CN105618013A - 一种以硅胶为基质的凝集素高效亲和色谱材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及亲和材料制备技术领域，是一种以硅胶为基质，合成含有双官能团的间隔臂修饰硅胶，制备出含有高键合量的凝集素亲和材料。其结构特征在于：以硅胶为基质，间隔臂末端含有环氧、羟基、羧基、异氰基、醛基等官能团，配基为凝集素。本发明制备凝集素亲和材料的步骤简捷，条件温和、成本低、键合量高、凝集素的性质稳定、且良好的保持了凝集素的活性，可广泛应用于糖蛋白和糖肽的分离和富集。

Description

一种以硅胶为基质的凝集素高效亲和色谱材料的制备方法

技术领域

本发明涉及亲和材料的制备技术，主要为凝集素亲和材料的制备方法，涉及到间隔臂的合成，以及凝集素亲和材料的制备。

背景技术

蛋白质的糖基化是蛋白质翻译后修饰中最重要的修饰之一，生物体中50％以上的蛋白质是糖基化的，糖蛋白参与了细胞免疫，信号传导，蛋白质的翻译调控、癌症等生理过程，在生命体中起着重要的作用(Syntheticglycopeptidesandglycoproteinsastoolsforbiology,Chem.Soc.Rev.,2005,34,58-68；Cancerglycanbiomarkersandtheirdetection–past,presentandfuture,Anal.Methods,2014,6,3918-3936)。正因为疾病中存在着异常的糖基化现象(ElucidationofN-GlycositesWithinHumanPlasmaGlycoproteinsforCancerBiomarkerDiscovery,MassSpectrometryofGlycoproteins,2013,951,307-322)，如岩藻糖增多而唾液酸下降(Fucoseandsialicacidexpressionsinhumanseminalfibronectinandα1-acidglycoproteinassociatedwithleukocytospermiaofinfertilemen,DiseaseMarkers，2011,31,317-325)，半乳糖的升高均与疾病相关(DifferentialGlycomicsofEpithelialMembraneGlycoproteinsfromUrinaryExovesiclesRevealsShiftstowardComplex-TypeN-GlycosylationinClassicalGalactosemia,JournalofProteomeResearc，2012,11,906-916)，所以分析蛋白质的糖基化可以为疾病的临床诊断提供一种方法。

亲和色谱是糖蛋白的分离分析中常用的一种方法。亲和色谱法的突出特点是可对天然生物活性物质进行高特效性的分离和纯化，具有高浓缩效应，可从大量样品基体中分离纯化出所希望获取的少量生物活性物质。这种特效性的产生，是由于在亲和固相基体上，键合连接了特异性的配位体。此配位体的特效官能团可与被分离的生物分子生成具有镶嵌结构的络合物，存在着特效、可逆的分子间相互作用，依据生物识别原理，再利用具有恰当组成、可使镶嵌络合物解离的流动相，经过简单的洗脱步骤，就可实现对目标分子的高纯度、高产率的分离。常见的富集糖蛋白的亲和色谱材料为特异性抗原抗体材料，凝集素亲和材料，硼亲和材料等。

凝集素(Lectin)是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红细胞，故名凝集素，亦称外源凝集素。除红细胞外，还能凝集淋巴细胞、纤维细胞、精子等。常用的为植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如伴刀豆素A(Conconvalina,ConA)、麦胚素(Wheatgermagglutinin,WGA)、花生凝集素(Peanutagglutinin,PNA)和大豆凝集素(Soybeanagglutinin,SBA)等，凝集素(Lectin)是其总称。凝集素在动，植物体内广泛存在。迄今为止，已发现的植物凝集素有1000多种。凝集素最大的特点是能识别糖蛋白、糖脂、特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的糖基。一种凝集素具有只对某一种特异性糖基专一性结合的能力。人们逐渐将发现的凝集素发展成强有力的工具来纯化、分离、分析糖蛋白，并将其用于分析组织、细胞和蛋白质的糖结构。

亲和色谱材料的制备及使用中存在的问题。(1)亲和色谱固定相有基体、间隔臂、配位体三部分构成。由于用作基体的载体材料种类繁多；间隔臂具有亲水或疏水性质、长度可以调节；配位体与目标分子作用机理模式多样，因此亲和色谱固定相的制备比其它色谱固定相的制备要复杂，不仅制备程序冗长，且每步键合反应后需检测键合效果，其总体制备成本也较高。(2)常见的亲和材料为凝胶基质，不耐高压，限制了其在高效亲和色谱中的应用，而采用硅胶基质的材料容易解决抗压的问题，但是惰性的材料表面仍然存在非特异性作用，材料表面的电荷作用影响生物大分子和基质间的相互作用。

为提高糖蛋白的分离纯化效率，高效亲和色谱方法集中液相色谱和亲和色谱的优势，基于在硅胶基质上的化学改性引入亲和配基而得到的高效亲和色谱材料，并将其应用于糖蛋白的分离分析及制备中，为糖蛋白药物的分离纯化提供了一种参考。

发明内容

针对凝集素亲和色谱材料制备路线冗长复杂，凝集素的活性不能够很好的保持所存在的问题，本发明提供一种高效制备凝集素亲和材料的方法，主要涉及亲和材料间隔臂的合成，凝集素亲和材料的合成过程。操作步骤如下：

硅胶预处理：硅胶加入体积浓度为1～36％的盐酸或硝酸溶液中，加热回流搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，在100～160℃干燥6～10小时,后在80℃干燥6～12小时至恒重；

间隔臂末端含有官能团的硅烷化试剂的制备:惰气保护下，室温，氨基烷氧基(三甲氧基或者三乙氧基)硅烷试剂溶于含有双官能团试剂的极性非质子性溶剂中，电磁搅拌4～6小时，得到一端含有烷氧基硅烷的官能团，另一端含有环氧、羧基、醛基、异氰基、羟基等官能团的硅烷试剂；

硅烷试剂改性硅胶固定相的制备：惰气保护，将步骤a处理好的硅胶溶于有机溶剂中，加入步骤b得到的硅烷化试剂，加热回流，反应16～48小时；反应体系冷却至室温，减压过滤，依次用甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，固体产品在60～100℃下干燥12～24小时，得到末端含有环氧、羧基、醛基、异氰基、羟基等官能团的硅胶固定相；

凝集素键合硅胶亲和材料的制备：惰气保护，将上述干燥的硅胶加入无水有机溶剂或者不含有一级氨基的缓冲盐溶液中，用活化试剂活化官能团，比如用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基官能团，反应2～4小时后，减压抽滤固定相，用不含有一级氨基的缓冲盐溶液洗涤固定相，迅速重溶于不含有一级氨基的缓冲盐溶液中；惰气气氛保护下，将凝集素溶解于有特异性结合的糖的不含有一级氨基的缓冲盐溶液，并加入上述经过官能团活化的硅胶缓冲盐溶液中，4～25℃搅拌4～24小时，然后加入含有一级氨基的试剂，对未反应完全的活化基团封尾2～4小时，离心；取上层清液，应用BCA方法测凝集素的浓度，下层固定相用缓冲盐溶液洗涤至上层清液中无蛋白质的吸收，得到键合有凝集素的硅胶亲和材料。

惰气气氛为氮气、氩气、氦气中的一种或二种以上；

无水有机溶剂为无水N，N-二甲基酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO),

中的一种或两种以上。

本发明与现有技术相比具有以下特点：

1.凝集素材料性能稳定，易于保存。将合成的凝集素填料，放于含有NaN3的缓冲盐溶液中，在4℃的冰箱中保存，可存放12个月；

2.操作简单，所用溶剂均是中性的缓冲盐溶液，对环境无污染；

3.亲和材料中凝集素的键合量高，为90-100mg/g,键合率为90-97％；

4.键合强度高，所制备的凝集素亲和材料的耐受酸碱范围为4-8；

5.在应用的过程中凝集素的损失量小，键合时活性损失小，亲和材料在应用

一年至两年后，对比应用结果，亲和分离效果相同；

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做详细描述。

实施例1：

取5g硅胶，置于100mL玻璃圆底烧瓶中，加入50mL6M的盐酸加热回流1小时，水洗至中性，在150℃下干燥5小时。

氮气保护，取胺丙基三甲氧基硅烷试剂1.66g，溶于20mL无水处理的四氢呋喃溶液中，电磁搅拌，加入丁二酸酐1.027g，三乙胺调节pH值7，室温搅拌，液相色谱检测得到羧基化的硅烷试剂。

氮气保护，将干燥好的硅胶(2.00g),溶于30mL无水甲苯中，加入上述含有羧基官能团的硅烷试剂，并滴加吡啶(1mmol,80uL)，加热回流，反应12小时，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯、四氢呋喃、甲醇、水、甲醇洗涤，80℃下干燥固化6小时。

称量上述干燥的硅胶1.0g,氮气保护，溶于10mL无水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入100mMEDCI,200mMNHS,室温搅拌4小时，减压抽滤，并依次用30mLN，N-二甲基酰胺和20mL(pH7.2)磷酸盐缓冲溶液洗涤，所得硅胶置于100mL圆底烧瓶，加入40mL(pH7.2)磷酸盐缓冲盐溶液，取120mg伴刀豆凝集素ConA和甲基-α-吡喃甘露糖加入10mL(pH7.2)磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀，将其加入活化的硅胶中，甲基-α-吡喃甘露糖于体系中的终浓度为0.1M，4℃搅拌12小时；反应完成后，加入终体积浓度2％的乙醇胺封闭活化基团，搅拌2小时,将键合有ConA的硅胶离心，移除上层清液，用20mL(pH7.2)磷酸盐缓冲溶液洗涤硅胶3次，紫外检测至上层清液中无蛋白质的吸收峰(并用BCA的方法测定上层清液和洗涤液中蛋白质的浓度，计算所制备的硅胶上凝集素的健合量99.3mg/g)，将所制备的硅胶储存于0.02％NaN3的HEPES缓冲溶液中，放在4℃冰箱中保存。

实施例2：取5g硅胶，置于100mL玻璃圆底烧瓶中，加入50mL6M的盐酸加热回流4小时，水洗至中性，在150℃下干燥5小时；

氮气气氛保护，取胺丙基三乙氧基硅烷试剂1.66g，溶于10mL无水处理的四氢呋喃溶液中，电磁搅拌，加入戊二酸酐1.027g，三乙胺调节pH值为6，室温搅拌，液相色谱检测得到末端含有羧基基团的硅烷试剂。氮气保护，将干燥好的硅胶(2.00g),溶于20mL无水甲苯中，加入含有羧基官能团的硅烷试剂，并滴加吡啶(1mmol,80μL)，加热回流，反应48小时，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化12小时；

称量上述干燥的硅胶1.0g,氮气气氛保护，溶于10mL无水N，N-二甲基酰胺(DMF)中，加入100mMEDCI,200mMNHS,室温搅拌4小时，减压抽滤，并依次用30mLN，N-二甲基酰胺和20mL(pH7.2)HEPES缓冲盐溶液洗涤，所得硅胶置于100mL圆底烧瓶，加入20mL的缓冲盐溶液，取100mg伴刀豆凝集素WGA加入0.2MN-乙酰葡糖胺的HEPES缓冲盐溶液中，搅拌均匀，将其加入活化的硅胶中，4℃搅拌48小时；反应完成后，加入2％的乙醇胺封闭活化基团，搅拌1小时,将键合有WGA的硅胶离心，移除上层清液(保存，用BCA的方法测定蛋白质的键合浓度70mg/g，多次用缓冲溶液洗涤硅胶，紫外检测至上层清液中无蛋白质的吸收峰，将所制备的硅胶储存于0.02％NaN3的HEPES缓冲溶液中，放在4℃冰箱中保存。

实施例3：氮气保护，将干燥好的硅胶(2.00g),溶于无水甲苯中，加入环氧丙基氧丙基三甲氧基硅烷(0.7ml)，并滴加三乙胺调节pH值为8，加热回流，反应48小时，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化12小时，得到末端含有环氧基官能团的硅胶固定相。

氮气气氛保护，称量上述干燥的硅胶1.0g溶于20mL(pH7.2)MES缓冲溶液中；取100mg大豆凝集素(SBA)加入0.1MN-乙酰乳糖胺的MES缓冲盐溶液中，搅拌均匀，将其加入上述硅胶中，4℃搅拌12小时；反应完成后，加入终体积浓度为2％的乙醇胺封闭活化基团，搅拌1小时,将键合有SBA的硅胶离心，移除上层清液，用20mL(pH7.2)MES缓冲盐溶液洗涤硅胶3次，紫外检测至上层清液中无蛋白质的吸收峰(并用BCA的方法测定上层清液和洗涤液中蛋白质的浓度，计算所制备的硅胶上凝集素的健合量75mg/g)，将所制备的硅胶储存于0.02％NaN3的MES缓冲盐溶液中，放在4℃冰箱中保存。

实施例4：氮气气氛保护，取端基含有羧基和羟基的PEG试剂0.5g(分子量为2,000)，加入EDCI/NHS(53mg/27mg)活化PEG试剂中的羧基4小时，随即加入氨丙基硅烷试剂35μL，室温搅拌1小时，液相色谱检测至反应完全。氮气保护，将干燥好的硅胶2.0g溶于无水甲苯中，加入上述PEG化的硅烷化试剂，并滴加三乙胺调节pH值为8，加热回流，反应48小时，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化12小时，得到末端含有羟基官能团的硅胶固定相。氮气保护，称量上述干燥的硅胶1.0g溶于DMF溶液中，加入羰基二咪唑CDI(0.5g)或者N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)(0.2g)试剂活化羟基，室温搅拌4小时，减压抽滤，依次用DMF和磷酸盐缓冲溶液洗涤，并置于100mL的玻璃烧瓶中，加入20mL磷酸盐缓冲溶液；取80mg蓖麻凝集素(RCA)加入0.1M半乳糖的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀，将其加入上述硅胶中，4℃搅拌24小时；反应完成后，加入终体积浓度为2％的乙醇胺封闭活化基团，搅拌2小时,将键合有RCA的硅胶离心，移除上层清液，用20mL(pH7.2)磷酸盐缓冲溶液洗涤硅胶3次，紫外检测至上层清液中无蛋白质的吸收峰(并用BCA的方法测定上层清液和洗涤液中蛋白质的浓度，计算所制备的硅胶上凝集素的健合量90mg/g)，将所制备的硅胶储存于0.02％NaN3的磷酸盐缓冲溶液中，放在4℃冰箱中保存。

实施例5：氮气气氛保护，取氨丙基三甲氧基硅烷试剂1.66g，溶于20mL无水处理的DMF溶液中，电磁搅拌，加入戊二醛10mL，室温搅拌1小时，液相色谱检测得到醛基化的硅烷试剂。氮气气氛保护，将干燥好的硅胶(2.00g),溶于无水甲苯20mL，加入上述制备的硅烷试剂，并滴加三乙胺30μL，加热回流，反应48小时，停止反应，冷却抽滤，依次用无水甲苯，四氢呋喃，甲醇，水，甲醇洗涤，80℃下干燥固化12小时，得到末端含有醛基官能团的硅胶固定相；

氮气气氛保护，称量上述干燥的硅胶1.0g溶于20mL(pH7.2)HEPES缓冲盐溶液中；取100mg荆豆凝集素(UEA)加入0.1ML-岩藻糖的HEPES缓冲盐溶液中，搅拌均匀，将其加入上述硅胶中，4℃搅拌12小时；反应完成后，加入2％的乙醇胺封闭醛基，搅拌2小时；加入NaBH4还原希夫碱和未反应的醛基，室温搅拌1小时；将键合有UEA的硅胶离心，移除上层清液，并用BCA的方法测定上层清液和洗涤液中蛋白质的浓度，计算所制备的硅胶上凝集素的健合量97mg/g)，将所制备的硅胶储存于0.02％NaN3的磷酸盐缓冲溶液中，放在4℃冰箱中保存。

实施例6：称取葡聚糖(分子量10,000)1.5g，以pH4.5磷酸盐缓冲液溶解，加入高碘酸钠0.25g，室温避光下以1500r/min搅拌2小时，立即加入丙三醇10mL，室温1500r/min继续搅拌60min，将反应混和液置透析袋中，以水为介质4℃透析2天，透析液冷冻干燥，得氧化葡聚糖1.0g；

将1.0g氧化的葡聚糖溶于N,N-二甲基酰胺(DMF)和水的混合溶液中，取1.0g氨基化的硅胶加入上述的葡聚糖溶液中，室温搅拌5小时，过滤，并依次用DMF、水、甲醇洗涤；所得硅胶置于100mL圆底烧瓶中，取100mg唾液酸凝集素(SNA)加入0.1MN-乙酰神经氨酸的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀，将其加入至活化的硅胶中，4℃搅拌24小时；反应完成后，加入0.2mg的硼氢化钠，室温搅拌2小时,将键合有SNA的硅胶离心，移除上层清液，并用BCA的方法测定上层清液和洗涤液中蛋白质的浓度，计算所制备的硅胶上凝集素的键合量75mg/g，将所制备的硅胶储存于0.02％NaN3的磷酸盐缓冲溶液中，放在4℃冰箱中保存。

Claims (9)

1.一种以硅胶为基质的凝集素高效亲和色谱材料的制备方法，步骤如下：

a.硅胶预处理：用酸溶液处理硅胶，活化硅胶表面的羟基；

b.含有双官能团间隔臂的制备:在惰气气氛保护下，室温，将氨丙基烷氧基硅烷溶于非质子极性溶剂中，加入双官能团试剂，电磁搅拌4～6小时，得到一端含有烷氧官能团，另一端含有羧基、醛基、异氰基或羟基等官能团的硅烷试剂中间体；

非质子极性溶剂包括:二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二噁烷、二甲亚砜、乙腈中的一种或二种以上；

双官能团试剂为可以和氨基成化学键的试剂，双官能团试剂中的两个官能团可以相同也可以不同，如丁二酸酐、戊二酸酐、苯甲酸酐、戊二醛、双异氰基PEG(PEG分子量200～6,000)、单环氧基PEG试剂(PEG分子量200～6,000)、醛基PEG(PEG分子量200～6,000)、氧化葡聚糖(分子量1,000～10,000)中的一种或二种以上；

c.双官能团硅烷化试剂修饰硅胶的制备：在惰气气氛保护下，将步骤a处理好的硅胶溶于有机溶剂中，加入步骤b所得到的产物溶液，加热回流，反应16～48小时；反应体系冷却至室温，减压过滤，依次用甲苯、四氢呋喃、甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在60～100℃下干燥12～24小时，得到间隔臂末端含有可活化官能团的硅胶固定相；

氨丙基烷氧基硅烷的使用量与所修饰的硅胶用量的对应关系为0.03～3mmol氨丙基烷氧基硅烷/g硅胶；

d.凝集素键合硅胶亲和材料的制备：在惰气气氛保护下，将上述经过合成的烷氧基硅烷化试剂修饰后的硅胶固定相加入无水有机溶剂或者不含有一级氨基的缓冲盐溶液中，加入活化官能团试剂，室温反应2～4小时，减压抽滤，用不含有一级氨基的缓冲盐溶液洗涤并将所得固定相重溶于不含有一级氨基的缓冲盐溶液置于玻璃容器中；

活化官能团的试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺(EDCI)、EDCI/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)、羰基二咪唑(CDI)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N,N二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)中的一种或二种以上；

不含有一级氨基的缓冲盐溶液为磷酸盐(PBS)缓冲溶液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸(HEPES)缓冲溶液中的一种；

在惰气气氛保护下，将凝集素与和凝集素有特异性结合的糖溶解于不含有一级氨基的缓冲盐溶液中，加入上述的硅胶缓冲盐溶液中，4～25℃搅拌4～24小时，然后加入含有一级氨基的试剂，对未反应完全的活化基团封尾2～4小时，离心，收集固体，得到键合有凝集素的硅胶亲和材料；

一级氨基试剂可以为三羟甲基氨基甲烷、氨基乙醇和BSA缓冲溶液中的一种或两种以上。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤a：硅胶加入体积浓度为1～36％的盐酸或硝酸溶液中，硅胶与溶液的体积比1/2～1/20，加热回流搅拌1～48小时，过滤，水洗至中性，在100～160℃干燥6～10小时，后在40～80℃干燥6～10小时至恒重。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤b：氨丙基烷氧基硅烷是氨丙基三甲氧基硅烷或者氨丙基三乙氧基硅烷中的一种或二种，氨丙基烷氧基硅烷试剂在非质子极性溶剂中的浓度为0.5-5M，氨丙基烷氧基硅烷试剂在非质子极性溶剂中和双官能团试剂反应，氨丙基烷氧基硅烷试剂和双官能团试剂的物质的量比为1/1～1/3,控制溶液体系的pH值为4～8，搅拌，用液相色谱或者质谱检测反应，至反应完全。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

控制溶液体系的pH值为4～8的方法是加入三乙胺、吡啶、乙二胺、异丙基胺或者盐酸、柠檬酸、乙酸中的一种或二种以上。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤c中：所述有机溶剂为苯、甲苯、或者N,N-二甲基酰胺中的一种或二种以上；

步骤a处理好的硅胶在有机溶剂中的质量浓度为0.02～0.2g/ml；60-120℃反应。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述凝集素为伴刀豆蛋白凝集素(ConA)、麦胚凝集素(WGA)、大豆凝集素(SBA)、蓖麻凝集素(RCA)、荆豆凝集素(UEA)或唾液酸凝集素(SNA)，与凝集素有特异性结合的糖一一对应的为甲基-α-D-吡喃甘露糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰乳糖胺，乳糖，L-岩藻糖，N-乙酰神经氨酸。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

将1克上述含有可活化官能团的硅胶固定相加入5～50ml无水有机溶剂或者5～50ml不含有一级氨基的缓冲盐溶液中；

加入活化官能团的试剂，其用量与步骤c所得硅胶固定相的对应关系为0.02～2mmol/g，活化硅胶2～4小时，减压抽滤；用不含有一级氨基的缓冲盐溶液多次洗涤并重溶于不含有一级氨基的缓冲盐溶液中；

在惰气气氛保护下，将凝集素与和凝集素有特异性结合的糖溶解于不含有一级氨基的缓冲盐溶液，加入上述经过官能团活化的硅胶缓冲盐溶液；

体系中凝集素的浓度为0.1～1M、与凝集素有特异性结合的糖的浓度为0.05～0.5M、体系总体积为50～100ml，于4～25℃搅拌4～24小时，然后加入终体积浓度为1％～10％的一级氨基试剂，对未反应完全的活化基团封尾2～4小时，离心，收集亲和材料，得到键合有凝集素的硅胶亲和固定相。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤d中加入含活化官能团的试剂为EDCI和NHS时，对间隔臂末端为羧基官能团的硅胶材料进行活化，EDCI/NHS的物质的量之比为1/1.5～1/5,EDCI与待活化的硅胶的比例关系为0.02～2mmol/g。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤d中加入糖并在4～25℃低温搅拌是为了保护凝集素的特异性结合位点，在键合的过程避免影响凝集素特异性，而凝集素的浓度过高会使得凝集素聚集沉降；

反应完成后，离心，收集上层清液，下层固定相再用不含有一级氨基的缓冲盐溶液洗涤1次以上至上层清液中无蛋白质的吸收，收集上层清液，应用二喹啉甲酸(BCA)的方法检测所有收集得到的上层清液中蛋白质的浓度，计算硅胶亲和固定相中键合的凝集素的含量70～97％；收集固体，得到键合有凝集素的硅胶亲和固定相，最终存放在加入体积浓度2％NaN₃(抑制生菌)的磷酸盐缓冲溶液中，4～25℃低温保存。