CN106978451B - 一种固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，属于固定化酶催化反应应用领域。该方法以磁性纤维素‑二甲基咪唑锌盐为载体固定化葡萄糖氧化酶，并将其应用于催化葡萄糖氧化反应。具有固定化葡萄糖氧化酶催化效率高，酶活回收率高，操作简便，稳定性高，可重复使用等特点。本发明的条件温和，操作简便，转化率高，且催化剂固定化葡萄糖氧化酶可以通过磁铁分离重复使用。在最适条件下恒温，恒pH下进行反应，重复操作9次后固定化葡萄糖氧化酶仍保留有较高酶活。

Description

一种固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法
技术领域
本发明属于固定化酶催化反应应用领域，具体涉及一种固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法。
背景技术
葡萄糖酸钠是一种用途极为广泛的多羟基有机酸盐，易溶于水。其分子式为C6H11NaO7，相对分子质量为218.14。是葡萄糖的一种深加工产品。同时，还是制备葡萄糖酸盐(铜、锌、亚铁盐)与葡萄糖酸内酯等产品的基础原料，在建筑工业、食品、水质稳定剂、医药等方面有着广泛的用途。
酶是一种重要的生物催化剂，其能高效、专一、温和地将底物转化为产物。然而，酶易失活、难以重复使用，故在工业上尤其是在有机合成中的应用受到一定的限制。通过固定化除了更方便的处理酶，固定化酶可以使其更容易从产品的分离，从而最小化或消除产品的蛋白质污染问题。固定化也有利于有效的回收和再利用价格昂贵的酶，在许多应用中考虑到经济的可行性，使它们用于连续的固定床操作。另一个好处可以增强其稳定性，如热稳定性与机溶剂耐受性或酶的自溶。改进酶性能通过增强稳定性和重复再利用反映在较高的催化剂生产率。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法。该方法以本实验室制备出的磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐为载体固定化葡萄糖氧化酶，并将其应用于催化葡萄糖氧化反应。具有固定化葡萄糖氧化酶催化效率高，酶活回收率高，操作简便，稳定性高，可重复使用等特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，包含如下步骤：
(1)将葡萄糖氧化酶固定于磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐载体上，固定化0.5～3h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
(2)将步骤(1)制得的固定化葡萄糖氧化酶与葡萄糖溶液混合反应；
(3)在步骤(2)制得的混合溶液保持在30～70℃下，pH 4.0～9.0，搅拌反应1～24h；
(4)将步骤(3)制得的混合溶液中加入氢氧化钠溶液；
(5)用磁铁将步骤(4)制得的反应液中固定化酶分离，洗涤投入下一次的使用，将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸钠。
步骤(1)中所述的磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐在专利“申请号：201610111460.0、名称：一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用”中公开。
步骤(1)中所述的葡萄糖氧化酶与磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐的质量比为0.05～0.4；优选为1:10。
步骤(1)中所述的固定化的时间优选为1h；
步骤(2)中所述的葡萄糖溶液的浓度为20～200mM；优选为100～200mM；更优选为100mM；
步骤(3)中所述的搅拌反应的温度优选为40～50℃；更优选为40℃；
步骤(3)中所述的搅拌反应的pH优选为6.0～7.0；更优选为6.0；
步骤(3)中所述的搅拌反应的时间为6h；
步骤(3)中所述的搅拌的速率为150～400rpm；优选为200～240rpm；
步骤(4)中所述的加入氢氧化钠溶液至反应液的pH为10。
步骤(4)中所述的氢氧化钠溶液的浓度为50～500mM；优选为200～400mM。
本发明的原理：葡萄糖酸钠(sodium gluconate)，又称五羟基己酸钠，是一种用途极为广泛的多羟基有机酸盐，易溶于水。是葡萄糖的一种深加工产品。同时，还是制备葡萄糖酸盐(铜、锌、亚铁盐)与葡萄糖酸内酯等产品的基础原料，在建筑工业、食品、水质稳定剂、医药等方面有着广泛的用途。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明在用磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠过程中条件温和，操作简便，转化率高，且催化剂固定化葡萄糖氧化酶可以通过磁铁分离重复使用。在最适条件下恒温，恒pH下进行反应，重复操作9次后固定化葡萄糖氧化酶仍保留有较高酶活。
附图说明
图1是磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶的SEM扫描电镜图。
图2是磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶重复操作9次后的相对酶活。
图3是葡萄糖酸钠液相标品图(A)和实施例5酶促反应产物液相图(B)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中葡萄糖氧化酶粗酶粉购自试剂公司；
磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶的SEM扫描电镜图，如图1所示。
实施例1
(1)称取一定量葡萄糖氧化酶粗酶粉与磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐载体按质量比1:10进行混合，固定化1h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
(2)称取18g葡萄糖溶解在水中，制备得到100mM的葡萄糖溶液，与步骤(1)制得的固定化葡萄糖氧化酶混合，在转速200rpm，pH 7.0，温度40℃下进行反应；
(3)反应6h至反应液中检测不到葡萄糖的存在结束反应；
(4)向步骤(3)制得的反应液中加入氢氧化钠至反应液pH为10；
(5)用磁铁将步骤(4)制得的反应液中固定化葡萄糖氧化酶分离，洗涤投入下一次的使用，并将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸钠。
本实施例中葡萄糖转化率为96.25％，磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶重复使用9次仍保留有60.61％的酶活。
实施例2
(1)称取一定量葡萄糖氧化酶粗酶粉与磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐载体按质量比1:10进行混合，固定化1h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
(2)称取36g葡萄糖溶解在水中，制备得到200mM的葡萄糖溶液，与步骤(1)制得的固定化葡萄糖氧化酶混合，在转速200rpm，pH 7.0，温度40℃下进行反应；
(3)反应6h至反应液中检测不到葡萄糖的存在结束反应；
(4)向步骤(3)制得的反应液中加入氢氧化钠至反应液pH为10；
(5)用磁铁将步骤(4)制得的反应液中固定化葡萄糖氧化酶分离，洗涤投入下一次的使用，并将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸钠。
本实施例中葡萄糖转化率为92.25％，磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶重复使用9次仍保留有53.72％的酶活。
实施例3
(1)称取一定量葡萄糖氧化酶粗酶粉与磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐载体按质量比1:10进行混合，固定化1h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
(2)称取18g葡萄糖溶解在水中，制备得到100mM的葡萄糖溶液，与步骤(1)制得的固定化葡萄糖氧化酶混合，在转速240rpm，pH 7.0，温度40℃下进行反应；
(3)反应6h至反应液中检测不到葡萄糖的存在结束反应；
(4)向步骤(3)制得的反应液中加入氢氧化钠至反应液pH为10；
(5)用磁铁将步骤(4)制得的反应液中固定化葡萄糖氧化酶分离，洗涤投入下一次的使用，并将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸钠。
本实施例中葡萄糖转化率为98.74％，磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶重复使用9次仍保留有54.67％的酶活。
实施例4
(1)称取一定量葡萄糖氧化酶粗酶粉与磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐载体按质量比1:10进行混合，固定化1h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
(2)称取18g葡萄糖溶解在水中，制备得到100mM的葡萄糖溶液，与步骤(1)制得的固定化葡萄糖氧化酶混合，在转速200rpm，pH 7.0，温度50℃下进行反应；
(3)反应6h至反应液中检测不到葡萄糖的存在结束反应；
(4)向步骤(3)制得的反应液中加入氢氧化钠至反应液pH为10；
(5)用磁铁将步骤(4)制得的反应液中固定化葡萄糖氧化酶分离，洗涤投入下一次的使用，并将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸钠。
本实施例中葡萄糖转化率为87.93％，磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶重复使用9次仍保留有51.94％的酶活。
实施例5
(1)称取一定量葡萄糖氧化酶粗酶粉与磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐载体按质量比1:10进行混合，固定化1h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
(2)称取18g葡萄糖溶解在水中，制备得到100mM的葡萄糖溶液，与步骤(1)制得的固定化葡萄糖氧化酶混合，在转速200rpm，pH 6.0，温度40℃下进行反应；
(3)反应6h至反应液中检测不到葡萄糖的存在结束反应；
(4)向步骤(3)制得的反应液中加入氢氧化钠至反应液pH为10；
(5)用磁铁将步骤(4)制得的反应液中固定化葡萄糖氧化酶分离，洗涤投入下一次的使用，并将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸钠。
本实施例中葡萄糖转化率为99.36％，磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶重复使用9次仍保留有64.29％的酶活。
本实施中磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐固定化葡萄糖氧化酶重复操作9次后的相对酶活，如图2所示。
葡萄糖酸钠液相标品图(A)和本实施例酶促反应产物液相图(B)，如图3所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将葡萄糖氧化酶固定于磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐载体上，固定化0.5～3h，得到固定化葡萄糖氧化酶；
(2)将步骤(1)制得的固定化葡萄糖氧化酶与葡萄糖溶液混合反应；
(3)在步骤(2)制得的混合溶液保持在30～70℃下，pH 4.0～9.0，150～400rpm搅拌反应1～24h；
(4)将步骤(3)制得的混合溶液中加入氢氧化钠溶液至反应液的pH为10；
(5)用磁铁将步骤(4)制得的反应液中固定化葡萄糖氧化酶分离，洗涤投入下一次的使用，将反应液旋蒸，结晶，干燥得到葡萄糖酸钠。
2.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的葡萄糖氧化酶与磁性纤维素-二甲基咪唑锌盐的质量比为0.05～0.4。
3.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的葡萄糖溶液的浓度为20～200mM。
4.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的搅拌反应的温度为40～50℃。
5.根据权利要求4所述的固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的搅拌反应的温度为40℃。
6.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的搅拌反应的pH为6.0～7.0。
7.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的搅拌反应的时间为6h。
8.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的氢氧化钠溶液的浓度为50～500mM。
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