CN110872383A - 一种青霉胺修饰的多级孔杂化材料的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种青霉胺修饰的多级孔杂化材料的制备及其在糖肽富集中的应用。具体是将八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷、环氧功能单体、可降解聚合物和引发剂在有机试剂中超声溶解，然后在水浴加热的情况下进行自由基聚合反应。反应完成后，在酸性条件下使可降解聚合物进行降解从而得到表面含有环氧功能团的分级孔材料。最后将该材料用青霉胺进行衍生形成含有两性亲水官能团的多级孔道整体材料。该材料的制备过程简单，原料易得，成本较低，所制备材料同时具有微孔、介孔和大孔，不但具有较大的比表面积，而且具有可加快传质速度的大孔结构，这些特点使其修饰后成功用于生物样品中糖肽的分离富集。

Description

一种青霉胺修饰的多级孔杂化材料的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种糖肽富集材料，具体是一种青霉胺功能化的多级孔杂化整 体材料及其制备，以及其在生物样品中的糖肽富集应用。

背景技术

最近几十年来多孔材料作为一种新型材料引起了许多研究者的高度关注。这 种材料同时含有渗透孔隙结构和连续的矩阵结构。国际纯粹和应用化学联合会 按照孔径的大小将其分为：微孔(孔径＜2nm)、介孔(孔径为2～50nm)及大孔 (孔径＞50nm)。多孔材料包含了两种或两种以上的孔结构，其中，微孔和介孔 的存在会使材料具有很大的比表面积，提供更多的活性中心，而大孔的存在， 在应用过程中可以加快传质速率。由于其具有丰富的多级结构、较好的水热稳 定性、大的比表面积等优势，使得其被广泛地应用于石油能源、催化、物理光 学、分离科学和生物医药学等领域(文献1.Martin，H.et.al..“Hierarchically-structured porous materials:from basic understanding toapplications”A.Chem.Soc.Rev.2016,45,3311-3312.文献2.Schwieger,W.et.al.“Hierarchy concepts:classification and preparation strategies for zeolitecontaining materials with hierarchical porosity”A.Chem.Soc.Rev.2016,45,3353-3376.)。

根据材料的组成划分，多级孔材料可以分为多级孔金属材料、多级孔无机 非金属材料和多级孔高分子材料。其中，多级孔高分子材料是通过有机功能单 体发生聚合交联反应形成多级孔结构。这类材料兼有多孔材料和高分子的优点， 如高比表面积、良好的通透性、合成工艺简单以及成本低等优点。其中部分有 机材料对生物体较低的毒性和良好的相容性，因此可用作药物载体或支架在生 命领域具有广阔的应用空间。

糖基化修饰是最为普遍的蛋白质翻译后修饰之一，其对蛋白质的折叠，构象 的稳定，以及蛋白质的活性等都具有重要影响。哺乳动物体内50％以上的蛋白质 都会在其一生的某个阶段发生糖基化修饰。糖基化蛋白质参与了众多重要的生 命过程，如蛋白质相互作用、免疫应答、细胞通讯、细胞凋亡等。同时，许多 细胞表面和体液中糖基化蛋白质上糖链的改变已经被证实在癌症或者其他疾病 的发生和发展过程中起着很大作用，蛋白质糖基化的异常变化已经成为肿瘤发 生和发展的重要标志之一(文献3.H.J.；Miyamoto,S.et.al.“An Profiling of glycans in serum for the discovery of potentialbiomarkers for ovarian cancer”J. Proteome Res.,2006,5(7):1626-1635)。然而在糖基化修饰研究中，糖基化蛋白 质相对丰度较低，酶解后产生的糖基化肽段仅占蛋白质酶解肽段的2～5％^[126]， 在质谱分析中的信号受到非糖基化肽段的抑制，因此，需要高效的分离富集方 法去除糖基化样品中的非糖基化蛋白质或肽段，尽可能地减少高丰度非糖基化 肽段的干扰(文献4.Sun,B.Y.et.al.“Shotgun glycopeptide capture approach coupledwith mass Spectrometry for comprehensive glycoproteomics”Mol.Cell.Proteomics,2007,6(1)，141-149；文献5.Zielinska,D.F.et.al.“Precision Mapping ofan In Vivo N-Glycoproteome Reveals Rigid Topological and SequenceConstraints”Cell,2010,141(5)，897-907)。目前富集糖肽的主要方法有凝集素 亲和法、硼酸亲和色谱法、亲水色谱法(HILIC)等。其中HILIC在特异性、覆 盖率、重复性、质谱兼容性等方面的优势，使其在糖肽富集与分离中得到越来 越多的应用。但目前亲水法依然存在对糖肽选择性低的缺点，非糖肽不能被有 效去除，影响了糖肽的质谱响应。因此，寻找和制备新型糖肽富集材料依然是 研究人员的重点(文献6.Zhu,J.et.al.“ComprehensiveMapping of Protein N-Glycosylation in Human Liver by Combining HydrophilicInteraction Chromatography and Hydrazide Chemistry”J.Proteome Res.,2014,13(3)， 1713-1721.文献7.Sun,N.et.al.“Hydrophilic Mesoporous Silica Materials forighly Specific Enrichment of N-Linked Glycopeptide”Anal.Chem.2017,89, 1764-1771.文献8.陈成等“新型四肽亲水材料用于糖肽的高效富集”分析化学， 2017，45(8)，1149-1154)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青霉胺功能化的多级孔杂化整体材料的制备及 应用，其可用作亲水色谱的固定相高效快速地完成对蛋白质组学中糖肽的分离 富集。

为实现上述目的，可按如下步骤操作，

该材料是利用八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷(Polyhedral oligomericvinylsilsesquioxane，vinylPOSS)表面的乙烯基与环氧功能单体中乙烯基在热引 发剂的条件下进行自由基聚合，同时将不参与反应的可降解聚合物掺杂在其中 形成整体材料，然后将其在酸性条件下进行水解，除去可降解聚合物，可以得 到表面带有环氧功能化的多级孔杂化材料。制备过程示意图如图1所示。

(1)环氧功能杂化整体材料的制备：在容量为10～15mL的安瓿瓶中，依次加 入50～200mg八乙烯基倍半硅氧烷、10～150mg烯丙基缩水甘油醚、5～60mg聚 己内酯、10～30mg偶氮二异丁腈以及1.0～5.0mL四氢呋喃，10～30min超声溶解， 使其完全溶解形成均匀透明混合溶液，同时除去溶液中的溶解氧。将装有混合 溶液的安瓿瓶置入液氮(温度为-193℃左右)中，使混合溶液凝固成固体。用 真空泵将安瓿瓶抽真空，除去瓶中的氧气，用火焰进行密封后放入55～65℃水 浴锅中，反应12～48小时，使安瓿瓶中的混合液体发生聚合反应，成为白色固 体。聚合反应完成后，将安瓿瓶顶端敲碎，将其中的材料转移至10～50mL玻璃 瓶中，用四氢呋喃浸泡洗涤材料3～5次，清洗除去未参与反应的物质，得到环 氧功能整体材料。

(2)含有分级孔的环氧功能杂化整体材料的制备：在(1)所得的整体材料中加 入10～40mL盐酸溶液(1～2mol/L，乙醇/水＝2/3，v/v)，使其浸没整体材料，然 后密封，并放入60～80℃水浴锅中48～96小时，水解可降解聚合物。降解完成 后用乙醇/水(1/1,v/v)溶液洗涤得到的材料，去除盐酸及水解产物，得到环氧 功能化的分级孔杂化整体材料。

(3)青霉胺修饰的分级孔杂化整体材料的制备：将(2)所得的材料中加入 10～15mL青霉胺碱性溶液(0.05～0.07g/mL，pH＝9～10)，放入55～65℃水浴 锅中反应12～18小时。取出后用乙醇/水(1/1，v/v)溶液洗涤材料，去除剩余的 青霉胺及缓冲盐，最后置于40～80℃的真空干燥箱中干燥2～12小时得到青霉胺 修饰的多级孔杂化整体材料。

所述青霉胺功能化的多级孔杂化整体材料可用生物样品中糖肽的分离富集。

本发明具有如下优点：

(1)该制备过程简单，原料易得，成本低廉。

(2)所制备的材料同时具有微孔、介孔和大孔，既有可用于吸附样品的较大 的比表面积，又有可加快传质速度的大孔结构。

附图说明

图1为环氧功能化的多级孔杂化整体材料的制备示意图。

图2为环氧杂化整体材料与制备功能单体的傅里叶变换-红外光谱对比图。

图3为实施案例环氧功能化的多级孔以及无孔杂化整体材料的扫描电镜图。

图4为实施案例1中环氧功能化的多级孔杂化整体材料的大孔孔径分布图。 所采用方法为压汞法。

图5为环氧功能化的多级孔杂化整体材料的氮气吸附/脱附曲线以及微、介 孔孔径分布图。介孔孔径分布图基于BJH模型绘制，微孔孔径分布图是基于DFT (密度泛函)模型绘制。

图6为青霉胺修饰后多级孔杂化材料对免疫球蛋白(IGg)酶解液富集前后 的质谱对比图。

具体实施方式

实施例1青霉胺功能化的多级孔杂化整体材料用于糖肽的分离富集。

青霉胺功能化的多级孔杂化整体材料的制备：

1)环氧功能杂化整体材料的制备：在容量为15mL的安瓿瓶中，依次加入63.3 mg八乙烯基倍半硅氧烷、91.0mg烯丙基缩水甘油醚、30mg聚己内酯、10mg 偶氮二异丁腈以及1.0mL四氢呋喃，15.0min超声溶解，使其完全溶解形成均 匀透明混合溶液，同时除去溶液中的溶解氧。将装有混合溶液的安瓿瓶置入液 氮(温度为-193℃左右)中，使混合溶液凝固成固体。用真空泵将安瓿瓶抽真 空，除去瓶中的氧气，用火焰进行密封后放入60℃水浴锅中，反应48小时， 使安瓿瓶中的混合液体发生聚合反应，成为白色固体。聚合反应完成后，将安 瓿瓶顶端敲碎，将其中的材料转移至20mL玻璃瓶中，用四氢呋喃浸泡洗涤材料 4次，清洗除去未参与反应的物质，得到环氧功能整体材料。

2)含有分级孔的环氧功能杂化整体材料的制备：在1)所得的材料中加入 12mL盐酸溶液(1mol/L，溶剂乙醇/水＝2/3，v/v)，使其浸没整体材料，然后将 玻璃瓶密封，并放入60℃水浴锅中48小时，水解可降解聚合物。降解完成后 用乙醇/水(1/1,v/v)溶液洗涤得到的材料，去除盐酸及水解产物，得到环氧功 能化的分级孔杂化整体材料。

3)青霉胺修饰的分级孔杂化整体材料的制备：将2)所得的材料加入10～15 mL的青霉胺碱性溶液(0.06g/mL，pH＝9)，放入60℃水浴锅中反应15小时。 取出将得到的材料用乙醇/水(1/1,v/v)溶液洗涤，去除剩余的青霉胺及缓冲盐， 然后置于60℃的真空干燥箱中干燥12小时得到青霉胺修饰的多级孔杂化整体 材料。

IgG酶解样品的制备：免疫球蛋白(IgG)1mg溶解在含8M尿素的100mM 的碳酸氢铵溶液中(pH＝8.2)，加入80μmol二硫苏糖醇，在60℃恒温1h，再加 入40μmol碘代乙酰胺，避光40min，用100mM的碳酸氢铵溶液将尿素浓度 稀释成1M，按照与胰蛋白酶的质量比为1:40的加入胰蛋白酶，在37℃的水浴 中反应时间16h，获得的酶解液除盐，冻干后保存在-20℃的冰箱中备用。

糖基化肽的富集：首先将10μg IgG酶解液用200μL上样液(ACN/H₂O/TFA， 88:11.9:0.1，v/v/v)稀释，加入青霉胺功能化的多级孔杂化材料后，室温震荡10 min。离心，除去上清液。然后采用上样液(400μL×3次)清洗，以除去非糖 肽和其他杂质。接着加入60μL洗脱液(ACN/H₂O/TFA，30:69.9:0.1，v/v/v)并 室温震荡10min后，混合物离心，取上清液用Triple TOF 5600质谱进行 MALDI-TOF/MS分析。另外，可将上清液冷冻干燥后，加入60μL含1000U PNGase F酶的10mmol/L NH₄HCO₃溶液(pH＝8.0)，37℃下孵育12h，以除 去糖基片段。最后去糖基化肽段同样采用MALDI-TOF/MS进行分析。

产物表征

实施案例1制备杂化整体材料的红外图如图2所示，波数1108cm^-1的强吸收 宽峰为Si-O-Si键的对称伸缩振动，波数1252cm^-1的弱吸收峰为C-O-C键的反对 称伸缩振动峰，而波数854和912cm^-1的振动峰则为环氧基团的吸收峰，说明 在材料中同时存在Si-O-Si,C-O-C和环氧基团。

扫描电镜如图3(a，b)，可以清晰看到整体材料中存在不同尺寸的孔。总 孔体积1.688cm³/g，孔隙率77.2％。压汞法测得材料中大孔体积1.207cm³/g，占 总孔体积71.5％，主要分布在10微米附近(图4)。氮气物理吸附/脱附实验结果显 示，材料BET比表面积为599.8m²/g,介孔分布较窄在3.9nm附近(图5b)，孔体积 0.366cm³/g，占总孔体积21.7％；微孔体积0.115cm³/g(采用t-plot方法)，占总孔 体积6.8％，主要分布在1.3和1.7nm附近(图5c)。这些结果都证明了合成的杂化 整体材料是同时具有大孔、介孔和微孔的三级孔道结构材料。

产物应用

采用标准蛋白IgG评价材料的糖肽富集效果。用基质辅助激光解吸电离飞行 时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行检测。图6为IgG酶解液富集前后的效果对比 图。如图6(a)所示，富集前，谱图中峰强度较高的信号绝大多数为非糖肽， 糖肽的信号几乎都被抑制了，仅检测出一条。用材料富集后，如图6(b)所示， 非糖肽明显减少，可以检测到23条典型的N-连接糖肽。为了验证富集的肽段均 为糖肽，肽段采用PNGase F酶进行去糖基化处理。结果发现，图6(b)中的糖 肽信号基本消失，图6(c)中仅能见到两条明显的肽段信号(EEQFNSTFR， m/z＝1158.67；EEQYNSTYR，m/z＝1190.66)，这说明多级孔功能材料从IgG中所 富集的肽段均为糖肽。

表 青霉胺功能化材料富集到的IgG酶解液中糖肽的分子量及糖型组成

N#表示糖基化位点；Hex:甘露糖；HexNAc:N-乙酰葡糖胺；Fuc:岩藻糖。

实施例2利用青霉胺功能化的无孔杂化整体材料用于糖肽的分离富集。

青霉胺功能化的无级孔杂化整体材料的制备：

步骤1)：在预聚液中去掉造孔剂PCL，其它同实施例1步骤1)，制备杂化 材料；

步骤2)：将1)所得的整体材料以四氢呋喃洗涤3次，再使用乙醇/水(1/1,v/v) 为溶液超声洗涤3次，依次清洗所得到的杂化整体材料；

步骤3)：同实施例1步骤3)用青霉胺对材料进行修饰。

使用与实施例1中相同的步骤对IgG酶解液中的糖肽进行富集。

结果:实施案例2制备的整体材料的扫描电镜如图3(c，d)所示，材料表 面光滑，没有明显的孔道结构。BET测试比表面积低于0.5m²/g，进一步说明材 料中既没有明显的微介孔存在。在IgG酶解液中仅富集除了9条糖肽，远远低 于实施案例1所制备的多级孔材料的糖肽富集效果。

Claims (8)

1.一种多级孔杂化材料的制备方法，该材料是利用八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷(Polyhedral oligomeric vinylsilsesquioxane，vinylPOSS)表面的乙烯基与环氧功能单体中乙烯基在热引发剂的条件下进行自由基聚合，同时将不参与反应的可降解聚合物掺杂在其中形成整体材料，然后将其在酸性条件下进行水解，除去可降解聚合物，可以得到表面带有环氧功能化的多级孔杂化材料。

2.按照权利要求1所述环氧功能化多级孔杂化材料的制备方法，其特征在于：

将vinylPOSS、环氧功能单体、热引发剂和不参与反应的可降解聚合物溶解在溶剂中，在加热条件下发生自由基反应，反应结束后在酸性条件下进行降解，除去整体材料中的可降解聚合物，从而得到表面环氧基团功能化的分级孔材料；

所述环氧功能单体为烯丙基缩水甘油醚(Allyl glycidyl ether，AGE)；

所述可降解聚合物为聚己内酯(Polycaprolactone，PCL，平均分子量Mn为1,000－10,000)；

所述溶剂为四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)；

所述降解试剂为1～2mol/L盐酸(Hydrochloric acid，HCL)溶液。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作，

(1)表面环氧基团功能化杂化整体材料的制备：在安瓿瓶中，依次加入50～200mg八乙烯基倍半硅氧烷、10～150mg烯丙基缩水甘油醚、5～60mg聚己内酯、10～30mg热引发剂以及1.0～5.0mL四氢呋喃，超声溶解，使其完全溶解形成均匀透明混合溶液，同时除去溶液中的溶解氧；将装有混合溶液的安瓿瓶置入-150～-200℃的环境中(优选液氮)，使混合溶液迅速凝固成固体；用真空泵将安瓿瓶抽真空，除去瓶中的氧气，用火焰密封安瓿瓶瓶口后放入55～65℃水浴锅中，反应12～48小时，使安瓿瓶中的混合液体发生聚合反应，成为白色固体；聚合反应完成后，将安瓿瓶顶端敲碎，将其中的材料转移至玻璃瓶中，用四氢呋喃浸泡洗涤材料3～5次，得到表面环氧基团功能化的整体材料；

(2)含有分级孔的环氧功能杂化整体材料的制备：在(1)所得的整体材料所在的玻璃瓶中加入10～40mL盐酸溶液，使其浸没整体材料，然后将玻璃瓶密封，并放入60～80℃水浴锅中48～96小时，水解可降解聚合物；降解完成后用乙醇/水(1/1,v/v)溶液洗涤得到的材料，去除盐酸及水解产物，得到表面环氧基团功能化的多级孔杂化整体材料。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：

所述热引发剂为偶氮二异丁腈(Azodiisobutyronitrile,AIBN)。

5.一种权利要求1-4任一方法制备获得的多级孔杂化材料。

6.一种青霉胺修饰的多级孔杂化材料，其是由权利要求5所述多级孔杂化材料用青霉胺进行衍生获得的青霉胺修饰的多级孔杂化材料。

7.一种权利要求6所述青霉胺修饰的多级孔杂化材料的制备方法，其特征在于：

将多级孔杂化材料加入10～15mL的青霉胺碱性溶液(0.05～0.07g/mL，pH＝9～10)，放入55～65℃水浴锅中反应12～18小时，然后用乙醇/水(1/1～1/2,v/v)溶液洗涤得到的材料，以去除剩余的青霉胺及缓冲盐，最后置于40～80℃的真空干燥箱中干燥2～12小时得到青霉胺修饰的多级孔杂化整体材料。

8.一种权利要求6所述青霉胺功能化的分级孔杂化材料的应用，其特征在于：青霉胺功能化的分级孔杂化材料球作为富集材料应用于生物样品中糖肽的分离富集。

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