CN108211424A - 一种用于赭曲霉毒素特异识别的poss基有机-无机杂化硅胶整体柱及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机‑无机杂化硅胶整体柱及其制备方法,其是以笼型低聚倍半多聚硅氧烷(POSS)交联剂与多胺单体经亲核反应形成的具有高交联3D骨架、表面富含有胺基的杂化硅胶整体柱为基质,高密度负载由抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的金纳米粒子,并利用纳米金氨基键合和自组装形成。本发明中制备的POSS基整体柱基质具有高度交联结构、多作用位点的特征,能够高效地负载纳米金粒子,从而可使对赭曲霉毒素A具有特异性识别的核酸适体能够高密度负载固定到POSS基整体柱上,从而可实现对赭曲霉毒素A的高效特异识别分离。
Description
技术领域
本发明属于整体聚合材料制备领域,具体涉及用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱及其制备方法。
背景技术
整体柱,又称连续床(continuous bed)是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合和类似浇铸的连续床固定相。核酸适配体修饰的亲和整体柱通过将核酸适配体和整体柱材料相结合,具有较高的选择性、高分辨率和高目标识别能力,作为新兴的功能材料受到了关注。
制备核酸适配体修饰整体柱较成熟的方式是基于生物素和链霉亲和素或醛基-氨基之间的桥联作用将适配体固定在固定相上,以链霉亲和素为连接媒介,将末端修饰生物素的核酸适配体固定到链霉亲和素活化的甲基丙烯酸缩水甘油酯有机聚合物整体柱基质上,该方法制备条件温和且有利于保持适配体的活性,可实现对细胞色素C和凝血酶的分离与检测。
利用戊二醛作为连接媒介,将末端修饰为氨基的核酸适配体固定到戊二醛活化的氨丙基硅胶基质整体柱上,制备的核酸适配体亲和整体柱可实现对蛋白的分离纯化和检测。通过反复延长戊二醛活化的时间来增加戊二醛的位点,以进一步提高核酸适配体的覆盖密度,增强对目标分子的结合,可实现在复杂样品中对赭曲霉毒素A的特异性识别和高灵敏检测,然而长时间的反复活化相对耗时繁琐。
纳米金颗粒由于其良好的稳定性、小尺寸效应、表面效应以及良好的生物相容性被广泛应用于众多领域。以纳米金为媒介,将功能试剂键合到具有高度交联和稳定的结构上,可以实现分子层上的高度分散和功能化。以纳米金为连接媒介将末端修饰有巯基的核酸适配体固定到表面带有巯基基团的基质整体柱上,制备的核酸适配体修饰的整体柱可对凝血酶进行富集、分离与检测。但是,上述方法制备的杂化硅胶基亲和整体柱中核酸适配体的覆盖密度都在277-342 pmol /μL的水平。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱及其制备方法。所得POSS基整体柱基质具有高度交联结构、多作用位点的特征,能够高效地负载纳米金粒子,从而可使对赭曲霉毒素A具有特异性识别的核酸适体能够高密度负载固定到POSS基整体柱上,从而可实现对赭曲霉毒素A的高效特异识别分离。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱,其是以笼型低聚倍半多聚硅氧烷(POSS)交联剂与多胺单体经亲核反应形成的具有高交联3D骨架、表面富含胺基的杂化硅胶整体柱为基质,高密度负载由抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的金纳米粒子,并利用纳米金氨基键合固定和自组装形成。
所述笼型低聚倍半多聚硅氧烷(POSS)交联剂为含环氧基团的笼型低聚倍半多聚硅氧烷,所述多胺单体为支化聚乙烯亚胺PEI 1200。
所述抗赭曲霉毒素核酸适配体的碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGG GTGGCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3';所述金纳米粒子的粒径为10~15 nm。
所述用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱的制备方法包括以下步骤:
(1)POSS基杂化硅胶整体柱基质的制备:
按比例称取多胺单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂及由正丙醇、1,4-丁二醇和聚乙二醇组成的三元致孔剂于2.0 mL离心管中,振荡混匀10 min,超声脱气20 min使其形成均一溶液;然后将混合物注入经3-氨基丙基三乙氧基硅烷键合修饰的石英毛细管中,两端密封后置于50 ℃水浴锅中恒温反应16 h;将制备好的整体柱取出,连接至液相色谱仪用高压溶剂泵,以甲醇为流动相冲洗整体柱2 h,以冲去床层内残留的溶剂,得到表面富含胺基的POSS基整体柱基质;
(2)表面修饰抗赭曲霉毒素核酸适配体的纳米金粒子的制备:
将表面修饰有抗赭曲霉毒素A的核酸适配体用8000 r/min离心10 min,然后加入pH7.4的缓冲液A进行稀释,再放置于90 ℃加热3 min,冷却至室温后形成浓度为100 μmol/L的核酸适配体储备溶液;按体积比40:60往40 μL的核酸适配体储备溶液中加入5 mmol/L三羧甲基磷酸(TCEP),置于摇床中室温孵育1 h以降解二硫键;加入2.0 mL 10.0 nmol/L的纳米金溶液,室温下漩涡振荡2 min后,于4℃下混匀反应16 h,再加入120 μL 1.0 mol/L的NaCl溶液,4 ℃下陈化24 h,10000 r/min离心分离30 min,二次水洗涤沉淀3次,采用缓冲液A重新分散,得到抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的金纳米粒子Apt@AuNPs的储备溶液;
(3)Apt@AuNPs修饰的POSS基杂化硅胶亲和整体柱的制备:
将步骤(2)得到的Apt@AuNPs储备溶液在室温下注入步骤(1)所得POSS基整体柱基质中,直到柱体由白色变成红棕色且末端流出的液体为粉红色后,用二次水清洗1 h,制得表面键合有Apt@AuNPs的POSS基杂化硅胶亲和整体柱,通入pH 8.5的缓冲液B后,于4 ℃下保存。
按质量百分数之和为100%计,步骤(1)中各组分所占质量百分数为:多胺单体10.00%~13.50%,笼型低聚倍半多聚硅氧烷12.50%~16.50%,1,4-丁二醇 9.80%~10.50%,正丙醇54.25%~58.88%,聚乙二醇 5.62%~7.12%。
所述笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂为不含极性硅羟基的八[(3-氧化缩水甘油丙基)二甲基硅氧基]取代笼型低聚倍半多聚硅氧烷;所述聚乙二醇的分子量为10000。
所述多胺单体使用时配成含水量50%的支化聚乙烯亚胺PEI 1200溶液。
所述缓冲液A由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl和1 mmol/L KCl组成;
所述缓冲液B由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和20mmol/LCaCl2组成。
本发明的显著优点在于:
本发明以具有多个氨基基团的聚乙烯亚胺作为功能单体,具有独特纳米尺寸的笼型聚倍半硅氧烷为交联剂,形成具有纳米尺寸材料的均一相POSS基基质载体,并结合纳米金优良的生物兼容性和高比表面积,以增加作用位点、减少位阻,从而显著地提高核酸适配体在整体柱上的键合量,通过纳米金氨基键合和自组装,纳米金在柱上的能谱值达84.1%,核酸适配体表面覆盖密度可以达到1413 pmol/μL。
附图说明
图1为抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的金纳米粒子负载前后柱表面的电镜图,其中A为负载前,B为负载后。
图2为不同整体柱对赭曲霉毒素A的识别情况对比图,其中A为未修饰核酸适配体的空白柱,B为修饰有不含抗赭曲霉毒素A的核酸适配体的对照柱,C为修饰有抗赭曲霉毒素A核酸适配体的亲和整体柱,峰1为赭曲霉毒素A。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
实施例1
一种用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱的制备方法具体步骤为:
(1) 毛细管内壁氨基化:
将毛细管空柱依次采用1.0 mol/L的HCl溶液、1.0 mol/L的NaOH溶液和H2O分别冲洗30min、3 h和15 min,接着用甲醇冲洗30 min,在25 ℃、0.4 MPa条件下氮气吹干;注入甲醇与3-氨基丙基三乙氧基硅烷按体积比1:1组成的混合物,在60 ℃下恒温水浴反应24 h,使毛细管壁上键合上带有氨基的硅烷化物质;然后用甲醇冲洗30 min,在70 ℃、0.4 MPa条件下氮气吹3 h,制得柱壁表面氨基化的毛细管;
(2) POSS基杂化硅胶整体柱基质的制备:
按表1比例称取PEI单体、Poss-epoxy交联剂及由正丙醇、1,4-丁二醇和PEG组成的三元致孔剂,于2.0 mL离心管中振荡混匀10 min,超声脱气20 min使其形成均一溶液,然后将混合物注入步骤(1)所得氨基化的毛细管中,两端密封后置于50 ℃水浴锅中恒温反应16 h,得到柱长为10 cm的POSS基整体柱;将制备好的整体柱取出,连接至液相色谱仪用高压溶剂泵,在泵压11.0 Mpa的状态下以甲醇为流动相冲洗毛细管2 h,冲去床层内残留的溶剂,得到表面富含有分支状结构的氨基活性基团的POSS基整体柱基质;
(3)表面修饰抗赭曲霉毒素核酸适配体的纳米金粒子的制备:
将表面修饰有抗赭曲霉毒素A的核酸适配体先用8000 r/min离心10 min,然后加入pH7.4的缓冲液A(所述缓冲液A由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、1 mmol/L KCl组成)进行稀释,放置于90 ℃加热3 min,冷却至室温后形成浓度为100 μmol/L的核酸适配体储备溶液;于40 μL 100 μmol/L的核酸适配体储备溶液中加入60 μL 5 mmol/L三羧甲基磷酸(TCEP),置于摇床中室温孵育1 h以减少二硫键的形成;然后加入2.0 mL纳米金溶液(纳米金浓度为10.0 nmol/L),室温下漩涡振荡2 min后,于4℃下混匀反应16 h,使核酸适配体5′ 端修饰的巯基与纳米金胶充分自组装;之后加入120 μL 1.0 mol/L NaCl溶液,4 ℃下陈化24 h,以巩固核酸适体和纳米金的结合;然后以10000 r/min离心分离30 min,二次水洗涤沉淀3次,最后重新分散在缓冲液A中,得到抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的金纳米粒子Apt@AuNPs的储备溶液;
(4)Apt@AuNPs修饰的POSS基杂化亲和整体柱制备:
将步骤(3)中得到的Apt@AuNPs储备溶液在室温下流经步骤(2)所得的POSS基整体柱基质中,直到柱体由白色变成红棕色且末端流出的液体为粉红色,用二次水清洗1 h,制得表面键合有Apt@AuNPs的POSS基杂化亲和整体柱,最后通入pH 8.5的缓冲液B(所述缓冲液B由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl2组成),于4 ℃温度下保存。
表1 POSS基整体柱的组分含量表
抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的金纳米粒子负载前后的柱表面电镜图如图1所示,其中,A为未负载的POSS基整体柱基质,B为负载后的POSS基杂化亲和整体柱。
实施例2
选用配方D分别制备未修饰核酸适配体的空白柱、修饰有不含抗赭曲霉毒素A的核酸适配体的对照柱和修饰有抗赭曲霉毒素A核酸适配体的亲和整体柱,柱长10cm,分别进行平衡、富集、清洗和洗脱,其具体步骤为:(1)平衡:先用pH 8.50的缓冲液平衡30min,其流速0.10 mL/min,压力250psi,所述缓冲液由10mmol/L Tris-HCl,120 mmol/L NaCl,5 mmol/LKCl和20mmol/L CaCl2组成;(2)富集:分别注入20 μL 10 ng/mL赭曲霉毒素A(OTA)溶液,使其在整体柱上富集1h,注入条件为流速0.05 mL/min,压力250psi;(3)清洗:将富集柱装到液相色谱泵上,用pH 8.50的缓冲液分别清洗,清洗流速0.1 mL/min,压力1000psi,收集最后的清洗液待查;(4)洗脱:以30%ACN-70%TE缓冲液(10mM pH8.5的Tris-HCl中含2.5mMEDTA)作为洗脱液将OTA从整体柱上洗脱下来,色谱条件为1000psi反压阀,流速0.1mL/min,收集20μL的洗脱液待查。采用HPLC-荧光检测器检测收集液,结果见图2。
由图2可见,空白柱和对照柱对赭曲霉毒素A未见有效保留,而亲和整体柱中的OTA被有效洗脱下来,证明本发明POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱可实现对赭曲霉毒素A的特异识别分离。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱及其制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 1
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36
Claims (8)
1.一种用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱,其特征在于:以笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂与多胺单体经亲核反应形成的具有高交联3D骨架、表面富含胺基的杂化硅胶整体柱为基质,高密度负载由抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的金纳米粒子,并利用纳米金氨基键合固定和自组装,形成所述用于赭曲霉毒素特异识别的有机-无机杂化硅胶亲和整体柱。
2. 根据权利要求1所述的用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱,其特征在于:所述笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂为含环氧基团的笼型低聚倍半多聚硅氧烷,所述多胺单体为支化聚乙烯亚胺PEI 1200。
3. 根据权利要求1所述的用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱,其特征在于:所述抗赭曲霉毒素核酸适配体的碱基序列为5'-SH-C6-GAT CGG GTG TGGGTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3';
所述金纳米粒子的粒径为10~15 nm。
4.一种制备如权利要求1-3任意一项所述的用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱的方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)POSS基杂化硅胶整体柱基质的制备:
按比例称取多胺单体、笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂及由正丙醇、1,4-丁二醇和聚乙二醇组成的三元致孔剂,于离心管中振荡混匀,超声脱气使其形成均一溶液;然后将混合物注入经3-氨基丙基三乙氧基硅烷键合修饰的石英毛细管中,两端密封后置于50 ℃水浴锅中恒温反应16 h;将制备好的整体柱取出,连接至液相色谱仪用高压溶剂泵,以甲醇为流动相冲洗整体柱2 h,得到表面富含胺基的POSS基整体柱基质;
(2)抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的纳米金粒子的制备:
将表面修饰有抗赭曲霉毒素A的核酸适配体用8000 r/min离心10 min,然后加入pH7.4的缓冲液A进行稀释,再放置于90 ℃加热3 min,冷却至室温后形成浓度为100 μmol/L的核酸适配体储备溶液;按体积比40:60往40 μL的核酸适配体储备溶液中加入5 mmol/L三羧甲基磷酸,置于摇床中室温孵育1 h以降解二硫键;加入2.0 mL 10.0 nmol/L的纳米金溶液,室温下漩涡振荡2 min后,于4℃下混匀反应16 h,再加入120 μL 1.0 mol/L的NaCl溶液,4 ℃下陈化24 h,10000 r/min离心分离30 min,二次水洗涤沉淀3次,采用缓冲液A重新分散,得到抗赭曲霉毒素核酸适配体表面修饰的金纳米粒子Apt@AuNPs的储备溶液;
(3)Apt@AuNPs修饰的POSS基杂化硅胶亲和整体柱的制备:
将步骤(2)得到的Apt@AuNPs储备溶液在室温下注入步骤(1)所得POSS基整体柱基质中,直到柱体由白色变成红棕色且末端流出的液体为粉红色后,用二次水清洗1 h,制得表面键合有Apt@AuNPs的POSS基杂化硅胶亲和整体柱,通入pH 8.5的缓冲液B后,于4 ℃下保存。
5. 根据权利要求4所述的用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱,其特征在于:按质量百分数之和为100%计,步骤(1)中各组分所占质量百分数为:多胺单体10.00%~13.50%,笼型低聚倍半多聚硅氧烷12.50%~16.50%,1,4-丁二醇 9.80%~10.50%,正丙醇54.25%~58.88%,聚乙二醇 5.62%~7.12%。
6.根据权利要求4或5所述的用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱,其特征在于:所述笼型低聚倍半多聚硅氧烷交联剂为不含极性硅羟基的八[(3-氧化缩水甘油丙基)二甲基硅氧基]取代笼型低聚倍半多聚硅氧烷;
所述聚乙二醇的分子量为10000。
7. 根据权利要求4所述的用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱,其特征在于:所述多胺单体使用时配成含水量50%的支化聚乙烯亚胺PEI 1200溶液。
8. 根据权利要求4所述的用于赭曲霉毒素特异识别的POSS基有机-无机杂化硅胶整体柱,其特征在于:所述缓冲液A由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl和1 mmol/L KCl组成;
所述缓冲液B由10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和20mmol/LCaCl2组成。
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