CN110596063B - 一种基于pei的赭曲霉毒素a的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于PEI的赭曲霉毒素A(OTA)的快速检测方法，属于赭曲霉毒素A检测领域。该方法包括以下步骤：在含0.05％PEI的MES缓冲液中，加入不同标准浓度的OTA，以OTA浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程及相关系数；将待测样品加到含PEI的MES缓冲液中，将测得的相对荧光值代入回归方程中，得到待测样品中的赭曲霉毒素A浓度。MES缓冲液的浓度为20mmol/L，pH为6。本发明基于表面活性剂PEI对OTA荧光光谱的增强作用，对OTA进行快速检测，操作步骤简单，材料廉价且易于获取；抗干扰性强，特异性好，灵敏度高，OTA浓度的检测下限为0.056nmol/L。

Description

一种基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法
技术领域
本发明属于赭曲霉毒素A检测领域，具体涉及一种基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法。
背景技术
赭曲霉毒素(ochratoxin)是曲霉菌属和青霉菌属某些种产生的二次代谢产物属于霉菌毒素的一种，包含赭曲霉毒素A(OTA)，赭曲霉毒素B(OTB)，赭曲霉毒素C(OTC)等七种类似化合物。OTA是赭曲霉毒素中毒性最强、分布最广，对人体和动植物危害最大的一种，在畜牧业中，动物食用被OTA污染的饲料会导致畜禽机体损伤，影响产能，而人体误食了被OTA污染的食物也会导致健康问题。OTA具有致癌性、致畸变性、肝脏毒性、肾脏毒性以及遗传毒性，同时对人体的神经和免疫系统具有严重危害。
OTA被国际癌症研究机构(IARC)列为可能的人类致癌物，世界各地的卫生组织对人体对于OTA的摄入量作出了详细规定。由于OTA的极端毒性，确定食品中的OTA含量是十分重要的。
目前已经建立起多种定量分析检测OTA的方法：包括薄层色谱法包括薄层色谱(TLC)，高效液相色谱(HPLC)，紫外可见光谱法(UV-Vis)，质谱(MS)或免疫分析法等。但是这些方法大多设备昂贵，对操作人员要求高，又或者操作简单，价格便宜，但是灵敏度不够。
OTA本身具有紫外/可见吸收、荧光、量子产率、和斯托克斯位移等光学特性。同一OTA在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度可能会有显著的不同，若溶剂和荧光物质形成络合物或溶剂使荧光物质的电离状态发生改变，则荧光光谱也会发生变化，当在荧光物质的溶液中加入表面活性剂时，基于表面活性剂的增溶原理、去质子化和其他的一些作用，该荧光物质的荧光光谱会发生增强，对荧光物质的荧光光谱产生增敏作用。
表面活性剂在各个领域有着广泛的应用，但是其在物质分析检测方面，尤其是OTA的分析检测方面相关研究却不多。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法，通过将待测样品加到含0.05％PEI的20mmol/L pH6 MES缓冲液中，将测得的相对荧光值代入回归方程中，得到待测样品中的赭曲霉毒素A的浓度。本发明操作步骤简单，材料廉价且易于获取，能够快速准确的检测OTA的浓度；在检测OTA时抗干扰性强，具有高度的特异性与灵敏性。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法，包括以下步骤：
1)在含PEI的MES缓冲液中，加入不同标准浓度的赭曲霉毒素A，以赭曲霉毒素A浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程及相关系数；
2)将待测样品加到含PEI的MES缓冲液中，将测得的相对荧光值代入回归方程中，得到待测样品中的赭曲霉毒素A浓度。
步骤1)中，MES缓冲液中含PEI的浓度为0.001％-0.1％。
步骤1)中，MES缓冲液中含PEI的浓度为0.05％。
步骤1)中，MES缓冲液的浓度为20mmol/L，pH为6。
步骤1)中，所述相对荧光值为发射波长450nm和激发波长390nm处的所测赭曲霉毒素A的荧光值与无赭曲霉毒素A时的荧光值差。
步骤2)中，回归方程为y＝1.2809x+1.3856。
进一步的，赭曲霉毒素A浓度的检测区间为0-100nmol/L。
进一步的，赭曲霉毒素A浓度的检测下限为0.056nmol/L。
上述方法在检测赭曲霉毒素A中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
1)本发明基于表面活性剂PEI对OTA荧光光谱的增强作用，对OTA进行快速检测，具有操作步骤简单，材料廉价且易于获取及快速准确等优点；无需依赖昂贵的设备，对操作人员要求不高；
2)本发明在检测OTA时抗干扰性强，具有高度的特异性；
3)OTA检测下限为0.056nmol/L，灵敏度高。
附图说明
图1是不同浓度的表面活性剂与100nmol/L OTA在pH6、pH7.4、pH9下的荧光光谱图；图中，A：无表面活性剂；B：0.005％PEI；C：0.005％CTAB；D：0.01％PDDA；固定发射波长450nm，狭缝宽度6×6nm；
图2是不同浓度PEI与1μmol/L OTA在pH6下的荧光波谱图；固定激发波长为390nm；狭缝宽度6×6nm；
图3是pH6；20mmol/L MES缓冲液中含0.05％PEI中OTA浓度与荧光强度的标准曲线图；
图4是100nmol/L OTA在pH620mmol/L MES缓冲液中特异性实验图；固定发射波长为450nm；狭缝宽度6×6nm；
图5是不同浓度OTA在大麦玉米粉加标实验荧光波谱图；固定激发波长为390nm；狭缝宽度6×6nm。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。
实施例1
一、OTA与阳离子表面活性剂结合后光学特性变化
1)聚乙烯亚胺(PEI)对OTA光学特性的影响
在3支1.5mL离心管中分别加入890μL pH6 20mmol/L MES缓冲液、890μL pH7.420mmol/LMOPS缓冲液、890μL pH9 20mmol/L碳酸盐缓冲液，接着在3支离心管中分别加入10μL浓度为0.5％的PEI溶液，最后分别加入100μL的1μmol/L的OTA溶液，得到pH分别为6、7.4和9的含相同浓度为0.005％PEI的100nmol/L的OTA溶液。迷你离心机摇匀后，低温静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
2)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对OTA光学特性的影响
在3支1.5mL离心管中分别加入890μL pH6 20mmol/L MES缓冲液、890μL pH7.420mmol/LMOPS缓冲液、890μL pH9 20mmol/L碳酸盐缓冲液，接着在3支离心管中分别加入10μL浓度为0.5％的CTAB溶液，最后分别加入100μL的1μmol/L的OTA溶液，得到pH分别为6、7.4和9的含相同浓度为0.005％CTAB的100nmol/L的OTA溶液。迷你离心机摇匀后，低温静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
3)聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)对OTA光学特性的影响
在3支1.5mL离心管中分别加入850μL pH6 20mmol/L MES缓冲液、850μL pH7.420mmol/LMOPS缓冲液、850μL pH9 20mmol/L碳酸盐缓冲液，接着在3支离心管中分别加入50μL浓度为0.2％的PDDA溶液，最后分别加入100μL的1μmol/L的OTA溶液，得到pH分别为6、7.4和9的含相同浓度为0.01％PDDA(由于低浓度的PDDA对OTA的影响很小，所以用了2倍0.005％浓度的PDDA)的100nmol/L的OTA溶液。迷你离心机摇匀后，低温静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
4)无表面活性剂组
在3支1.5mL离心管中分别加入900μL pH6 20mmol/LMES缓冲液、900μLpH7.420mmol/L MOPS缓冲液、900μL 20mmol/L碳酸盐缓冲液，接着分别加入100μL的1μmol/L的OTA溶液，得到pH分别为6、7.4和9的100nmol/L的OTA溶液。用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm以及激发波长340nm处测荧光，狭缝宽度设为6×6nm。
如图1所示，对于无表面活性剂组，在pH6时OTA在340nm处波峰很高，390nm刚刚开始出现，说明在pH6是OTA在水溶液中的形态主要为OTA-。pH7.4时，OTA在340nm和390nm处都有明显的荧光波峰，说明此时OTA在溶液中的形态为OTA-和OTA2-共存。在pH9时OTA只在390nm处有一个荧光波峰，此时OTA在水溶液中主要为OTA2-的形态存在。
阳离子表面活性剂对OTA的荧光特性具有显著的影响，尤其在弱酸性pH6和中性pH7.4时。并且由于不同阳离子表面活性剂的结构不同，所带正电荷量的差异，PEI、CTAB和PDDA与OTA分别呈现出了不同的荧光特性。并且呈现出一定的规律性。在pH6、7.4时，加入PEI、CTAB或者PDDA后，390nm处吸收峰都明显增强，说明阳离子表面活性剂促进了OTA由单阴离子状态向双阴离子转变。pH9时，在CTAB浓度为0.005％时，与无CTAB相比波峰高度降低，波峰位置右移。在pH6时，PEI与OTA和PDDA相比，促使OTA2-的对应波峰发生了明显升高，因此选择PEI来建立检测OTA的荧光分析法。
二、PEI浓度的优化
在7支1.5mL离心管中分别加入850μL pH6 20mmol/L MES缓冲液，接着依次加入50μL浓度为0％、0.02％、0.1％、0.2％、0.4％1％、2％的PEI溶液，最后5支管中分别加入100μL10μmol/L OTA，得到浓度依次为含0、0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％PEI的1μmol/LOTA溶液，pH为6。迷你离心机摇匀后，低温静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
如图2所示，在pH6条件下，OTA的荧光波峰的位置随PEI浓度变化趋势不变，并且在PEI浓度大于0.05％后，随着PEI浓度增大，OTA峰值的变化很小。因此PEI浓度优选0.05％。
三、标准曲线的建立
含0.05％PEI的20mmol/L pH6 MES缓冲液的配置：50mL离心管中加入49.5mL20mmol/L pH6MES缓冲液，随后加入500μL 5％PEI，迷你离心机摇匀后得到50mL含0.05％PEI的pH6 20mmol/L MES缓冲液。
设置OTA浓度梯度为0、0.1nmol/L、0.5nmol/L、1nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、100nmol/L，每个浓度三组设置平行试验。在7支1.5mL离心管中加入990μL含0.05％PEI的pH6 20mmol/L MES buffer，接着依次加入10μL浓度分别为0、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L、10μmol/L的OTA。迷你离心机摇匀后，低温静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm和激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。最后选取在激发波长为390nm下荧光波谱图取442.5nm处值绘制标准曲线，以赭曲霉毒素A浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程及相关系数，将待测样品加到含PEI的MES缓冲液中，将测得的相对荧光值代入回归方程中，得到待测样品中的赭曲霉毒素A浓度。其中，相对荧光值为发射波长450nm和激发波长390nm处的所测赭曲霉毒素A的荧光值与无赭曲霉毒素A时的荧光值差。如图3所示，在OTA的浓度在0-100nmol/L范围内，荧光波峰强度与OTA浓度之间线性关系为y＝1.2809x+1.3856，R2＝0.996表明相关性很高。LOD＝3σ/S，σ为线性斜率，S选取0nmol/L OTA时检测值的标准偏差。计算得出LOD(最小可检测浓度)＝0.056nmol/L。
在pH6 20mmol/LMES缓冲液中(含0.05％PEI)，OTA的荧光波峰强度与浓度存在线性关系，并且相关性很高，检测限很低。
四、特异性试验
编号OTA、OTB、ZEN的三支离心管中加入800μL pH6 20mmol/L MES缓冲液、100μL0.5％PEI，接着分别加入100μL 1μmol/L OTA、100μL1μmol/L OTB、100μL 1μmol/L ZEN。OTA、OTB、ZEN每组三个平行样，迷你离心机摇匀后静置5min，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm和激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。以无PEI组，即以100μL超纯水代替100μL0.5％PEI加入，作为空白对照组。
荧光波谱如图4所示，在没有加入PEI时，OTA、OTB和ZEN荧光波峰都很低，OTA相比OTB和ZEN略高。在加入PEI后，OTA、OTB和ZEN的荧光波峰明显升高，OTA的荧光波峰远高于OTB和ZEN。加入0.05％PEI后OTA荧光波峰高度约为未加PEI时荧光波峰的6倍。因此，基于PEI的检测OTA的荧光分析法在检测OTA时抗干扰性强，具有高度的特异性。
五、大麦粉/玉米粉加标试验
(1)无PEI组
①0nmol/LOTA组(空白对照组)：
Figure BDA0002208760820000061
迷你离心机混匀后，静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
②10nmol/L OTA组：
Figure BDA0002208760820000062
Figure BDA0002208760820000071
迷你离心机混匀后，静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm和激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
③50nmol/L OTA组：
Figure BDA0002208760820000072
迷你离心机混匀后，静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
(2)0.05％PEI组
①0nmol/LOTA组(空白对照组)：
Figure BDA0002208760820000073
迷你离心机混匀后，静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
②10nmol/L OTA组：
Figure BDA0002208760820000074
迷你离心机混匀后，静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
③50nmol/L OTA组：
Figure BDA0002208760820000081
迷你离心机混匀后，静置五分钟，用PerkinElmer荧光分光光度计在发射波长450nm、激发波长390nm及激发波长340nm处测荧光。
如图5和表1所示，在大麦粉溶液或者玉米粉溶液中，未加入PEI时，0nmol/L OTA、10nmol/LOTA、50nmol/LOTA荧光波峰变化很小，而在含0.05％PEI缓冲液中，0nmol/L OTA、10nmol/LOTA、50nmol/LOTA荧光波峰变化明显，表明在大麦和玉米中，PEI仍然对OTA荧光特性有显著影响，不仅可以检测出OTA，而且回收率很高，OTA浓度为10nmol/L时，OTA在大麦中的回收率为114％，在玉米中的回收率为112％，OTA浓度为100nmol/L时，OTA在大麦中的回收率为104％，在玉米中的回收率为117％。表明了该方法用于在实际环境中检测OTA的可行性。
表1 OTA在大麦粉和玉米粉中的回收率
10nmol/L OTA中回收率 50nmol/L OTA中回收率
大麦 114％ 104％
玉米 112％ 113％
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）在含PEI的MES缓冲液中，加入不同标准浓度的赭曲霉毒素A，以赭曲霉毒素A浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程及相关系数；MES缓冲液的浓度为20mmol/L，pH为6；MES缓冲液中含PEI的浓度为0.001%-0.1%；
2）将待测样品加到含PEI的MES缓冲液中，将测得的相对荧光值代入回归方程中，得到待测样品中的赭曲霉毒素A浓度；
所述相对荧光值为发射波长450nm和激发波长390nm处的所测赭曲霉毒素A的荧光值与无赭曲霉毒素A时的荧光值差。
2.根据权利要求1所述的基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法，其特征在于，步骤1）中，MES缓冲液中含PEI的浓度为0.05%。
3.根据权利要求1所述的基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法，其特征在于，步骤2）中，回归方程为y=1.2809x+1.3856。
4.根据权利要求1所述的基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法，其特征在于，赭曲霉毒素A浓度的检测区间为0-100nmol/L。
5.根据权利要求1所述的基于PEI的赭曲霉毒素A的快速检测方法，其特征在于，赭曲霉毒素A浓度的检测下限为0.056nmol/L。
6.权利要求1至5任一项所述的方法在检测赭曲霉毒素A中的应用。
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