CN108479114A - 一种腹泻性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种腹泻性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途，首先将采用环氧氯丙烷活化法活化的琼脂糖凝胶作为载体，然后将基因重组蛋白G偶联到载体上，得到了蛋白G‑sepharose，再将腹泻性贝类毒素抗体连接到蛋白G‑sepharose上，得到了抗体—蛋白G—sepharose，再用交联剂进行交联，得到了抗体—蛋白G—sepharose填料，最后将抗体—蛋白G—sepharose填料装柱后形成了高纯度和亲和力的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，充分利用基因重组蛋白G与腹泻性贝类毒素抗体特异性结合的特点，腹泻性贝类毒素抗体的Fab片段暴露在外，大幅度提高了基因重组蛋白G的抗体结合能力、腹泻性贝类毒素的捕捉能力和腹泻性贝类毒素的纯化效率。
Description
技术领域：
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种腹泻性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途。
背景技术：
亲和柱是将与纯化对象有专一结合作用的物质连接在不溶性载体上，制成亲和吸附剂后所装的柱，多用做亲和层析。
海洋中分布很广的一些赤潮生物可以分泌腹泻性贝类毒素，这种毒素通过食物链在各营养级生物之间传递和累积，如果误食了染毒的贝类，就会出现腹泻、恶心、呕吐等中毒症状，中毒的主要症状为腹泻和呕吐，所以又称为腹泻性贝类中毒；又由于DSP中毒事件大多是由于食用贝类引起的，故将这种藻毒素称为“贝毒”，部分DSP产毒藻可以形成赤潮，产毒藻的爆发性增长或聚集会导致海水中和食用贝类中的DSP毒素含量升高，因而，大规模的DSP中毒事件多与有毒赤潮有关，DSP可引起人类多种不适反应，对人的最小中毒量为12～18Mu(1Mu相当于3.2ug DTX-1)，DSP的毒性为LD50＝192×10-9，日本厚生省规定，贝类可食部分的毒力不得超过0.05Mug，美国、加拿大和欧洲一些国家规定DSP贝毒的允许剂量小于80ug/100g贝类组织；腹泻性贝类中毒与贝类生长环境中生长的浮游生物有关，特别与赤潮生物鳍藻有关，在赤潮区水体生长的贝类很容易积累腹泻性贝类毒素，腹泻性贝毒也是一类重要的赤潮藻毒素。在日本和欧洲发生过多次食用贝类中毒事件，主要中毒症状除腹泻、呕吐外，还伴随有恶心、腹痛、头痛，中毒者的潜伏期，根据食用有毒贝类量的多少有所差异，有的不足30min，有的长达14h，中毒者一般在48h内恢复健康，腹泻性贝类毒素主要作用于酶系统，为肿瘤促进剂。迄今为止，研究人员利用现代化学分离和分析技术，从受有毒赤潮生物污染的贝类体内和有毒赤潮生物细胞中，已分离出了12种腹泻性贝毒毒素成分，根据这些毒素的碳骨架结构，可以将它们分为三组：①酸性成分，软海绵酸(okadaic acid)和其天然衍生物轮状鳍藻毒素(dinophysistoxin，DTX)，软海绵酸是C38聚醚脂肪酸衍生物，鳍藻毒素1(DTXl)是35一甲基软海绵酸，鳍藻毒素3(DTX3)则为7一一酰基一35一甲基软海绵酸；②中性成分，蛤毒素(pectenotoxin，PTX)，包括蛤毒素1～6，它们均有着相同的大环内酯的碳骨架结构，差异在C4上；③其他成分，包括扇贝毒素和45一羟基扇贝毒素，它们的化学结构与从短裸甲藻中分离的短裸甲藻毒素结构相似，由彼此相连的醚环组成，并呈梯形，含有的硫酸酯基团是它的特征。腹泻性贝类毒素主要来源于可以形成赤潮的甲藻，如鳍藻属的渐尖鳍藻(Dinophysis cuminata)、具尾鳍藻(D.caudata)、倒卵形鳍藻(D.fortic)、D.acuta、D.mitra、D.norvegica等以及原甲藻属的利张原甲藻(Prorocentrumlima)和小原甲藻(P.minimMm)等。
腹泻性贝类毒素常用的检测方法有小鼠生物法、液相色谱法和酶联免疫吸附分析法，小鼠生物检测是由Yasumoto等建立的,用丙酮提取贝类中毒素经减压浓缩蒸干,再以1％吐温-60生理盐水溶解残留物,腹腔注射小白鼠,观察存活情况,计算其毒力，小鼠生物检测由于时间较长，不能确定毒素的组成成分,定量困难,假阳性高(通常是由脂肪酸引起),重现性差，已经很少使用了；液相色谱法是试样经甲醇提取，在碱性条件下水解释放出酯化态腹泻性贝类毒素，液相色谱分离，串联质谱法测定，进行定量分析，是目前为止应用最广泛的也最被认可的检测方法；酶联免疫吸附分析法主要是利用腹泻性贝类毒素的抗体与样品中抗原相互作用，通过显色反应来检测样本中的腹泻性贝类毒素，该方法使用方便，检测灵敏度高，但是由于检测样本复杂，基质较多，检测的假阳性几率很高。我国于2016年制定了贝类中腹泻性贝类毒素的测定标准(GB 5009.212—2016)，标准中规定采用小鼠生物法、酶联免疫吸附法液相色谱－串联质谱法和高效液相色谱法测定贝类产品中DSP。中国专利201320406851.7公开的一种腹泻性贝类毒素酶联免疫测试管试剂盒包括盒体和盒内的一包含有20根的测试管、23瓶试剂和放试剂的下凹瓶位，测试管是采用20根包被了羊抗鼠抗体的试管，所述的23瓶试剂分别为18瓶样品稀释液、1瓶腹泻型贝类毒素酶标记物、1瓶抗体工作液、1瓶显色液、1瓶终止液、1瓶标准液，所述试剂瓶都设有相应下凹瓶位；中国专利201210009803.4公开的一种腹泻性贝类毒素标准样品的制备方法包括以下步骤：A)将贝类样品去杂质取中肠腺；B)在所述中肠腺中加入蒸馏水，加入甲醇-丙酮-乙醚混合溶液，均质、混匀后得到匀浆液；C)将所述匀浆液预冷后进行冷冻干燥得到粗样；D)研磨所述粗样后过筛，得到贝类冻干粉；E)向所述贝类冻干粉中加入蒸馏水，加入甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液，混匀，预冷后再次进行冷冻干燥得到标准样品；F)封装所述标准样品；G)检验所述标准样品的均匀性和稳定性；H)对所述标准样品的DSP含量进行定值；其中，所述贝类样品包含DSP阳性或阴性的贝类样品；所述步骤B中甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液中甲醇：丙酮：乙醚体积比为3～6：2～5：1，所述混合溶液的体积量为加入蒸馏水的体积的1/10～1/5；蒸馏水的加入量与所述中肠腺等体积；所述步骤E中向所述贝类冻干粉中加入五倍体积蒸馏水，加入一倍体积的甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液；所述步骤E中甲醇-丙酮-乙醚的混合溶液中甲醇：丙酮：乙醚体积比为3～6：2～5：1。
对于腹泻性贝类毒素的液相色谱检测来说，样品采集和前处理是目前分析方法中的瓶颈，也是测定误差的主要来源，样品前处理分为提取和净化2个步骤，实验中大多采用固相萃取柱对样品提取液中的腹泻性贝类毒素进行净化，可以说样品的前处理技术是目前腹泻性贝类毒素分析研究的难点和热点之一。蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，具有很高的亲和力，抗体由两条重链和两条轻链构成，抗体分为Fab区和Fc区，其中，Fab区是抗原结合的区域，蛋白G与抗体结合后，抗体的Fab区域游离在外，不影响抗体的抗原结合能力。因此，需要研发设计一种操作简单和净化效率高的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，利用腹泻性贝类毒素特异性抗体对待检样本中的腹泻性贝类毒素进行分离和净化，很有社会和经济价值，应用前景广阔。
发明内容：
本发明的发明目的在于克服现有技术存在的缺点，设计一种腹泻性贝类毒素免疫亲和柱及其制备方法和用途，使亲和柱的结构简单，亲和柱的制备方法操作简便，亲和柱使用时的净化效率高。
为了实现上述目的，本发明涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的主体结构包括柱体、盖板、进样口、第一筛板、填料、第二筛板和出样口；圆管状结构的柱体的顶部设置有圆形片状结构的盖板，盖板的中心设置有圆管状结构的进样口，柱体的内部上部空间为空腔，柱体的内部中间设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第一筛板，柱体的内部下部空间填充有填料，柱体的底部设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第二筛板，第二筛板上设置有上宽下窄的锥形管状结构的出样口；填料为腹泻性贝类毒素抗体-蛋白G-sepharose填料。
本发明涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱制备方法的具体工艺过程包括活化、偶联、连接、交联和装柱共五个步骤：
(一)活化：用蒸馏水充分冲洗质量百分比浓度为2％的预溶胀琼脂糖凝胶sepharose2B，洗去琼脂糖凝胶sepharose2B中残存的乙醇，蒸馏水与琼脂糖凝胶sepharose2B的体积比为20:1，用漏斗过滤掉液体，得到湿凝胶，称取5克湿凝胶与7.5毫升摩尔质量为0.8M的NaOH水溶液、2毫升质量百分比浓度为30％的环氧氯丙烷水溶液和5毫升浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液在温度为25℃的条件下下进行8小时的摇床反应，反应结束后，用50毫升蒸馏水洗涤湿凝胶，洗去湿凝胶中混杂的环氧氯丙烷，完成琼脂糖凝胶sepharose2B的活化，活化后的琼脂糖凝胶sepharose2B作为载体备用；
(二)偶联：取1克载体用偶联缓冲液洗涤3次，将载体加入20毫升浓度为2mg/mL的基因重组蛋白G中在室温条件下偶联4小时，偶联缓冲液选取为pH值为8.9的摩尔质量为0.1M的NaHCO3水溶液和摩尔质量为0.8M的NaCl水溶液的混合液，将偶联后的载体用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤3次，得到偶联有基因重组蛋白G的琼脂糖凝胶sepharose2B，简称为蛋白G-sepharose；
(三)连接：将腹泻性贝类毒素抗体溶解于pH值为7.4和浓度为20mM的PBS中，得到10毫升浓度为2mg/mL的抗体，将蛋白G-sepharose用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤3次，PBS的每次使用量为30毫升，将抗体加入到洗涤过的蛋白G-sepharose中在室温条件下结合30分钟，得到连接有抗体的蛋白G-sepharose，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤连接有抗体的蛋白G-sepharose 3次，PBS的每次使用量为30毫升，连接有抗体的蛋白G-sepharose简称为抗体—蛋白G—sepharose；
(四)交联：用pH值为9.0和浓度为0.1M的硼酸缓冲液洗涤抗体—蛋白G—sepharose 3次，硼酸缓冲液的每次使用量为30毫升，在抗体—蛋白G—sepharose中加入pH值为9.0和浓度为0.1M的硼酸缓冲液以及交联剂，交联剂为庚二亚氨酸二甲酯，当抗体—蛋白G—sepharose的浓度为20mM时停止交联剂的加入，使抗体—蛋白G—sepharose、硼酸缓冲液和交联剂在室温条件下交联1小时，加入pH值为9.0和浓度为50mM的乙醇胺终止交联，并用浓度为50mM的乙醇胺封闭10分钟，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤交联后的抗体—蛋白G—sepharose 3次，得到抗体—蛋白G—sepharose填料；
(五)装柱：将用10毫升pH值为7.4和浓度为20mM的PBS重悬后的抗体—蛋白G—sepharose填料装入到柱体1的下部空间中，得到腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，完成腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的制备；抗体—蛋白G—sepharose填料的装入量根据需要制备的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的容量选取。
本发明涉及的琼脂糖凝胶能够被溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶或纤维素代替；腹泻性贝类毒素抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
本发明涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的用途包括净化和富集贝肉、粮食、水产和食品领域中的腹泻性贝类毒素。
本发明涉及的基因重组蛋白G的基因序列为GenBank CAA27638.1在大肠杆菌中表达出了与腹泻性贝类毒素抗体的高亲和力，基因重组蛋白G的1个分子的蛋白G可以结合3个分子的腹泻性贝类毒素抗体，并且只有腹泻性贝类毒素抗体能与基因重组蛋白G结合，其余抗体均不能与基因重组蛋白G结合，特异性高，以基因重组蛋白G为基础制备的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱具有特异性高，腹泻性贝类毒素结合量大，纯化效率高的特点。
本发明与现有技术相比，首先将采用环氧氯丙烷活化法活化的琼脂糖凝胶作为载体，然后将基因重组蛋白G偶联到载体上，得到了蛋白G-sepharose，再将腹泻性贝类毒素抗体连接到蛋白G-sepharose上，得到了抗体—蛋白G—sepharose，再用交联剂进行交联，得到了抗体—蛋白G—sepharose填料，最后将抗体—蛋白G—sepharose填料装柱后形成了高纯度和亲和力的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，充分利用基因重组蛋白G与腹泻性贝类毒素抗体特异性结合的特点，腹泻性贝类毒素抗体的Fab片段暴露在外，大幅度提高了基因重组蛋白G的抗体结合能力、腹泻性贝类毒素的捕捉能力和腹泻性贝类毒素的纯化效率；其亲和柱的结构简单，亲和柱制备方法操作简便，充分保证了抗体的抗原结合能力，亲和柱不需纯化处理即可直接用于高效液相色谱检测和荧光仪检测，降低了时间和经济成本。
附图说明：
图1为本发明实施例1涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的主体结构原理示意图。
图2为本发明实施例2涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱制备方法的流程框图。
具体实施方式：
下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步描述。
实施例1：
本实施例涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的主体结构包括柱体1、盖板2、进样口3、第一筛板4、填料5、第二筛板6和出样口7；圆管状结构的柱体1的顶部设置有圆形片状结构的盖板2，盖板2的中心设置有圆管状结构的进样口3，柱体1的内部上部空间为空腔，柱体1的内部中间设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第一筛板4，柱体1的内部下部空间填充有填料5，柱体1的底部设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第二筛板6，第二筛板6上设置有上宽下窄的锥形管状结构的出样口7；填料5为腹泻性贝类毒素抗体-蛋白G-sepharose填料。
实施例2：
本实施例涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱制备方法的具体工艺过程包括活化、偶联、连接、交联和装柱共五个步骤：
(一)活化：用蒸馏水充分冲洗质量百分比浓度为2％的预溶胀琼脂糖凝胶sepharose2B，洗去琼脂糖凝胶sepharose2B中残存的乙醇，蒸馏水与琼脂糖凝胶sepharose2B的体积比为20:1，用漏斗过滤掉液体，得到湿凝胶，称取5克湿凝胶与7.5毫升摩尔质量为0.8M的NaOH(氢氧化钠)水溶液、2毫升质量百分比浓度为30％的环氧氯丙烷水溶液和5毫升浓度为2mg/mL的NaBH4(硼氢化钠)水溶液在温度为25℃的条件下下进行8小时的摇床反应，反应结束后，用50毫升蒸馏水洗涤湿凝胶，洗去湿凝胶中混杂的环氧氯丙烷，完成琼脂糖凝胶sepharose2B的活化，活化后的琼脂糖凝胶sepharose2B作为载体备用；
(二)偶联：取1克载体用偶联缓冲液洗涤3次，将载体加入20毫升浓度为2mg/mL的基因重组蛋白G中在室温条件下偶联4小时，偶联缓冲液选取为pH值为8.9的摩尔质量为0.1M的NaHCO3(碳酸氢钠)水溶液和摩尔质量为0.8M的NaCl(氯化钠)水溶液的混合液，将偶联后的载体用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次，得到偶联有基因重组蛋白G的琼脂糖凝胶sepharose2B，简称为蛋白G-sepharose；
(三)连接：将腹泻性贝类毒素抗体溶解于pH值为7.4和浓度为20mM的PBS中，得到10毫升浓度为2mg/mL的抗体，将蛋白G-sepharose用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤3次，PBS的每次使用量为30毫升，将抗体加入到洗涤过的蛋白G-sepharose中在室温条件下结合30分钟，得到连接有抗体的蛋白G-sepharose，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤连接有抗体的蛋白G-sepharose 3次，PBS的每次使用量为30毫升，连接有抗体的蛋白G-sepharose简称为抗体—蛋白G—sepharose；
(四)交联：用pH值为9.0和浓度为0.1M的硼酸缓冲液洗涤抗体—蛋白G—sepharose 3次，硼酸缓冲液的每次使用量为30毫升，在抗体—蛋白G—sepharose中加入pH值为9.0和浓度为0.1M的硼酸缓冲液以及交联剂，交联剂为庚二亚氨酸二甲酯，当抗体—蛋白G—sepharose的浓度为20mM时停止交联剂的加入，使抗体—蛋白G—sepharose、硼酸缓冲液和交联剂在室温条件下交联1小时，加入pH值为9.0和浓度为50mM的乙醇胺终止交联，并用浓度为50mM的乙醇胺封闭10分钟，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤交联后的抗体—蛋白G—sepharose 3次，得到抗体—蛋白G—sepharose填料；
(五)装柱：将用10毫升pH值为7.4和浓度为20mM的PBS重悬后的抗体—蛋白G—sepharose填料装入到柱体1的下部空间中，得到腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，完成腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的制备；抗体—蛋白G—sepharose填料的装入量根据需要制备的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的容量选取。
实施例3：
本实施例涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱净化和富集贝肉中的腹泻性贝类毒素的具体工艺过程为：首先，在置有2.0g均质贝肉的一号50毫升具塞离心管中加入10毫升质量百分比浓度为80％的甲醇水溶液，涡旋振荡2min后超声提取10min，再以7000r/min的转速离心5min，将上清液移至二号50毫升具塞离心管中，再向一号50毫升具塞离心管中加入10毫升质量百分比浓度为80％的甲醇水溶液，涡旋振荡2min后超声提取10min，冷却至室温后，再以7000r/min的转速离心5min，再次将上清液移至二号50毫升具塞离心管中，移取5毫升上清液至三号50毫升离心管中后加入20毫升PBS对上清液进行稀释；其次，取出在室温条件下平衡30分钟后的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，将进样口3与注射器的针筒连接，注射器接入到气控操作架上，调节气控操作架的气泵压力，使三号50毫升离心管中的混合液经注射器流过腹泻性贝类毒素免疫亲和柱以实现三号50毫升离心管中的混合液的净化目的；然后，调节气控操作架的气泵压力，使6毫升质量百分比浓度为20％的甲醇水溶液以2-3滴/秒的流速经注射器流过腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，对腹泻性贝类毒素免疫亲和柱进行淋洗，待腹泻性贝类毒素免疫亲和柱内的残留液流净，取3毫升质量百分比为2％的氨水/甲醇溶液并使其以1滴/秒的流速经注射器流过腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，收集洗脱产物，将洗脱产物置于50℃的条件下用氮气吹干后用1毫升复溶溶液复溶成洗脱产物溶液，复溶溶液为2mmol/L乙酸铵溶液与乙腈构成的混合液；最后，将用0.22μm过滤器过滤后的洗脱产物溶液置于高效液相色谱中进行检测。
实施例4：
本实施例涉及的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱制备方法的具体工艺过程包括活化、偶联、连接、交联和装柱共五个步骤：
(一)活化：用蒸馏水充分冲洗质量百分比浓度为2％的预溶胀琼脂糖凝胶sepharose4B，洗去琼脂糖凝胶sepharose4B中残存的乙醇，蒸馏水与琼脂糖凝胶sepharose4B的体积比为20:1，用漏斗过滤掉液体，得到湿凝胶，称取5克湿凝胶与7.5毫升摩尔质量为0.8M的NaOH水溶液、2毫升质量百分比浓度为30％的环氧氯丙烷水溶液和5毫升浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液在温度为25℃的条件下下进行8小时的摇床反应，反应结束后，用50毫升蒸馏水洗涤湿凝胶，洗去湿凝胶中混杂的环氧氯丙烷，完成琼脂糖凝胶sepharose4B的活化，活化后的琼脂糖凝胶sepharose4B作为载体备用；
(二)偶联：按照每克载体配比30-200nmol基因重组蛋白G的比例取载体和基因重组蛋白G置于pH值为8.8的摩尔质量为0.1M的NaHCO3水溶液和摩尔质量为0.5M的NaCl水溶液构成的偶联缓冲液中偶联，当在室温条件下时，偶联2小时，当在4℃条件下时，偶联过夜，偶联产物与pH值为8.0的摩尔质量为1M的Tris.HCl(三(羟甲基)氨基甲烷)缓冲液在室温条件下反应2小时后用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤，得到偶联有基因重组蛋白G的琼脂糖凝胶sepharose4B，简称为蛋白G-sepharose；
(三)连接：将腹泻性贝类毒素抗体溶解于pH值为7.4和浓度为20mM的PBS中，得到10毫升浓度为2mg/mL的抗体，将蛋白G-sepharose用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤3次，PBS的每次使用量为30毫升，按照每克蛋白G-sepharose配比200nmol-1.2umol抗体的比例将抗体加入到洗涤过的蛋白G-sepharose中在室温条件下反应30分钟，得到连接有抗体的蛋白G-sepharose，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤连接有抗体的蛋白G-sepharose3次，PBS的每次使用量为30毫升，连接有抗体的蛋白G-sepharose简称为抗体—蛋白G—sepharose；
(四)交联：用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤抗体—蛋白G—sepharose，在抗体—蛋白G—sepharose中加入浓度为0.2M的三乙醇胺与浓度为20mM的二甲基庚二酸脂构成的pH值为9.0的交联剂在室温条件下反应1小时，加入pH值为7.4和浓度为20mM的乙醇胺终止反应，用含有质量百分比为0.01％的硫柳汞的pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤交联后的抗体—蛋白G—sepharose，得到抗体—蛋白G—sepharose填料；
(五)装柱：将抗体—蛋白G—sepharose填料装入到柱体1的下部空间中，得到腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，置于4℃的环境中保存，完成腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的制备；抗体—蛋白G—sepharose填料的装入量根据需要制备的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的容量选取。
Claims (6)
1.一种腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，其特征在于主体结构包括柱体、盖板、进样口、第一筛板、填料、第二筛板和出样口；圆管状结构的柱体的顶部设置有圆形片状结构的盖板，盖板的中心设置有圆管状结构的进样口，柱体的内部上部空间为空腔，柱体的内部中间设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第一筛板，柱体的内部下部空间填充有填料，柱体的底部设置有开设有筛孔的圆形片状结构的第二筛板，第二筛板上设置有上宽下窄的锥形管状结构的出样口；填料为腹泻性贝类毒素抗体-蛋白G-sepharose填料。
2.一种腹泻性贝类毒素免疫亲和柱制备方法，其特征在于具体工艺过程包括活化、偶联、连接、交联和装柱共五个步骤：
(一)活化：用蒸馏水充分冲洗质量百分比浓度为2％的预溶胀琼脂糖凝胶sepharose2B，洗去琼脂糖凝胶sepharose2B中残存的乙醇，蒸馏水与琼脂糖凝胶sepharose2B的体积比为20:1，用漏斗过滤掉液体，得到湿凝胶，称取5克湿凝胶与7.5毫升摩尔质量为0.8M的NaOH水溶液、2毫升质量百分比浓度为30％的环氧氯丙烷水溶液和5毫升浓度为2mg/mL的NaBH4水溶液在温度为25℃的条件下下进行8小时的摇床反应，反应结束后，用50毫升蒸馏水洗涤湿凝胶，洗去湿凝胶中混杂的环氧氯丙烷，完成琼脂糖凝胶sepharose2B的活化，活化后的琼脂糖凝胶sepharose2B作为载体备用；
(二)偶联：取1克载体用偶联缓冲液洗涤3次，将载体加入20毫升浓度为2mg/mL的基因重组蛋白G中在室温条件下偶联4小时，偶联缓冲液选取为pH值为8.9的摩尔质量为0.1M的NaHCO3水溶液和摩尔质量为0.8M的NaCl水溶液的混合液，将偶联后的载体用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤3次，得到偶联有基因重组蛋白G的琼脂糖凝胶sepharose2B，简称为蛋白G-sepharose；
(三)连接：将腹泻性贝类毒素抗体溶解于pH值为7.4和浓度为20mM的PBS中，得到10毫升浓度为2mg/mL的抗体，将蛋白G-sepharose用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤3次，PBS的每次使用量为30毫升，将抗体加入到洗涤过的蛋白G-sepharose中在室温条件下结合30分钟，得到连接有抗体的蛋白G-sepharose，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤连接有抗体的蛋白G-sepharose 3次，PBS的每次使用量为30毫升，连接有抗体的蛋白G-sepharose简称为抗体—蛋白G—sepharose；
(四)交联：用pH值为9.0和浓度为0.1M的硼酸缓冲液洗涤抗体—蛋白G—sepharose 3次，硼酸缓冲液的每次使用量为30毫升，在抗体—蛋白G—sepharose中加入pH值为9.0和浓度为0.1M的硼酸缓冲液以及交联剂，交联剂为庚二亚氨酸二甲酯，当抗体—蛋白G—sepharose的浓度为20mM时停止交联剂的加入，使抗体—蛋白G—sepharose、硼酸缓冲液和交联剂在室温条件下交联1小时，加入pH值为9.0和浓度为50mM的乙醇胺终止交联，并用浓度为50mM的乙醇胺封闭10分钟，用pH值为7.4和浓度为20mM的PBS洗涤交联后的抗体—蛋白G—sepharose 3次，得到抗体—蛋白G—sepharose填料；
(五)装柱：将用10毫升pH值为7.4和浓度为20mM的PBS重悬后的抗体—蛋白G—sepharose填料装入到柱体1的下部空间中，得到腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，完成腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的制备；抗体—蛋白G—sepharose填料的装入量根据需要制备的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱的容量选取。
3.一种腹泻性贝类毒素免疫亲和柱用途，其特征在于包括净化和富集贝肉、粮食、水产和食品领域中的腹泻性贝类毒素；净化和富集贝肉中的腹泻性贝类毒素的具体工艺过程为：首先，在置有2.0g均质贝肉的一号50毫升具塞离心管中加入10毫升质量百分比浓度为80％的甲醇水溶液，涡旋振荡2min后超声提取10min，再以7000r/min的转速离心5min，将上清液移至二号50毫升具塞离心管中，再向一号50毫升具塞离心管中加入10毫升质量百分比浓度为80％的甲醇水溶液，涡旋振荡2min后超声提取10min，冷却至室温后，再以7000r/min的转速离心5min，再次将上清液移至二号50毫升具塞离心管中，移取5毫升上清液至三号50毫升离心管中后加入20毫升PBS对上清液进行稀释；其次，取出在室温条件下平衡30分钟后的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，将进样口3与注射器的针筒连接，注射器接入到气控操作架上，调节气控操作架的气泵压力，使三号50毫升离心管中的混合液经注射器流过腹泻性贝类毒素免疫亲和柱以实现三号50毫升离心管中的混合液的净化目的；然后，调节气控操作架的气泵压力，使6毫升质量百分比浓度为20％的甲醇水溶液以2-3滴/秒的流速经注射器流过腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，对腹泻性贝类毒素免疫亲和柱进行淋洗，待腹泻性贝类毒素免疫亲和柱内的残留液流净，取3毫升质量百分比为2％的氨水/甲醇溶液并使其以1滴/秒的流速经注射器流过腹泻性贝类毒素免疫亲和柱，收集洗脱产物，将洗脱产物置于50℃的条件下用氮气吹干后用1毫升复溶溶液复溶成洗脱产物溶液，复溶溶液为2mmol/L乙酸铵溶液与乙腈构成的混合液；最后，将用0.22μm过滤器过滤后的洗脱产物溶液置于高效液相色谱中进行检测。
4.根据权利要求2所述的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱制备方法，其特征在于琼脂糖凝胶能够被溴化氰活化的琼脂糖凝胶、交联的琼脂糖凝胶、聚丙烯酸琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶或纤维素代替；腹泻性贝类毒素抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱制备方法，其特征在于基因重组蛋白G的基因序列为GenBank CAA27638.1在大肠杆菌中表达出了与腹泻性贝类毒素抗体的高亲和力，基因重组蛋白G的1个分子的蛋白G可以结合3个分子的腹泻性贝类毒素抗体，并且只有腹泻性贝类毒素抗体能与基因重组蛋白G结合，其余抗体均不能与基因重组蛋白G结合，特异性高，以基因重组蛋白G为基础制备的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱具有特异性高，腹泻性贝类毒素结合量大，纯化效率高的特点。
6.根据权利要求2所述的腹泻性贝类毒素免疫亲和柱制备方法，其特征在于所述琼脂糖凝胶sepharose2B替换为琼脂糖凝胶sepharose4B。
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