CN102391947B

CN102391947B - 一种多孔整体柱固定化酶微反应器的制备方法

Info

Publication number: CN102391947B
Application number: CN 201110343288
Authority: CN
Inventors: 叶芳贵; 张爱珠; 陆俊宇; 赵书林
Original assignee: Guangxi Normal University
Current assignee: Guangxi Normal University
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2011-11-03
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2031-11-03
Also published as: CN102391947A

Abstract

本发明公开了一种多孔整体柱固定化酶微反应器的制备方法，按照以下方法制备得到：首先制备聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)(poly(GMA-co-EDMA))整体柱，然后分别用半胱胺和金纳米粒子修饰poly(GMA-co-EDMA)整体柱，得到表面固载金纳米粒子的多孔聚合物整体柱。利用Au-NH₂键作用，将酶固定于该金纳米粒子修饰的多孔整体柱孔表面，即得多孔整体柱固定化酶微反应器。本发明具有以下优点：制备方法简单，酶固定反应条件温和，酶微反应器的通透性好，固定的酶量多，与自由溶液酶解相比，酶的活性、使用寿命和稳定性高，且可反复使用。

Description

一种多孔整体柱固定化酶微反应器的制备方法

技术领域

本方明涉及化学反应器，具体是一种多孔整体柱固定化酶微反应器的制备方法。

背景技术

酶催化反应具有高效、快速、高选择性等特点，因此受到了广泛的关注。与自由酶的相比，固定化酶具有以下优势：(1)酶可以重复使用，降低使用成本；(2)酶的稳定性得到较大提高。固定酶的载体材料的尺寸，渗透性，化学性质和机械强度都可能会影响到固定化酶的特性。因此，对载体基质的选择是影响所制备生物反应器活性和可用性的重要因素。近年来，多孔整体柱已经成为固定生物大分子的一种载体。选择多孔整体柱作为固定酶的载体是由于其独特的性质，包括能使底物与酶的活性位点更容易接触，非常低的背压，在大多数溶剂中能够稳定，其孔表面有多种官能团(Krenkova, J., Svec, F., J. Sep. Sci. 2009, 32, 706-718)。已有较多文献报道了将多孔整体柱作为载体，制备了各种不同的固定化酶微反应器(Stachowiak, T. B., Svec, F., Fréchet. J. M. J., Anal. Chem., 2007, 79, 6592-6598; Krenkova, J., Lacher, N. A., Svec, F., Anal. Chem., 2009, 81, 2004-2012; He, P., Greenway, G., Haswell, S. J., Process Biochem., 2010,45, 593-597)。固定化酶的性能与固定化方法也密切相关。目前国内外常见的固定化酶技术主要有物理吸附法，化学键合法、交联法。物理吸附固定酶的稳定性较差，酶易流失导致其使用寿命较短；化学键合法和交联法由于相对剧烈的固定化化学反应条件，往往易导致酶活性降低、甚至失去活性。

金纳米粒子因其具有特殊的稳定性、小尺寸效应、量子效应、表面效应和良好的生物亲和效应等，已被广泛应用于化学和生物学研究。由于金纳米粒子对SH、NH₂、CN等配体具有很强的亲和性，使得含以上官能基团的配体能够共价键合在其表面。将生物分子如蛋白质固定于金纳米粒子上是提高它们稳定性和使用寿命的一种有效的方法(Lu, J. Y., Ye, F.G., Zhang, A. Z., Wei, Z., Peng, Y., Zhao S., L., J. Sep. Sci., 2011, 34, 2329-2336)，其反应条件温和，能够使固定的生物大分子具有较为稳定的生物活性是该固定方法的一个主要的优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多孔整体柱固定化酶反应器的制备方法，该方法具有便捷、易于实现、环保等特点。

实现本发明目的的技术方案是：

用金纳米粒子胶体溶液，去修饰聚合物毛细管整体柱，然后再将酶固定到修饰过的聚合物毛细胞管整体柱的表面，得到多孔整体柱固定化酶反应器。

多孔整体柱固定化酶反应器的制备方法，包括如下步骤：

(1)金纳米粒子的合成：在搅拌条件下，先将去离子水加热回流至沸腾，接着加入氯金酸并继续加热至溶液剧烈沸腾，然后迅速加入柠檬酸钠并保持溶液沸腾一定时间，这期间溶液颜色由灰色变为酒红色，移去热源后自然冷却至室温，即获得金纳米粒子胶体溶液，于4℃下保存备用；所制得的金纳米粒子为球形，粒径为5~30nm

(2)多孔整体柱的制备：以甲基丙烯酸缩水甘油酯为功能单体(GMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂(EDMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)为热引发剂、1,4-丁二醇和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为致孔剂，在经乙烯基功能化的石英毛细管内原位聚合，制得聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯) (poly(GMA-co-EDMA))整体柱；各成分的用量重量百分比为：GMA10-20%，EDMA4-14%，DMF33-43%，丁二醇33-43%，AIBN0.8-1.2%，在室温下，用助推器将0.5~2.5mol/L的半胱胺水溶液通入poly(GMA-co-EDMA)整体柱中，反应10~60min，再用去离子水冲洗柱子，直至流出的液体为中性，即可得硫醇基衍生化的毛细管整体柱poly(GMA-co-EDMA-SH)；接着，室温下向poly(GMA-co-EDMA-SH)柱通入金纳米粒子胶体溶液直至红色溶液流出，通过Au-S键将金纳米粒子固载于整体柱孔表面，然后用蒸馏水冲去未反应的金纳米粒子胶体溶液，得到金纳米粒子修饰毛细管整体柱 poly (GMA-co-EDMA-AuNPs)；

(3)酶的固定：将0.05~0.2 mg mL⁻¹ 的酶溶液吸入注射器中，室温下以0.1~0.5 mL/h的流速通过入poly (GMA-co-EDMA-AuNPs)整体柱，反应时间为1~5h，通过Au-NH₂键作用将酶固定于(poly(GMA-co-EDMA))整体柱的表面，用5~30mmol/L, pH 6.5~7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗该整体柱，以除去未反应的酶，即得到多孔整体柱固定化酶微反应器。

所述毛细管的内径为25~530 μm。

本发明具有以下优点：

1、本发明以有机聚合物整体柱作为固定化酶微反应器的载体，具有制备简单，通透性好，背压低，比表面积大等优点；

2、本发明利用金纳米粒子对含NH₂的配体具有高度亲和性的特点将酶固定于多孔整体柱孔表面，具有酶的固定化反应条件温和、固定的酶量多、酶活性高、稳定性好和使用寿命长的优点；

3、应用范围广，具有很好的应用前景。

附图说明

图 1 多孔整体柱固定化酶微反应器制备过程示意图

图2 金纳米粒子的透射电镜图

图3 金纳米粒子修饰多孔整体柱的扫描电镜图 (a) 400× (b) 12000×

图4 多孔整体柱固定化酶微反应器的重现性和稳定性

图5 固定化α-葡萄糖苷酶微反应器的酶催化产物毛细管电泳分离图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但这些实施例绝非是对本发明的限定。

实施例1：制备多孔整体柱固定化α-葡萄糖苷酶微反应器及其应用

参阅图1，多孔整体柱固定化酶微反应器的制备方法，具体步骤如下：

(1)金纳米粒子的合成

量取100mL的去离子水置于250mL的圆底烧瓶中，在搅拌条件下加热回流至沸腾后加入1mL 1% (w/w)的氯金酸，然后继续加热至溶液剧烈沸腾，迅速加入2.5mL 1% (w/w)柠檬酸钠，继续保持溶液沸腾15min。这期间溶液的颜色由灰色变为酒红色。移去热源后自然冷却至室温，图2为所制得的金纳米粒子透射电镜图，从图中可知，金纳米粒子为球形，其粒径大约为15nm。

(2)多孔整体柱的制备

将石英毛细管(规格为内径530μm，外径690μm) 依次通入0.1mol/L HCl (30min)，去离子水(30min)， 0.1 mol/L NaOH (3h)，去离子水(30min)，甲醇(15min)，常温下通氮气15min。然后将γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷与甲醇按照1:1(v/v体积比)混合注入到处理好的毛细管中，于60℃水浴中反应24h。反应完成后用甲醇冲洗毛细管柱30min以除去未反应的物质，然后置于70℃气相色谱仪柱温箱中吹氮气3h，得到预处理好的毛细管，两端封口备用。将0.26g GMA、0.14g EDMA、4 mg AIBN 溶于 0.8 g DMF和 0.8 g 1,4-丁二醇的混合溶液中，超声震荡反应混合液，使其充分溶解澄清，接着氮吹10 min。将一小部分反应混合物吸入经上述乙烯化预处理的毛细管中，将毛细管的两端用硅橡胶封口，并浸于 60℃恒温水浴箱内，反应 24 h。反应完成后，用甲醇冲洗毛细管柱约 2 h，去除床层内致孔剂、残留反应试剂以及反应产生的一些低聚合度物质，制得聚poly(GMA-co-EDMA)整体柱。在室温下，用助推器将2.5mol/L的半胱胺水溶液通入poly(GMA-co-EDMA)整体柱中，反应20min，再用蒸馏水冲洗柱子，直至流出的液体为中性，即可得硫醇基衍生化的poly(GMA-co-EDMA-SH)整体柱。接着，室温下该poly(GMA-co-EDMA-SH)通入金纳米粒子胶体溶液直至红色溶液流出，用蒸馏水冲去未反应的金纳米粒子胶体溶液，得到金纳米粒子修饰poly (GMA-co-EDMA-AuNPs) 整体柱。图3为poly (GMA-co-EDMA-AuNPs)整体柱的横截面环境电镜扫描图。

(3)酶的固定

除去一次性医用注射器的不锈钢针头, 从制备好的poly(GMA-co-EDMA-AuNPs)整体柱中截出2cm, 用粘胶将其固定至原不锈钢针头部位，将0.1mg mL⁻¹ 的α-葡萄糖苷酶溶液吸入注射器中，室温下以0.2 mL/h的流速流过poly (GMA-co-EDMA-AuNPs)整体柱，反应时间为3h。用0.4 mL的磷酸盐缓冲溶液(10 mol/L, pH 7)冲洗该整体柱，以除去未键合的α-葡萄糖苷酶，即得到多孔整体柱固定化α-葡萄糖苷酶微反应器。考察了该微反应器的性能，如图4(a)所示，一天内连续使用该酶微反应器25次后，其酶活损失了大约20%；一个月内使用该酶微反应器6次，α-葡萄糖苷酶的活力只损失7.6%，如图4(b)所示。可见本发明所制备的酶微反应器具有良好的重现性和稳定性。

具体应用：

以α-葡萄糖苷酶为具体酶，进行具体的应用研究。

(1)按照实施例一的步骤进行，得到α-葡萄糖苷酶微反应器。α-葡萄糖苷酶能够催化底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，其催化产物为4-硝基酚(pNP)和D-吡喃葡萄糖苷。

(2)使用前先用0.2mL 10mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)平衡整体柱固定化酶微反应器。接着用注射泵将0.5mmol/L pNPG以0.6 mL/h的流速通入酶微反应器，流出液收集于0.5ml的离心管中，进行毛细管电泳分析。以25mmol/L硼砂盐缓冲液(pH 9.0)作为电泳介质，230 nm为检测波长，收集液采用重力进样10s，进样高度差15cm，接着在毛细管两端加分离电压9kV，使未反应的底物pNPG和产物pNP分离，根据产物峰面积得到固定化酶的活性。将1.86mmol/L α-葡萄糖苷酶标准抑制剂(阿卡波糖)与1.0mmol/L的pNPG按照1:1(v/v)的比例混合，按以上步骤分析，通过比较含抑制剂和不含抑制剂时产物pNP的峰面积，可用于研究单一化合物或混合物对该酶的抑制效率，如图5所示，在有抑制剂共存条件下，产物pNP的峰面积明显减小。

Claims

1.一种多孔整体柱固定化酶微反应器的制备方法，其特征在于：制备方法包括如下步骤：

(1)金纳米粒子的合成：在搅拌条件下，先将去离子水加热回流至沸腾，接着加入氯金酸并继续加热至溶液剧烈沸腾，然后迅速加入柠檬酸钠并保持溶液沸腾一定时间，这期间溶液颜色由灰色变为酒红色，移去热源后自然冷却至室温，即获得金纳米粒子胶体溶液，于4℃下保存备用；所述金纳米粒子为球形，粒径为5~30nm；

(2)多孔整体柱的制备：以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂、偶氮二异丁腈(AIBN)为热引发剂、1,4-丁二醇和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为致孔剂，在经乙烯基功能化的石英毛细管内原位聚合，制得聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯) (poly(GMA-co-EDMA))整体柱；室温下，用助推器将0.5~2.5mol/L的半胱胺水溶液通入poly(GMA-co-EDMA)整体柱中，反应10~60min，再用去离子水冲洗柱子，直至流出的液体为中性，即可得硫醇基衍生化的毛细管整体柱poly(GMA-co-EDMA-SH)，接着，室温下向poly(GMA-co-EDMA-SH)柱通入金纳米粒子胶体溶液直至红色溶液流出，用蒸馏水冲去未反应的金纳米粒子胶体溶液，得到金纳米粒子修饰毛细管整体柱 poly (GMA-co-EDMA-AuNPs)；

(3)酶的固定：将0.05~0.2 mg mL⁻¹ 的酶溶液吸入注射器中，室温下以0.1~0.5 mL/h的流速通过入poly (GMA-co-EDMA-AuNPs)整体柱，反应时间为1~5h，用0.3~0.6mL的5~20mmol/L, pH 6.5~7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗该整体柱，以除去未反应的酶，即得到多孔整体柱固定化酶微反应器；所述酶的固定是通过Au-NH₂键作用固定酶于poly (GMA-co-EDMA-AuNPs)整体柱孔表面，酶的固定化反应是在室温下进行的。

2.如权利要求1所述的多孔整体柱固定化酶微反应器制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中酶溶液是用5~30 mmol/L， pH为6.5~7.5磷酸盐缓冲液配制，固定酶之后用5~20 mmol/L, pH 6.5~7.5的磷酸盐缓冲液冲洗柱子除去未键合的酶。

3.如权利要求1所述的多孔整体柱固定化酶微反应器制备方法，其特征在于所用的整体材料载体的制备在25~530 μm内径的毛细管中进行。

4.用权利要求1-3之一所述制备方法制备的多孔整体柱固定化酶微反应器。