CN105543211B - 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用。本发明将纤维素溶解于NaOH‑Urea水溶液中，在搅拌条件下，加入纳米Fe3O4，加水再生，产物分离并洗涤，得到磁性纤维素；将步磁性纤维素与硝酸锌溶液混合搅拌5～30min，然后加入2‑甲基咪唑溶液，搅拌反应0.5～24h；得到载体磁性纤维素‑二甲基咪唑锌盐；将载体磁性纤维素‑二甲基咪唑锌盐与葡萄糖氧化酶液混合在0～25℃的温度下固定化1～12h，得到固定化葡萄糖氧化酶；本发明不需要加交联剂，固定化效率高，酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。

Description

一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于固定化酶技术领域，具体涉及一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用。
背景技术
传统意义上固定化是指釆用物理或化学的方法将酶在空间上限制在一些水不溶性的载体周围，限制其自由活动但是不影响生物催化剂的活性。传统的固定化技术主要分为四种：吸附法、包埋法、共价结合法、交联法。通常吸附法和包埋法的固定化效率(小于40％)和酶活回收率较低(小于20％)，交联法由于要加入交联剂，酶活的损失比较大。随着生物技术和材料科技的进步，固定化技术正面临着一个非常重要的转型。越来越多的新型材料用于酶的固定化，尤其是纳米材料以其独特的理化特性在固定化领域有着越来越重要的应用。传统的多孔材料无法进一步提高其负载量，是因为增加载体比表面积的同时不可避免的会减小微孔的直径，从而降低其负载能力。而纳米材料具有很大的比表面积，因此具有很好的负载能力。然而，这些载体的表面往往缺乏活泼的官能团不利于蛋白的结合。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，该方法以磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐为载体固定化葡萄糖氧化酶，具有固定化葡萄糖氧化酶固定化效率高，酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的固定化葡萄糖氧化酶。
本发明的再一目的在于提供上述固定化葡萄糖氧化酶的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，包含如下步骤：
(1)将纤维素溶解于NaOH-Urea水溶液中，在搅拌条件下，加入纳米Fe3O4，加水再生，产物分离并洗涤，得到磁性纤维素；
(2)将步骤(1)制得的磁性纤维素与硝酸锌溶液混合搅拌5～30min，得到混合溶液；
(3)在步骤(2)制得的混合溶液中加入2-甲基咪唑溶液，搅拌反应0.5～24h；得到载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐；
(4)将步骤(3)制得的载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐与葡萄糖氧化酶液混合，在0～25℃的温度下固定化1～12h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
步骤(1)中所述的纤维素优选为微晶纤维素；
步骤(1)中所述的纳米Fe3O4的制备方法，包含如下步骤：
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶解在水中，调节溶液pH为9～12；然后将混合溶液在30℃下反应0.5～3h，得到纳米Fe3O4；制得的纳米Fe3O4保存在Tris-HCl的缓冲溶液中；
所述的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O的物质的量比优选为2:1；
所述的Tris-HCL的缓冲溶液pH优选为7；
步骤(1)中所述的NaOH-Urea水溶液优选为包含如下按质量百分比计的组分：7％NaOH和12％Urea；
步骤(1)中所述的NaOH-Urea水溶液与纤维素的质量比为1：(0.01～0.05)；
步骤(1)中所述的溶解的温度优选为-12℃以下；
步骤(1)中所述的纤维素与纳米Fe3O4的质量比为1：(0.1～3)；
步骤(2)中所述的硝酸锌溶液中的硝酸锌与磁性纤维素的质量比为1：(0.5～2)；
步骤(3)中所述的2-甲基咪唑溶液中的2-甲基咪唑与步骤(2)中硝酸锌溶液中的硝酸锌的摩尔比优选为4:1；
步骤(2)、(3)中所述的搅拌速率为100～500rpm；
步骤(4)中所述的固定化葡萄糖氧化酶中，葡萄糖氧化酶的负载量为20mg/g～300mg/g磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐；
一种固定化葡萄糖氧化酶通过上述制备方法制备得到；
所述的固定化葡萄糖氧化酶在酶制剂领域中的应用；
本发明的原理：金属-有机骨架(MOF)材料，是基于有机配体与金属离子间的金属-配体络合作用，通过自组装而形成的一类超分子微孔网络结构材料。利用MOF材料的多空结构可以很好地固定化酶，而将固定化酶重复利用传统的方法是利用离心的手段进行分离，而此方法不利于固定化酶的重复利用并且会对酶活造成一定的损失。针对这一问题，本发明将纤维素在-12℃下溶解在NaOH/Urea溶液中，同时引入纳米四氧化三铁，然后加水再生破坏了溶剂与纤维素之间的氢键，当溶剂慢慢与水混合之后，纤维素自身又开始以氢键的方式重新形成结晶体结构，慢慢从混合溶液中析出，在磁场作用下产物可与液相快速分离，进而得到磁性纤维素微球(RCM)；磁性纤维素纳米晶为基材，通过合成ZIF-8进行表面改性，获得载体；然后将酶通过嵌入方式固定在载体上，从而得到固定化的酶制剂。
本发明相对于现有技术具有以下优点：
(1)本发明在固定化酶过程中不使用戊二醛、甲醛等双功能试剂，成本较低，反应温和，能够较大程度保地持酶活(78.6％～90％)，提高酶活回收率。
(2)本发明所制备的材料能够用作固定化酶的载体，能够固定化脂肪酶、蛋白酶、过氧化物酶等一系列酶。并具有作为蛋白质药物载体的潜质。
附图说明
图1是实施例1～3制备得到的磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐的红外光谱图；其中，(a)：实施例1；(b)：实施例2；(c)：实施例3。
图2是实施例1～5制备得到的磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐的X-射线衍射图：其中，(a)：实施例1；(b)：实施例2；(c)：实施例3；(d)：实施例4；(e)：实施例5。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中葡萄糖氧化酶粗酶粉购自试剂公司；
实施例1
(1)称取2.43g FeCl3·6H2O和0.9g FeCl2·4H2O溶解在300mL蒸馏水中，向溶液中滴加氨水，调节溶液pH为10，将混合溶液在30℃下反应1h，得到纳米Fe3O4；制得的纳米Fe3O4可保存在pH＝7的Tris-HCl的缓冲溶液中；
(2)称取10mg微晶纤维素，-12℃条件下溶解在含有质量百分比为7％NaOH与12％Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纤维素的质量比是1：0.02；在磁力搅拌条件下加入5mg的Fe3O4，然后向混合溶液中加水使纤维素再生，用磁铁将其分离，并用蒸馏水洗涤三次，得到磁性纤维素纳米晶；
(3)取23.799mg六水合硝酸锌溶解在2mL蒸馏水中，与15mg步骤(1)制得的磁性纤维素纳米晶混合搅拌20min，搅拌速度为100rpm，得到混合溶液；
(4)将26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸馏水中，然后加入步骤(3)制得的混合溶液中，搅拌条件(搅拌速度为100rpm)下反应30min，得到载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐；
(5)将葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，过滤除去不溶性杂质，取0.1mL酶液(酶含量1mg)与步骤(3)制得的载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐混合，25℃搅拌条件下进行固定化12h，然后用蒸馏水洗涤未固定化到载体上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
本实施例固定化酶效率为92.4％，酶活回收率为78.6％，制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的负载量为26.5mg酶/g载体。
实施例2
(1)称取2.43g FeCl3·6H2O和0.9g FeCl2·4H2O溶解在300mL蒸馏水中，向溶液中滴加氨水，调节溶液pH为10，将混合溶液在30℃下反应1h，得到纳米Fe3O4；制得的纳米Fe3O4可保存在pH＝7的Tris-HCl的缓冲溶液中；
(2)称取10mg微晶纤维素，-12℃条件下溶解在含有质量百分比为7％NaOH与12％Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纤维素的质量比是1：0.02，在磁力搅拌条件下加入10mg的Fe3O4，然后向混合溶液中加水使纤维素再生，用磁铁将其分离，并用蒸馏水洗涤三次，得到磁性纤维素纳米晶；
(3)取23.799mg六水合硝酸锌溶解在2mL蒸馏水中，与20mg步骤(1)制得的磁性纤维素纳米晶混合搅拌20min，搅拌速度为300rpm，得到混合溶液；
(4)将26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸馏水中，然后加入步骤(3)制得的混合溶液中，搅拌条件(搅拌速度为300rpm)下反应12h，得到载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐；
(5)将葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，过滤除去不溶性杂质，取0.6mL酶液(酶含量6mg)与步骤(3)制得的载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐混合，0℃条件搅拌下进行固定化12h，用蒸馏水洗涤未固定化到载体上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
本实施例固定化酶效率为87.3％，酶活回收率为84.2％，制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的负载量为121.7mg酶/g载体。
实施例3
(1)称取2.43g FeCl3·6H2O和0.9g FeCl2·4H2O溶解在300mL蒸馏水中，向溶液中滴加氨水，调节溶液pH为10，将混合溶液在30℃下反应1h，得到纳米Fe3O4；制得的纳米Fe3O4可保存在pH＝7的Tris-HCl的缓冲溶液中；
(2)称取10mg微晶纤维素，-12℃条件下溶解在含有质量百分比为7％NaOH与12％Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纤维素的质量比是1：0.02，在磁力搅拌条件下加入15mg的Fe3O4，然后向混合溶液中加水使纤维素再生，用磁铁将其分离，并用蒸馏水洗涤三次，得到磁性纤维素纳米晶；
(3)取23.799mg六水合硝酸锌溶解在2mL蒸馏水中，与25mg步骤(1)制得的磁性纤维素纳米晶混合搅拌20min，搅拌速度为500rpm，得到混合溶液；
(4)将26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸馏水中，然后加入步骤(3)制得的混合溶液中，搅拌条件(搅拌速度为300rpm)下反应24h，得到载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐；
(5)将葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，过滤除去不溶性杂质，取1mL酶液(酶含量10mg)与步骤(3)制得的载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐混合，25℃搅拌条件下进行固定化3h，用蒸馏水洗涤未固定化到载体上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
本实施例固定化酶效率为89.5％，酶活回收率为83.6％，制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的负载量为247.6mg酶/g载体。
实施例4
(1)称取2.43g FeCl3·6H2O和0.9g FeCl2·4H2O溶解在300mL蒸馏水中，向溶液中滴加氨水，调节溶液pH为10，将混合溶液在30℃下反应1h，得到纳米Fe3O4；制得的纳米Fe3O4可保存在pH＝7的Tris-HCl的缓冲溶液中；
(2)称取10mg微晶纤维素，-12℃条件下溶解在含有质量百分比为7％NaOH与12％Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纤维素的质量比是1：0.05；在磁力搅拌条件下加入20mg的Fe3O4，然后向混合溶液中加水使纤维素再生，用磁铁将其分离，并用蒸馏水洗涤三次，得到磁性纤维素纳米晶；
(3)取23.799mg六水合硝酸锌溶解在2mL蒸馏水中，与30mg步骤(1)制得的磁性纤维素纳米晶混合搅拌20min，搅拌速度为300rpm，得到混合溶液；
(4)将26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸馏水中，加入步骤(3)制得的混合溶液中，搅拌条件(搅拌速度为300rpm)下反应1h，得到载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐；
(5)将葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，过滤除去不溶性杂质，取1mL酶液(酶含量10mg)与步骤(3)制得的载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐混合，25℃搅拌条件下进行固定化6h，然后用蒸馏水洗涤未固定化到载体上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
本实施例固定化酶效率为92.6％，酶活回收率为79.4％，制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的负载量为286.7mg酶/g载体。
实施例5
(1)称取2.43g FeCl3·6H2O和0.9g FeCl2·4H2O溶解在300mL蒸馏水中，向溶液中滴加氨水，调节溶液pH为10，将混合溶液在30℃下反应1h，得到纳米Fe3O4；制得的纳米Fe3O4可保存在pH＝7的Tris-HCl的缓冲溶液中；
(2)称取10mg微晶纤维素，-12℃条件下溶解在含有质量百分比为7％NaOH与12％Urea的NaOH-Urea水溶液中，其中，NaOH-Urea溶液和纤维素的质量比是1：0.02；在磁力搅拌条件下加入30mg的Fe3O4，然后向混合溶液中加水使纤维素再生，用磁铁将其分离，并用蒸馏水洗涤三次，得到磁性纤维素纳米晶；
(3)取23.799mg六水合硝酸锌溶解在2mL蒸馏水中，与40mg步骤(1)制得的磁性纤维素纳米晶混合搅拌20min，搅拌速度为100rpm，得到混合溶液；
(4)将26.272mg的2-甲基咪唑溶解在2mL蒸馏水中，步骤(3)制得的混合溶液中，搅拌条件(搅拌速度为100rpm)下反应30min，得到载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐；
(5)将葡萄糖氧化酶粗酶粉溶解在水中，过滤除去不溶性杂质，取1mL酶液(酶含量10mg)与步骤(3)制得的载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐混合，25℃搅拌条件下进行固定化应12h，用蒸馏水洗涤未固定化到载体上的酶，得到固定化葡萄糖氧化酶；
本实施例固定化酶效率为84.7％，酶活回收率为86.9％，制得的固定化葡萄糖氧化酶中葡萄糖氧化酶的负载量为275.8mg酶/g载体。
效果实施例
对实施例1～5制得的磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐分别进行红外光谱和X-射线衍射检测；结果见图1和图2。
从图1可以看出，实施例1～3制得的磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐在3440和3370cm-1处峰分别反映纤维素分子内和分子间氢键的峰。594cm-1处有很强的吸收峰，是Fe3O4特征吸附峰。
从图2可以看出，衍射角为12.4，20.2和22.2°的三个峰为再生纤维素衍射峰，在衍射角为30.24，35.60，43.24，和57.16°出现明显的峰为Fe3O4的晶面衍射峰。并且随着Fe3O4含量增多，其峰强度明显增强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将纤维素溶解于NaOH-Urea水溶液中，在搅拌条件下，加入纳米Fe3O4，加水再生，产物分离并洗涤，得到磁性纤维素；
(2)将步骤(1)制得的磁性纤维素与硝酸锌溶液混合搅拌5～30min，得到混合溶液；
(3)在步骤(2)制得的混合溶液中加入2-甲基咪唑溶液，搅拌反应0.5～24h；得到载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐；
(4)将步骤(3)制得的载体磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐与葡萄糖氧化酶液混合在0～25℃的温度下固定化1～12h，得到固定化葡萄糖氧化酶。
2.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的纳米Fe3O4的制备方法，包含如下步骤：
将FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O溶解在水中，调节溶液pH为9～12；然后将混合溶液在30℃下反应0.5～3h，得到纳米Fe3O4。
3.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)中NaOH-Urea水溶液为包含如下按质量百分比计的组分：7％NaOH和12％Urea。
4.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的溶解的温度为-12℃以下。
5.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的纤维素与纳米Fe3O4的质量比为1：(0.1～3)。
6.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的硝酸锌溶液中的硝酸锌与磁性纤维素的质量比为1：(0.5～2)。
7.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的2-甲基咪唑溶液中的2-甲基咪唑与步骤(2)中硝酸锌溶液中的硝酸锌的摩尔比为4:1。
8.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的固定化葡萄糖氧化酶中，葡萄糖氧化酶的负载量为20mg/g～300mg/g磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐。
9.一种固定化葡萄糖氧化酶，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的固定化葡萄糖氧化酶在酶制剂领域中的应用。
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