CN114130377A

CN114130377A - 一种亲和层析填料、其制备方法及用途

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Publication number: CN114130377A
Application number: CN202111529088.2A
Authority: CN
Inventors: 董曼佳; 张东升; 高晓芳; 陈德和
Original assignee: Wuxi Chuangpu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuxi Chuangpu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-03-04

Abstract

本发明公开了一种亲和层析填料，其制备方法和用检测真菌毒素的用途所述亲和层析填料包括：(a)抗体；和(b)亲和配体‑基质偶联物，其中所述抗体与所述亲和配体‑基质偶联物中的亲和配体通过异源双功能交联剂偶联，所述亲和配体是蛋白A或蛋白G。本发明的填料对抗原(例如真菌毒素)的结合活性高，并且检测准确性高；本发明的方法能够节约抗体资源、提高抗体利用率，降低生产成本。

Description

一种亲和层析填料、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于免疫亲和色谱技术和食品安全检测领域，具体涉及一种亲和层析填料、特别是通过异源双功能交联剂偶联抗体的蛋白A/G-琼脂糖凝胶填料，其制备方法以及用于真菌毒素的色谱分析和/或检测的用途。

背景技术

真菌毒素(Mycotoxin)是真菌在生长过程中产生的次级代谢产物，其种类多、分布广，目前已经发现的毒素高达400多种，其中大部分都具有毒性，且具有致癌、致畸作用，在农作物种植、收储和加工等各个环节中污染食品，对人体健康造成严重伤害。

真菌毒素的常用检测方法有液相色谱-质谱联用法、免疫亲和柱-高效液相法、酶联免疫试剂盒法以及胶体金、荧光免疫层析法等。其中，用免疫亲和柱(IAC柱)净化富集，高效液相色谱仪进行检测的方法是最为常见的定量分析方法。针对生物毒素小分子净化和富集的IAC柱在国内外已经得到商品化并广泛应用。使固定化的抗体维持高密度、高活性是制备一次性、大容量、低成本IAC柱的关键。

但是，当抗体被固定在载体表面时，其活性通常比溶液中要低，活性降低的主要原因在于：一是高密度造成抗体分子的空间位阻；二是载体表面抗体的随机偶联，如溴化氰法。因此，抗体高度定向化的方法被陆续开发出来。目前，主要有3种形式，一种是利用醛基化单抗与己二酸二酰肼反应生成酰肼化单抗，再与醛基化的载体进行定向化，这不仅需要高纯度的单抗，生成的腙加合物在弱酸下不稳定，且二次修饰抗体容易导致单抗活性的降低，如CN101241128B；第二种是利用单抗还原或酶解片段Fab′上的游离巯基在金表面的吸附固定，但单抗片段获得重现性差，非特异性吸附高。第三种是通过蛋白A/G结合单抗，该固定化应用最为广泛，如CN104117229B、CN104437408A，但因同源交联剂，如庚二亚氨酸二甲酯(DMP)无选择性反应而导致抗原结合域的过度修饰，使得抗体失活，利用率不高，是其最大缺陷。又如文献“基于蛋白A-琼脂糖凝胶黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备”(龚燕等，食品科学，2015，Vol.36，No.10)报道的，定向偶联中单抗的有效利用率为52.7％。

发明内容

针对当前本领域面临的问题和发展趋势以及现有技术的不足，本发明提供了一种包括通过异源双功能交联剂偶联抗体的亲和配体-基质偶联物的填料、其制备方法及用途，所述填料对抗原(例如真菌毒素)的结合活性高，并且检测准确性高；所述方法能够节约抗体资源、提高抗体利用率，降低生产成本。

具体地，本发明提供了一种亲和层析填料，其包括：

(a)抗体；和

(b)亲和配体-基质偶联物；

其中所述抗体与所述亲和配体-基质偶联物中的蛋白A通过异源双功能交联剂偶联，所述亲和配体是蛋白A或蛋白G。

在一些实施方案中，异源双功能交联剂分别与亲和配体上引入的巯基和抗体上的游离氨基反应实现亲和配体与抗体的偶联。

在一些实施方案中，异源双功能交联剂的实例包括但不限于：磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(Sulfo-SMCC)、m-苯甲酰马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS)、N[γ-马来酰亚胺氧化丁醛]琥珀酰亚胺(GMBS)、琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)、琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸(SMPB)、m-苯甲酰马来酰亚胺-N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-MBS)、N[γ-马来酰亚胺氧化丁醛]磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-GMBS)、磺基琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸(Sulfo-SMPB)。

在一些实施方案中，异源双功能交联剂是Sulfo-SMCC。

在一些实施方案中，蛋白A是天然蛋白A、重组蛋白A、蛋白A类似物或经化学修饰的天然蛋白A、重组蛋白A或蛋白A类似物。

在一些实施方案中，蛋白A类似物是与天然蛋白A具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列一致性的多肽，或者相对于天然蛋白A包含一个或多个氨基酸替换、缺失或添加的多肽，例如包含至多10个，如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸替换、缺失或添加的多肽。

在一些实施方案中，蛋白G是天然蛋白G、重组蛋白G、蛋白G类似物或经化学修饰的天然蛋白G、重组蛋白G或蛋白G类似物。

在一些实施方案中，蛋白G类似物是与天然蛋白G具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列一致性的多肽，或者相对于天然蛋白G包含一个或多个氨基酸替换、缺失或添加的多肽，例如包含至多10个，如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸替换、缺失或添加的多肽。

在一些实施方案中，亲和配体(例如蛋白A和蛋白G)是经巯基化修饰的。

在一些实施方案中，基质的实例包括但不限于：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、琼脂糖和葡聚糖复合凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯凝胶、聚甲基丙烯酸甲酯凝胶、多孔二氧化硅、玻璃纤维、或二氧化钛。

在一些实施方案中，基质为琼脂糖凝胶。

在一些实施方案中，基质可以通过本领域已知方式和方法进行活化并与亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)偶联，例如多糖基质(如琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、琼脂糖和葡聚糖复合凝胶)可以通过溴化氰活化法或环氧乙烷基活化法进行活化；聚丙烯酰胺凝胶可以通过戊二醛活化，或者通过氨乙基化作用、肼解作用、碱解作用对甲酰胺基修饰而活化；多孔二氧化硅、玻璃纤维等可以通过硅烷化试剂活化。

在一些实施方案中，亲和配体-基质偶联物，例如蛋白A琼脂糖凝胶或蛋白G琼脂糖凝胶可以通过商业途径获得。

在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。

在一些实施方案中，抗体是IgG。在一些实施方案中，抗体是鼠IgG2a、IgG2b或IgG1抗体。

在一些实施方案中，抗体是特异性结合真菌毒素的单克隆抗体。

在一些实施方案中，真菌毒素的实例包括但不限于：玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素(例如黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素(例如赭曲霉毒素A)、单端孢霉烯族毒素、杂色曲霉素、或伏马毒素。

在一些实施方案中，真菌毒素是玉米赤霉烯酮。

在一些实施方案中，抗体是抗ZEN抗体。在一些实施方案中，抗ZEN抗体是IgG2a抗体。

本发明还提供了一种制备上述亲和层析填料的方法，其包括：

使所述抗体与亲和配体-基质偶联物混合并反应，然后加入异源双功能交联剂进行偶联，得到偶联产物，所述亲和配体是蛋白A或蛋白G。

在一些实施方案中，制备上述亲和层析填料的方法包括：

(1)使硫醇试剂与亲和配体-基质偶联物混合并反应，得到巯基化亲和配体-基质偶联物；

(2)使所述抗体与所述巯基化亲和配体-基质偶联物混合并反应，然后加入异源双功能交联剂进行偶联，得到偶联产物；

所述亲和配体是蛋白A或蛋白G。

在一些实施方案中，硫醇试剂是N-琥珀酰亚胺-S-乙酰巯基乙酸酯(SATA)。

在一些实施方案中，引入亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)的巯基可以带有巯基保护基，例如乙酰基。在一些实施方案中，巯基保护基可以在亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)经由异源双功能交联剂与抗体的偶联反应之前才脱去，以保护巯基使其能够长期保存而不被再氧化，为本公开的亲和层析填料的保存和应用提供了便利。在一些实施方案中，通过脱酰溶液脱去巯基保护基(例如乙酰基)，脱酰溶液包含盐酸羟胺、EDTA二钠和PBS缓冲液(pH7.2)。

在一些实施方案中，所述亲和配体以亲和配体-基质偶联物的形式存在。在一些实施方案中，所述亲和配体以亲和配体-琼脂糖凝胶混悬液的形式存在。在一些实施方案中，所述亲和配体以蛋白A-琼脂糖凝胶混悬液或蛋白G-琼脂糖凝胶混悬液的形式存在。

在一些实施方案中，蛋白A-琼脂糖凝胶混悬液或蛋白G-琼脂糖凝胶混悬液存在于保护液中，例如保护液为20％乙醇水，凝胶与保护液的体积比为1:1。

在一些实施方案中，硫醇试剂与亲和配体-基质偶联物(例如蛋白A-基质偶联物或蛋白G-基质偶联物)在PBS缓冲液(pH7.4)中反应。在一些实施方案中，硫醇试剂为SATA的DMSO溶液，例如浓度为约0.65mol/L。在一些实施方案中，使硫醇试剂与亲和配体-基质偶联物在室温下反应10min至1小时，例如20min至40min，例如约30min。在一些实施方案中，使硫醇试剂与亲和配体-基质偶联物在垂直混匀器上反应。

在一些实施方案中，步骤(1)中，硫醇试剂与亲和配体-基质偶联物反应完成后，抽滤去除未反应和/或已水解的SATA，然后用PBS洗涤和重悬浮所得到的引入巯基的亲和配体-基质偶联物。

在一些实施方案中，在硫醇试剂与亲和配体-基质偶联物(例如蛋白A-基质偶联物或蛋白G-基质偶联物)混合之前，先测定亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)中游离氨基的数目。

在一些实施方案中，蛋白A或蛋白G中游离氨基的数目根据以下方法测定：

(a)配制BSA(胎牛血清白蛋白)标准工作液，例如1mg/mL的BSA水溶液，用紫外分光光度计测定260nm及280nm下的吸光度值，根据公式计算其实际蛋白含量，公式如下：

C_蛋白＝1.45×A_280nm－0.74×A_260nm

其中A_280nm表示蛋白在280nm波长处的吸光度值，A_260nm表示蛋白在280nm波长处的吸光度值。

(b)按照1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL的浓

度梯度稀释BSA标准工作液；

(c)向标准工作液中加入0.1M硼酸缓冲液和0.1％(v/v)的TNBS(三

硝基苯磺酸)，40℃反应约100min；

(d)用紫外分光光度计测定每个浓度下BSA溶液的OD₄₂₄值，并绘制标

准曲线；

(e)取1mg/mL蛋白A或蛋白G样品，加入0.1M硼酸缓冲液和0.1％(v/v)的TNBS(三硝基苯磺酸)，40℃反应约100min，紫外分光光度计测定OD₄₂₄值，根据标准曲线计算蛋白A或蛋白G中游离氨基的数目。

在一些实施方案中，硫醇试剂与亲和配体-基质偶联物(例如蛋白A-基质偶联物或蛋白G-基质偶联物)中游离氨基的摩尔比为2:1至20:1，例如2:1至15:1，或者2:1至10:1，例如约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、或约9:1。

在一些实施方案中，异源双功能交联剂一端连接抗体上的氨基，另一端连接亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)上引入的巯基。在一些实施方案中，异源双功能交联剂与抗体的偶联和异源双功能交联剂与巯基化亲和配体的偶联分别在不同pH下进行。在一些实施方案中，异源双功能交联剂与巯基化亲和配体-基质偶联物上的巯基化亲和配体偶联的pH范围是6.5-7.5，例如约7.0，异源双功能交联剂与抗体上的游离氨基偶联的pH范围是7.5-10，例如约8.0。在一些实施方案中，异源双功能交联剂在pH为约7.0时与亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)上引入的巯基反应的速度是与抗体上的氨基反应速度的1000倍，在pH为约8.0时异源双功能交联剂与抗体上的游离氨基的反应更加明显。

在一些具体的实施方案中，上述异源双功能交联剂是Sulfo-SMCC。

在一些实施方案中，步骤(2)中，所述引入巯基的亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)先与抗体混合并反应30min-2h，例如约1h，加入脱酰溶液并反应1-3h，例如约2h，用pH约7.0的PBS缓冲液洗涤并重悬浮，加入异源双功能交联剂并在室温下反应10min至1小时，例如20min至40min，例如约30min，用pH约8.0的PBS缓冲液洗涤并重悬浮，继续反应30min-2h，例如约1h。

在一些实施方案中，所述方法还包括封闭和酸洗偶联产物的步骤。在一些实施方案中，封闭步骤包括：在室温下，使偶联产物与乙醇胺反应30min-1h，例如约45min，然后用醋酸缓冲液冲洗偶联产物，冲洗滤液可任选地中和后用于抗体回收，偶联产物然后用PBS缓冲液冲洗并重悬浮，得到所述亲和层析填料。

在一些实施方案中，乙醇胺溶液的浓度为1-10％(v/v)，例如约6％(v/v)。在一些实施方案中，乙醇胺溶液的pH为约8.0。乙醇胺溶液用于封闭偶联产物上多余的磺基琥珀酰亚胺。

在一些实施方案中，醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为约4.4。醋酸缓冲液用于洗脱未被异源交联剂固定的抗体。

在一些实施方案中，偶联产物与PBS的体积比为1:2至1:5，例如约1:2或约1:3。

本发明还提供了一种检测真菌毒素的方法，其包括使用本发明的亲和层析填料对真菌毒素进行色谱分析。本发明还提供了前述任一种亲和层析填料在用于检测真菌毒素中的用途。

在一些实施方案中，所述亲和层析填料中的抗体是特异性结合所述真菌毒素的抗体。

与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：

1)本发明提供的亲和层析填料，其抗体通过异源双功能交联剂与亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)共价偶联，使得抗体与亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)牢牢固定，即使含酸性有机相溶剂(例如醋酸)洗脱，抗体也毫无泄露，保证了洗脱液中小分子毒素测定的准确性；经实验发现，这种亲和层析填料对抗原(例如真菌毒素)的结合活性高，并且检测准确性高；

2)采用异源双功能交联剂有序进行交联，避免了IgG抗体的Fab段的氨基被同源的交联剂过度修饰，充分保证了抗体抗原结合域的活性；

3)本发明提供的制备亲和层析填料的方法，通过异源双功能交联剂与亲和配体(例如蛋白A或蛋白G)共价偶联，未被异源交联剂固定的抗体经酸洗下来后可被重复再利用，节约了宝贵的抗体资源，使得IAC柱的生产成本大大降低，因此能够节约抗体资源、显著提高了抗体利用率(例如抗体的利用率高达63％以上)，降低了生产成本，提高了偶联抗体的利用价值。

当然，实施本发明的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1是实施例1的亲和层析填料制备的路线图。

具体实施方式

定义

为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本公开中的它处另有明确定义，否则本公开使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

天然蛋白A是从A型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分离而得的一种细胞壁蛋白，其具有不在抗原结合点而与免疫球蛋白Fc结合的性质。本文中，术语“蛋白A”是包括天然蛋白A、重组蛋白A及其类似物或衍生物；其中蛋白A类似物是与天然蛋白A具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列一致性的多肽，或者相对于天然蛋白A包含一个或多个氨基酸替换、缺失或添加；蛋白A衍生物为具有至少一种化学修饰(例如巯基化修饰)的天然蛋白A、重组蛋白A或蛋白A类似物。蛋白类似物和衍生物均保留其与抗体(例如IgG Fc)的结合活性。

天然蛋白G是G型链球菌分离而得的一种细胞壁蛋白，其N-端部分为白蛋白结合域，C-端部分是IgG结合域和细胞壁结合域。本文中，术语“蛋白G”是包括天然蛋白G、重组蛋白G及其类似物或衍生物；其中蛋白G类似物是与天然蛋白G具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列一致性的多肽，或者相对于天然蛋白G包含一个或多个氨基酸替换、缺失或添加；蛋白G衍生物为具有至少一种化学修饰(例如巯基化修饰)的天然蛋白G、重组蛋白G或蛋白G类似物。蛋白类似物和衍生物均保留其与抗体(例如IgG Fc)的结合活性。

本文中，术语“异源双功能交联剂”是指能够靶向不同蛋白质上的不同官能基团，以实现更大的变异性或特异性交联的交联剂。例如，在一些实施方案中，异源双功能交联剂分别与蛋白A或蛋白G上引入的巯基和抗体上的游离氨基反应实现蛋白A或蛋白G与抗体的偶联。

本公开所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，例如，“约”指至多±20％的误差范围。

实施例

以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1亲和层析填料的制备方法

1、凝胶中游离氨基的测定

采用三硝基苯磺酸(TNBS)法测定蛋白中自由氨基的数目(主要是赖氨酸)，TNBS与蛋白表面的赖氨酸ε-氨基发生反应，该反应生成三硝基苯衍生物，其在424nm处有特征吸收峰，通过该反应可以确定蛋白质中自由氨基数目。以BSA中游离氨基数作为标准工作曲线(按每分子BSA有60个游离氨基计)，将BSA配置成一系列浓度，加入硼酸缓冲液及TNBS溶液，混匀后反应，在424nm处测定OD值，以此来计算蛋白A中游离氨基的数目，即为可导入巯基的数目。具体操作步骤如下：

①配制BSA(sigma)标准工作溶液，称取20mgBSA粉末溶于20mL去离子水中，配制成浓度为1mg/mL的BSA水溶液。用紫外分光光度计测定260nm及280nm下的吸光度值，根据公式计算其实际蛋白含量，公式如下：

C_蛋白＝1.45×A_280nm－0.74×A_260nm

式中：A_280nm——蛋白在280nm波长处的吸光度值，

A_260nm——蛋白在280nm波长处的吸光度值。

②配制BSA标准工作曲线，分别取上述标准工作溶液1mL，2mL，3mL，4mL，5mL于5mL容量瓶中，加去离子水定容至刻度线，混匀，即为标准工作曲线。

③取5支玻璃试管，每支试管中分别加入1mL硼酸缓冲液(0.1M，pH8.5)，1mL 0.1％TNBS(将5％TNBS取300uL+14.7mL水稀释，即为0.1％TNBS)。混匀，放于水浴锅中，40℃反应100min。

④用紫外分光光度计在424nm处测定每个浓度下BSA溶液的OD值(参比：1mL 0.1％TNBS，1mL buffer，1mL水同样条件反应)。

⑤测样，取1mL样品(纯净水透析，浓度1mg/mL)+1mL硼酸缓冲溶液+1mL TNBS，在上述同样条件下进行测试。

2、保护性巯基的导入

蛋白A本身很少或不含自由巯基，因此采用SATA将保护性巯基引入到蛋白中，SATA是一种硫醇试剂，它可以通过末端NHS酯键与蛋白A上氨基结合，且乙酰化的巯基通过羟胺的作用脱乙酰化可以暴露出巯基，这种方法因为需要一个脱乙酰化的过程，因此保护了巯基使其能够长期保存而不被再氧化。

①配制PBS溶液，用盐酸调节pH为7.4，0.22μm滤膜过滤。

②配制SATA溶液，称取500mg SATA溶解在3.33mL DMSO里，浓度为150mg/mL(即0.65mol/L)。

③取蛋白A凝胶混悬液(保护液为20％乙醇水，凝胶与保护液体积比为1:1)，抽滤去除保护液，用pH7.4 PBS缓冲溶液洗涤凝胶2-3次，然后将凝胶转移出来，并重悬浮至一定体积。

④加入配制好的SATA溶液，25℃垂直混匀器上反应30min。

⑤反应结束后抽滤去除未反应及已水解的SATA，用PBS冲洗凝胶2-3次，然后用PBS重悬浮凝胶，定容至一定体积，4℃保存备用。

3、抗体偶联

采用异源双功能交联剂Sulfo-SMCC偶联抗体与蛋白A，Sulfo-SMCC一端连接抗体上氨基，一端连接蛋白A上引入的巯基。Sulfo-SMCC的马来酰亚胺端与巯基偶联的pH范围为6.5-7.5，尤其在pH7.0时，与巯基端反应的速度比与氨基反应的速度1000倍，但是，在碱性pH8.0情况下，与氨基反应变得更加明显。

①脱酰溶液的配制(现配现用)：准确称取1.74g盐酸羟胺和0.365gEDTA二钠溶解于40mL PBS缓冲液中，用NaOH调节pH为7.2，加水至终体积为50mL(即0.5mol/L)。

②Sulfo-SMCC溶液配制：准确称取10mg sulfo-SMCC溶解于50mLPBS缓冲溶液中，震荡混匀，即为0.2mg/mL的SMCC溶液，4℃保存待用。

③取已导入保护性巯基的凝胶混悬液，加入已纯化好的抗体，25℃垂直混匀器上反应1h。

④加入脱酰溶液，在垂直混匀器上继续反应2h，使得巯基全部脱保护。

⑤抽滤掉反应液，用pH7.0的PBS冲洗凝胶2-3次后重悬浮至起始体积。

⑥加入双功能异源交联剂Sulfo-SMCC溶液，在垂直混匀器上继续反应30min。

⑦抽滤掉反应液，用pH8.0的PBS冲洗凝胶2-3次，再重悬浮至起始体积，继续在垂直混匀器上反应1h。

4、封闭和酸洗

①乙醇胺溶液的配制：取12mL乙醇胺，用水定容至200mL，调节pH至8.0，用0.22μm滤膜过滤。

②0.2M pH4.4醋酸缓冲液的配制：称取27.2g三水合醋酸钠，用水定容至1L，0.22μm滤膜过滤；取11.5mL冰醋酸，加水定容至1L，0.22μm滤膜过滤；取370mL0.2M醋酸钠溶液，加入630mL0.2M醋酸溶液，混匀，即为0.2M pH4.4醋酸缓冲液。

③取偶联好抗体的凝胶溶液，抽滤掉反应液，用乙醇胺溶液冲洗凝胶1-2次，再用乙醇胺溶液重悬浮至起始体积，垂直混匀仪上室温反应时间45min。

④反应结束，抽滤掉反应液，将凝胶用2-3倍体积的pH4.4醋酸缓冲液冲洗，收集滤液用Tris溶液中和，回收未结合的抗体。而后立即用大量的PBS冲洗凝胶并重悬浮至一定体积，凝胶与PBS体积比为1:2或1:3，即为制备好的凝胶悬浮液，4℃保存待用。

⑤用紫外分光光度计测定醋酸冲洗下来的抗体溶液浓度，在260nm及280nm处分别测定吸光度值，按照步骤1中公式计算酸洗下来抗体浓度。

5、装柱检测

①取适量凝胶混悬液，装入亲和柱柱管内，装上上下筛板、上下堵头，制备成免疫亲和凝胶柱。

②取毒素标品，用10％甲醇水稀释至一定浓度，过免疫亲和柱，用水清洗去杂，甲醇洗脱，用高效液相色谱测定流出液、去杂液及洗脱液中毒素含量，计算柱容量。

③根据加入抗体量及酸洗下来抗体量计算出每支凝胶柱理论柱容量，理论柱容量与实际柱容量之比即为抗体利用率。

实施例2.ZEN免疫亲和凝胶柱的制备

本实施例中所采用的实验材料如下：

标准品：玉米赤霉烯酮(ZEN)粉末，纯度＞98％，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；

柱管：货号AC-3ml，东莞睿博远识生物过滤技术有限公司；

抗体：抗ZEN抗体(纯度≥99％，浓度10mg/mL，抗体亚型为IgG_2a)，无锡创谱生物科技有限公司；

蛋白A-凝胶：结合人IgG最大载量44mg/mL，粒径40-120μm，4％琼脂糖凝胶，常州天地人和生物科技有限公司。

实验步骤：

a.取10mL蛋白A凝胶混悬液(凝胶体积5mL)，抽滤，用PBS缓冲溶液洗涤凝胶2-3次，然后用PBS重悬浮凝胶并定容至10mL。

b.加入1.5mL 0.65mol/L SATA溶液(SATA与游离氨基摩尔比为5:1)，25℃垂直混匀器上反应30min。

c.抽滤，用PBS缓冲溶液洗涤凝胶2-3次，然后用PBS缓冲液重悬浮凝胶至10mL。

d.加入25mg ZEN抗体，垂直混匀器上反应1h，加入1mL 0.5mol/L脱酰溶液，反应2h，抽滤，用pH7.0的PBS洗2遍并重悬浮至10mL。

e.加入7.5mL 0.2mg/mL的Sulfo-SMCC溶液(SMCC与抗体摩尔比为20:1)，室温反应30min，抽滤，用pH8.0的PBS洗两遍并重悬浮至10mL，再继续反应1h。

f.抽滤，用乙醇胺溶液冲洗凝胶，并重悬浮至10mL，再反应45min。

g.抽滤，用pH4.4的醋酸缓冲液冲洗，收集滤液中和，测定蛋白浓度。

h.立即用10倍体积的PBS冲洗凝胶2-3次并重悬浮至10mL，即为制备好的ZEN免疫亲和填料。

i.取0.2mLZEN免疫亲和凝胶悬液，装入上下筛板，上下堵头，制备成免疫亲和凝胶柱。

j.本实验重复进行3次，每次制成的凝胶柱取3支做柱容测试。

实施例3.ZEN免疫亲和柱柱容量测定

a.标准储备液制备

用移液管准确移取0.5mL 20.52μg/mL ZEN标(GBW(E)100301，国家粮食局科学研究院，纯度≥99％)到5mL容量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度线，振摇15min，配成浓度为2052ng/mL的ZEN标准储备液。

b.标准工作曲线制备

用移液管分别移取适量ZEN标准储备液到5mL容量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度线，振摇15min，配成浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL的ZEN系列标准工作液，HPLC检测用。

c.测试工作液制备

取ZEN粉末标，用10％甲醇-水溶解，配制成浓度约为100ng/mL的ZEN测试工作液。

d.柱容量测定

将一次性20mL注射器连接于亲和柱上部，准确移取10mLZEN测试工作液注入注射器中，以1滴/2秒的速度缓慢通过亲和柱(收集流出液)；用20mL水淋洗去杂，流速2滴/秒(收集去杂液)，直至2～3mL空气通过柱体，保证柱内无残余液体；准确加入2.0mL甲醇洗脱，自然重力流，直至2～3mL空气通过柱体，收集全部洗脱液，过0.22μm滤膜，HPLC测定。

e.色谱条件

色谱柱：C18-H柱(250mm*4.6mm*5μm)；

岛津RF-20A_xs荧光检测器，激发波长274nm，发射波长440nm；

流动相：乙腈-水(60:40)，等度洗脱；

流速：1.0mL/min；

柱温：35℃；

进样体积：20μL。

f.柱容量及抗体利用率计算

表1.HPLC测定的柱容量结果

经紫外分光光度计测定酸洗抗体浓度，计算出单支柱理论柱容量及抗体利用率，结果如表2所示：

表2.单支柱理论柱容量及抗体利用率

Claims

1.一种亲和层析填料，其包括：

(a)抗体；和

(b)亲和配体-基质偶联物；

其中所述抗体与所述亲和配体-基质偶联物中的亲和配体通过异源双功能交联剂偶联，所述亲和配体是蛋白A或蛋白G。

2.如权利要求1所述的亲和层析填料，其中，所述蛋白A是经巯基化修饰的天然蛋白A、重组蛋白A或蛋白A类似物，其中蛋白A类似物是与天然蛋白A具有至少70％序列一致性的多肽；

所述蛋白G是经巯基化修饰的天然蛋白G、重组蛋白G或蛋白G类似物，其中蛋白G类似物是与天然蛋白G具有至少70％序列一致性的多肽；

优选地，所述异源双功能交联剂分别与亲和配体上引入的巯基和抗体上的游离氨基反应实现亲和配体与抗体的偶联。

3.如权利要求1或2所述的亲和层析填料，其中，所述异源双功能交联剂选自磺基琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(Sulfo-SMCC)、m-苯甲酰马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS)、N[γ-马来酰亚胺氧化丁醛]琥珀酰亚胺(GMBS)、琥珀酰亚胺4-[N-甲基马来酸]-1-羧环己烷(SMCC)、琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸(SMPB)、m-苯甲酰马来酰亚胺-N-羟基磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-MBS)、N[γ-马来酰亚胺氧化丁醛]磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-GMBS)、磺基琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸(Sulfo-SMPB)，优选为Sulfo-SMCC。

4.如权利要求1或2所述的亲和层析填料，其中，所述基质选自琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、琼脂糖和葡聚糖复合凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯凝胶、聚甲基丙烯酸甲酯凝胶、多孔二氧化硅、玻璃纤维、和二氧化钛，优选为琼脂糖凝胶。

5.如权利要求1或2所述的亲和层析填料，其中，所述抗体是IgG抗体，

优选地，所述抗体是特异性结合真菌毒素的单克隆抗体；

更优选地，所述真菌毒素选自玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素(例如黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素(例如赭曲霉毒素A)、单端孢霉烯族毒素、杂色曲霉素、和伏马毒素。

6.一种制备如权利要求1至5中任一项所述的亲和层析填料的方法，其包括：

使所述抗体与所述亲和配体-基质偶联物混合并反应，然后加入异源双功能交联剂进行偶联，得到偶联产物。

7.如权利要求6所述的方法，其包括：

(2)使所述抗体与巯基化亲和配体-基质偶联物混合并反应，然后加入异源双功能交联剂进行偶联，得到偶联产物；

优选地，所述异源双功能交联剂与巯基化亲和配体-基质偶联物偶联的pH范围是6.5-7.5，所述异源双功能交联剂与抗体上的游离氨基偶联的pH范围是7.5-10。

8.如权利要求6或7所述的方法，所述方法还包括封闭和酸洗所述偶联产物的步骤；优选地，封闭和酸洗步骤包括：在室温下，使偶联产物与乙醇胺反应30min-1h；醋酸缓冲液冲洗，PBS缓冲液冲洗并重悬浮，得到所述亲和层析填料。

9.如权利要求7所述的方法，所述硫醇试剂是SATA；优选地，硫醇试剂与亲和配体-基质偶联物中游离氨基的摩尔比为2:1至20:1，更优选5:1。

10.一种检测真菌毒素的方法，其包括使用如权利要求1至5中任一项所述的亲和层析填料对真菌毒素进行净化和富集，再使用色谱法，优选高效液相色谱进行检测。