativamente o anticorpo biespecífico intacto da versão grampeada do anticorpo bi- específico. Finalmente, após a versão grampeada do anticorpo bies- pecífico eluir, o último pico/rebaixo principal da coluna de cHA corres- ponde à eluição do segundo anticorpo origem (homodímero anti-CD3 monoespecífico), bem como espécies de massa molecular elevada ("HMMS") (também conhecido como agregados de proteína) da coluna de cHA. Assim, o gráfico da FIG. 3 mostra que o anticorpo intacto anti- BCMA/CD3 pode ser efetivamente purificado a partir de múltiplas im- purezas, incluindo espécies relacionadas de anticorpos grampeados e parentais por cromatografia em resina cHA.

[00126] A FIG. 4 fornece um gráfico que mostra informações mais detalhadas sobre as diferentes espécies moleculares presentes nas frações sequencialmente eluídas da coluna de resina cHA, de acordo com o perfil de eluição de cHA representado na FIG. 3. Especificamen- te, a FIG. 4 fornece informações detalhadas sobre as quantidades re- lativas de: i) a proteína de anticorpo biespecífica anti-BCMA/CD3 intac- ta de interesse ("POI"); ii) a versão grampeada do anticorpo biespecífi- co; iii) o primeiro anticorpo origem/o anticorpo anti-BCMA monoespecí- fico; iv) o segundo anticorpo origem/o anticorpo anti-CD3 monoespecí- fico; e v) espécies de massa molecular elevada ("HMMS") nas diferen- tes frações eluídas da coluna de cHA. O eixo X da FIG. 4 representa, da esquerda para a direita, a sequência de eluato da coluna de cHA

(isto é, de baixo teor de sal a alto teor de sal; cada ponto de dados in- dica uma fração eluída da coluna). O eixo Y da FIG. 4 representa, no lado esquerdo, a porcentagem de cada um dentre i) a proteína de anti- corpo biespecífica anti-BCMA/CD3 intacta de interesse ("POI"); ii) a versão grampeada do anticorpo biespecífico; iii) o primeiro anticorpo origem/o anticorpo anti-BCMA monoespecífico; e iv) o segundo anti- corpo origem/o anticorpo anti-CD3 monoespecífico em cada fração. O eixo Y da FIG. 4 mostra, no lado direito, a % de HMMS em cada fra- ção.

[00127] O método usado para gerar os dados na FIG. 3 também foi usado com uma preparação de anticorpo que não havia sido enrique- cida com nenhum anticorpo adicional; Os dados desta cromatografia são apresentados na FIG. 5. Assim, os dados na FIG. 5 reflete a purifi- cação via resina cHA de uma preparação de anticorpo típica eluída de uma coluna de permuta de íons durante a preparação de anticorpos biespecíficos anti-BCMA/CD3, que contém principalmente anticorpos biespecíficos anti-BCMA/CD3 intactos de interesse, bem como várias impurezas, incluindo a versão grampeada do anticorpo biespecífico. Na FIG. 5, o eixo X representa, da esquerda para a direita, a sequên- cia do material eluído da coluna de cHA. O eixo Y mostra a absorvên- cia UV (a 280 nM) e a condutividade, conforme observado separada- mente no gráfico. Os picos origem 1 e origem 2 são menores na FIG. 5 do que na FIG. 3, porque a amostra carregada na coluna de cHA para a FIG. 5 não foi adicionada com o anticorpo origem 1 e 2 adicional (enquanto que na FIG. 3, as amostras foram adicionadas com o anti- corpo origem 1 e origem 2).

[00128] A FIG. 6 fornece um gráfico mostrando informações adicio- nais sobre a recuperação do anticorpo biespecífico anti-BCMA/CD3 intacto de interesse da resina cHA, bem como a quantidade relativa de anticorpo biespecífico grampeada em várias frações eluídas da resina cHA, da esquerda para a direita, a sequência de eluato da coluna de cHA (isto é, de baixo teor de sal para alto teor de sal; cada ponto de dados indica uma fração eluída da coluna). Ao longo do eixo vertical/Y, três variáveis diferentes são plotadas para cada fração: Variável 1) (di- amantes): a recuperação cumulativa de anticorpos biespecíficos intac- ta ("% de POI"), que é a quantidade total de anticorpo biespecífico anti- BCMA/CD3 intacto (isto é, a proteína de interesse) recuperado da co- luna de cHA através dessa fração na execução da cromatografia (em outras palavras, é como se todo o material eluído da coluna de cHA durante a execução e até essa fração fosse coletado e agrupado e, em seguida, é medida a quantidade total de anticorpo biespecífico anti- BCMA/CD3 intacto nesse material combinado); Além disso, o valor "% de POI" é apresentado como a porcentagem da quantidade total do anticorpo/proteína biespecífica anti-BCMA/CD3 intacta de interesse que foi carregada na coluna de cHA que foi recuperada (isto é, em vez de ser apresentada como um valor em gramas). Variável 2) (quadra- dos): a % da proteína em cada fração respectiva que é o anticorpo bi- específico grampeado ("% de Grampo"). Variável 3) (triângulos): a re- cuperação cumulativa de anticorpos biespecíficos grampeados ("Grampo Cumulativo"), que é a quantidade total de anticorpo biespe- cífico grampeado recuperado da coluna de cHA através dessa fração na execução da cromatografia. Além disso, na FIG. 6, o eixo Y do lado esquerdo lista valores para a % de POI e o eixo Y do lado direito lista valores para a % de Grampo.

[00129] A FIG. 6 também contém informações que mostram como certas frações diferentes na FIG. 6 correspondem a diferentes pontos na absorvência de UV no perfil de cromatografia, como mostrado na FIG. 5. Assim, por exemplo, a FIG. 5 mostra que o maior pico de ab- sorvência UV/eluição da proteína da resina cHA corresponde à proteí- na de interesse/anticorpo biespecífico anti-BCMA/CD3 intacto. O topo desse grande pico de absorvência UV/eluição de proteína da coluna de cHA também é chamado de "Ápice" da execução; o pico da fração de cromatografia correspondente a este ponto Ápice é observado na FIG. 6. Então, vários pontos após o Ápice do Pico também são anota- dos na FIG. 6. Esses pontos são "90 %", "80 %", "70 %", "60 %" e "50 %" e são calculados da seguinte forma. O valor da absorvência UV no Ápice é definido como ponto de partida para cálculos adicionais. En- tão, o valor de UV que é 90 % do valor do Ápice UV é determinado. O valor de 90 % de Ápice UV que ocorre após o valor do Ápice UV ser alcançado durante a execução da cromatografia (isto é, no final da ex- tremidade do pico) é anotado como a fração "90 %"; também pode ser referido no presente documento como a fração de "90 % após o Ápice" ou similar. Esse processo é repetido para os valores de 80 %, 70 %, 60 % e 50 % (isto é, cada um desses valores fica mais abaixo do final da cauda do pico e, portanto, representa uma quantidade cada vez maior de material coletado). Como a FIG. 6 mostra, à medida que a % do valor do Ápice diminui, a % de Grampo nas frações aumenta. Isso é consistente com o processo no qual o anticorpo biespecífico grampea- do elui da coluna de cHA posteriormente/sob condições salinas mais altas do que o anticorpo biespecífico anti-BCMA/CD3 intacto. Assim, se uma fração maior do Ápice do Pico for coletada, (isto é, para uma % menor após a fração do Ápice do Pico), também serão coletados mais anticorpos biespecíficos grampeados, devido à sobreposição parcial entre os perfis de eluição do anticorpo biespecífico intacto e o anticorpo biespecífico grampeado.

[00130] Vários valores da FIG. 6 também são fornecidos abaixo na Tabela 1. Conforme mostrado na Tabela 1, de acordo com o método de purificação de cHA no presente documento fornecido, por exemplo, se o eluato de 90 % após o Ápice do Pico da coluna de cHA for cole- tado (isto é, a recuperação de % de POI através da fração de "90 %

após o Ápice do Pico"), então 54 % do anticorpo/proteína biespecífica intacta de interesse que foram carregados na coluna de cHA são recu- perados e esse pool de proteínas recuperado contém 0 % de anticorpo biespecífico grampeado. Em outro exemplo, se o eluato de 50 % após o Ápice do Pico da coluna de cHA for coletado (isto é, a % de recupe- ração de POI através da fração "50 % após o Ápice do Pico"), 74 % do anticorpo/proteína biespecífica intacta de interesse que foram carrega- dos na coluna de cHA são recuperados e esse pool de proteínas recu- peradas contém 0,2 % de anticorpo biespecífico grampeado. Por con- seguinte, como mostrado na FIG. 6 e Tabela 1, a purificação robusta do anticorpo biespecífico intacto de interesse do anticorpo biespecífico grampeado pode ser efetivamente alcançada por meio de uma resina cHA. Tabela 1 Pool do Pico % de POI % de Grampo Cumulativo Ápice do Pico 34 0 90 % após o Ápice do Pico 54 0 80 % após o Ápice do Pico 61 0,1 70 % após o Ápice do Pico 67 0,1 60 % após o Ápice do Pico 70 0,2 50 % após o Ápice do Pico 74 0,2

[00131] Para os resultados da cromatografia de cHA, como mostra- do nas FIGs 3-6, a cromatografia de cHA foi realizada da seguinte ma- neira. A preparação de anticorpo contendo o anticorpo anti-BCMA/CD3 biespecífico de interesse e várias impurezas foi carregada em uma co- luna de cromatografia contendo uma resina cHA. A resina cHA era cHA Tipo 1, tamanho de conta de 40 µM (Bio-Rad). Para as cromato- grafias representadas nas FIGs. 3 e 4, a resina cHA foi carregada com amostra até uma densidade de proteínas na resina cHA de 30 g/L. Pa- ra as cromatografias representadas nas FIGs. 5 e 6, a resina cHA foi carregada com amostra até uma densidade de proteína na resina cHA de 10 g/L. Antes de carregar a amostra na resina cHA, a resina foi pré- equilibrada com 5 volumes de coluna do tampão de equilíbrio 1, segui- dos por 5 volumes de coluna do tampão de equilíbrio 2. A composição dos vários tampões descritos neste método está listada abaixo na Ta- bela 2. A preparação de anticorpo contendo o anticorpo anti- BCMA/CD3 biespecífico parcialmente purificado de interesse foi carre- gada na coluna de resina cHA em um tampão de carga contendo aproximadamente 50 mM de Tris e 60 mM de glicina, pH 7,5. Após a preparação do anticorpo ter sido carregada na coluna de resina cHA, a coluna foi então lavada com 3 volumes de coluna de tampão de lava- gem. Em seguida, o anticorpo biespecífico de interesse (isto é, o anti- corpo biespecífico intacto) foi eluído da resina cHA usando 20 volumes de coluna de tampão de eluição, nos quais a concentração de fosfato de sódio no tampão de eluição foi aumentada de 40 mM para 80 mM ao longo do curso da eluição. Como mostrado nas FIGs 3-6, as várias impurezas que estavam presentes na preparação do anticorpo com o anticorpo biespecífico de interesse também são eluídas da coluna de cHA em resposta ao tampão de eluição, mas o fazem sob concentra- ções de sal suficientemente diferentes do anticorpo biespecífico anti- BCMA/CD3 intacto de interesse, de modo que o anticorpo biespecífico intacto possa ser efetivamente separado das várias impurezas, inclu- indo a versão grampeada do anticorpo biespecífico intacto.

[00132] Após a eluição da proteína de interesse da coluna de resina cHA pelo tampão de eluição, de acordo com o protocolo descrito aci- ma, a resina cHA pode então ser extraída com 5 volumes de coluna de Tampão de Extração, seguida de higienização com 5 volumes de co- luna de Tampão de Sanitização, seguida por 5 colunas volumes de Tampão de Armazenamento.

[00133] Para cada uma das análises acima de material diferente eluído da coluna de cHA, o tipo e a quantidade das diferentes espécies moleculares em várias frações/conjuntos foram determinados por aná- lise de permuta de cátions analíticos (CEX). Tabela 2 Nome do Tampão Composição Volume (s) de Coluna Tampão de Equilíbrio 400 mM de fosfato sódico, pH 7,5 5 1 Tampão de Equilíbrio 20 mM de HEPES, 2 mM de fos- 5 2 fato sódico, pH 7,5 Tampão de Carga Pool de proteína em aproxima- N/A damente 50 mM de Tris, 60 mM de glicina, ajustado em pH 7,5; Tampão de Lavagem 20 mM de HEPES, 40 mM de fos- 3 fato sódico Tampão de Eluição 20 volumes de coluna gradiente 20 de 40-100 mM de fosfato sódico Tampão de Extração 400 mM de fosfato sódico, pH 7,5 5 Tampão de Sanitiza- 500 mM de fosfato de potássio, 1 5 ção mM de hidróxido de sódio Tampão de Armaze- 100 mM de hidróxido de sódio 5 namento Exemplo 2: Purificação de um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti- CD3 por cromatografia em resina cHA - desafios de carregamento em massa Objetivo:

[00134] O objetivo neste exemplo foi determinar se o método de purificação de anticorpo biespecífico descrito no Exemplo 1 pode ser efetivamente usado com vários desafios de carregamento em massa na resina cHA. Por exemplo, um objetivo específico era determinar se, para vários desafios de carregamento em massa na coluna de resina cHA, seria possível recuperar consistentemente mais de 50 % do anti- corpo biespecífico de entrada e, ao mesmo tempo, não ter mais de 1 % de anticorpo biespecífico grampeado como impureza no produto de anticorpo biespecífico purificado, recuperado. Materiais e Métodos:

[00135] Os materiais e métodos para este Exemplo foram os mes- mos do Exemplo 1, exceto que a resina de cHA foi carregada com a amostra de preparação de anticorpo para uma densidade de proteína na resina cHA (em diferentes ciclos de cromatografia) de 8 g/L, 10 g/L ou 12 g/L. Resultados:

[00136] Os resultados destes ciclos de cromatografia estão resumi- dos abaixo na Tabela 3. Para todos 3 dos ciclos de cromatografia, o material após o Ápice do Pico a 90% (como descrito no Exemplo 1) foi coletado e analisado. Como mostrado na Tabela 3, para cada um dos desafios em massa de 8 g/L, 10 g/L e 12 g/L, mais de 50 % do anticor- po biespecífico intacto carregado foram recuperados como anticorpo biespecífico purificado, e o produto de anticorpo biespecífico purificado recuperado continha menos de 1 % de anticorpo biespecífico grampe- ado como uma impureza.

[00137] Assim, essas experiências mostram que o anticorpo bies- pecífico intacto de interesse pode ser consistentemente eficazmente separado do anticorpo biespecífico grampeado por cromatografia na resina cHA, em vários desafios de carregamento em massa de resina cHA. Tabela 3 Desafio em Massa Recuperação de POI Grampo Cumulativo Cumulativa 8 gramas/litro 56 % 0,4 10 gramas/litro 58 % 0,5 12 gramas/litro 58 % 0,8 Exemplo 3: Purificação de um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti- CD3 por cromatografia em resina cHA - diferentes desafios de pH Objetivo:

[00138] O objetivo neste exemplo foi determinar se o método de purificação de anticorpo biespecífico descrito no Exemplo 1 pode ser efetivamente realizado sob diferentes condições de pH. Materiais e Métodos:

[00139] Os materiais e métodos para este Exemplo foram os mes- mos que no Exemplo 1, exceto que o pH dos tampões utilizados ao longo do método foi pH 7,0, pH 7,5 ou pH 8,0 (em diferentes ciclos de cromatografia). Para estes ciclos de cromatografia, a resina cHA foi carregada com amostra de preparação de anticorpo até uma densida- de de proteína de 30 g/L na resina cHA. Resultados:

[00140] Os resultados destes ciclos de cromatografia estão resumi- dos abaixo na Tabela 4. Para todas os 3 dos ciclos de cromatografia, o material Ápice do Pico (como descrito no Exemplo 1) foi coletado e analisado. Como mostrado na Tabela 4, a proteína de anticorpo bies- pecífica intacta de interesse foi recuperada com sucesso para cada uma das diferentes condições de pH testadas, e o pH 7,5 produziu a recuperação mais alta da proteína de interesse. (A quantidade de anti- corpo biespecífico grampeado no material purificado não foi determi- nada separadamente para estes ciclos de cromatografia.)

[00141] Assim, estas experiências mostram que o anticorpo biespe- cífico intacto de interesse pode ser efetivamente purificado por croma- tografia em resina cHA em diferentes condições de pH. Tabela 4 pH do Tampão Recuperação de POI Cumulativa 7,0 30 % 7,5 40 % 8,0 20 % Exemplo 4: Purificação de um anticorpo biespecífico anti-FLT3/anti- CD3 por cromatografia em resina cHA Objetivo:

[00142] O objetivo deste exemplo foi determinar se o método de purificação de anticorpo biespecífico descrito no Exemplo 1 pode ser efetivamente realizado com um anticorpo biespecífico diferente do usado no Exemplo 1, no qual também havia a necessidade de separar um anticorpo biespecífico intacto de interesse de várias impurezas, incluindo um anticorpo biespecífico grampeado relacionado de massa similar. Neste exemplo, o anticorpo de interesse era um anticorpo anti- FLT3/anti-CD3 biespecífico heterodimérico. Materiais e Métodos:

[00143] O anticorpo anti-FLT3/anti-CD3 biespecífico, heterodimérico usado neste exemplo continha a mesma cadeia pesada e cadeia leve anti-CD3 que no Exemplo 1. As sequências de aminoácidos dos poli- peptídeos na subdivisão de FLT3 do anticorpo biespecífico são mos- tradas nas seguintes SEQ ID NOs: cadeia pesada de FLT3: SEQ ID NO: 10; cadeia leve de FLT3: SEQ ID NO: 12.

[00144] A versão grampeada do anticorpo biespecífico no exemplo tinha um grampo na mesma posição da cadeia pesada anti-CD3 como descrito no Exemplo 1.

[00145] Os materiais e métodos para este Exemplo foram os mes- mos que no Exemplo 1, exceto que, como descrito acima, a amostra de preparação de anticorpos continha anticorpo anti-FLT3/anti-CD3 biespecífico. A resina cHA foi carregada com a amostra de preparação de anticorpo para a densidade de proteínas na resina cHA de 10 g/L. Resultados:

[00146] A FIG. 7 mostra um gráfico que fornece informações sobre a recuperação do anticorpo anti-FLT3/CD3 biespecífico intacto de inte- resse da resina cHA, bem como a quantidade relativa de anticorpo bi- específico grampeado em várias frações eluídas da resina cHA. O eixo X representa, da esquerda para a direita, a sequência de eluato da co- luna cHA (isto é, de baixo teor de sal para alto teor de sal; cada ponto de dados indica uma fração eluída da coluna). Ao longo do eixo verti- cal/Y, três variáveis diferentes são plotadas para cada fração: Variável 1) (diamantes): % de POI; Variável 2) (quadrados): % de Grampo; e Variável 3) (triângulos), cada um dos quais foi determinado como des- crito no Exemplo 1 para a FIG. 6. Além disso, na FIG. 7, o eixo Y do lado esquerdo lista valores para o % de POI e o eixo Y do lado direito lista valores para o % de Grampo. A FIG. 7 também contém informa- ções que mostram como certas frações diferentes na FIG. 7 corres- pondem a pontos diferentes na absorvência UV no perfil de cromato- grafia correspondente (não mostrado). Os pontos anotados como "Ápi- ce", "85 %" e "60 %" foram determinados da mesma maneira que a descrita na FIG. 6

[00147] Vários valores da FIG. 7 também são fornecidos abaixo na Tabela 5. Como mostrado na Tabela 5, o método de purificação de resina cHA no presente documento fornecido permite, por exemplo, a recuperação de mais de 80 % de anticorpo anti-FLT3/CD3 biespecífico intacto de interesse, enquanto tendo menos de 1 % de anticorpo bies- pecífico grampeado no produto anticorpo purificado.

[00148] Por conseguinte, como mostrado na FIG. 7 e Tabela 5, a purificação do anti-FLT3/CD3 biespecífico intacto do anticorpo biespe- cífico grampeado pode ser efetivamente alcançada por meio de uma resina cHA. Tabela 5 Pool do Pico % de POI % de Grampo Cumulativo Ápice do Pico 55 0,2 85 % após o Ápice do Pico 72 0,4 60 % após o Ápice do Pico 82 0,7

[00149] Embora os ensinamentos divulgados tenham sido descritos com referência a várias pedidos, métodos, kits e composições, será apreciado que várias alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar dos ensinamentos no presente documento e da invenção reivindicada abaixo. Os exemplos precedentes são fornecidos para melhor ilustrar os ensinamentos divulgados e não se destinam a limitar o escopo dos ensinamentos no presente documento apresentados. Embora os presentes ensinamentos tenham sido descritos em termos dessas modalidades exemplares, o especialista versado entenderá facilmente que inúmeras variações e modificações dessas modalida- des exemplares são possíveis sem experimentação indevida. Todas essas variações e modificações estão dentro do escopo dos ensina- mentos atuais.

[00150] Todas as referências no presente documento citadas, inclu- indo patentes, pedidos de patente, papéis, livros de texto e similares, e as referências no presente documento citadas, na medida em que ain- da não sejam, são no presente documento incorporados por referência em sua totalidade. No caso de um ou mais da literatura incorporada e de materiais similares diferirem ou contradizerem este pedido, incluin- do porém, não se limitando a termos definidos, uso de termos, técni- cas descritas ou similares, este pedido prevalece.

[00151] A descrição e exemplos precedentes detalham certas mo- dalidades específicas da invenção e descrevem o melhor modo con- templado pelos inventores. Deverá ser apreciado, no entanto, que não importa o quão detalhado o precedente possa aparecer no texto, a in- venção pode ser praticada de várias maneiras e a invenção deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes das mesmas.

[00152] Entende-se que sempre que modalidades são descritas no presente documento com a linguagem "compreendendo", outras mo- dalidades análogas descritas em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em" também são fornecidas.

[00153] Onde os aspectos ou modalidades da invenção são descri- tos em termos de um grupo Markush ou outro agrupamento de alterna-

tivas, a presente invenção abrange não apenas o grupo inteiro listado como um todo, porém, cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal, porém, também o grupo principal está ausente de um ou mais membros do grupo. A presente invenção também prevê a exclusão explícita de um ou mais de qual- quer um dos membros do grupo na invenção reivindicada.

[00154] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos no presente documento utilizados têm o mesmo sig- nificado que é comumente entendido por alguém versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, a presente espe- cificação, incluindo definições, prevalecerá. Em toda esta especifica- ção e reivindicações, a palavra "compreender" ou variações como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas para implicar a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros declara- do, porém, não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. A menos que de outra maneira requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Qualquer(quaisquer) exemplo(s) que segue(m) o termo "p.ex." ou "por exemplo" não pretende ser exaustivo ou limitante. O termo "ou" quando usado no contexto de uma lista de várias opções (por exemplo, "A, B ou C") deve ser interpretado para incluir qualquer uma ou mais das opções, a menos que o contexto in- dique claramente o contrário.

[00155] Métodos e materiais exemplares são no presente documen- to descritos, embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos no presente documento descritos também possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de purificar um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: A) carregar uma preparação de anticorpo em um tampão de carga em uma resina hidroxiapatita (HA), em que: a preparação de anticorpo compreende: I) um anticorpo in- tacto de interesse e II) uma versão grampeada do anticorpo de inte- resse, em que a versão grampeada do anticorpo de interesse é uma produção de degradação do anticorpo intacto de interesse, e tem uma massa que é menos de 10 % diferente da massa do anticorpo intacto de interesse; e B) eluir o anticorpo intacto de interesse da resina HA com um tampão de eluição compreendendo um íon, em que a concentra- ção do íon no tampão de eluição é aumentada durante a eluição.

2. Método de purificar um anticorpo biespecífico, caracteri- zado pelo fato de que compreende: A) carregar uma preparação de anticorpo em um tampão de carga em uma resina hidroxiapatita (HA), em que: a preparação de anticorpo compreende: I) um anticorpo bi- específico intacto de interesse; e II) pelo menos uma espécie de impu- reza, em que as espécies de impureza são selecionadas do grupo que consiste em: a) uma versão grampeada do anticorpo biespecífico de interesse, em que a versão grampeada do anticorpo biespecífico de interesse é uma produção de degradação do anticorpo biespecífico intacto de interesse e tem uma massa que é menos de 10 % diferente da massa do anticorpo biespecífico intacto de interesse; b) um primei- ro anticorpo origem, em que o primeiro anticorpo origem é um anticor- po monoespecífico tendo a mesma especificidade de antígeno que uma primeira subdivisão do anticorpo biespecífico intacto; c) um se- gundo anticorpo origem, em que o segundo anticorpo origem é um an-

ticorpo monoespecífico tendo a mesma especificidade de antígeno que uma segunda subdivisão do anticorpo biespecífico intacto; e d) espé- cies de massa molecular elevada (HMMS); e B) eluir o anticorpo biespecífico intacto de interesse da re- sina HA com um tampão de eluição compreendendo um íon, em que a concentração do íon no tampão de eluição é aumentada durante a eluição.

3. Método de purificar um anticorpo biespecífico, caracteri- zado pelo fato de que compreende: A) carregar uma preparação de anticorpo em um tampão de carga em uma resina hidroxiapatita (HA), em que: I) a preparação de anticorpo compreende: a) um anticorpo biespecífico intacto de interesse e b) uma versão grampeada do anti- corpo biespecífico de interesse, em que a versão grampeada do anti- corpo de interesse é uma produção de degradação a partir do anticor- po biespecífico intacto de interesse, e tem uma massa que é menos de 10 % diferente da massa do anticorpo biespecífico intacto de interes- se; e II) a relação de moléculas do anticorpo biespecífico gram- peado para moléculas do anticorpo biespecífico intacto na preparação de anticorpos está entre pelo menos 1:50 e não superior a 1:5; B) eluir o anticorpo biespecífico intacto da resina HA com um tampão de eluição compreendendo um íon, em que a concentra- ção do íon no tampão de eluição é aumentada durante a eluição e, op- cionalmente, C) coletar uma fração purificada eluída da resina HA, em que a fração purificada compreende o anticorpo biespecífico intacto.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico heterodiméri- co.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de compreender ainda a coleta de uma fração purifica- da eluída da resina HA, em que a fração purificada compreende o an- ticorpo intacto de interesse e em que a fração purificada compreende pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % em massa de anticorpo intacto de interesse.

6. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a fração purificada compreende o anticorpo biespecí- fico intacto e o anticorpo biespecífico grampeado, ainda em que a re- lação de moléculas de anticorpo biespecífico grampeadas para molé- culas de anticorpo biespecíficas intactas na fração purificada não é maior que 1:100.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de interesse é um anticorpo anti-CD3 e em que o anticorpo compreende pelo menos um dos seguintes: i) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 1 ; ii) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2; iii) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1 e uma região VL compreendendo uma se- quência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 3; ou iv) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 4.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico é: i) um anticorpo biespecífico anti-BCMA/anti-CD3 compreendendo uma sub- divisão anti-BCMA e uma subdivisão anti-CD3, ou ii) um anticorpo bi- específico anti-FLT3/anti-CD3 compreendendo uma subdivisão anti- FLT3 e uma subdivisão anti-CD3.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a subdivisão anti-CD3 compreende pelo menos um dos seguintes: i) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1; ii) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2; iii) uma região VH compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 1 e uma região VL com- preendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 3; ou iv) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 4.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracte- rizado pelo fato de que a subdivisão anti-BCMA compreende pelo me- nos um dos seguintes: i) uma região VH compreendendo uma sequên- cia de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 5; ii) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mos- trado na SEQ ID NO: 6; iii) uma região VH compreendendo uma se- quência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 5 e uma regi- ão VL compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostra- do na SEQ ID NO: 7; ou iv) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 6 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 8.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracte- rizado pelo fato de que a subdivisão anti-FLT3 compreende pelo me- nos um dos seguintes: i) uma região VH compreendendo uma sequên- cia de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 9; ii) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mos- trado na SEQ ID NO: 10; iii) uma região VH compreendendo uma se-

quência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 9 e uma regi- ão VL compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostra- do na SEQ ID NO: 11; ou iv) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 12.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a preparação do anticorpo é carregada na resina HA até uma densidade na resina dentre 5 g/L e 20 g/L.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos 1 grama de preparação de anticorpo é carregado na resina HA.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a preparação de anticor- pos compreende pelo menos 50 %, porém, menos de 95 % em massa de anticorpos intactos de interesse.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo grampeado tem uma massa que é menos de 1 % diferente da massa do anticorpo intacto.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo grampeado tem uma massa que está entre cerca de 5 e 100 Daltons maior que a massa do anticorpo intacto.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo grampeado tem uma ligação peptídica clivada em uma cadeia polipeptídica do an- ticorpo e em que a ligação peptídica clivada está em uma cadeia pe- sada do anticorpo.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo grampeado contém o mesmo número de aminoácidos e as mesmas sequências de aminoácidos que o anticorpo intacto.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo grampeado contém um número diferente de aminoácidos que o anticorpo intacto.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de interesse compreende um domínio VH e VL que se liga especificamente a CD3 e em que o anticorpo grampeado compreende uma ligação peptídica clivada no domínio VH que se liga especificamente a CD3.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a resina HA é resina hidro- xiapatita cerâmica (cHA).

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que após o carregamento da preparação do anticorpo na resina HA, porém, antes da eluição do an- ticorpo biespecífico intacto, a resina é lavada com um tampão de lava- gem compreendendo íons de fosfato na concentração entre 10 e 50 mM.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o íon no tampão de eluição é fosfato.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a concentração do íon de fosfato é aumentada durante a eluição de cerca de 40 mM a 100 mM.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o pH de pelo menos um dos tampões de carga, tampão de lavagem e tampão de eluição é igual ou próximo ao pH 7,0 e 8,0.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a preparação de anticor- pos contém proteínas que foram previamente carregadas em e eluídas em pelo menos um dentre: i) uma resina de proteína A e ii) uma resina de permuta de íons.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é isolado e/ou purificado para uso como ou na preparação de produtos farmacêuti- cos.