CN111788222A - 抗体纯化 - Google Patents

Abstract

提供了用于纯化抗体的方法。所提供的纯化方法涉及使用羟基磷灰石树脂(HA)以使感兴趣的抗体与一种或多种杂质物质分离。

Description

抗体纯化

本申请要求2018年2月27日提交的美国临时申请号62/635,943的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

领域

本发明涉及用于从杂质(例如抗体降解产物)纯化抗体的方法。本文所公开的纯化方法涉及使用羟基磷灰石树脂。

背景

抗体是用于医学、诊断、工业及其他用途的重要生物分子。虽然许多方法和试剂可用于抗体的重组产生，但由于抗体的(例如)大小和分子复杂性，通常，特别是在大规模/工业规模生产水平下，仍难以有效地产生和纯化感兴趣的重组抗体。

例如，在感兴趣的重组抗体的生产中，有时可能出现与感兴趣的抗体相关的降解产物；该降解产物是不想要的杂质。该降解产物可以具有非常类似于感兴趣的抗体的一些分子性质(例如相同或几乎相同的氨基酸序列或质量)。由于感兴趣的完整抗体与抗体的降解形式之间的分子相似性，可能极难有效地将完整抗体与经降解的抗体分离。

因此，需要用于从杂质纯化抗体的新颖并且改进的方法。

概述

本文提供用于从一种或多种杂质纯化感兴趣的抗体的方法。

在一些实施方案中，本文提供纯化抗体的方法，该方法包括：A)将加载缓冲液中的抗体制剂加载至羟基磷灰石(HA)树脂上，其中：该抗体制剂包含：I)感兴趣的完整抗体和II)感兴趣的抗体的修剪形式，其中感兴趣的抗体的该修剪形式为感兴趣的完整抗体的降解产物，并且其质量与感兴趣的完整抗体的质量相差小于10％；和B)用洗脱缓冲液从HA树脂洗脱感兴趣的完整抗体。

在一些实施方案中，本文提供纯化双特异性抗体的方法，该方法包括：A)将加载缓冲液中的抗体制剂加载至羟基磷灰石(HA)树脂上，其中：该抗体制剂包含：I)感兴趣的完整双特异性抗体；和II)至少一种杂质，其中该杂质选自：a)感兴趣的双特异性抗体的修剪形式，其中感兴趣的双特异性抗体的该修剪形式为感兴趣的完整双特异性抗体的降解产物，并且其质量与感兴趣的完整双特异性抗体的质量相差小于10％；b)第一亲本抗体，其中该第一亲本抗体为具有与完整双特异性抗体的第一臂相同的抗原特异性的单特异性抗体；c)第二亲本抗体，其中该第二亲本抗体为具有与完整双特异性抗体的第二臂相同的抗原特异性的单特异性抗体；和d)高分子质量物质(HMMS)；和B)用洗脱缓冲液从HA树脂洗脱感兴趣的完整双特异性抗体。

在一些实施方案中，本文提供纯化双特异性抗体的方法，该方法包括：A)将加载缓冲液中的抗体制剂加载至羟基磷灰石(HA)树脂上，其中：I)该抗体制剂包含：a)感兴趣的完整双特异性抗体和b)感兴趣的双特异性抗体的修剪形式，其中感兴趣的抗体的该修剪形式为感兴趣的完整双特异性抗体的降解产物，并且其质量与感兴趣的完整双特异性抗体的质量相差小于10％；和II)该抗体制剂中修剪的双特异性抗体的分子与完整双特异性抗体分子的比率在至少1:50与不大于1:5之间；B)用洗脱缓冲液从HA树脂洗脱完整双特异性抗体。在一些实施方案中，该方法进一步包括步骤C)收集从HA树脂洗脱的纯化级分，其中该经纯化的级分包含完整双特异性抗体。

在一些实施方案中，本文提供纯化抗体的方法，该方法包括：A)将加载缓冲液中的抗体制剂加载至羟基磷灰石(HA)树脂上，其中：I)该抗体制剂包含：a)感兴趣的完整抗体和b)感兴趣的抗体的修剪形式，其中感兴趣的抗体的该修剪形式为感兴趣的完整抗体的降解产物，并且其质量与感兴趣的完整抗体的质量相差小于10％；和II)抗体的该修剪形式占该抗体制剂的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％(以质量计)；B)用洗脱缓冲液从HA树脂洗脱完整抗体，和C)收集从HA树脂洗脱的经纯化的级分，其中该经纯化的级分包含完整抗体，并且包含以质量计少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的修剪的抗体，其中该经纯化的级分包含比抗体制剂更低的质量百分比的修剪的抗体。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及用洗脱缓冲液从HA树脂洗脱感兴趣的抗体的方法中，该洗脱缓冲液包含离子。任选地，缓冲液中离子的浓度在洗脱期间增加。任选地，HA树脂周围缓冲液中离子的浓度在洗脱期间增加。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及抗体的方法中，该抗体为异源二聚体双特异性抗体。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及收集从HA树脂洗脱的经纯化的级分的方法中，其中该经纯化的级分包含感兴趣的完整抗体，该经纯化的级分包含以质量计至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的感兴趣的完整抗体。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及包含完整双特异性抗体和修剪的双特异性抗体的经纯化的级分的方法中，该经纯化的级分中修剪的双特异性抗体分子与完整双特异性抗体分子的比率不大于1:400、1:200、1:100或1:50。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及感兴趣的抗体为抗-CD3抗体或为包含抗-CD3臂的双特异性抗体的方法中，该抗体包含以下中的至少一种：i)包含如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的VH区；ii)包含如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链；iii)包含如SEQID NO：1所示氨基酸序列的VH区和包含如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的VL区；或iv)包含如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及双特异性抗体的方法中，该双特异性抗体为：i)包含抗-BCMA臂和抗-CD3臂的抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体，或ii)包含抗-FLT3臂和抗-CD3臂的抗-FLT3/抗-CD3双特异性抗体。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及包含抗-BCMA臂的双特异性抗体的方法中，该抗-BCMA臂包含以下中的至少一种：i)包含如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的VH区；ii)包含如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的重链；iii)包含如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的VH区和包含如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的VL区；或iv)包含如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及包含抗-FLT3臂的双特异性抗体的方法中，该抗-FLT3臂包含以下中的至少一种：i)包含如SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的VH区；ii)包含如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的重链；iii)包含如SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的VH区和包含如SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的VL区；或iv)包含如SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的轻链。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及将抗体制剂加载至HA树脂上的方法中，将抗体制剂加载至HA树脂上，以使树脂上的密度在2、3、4或5g/L至8、9、10、12、15或20g/L之间。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及将抗体制剂加载至HA树脂上的方法中，将至少1、5、10、50、100、500、1000或5000克抗体制剂加载至HA树脂上。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及抗体制剂的方法中，该抗体制剂包含以质量计至少50％、60％、70％或80％并且小于90％、95％、97％、98％或99％的感兴趣的完整抗体。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及修剪的抗体的方法中，该修剪的抗体的质量与完整抗体的质量相差小于0.1％、0.5％、1％或2％。在一些实施方案中，在本文所提供的涉及修剪的抗体的方法中，该修剪的抗体的质量为比完整抗体的质量大大约5至100道尔顿。在一些实施方案中，在本文所提供的涉及修剪的抗体的方法中，该修剪的抗体的质量比完整抗体的质量大大约18道尔顿。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及修剪的抗体的方法中，该修剪的抗体在抗体的多肽链中具有经裂解的肽键，并且其中该经裂解的肽键在抗体的重链中。在一些实施方案中，在本文所提供的涉及修剪的抗体的方法中，该修剪的抗体在抗体的多肽链中具有经裂解的肽键，并且其中该经裂解的肽键在抗体的轻链中。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及修剪的抗体的方法中，该修剪的抗体包含与完整抗体相同数量的氨基酸和相同的氨基酸序列。或者，在一些实施方案中，修剪的抗体包含与完整抗体不同数量的氨基酸。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及包含特异性结合CD3的VH和VL结构域的感兴趣的抗体的方法中，对应的修剪的抗体包含特异性结合CD3的VH结构域中的经裂解的肽键。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及HA树脂的方法中，该HA树脂为陶瓷羟基磷灰石(cHA)树脂。

在一些实施方案中，在本文提供的方法中，在将抗体制剂加载到HA树脂上之后但在从树脂洗脱完整的双特异性抗体之前，用包含磷酸盐离子的洗涤缓冲液洗涤HA树脂。任选地，洗涤缓冲液包含浓度在约5、10、15、20mM与30、40或50mM之间的磷酸盐离子。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及包含离子的洗脱缓冲液的方法中，该离子为磷酸盐。在一些实施方案中，洗脱期间磷酸盐离子的浓度可从约30、40或50mM增加至约60、70、80、100、150或200mM。

在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，加载缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中的至少一种的pH为约pH7.0和8.0或在约pH7.0与8.0之间。

在一些实施方案中，在本文所提供的涉及抗体制剂的方法中，该抗体制剂包含预先加载至以下中的至少一种上并从中洗脱的蛋白质：i)蛋白质A树脂和ii)离子交换树脂。任选地，该抗体制剂包含预先加载至以下两种上并从中洗脱的蛋白质：i)蛋白质A树脂和ii)离子交换树脂。

在一些实施方案中，使用如本文所述的方法制备的抗体经分离和/或纯化以用作药物或用于制备药物。

在一些实施方案中，提供使用如本文所述的方法纯化的抗体。

附图说明

图1描绘制备双特异性抗体的方法的示意图，该双特异性抗体可根据本文所提供的方法进行纯化。

图2描绘示例性i)完整双特异性抗体(左侧图)和ii)双特异性抗体的修剪形式(右侧图)的示意图，其中该修剪的双特异性抗体为可与完整双特异性抗体一起存在于抗体制剂中的杂质。

图3描绘显示通过从HA树脂洗脱从多种不同杂质分离感兴趣的抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体(“POI”)的层析图。

图4描绘显示根据如图3的层析图中所描绘的HA层析运行从HA树脂洗脱的不同级分中的不同种蛋白质(包括感兴趣的抗体和各种杂质)的相对量的图。

图5描绘显示通过从HA树脂洗脱从多种不同杂质分离感兴趣的抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体(“POI”)的层析图。

图6描绘显示根据如图5的层析图中所描绘的HA层析运行从HA树脂洗脱的不同级分中的不同种蛋白质(包括感兴趣的抗体和各种杂质)的相对量的图，其中感兴趣的抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体通过从HA树脂洗脱从多种不同杂质分离。

图7描绘显示根据HA层析运行从HA树脂洗脱的不同级分中的不同种蛋白质(包括感兴趣的抗体和各种杂质)的相对量的图，其中感兴趣的抗-FLT3/抗-CD3双特异性抗体通过从HA树脂洗脱从多种不同杂质分离。

详细描述

本文提供用于从一种或多种杂质纯化感兴趣的抗体的方法。本文所提供的方法涉及使用羟基磷灰石树脂从杂质分离感兴趣的抗体。在一些实施方案中，感兴趣的抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，杂质为与感兴趣的抗体相关的抗体(即，其具有与感兴趣的抗体相似或相同的氨基酸序列)，但相比感兴趣的抗体以一种或多种方式改变，并且其质量不同于感兴趣的抗体。任选地，抗体杂质物质的质量与感兴趣的抗体的质量非常相似。例如，在一些实施方案中，抗体杂质物质的质量与感兴趣的抗体的质量相差小于5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％或0.01％。任选地，本文所提供的方法可用于从一种或多种杂质大规模纯化感兴趣的抗体。

定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号及其他科学术语或术语学意欲具有通常为本发明所属领域的技术人员所理解的含义。在一些情况中，为清晰起见和/或为便于参考而在本文中定义具有通常所理解含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定要被解释为表示与本领域通常所理解的实质性差异。

除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：

“抗体”为能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标(例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、单链(ScFv)和结构域抗体(包括(例如)鲨鱼和骆驼科抗体)、双抗体和包含抗体的融合蛋白和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。术语“抗体”包括单特异性、双特异性和多特异性抗体。抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且该抗体不需要是任何特定类别。取决于其重链的恒定区的抗体氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配至不同类别。有五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的几种可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。

如本文所用，术语“重链”、“轻链”、“可变区”或“可变结构域”、“框架区”、“恒定结构域”和类似术语具有其在免疫学领域中的寻常含义并且是指天然存在的免疫球蛋白中的结构域和重组结合蛋白(例如人源化抗体、双特异性抗体、单链抗体、嵌合抗体等)的对应结构域。天然存在的免疫球蛋白的基本结构单元为具有两条轻链和两条重链的四聚物，通常以约150,000Da的糖蛋白表示。每条链的氨基端(N端)部分包含主要负责抗原识别的约100-110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端(C端)部分限定恒定区。每条轻链包含轻链可变结构域(VL)和轻链恒定结构域(CL)。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区，其具有CH1、饺链、CH2和CH3结构域。IgG分子的可变区包含具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)，其包含与抗原接触的残基和非CDR区段(称为框架区(FR)，其一般维持结构并且确定CDR环的定位(尽管某些框架残基也可接触抗原)。每个VH和VL包含从氨基端至羧基端以以下结构配置的三个CDR和四个FR：n-FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4-c。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)和类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

“双特异性”或“双重特异性”为具有两个不同抗原结合位点的杂合抗体。双特异性抗体的两个抗原结合位点结合两个不同表位，其可位于相同或不同蛋白质靶标上。

“完整”抗体是指重组抗体，其包含重组抗体的所有预期肽键和氨基酸(即，基于编码该抗体的多肽的核酸序列所预期的)。相反地，“修剪的”抗体指与对应的“完整”抗体相比缺失至少一个肽键的对应的“完整”抗体的形式。除非上下文另有明确规定，否则本文提及“感兴趣的抗体”时一般指感兴趣的完整抗体。

本文中提及“约”某一值或参数时包括针对该值或参数本身的实施方案以及针对可比该参数的规定数值低10％或高10％的值或参数的实施方案。例如，提及“约5mg”时包括5mg以及介于4.5mg与5.5mg之间的任何值。

方法

本文所提供的方法可用于从一种或多种杂质纯化感兴趣的抗体。在本文所提供的方法中，将包含感兴趣的抗体和一种或多种杂质分子的抗体制剂(在本文中也称为“起始样品”)加载至羟基磷灰石(HA)树脂上，该羟基磷灰石(HA)树脂结合感兴趣的抗体和任选一种或多种杂质分子。然后洗涤该HA树脂以除去任何松散结合的杂质。(在一些实施方案中，所有杂质分子可流过但不结合该HA树脂。)接下来，使用磷酸盐洗脱缓冲液从HA树脂洗脱感兴趣的抗体，该磷酸盐洗脱缓冲液通常通过磷酸盐离子浓度递增梯度引入至该树脂上。从HA树脂洗脱感兴趣的抗体产生包含感兴趣的抗体和与起始样品中与感兴趣的抗体一起存在的相比更少(或没有)的杂质的纯化样品。在从HA树脂洗脱感兴趣的抗体期间，结合HA树脂的任何杂质分子也可在磷酸盐离子浓度递增梯度期间的某一点洗脱。然而，杂质分子在与感兴趣的抗体的洗脱条件显著不同的条件下从HA树脂洗脱，使得在洗脱过程中可有效地从杂质分子分离感兴趣的抗体。以下提供关于上述方法步骤和相关材料和步骤的其他细节。

羟基磷灰石树脂

各种羟基磷灰石树脂可商业上购得，并且任何可用形式的材料可与本文所提供的方法一起使用。任选地，羟基磷灰石呈结晶形式。任选地，羟基磷灰石经结块以形成颗粒并且在高温下烧结成稳定的多孔陶瓷块。

在一些实施方案中，本文所提供的HA树脂为陶瓷羟基磷灰石(cHA)树脂。“陶瓷羟基磷灰石”/“cHA”是指式Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂的不溶性羟基化磷酸钙，其已在高温下经过烧结形成球形大孔陶瓷形式。除非另有说明，否则如本文所用“陶瓷羟基磷灰石”/“cHA”包括(但不限于)I型和II型陶瓷羟基磷灰石，并且还包括任何适宜的粒度。可与本文所提供的方法一起使用的典型cHA粒度包括(例如)直径在1至100μm或1至1000μm之间的粒度，例如20μm、40μm或80μm。可与本文所提供的方法一起使用的示例性cHA树脂包括CHT^TMI型和II型树脂(Bio-Rad)。本文中针对“HA树脂”或类似的任何提及均包括cHA树脂。

通常，在本文所提供的方法中，HA树脂提供于一个或多个层析柱中。柱性质(例如柱直径、长度和填充密度)可根据各种因素来选择，包括特定纯化项目的需求(即意欲纯化的蛋白质的量)和与待用于柱中的HA树脂相关的因素(例如其孔径、粒度、可压缩性、加载能力和动态结合能力)。此外，本文所提供的方法通常相关地描述层析柱中的HA树脂；然而，不排除树脂的其他适宜的相关构型。此外，本文提及“HA柱”或类似时指填充有HA树脂的层析柱。

在蛋白质加载之前平衡HA柱

在一些实施方案中，在将包含感兴趣的抗体的样品加载至HA柱之前，本文所提供的方法可包括用一种或多种平衡缓冲液预平衡柱的步骤。可将平衡缓冲液引入至柱上例如以确保HA树脂在方法开始时是清洁的(即，确保树脂没有已经结合至树脂的杂质)和/或确保HA树脂周围的溶液与待加载至树脂上的样品相容。

在一些实施方案中，平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液，其包含(例如)磷酸钠，其中该缓冲液中磷酸盐离子的浓度为约100至500mM。此类平衡缓冲液在本文中也可称为“高磷酸盐平衡缓冲液”或类似术语。例如，在一个实施方案中，高磷酸盐平衡缓冲液可包含约250至450mM磷酸盐离子；在其他实施方案中，其可包含约200、250、300、350、400或450mM磷酸盐离子。该平衡缓冲液包含在缓冲液中的相对高浓度的磷酸盐离子，以洗脱已经存在于HA树脂上的任何污染物/杂质(即在将包含感兴趣的蛋白质的样品加载到树脂上之前存在的污染物/杂质；此类杂质可能是存在的，例如，如果HA树脂先前已用于纯化方法中，和在先前使用后未完全清洗树脂)。高磷酸盐平衡缓冲液可具有约6.0至9.0的pH。例如，在一个实施方案中，高磷酸盐平衡缓冲液可具有约7.0至8.0的pH；在其他实施方案中，其可具有约7.0、7.5或8.0的pH。在一个实施方案中，高磷酸盐平衡缓冲液包含约400mM磷酸盐离子，并且具有约7.5的pH。在一些实施方案中，高磷酸盐平衡缓冲液在本文中也可称为“平衡缓冲液1”。

在一些实施方案中，平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液，其包含(例如)磷酸钠，其中该缓冲液中磷酸盐离子的浓度为约1至20mM。此类平衡缓冲液在本文中也可称为“低磷酸盐平衡缓冲液”或类似术语。例如，在一个实施方案中，低磷酸盐平衡缓冲液可包含约1至10mM磷酸盐离子；在其他实施方案中，其可包含约1、2、3、4、5或10mM磷酸盐离子。该平衡缓冲液包含在缓冲液中的相对低浓度的磷酸盐离子，以在HA树脂周围产生有助于感兴趣的蛋白质结合树脂的条件。任选地，低磷酸盐平衡缓冲液可另外包含浓度为约1至50mM的HEPES。例如，在一个实施方案中，低磷酸盐平衡缓冲液可包含约2至30mM HEPES；在其他实施方案中，其可包含约5、10、15、20或25mM HEPES。低磷酸盐平衡缓冲液可具有约6.0至9.0的pH。例如，在一个实施方案中，低磷酸盐平衡缓冲液可具有约7.0至8.0的pH；在其他实施方案中，其可具有约7.0、7.5或8.0的pH。在一个实施方案中，低磷酸盐平衡缓冲液包含约2mM磷酸盐离子、20mM HEPES，并且具有约7.5的pH。在一些实施方案中，低磷酸盐平衡缓冲液在本文中也可称为“平衡缓冲液2”。然而，重要的是，利用本文所提供的方法，可使用低磷酸盐平衡缓冲液来预平衡树脂，而无需在该方法期间预先使用高磷酸盐平衡缓冲液。

用包含感兴趣的抗体的样品加载HA柱

一旦HA柱准备好加载蛋白质，立刻将包含感兴趣的抗体和杂质的样品加载至HA柱上。于其中加载样品至HA柱上的缓冲液在本文中可称为“加载缓冲液”。在一些实施方案中，当最初获得包含感兴趣的抗体的样品以与如本文所提供的方法一起使用时，该样品已经在适宜的加载缓冲液中以用于加载该样品至HA柱上。然而，在其他实施方案中，在将样品加载至HA柱上之前，可处理该样品(例如稀释、浓缩或缓冲液交换)以改变样品的缓冲条件，使得该样品在适合的缓冲液中以用于加载至柱上。例如，利用本文所提供的方法，加载缓冲液不能具有高浓度的磷酸盐离子，其会阻碍感兴趣的抗体结合HA树脂。因此，如果包含感兴趣的抗体的初始样品包含高浓度的磷酸盐离子，则该样品需要进行(例如)稀释或缓冲液交换，直至该样品中磷酸盐离子的浓度降低至允许感兴趣的抗体结合HA树脂的适当低的浓度。

在一些实施方案中，加载缓冲液包含不超过约10mM的磷酸盐离子。例如，在一些实施方案中，加载缓冲液包含少于约10mM、5mM、4mM、3mM、2mM或1mM的磷酸盐离子。在一些实施方案中，加载缓冲液包含0mM磷酸盐离子。任选地，加载缓冲液可包含各种其他盐或缓冲组分(例如Tris、甘氨酸)。加载缓冲液可具有约6.0至9.0的pH。例如，在一个实施方案中，加载缓冲液可具有约7.0至8.0的pH；在其他实施方案中，其可具有约7.0、7.5或8.0的pH。

在一些实施方案中，可将包含感兴趣的抗体的样品加载至HA树脂上，使在树脂上的密度为至少1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、15g/L、20g/L、25g/L或30g/L。在一些实施方案中，可将包含感兴趣的抗体的样品加载至HA树脂上，使在树脂上的密度为至少1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、15g/L、20g/L或25g/L至不大于2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、15g/L、20g/L、25g/L或30g/L，其中第二值大于第一值。

洗涤HA柱

在将包含感兴趣的抗体和杂质的样品加载至HA柱上之后，但在洗脱感兴趣的抗体之前，本文所提供的方法可任选包括用一种或多种洗涤缓冲液洗涤经加载的柱的另一步骤，例如，以除去非特异性固定的杂质或以其他方式制备或平衡柱以用于洗脱步骤。任何洗涤缓冲液的性质可由本领域普通技术人员确定。在一个实施方案中，洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲液，其包含(例如)磷酸钠，并且该缓冲液中磷酸盐离子的浓度为约5至50mM。例如，在一个实施方案中，洗涤缓冲液可包含约10至40mM磷酸盐离子；在其他实施方案中，其可包含约10、20、30、40或50mM磷酸盐离子。任选地，洗涤缓冲液可另外包含浓度为约1至50mM的HEPES。例如，在一个实施方案中，洗涤缓冲液可包含约2至30mM HEPES；在其他实施方案中，其可包含约5、10、15、20或25mM HEPES。洗涤缓冲液可具有约6.0至9.0的pH。例如，在一个实施方案中，洗涤缓冲液可具有约7.0至8.0的pH；在其他实施方案中，其可具有约7.0、7.5或8.0的pH。在一个实施方案中，洗涤缓冲液包含约40mM磷酸盐离子、20mM HEPES，并且具有约7.5的pH。

从HA柱洗脱感兴趣的抗体

本文所提供的方法包括从HA树脂中洗脱结合的感兴趣的抗体的步骤。结合的感兴趣的抗体通过一种或多种洗脱缓冲液来洗脱。通常，洗脱缓冲液包含一种或多种盐或离子，并且在洗脱期间盐或离子的浓度增加。

在一些实施方案中，本文所提供的洗脱缓冲液包含磷酸盐离子。任选地，洗脱缓冲液中磷酸盐离子的浓度在洗脱期间从约20mM的初始浓度增加至约200mM。例如，在一个实施方案中，洗脱缓冲液中磷酸盐离子的浓度在洗脱期间从约40mM的初始浓度增加至约80mM或从约40mM的初始浓度增加至约100mM。增加洗脱缓冲液中磷酸盐离子的浓度的特定方法和速率可确定为适于感兴趣的抗体，并且考虑到也结合HA树脂的杂质分子的类型。例如，洗脱缓冲液中磷酸盐离子的浓度可以以逐渐/浅线性梯度升高。使用浅梯度可允许有效地分离在类似但不同的条件下从HA树脂洗脱的一种或多种分子。或者，在一些实施方案中，洗脱缓冲液中磷酸盐离子的浓度可以以陡梯度升高，或其可逐步地升高。任选地，洗脱缓冲液可另外包含浓度为约1至50mM的HEPES。例如，在一个实施方案中，洗脱缓冲液可包含约2至30mMHEPES；在其他实施方案中，其可包含约5、10、15、20或25mM HEPES。洗脱缓冲液可具有约6.0至9.0的pH。例如，在一个实施方案中，洗脱缓冲液可具有约7.0至8.0的pH；在其他实施方案中，其可具有约7.0、7.5或8.0的pH。在一个实施方案中，洗脱缓冲液包含约40-80mM磷酸盐离子(在梯度上增加)、20mM HEPES，并且具有约7.5的pH。

洗脱条件包括(但不限于)适于与HA树脂一起使用的洗脱缓冲液的性质(例如缓冲液组成、pH、浓度、离子强度和类似性质)；可确定洗脱缓冲液的性质中的任何必要步骤或梯度变化；待使用的洗脱缓冲液的柱体积数；流速和类似的，以最优化从HA柱洗脱感兴趣的抗体、以及从杂质分子分离感兴趣的抗体。

洗脱后，任选单独或分别收集包含感兴趣的抗体的一个或多个峰值级分并任选合并，任选调整pH，任选过滤并且然后任选在按需额外加工之前储存。收集的峰值级分可通过任何适宜方法鉴定，例如使用在A280下的紫外线进行鉴定并且当紫外线信号高于所需量时和/或当处在洗脱条件中的所需点时开始收集。

从HA树脂洗脱并且包含感兴趣的抗体的材料在本文中可任选地称为“经纯化的级分”或类似术语。经纯化的级分可包含来自从HA树脂洗脱的单一级分的材料，或其可以是已经合并在一起的从HA树脂洗脱的多个级分的组合。通常，制备经纯化的级分，以使得在收集大量感兴趣的抗体与少量杂质分子之间进行平衡。必须经常平衡此类竞争目标，例如，因为当感兴趣的抗体从HA树脂洗脱时，和当一种杂质分子物质从HA树脂洗脱时，条件之间可能存在至少部分重叠。

用于本文所提供方法的任何缓冲液(例如平衡缓冲液、加载缓冲液、洗涤缓冲液或洗脱缓冲液)也可包含额外或替代的适宜组分，例如乙酸盐、琥珀酸盐、MES、ACES、MOPSO、PIPES、BES、TAPSO、AMPSO、TRICINE、EPPS、Bicine、DIPSO、HEPPSO、咪唑、Tris、Bis-tris、TAPS、精氨酸、甘氨酸、乙腈、乙醇、甲醇、1％月桂基硫酸钠(SDS)或其他表面活性剂和类似物。

在一些实施方案中，本文所提供的任何缓冲液可具有约6.0至9.0的pH。在其他实施方案中，本文所提供的任何缓冲剂可具有约5.0至9.0、5.5至9.0、6.5至9.0、7.0至9.0、7.5至9.0、7.0至8.0或6.5至8.5的pH。

在本文所提供的描述为包含“磷酸盐离子”的缓冲液中，磷酸盐离子可在缓冲液中由任何适宜磷酸盐(例如磷酸钠或磷酸钾)产生。此外，本文所提供的描述为用“磷酸钠”制备的溶液可用任何适宜磷酸钠盐(例如磷酸二氢钠或磷酸氢二钠)制备。

在已从HA柱洗脱感兴趣的抗体后，任选清洗HA柱以除去杂质和降解柱树脂的其他组分并准备用于后续储存使用。在一个实施方案中，首先使用缓冲液(例如包含浓度为约0.4M的磷酸钠并且pH为约7.5的缓冲液)再生柱；接着使用清洁溶液(例如约1M NaOH和约0.5M磷酸钾)进行任选的消毒步骤，并且然后使用储存溶液(例如约0.1M NaOH)准备用于储存。

抗体

本文所提供的方法可用于从一种或多种杂质纯化感兴趣的抗体。例如，经纯化的抗体可用作药物或用于制备药物。

在一些实施方案中，根据本文所提供方法纯化的抗体为本文所提供抗体的任何类型。例如，根据本文所提供方法纯化的抗体可为全长抗体或抗体片段(例如scFv或Fab)，并且其可以是单特异性的或双特异性的。通常，根据本文所提供方法纯化的感兴趣的抗体为重组抗体。

IgG抗体

在一些实施方案中，根据本文所提供方法所纯化的抗体为免疫球蛋白G(IgG)抗体。如本领域中已知，IgG抗体包含两条重链和两条轻链，并且具有通用的“Y”形状。在标准IgG分子中，该两条重链具有相同氨基酸序列，并且该两条轻链具有相同氨基酸序列。IgG抗体可描述成具有两个“臂”(即“第一臂”和“第二臂”)，其中每个臂包含通过二硫键连接在一起的一条重链和一条轻链。在标准IgG分子中，抗体的第一臂与抗体的第二臂相同(归因于每个臂包含重链和轻链，其分别具有与另一臂中的重链和轻链相同的氨基酸序列)。重链的N端区包含重链可变区(VH)，轻链的N端区包含轻链可变区(VL)。该VH和VL区包含抗体的特异性结合抗原的部分。因此，IgG抗体的每个臂可特异性结合抗原。在标准IgG分子中，IgG抗体的第一臂和第二臂均结合相同抗原(归因于两个臂均包含具有相同的各自氨基酸序列的重链和轻链的事实)。基于具有相同的2个臂，标准IgG抗体可称为“同型二聚”。根据本文所提供方法纯化的IgG抗体可以是亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

双特异性IgG抗体

在一些实施方案中，根据本文所提供方法所纯化的抗体为双特异性IgG抗体。在双特异性IgG抗体中，抗体的两个臂中的每一个臂均特异性结合不同抗原。另外，双特异性IgG抗体的第一臂中的重链的氨基酸序列不同于相同双特异性IgG抗体的第二臂中的重链的氨基酸序列，类似地，双特异性IgG抗体的第一臂中的轻链的氨基酸序列通常不同于相同双特异性IgG抗体的第二臂中的轻链的氨基酸序列。因此，基于具有不同的2个臂，双特异性IgG抗体可称为“异源二聚体”的。双特异性IgG抗体的第一臂可描述为对“第一抗原”具有特异性，和双特异性IgG抗体的第二臂可描述为对“第二抗原”具有特异性。在一些实施方案中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一些实施方案中，双特异性抗体包含免疫学上惰性的Fc区。

双特异性IgG抗体-制备方法

本领域中已知用于制备双特异性抗体的方法(参见，例如，Suresh等人,Methodsin Enzymology 121:210,1986)。传统上，重组产生双特异性抗体基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同特异性(Millstein and Cuello,Nature 305,537-539,1983)。

最近，已开发采取以下一般步骤来制备双特异性异源二聚体抗体的方法：

1)单独表达第一同源二聚体抗体(在本文中也称为“第一亲本抗体”)和第二同源二聚体抗体(在本文中也称为“第二亲本抗体”)并纯化。第一同源二聚体抗体对所制备的双特异性抗体的第一靶抗原具有特异性，和第二同源二聚体抗体对所制备的双特异性抗体的第二靶抗原具有特异性。因此，例如，如果目标是制备对BCMA和CD3具有特异性的双特异性抗体，则单独表达单克隆抗-BCMA抗体(“第一亲本抗体”)和单克隆抗-CD3抗体(“第二亲本抗体”)并纯化。

2)接下来，将经纯化的第一同源二聚体/亲本抗体和经纯化的第二同源二聚体/亲本抗体混合并且在促进抗体臂交换的条件下一起孵育，使得形成包含来自第一亲本抗体的第一臂和来自第二亲本抗体的第二臂的异源二聚体双特异性抗体。此类条件通常涉及一系列还原条件，接着氧化条件。还原条件促进将同源二聚体抗体的两条重链连接在一起的二硫键裂解，并且由此允许第一亲本抗体和第二亲本抗体之间的抗体臂交换。随后的氧化条件则形成新的二硫桥，该二硫桥将新形成的双特异性抗体稳定化。用于产生双特异性抗体的此种一般方法概述于图1中。在图1中，描绘了第一亲本抗体(“亲本抗体A”；灰色)和第二亲本抗体(“亲本抗体B”；黑色)，其各自为单特异性同源二聚体，并且包含第一臂和第二臂。通常，第一亲本抗体和第二亲本抗体对不同抗原具有特异性。然后，将第一亲本抗体和第二亲本抗体混合在一起并且暴露至还原和氧化步骤，其导致形成感兴趣的双特异性抗体，该感兴趣的双特异性抗体包含来自亲本抗体A的第一臂和来自亲本抗体B的第二臂和两个臂的各自的特异性。

任选地，抗体重链的氨基酸序列可以以一种或多种方式修饰以促进双特异性抗体的形成。例如，双特异性抗体的一个臂的重链可在第一饺链区中包含氨基酸修饰，使得该第一饺链区中的经取代/置换的氨基酸具有与所形成的双特异性抗体的另一臂的饺链区中的对应氨基酸相反的电荷。此描述于(例如)国际专利申请号PCT/US2011/036419(WO2011/143545)中。在另一方法中，所需的异源多聚体或异源二聚体蛋白(例如，双特异性抗体)的形成通过改变或改造第一和第二免疫球蛋白样Fc区(例如，饺链区和/或CH3区)之间的界面来增强。在该方法中，双特异性抗体可包含CH3区，其中该CH3区包含第一CH3多肽和第二CH3多肽，其一起相互作用以形成CH3界面，其中该CH3界面内的一个或多个氨基酸使同源二聚体的形成不稳定并且对同源二聚体的形成不是静电不利的。该方法也描述于国际专利申请号PCT/US2011/036419(WO2011/143545)中。

用于制备双特异性抗体的上述方法及其他方法进一步描述于(例如)：国际专利申请号PCT/IB2011/054899(WO2012/059882)、PCT/US2011/036419(WO2011/143545)和Giese等人，Biotechnology Progress,“Bispecific Antibody Process Development：Assemblyand Purification of Knob and Hole Bispecific Antibodies”,17Jan 2018和引述于其中的参考文献，出于所有目的，其各自均以引用的方式并入本文中。本文所提供的用于纯化抗体的方法可用于纯化通过任何适宜方法制备的双特异性抗体。

双特异性IgG抗体-特异性

在一些实施方案中，可根据本文所提供的方法纯化的抗体为全长人双特异性IgG抗体，其中该双特异性抗体的第一臂的第一抗体可变结构域能够结合第一抗原，该双特异性抗体的第二臂的第二抗体可变结构域能够结合第二抗原。该第一抗原和第二抗原可具有如本文所述的抗原的任何特征。在一些实施方案中，该第一抗原出现在第一细胞类型上，该第二抗原出现在第二细胞类型上。

在一些实施方案中，可根据本文所提供的方法纯化的抗体为全长人双特异性IgG抗体，其中该抗体的第一抗体可变结构域能够通过特异性结合位于人免疫效应细胞上的效应抗原募集人免疫效应细胞的活性，并且其中该抗体的第二抗体可变结构域能够特异性结合靶抗原。

可被本文所提供的抗体结合的人免疫效应细胞可以是本领域中已知的多种免疫效应细胞中的任何一种。例如，免疫效应细胞可以是人淋巴细胞谱系的成员，包括(但不限于)T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、B细胞和天然杀伤(NK)细胞。免疫效应细胞也可以是(例如)人骨髓谱系的成员，包括(但不限于)单核细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。此类免疫效应细胞可对靶细胞具有细胞毒性或凋亡作用或在通过效应抗原的结合活化后具有其他所需效应。该效应抗原为表达于人免疫效应细胞上的抗原(例如，蛋白质或多肽)。可被本文所提供的抗体结合的效应抗原的实例包括(但不限于)人CD3(或CD3(分化簇)复合物)、CD16、NKG2D、NKp46、CD2、CD28、CD25、CD64和CD89。

靶抗原表达在患病条件(例如，炎性疾病、增生性疾病(例如，癌症)、免疫疾病、神经疾病、神经退化性疾病、自体免疫疾病、传染病(例如，病毒感染或寄生虫感染)、过敏反应、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病)中的靶细胞上。靶抗原不是效应抗原。靶抗原的实例包括(但不限于)BCMA、EpCAM(上皮细胞黏附分子)、CCR5(5型趋化因子受体)、CD19、HER(人表皮生长因子受体)-2/neu、HER-3、HER-4、EGFR(表皮生长因子受体)、FLT3(Fms样酪氨酸激酶3)、PSMA、CEA、MUC-1(黏蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、CIhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神经节苷脂GD3、9-O-乙酰基-GD3、GM2、GloboH、岩藻糖基GM1、Poly SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CD44v6、Shh(Sonic Hedgehog)、Wue-1、浆细胞抗原、(膜结合的)IgE、MCSP(黑色素瘤硫酸软骨素蛋白多糖)、CCR8、TNF-α前体、STEAP、间皮素、A33抗原、PSCA(前列腺干细胞抗原)、Ly-6；桥体芯蛋白4、E-钙黏素新表位、胎儿乙酰胆碱受体、CD25、CA19-9标记物、CA-125标记物和II型MIS(Muellerian抑制物质)受体、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(纤维母细胞活化抗原)、内皮唾液酸蛋白(endosialin)、EGFRvIII、LG、SAS和CD63。

在一些实施方案中，根据本文所提供的方法纯化的抗体可以是如2016年3月30日提交的美国申请号15/085,644(公开号US20160297885)或2018年5月31日提交的美国申请号15/993,874(公开号US20180346601)中所述的任何抗体，所述申请的全文针对所有目的以引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，根据本文所提供的方法纯化的抗体可以是双特异性IgG抗体，其中抗体的一个臂特异性结合分化簇3(CD3)。关于CD3的信息通过例如UniProtKB ID#P07766提供。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3结合臂的重链的VH区具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3结合臂的重链具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCRVRCPRCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：2)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：1中所示VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3-结合臂的轻链的VL区具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：3)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3-结合臂的轻链具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：4)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQID NO：3中所示VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3-结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的氨基酸序列，CD3-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3-结合臂的重链具有包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的氨基酸序列，CD3-结合臂的轻链具有包含SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合CD3的双特异性IgG抗体中，CD3-结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：1中所示VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，CD3-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQ ID NO：3中所示VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，根据本文所提供的方法纯化的抗体可以是双特异性IgG抗体，其中抗体的一个臂特异性结合B-细胞突变抗原(BCMA)。关于BCMA的信息通过例如UniProtKB ID#Q02223提供。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的重链的VH区具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA结合臂的重链具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGGSGGSLPYADIVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCEVECPECPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：6)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：5中所示VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的轻链的VL区具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQSWPLTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：7)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的轻链具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYQSWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：8)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQID NO：7中所示VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的氨基酸序列，BCMA-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的重链具有包含SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的氨基酸序列，BCMA-结合臂的轻链具有包含SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：5中所示VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，BCMA-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQ ID NO：7中所示VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的重链的VH区具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMSWVRQAPGKGLEWVSAIGgSGGSLPYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：13)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合BCMA的双特异性IgG抗体中，BCMA-结合臂的轻链的VL区具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQ APRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY CQQYQEWPLTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：14)。在一些实施方案中，在本文任何提及抗体包含具有包含SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的氨基酸序列的VH区的情况下，该抗体可替代性地包含含有SEQ ID NO：13中所示氨基酸序列的VH区。在一些实施方案中，在本文任何提及抗体包含具有包含SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的氨基酸序列的VL区的情况下，该抗体可替代性地包含含有SEQ ID NO：14中所示氨基酸序列的VL区。类似地，本文还包括分别含有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的VH和VL序列的抗-BCMA重链和轻链。

在一些实施方案中，根据本文所提供的方法纯化的抗体可以是双特异性IgG抗体，其中该抗体的一个臂特异性结合fms样酪氨酸激酶3(FLT3)。关于FLT3的信息通过例如UniProtKB ID#P36888提供。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体中，FLT3-结合臂的重链的VH区具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：9)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体中，FLT3-结合臂的重链具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCEVECPECPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：10)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体中，FLT3-结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：9中所示VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体中，FLT3-结合臂的轻链的VL区具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO：11)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体中，FLT3-结合臂的轻链具有包含以下氨基酸序列的氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：12)。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体中，FLT3-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQID NO：11中所示VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体中，FLT3-结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列的氨基酸序列，FLT3-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体，FLT3-结合臂的重链具有包含SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的氨基酸序列，FLT3-结合臂的轻链具有包含SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，在其一个臂特异性结合FLT3的双特异性IgG抗体中，FLT3-结合臂的重链的VH区具有包含SEQ ID NO：9中所示VH序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列，FLT3-结合臂的轻链的VL区具有包含SEQ ID NO：11中所示VL序列的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文提供双特异性抗-BCMA/抗-CD3抗体，其中抗体的抗-BCMA臂具有以上针对抗-BCMA臂所述的任何特征，抗体的抗CD3臂具有以上针对抗-CD3臂所述的任何特征。在一些实施方案中，本文提供双特异性抗-FLT3/抗-CD3抗体，其中抗体的抗-FLT3臂具有以上针对抗-FLT3臂所述的任何特征，抗体的抗-CD3臂具有以上针对抗-CD3臂所述的任何特征。

本文还提供纯化对任何上述抗原具有亲和力和/或包含上述任何氨基酸序列的单特异性抗体的方法。例如，本文还提供包含SEQ ID NO：1中所示VH氨基酸序列的单特异性、同源二聚体抗-CD3抗体的纯化。

杂质

本文所提供的方法可用于从一种或多种杂质纯化感兴趣的抗体。

杂质包括(例如)感兴趣的抗体的修剪形式、蛋白质聚集体，以及在感兴趣的双特异性抗体的情况下，与感兴趣的双特异性抗体的形成有关的亲本单特异性抗体。此类不同杂质在本文中也可称为不同“杂质物质”、“杂质分子”或类似术语。

感兴趣的抗体的修剪形式

“感兴趣的抗体的修剪形式”、“修剪的抗体”或类似术语是指其中与对应的感兴趣的完整抗体相比抗体中的一个或多个多肽键已经裂解的重组抗体。相反地，“完整”抗体指重组抗体，其包含重组抗体的所有预期肽键和氨基酸(即，基于编码抗体的多肽的核酸序列所预期的)。

因此，修剪的抗体可被认为是与感兴趣的抗体相关的降解产物。抗体中肽键的裂解可通过例如酶促(例如蛋白酶介导的)或非酶促活性发生。

在一些实施方案中，当裂解抗体多肽中的肽键时，在裂解后，多肽链的裂解部分可能不再与抗体的其余部分共价连接；在该情况中，多肽链的经裂解的部分可与抗体的其余部分解离。这最通常发生在裂解位于α多肽链的N或C端附近的肽键中时，并且其产生与对应的完整抗体相比已失去一个或多个氨基酸的修剪的抗体。由于抗体中一个或多个氨基酸的丢失，此类修剪的抗体具有比对应的完整抗体更少的质量。

或者，在一些其他实施方案中，当抗体多肽中的肽键被裂解时，在裂解后，多肽链的经裂解的部分可能仍然保持与抗体的其余部分共价连接(例如，通过链内-或链间二硫键)。在此情况中，即使抗体的肽键裂解，多肽链的经裂解的部分仍将通过连接多肽链的经裂解的部分与抗体的其余部分的其余完整共价键保持拴系至抗体的其余部分。在此情况中，与完整抗体相比，修剪的抗体仍将具有相同数量的氨基酸和氨基酸序列。另外，在至少一些实施方案中，此种类型的修剪的抗体可具有比对应的完整抗体略大的质量。此种质量增加可能是(例如)在肽键断裂时发生的一种或多种化学反应的结果。在此类反应中，一个或多个原子(例如H、O)可与抗体多肽链的原子反应并且与抗体链共价连接，此导致与对应的完整抗体相比修剪的抗体的质量增加。

由于“修剪的”抗体由对应的“完整”抗体产生，因此抗体的“修剪”形式具有与抗体的对应“完整”形式相同的氨基酸序列(在经过肽键裂解，抗体中没有失去氨基酸的情况中)或几乎相同的氨基酸序列(在经过肽键裂解，抗体中失去一个或多个氨基酸序列的情况中)。

通常，抗体的修剪形式具有与对应的完整抗体的质量相似的质量。如上所述，在一些实施方案中，修剪的抗体可具有小于对应的完整抗体的质量(例如，在修剪导致抗体失去一个或多个氨基酸的情况中)。或者，在一些实施方案中，修剪的抗体可具有大于对应的完整抗体的质量(在修剪不导致抗体失去任何氨基酸，而是导致抗体经由由于肽键裂解而发生的一个或多个反应获得至少一个原子的情况中)。

在一些实施方案中，抗体的修剪形式的质量与对应的完整感兴趣的抗体的质量相差不超过50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％。换言之，在一些实施方案中，感兴趣的抗体的修剪形式的质量与对应的感兴趣的完整抗体的质量相差不超过50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％。

如上所述，在一些实施方案中，感兴趣的抗体的修剪形式具有小于对应的感兴趣的完整抗体的质量。例如，在一些实施方案中，抗体的修剪形式的质量比对应的感兴趣的完整抗体的质量小不超过50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％。换言之，如果抗体的修剪形式的质量比对应的感兴趣的完整抗体的质量小不超过10％，则例如如果感兴趣的完整抗体的质量为100,000Da，则抗体的修剪形式的质量比100,000Da小不超过10,000Da(100,000的10％为10,000)-即其具有在90,000Da与100,000Da之间的质量。

也如上所述，在一些实施方案中，感兴趣的抗体的修剪形式具有大于对应的感兴趣的完整抗体的质量。例如，在一些实施方案中，抗体的修剪形式的质量比对应的感兴趣的完整抗体的质量大不超过5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％。换言之，如果抗体的修剪形式的质量比对应的感兴趣的完整抗体的质量大不超过1％，则例如如果感兴趣的完整抗体的质量为100,000Da，则抗体的修剪形式的质量比100,000Da大不超过1,000Da(100,000的1％为1,000)-即其具有在100,000Da与101,000Da之间的质量。

高分子质量物质(HMMS)/蛋白质聚集体

在一些实施方案中，与本文所提供的方法相关的杂质称为“高分子质量物质”(HMMS)。HMMS指任何高分子质量污染物或杂质，但通常是形成聚集体的至少两种蛋白质的缔合。举例来说，HMMS可包括已聚集在一起的感兴趣的抗体的多个分子和/或来自用于产生感兴趣的抗体的宿主细胞的蛋白质的聚集体。聚集体可通过任何过程(包括(例如)分子的共价或非共价连接)来产生。

亲本抗体

在一些实施方案中，与本文所提供的方法相关的杂质为“亲本抗体”或“亲代抗体”或类似术语。此种类型的杂质分子与本文所提供的方法相关，其中感兴趣的抗体为由两种不同亲本抗体产生的双特异性抗体，例如，如图1中所概述。此类亲本抗体为单特异性、同源二聚体。由于多种可能的机制，亲本抗体可存在于具有感兴趣的双特异性抗体的抗体制剂中，例如：i)在一些情形中，一些亲本抗体分子在还原步骤期间不分离成第一臂和第二臂，以将亲本抗体分离成单独的第一臂和第二臂(并且因此，所述抗体保持为单特异性同源二聚体)；或ii)在一些情形中，来自相同类型的亲本抗体的分离的第一臂和第二臂连接在一起，如此它们形成单特异性同源二聚体(而不是参与形成异源二聚体双特异性抗体)。如本文所用，“亲本抗体”是指通过任何上述机制产生的同源二聚体分子。另外，如本文所提供的抗体制剂可包含来自一种或两种亲本种类的亲本抗体作为杂质。

从杂质纯化感兴趣的抗体

本文提供用于从一种或多种杂质纯化感兴趣的抗体的方法。

在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，感兴趣的抗体在包含感兴趣的抗体以及一种或多种杂质分子物质的抗体制剂(本文中也称为“起始样品”)中。在用于如本文所提供的方法的该起始物质中，感兴趣的抗体可占(例如)抗体制剂中蛋白质的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(以质量计)。然后，在本文所提供的方法的一些实施方案中，收集经纯化的级分(在本文中也称为“经纯化的样品”)作为来自HA树脂的洗脱物。该经纯化的级分包含感兴趣的抗体，在一些实施方案中，仍包含一种或多种杂质分子。在一些实施方案中，在本文所提供的经纯化的级分中，感兴趣的抗体可占(例如)经纯化的级分中蛋白质的至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(以质量计)。

在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，起始样品为以质量计至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的感兴趣的抗体，在相同方法中随后的经纯化的样品为以质量计至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的感兴趣的抗体，其中第二值大于第一值。

在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，起始样品包含以质量计至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％的感兴趣的抗体的修剪形式。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，经纯化的样品包含以质量计不超过约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的感兴趣的抗体的修剪形式。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，起始样品包含以质量计至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％的感兴趣的抗体的修剪形式，在相同方法中随后的经纯化的样品包含以质量计不超过约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的感兴趣的抗体的修剪形式，其中第二值小于第一值。

在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，起始样品包含感兴趣的完整抗体和感兴趣的抗体的修剪形式，其中修剪的抗体与完整抗体的比率为至少约1:100、1:50、1:25、1:20、1:10、1:5、1:4或1:3。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，经纯化的样品包含感兴趣的完整抗体和感兴趣的抗体的修剪形式，其中修剪的抗体与完整抗体的比率不超过约1:100、1:50、1:25、1:20或1:10。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，起始样品包含感兴趣的完整抗体和感兴趣的抗体的修剪形式，其中起始样品中修剪的抗体与完整抗体的比率为至少约1:100、1:50、1:25、1:20、1:10、1:5、1:4或1:3并且其中在相同方法中随后的经纯化的样品中修剪的抗体与完整抗体的比率不超过约1:200、1:100、1:50、1:25、1:20或1:10，其中第二比率小于第一比率。在一些实施方案中，在本文所提供的方法中，起始样品包含感兴趣的完整抗体和感兴趣的抗体的修剪形式，其中起始样品中修剪的抗体与完整抗体的比率约在组A(组A比率：1:100、1:50、1:25、1:20、1:10、1:5或1:4)中的一个比率与组B(组B比率：1:50、1:25、1:20、1:10、1:5、1:4或1:3)中的一个比率之间并且其中在相同方法中随后的经纯化的样品中修剪的抗体与完整抗体的比率不超过约1:200、1:100、1:50、1:25、1:20或1:10，其中在经纯化的样品中的该比率小于在起始样品中的。

在一些实施方案中，根据本文所提供的方法提供的起始样品包含至少1、5、10、15、20、25、50、100、200、500、1000、2000、5000或10,000克感兴趣的完整抗体。在一些实施方案中，根据本文所提供的方法提供的经纯化的样品包含至少1、5、10、15、20、25、50、100、200、500、1000、2000、5000或10,000克感兴趣的完整抗体。在一些实施方案中，根据本文所提供的方法提供的起始样品包含至少5、10、15、20、25、50、100、200、500、1000、2000、5000或10,000克感兴趣的完整抗体。在相同方法中随后的经纯化的样品包含至少1、5、10、15、20、25、50、100、200、500、1000、2000或5000克感兴趣的完整抗体，其中第一值大于第二值。

另外，关于起始样品或经纯化的样品中感兴趣的抗体的a)量或b)纯度的任何以上描述可参考相同样品一起考虑。例如，如上所述，起始样品可包含以质量计至少约80％的感兴趣的抗体；另外，也如以上所述，起始样品可包含至少约10克感兴趣的抗体。因此，本文还提供起始样品，其包含以质量计至少约80％的感兴趣的抗体和至少10克感兴趣的抗体等。

一般技术

除非另有指示，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。此类技术充分阐释于文献中，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook等人,1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A LaboratoryNotebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weirand C.C.Blackwell,eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Millerand M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,eds.,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人,eds.,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway andP.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)；Using antibodies:alaboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood AcademicPublishers,1995)以及以上参考文献的随后的版本和对应的网站(如果适用的话)。

提供以下实施例仅用于举例说明目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。事实上，除了那些本文所示和所述以外，从前述描述本发明的各种改变对于本领域技术人员而言将变得明显并且落在随附权利要求书的范围内。

实施例

实施例1:通过cHA树脂层析纯化抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体

目标：

在此实施例中，检查用于从各种杂质分离感兴趣的全长双特异性人IgG的方法。感兴趣的抗体为异源二聚体双特异性抗-BCMA/抗-CD3抗体(即双特异性抗体的一个臂对BCMA具有特异性，另一臂对CD3具有特异性)。在纯化开始时与感兴趣的双特异性抗体一起存在的杂质包括：i)感兴趣的完整抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体的修剪形式；ii)同源二聚体、单特异性抗-BCMA亲本抗体；iii)同源二聚体、单特异性抗-CD3抗体；和iv)蛋白质聚集体/高分子质量物质(HMMS)。

从双特异性抗体的修剪形式纯化感兴趣的完整双特异性抗体代表特别的挑战，因为双特异性抗体的修剪形式包含与感兴趣的完整双特异性抗体相同数量的氨基酸和相同氨基酸序列，并且与完整双特异性抗体的质量相差仅18道尔顿(Da)。具体而言，完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体的质量为148095.5Da，而双特异性抗体的对应修剪形式的质量为148113.5(通过质谱法测定)。因此，修剪的双特异性抗体的质量与完整双特异性抗体的质量相差小于0.1％(甚至小于0.02％)(即148095Da的0.1％为148Da；148095Da的0.02％为29.6Da)。换言之，修剪的双特异性抗体的质量为感兴趣的完整双特异性抗体的质量的100.01％。因此，修剪的双特异性抗体的质量与感兴趣的完整双特异性抗体的质量非常相似。

双特异性抗体的修剪形式在抗-CD3重链的肽键中含有裂解(在重链的第56位和第57位氨基酸之间)。该抗-CD3重链具有如SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列，并且因此，在SEQID NO：2的“RG”序列中的氨基酸R与G之间发生裂解(“RG”仅在SEQ ID NO：2中出现一次)。据信，与完整双特异性抗体相比，该裂解导致修剪的双特异性抗体中增加1个氧原子和2个氢原子(此将相当于质量增加18Da)。此外，尽管在抗-CD3重链中存在经裂解的肽键，但重链的经裂解的56个氨基酸部分(即链的头56个氨基酸)仍然通过完整的、保留的链内二硫键结合抗体的其余部分。链内二硫键位于抗-CD3重链的C22与C98(即SEQ ID NO：2中所示序列的C22与C98)之间。通过链内肽键将经裂解的56个氨基酸部分连续地拴系至抗体的其余部分示意性地显示于图2中。

在图2中，左边的示意图描绘感兴趣的完整双特异性抗体，其包含双特异性抗体的抗-CD3和抗-BCMA臂的完整重链和轻链(在该图中，较长的链代表抗体的重链，较短的链代表轻链)。另外，图2也显示各种抗体内二硫链，包括链内二硫键(例如，连接相同轻链或重链中的不同氨基酸)、以及链间二硫键(例如连接抗-BCMA臂的重链至抗-CD3臂的重链，或连接抗-CD3臂的轻链至抗-CD3臂的重链)。

在开发从各种杂质纯化感兴趣的完整双特异性抗体的方法中提出的另一个挑战是开发可在纯化相对大量的感兴趣的双特异性抗体时有效地从杂质分离感兴趣的双特异性抗体的方法的目标。例如，与此实施例相关的工作的一个目标是开发用于纯化双特异性抗体的方法，该方法对于纯化至少1克双特异性抗体的方法而言将是有效的。如本领域中已知的，大规模纯化蛋白质通常存在以小规模纯化相同蛋白质期间不存在(或明显不太成问题)的许多困难，此归因于(例如)难以实现在大规模进行层析时在不同蛋白质之间获得明显层析分辨率。

材料和方法：

用于此工作的起始材料为包含感兴趣的双特异性IgG抗-BCMA/CD3抗体以及各种杂质(例如上述那些杂质)的抗体制剂。双特异性抗体的多肽的氨基酸序列显示于以下SEQID NO：BCMA重链：SEQ ID NO：6；BCMA轻链：SEQ ID NO：8；CD3重链：SEQ ID NO：2；CD3轻链：SEQ ID NO：4中。如本文前面所述，感兴趣的双特异性抗体已从两种单独的亲本抗体制备。更具体而言，已通过蛋白质-A层析纯化亲本单特异性抗-CD3和抗-BCMA抗体，并且此类经纯化的亲本单特异性抗-CD3和抗-BCMA抗体已被用于产生感兴趣的双特异性抗-BCMA/CD3抗体。产生的双特异性抗-BCMA/CD3抗体已通过离子交换层析纯化。从包含感兴趣的双特异性抗体和各种残留杂质的离子交换柱中洗脱用作此实施例中纯化工作的起始材料的抗体制剂，并且其具有50mM Tris和60mM甘氨酸，pH7.5的大致浓度的缓冲液/盐。该抗体制剂包含超过85％(以质量计)的感兴趣的完整双特异性抗体；其也包含约8％修剪的双特异性抗体、约1％单特异性抗-BCMA亲本抗体、约1％单特异性抗-CD3亲本抗体和约2％蛋白质聚集体/高分子质量物质(HMMS)。因此，虽然用作该方法中起始材料的抗体制剂包含已经相对纯的感兴趣的完整双特异性抗体，但该方法的目标是开发提高完整双特异性抗体的纯度的方法。

结果：

测试了多种不同层析树脂和条件，以试图鉴定适宜的树脂和缓冲液条件，其允许从修剪的双特异性抗体、单特异性亲本抗体和蛋白质聚集体中有效地纯化感兴趣的完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体。在此过程中，例如，测试多种不同离子交换和疏水性相互作用树脂、以及各种缓冲液和pH条件。经过大量测试后，羟基磷灰石树脂是可允许从各种杂质(包括修剪的双特异性抗体)有效地纯化完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体的唯一确认的树脂。

图3显示从陶瓷羟基磷灰石(“cHA”)树脂柱洗脱感兴趣的双特异性抗体和从多种不同杂质同时分离感兴趣的抗-BCMA/CD3双特异性抗体(包括双特异性抗体的修剪形式、两种亲本抗体和高分子质量蛋白质物质)的层析曲线。对于描绘于图3中的层析运行，加载至cHA树脂上的抗体制剂用额外的亲本抗-BCMA和亲本抗-CD3抗体加标，以便更清楚地鉴定这些分子从cHA柱洗脱的位置(然而，未加入额外的完整或修剪的双特异性抗体)。在图3中，X轴从左到右描绘来自cHA柱的洗脱物的顺序(即，左边的材料早于右边的材料/在比右边的材料更低的盐下从cHA柱洗脱)。通常，从柱中以连续级分形式收集洗脱物；因此，X轴也可被认为描绘来自cHA树脂柱的洗脱物级分的顺序。Y轴描绘UV吸光度(在280nM下)和电导率，如图中单独指出的。UV吸光度对应于洗脱的蛋白质的存在，电导率对应于洗脱材料中的盐浓度。因此，图3描绘随着流过cHA树脂的洗脱缓冲液中的盐浓度增加，来自cHA树脂柱的不同蛋白质的洗脱曲线。遵循图3中的UV图(从左到右)，该图显示各个峰和肩峰，其对应于感兴趣的完整双特异性抗-BCMA/CD3抗体或各种杂质。具体而言，从左到右，第一UV峰对应于第一亲本抗体(“亲本1”；单特异性抗-BCMA同源二聚体)的洗脱。下一个主峰(和图中的最大峰)的早期级分对应于感兴趣的完整双特异性抗体蛋白(“POI”)。该相同主峰的后端/尾端对应于双特异性抗体的修剪形式(“修剪的”)。虽然完整双特异性抗体的洗脱曲线与修剪的双特异性抗体的洗脱曲线之间存在一些重叠，但此两种抗体类型在足够不同的盐条件和级分下从cHA柱洗脱，以便从双特异性抗体的修剪形式显著分离完整双特异性抗体。最后，在双特异性抗体的修剪形式洗脱后，cHA柱的最后一个主峰/肩峰对应于第二亲本抗体(单特异性抗-CD3同源二聚体)以及高分子质量物质(“HMMS”)(也称为蛋白质聚集体)从cHA柱中的洗脱。因此，图3的图显示可通过cHA树脂层析从多种杂质(包括相关的修剪的和亲本抗体物质)有效地纯化完整抗-BCMA/CD3抗体。

根据描绘于图3中的cHA洗脱曲线，图4提供显示关于来自cHA树脂柱的顺序洗脱的级分中存在的不同分子物质的更详细信息的图。具体而言，图4提供关于以下物质的相对量的详细信息：i)感兴趣的完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体蛋白质(“POI”)；ii)双特异性抗体的修剪形式；iii)第一亲本抗体/单特异性抗-BCMA抗体；iv)第二亲本抗体/单特异性抗-CD3抗体；和v)从cHA柱洗脱的不同级分中的高分子质量物质(“HMMS”)。图4的X轴从左到右描绘来自cHA柱的洗脱物的顺序(即从低盐至高盐；每个数据点指示从柱洗脱的级分)。图4的Y轴在左侧描绘以下各自的百分比：i)感兴趣的完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体蛋白质(“POI”)；ii)双特异性抗体的修剪形式；iii)第一亲本抗体/单特异性抗-BCMA抗体；和iv)各级分中的第二亲本抗体/单特异性抗-CD3抗体。图4中的Y轴在右侧描绘每个级分中的％HMMS。

用于生成图3中的数据的方法也与尚未加标任何额外抗体的抗体制剂一起使用；该色谱运行的数据显示于图5中。因此，图5中的数据反映在制备抗-BCMA/CD3双特异性抗体期间通过cHA树脂纯化从离子交换柱洗脱的典型抗体制剂，其主要包含感兴趣的完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体以及各种杂质(包括双特异性抗体的修剪形式)。在图5中，X轴从左到右描绘来自cHA柱的经洗脱的材料的顺序。Y轴描绘UV吸光度(在280nM下)和电导率，如图中单独指出的。亲本1和亲本2峰在图5中比在图3中小，因为对于图5加载于cHA柱上的样品未加标额外的亲本1和亲本2抗体(而对于图3，样品加标额外的亲本1和亲本2抗体)。

图6提供显示关于从cHA树脂回收感兴趣的完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体以及来自cHA树脂的各种经洗脱的级分中修剪的双特异性抗体的相对量的额外信息的图。X轴从左到右描绘来自cHA柱的洗脱物的顺序(即从低盐至高盐；每个数据点指示从柱洗脱的级分)。沿垂直轴/Y轴，绘制每个级分的三个不同变量：变量1)(菱形)：完整双特异性抗体累积回收率(“POI％”)，其是在层析运行中通过该级分从cHA柱中回收的完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体(即感兴趣的蛋白质)的总量(换言之，就好像收集在运行期间从cHA柱洗脱直至并且包括该级分的所有物质并合并在一起，并且然后测定该经合并的物质中完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体的总量)；此外，“POI％”值表示为加载至cHA柱上的已回收的感兴趣的完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体/蛋白质的总量的百分比(即，不是表示为以克计的值)。变量2)(正方形)：各个级分中蛋白质的％，该蛋白质为修剪的双特异性抗体(“修剪的％”)。变量3)(三角形)：修剪的双特异性抗体累积回收率(“累积修剪的”)，其是在层析运行中通过该级分从cHA柱回收的修剪的双特异性抗体的总量。另外，在图6的图中，左侧Y轴列出POI％值，右侧Y轴列出修剪的％值。

图6还包含显示图6中的某些不同级分对应于如图5中所示层析曲线中的不同UV吸光度点的程度的信息。因此，例如，图5显示来自cHA树脂的UV吸光度/蛋白质洗脱的最大峰对应于感兴趣的蛋白质/完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体。来自cHA柱的UV吸光度/蛋白质洗脱的该大峰的顶部也被称为运行的“顶点”；对应于该顶点的层析级分峰标注于图6中。然后，图6中还标注在顶点峰之后的各个点。此类点为“90％”、“80％”、“70％”、“60％”和“50％”并且它们如下计算。将在顶点下的UV吸光度值设为额外计算的起点。然后，确定顶点UV值的90％的UV值。在层析运行期间实现顶点UV值之后(即，朝向峰的尾端)发生的90％顶点UV值标注为“90％”级分；其在本文中也可称为“顶点后90％”级分或类似术语。重复该过程以得到80％、70％、60％和50％值(即，此类值中的每一个均从峰向尾端进一步向下，并且因此代表所收集材料的量越来越大)。如图6所显示，随着顶点值的％减小，级分中的修剪的％增加。此与修剪的双特异性抗体相比完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体在更晚的时间/在更高的盐条件下从cHA柱洗脱的过程一致。因此，如果收集顶点峰值的更大级分(即，至更低的％峰值顶点后级分)，由于完整双特异性抗体和修剪的双特异性抗体的洗脱曲线之间的部分重叠，则还将收集更多的修剪的双特异性抗体。

来自图6的各个值还提供于下表1中。如表1中所显示，根据本文所提供的cHA纯化方法，例如，如果收集来自cHA柱的峰值顶点后90％洗脱物(即通过“峰值顶点后90％”级分的POI％回收率)，则回收加载至cHA柱上的感兴趣的完整双特异性抗体/蛋白质的54％，并且该回收的蛋白质池包含0％修剪的双特异性抗体。在另一个实施例中，如果收集来自cHA柱的峰值顶点后50％洗脱物(即通过“峰值顶点后50％”级分的POI％回收率)，则回收加载至cHA柱上的感兴趣的完整双特异性抗体/蛋白质的74％，并且该回收的蛋白质池包含0.2％修剪的双特异性抗体。因此，如图6和表1中所显示，可通过cHA树脂有效地实现从修剪的双特异性抗体稳健纯化感兴趣的完整双特异性抗体。

表1

对于如图3至6中所所示cHA层析结果，可以如下进行cHA层析。将包含感兴趣的双特异性抗-BCMA/CD3抗体和各种杂质的抗体制剂加载至包含cHA树脂的层析柱上。cHA树脂为1型cHA,40μM珠粒尺寸(Bio-Rad)。对于描绘于图3和4中的层析运行，将cHA树脂加载样品至cHA树脂上的蛋白质密度为30g/L。对于描绘于图5和6中的层析运行，将cHA树脂加载样品至cHA树脂上的蛋白质密度为10g/L。在将样品加载至cHA树脂上之前，用5柱体积的平衡缓冲液1，随后用5柱体积的平衡缓冲液2预平衡该树脂。该方法中所描述的各种缓冲液的组成列于下表2中。将包含经部分纯化的感兴趣的双特异性抗-BCMA/CD3抗体的抗体制剂于pH7.5的包含约50mM Tris和60mM甘氨酸的加载缓冲液中加载至cHA树脂柱上。将抗体制剂加载至cHA树脂柱上后，随后用3柱体积的洗涤缓冲液洗涤该柱。然后，使用20柱体积的洗脱缓冲液从cHA树脂洗脱感兴趣的双特异性抗体(即完整双特异性抗体)，其中在洗脱过程中洗脱缓冲液中的磷酸钠浓度从40mM增加至80mM。如图3至6中所显示，与感兴趣的双特异性抗体一起存在于抗体制剂中的各种杂质也响应洗脱缓冲液而从cHA柱洗脱，但它们在与感兴趣的完整抗-BCMA/CD3双特异性抗体完全不同的盐浓度下洗脱，使得该完整双特异性抗体可有效地从各种杂质(包括完整双特异性抗体的修剪形式)分离。

在根据上述方案通过洗脱缓冲液从cHA树脂柱洗脱感兴趣的蛋白质后，可接着用5柱体积的剥离缓冲液剥离cHA树脂，接着用5柱体积的消毒缓冲液消毒，然后加入5柱体积的存储缓冲液。

对于从cHA柱洗脱的不同材料的每种上述分析物，通过分析型阳离子交换(CEX)分析确定各个级分/池中不同分子物质的类型和量。

表2

实施例2：通过cHA树脂层析纯化抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体-质量加载挑战

目标

此实施例的目标是确定实施例1中所述的双特异性抗体纯化方法是否可有效地与各种cHA树脂柱质量加载挑战一起使用。例如，一个特定目标是确定对于cHA树脂柱上的各种质量加载挑战是否可持续回收超过50％的输入双特异性抗体，同时所回收的经纯化的双特异性抗体产物中作为杂质的修剪的双特异性抗体不超过1％。

材料和方法：

用于此实施例的材料和方法与实施例1中的相同，不同之处在于cHA树脂用抗体制剂样品加载至cHA树脂上8g/L、10g/L或12g/L的蛋白质密度(在不同层析运行中)。

结果：

这些层析运行的结果概述于下表3中。对于所有3次层析运行，收集峰值顶点后90％材料(如实施例1中所述)并分析。如表3中所显示，对于8g/L、10g/L和12g/L质量挑战中的每一个，回收超过50％的经加载的完整双特异性抗体作为经纯化的双特异性抗体，并且所回收的经纯化的双特异性抗体产物包含少于1％的修剪的双特异性抗体作为杂质。

因此，这些实验显示在各种cHA树脂质量加载挑战下，可通过cHA树脂层析始终有效地从修剪的双特异性抗体分离感兴趣的完整双特异性抗体。

表3

质量挑战	POI累积回收率	累积修剪的
			8克/升	56％	0.4
10克/升	58％	0.5
			12克/升	58％	0.8

实施例3：通过cHA树脂层析纯化抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体-不同pH挑战

目标：

此实施例的目标是确定实施例1中所述的双特异性抗体纯化方法是否可在不同pH条件下有效地进行。

材料和方法：

用于此实施例的材料和方法与实施例1中的相同，不同之处在于整个方法中所使用的缓冲液的pH为pH7.0、pH7.5或pH8.0(在不同层析运行中)。对于这些层析运行，将cHA树脂用抗体制剂样品加载至cHA树脂上30g/L的蛋白质密度。

结果：

这些层析运行的结果概述于下表4中。对于所有3次层析运行，收集峰值顶点材料(如实施例1中所述)并分析。如表4中所显示，针对每种不同所测试的pH条件成功地回收感兴趣的完整双特异性抗体蛋白，并且pH7.5产生感兴趣的蛋白的最高回收率。(对于这些层析运行，未单独确定经纯化的材料中修剪的双特异性抗体的量。)

因此，这些实验显示可在不同pH条件下通过cHA树脂层析有效地纯化感兴趣的完整双特异性抗体。

表4

缓冲液pH	POI累积回收率
		7.0	30％
7.5	40％
		8.0	20％

实施例4：通过cHA树脂层析纯化抗-FLT3/抗-CD3双特异性抗体

目标：

此实施例的目标是确定实施例1中所述的双特异性抗体纯化方法是否可利用与实施例1中所使用不同的双特异性抗体有效地进行，其中还需要从各种杂质(包括具有相似质量的相关修剪的双特异性抗体)分离感兴趣的完整双特异性抗体。在此实施例中，感兴趣的抗体为异源二聚体双特异性抗-FLT3/抗-CD3抗体。

材料和方法：

用于此实施例中的异源二聚体双特异性抗-FLT3/抗-CD3抗体包含与实施例1中相同的抗-CD3重链和轻链。双特异性抗体的FLT3臂中的多肽的氨基酸序列显示于以下SEQ IDNO：FLT3重链：SEQ ID NO：10；FLT3轻链：SEQ ID NO：12中。

此实施例中的双特异性抗体的修剪形式在与实施例1中所述的抗-CD3重链相同的位置中具有修剪。

用于此实施例的材料和方法与实施例1中的相同，不同之处在于，如以上所述，抗体制剂样品包含双特异性抗-FLT3/抗-CD3抗体。将cHA树脂用抗体制剂样品加载至cHA树脂上10g/L的蛋白质密度。

结果：

图7显示提供关于从cHA树脂回收感兴趣的完整双特异性抗-FLT3/CD3抗体以及来自cHA树脂的各种经洗脱的级分中修剪的双特异性抗体的相对量的信息的图。X轴从左到右描绘来自cHA柱的洗脱物的顺序(即从低盐至高盐；每个数据点指示从柱洗脱的级分)。沿垂直轴/Y轴，绘制每个级分的三个不同变量：变量1)(菱形)：％POI；变量2)(正方形)：％修剪；和变量3)(三角形)，其各自如实施例1中针对图6所述确定。另外，在图7的图中，左侧Y轴列出％POI值，右侧Y轴列出％修剪的值。图7还包含显示图7中的某些不同级分对应于对应的层析曲线中的不同UV吸光度点(未显示)的程度的信息。标注为“顶点”、“85％”和“60％”的点以如针对图6所述的相同方式确定。

来自图7的多个值也提供于下表5中。如表5中所显示，本文所提供的cHA树脂纯化方法允许(例如)回收超过80％的感兴趣的完整双特异性抗-FLT3/CD3抗体，同时在经纯化的抗体产物中具有少于1％的修剪的双特异性抗体。

因此，如图7和表5中所显示，可通过cHA树脂有效地实现从修剪的双特异性抗体纯化完整双特异性抗-FLT3/CD3。

表5

峰值池	％POI	％累积修剪
			峰值顶点	55	0.2
峰值顶点后85％	72	0.4
			峰值顶点后60％	82	0.7

虽然已参考各种应用、方法、试剂盒和组合物描述所公开的教导内容，但应理解，在不脱离本文教导内容和以下所主张的发明的情况下，可进行各种改变和修改。提供前述实施例以更好地举例说明所公开的教导内容，而无意限制本文所呈现教导内容的范围。虽然已根据这些示例性实施方案描述本发明教导内容，但本领域技术人员将容易理解，这些示例性实施方案的许多变化和修改可能的，而无需过度的实验。所有这些变化和修改均在当前教导内容的范围内。

本文引述的所有参考文献(包括专利、专利申请、论文、教科书和类似物)及其中引述的参考文献在它们尚没有的程度上以全文引用的方式并入本文中。假如所并入的文献和类似材料中的一种或多种与本申请(包括(但不限于)所定义的术语、术语用法、所描述的技术或类似)不同或相矛盾，则以本申请为准。

前述描述和实施例详述本发明的某些特定实施方案并描述发明人设想的最佳模式。然而，应理解，不论前述内容可如何详细地出现在文本中，本发明可以以多种方式实施并且应根据随附权利要求书及其任何等效物来解释本发明。

应理解，在本文中用语句“包含”描述任何实施方案时，也提供以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的其他类似实施方案。

在根据Markush组或其他替代分组描述本发明的方面或实施方案的情况中，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，并且包括该组中的每个独立的成员和主要组的所有可能的子组，而且包括缺少一个或多个组成员的主要组。本发明还设想明确排除所主张发明中的任何组成员中的一个或多个。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有如本领域技术人员通常所理解的相同含义。假如发生冲突，将以本说明书(包括定义)为准。在本说明书和权利要求书中，词语“包括”或变化形式(例如“包含”或“含有”)将被理解为意指包括所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数,复数术语应包括单数。在术语“例如”之后的任何实施例并不意味着穷举或限制。除非上下文清楚地另作指明，否则术语“或”在用于多个选项(例如“A、B或C”)列表的上下文中时应解释为包括所述选项中的任何一个或多个。

本文描述了示例性方法和材料，然而，与那些本文所述的类似或等效的方法和材料也可用于本发明的实践或测试中。所述材料、方法和实施例仅是举例说明性的而无意是限制性的。

序列表

<110> Pfizer Inc.

Iskra, Timothy

Sacramo, Ashley Margaret

<120> 抗体纯化

<130> PC72423A

<150> US 62/635,943

<151> 2018-02-27

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Arg

210 215 220

Val Arg Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 4

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ile Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Gly Gly Ser Gly Gly Ser Leu Pro Tyr Ala Asp Ile Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Glu Val Glu Cys Pro Glu Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

260 265 270

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

305 310 315 320

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

325 330 335

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

340 345 350

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

355 360 365

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

370 375 380

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

405 410 415

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

420 425 430

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 7

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 7

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Trp Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 10

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Ser Pro Ser Asp Val Gly Trp Gly Tyr Gly Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

130 135 140

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn

195 200 205

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg

210 215 220

Lys Cys Glu Val Glu Cys Pro Glu Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 11

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的构建体

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Phe Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims (27)

1.一种纯化抗体的方法，所述方法包括：

A)将加载缓冲液中的抗体制剂加载至羟基磷灰石(HA)树脂上，其中

所述抗体制剂包含：I)感兴趣的完整抗体和II)感兴趣的抗体的修剪形式，其中感兴趣的抗体的所述修剪形式为感兴趣的完整抗体的降解产物，并且其质量与感兴趣的完整抗体的质量相差小于10％；和

B)用包含离子的洗脱缓冲液从HA树脂洗脱感兴趣的完整抗体，其中所述洗脱缓冲液中离子的浓度在洗脱期间增加。

2.一种纯化双特异性抗体的方法，所述方法包括：

A)将加载缓冲液中的抗体制剂加载至羟基磷灰石(HA)树脂上，其中：

所述抗体制剂包含：I)感兴趣的完整双特异性抗体；和II)至少一种杂质物质，其中所述种杂质物质选自：a)感兴趣的双特异性抗体的修剪形式，其中所述感兴趣的双特异性抗体的所述修剪形式为所述感兴趣的完整双特异性抗体的降解产物，并且其质量与感兴趣的完整双特异性抗体的质量相差小于10％；b)第一亲本抗体，其中所述第一亲本抗体为具有与所述完整双特异性抗体的第一臂相同的抗原特异性的单特异性抗体；c)第二亲本抗体，其中所述第二亲本抗体为具有与所述完整双特异性抗体的第二臂相同的抗原特异性的单特异性抗体；和d)高分子质量物质(HMMS)；和

B)用包含离子的洗脱缓冲液从HA树脂洗脱所述感兴趣的完整双特异性抗体，其中所述洗脱缓冲液中离子的浓度在洗脱期间增加。

3.一种纯化双特异性抗体的方法，所述方法包括：

A)将加载缓冲液中的抗体制剂加载至羟基磷灰石(HA)树脂上，其中：

I)所述抗体制剂包含：a)感兴趣的完整双特异性抗体和b)所述感兴趣的双特异性抗体的修剪形式，其中所述感兴趣的抗体的所述修剪形式为所述感兴趣的完整双特异性抗体的降解产物，并且其质量与所述感兴趣的完整双特异性抗体的质量相差小于10％；和

II)所述抗体制剂中所述修剪的双特异性抗体的分子与所述完整双特异性抗体的分子的比率在至少1:50与不大于1:5之间；

B)用包含离子的洗脱缓冲液从所述HA树脂洗脱所述完整双特异性抗体，其中所述洗脱缓冲液中离子的浓度在洗脱期间增加，和任选地，

C)收集从所述HA树脂洗脱的经纯化的级分，其中所述经纯化的级分包含所述完整双特异性抗体。

4.权利要求1的方法，其中所述抗体为异源二聚体双特异性抗体。

5.权利要求1或2的方法，其进一步包括收集从所述HA树脂洗脱的经纯化的级分，其中所述经纯化的级分包含所述感兴趣的完整抗体，并且其中所述经纯化的级分包含以质量计至少95％、96％、97％、98％或99％的感兴趣的完整抗体。

6.权利要求3的方法，其中所述经纯化的级分包含所述完整双特异性抗体和所述修剪的双特异性抗体，此外，其中所述经纯化的级分中修剪的双特异性抗体分子与完整双特异性抗体分子的比率不大于1:100。

7.权利要求l的方法，其中所述感兴趣的抗体为抗-CD3抗体，并且其中所述抗体包含以下中的至少一种：i)包含如SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的VH区；ii)包含如SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的重链；iii)包含如SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的VH区和包含如SEQID NO：3中所示氨基酸序列的VL区；或iv)包含如SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的轻链。

8.权利要求2-6中任一项的方法，其中所述双特异性抗体为：i)包含抗-BCMA臂和抗-CD3臂的抗-BCMA/抗-CD3双特异性抗体，或ii)包含抗-FLT3臂和抗-CD3臂的抗-FLT3/抗-CD3双特异性抗体。

9.权利要求8的方法，其中所述抗-CD3臂包含以下中的至少一种：i)包含如SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的VH区；ii)包含如SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的重链；iii)包含如SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的VH区和包含如SEQ ID NO：3中所示氨基酸序列的VL区；或iv)包含如SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：4中所示氨基酸序列的轻链。

10.权利要求8或9的方法，其中所述抗-BCMA臂包含以下中的至少一种：i)包含如SEQID NO：5中所示氨基酸序列的VH区；ii)包含如SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的重链；iii)包含如SEQ ID NO：5中所示氨基酸序列的VH区和包含如SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的VL区；或iv)包含如SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的重链和如SEQ ID NO：8中所示氨基酸序列的轻链。

11.权利要求8或9的方法，其中所述抗-FLT3臂包含以下中的至少一种：i)包含如SEQID NO：9中所示氨基酸序列的VH区；ii)包含如SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的重链；iii)包含如SEQ ID NO：9中所示氨基酸序列的VH区和包含如SEQ ID NO：11中所示氨基酸序列的VL区；或iv)包含如SEQ ID NO：10中所示氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO：12中所示氨基酸序列的轻链。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中将所述抗体制剂加载至所述HA树脂上，使在所述树脂上的密度为5g/L至20g/L。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中将至少1克抗体制剂加载至所述HA树脂上。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述抗体制剂包含以质量计至少50％但小于95％的感兴趣的完整抗体。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述修剪的抗体的质量与所述完整抗体的质量相差小于1％。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述修剪的抗体的质量比所述完整抗体的质量大大约5至100道尔顿。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述修剪的抗体在所述抗体的多肽链中具有经裂解的肽键，并且其中所述经裂解的肽键在所述抗体的重链中。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述修剪的抗体包含与所述完整抗体相同数量的氨基酸和相同氨基酸序列。

19.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述修剪的抗体包含与所述完整抗体不同数量的氨基酸。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述感兴趣的抗体包含特异性结合CD3的VH和VL结构域，并且其中所述修剪的抗体在特异性结合CD3的VH结构域中包含经裂解的肽键。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述HA树脂为陶瓷羟基磷灰石(cHA)树脂。

22.权利要求1-21中任一项的方法，其中在将所述抗体制剂加载至所述HA树脂上之后但在洗脱所述完整双特异性抗体之前，用包含浓度为10-50mM的磷酸盐离子的洗涤缓冲液洗涤所述树脂。

23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液中的离子为磷酸盐。

24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述磷酸盐离子的浓度在所述洗脱期间从约40mM增加至100mM。

25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述加载缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中的至少一种的pH为约pH7.0和8.0或在约pH7.0与8.0之间。

26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述抗体制剂包含蛋白质，所述蛋白质预先加载至以下中的至少一种上并从中洗脱：i)蛋白质A树脂和ii)离子交换树脂。

27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述抗体经分离和/或纯化以用作药物或用于制备药物。

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