JP2018511300A - 抗糖タンパク質抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年1月16日に出願され、発明の名称が「抗糖タンパク質抗体及びその使用(ANTI−GLYCOPROTEIN ANTIBODIES AND USES THEREOF)」である米国仮特許出願第62/104,407号(代理人整理番号43257.4802)の利益を主張し、上記出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、その開示の一部として、名称が「43257o4813.txt」であり、サイズが136,707バイトであり、2016年1月15日に作成した電子的生物配列表テキストファイルを包含し、この電子的生物配列表テキストファイルは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、一般的に抗糖タンパク質抗体に関する。例示抗体は、微生物系、例えば、Pichia pastorisで産生され得るマンノシル化タンパク質に特異的に結合する。本抗体は、タンパク質の精製またはモニタリング、例えばマンノシル化タンパク質について枯渇させるかもしくは富化するか、またはマンノシル化タンパク質を検出するかもしくはその存在量を決定するために使用可能である。
タンパク質の大規模な経済的精製は、バイオテクノロジー産業において益々重要な関心事である。一般的に、タンパク質は、当該タンパク質に関する遺伝子を含む組換えプラスミドの挿入によって、興味あるタンパク質を産生するように操作した原核生物、例えば、細菌、または真核生物、例えば、哺乳類もしくは真菌の細胞株を細胞培養することによって生成される。使用する細胞株は生きている生物なので、それらは、動物血清の調製物から供給されることもある、糖、アミノ酸、及び成長因子を含む複雑な成長培地で育てなければならない。ヒトの治療用としての使用に十分な純度まで、細胞に供給された化合物の混合物から及び細胞自体が産生した副産物から所望タンパク質を分離することは、厄介な難題をもたらす。
本開示は、特異的にマンノシル化ポリペプチドに結合する、本明細書で実証する新クラスの抗糖タンパク質抗体、ならびにその抗原結合性フラグメント及び変異体、及びそれらをコードするポリヌクレオチド、及びそれらを含むベクターを提供する。本開示の例示抗糖タンパク質抗体としては、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、ならびにそのフラグメント及び変異体が挙げられる。
本開示は、Pichia pastorisから産生された糖タンパク質に特異的に結合するが、哺乳類細胞から産生された同糖タンパク質には結合しない糖タンパク質結合抗体を提供し、該抗体は、マンノシル化タンパク質に特異的に結合することを示している。
抗体Ab1
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する:
QEQLVESGGGLVQPGASLTLTCTASGFSFSNTNYMCWVRQAPGRGLEWVGCMPVGFIASTFYATWAKGRSAISKSSSTAVTLQMTSLTVADTATYFCARESGSGWALNLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号1)。
QEQLVESGGGLVQPGASLTLTCTASGFSFSNTNYMCWVRQAPGRGLEWVGCMPVGFIASTFYATWAKGRSAISKSSSTAVTLQMTSLTVADTATYFCARESGSGWALNLWGQGTLVTVSS(配列番号2)。
GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号10)。
DPVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQASESVESGNWLAWYQQKPGQPPKLLIYYTSTLASGVPSRFKGSGSGAHFTLTISGVQCDDAATYYCQGAFYGVNTFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号21)。
DPVLTQTPSPVSAAVGGTVTISCQASESVESGNWLAWYQQKPGQPPKLLIYYTSTLASGVPSRFKGSGSGAHFTLTISGVQCDDAATYYCQGAFYGVNTFGGGTEVVVK(配列番号22)。
RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号30)。
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する:
QSLEESGGGLVKPEGSLTLTCKASGFSFTGAHYMCWVRQAPGKGLEWIACIYGGSVDITFYASWAKGRFAISKSSSTAVTLQMTSLTAADTATYVCARESGSGWALNLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号41)。
QSLEESGGGLVKPEGSLTLTCKASGFSFTGAHYMCWVRQAPGKGLEWIACIYGGSVDITFYASWAKGRFAISKSSSTAVTLQMTSLTAADTATYVCARESGSGWALNLWGPGTLVTVSS(配列番号42)。
GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号50)。
QVLTQTASPVSAAVGGTVTISCQSSQSVENGNWLAWYQQKPGQPPKLLIYLASTLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGAYSGINVFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号61)。
QVLTQTASPVSAAVGGTVTISCQSSQSVENGNWLAWYQQKPGQPPKLLIYLASTLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGAYSGINVFGGGTEVVVK(配列番号62)。
RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号70)。
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する:
QSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFFFSGAHYMCWVRQAPGQGLEWIGCTYGGSVDITFYASWAKGRFAISKTSSTTVTLQLTSLTAADTATYVCARESGSGWALNLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号81)。
QSLEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFFFSGAHYMCWVRQAPGQGLEWIGCTYGGSVDITFYASWAKGRFAISKTSSTTVTLQLTSLTAADTATYVCARESGSGWALNLWGQGTLVTVSS(配列番号82)。
GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号90)。
QVLTQTPSPVSAAVGGAVTINCQSSQSVENGNWLGWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVPSRFTGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGAYSGINAFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号101)。
QVLTQTPSPVSAAVGGAVTINCQSSQSVENGNWLGWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVPSRFTGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGAYSGINAFGGGTEVVVK(配列番号102)。
RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号110)。
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する:
QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIYPNNPVTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCGRSDSNGHTFNLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号121)。
QSLEESGGDLVKPGASLTLTCTASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIYPNNPVTYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCGRSDSNGHTFNLWGQGTLVTVSS(配列番号122)。
GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号130)。
DPVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQSVNQNDLSWYQQKPGQPPKRLIYYASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDMQCDDAATYYCQGSFRVSGWYWAFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号141)。
DPVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQSSQSVNQNDLSWYQQKPGQPPKRLIYYASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDMQCDDAATYYCQGSFRVSGWYWAFGGGTEVVVK(配列番号142)。
RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号150)。
一実施形態では、本発明は、マンノシル化タンパク質等の糖タンパク質と特異的に結合し、かつ下記配列を含むかまたは下記配列から成る重鎖配列を含む抗体または抗体フラグメントを包含する:
QQQLLESGGGLVQPEGSLALTCTASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWVGCIYSGDDNDITYYASWARGRFTISNPSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCARGHAIYDNYDSVHLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号161)。
QQQLLESGGGLVQPEGSLALTCTASGFSFSSGYDMCWVRQPPGKGLEWVGCIYSGDDNDITYYASWARGRFTISNPSSTTVTLQMTSLTVADTATYFCARGHAIYDNYDSVHLWGQGTLVTVSS(配列番号162)。
GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(配列番号170)。
IVMTQTPSSRSVPVGGTVTINCQASEIVNRNNRLAWFQQKPGQPPKLLMYLASTPASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISDVVCDDAATYYCTAYKSSNTDGIAFGGGTEVVVKRTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号181)。
IVMTQTPSSRSVPVGGTVTINCQASEIVNRNNRLAWFQQKPGQPPKLLMYLASTPASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISDVVCDDAATYYCTAYKSSNTDGIAFGGGTEVVVK(配列番号182)。
RTPVAPTVLLFPPSSDEVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFSRKNC(配列番号190)。
抗体Ab1
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質への結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る:
caggagcagttggtggagtccgggggaggcctggtccagcctggggcatccctgacactcacctgcacagcttctggattctccttcagtaacaccaattacatgtgctgggtccgccaggctccagggaggggcctggagtgggtcggatgcatgcccgttggttttattgccagcactttctacgcgacctgggcgaaaggccgatccgccatctccaagtcctcgtcgaccgcggtgactctgcaaatgaccagtctgacagtcgcggacacggccacctatttctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcgcttaacttgtggggccaagggaccctggtcaccgtctcgagcgggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号11)。
caggagcagttggtggagtccgggggaggcctggtccagcctggggcatccctgacactcacctgcacagcttctggattctccttcagtaacaccaattacatgtgctgggtccgccaggctccagggaggggcctggagtgggtcggatgcatgcccgttggttttattgccagcactttctacgcgacctgggcgaaaggccgatccgccatctccaagtcctcgtcgaccgcggtgactctgcaaatgaccagtctgacagtcgcggacacggccacctatttctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcgcttaacttgtggggccaagggaccctggtcaccgtctcgagc(配列番号12)。
gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号20)。
gaccctgtgctgacccagactccatcccccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccaggccagtgagagtgttgagagtggcaactggttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctattatacatccactctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctggggcacacttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcgctttttatggtgtgaatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号31)。
gaccctgtgctgacccagactccatcccccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccaggccagtgagagtgttgagagtggcaactggttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctattatacatccactctggcatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctggggcacacttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcgctttttatggtgtgaatactttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(配列番号32)。
cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号40)。
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号41の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る:
cagtcgttggaggagtccgggggaggcctggtcaagcctgagggatccctgacactcacctgcaaagcctctggattctccttcactggcgcccactacatgtgctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcgcatgtatttatggtggtagtgttgatataactttctacgcgagctgggcgaaaggccgattcgccatctccaagtcctcgtcgaccgcggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatgtctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcgcttaacttgtggggcccggggaccctagtcaccgtctcgagcgggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号51)。
cagtcgttggaggagtccgggggaggcctggtcaagcctgagggatccctgacactcacctgcaaagcctctggattctccttcactggcgcccactacatgtgctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcgcatgtatttatggtggtagtgttgatataactttctacgcgagctgggcgaaaggccgattcgccatctccaagtcctcgtcgaccgcggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatgtctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcgcttaacttgtggggcccggggaccctagtcaccgtctcgagc(配列番号52)。
gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号60)。
caagtgctgacccagactgcatcgcccgtgtctgccgctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccagtccagtcagagtgttgagaatggcaactggttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggaatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtacagtgtgacgatgctgccacttactactgtcagggcgcttatagtggtattaatgttttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号71)。
caagtgctgacccagactgcatcgcccgtgtctgccgctgtgggaggcacagtcaccatcagttgccagtccagtcagagtgttgagaatggcaactggttagcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggaatctggggtcccatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtacagtgtgacgatgctgccacttactactgtcagggcgcttatagtggtattaatgttttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(配列番号72)。
cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号80)。
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号81の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る:
cagtcgttggaggagtccgggggaggcctggtccagcctgagggatccctgacactcacctgtacagcctctggattcttcttcagtggcgcccactacatgtgctgggtccgccaggctccagggcaggggctggagtggatcggatgcacttatggtggtagtgttgatatcactttctacgcgagctgggcgaaaggccgattcgccatctccaaaacctcgtcgaccacggtgactctgcaactgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatgtctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcacttaacttgtggggccaggggaccctcgtcaccgtctcgagcgggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号91)。
cagtcgttggaggagtccgggggaggcctggtccagcctgagggatccctgacactcacctgtacagcctctggattcttcttcagtggcgcccactacatgtgctgggtccgccaggctccagggcaggggctggagtggatcggatgcacttatggtggtagtgttgatatcactttctacgcgagctgggcgaaaggccgattcgccatctccaaaacctcgtcgaccacggtgactctgcaactgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatgtctgtgcgagagaaagcggtagtggctgggcacttaacttgtggggccaggggaccctcgtcaccgtctcgagc(配列番号92)。
gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号100)。
caggtgctgacccagactccatcccccgtgtctgcagctgtgggaggcgcagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttgagaatggcaactggttaggctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggcatctggggtcccttcgcggttcaccggcagcggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactattgtcaaggcgcttatagtggtattaatgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号111)。
caggtgctgacccagactccatcccccgtgtctgcagctgtgggaggcgcagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttgagaatggcaactggttaggctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatctatctggcatccactctggcatctggggtcccttcgcggttcaccggcagcggatctgggacacagttcactctcaccatcagcggcgtgcagtgtgacgatgctgccacttactattgtcaaggcgcttatagtggtattaatgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(配列番号112)。
cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号120)。
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号121の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る:
cagtcgttggaggagtccgggggagacctggtcaagcctggggcatccctgacactcacctgcacagcctctggattctccttcagtagcggctacgacatgtgttgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcgcctgtatttaccctaataatcctgtcacttactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccaaaacctcgtcgaccacggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatttctgtgggagatctgatagtaatggtcatacctttaacttgtggggccaaggcaccctcgtcaccgtctcgagcgggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号131)。
cagtcgttggaggagtccgggggagacctggtcaagcctggggcatccctgacactcacctgcacagcctctggattctccttcagtagcggctacgacatgtgttgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggatcgcctgtatttaccctaataatcctgtcacttactacgcgagctgggcgaaaggccgattcaccatctccaaaacctcgtcgaccacggtgactctgcaaatgaccagtctgacagccgcggacacggccacctatttctgtgggagatctgatagtaatggtcatacctttaacttgtggggccaaggcaccctcgtcaccgtctcgagc(配列番号132)。
gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号140)。
gaccctgtgatgacccagactccatcctccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttaatcagaacgacttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagcgcctgatctattatgcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacatgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcagttttcgtgttagtggttggtactgggctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号151)。
gaccctgtgatgacccagactccatcctccgtgtctgcagctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccagtccagtcagagtgttaatcagaacgacttatcctggtatcagcagaaaccagggcagcctcccaagcgcctgatctattatgcatccactctggcatctggggtctcatcgcggttcaaaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgacatgcagtgtgacgatgctgccacttactactgtcaaggcagttttcgtgttagtggttggtactgggctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(配列番号152)。
cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号160)。
一実施形態では、本発明はさらに、糖タンパク質に対して結合特異性を有する抗体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号161の重鎖配列をコードする下記ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいは該ポリヌクレオチド配列から成る:
cagcagcagttgctggagtccgggggaggcctggtccagcctgagggatccctggcactcacctgcacagcttctggattctccttcagtagcggctacgacatgtgctgggtccgccagcctccagggaaggggctggagtgggtcggctgcatttatagtggtgatgataatgatattacttattacgcgagctgggcgagaggccgattcaccatctccaacccctcgtcgaccactgtgactctgcaaatgaccagtctgacagtcgcggacacggccacctatttctgtgcgcgaggtcatgctatttatgataattatgatagtgtccacttgtggggccaggggaccctcgtcaccgtctcgagcgggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号171)。
cagcagcagttgctggagtccgggggaggcctggtccagcctgagggatccctggcactcacctgcacagcttctggattctccttcagtagcggctacgacatgtgctgggtccgccagcctccagggaaggggctggagtgggtcggctgcatttatagtggtgatgataatgatattacttattacgcgagctgggcgagaggccgattcaccatctccaacccctcgtcgaccactgtgactctgcaaatgaccagtctgacagtcgcggacacggccacctatttctgtgcgcgaggtcatgctatttatgataattatgatagtgtccacttgtggggccaggggaccctcgtcaccgtctcgagc(配列番号172)。
gggcaacctaaggctccatcagtcttcccactggccccctgctgcggggacacaccctctagcacggtgaccttgggctgcctggtcaaaggctacctcccggagccagtgaccgtgacctggaactcgggcaccctcaccaatggggtacgcaccttcccgtccgtccggcagtcctcaggcctctactcgctgagcagcgtggtgagcgtgacctcaagcagccagcccgtcacctgcaacgtggcccacccagccaccaacaccaaagtggacaagaccgttgcgccctcgacatgcagcaagcccacgtgcccaccccctgaactcctggggggaccgtctgtcttcatcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcacgcacccccgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccaggatgaccccgaggtgcagttcacatggtacataaacaacgagcaggtgcgcaccgcccggccgccgctacgggagcagcagttcaacagcacgatccgcgtggtcagcaccctccccatcgcgcaccaggactggctgaggggcaaggagttcaagtgcaaagtccacaacaaggcactcccggcccccatcgagaaaaccatctccaaagccagagggcagcccctggagccgaaggtctacaccatgggccctccccgggaggagctgagcagcaggtcggtcagcctgacctgcatgatcaacggcttctacccttccgacatctcggtggagtgggagaagaacgggaaggcagaggacaactacaagaccacgccggccgtgctggacagcgacggctcctacttcctctacagcaagctctcagtgcccacgagtgagtggcagcggggcgacgtcttcacctgctccgtgatgcacgaggccttgcacaaccactacacgcagaagtccatctcccgctctccgggtaaa(配列番号180)。
atcgtgatgacccagactccatcttccaggtctgtccctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccaggccagtgaaattgttaatagaaacaaccgcttagcctggtttcaacagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatgtatctggcttccactccggcatctggggtcccatcgcggtttagaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgatgtggtgtgtgacgatgctgccacttattattgtacagcatataagagtagtaatactgatggtattgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaacgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号191)。
atcgtgatgacccagactccatcttccaggtctgtccctgtgggaggcacagtcaccatcaattgccaggccagtgaaattgttaatagaaacaaccgcttagcctggtttcaacagaaaccagggcagcctcccaagctcctgatgtatctggcttccactccggcatctggggtcccatcgcggtttagaggcagtggatctgggacacagttcactctcaccatcagcgatgtggtgtgtgacgatgctgccacttattattgtacagcatataagagtagtaatactgatggtattgctttcggcggagggaccgaggtggtggtcaaa(配列番号192)。
cgtacgccagttgcacctactgtcctcctcttcccaccatctagcgatgaggtggcaactggaacagtcaccatcgtgtgtgtggcgaataaatactttcccgatgtcaccgtcacctgggaggtggatggcaccacccaaacaactggcatcgagaacagtaaaacaccgcagaattctgcagattgtacctacaacctcagcagcactctgacactgaccagcacacagtacaacagccacaaagagtacacctgcaaggtgacccagggcacgacctcagtcgtccagagcttcagtaggaagaactgt(配列番号200)。
ホモポリマーまたはヘテロポリマーポリペプチドを含めた所望タンパク質(例えば、組換えタンパク質)、例えば抗体または抗体フラグメントは、酵母及び糸状真菌細胞内で発現し得る。一実施形態では、所望タンパク質は、酵母内で組換えにより発現し、特に好ましい酵母としては、メチロトローフ酵母株、例えば、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha(Pichia angusta)、Pichia guillermordii、Pichia methanolica、Pichia inositovera等が挙げられる(例えば、参照によってそれぞれの全体を援用する米国特許第4,812,405号、第4,818,700号、第4,929,555号、第5,736,383号、第5,955,349号、第5,888,768号、及び第6,258,559号を参照されたい)。他の酵母例としては、Arxiozyma;Ascobotryozyma;Citeromyces;Debaryomyces;Dekkera;Eremothecium;Issatchenkia;Kazachstania;Kluyveromyces;Kodamaea;Lodderomyces;Pachysolen;Pichia;Saccharomyces;Saturnispora;Tetrapisispora;Torulaspora;Williopsis;Zygosaccharomyces;Yarrowia;Rhodosporidium;Candida;Hansenula;Filobasium;Sporidiobolus;Bullera;Leucosporidium及びFilobasidellaが挙げられる。
モノクロナール抗体は卓越した治療薬になったが、それらの精製プロセスは、ヒトに用いるのに適した産物を確実かつ予想通りに生成する必要がある。典型的には、所望抗体産物の許容収率を維持しながら、不純物、例えば宿主細胞タンパク質、DNA、外来性及び内在性ウイルス、内毒素、凝集体及び他の種、例えば糖変異体を制御する。さらに、精製プロセス中に導入された不純物(例えば、浸出タンパク質A、樹脂及びフィルターからの抽出可能物、プロセス緩衝液及び薬剤、例えば界面活性剤)も除去した後に抗体を治療薬として使用することができる。
細胞培養からの抗体の回収の第1ステップは採取である。細胞及び細胞デブリを除去し、クロマトグラフィーに適した浄化濾過液、すなわち、採取細胞培養液(harvested cell culture fluid)(HCCF)を得る。一次回収の例示方法としては、遠心分離、深層濾過及び無菌濾過、凝集法、沈殿法ならびに/または規模及び施設容量に応じて適用可能な手法がある。
一実施形態では、細胞及び凝集デブリをブロスから遠心分離により除去する。遠心分離は、パイロット及び商業規模製造に使用可能である。好ましくは、大規模製造で遠心分離を用いて、>3%の固体パーセントで細胞培養から採取細胞培養液を与える(すなわち、サブミクロンデブリのレベル上昇)。
細胞採取に接線流微量濾過を利用することもできる。特に、細胞培養液は微細孔膜に接線方向に流れ、圧力駆動濾液流は、より大きい不溶デブリから可溶産物を分離する。膜ファウリングは、慣性揚力及び膜表面を横切る乱流により生じるせん断誘導拡散によって制限される。
一実施形態では、沈殿/凝集に基づく前処理ステップを用いて、細胞培養液中の細胞デブリ及びコロイドの量を減らし、既存の濾過列機器能力を超えることができる。凝集法は、ポリマー吸着、例えば、カチオン性、中性及びアニオン性ポリマーによる細胞及び細胞デブリへの静電引力を伴って細胞汚染物を排除し、浄化効率の改善及び高回収率をもたらす。凝集試薬、例えば、塩化カルシウム及びリン酸カリウムは、超低レベル、例えば、20〜60mMの塩化カルシウムと、リン酸カルシウムを形成するために添加される等モル量のリン酸で、リン酸カルシウムと細胞、細胞デブリ及び不純物の共沈殿に寄与すると考えられる。
バイオ医薬品業界では、クロマトグラフィーは、その高い分解能のため、重大な意味を持ち、広く用いられる分離及び精製技術である。クロマトグラフィーは、生体分子間の物理的及び化学的差異を分離に活用する。例えば、タンパク質Aクロマトグラフィーを採取後に行って、小割合のプロセス関連不純物及び産物関連不純物のみの除去を必要とする比較的純粋な産物を得ることができる。次に1または2つのさらなるクロマトグラフィーステップ、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及び/またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを組み入れて仕上げステップとして利用することができる。これらのステップは、追加のウイルス、宿主細胞タンパク質及びDNAクリアランスを可能にし、ならびに、凝集体、望まれない産物変異種及び他の少量の汚染物を除去することができる。最後に、精製産物を濃縮及び透析濾過して最終処方緩衝液とすることができる。
硫酸アンモニウム沈殿法
硫酸アンモニウム沈殿法は、血清、腹水液または細胞培養上清から抗体を富化及び濃縮するために頻繁に使用される。リオトロピック塩の濃度が試料中で増加するにつれて、タンパク質及び他の巨大分子はそれらが沈殿するまで漸進的に溶解しにくくなる。すなわち、リオトロピック効果は「塩析」と呼ばれる。抗体は、多くの他のタンパク質及び血清成分より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する。
イオン交換クロマトグラフィー(IEC)は、所与の緩衝系(pH)におけるタンパク質の正味の電荷に基づいてタンパク質と結合する正または負に荷電した樹脂を用いる。高度の特異性で標的抗体と結合して放出するIEC条件を決定することができ、これはモノクロナール抗体の生産を伴う商業的運用において特に重要であり得る。反対に、抗体以外の全ての他の試料成分とほとんど結合する条件を見つけることができる。一旦最適化すれば、IECは、対費用効果が高く、穏やかで信頼できる抗体精製方法である。
固定化金属キレートクロマトグラフィー(IMAC)は、キレート固定化二価金属イオン(例えば、ニッケルNi2+)を用いて、3つ以上の連続ヒスチジン残基のクラスターを含有するタンパク質またはペプチドに結合させる。この方略は、末端6xHis融合タグを含有するように操作された組換えタンパク質の精製に特に有用であり得る。哺乳類IgGは、固定化ニッケルによって結合され得るヒスチジンクラスターを有する、血清(またはモノクロナール細胞培養上清)中の数少ない豊富タンパク質の1つである。IECのように、結合及び溶出のためのIMAC条件を特定試料について最適化して、穏やかで信頼できる抗体精製を提供することができる。例えば、標識手順後にIMACを用いて、AP標識またはHRP標識(酵素複合)抗体を過剰の非複合酵素から分離することができる。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)は、タンパク質をそれらの疎水性に基づいて分離し、電荷、サイズまたはアフィニティーに基づいてタンパク質を分離する他の技術を補完する。例えば、高塩緩衝液中のHICカラム上に試料を負荷すると、高塩緩衝液が溶液中におけるタンパク質分子の溶媒和を低減させ、それによって試料タンパク質分子の疎水性領域を露出させ、これが結果的にHIC樹脂に結合する。一般的に、分子の疎水性が高いほど、結合を促進するために必要な塩が少ない。そこで、塩濃度を下げるグラジエントを用いて、HICカラムから試料を溶出させ得る。特に、イオン強度が下がるにつれて、分子の親水性領域の露出が増え、疎水性が増大する順にカラムから分子が溶出する。
疎水性電荷誘導クロマトグラフィー(HCIC)は、低pHでイオン化するリガンドのpH依存性挙動に基づいている。この技術は、高濃度のリオトロピック塩を必要とせずに疎水性相互作用によって吸着が起こるように、高密度でヘテロ環リガンドを利用する。HCICにおける脱着は、pHを下げてイオン性リガンドと結合タンパク質との間に電荷反発を引き起こすことによって促進される。代表的な市販HCIC樹脂は、MEP−Hypercel(Pall Corporation)であり、官能基として4−メルカプトエチルピリジンを有するセルロースに基づく媒体である。このリガンドは、低pHで正電荷を得るNヘテロ環を有する疎水性部分である。
硫黄親和性吸着は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)の特性と、チオエーテルに近接したスルホン基へのタンパク質の結合を伴う硫酸アンモニウム沈殿法の特性(すなわち、リオトロピック効果)を併せ持つ高度選択的タイプのタンパク質−リガンド相互作用である。厳密なHICとは対照的に、硫黄親和性吸着は、高濃度のリオトロピック塩(例えば、塩化ナトリウムに対立するものとして硫酸カリウム)に依存する。例えば、結合は、硫酸カリウムと平衡化させた典型的抗体試料にかなり特異的である。非結合成分を洗い流した後、抗体は、穏やかな溶出条件(例えば、50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7〜8)で容易に回収される。硫黄親和性吸着剤(T−Gelとも呼ばれる)は、スルホン−チオエーテルリガンドを含むように修飾された6%のビーズ状(beaded)アガロースであり、種々の動物種由来の免疫グロブリンに対して高い結合能及び広い特異性を有する。
アフィニティークロマトグラフィー(アフィニティー精製とも呼ばれる)は、分子間の特異的結合の相互作用を利用する。一般的に、特定リガンドは、固体担体に化学的に固定化または「共役」している。その結果、複合混合物がカラムを通過するとき、リガンドに特異的な結合親和性を有する分子が結合するようになる。他の試料成分を洗い流した後、結合分子を担体から取り除くと、最初の試料からのその精製ということになる。
アフィニティー精製は、静止物質(固定相)に固定化しているリガンドとの結合相互作用の差異に基づいた溶液(移動相)中分子の分離を伴う。アフィニティー精製における担体またはマトリックスは、生体分子特異的リガンドが共有結合するいずれの物質でもある。典型的に、アフィニティーマトリックスとして使用すべき物質は、標的分子が見られる系に不溶性である。通常は、常にではないが、不溶性マトリックスは固体である。
1.粗試料をアフィニティー担体と共にインキュベートして、試料中の標的分子が固定化リガンドに結合できるようにする;
2.担体から非結合試料成分を洗い流す;及び
3.結合相互作用がもはや起こらないように緩衝液条件を変えることによって、固定化リガンドから標的分子を溶出させる(解離させて回収する)。
タンパク質:リガンド相互作用を伴う多くのアフィニティー精製手順は、特に抗体:抗原または天然タンパク質:タンパク質相互作用がアフィニティー精製の基礎であるときは、生理的pH及びイオン強度の結合緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水(PBS)を使用する。結合相互作用が起こったらすぐに、担体を追加緩衝液で洗浄して試料の非結合成分を除去する。低レベルの界面活性剤の添加によるかまたは結合緩衝液及び/もしくは洗浄緩衝液の塩濃度に対する適度な調整によって、非特異的(例えば、単純なイオン)結合相互作用を最小限にすることができる。最後に、溶出緩衝液(例えば、0.1Mのグリシン・HCl、pH2.5〜3.0)を添加して結合相互作用を破壊し(タンパク質構造に永久に影響を与えることなく)、目標分子を遊離させ、次に目標分子をその精製形態で収集する。溶出緩衝液は、結合相手を極端なpH(低いかまたは高い)、高塩(イオン強度)、分子の一方または両方を変性させる界面活性剤もしくはカオトロピック剤の使用、カウンターリガンドとの結合要因の排除または競合によって結合相手を解離させ得る。場合によっては、溶出緩衝液から貯蔵もしくは下流処理にさらに適した緩衝液に精製タンパク質を交換するために引き続き透析または脱塩が必要なことがある。
バイオ医薬製品ならびにそれらの関連中間体及び賦形剤中の不純物のプロファイリングは規制上求められているものである。例えば、US Food and Drug Administration,Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products:Recommended Approachesを参照されたい。このガイダンスは、どのようにこれらの不純物の安全性及び曝露閾値を評価するかについての推奨を行う。The European Medicines Agency’s(EMEA committee for Medicinal Products for Human Use(CHMP)もGuideline on the Limits of Genotoxic Impuritiesを公表した。これは、欧州当局により新製剤に適用され、場合によっては医薬品開発における原薬にも適用されている。これらの指針は、さらに一般的なアプローチで不純物に取り組む、産業のための調和国際会議(International Conference on Harmonization)(ICH)ガイダンス:Q3A(R2)Impurities in New Drug Substances,Q3B(R2)Impurities in New Drug Products,and Q3C(R3)Impurities:Residual Solventsを増強する。
下記実施例は、対象発明をどのように作り、使用するかの完全な開示及び記述を当業者に提供するために示すものであり、発明とみなされるものの範囲を限定する意図ではない。使用した数(例えば、量、温度、濃度等)に関する正確さを確保する努力を行ったが、いくらかの実験誤差及び偏差を許容すべきである。特に指定のない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
Ab−Aは、P.pastoris(さらに下記実施例で述べる)で発現されたヒト化IgG1抗体である。利用した培養条件及び精製ステップによって左右されるAb−Aのいくつかの調製物は、異なる検出可能レベルのマンノシル化Ab−Aを含むことが観察された。さらに後述するように、これらのマンノシル化抗体は、レクチンに基づく結合アッセイを用いて、または本明細書で開示する抗糖タンパク質抗体を用いて検出可能だった。
マンノシル化タンパク質に結合する抗体を同定及び特徴づけるために、抗体含有溶液をELISAで試験する。簡潔に述べると、ELISA緩衝液(PBS中0.5%の魚皮膚ゼラチン、pH7.4)で希釈したビオチン化マンノシル化抗体(ウェル毎に50μL、1μg/mL)でニュートラアビジン被覆プレート(Thermo Scientific)を室温で約1時間または代わりに4℃で一晩被覆する。次にプレートをELISA緩衝液で1時間室温でさらに遮断し、洗浄緩衝液(PBS、0.05%のツイーン20)を用いて洗浄する。試験した血清試料をELISA緩衝液を用いて段階希釈する。希釈血清試料の50マイクロリットルをウェル上に移し、1時間室温でインキュベートする。このインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で洗浄する。成長のため、ヤギ抗ウサギFc特異性HRP結合型ポリクローナル抗体(ELISA緩衝液に1:5000希釈)をウェル上に添加し、45分間RTでインキュベートする。洗浄溶液による3回の洗浄ステップ後、TMB基質を用いて2分間室温でプレートを成長させ、0.5MのHClを用いて反応をクエンチする。ウェル吸光度を450nmで読み取る。
許容可能な力価が達成されたら、ウサギ(複数可)を屠殺する。脾臓、リンパ節、及び全血を採取して以下のように処理する。
B細胞培養設置の日に、PBMC、脾細胞、またはリンパ節バイアルを解凍させて用いる。バイアルをLN2タンクから取り出して37℃の水浴内に解凍するまで置く。バイアルの中身を15mlのコニカル遠心管(Corning)に移し、10mlの上記変性RPMIを管にゆっくり加える。細胞を5分間2000RPMで遠心分離にかけ、上清を捨てる。細胞を10mlの新鮮培地に再懸濁する。細胞密度及び生存率をトリパンブルーにより決定する。
マンノシル化タンパク質に特異性の抗体を産生するウェルを同定するため、2ステップ手順を用いた。第1ステップでは、抗原認識(ELISA)による血清試料の力価決定についての記載と同じプロトコルを以下の点を変えて利用する。簡潔に述べると、ニュートラアビジン被覆プレートをビオチン化マンノシル化タンパク質(ウェル毎に50μL、それぞれ1μg/mL)で被覆する。B細胞上清試料(50μL)を前希釈せずに試験する。第2ステップでは、第1ステップで用いたのと同一の配列であるが、マンノースを含まない配列のビオチン化タンパク質を用いてニュートラアビジンプレートを被覆する。マンノシル化のないタンパク質は、哺乳類細胞(例えば、CHO細胞、ヒト腎細胞、その他)を用いるかまたは細菌発現系を用いて生成可能である。第2アッセイにおける反応性は、抗体特異性がマンノース構造よりはむしろタンパク質に対することを示すことになるので、該抗体を捨てることとなる。
興味あるウェルを含有するプレートを−70℃から取り出し、ウェル当たり200マイクロリットルの培地(10%の完全RPMI、55μMのBME)で5回洗浄することにより各ウェルから細胞を回収する。回収した細胞を遠心分離によりペレット化し、上清を慎重に除去する。ペレット化細胞を100μLの培地に再懸濁する。抗体を発現する細胞を同定するため、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ(M280 Dynabeads,Invitrogen)をN末端及びC末端の両ビオチン化マンノシル化タンパク質の組合せで被覆する。個々のビオチン化マンノシル化タンパク質ロットを段階希釈により最適化する。次に約4x10E7被覆ビーズを含有する100マイクロリットルを再懸濁細胞と混合する。この混合物に、培地に1:100希釈した15マイクロリットルのヤギ抗ウサギH&L IgG−FITC(Jackson Immunoresearch)を加える。
単離された単一のB細胞から複合RT−PCRに基づく方法を用いて抗体配列を回収する。制限酵素を含有するプライマーをデザインして、標的免疫グロブリン遺伝子の保存領域及び定常領域(重鎖及び軽鎖)、例えばウサギ免疫グロブリン配列にアニールし、2ステップネステッドPCR回収を利用して抗体配列を増幅する。各ウェルからのアンプリコンを回収及びサイズの完全性について解析する。結果として生じるフラグメントを次にAluIで消化して配列クローン性を鑑別する。同一配列は、それらの電気泳動解析で共通のフラグメンテーションパターンを示した。次にPCRプライマー内に含まれる制限酵素部位を用いて元の重鎖及び軽鎖アンプリコンフラグメントを消化し、発現ベクターにクローン化する。サブクローン化DNAフラグメントを含有するベクターを増幅させて精製する。サブクローン化重鎖及び軽鎖の配列を発現前に検証する。
特異性B細胞から回収した抗体の抗原特異性及び機能特性を決定するため、所望の対を成す重鎖及び軽鎖配列の発現を駆り立てるベクターをCHO細胞、ヒト腎細胞または他の哺乳類細胞に移す。
組換え発現抗体のマンノシル化ポリペプチドに結合する能力を特徴づけるため、抗体含有溶液をELISAにより試験する。全てのインキュベーションは室温で行う。簡潔に述べると、ニュートラアビジンプレート(Thermo Scientific)をマンノシル化ポリペプチド含有溶液(PBS中1μg/mL)で2時間被覆する。次にマンノシル化ビオチン化ポリペプチド被覆プレートを洗浄緩衝液(PBS、0.05%のTween−20)で3回洗浄する。次に遮断溶液(PBS、0.5%の魚皮膚ゼラチン、0.05%のTween−20)を用いて約1時間プレートを遮断する。次に遮断溶液を除去してから、試験する抗体の希釈系列と共にプレートを約1時間インキュベートする。このインキュベーションの最後に、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、さらに二次抗体含有溶液(ペルオキシダーゼ結合型アフィニピュアFcフラグメント特異性ヤギ抗ウサギIgG(Jackson Immunoresearch)と共に約45分間インキュベートし、3回洗浄する。当該時点で基質溶液(TMBペルオキシダーゼ基質、BioFx)と3〜5分間暗所でインキュベートする。HCl含有溶液(0.5M)を添加して反応を停止させ、プレートリーダーで450nmにてプレートを読み取る。
5つのウサギ抗糖タンパク質抗体の可変重鎖及び軽鎖を単離ウサギB細胞から増幅させ、それぞれウサギIgG定常ドメインとインフレームでクローン化した。5つの抗糖タンパク質抗体を本明細書ではAb1、Ab2、Ab3、Ab4、及びAb5と称し;それらの重鎖及び軽鎖のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列を図1〜4に提供し、これらの配列ならびに可変領域、フレームワーク領域(FR)、相補性決定領域(CDR)、及び定常ドメインの配列番号を図5〜12に提供してある。全長Ab1ポリペプチドは、配列番号1の重鎖ポリペプチド及び配列番号21の軽鎖ポリペプチドで構成される。全長Ab2ポリペプチドは、配列番号41の重鎖ポリペプチド及び配列番号61の軽鎖ポリペプチドで構成される。全長Ab3ポリペプチドは、配列番号81の重鎖ポリペプチド及び配列番号101の軽鎖ポリペプチドで構成される。全長Ab4ポリペプチドは、配列番号121の重鎖ポリペプチド及び配列番号141の軽鎖ポリペプチドで構成される。全長Ab5ポリペプチドは、配列番号161の重鎖ポリペプチド及び配列番号181の軽鎖ポリペプチドで構成される。
抗体Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、及びAb5を、培養哺乳類細胞(例えば、CHO細胞、ヒト腎細胞株等)で発現させる。さらに、基本的に以下のようにこれらの抗体をPichia pastorisで発現させる。適切なプロモーターの制御下でそれぞれの抗体の重鎖及び軽鎖をコードする組込み遺伝子を含有し、場合により各遺伝子の複数コピーを含有するP.pastoris株を調製する(参照によってその全体をここに援用する米国特許出願公開第2013/0045888号参照)。組込みの正しさはサザンブロット法により検証し、抗体の発現及び分泌はウエスタンブロット法により検証する。抗体産生のため、下記栄養素(%w/v)を含有する培地を用いて種菌を増やす:酵母エキス3%、無水ブドウ糖4%、YNB 1.34%、ビオチン0.004%及び100mMのリン酸カリウム。発酵用種菌を作り出すため、30℃及び300rpmで振盪するインキュベーター内で約24時間細胞を増やす。次に1Lの無菌成長培地を含有するLabforsの2.5Lの作業容積容器に10%の種菌を加える。成長培地は下記栄養素を含有する:硫酸カリウム18.2g/L、第一リン酸アンモニウム36.4g/L、リン酸二カリウム12.8g/L、硫酸マグネシウム七水和物3.72g/L、クエン酸ナトリウム二水和物10g/L、グリセロール40g/L、酵母エキス30g/L、PTM1微量金属4.35mL/L、及び消泡剤204 1.67mL/L。PTM1微量金属溶液は下記成分を含有する:硫酸銅六水和物6g/L、ヨウ化ナトリウム0.08g/L、硫酸マグネシウム水和物3g/L、モリブデン酸ナトリウム二水和物0.2g/L、ホウ酸0.02g/L、塩化コバルト0.5g/L、塩化亜鉛20g/L、硫酸第一鉄七水和物65g/L、ビオチン0.2g/L、及び硫酸5mL/L。
この実施例は、ELISAアッセイにおける糖タンパク質(特に、マンノース含有抗体)の検出のための抗体Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、及びAb5の使用について述べる。結果は、マンノシル化抗体の高感度検出を実証し、Ab1は最高の感度を示し、ユーロピウムに基づく検出は、HRPに基づく検出より大きいシグナル伝達を示す。
抗原ダウンHRP ELISA
簡潔に述べると、ストレプトアビジンプレート(Thermo Scientific)をビオチン化抗原溶液(多様なマンノシル化の対照抗体、PBS中1ug/mL)で1時間被覆した。次に抗原被覆プレートを洗浄緩衝液(PBS、0.05%のTween−20)で3回洗浄した。次に遮断溶液(PBS、0.5%の魚皮膚ゼラチン、0.05%のTween−20)を用いてプレートを約1時間遮断した。次に遮断溶液を除去してから、試験する抗体の希釈系列と共に約1時間インキュベートした。このインキュベーションの最後に、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、さらに二次抗体含有溶液(ペルオキシダーゼ結合型アフィニピュア抗ウサギIgG、Fcフラグメント特異性(Jackson Immunoresearch)と共に約45分間インキュベートし、3回洗浄した。当該時点で基質溶液(TMBペルオキシダーゼ基質、BioFx)を加え、3〜5分間暗所でインキュベートした。0.5MのHClを添加して反応を停止させ、プレートリーダーで450nmにてプレートを読み取った。
簡潔に述べると、ストレプトアビジンプレート(Thermo Scientific)をビオチン化抗体溶液(Ab1〜5、PBS中1ug/mL)で1時間被覆した。次に抗体被覆プレートを洗浄緩衝液(PBS、0.05%のTween−20)で3回洗浄した。次に遮断溶液(PBS、0.5%の魚皮膚ゼラチン、0.05%のTween−20)を用いてプレートを約1時間遮断した。次に遮断溶液を除去してから、試験する抗原の希釈系列と共に約1時間インキュベートした。このインキュベーションの最後に、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、さらに二次抗体含有溶液(ペルオキシダーゼ結合型アフィニピュアF(ab’)2フラグメントヤギ抗ヒトIgG、Fcフラグメント特異性(Jackson Immunoresearch)と共に約45分間インキュベートし、3回洗浄した。当該時点で基質溶液(TMBペルオキシダーゼ基質、BioFx)を加え、3〜5分間暗所でインキュベートした。0.5MのHClを添加して反応を停止させ、プレートリーダーで450nmにてプレートを読み取った。
簡潔に述べると、白色ストレプトアビジンプレート(Thermo Scientific)をビオチン化抗体溶液(Ab1〜5、PBS中1ug/mL)で1時間被覆した。次に抗体被覆プレートを洗浄緩衝液(PBS、0.05%のTween−20)で3回洗浄した。次に遮断溶液(PBS、0.5%の魚皮膚ゼラチン、0.05%のTween−20)を用いてプレートを約1時間遮断した。次に遮断溶液を除去してから、試験する抗原の希釈系列と共に約1時間インキュベートした。このインキュベーションの最後に、プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、さらに二次抗体含有溶液(ユーロピウム結合型抗ヒトIgG(Cisbio)と共に約45分間インキュベートし、3回洗浄した。当該時点で200μlのHTRF緩衝液(Cisbio)を加え、330での励起/620nmでの発光を用いてプレートを読み取った。
図13は、Ab1及びAb2を用いて抗体Ab−Aの異なるロットのグリコシル化を検出するELISAアッセイの結果を示す。アッセイ形式は、抗糖変異体(AGV)抗体が置かれたものであり、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)検出によるものであった。滴定した異なるAb−Aロットを有するストレプトアビジンプレートにビオチン化抗体を結合させた。2つの抗体Ab1及びAb2は各試験試料に対して同様に反応した。このアッセイ形式では、Ab1とAb2の感度は比較的類似し、プレート上に置かれた抗体及び溶液中のマルチポイントマンノシル化Ab−Aによる「スーパーアビディティー」効果に起因する可能性がある。
この実施例は、Ab1が、糖タンパク質(特に、マンノシル化抗体)への結合についてレクチンDC−SIGNと競合したことを実証する。結果は、Ab1が結合するエピトープが、DC−SIGNに対する結合部位と少なくとも重複することを実証する。
Ab−Aロット2の試料(その調製については実施例1で上述してある糖タンパク質富化抗体試料)をLC−LC−ビオチン(Pierceカタログ番号21338)でビオチン化し、ストレプトアビジンセンサー(Forte Bioカタログ番号18−5019)に150秒間10ug/mlで結合させてから、Ab1を用いて1×キネティクス緩衝液中20ug/mlまたは0ug/mlで1500秒間前処理を施して飽和を達成した。次に前処理シグナル(図示せず)をX軸とY軸の両方についてゼロに正規化した。実験の次ステップは、20ug/ml及び0ug/mlという同Ab1濃度を維持したが、15ug/mlでDC−SIGN(R&D Systemsカタログ番号161−DC−050)を含めた。これらの条件を500秒間保持した。20ug/mlでAb1を前処理した条件では明白なDC−SIGN結合シグナルは観察されなかった。Ab1処理なしのDC−SIGN条件では強いシグナルが観察された。次にセンサーを1×キネティクス緩衝液内での解離条件に動かした。DC−SIGNは結合したままに見えたが、前処理で結合したAb1を有する条件では、シグナルは、その以前のレベルから減衰することが観察された。
図16に示すように、DC−SIGNのAb−Aロット2被覆バイオセンサーへの結合(上部灰色線)は、Ab1前処理によって妨げられる(下黒色線)。これらの結果は、Ab1がマンノシル化タンパク質上で結合するエピトープは、DC−SIGNに対する結合部位と少なくとも重複することを実証する。
このアッセイは、糖タンパク質検出のためのハイスループットHTRFベースアッセイについて述べる。
AGV HTRFアッセイ
簡潔に述べると、ハーフエリア白色96ウェルプレート(Perkin Elmer)を用いて抗体/抗原相互作用を読み取った。抗体(3nM)、抗原(1nM)、ユーロピウム標識抗ウサギFc(1nMのドナー−Cisbio)、及び抗ヒトXL665(30nMのアクセプター−Cisbio)をアッセイ緩衝液(Cisbio)中ウェル毎に60μlで混ぜ合わせる。試料を室温で1時間インキュベートする。インキュベーションしたら、励起330nm、発光620/665nmで300マイクロ秒遅延によりプレートを読み取る。データは665/620の比として報告してある。この実施例で試験した抗体はAb−B及びAb−Dであり、P.pastoris内で発現された2つの異なるヒト化IgG1抗体である。これらの実施例で試験した各ヒト化抗体は、異なる免疫原に対して産生され、他の分子とは異なる標的分子に特異的に結合する。
図17A〜Bは、精製画分中の糖タンパク質レベルを定量化するためのハイスループットアッセイ(HTRF)におけるAGV抗体Ab1の使用を示す。Ab−B(図17A)及びAb−D(図17B)をカラム精製にかけ、AGV抗体を用いて(横軸に番号を付した)あらゆる他の収集画分をアッセイして糖タンパク質の相対量を決定した。抗体の量は、対照の百分率(POC)、詳細には、Ab−Aの糖タンパク質富化調製物(Ab−Aロット2)に対する糖タンパク質の量として表す。参考のため、Ab−Aロット1(相対的に低い量の糖タンパク質を含有する)に含まれる糖タンパク質の量を横線で示してあり、これは対照の約25%のレベルであった。
この実施例は、糖タンパク質含有抗体のクロマトグラフ精製画分の糖タンパク質分析を実証する。抗糖タンパク質抗体Ab1またはGNAを用いて糖タンパク質を検出した。
ポリプロピレングリコール(PPG)カラムから溶出されたAb−Aのクロマトグラフ画分にAb1またはGNAを用いる糖タンパク質分析を施した。Ab1に基づく検出は、実施例6に記載のHTRF法により行った。
図18A〜Bは、ポリプロピレングリコール(PPG)カラムから溶出されたAb−Aの画分に含まれる糖タンパク質の定量化を示す。Ab1及びGNAを用いて、各画分に含まれる糖タンパク質の相対量(対照の百分率、POCとして表される)を評価した。各画分に含まれるタンパク質質量も相対単位(質量RU)で示す。Ab1及びGNAを用いた検出で同様パターンの反応性が見られた。
この実施例は、Ab1、GNA、及びDC−SIGN検出方法による抗体の複数ロットにおける糖タンパク質の検出を示す。各方法で検出された糖タンパク質の相対レベルは同様であり、糖タンパク質の存在を検出するためのAb1を用いる方法の適合性がさらに確証された。
試料の貯蔵及び取扱い:試料及び標準物質は、既存の安定性データに応じて4℃または−20℃で貯蔵した。アッセイを準備しながら、試料を氷上で保持した。キネティクス緩衝液(Forte Bioカタログ番号18−5032、10×及び1×、PBS+0.1%のBSA、0.02%のTween20及び0.05%のアジ化ナトリウムを含有)は4℃で貯蔵した。GNLは4℃で貯蔵する。
図19A〜Dは、図18A〜Bに示す精製からプールした画分の糖タンパク質解析の結果を示す。図19Aは、図15(Ab1はプレート上に置かれ、0.3μg/mLのAb−A試料は溶液中)と同様のユーロピウムに基づく抗体ダウンELISAアッセイでAGV抗体Ab1を用いる異なる調製物中の糖タンパク質のELISA検出を示す。図19Bは、ELISAアッセイを用いて検出した糖タンパク質の検出レベルを対照試料の百分率(POC)としてグラフに示す。図19C〜Dは、それぞれGNAまたはDC−SIGNを用いて決定した同試料中の糖タンパク質の検出レベルを示す。表示「fxn12−21」及び「fxn4−23」は、それぞれ図18A〜Bに示す精製からの12〜21または4〜23の番号を付した画分のプーリングを示す。
この実施例は、抗体Ab1、GNA、及びDC−SIGNを用いて得たシグナルとマンノースの量との間の相関性を示す。
Ab−Aの3つのロットにO糖型解析を施した。一般的にStadheim et al.,“Use of high−performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection for O−glycan determination in yeast,”Nature Protocols,2008 3:1026に記載されているように、各調製物に含まれるモノマンノース、ジマンノース、及びトリマンノースの相対量を決定した。実施例7に記載のようにGNAを使用し、実施例8に記載のようにDC−SIGNを用いて、各ロットに糖タンパク質解析を施した。さらに、各ロットについて、実施例6に記載のHTRF法によって、Ab1を用いる糖タンパク質解析を行った。各検出法のシグナルを対照の百分率(POC)として数量化した。
図21は、AGV、GNA、及びDC−SIGNからのシグナルに関するO糖型組成の結果を示す。表は、糖アルコールの相対単位、詳細には各試料についてのモノマンノース、ジマンノース、及びトリマンノース、ならびにGNA、Ab1及びDC−SIGNシグナルのレベルを示す。
序論
細胞の低い生産性は、組換えタンパク質生産の制限因子となり得る。高性能株を単離することは、生産性を高めるための強力な手法となる。変異誘発(無作為または半合理的)及び組換えDNA法を含めたいくつかの分子生物学技術を用いて遺伝的多様性を作り出すことができ、あるいは自発発生的な株を使用することもできる。該技術により作り出されるライブラリーサイズは一般的に非常に大きく(>105)、所望変異体の単離を典型的な「無駄骨を折る」問題にする。ハイスループットスクリーニングを利用して、向上した生産性等の所望特性を有する変異体を富化することができる。
下記試薬を用いた:FACS緩衝液(2%のFBSを含むPBS);ビオチン化Ab1(上記実施例に記載)、1mg/ml濃度のストック溶液として;ストレプトアビジン(Jackson Immunoresearchカタログ番号016−000−084)、5mg/ml濃度のストック溶液として;ビオチン化ロバ抗ヒトIgG(H+L)ML*「捕捉抗体」(Jackson Immunoresearchカタログ番号709−065−149、1mg/ml濃度のストック溶液として);蛍光標識ロバ抗ヒトIgG(H+L)ML*「検出抗体」:(Jackson Immunoresearchカタログ番号709−545−149)、0.5mg/ml濃度のストック溶液として;ヨウ化プロピジウム50ug/ml(BD Pharmingen 51−66211E);及び10%のPEG8000を補充した無酸培地(AFM)。
この実施例で用いた捕捉試薬の配置を図22に示す。細胞表面をビオチン化するために以下の2つの異なる細胞結合因子を試験した:ビオチン化Galanthus nivalis凝集素(GNA,Vector Laboratories,Burlingame,CA)、及びマンノシル化タンパク質に結合するビオチン化抗体(Ab1)。GNAによる細胞表面の標識化は、相互作用が相対的に弱く、非標識細胞と混合すると、GNAが標識細胞から非標識細胞に遊走し、結果としてフローサイトメトリープロファイルにおいて蛍光シグナルが単一ピークになる(図23A)という欠点を有することが分かった。対照的に、Ab1は、細胞に強くかつ本質的に不可逆的に結合し、2つの出発細胞集団に対応する2つの蛍光シグナルピークをもたらす(図23B)。従って、Ab1等の抗糖タンパク質抗体の使用は、安定した捕捉マトリックスの構築を可能にする。
「産生株」を分泌するマトリックス標識Ab−Aをマトリックス標識非産生性ヌル株と混合すると、分泌産物の交差結合が観察された(図25A)。これらの結果から、高産生性細胞から分泌され(かつマトリックスによって捕捉されない)抗体は、拡散し、低または非分泌性細胞上の捕捉マトリックスに結合することができ、結果としてフローサイトメトリープロファイルにおける蛍光シグナルが単一ピークになると推定した。該交差結合には、培地の浸透性を下げることによって対処した。1つの試験薬はゼラチンであったが、ゼラチンの補充は、10%ほどの低濃度でさえ、細胞の生存率及び生産性に深刻な悪影響を及ぼすことが観察された(データ示さず)。ゼラチンは、酸素及び栄養素の取込みに悪影響を及ぼすと仮定した。分子クラウディング薬、特に10〜15%のポリエチレングリコール(PEG8000)による培地の補充を試験した。デキストラン、フィコール、BSA等の他の分子クラウディング薬で交差結合の阻止が達成可能であることを企図する。異なる分子量または異なる濃度のPEG分子をも使用可能であろう。10%のPEG8000による補充は、生産性に悪影響を与えることなく交差結合を制限することが分かった(図25B及び図25C)。10%のPEG8000を含有する培地で非産生性株(「ヌル株」)と抗体産生性株(「産生株」)との混合物を培養することから生じる結果は、抗体産生性細胞からヌル細胞への抗体の遊走の制限を示唆する。等数のヌル細胞と産生細胞の混合物(「50:50混合 ヌル及び産生」)は、フローサイトメトリープロファイルにおいて2つの蛍光シグナルピークをもたらしたが(図25B)、90%のヌル細胞と10%の産生細胞との混合物(「90_10混合w−PEG」)は、産生株から得られるピーク蛍光強度に類似の蛍光強度を示す細胞の低いピークまたは肩部を含む蛍光シグナル分布を生じさせた(図25C)。これらの結果は、10%のPEG8000を含めると、所与の細胞に関するシグナルのレベルが当該個々の細胞による抗体産生のレベルをさらに密接に反映するように、細胞間の抗体の遊走を減らしたことを示す。
上述のフローサイトメトリーを可能にした細胞表面捕捉マトリックス手法を2つの概念証明実験において利用して、混合培地内の高産生性細胞を富化した。これらの実験では、異なるヒト化IgG1抗体(Ab−A、Ab−D、Ab−E、及びAb−Fの中から2つの抗体)を産生する細胞を規定比で混合し、上記方法を用いて高産生性株を捕捉し、染色し、富化した。この実験では、高産生性株が約20倍〜約150倍に富化された。この結果は、高産生性株の首尾よい富化は、高生産性細胞を単離するためのスクリーニングアッセイとの関連で遂行できたことを示している。
結果は、高産生性株の首尾よい富化は、抗体捕捉方略後に抗体検出及び細胞選別においてAb−1等の抗糖タンパク質抗体を用いて実現可能であることを示している。これらの概念証明実験では、既知の高産生性及び低産生性株を混合し、その結果、出発株の富化を検出することによって容易に富化を定量化できた(抗生物質耐性マーカーによって区別した)。ある実験では、高産生性株が出発集団の1%未満から選別後の最終集団の約20%まで富化され、約20倍の富化を示した。別の実験では、高産生性株が出発集団の0.1%未満から選別後の最終集団の約15%まで富化され、約150倍の富化を示した。これらの結果から、これらの方法は、高産生性細胞を単離するためのスクリーニングアッセイとの関連で実現可能であると推測される。遺伝的変異は、化学的突然変異誘発、発現ライブラリーによる形質転換、系統的または無作為的遺伝子ノックアウトによってのように、集団に導入可能である。発現レベル上昇をもたらす細胞を回収し、さらに処理することができる。遺伝的に同種の集団を作り出すために単一コロニーから高産生性細胞を成長させてよく、あるいは富化細胞の混合集団を用いてもよい。発現レベル上昇は、結果として生じる細胞の発現レベルを出発細胞または他の既知標準物質と比べて直接測定することによって確証可能である。発現上昇をもたらす規定遺伝子差異を有する細胞を生成するために、出発細胞からの遺伝的差異を決定し、産生株に導入することができる。
クロマトグラフィーステップで抗体を用いて糖変異体レベルを減らすかまたは排除するためにAb−1等のAGV抗体を使用する可能性を評価するため、2つの異なる方法を用いてクロマトグラフィー樹脂上にAb−1を固定化した。次にこれらのアフィニティー樹脂を用いてAb−Aのロット(ロット9)における糖変異体レベルの低減を評価した。
GE NHS活性化Sepharose(登録商標)4 Fast Flow樹脂
製造業者のガイドラインに従い、1mMの冷却HClを用いて樹脂を活性化することによってプレ活性化樹脂を調製し、室温で5時間までの穏やかな撹拌を伴うインキュベーションによってAb−1との共有結合により機能化した。Tris pH8を最終濃度0.1Mで添加してカップリング反応を停止させた。この機能化樹脂を0.1MのTris、pH8及び0.1MのアルギニンpH4の交互洗浄によりすすいでいずれの非結合タンパク質をも除去した。カップリングに用いたAb−1の量は、定着樹脂1ミリリットル当たり0.7〜25ミリグラムの抗体の範囲であった。
製造業者のガイドラインと同様の手順で樹脂(ビーズ状ポリアクリルアミドで構成)を調製した。樹脂をDPBS(カルシウムまたはマグネシウムなし)ですすいだ。20:1または40:1モル比のビオチン:抗体でPierceスルホNHSビオチンを用いてAb−1をビオチン化し、製造業者の推奨によって緩衝液を交換して遊離ビオチンを除去した。室温で約1時間もしくは4℃で一晩の撹拌を利用するかまたは室温と4℃のインキュベーションの組合せでビオチン化Ab−1をストレプトアビジン樹脂とインキュベートした。カップリングに用いたAb−1の量は、定着樹脂1ミリリットル当たり約1ミリグラムであった。
第1の実験では、20ミリグラムのAb−Aロット9(セラミックヒドロキシアパタイトカラムからの溶出液)をDPBSで0.5mg/mlまで希釈し、2mlのAb−1機能化NHS樹脂を詰めた0.3ml/分の流速のDPBS平衡化カラムにかけた。第2の実験では、セラミックヒドロキシアパタイトカラムからの20ミリグラムのAb−Aロット9溶出液をDPBSで0.5mg/mlまで希釈し、2.2mlのAb−1機能化Ultralink樹脂を詰めた0.3ml/分の流速のDPBS平衡化カラムにかけた。これらの両樹脂はフロースルーモードで使用した。フロースルー画分をプールし、AGV HTRFアッセイを用いて負荷物質(Ab−Aロット9)の糖変異体シグナルに対する糖変異体シグナルを決定した。
Claims (45)
- 糖タンパク質上の、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、もしくはAb5から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ(複数可)に特異的に結合し、及び/あるいは糖タンパク質上の、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、もしくはAb5から選択される抗糖タンパク質抗体と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ(複数可)への結合について競合する、抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
- (a)前記抗体または抗体フラグメントが、糖タンパク質上の、前記抗糖タンパク質抗体Ab1と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ(複数可)に特異的に結合し、及び/あるいは前記抗糖タンパク質抗体Ab1と同一または重複する線形もしくは立体構造エピトープ(複数可)への結合について競合し、
(b)前記抗体フラグメントが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、一価抗体、またはmetMabから選択され、
(c)前記抗体フラグメントがFabフラグメントであり、
(d)前記抗体または抗体フラグメントが、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、またはAb5から選択される抗糖タンパク質抗体と同一の相補性決定領域(CDR)を含み、
(e)前記抗体または抗体フラグメントが、配列番号4のCDR1配列、配列番号6のCDR2配列、及び配列番号8のCDR3配列を含む可変重(VH)鎖、ならびに/または配列番号24のCDR1配列、配列番号26のCDR2配列、及び配列番号28のCDR3配列を含む可変軽(VL)鎖を含むFabフラグメントを含み、
(f)前記抗体または抗体フラグメントが、前記VL及び前記VH領域のそれぞれに、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、またはAb5から選択される抗糖タンパク質抗体に含まれるものと同一である少なくとも2つのCDRを含み、
(g)前記抗体または抗体フラグメントが、ヒト化、単鎖、またはキメラ抗体を含み、
(h)前記抗体または抗体フラグメントが、ウサギ抗体または抗体フラグメントであり、
(i)前記抗体または抗体フラグメントが、担体に結合しており、
(j)前記抗体または抗体フラグメントが、宿主動物から単離された抗体または抗体フラグメントと比較して1つ以上のアミノ酸配列修飾を含み、及び/または
(k)前記抗体または抗体フラグメントが、直接もしくは間接的に検出可能標識または治療薬に付着している、
請求項1に記載の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。 - (a)配列番号2、42、82、122、もしくは162から選択されるVHポリペプチド配列、またはそれと少なくとも90%の配列同一性を示すその変異体;及び/または配列番号22、62、102、142、もしくは182から選択されるVLポリペプチド配列、またはそれと少なくとも90%の配列同一性を示すその変異体
を含む単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであって、
前記抗糖タンパク質抗体が1つ以上の糖タンパク質抗体と特異的に結合するか、または
(b)配列番号2、42、82、122、もしくは162から選択されるVHポリペプチド配列、またはそれと少なくとも90%の配列同一性を示すその変異体;及び/または配列番号22、62、102、142、もしくは182から選択されるVLポリペプチド配列、またはそれと少なくとも90%の配列同一性を示すその変異体
を含む単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであって、
前記VHまたはVLポリペプチド中のフレームワーク(FR)またはCDR残基の1つ以上が別のアミノ酸残基で置換され、結果として1つ以上の糖タンパク質抗体と特異的に結合する抗糖タンパク質抗体になっている、
前記単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。 - 前記抗体または抗体フラグメントの1つ以上のフレームワーク(FR)残基が、前記VHまたはVLポリペプチドに含まれる前記CDRが由来した親ウサギ抗糖タンパク質抗体の対応部位に存在するアミノ酸で置換されているか、または保存的アミノ酸置換によって置換されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントであって、場合により、
(a)前記VLポリペプチド配列の前記CDR中の前記残基の最大で1または2個が修飾され、
(b)前記VHポリペプチド配列の前記CDR中の前記残基の最大で1または2個が修飾され、
(c)前記抗体がヒト化され、
(d)前記抗体がキメラであり、
(e)前記抗体が単鎖抗体を含み、
(f)前記抗体がヒトFcを含み、及び/または
(g)前記抗体が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4由来の1つ以上のフレームワーク及び/または定常ドメイン配列を含む、
前記単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。 - 前記抗体が、1つ以上の糖タンパク質に特異的に結合し、場合により、前記抗体が、1つ以上のマンノシル化タンパク質に特異的に結合するかまたはマンノシル化抗体重鎖もしくは軽鎖に特異的に結合する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
- 前記抗体が、配列番号201、205、もしくは209の配列を有する重鎖定常ポリペプチドまたはそのマンノシル化フラグメント及び/あるいは配列番号203、207、もしくは211の配列を含むマンノシル化ヒトIgG1抗体軽鎖定常ポリペプチドまたはそのマンノシル化フラグメントを含むマンノシル化ヒトIgG1抗体または抗体フラグメントに特異的に結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。
- 前記抗体が、下記:
(a)酵母種;
(b)Candida spp.、Debaryomyces hansenii、Hansenula spp.(Ogataea spp.)、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Lipomyces spp.、Pichia stipitis(Scheffersomyces stipitis)、Pichia sp.(Komagataella spp.)、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomycopsis spp.、Schwanniomyces occidentalis、Yarrowia lipolytica、及びPichia pastoris(Komagataella pastoris)から成る群より選択される酵母種;
(c)糸状真菌種;
(d)Trichoderma reesei、Aspergillus spp.、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus awamori、Aspergillus oryzae、Neurospora crassa、Penicillium spp.、Penicillium chrysogenum、Penicillium purpurogenum、Penicillium funiculosum、Penicillium emersonii、Rhizopus spp.、Rhizopus miehei、Rhizopus oryzae、Rhizopus pusillus、Rhizopus arrhizus、Phanerochaete chrysosporium、及びFusarium graminearumから成る群より選択される糸状真菌種;または
(e)Pichia pastoris
内で産生される1つ以上のマンノシル化抗体または抗体フラグメントに特異的に結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメント。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗糖タンパク質抗体または抗体フラグメントをコードする核酸配列(複数可)、または前記核酸配列(複数可)を含み、場合によりプラスミドもしくは組換えウイルスベクターであるベクター。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗体または抗体フラグメントを発現する培養または組換え細胞であって、場合により前記細胞が、
(a)哺乳類、酵母、細菌、真菌、または昆虫細胞から選択され、
(b)酵母細胞であり、
(c)二倍体酵母細胞であり、
(d)ピキア属の酵母細胞であり、及び/または
(e)Pichia pastorisである、
前記細胞。 - 試料中の糖タンパク質の検出方法であって、前記試料を抗糖タンパク質抗体と接触させ、前記糖タンパク質の前記抗糖タンパク質抗体との結合を検出することを含み、場合により前記糖タンパク質がマンノシル化糖タンパク質である、前記方法。
- 前記抗糖タンパク質抗体が、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗糖タンパク質抗体である、請求項10に記載の方法。
- 前記糖タンパク質が、
(a)酵母種内で産生され、
(b)Candida spp.、Debaryomyces hansenii、Hansenula spp.(Ogataea spp.)、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Lipomyces spp.、Pichia stipitis(Scheffersomyces stipitis)、Pichia sp.(Komagataella spp.)、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomycopsis spp.、Schwanniomyces occidentalis、Yarrowia lipolytica、及びPichia pastoris(Komagataella pastoris)から成る群より選択される酵母種内で産生され、
(c)糸状真菌種内で産生され、
(d)Trichoderma reesei、Aspergillus spp.、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus awamori、Aspergillus oryzae、Neurospora crassa、Penicillium spp.、Penicillium chrysogenum、Penicillium purpurogenum、Penicillium funiculosum、Penicillium emersonii、Rhizopus spp.、Rhizopus miehei、Rhizopus oryzae、Rhizopus pusillus、Rhizopus arrhizus、Phanerochaete chrysosporium、及びFusarium graminearumから成る群より選択される糸状真菌種内で産生され、または
(e)Pichia pastoris内で産生される、
請求項10または11に記載の方法。 - 前記糖タンパク質の前記抗糖タンパク質抗体との結合の前記検出ステップが、
(a)ELISAアッセイを含み、場合により前記ELISAアッセイが西洋ワサビペルオキシダーゼまたはユーロピウム検出を利用し、
(b)前記抗糖タンパク質抗体が担体に結合しており、
(c)前記検出ステップが、タンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセスを使用し、及び/または
(d)前記検出ステップが、光干渉法、二重偏光干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、多角光散乱法、表面プラズモン共鳴法、ELISA、化学発光ELISA、ユーロピウムELISA、ファーウエスタン法、または電界発光法を用いるタンパク質−タンパク質相互作用モニタリングプロセスを使用する、
請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 精製カラムからの複数画分に対して行う、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法であって、糖タンパク質の検出レベルに基づいて、複数画分をプールして、
(a)前記抗糖タンパク質抗体に結合する糖タンパク質が枯渇した精製産物を生じさせ、前記精製産物は、場合により医薬品投与に適しており、または
(b)前記抗糖タンパク質抗体に結合する糖タンパク質に富んだ精製産物を生じさせ、前記精製産物は、場合により医薬品投与に適しており、
場合により、ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化ポリペプチドの質量を測定することによって純度を決定する、前記方法。 - (a)前記検出される糖タンパク質が、O結合型グリコシル化の結果であり、
(b)前記検出される糖タンパク質が、ポリペプチドの糖変異体であり、
(c)前記検出される糖タンパク質が、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子または酵素であり、
(d)前記検出される糖タンパク質が、抗体または抗体フラグメントを含み、場合により、重鎖ポリペプチド及び/または軽鎖ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化重鎖ポリペプチド及び/またはグリコシル化軽鎖ポリペプチドの質量を測定することによって純度を決定し、
(e)前記検出される糖タンパク質が、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントを含み、
(f)前記検出される糖タンパク質が、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ起源の抗体を含み、
(g)前記検出される糖タンパク質が、ウサギ起源の抗体を含み、
(h)前記検出される糖タンパク質が、一価、二価、または多価抗体を含み、及び/または
(i)前記検出される糖タンパク質が、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IL−12、IL−13、IL−17、IL−18、IFN−α、IFN−γ、BAFF、CXCL13、IP−10、CBP、アンジオテンシン、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、Nav1.7、Nav1.8、VEGF、PDGF、EPO、EGF、FSH、TSH、hCG、CGRP、NGF、TNF、HGF、BMP2、BMP7、PCSK9またはHRGに特異的に結合する抗体を含む、
請求項14に記載の方法。 - (a)10%未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
(b)5%未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
(c)1%未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、及び/または
(d)0.5%未満の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールする、
請求項14または15に記載の方法。 - (a)90%超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
(b)95%超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
(c)99%超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、または
(d)99.5%超の糖タンパク質を含む試料もしくは溶出液またはその画分をプールする、
請求項14または15に記載の方法。 - 所望ポリペプチドの純度に基づいて、異なる試料もしくは溶出液またはその画分をプールすることをさらに含み、場合により、
(a)91%超の純度を有する試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、
(b)97%超の純度を有する試料もしくは溶出液またはその画分をプールし、または
(c)99%超の純度を有する試料もしくは溶出液またはその画分をプールする、
請求項14または15に記載の方法。 - 場合により、
(a)アフィニティーリガンド、
(b)タンパク質A及び/またはタンパク質G、
(c)レクチン、
(d)混合モードクロマトグラフィー担体、
(e)セラミックヒドロキシアパタイト、セラミックフルオロアパタイト、結晶性ヒドロキシアパタイト、結晶性フルオロアパタイト、CaptoAdhere、Capto MMC、HEA Hypercel、PPA Hypercel及びToyopearl MX−Trp−650Mから選択される混合モードクロマトグラフィー担体、
(f)セラミックヒドロキシアパタイトを含む混合モードクロマトグラフィー担体、
(g)疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、
(h)Butyl Sepharose 4 FF、Butyl−S Sepharose FF、Octyl Sepharose 4 FF、Phenyl Sepharose BB、Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepharose 6 FF High Sub、Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub、Source 15ETH、Source 15ISO、Source 15PHE、Capto Phenyl、Capto Butyl、Streamline Phenyl、TSK Ether 5PW(20um及び30um)、TSK Phenyl 5PW(20um及び30um)、Phenyl 650S、M、及びC、Butyl 650S、M及びC、Hexyl−650M及びC、Ether−650S及びM、Butyl−600M、Super Butyl−550C、Phenyl−600M、PPG−600M;孔径120、200、300Aを有するYMC−Pack Octyl Columns−3、5、10P、15及び25um、孔径120、200及び300Aを有するYMC−Pack Phenyl Columns−3、5、10P、15及び25um、孔径120、200及び300Aを有するYMC−Pack Butyl Columns−3、5、10P、15及び25um、Cellufine Butyl、Cellufine Octyl、Cellufine Phenyl;WP HI−Propyl(C3);Macroprep t−ButylまたはMacroprep methyl;及びHigh Density Phenyl−HP2 20umから選択される疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、及び/または
(i)ポリプロピレングリコール(PPG)600MまたはPhenyl Sepharose HPを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー担体
を含む、クロマトグラフィー担体を用いて前記所望ポリペプチドを精製する、
請求項10〜18のいずれか1項に記載の方法。 - 不純物をモニターするためのサイズ排除クロマトグラフィーによる1つ以上の試料の分析をさらに含み、場合により、前記サイズ排除クロマトグラフィー担体がGS3000SWである、請求項10〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中の糖タンパク質濃度の低減方法であって、
(i)前記試料を抗糖タンパク質抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させ、それによって前記抗体またはフラグメントを前記糖タンパク質に結合させ、(ii)前記抗体またはフラグメント及びそれに結合した前記糖タンパク質を前記試料の残余から分離し、それによって前記試料中の糖タンパク質濃度を低減させることを含み、場合により前記試料が、インビボ投与に適した調剤試薬を含み、及び/または場合により前記方法が、精製カラムからプールされた画分に対して行われる、前記方法。 - 前記抗糖タンパク質抗体が、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗糖タンパク質抗体である、請求項21に記載の方法。
- (a)酵母種内で行われ、
(b)Candida spp.、Debaryomyces hansenii、Hansenula spp.(Ogataea spp.)、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Lipomyces spp.、Pichia stipitis(Scheffersomyces stipitis)、Pichia sp.(Komagataella spp.)、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomycopsis spp.、Schwanniomyces occidentalis、Yarrowia lipolytica、及びPichia pastoris(Komagataella pastoris)から成る群より選択される酵母種内で行われ、
(c)糸状真菌種内で行われ、
(d)Trichoderma reesei、Aspergillus spp.、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus awamori、Aspergillus oryzae、Neurospora crassa、Penicillium spp.、Penicillium chrysogenum、Penicillium purpurogenum、Penicillium funiculosum、Penicillium emersonii、Rhizopus spp.、Rhizopus miehei、Rhizopus oryzae、Rhizopus pusillus、Rhizopus arrhizus、Phanerochaete chrysosporium、及びFusarium graminearumから成る群より選択される糸状真菌種内で行われ、または
(e)Pichia pastoris内で行われる、
請求項21または22に記載の方法。 - (a)前記抗糖タンパク質抗体が担体に結合し、
(b)前記抗糖タンパク質抗体が樹脂を含む担体に結合し、または
(c)前記抗糖タンパク質抗体が、アガロース、架橋アガロース、ポリアクリルアミド、その誘導体を含む樹脂、または官能基、ペプチド、もしくはタンパク質を固定化できる別の樹脂もしくはポリマーを含む担体に結合する、
請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。 - (a)前記検出される糖タンパク質が、O結合型グリコシル化の結果であり、
(b)前記検出される糖タンパク質が、ポリペプチドの糖変異体であり、
(c)前記検出される糖タンパク質が、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子または酵素であり、
(d)前記検出される糖タンパク質が、抗体または抗体フラグメントを含み、場合により、重鎖ポリペプチド及び/または軽鎖ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化重鎖ポリペプチド及び/またはグリコシル化軽鎖ポリペプチドの質量を測定することによって純度を決定し、
(e)前記検出される糖タンパク質が、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントを含み、
(f)前記検出される糖タンパク質が、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ起源の抗体を含み、
(g)前記検出される糖タンパク質が、ウサギ起源の抗体を含み、
(h)前記検出される糖タンパク質が、一価、二価、または多価抗体を含み、及び/または
(i)前記検出される糖タンパク質が、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IL−12、IL−13、IL−17、IL−18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP−10、CBP、アンジオテンシン、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、Nav1.7、Nav1.8、VEGF、PDGF、EPO、EGF、FSH、TSH、hCG、CGRP、NGF、TNF、HGF、BMP2、BMP7、PCSK9またはHRGに特異的に結合する抗体を含む、
請求項21〜24のいずれか1項に記載の方法。 - (a)前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の10%未満に低減し、
(b)前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の5%未満に低減し、
(c)前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の1%未満に低減し、
(d)前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の0.5%未満に低減し、
(e)前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の0.10%未満に低減し、
(f)前記試料中の糖タンパク質濃度が、前記試料中の総タンパク質の0.01%未満に低減し、
場合により、前記試料中のポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化ポリペプチドの質量を測定することによって前記試料中の糖タンパク質濃度を決定する、
請求項21〜25のいずれか1項に記載の方法。 - 場合により、
(a)アフィニティーリガンド、
(b)タンパク質A及び/またはタンパク質G、
(c)レクチン、
(d)混合モードクロマトグラフィー担体、
(e)セラミックヒドロキシアパタイト、セラミックフルオロアパタイト、結晶性ヒドロキシアパタイト、結晶性フルオロアパタイト、CaptoAdhere、Capto MMC、HEA Hypercel、PPA Hypercel及びToyopearl MX−Trp−650Mから選択される混合モードクロマトグラフィー担体、
(f)セラミックヒドロキシアパタイトを含む混合モードクロマトグラフィー担体、
(g)疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、
(h)Butyl Sepharose 4 FF、Butyl−S Sepharose FF、Octyl Sepharose 4 FF、Phenyl Sepharose BB、Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepharose 6 FF High Sub、Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub、Source 15ETH、Source 15ISO、Source 15PHE、Capto Phenyl、Capto Butyl、Streamline Phenyl、TSK Ether 5PW(20um及び30um)、TSK Phenyl 5PW(20um及び30um)、Phenyl 650S、M、及びC、Butyl 650S、M及びC、Hexyl−650M及びC、Ether−650S及びM、Butyl−600M、Super Butyl−550C、Phenyl−600M、PPG−600M;孔径120、200、300Aを有するYMC−Pack Octyl Columns−3、5、10P、15及び25um、孔径120、200及び300Aを有するYMC−Pack Phenyl Columns−3、5、10P、15及び25um、孔径120、200及び300Aを有するYMC−Pack Butyl Columns−3、5、10P、15及び25um、Cellufine Butyl、Cellufine Octyl、Cellufine Phenyl;WP HI−Propyl(C3);Macroprep t−ButylまたはMacroprep methyl;及びHigh Density Phenyl−HP2 20umから選択される疎水性相互作用クロマトグラフィー担体、及び/または
(i)ポリプロピレングリコール(PPG)600MまたはPhenyl Sepharose HPを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー担体
を含むクロマトグラフィー担体を用いて前記所望ポリペプチドを精製する、
請求項21〜26のいずれか1項に記載の方法。 - 不純物をモニターするためのサイズ排除クロマトグラフィーによる1つ以上の試料の分析をさらに含み、場合により前記サイズ排除クロマトグラフィー担体がGS3000SWである、請求項21〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞による分泌ポリペプチドの発現レベルの検出方法であって、(i)捕捉試薬を前記細胞に結合させ、(ii)前記細胞を培養し、それによって前記細胞から前記分泌ポリペプチドが発現及び分泌され、(iii)前記分泌ポリペプチドに結合する検出試薬と前記細胞を接触させ、(iv)前記検出試薬を検出し、その結果、前記細胞による前記分泌ポリペプチドの発現レベルを検出する、前記方法。
- 前記捕捉試薬が、前記細胞に不可逆的に結合する、請求項29に記載の方法。
- 前記捕捉試薬が、請求項1〜7のいずれか1項に記載の抗糖タンパク質抗体を含む、請求項29または30に記載の方法。
- 前記捕捉試薬が、前記分泌ポリペプチドに結合する結合部分をさらに含み、場合により、
(a)前記分泌ポリペプチドに特異的な抗体を含み、または
(b)抗Fc抗体を含み、この場合、前記分泌ポリペプチドは、前記結合部分が特異的に結合するFc領域もしくはそのフラグメントを含み、または
(c)ビオチンを含む、
請求項29〜31のいずれか1項に記載の方法。 - 前記捕捉試薬がビオチンを含み、かつ前記結合部分がアビジンもしくはストレプトアビジンを含むか、または前記捕捉試薬がアビジンもしくはストレプトアビジンを含み、かつ前記結合部分がビオチンを含み、前記捕捉試薬及び前記結合部分が、前記アビジンとビオチンの相互作用と共に結合する、請求項29〜32のいずれか1項に記載の方法。
- (a)前記細胞が酵母細胞であり、
(b)前記細胞が、Candida spp.、Debaryomyces hansenii、Hansenula spp.(Ogataea spp.)、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces marxianus、Lipomyces spp.、Pichia stipitis(Scheffersomyces stipitis)、Pichia sp.(Komagataella spp.)、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomycopsis spp.、Schwanniomyces occidentalis、Yarrowia lipolytica、及びPichia pastoris(Komagataella pastoris)から成る群より選択される種の酵母細胞であり、または
(c)前記細胞がPichia pastorisである、
請求項29〜33のいずれか1項に記載の方法。 - (a)前記分泌ポリペプチドが、O結合型グリコシル化の結果であり、
(b)前記分泌ポリペプチドが、ポリペプチドの糖変異体であり、
(c)前記分泌ポリペプチドが、ホルモン、成長因子、受容体、抗体、サイトカイン、受容体リガンド、転写因子または酵素であり、
(d)前記分泌ポリペプチドが抗体または抗体フラグメントを含み、場合により、重鎖ポリペプチド及び/または軽鎖ポリペプチドの総質量の百分率としてグリコシル化重鎖ポリペプチド及び/またはグリコシル化軽鎖ポリペプチドの質量を測定することによって純度を決定し、
(e)前記分泌ポリペプチドが、ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはそのフラグメントを含み、
(f)前記分泌ポリペプチドが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはウシ起源の抗体を含み、
(g)前記分泌ポリペプチドが、ウサギ起源の抗体を含み、
(h)前記分泌ポリペプチドが、一価、二価、または多価抗体を含み、及び/または
(i)前記分泌ポリペプチドが、IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IL−12、IL−13、IL−17、IL−18、IFN−α、IFN−γ、BAFF、CXCL13、IP−10、CBP、アンジオテンシン、アンジオテンシンI、アンジオテンシンII、Nav1.7、Nav1.8、VEGF、PDGF、EPO、EGF、FSH、TSH、hCG、CGRP、NGF、TNF、HGF、BMP2、BMP7、PCSK9またはHRGに特異的に結合する抗体を含む、
請求項29〜34のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(ii)が、ポリエチレングリコールまたは別の分子クラウディング薬を含む媒体内で行われ、場合により、
(a)前記ポリエチレングリコールが、約1000Da〜約100kDaの平均分子量のものであり、
(b)前記ポリエチレングリコールが、約5000Da〜約15kDaの平均分子量のものであり、
(c)前記ポリエチレングリコールが、約7000Da〜約9000Daの平均分子量のものであり、または
(d)前記ポリエチレングリコールが、約8000Daの平均分子量のものである、
請求項29〜35のいずれか1項に記載の方法。 - (a)前記ポリエチレングリコールが、約1%〜約20%(w/v)の濃度で存在し、
(b)前記ポリエチレングリコールが、約5%〜約15%(w/v)の濃度で存在し、
(c)前記ポリエチレングリコールが、約8%〜約12%(w/v)の濃度で存在し、または
(d)前記ポリエチレングリコールが、約10%(w/v)の濃度で存在する、
請求項36に記載の方法。 - ステップ(ii)が、デキストラン、フィコール、及び/またはBSAの1つ以上を含む媒体内で行われる、請求項29〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出試薬が蛍光成分を含む、請求項29〜38のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(iv)が、蛍光活性化細胞選別によって前記検出試薬を検出することを含む、請求項29〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 異種細胞集団に対して行われ、かつ場合により上昇レベルの前記分泌ポリペプチドを発現する細胞に対して前記異種細胞集団を富化することをさらに含む、請求項29〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異種細胞集団が、遺伝子修飾細胞を含み、場合により、
(a)前記遺伝子修飾細胞が、化学的、放射線学的、または挿入突然変異誘発によって突然変異を起こされた細胞を含み、
(b)前記遺伝子修飾細胞が、遺伝子ノックアウト細胞のライブラリーを含み、
(c)前記遺伝子修飾細胞が、プラスミドライブラリーで形質転換された細胞を含み、
(d)前記遺伝子修飾細胞が、cDNAライブラリーで形質転換された細胞を含み、
(e)前記遺伝子修飾細胞が、高発現プロモーターに作動可能に連結されたcDNA配列を含有するプラスミドを含むcDNAライブラリーで形質転換された細胞を含み、
(f)前記遺伝子修飾細胞が、高コピープラスミドを含むcDNAライブラリーで形質転換された細胞を含み、及び/または
(g)前記遺伝子修飾細胞が、酵母種から得られたゲノムDNAもしくはcDNAを含むプラスミドライブラリーで形質転換された細胞を含む、
請求項41に記載の方法。 - 前記酵母種がPichia pastorisである、請求項42に記載の方法。
- 上昇レベルの分泌ポリペプチドを発現する細胞であって、請求項29〜43のいずれか1項に記載の方法で検出される、前記細胞。
- 分泌ポリペプチドの発現レベルを高める遺伝子修飾を含む細胞であって、請求項29〜43のいずれか1項に記載の方法で検出される遺伝子修飾を含有する、前記細胞。
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