CN104805068B - 一种大豆环氧化合物水解酶制剂及固定化方法 - Google Patents
一种大豆环氧化合物水解酶制剂及固定化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104805068B CN104805068B CN201510183836.4A CN201510183836A CN104805068B CN 104805068 B CN104805068 B CN 104805068B CN 201510183836 A CN201510183836 A CN 201510183836A CN 104805068 B CN104805068 B CN 104805068B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- epoxide hydrolase
- enzyme
- soybean
- soybean epoxide
- uio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明属于材料的技术领域，公开了一种大豆环氧化合物水解酶固定方法及酶制剂。所述方法为将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为5‑9的缓冲溶液中，配置成酶溶液；将酶溶液与UiO‑66‑NH2纳米晶体混合，得到混合物；在0‑35℃下，向混合物中加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终饱和度为80％，搅拌混合1‑60min，得到混合悬浊液；将混合悬浊液与戊二醛溶液混合，搅拌反应1‑200min，冷冻干燥，得到大豆环氧化合物水解酶制剂。本发明使用简单的沉淀交联技术，成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活，提高载体的载酶量，提高酶活回收率，固定化效果好。
Description
技术领域
本发明属于材料的技术领域，涉及一种大豆环氧化合物水解酶固定方法及酶制剂。
背景技术
金属有机骨架材料固定化酶是国内外的研究热点因为其独特多样的拓扑结构、孔隙度以及物理特性。金属有机骨架材料具有多孔、大比表面积和多金属位点等诸多性能，在气体贮存、分子分离、催化、药物缓释等领域有较好的应用前景。
目前金属有机骨架材料固定化酶常用的是封装和物理吸附的方法将酶固定在中孔载体上，但封装和物理吸附法所需要的固定时间较长(50h，Lykourinou V.,Chen Y.,Wang X.-S.,et al.Immobilization of MP-11into a mesoporous metal–organicframework,MP-11@mesoMOF:a new platform for enzymatic catalysis[J].Journal ofthe American Chemical Society,2011,133:10382-10385)，载酶量较低(7.0-50.5mg酶/g载体，Chen Y.,Lykourinou V.,Vetromile C.,et al.How can proteins enter theinterior of a MOF Investigation of cytochrome c translocation into a MOFconsisting of mesoporous cages with microporous windows[J].Journal of theAmerican Chemical Society,2012,134:13188-13191)。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简单的沉淀交联技术的固定化方法即一种大豆环氧化合物水解酶固定方法。本发明将酶沉淀在UiO-66-NH2纳米晶体的表面，再通过戊二醛(交联剂)的交联作用，酶包裹在UiO-66-NH2纳米晶体的表面，从而形成一种特定结构的固定化酶。通过本发明的固定化方法所制备的固定化大豆环氧化合物水解酶具有固定化效率高、酶的稳定性好、载酶量高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。
本发明的另一目的在于提供由上述固定方法制备而成的酶制剂。
一种大豆环氧化合物水解酶固定方法，具体包括以下步骤：
(1)将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为5-9的缓冲溶液中，配置成酶溶液；
(2)将(1)中所得的酶溶液与UiO-66-NH2纳米晶体混合，得到混合物；
(3)在0-35℃下，向(2)所得的混合物中加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终饱和度为80％搅拌混合1-60min，得到混合悬浊液；
(4)将(3)所得的混合悬浊液与戊二醛溶液混合，搅拌1-200min，得到固定化大豆环氧化合物水解酶；
(5)将(4)中所得的固定化大豆环氧化合物水解酶冷冻干燥后得到大豆环氧化合物水解酶制剂。
所述步骤(1)中的UiO-66-NH2纳米晶体是由四氯化铬与2-氨基对苯二甲酸合成得到；其具体制备方法为：称取摩尔比为1：1的2-胺基对苯二甲酸(1.1464g)和四氯化锆(1.4914g)溶解到90-100mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在80℃的油浴条件下搅拌反应2h，然后调高温度至100℃继续搅拌反应4h；反应结束后抽滤并用无水乙醇洗涤，最后在70℃条件下烘干即得UiO-66-NH2纳米晶体。
所述缓冲液为磷酸缓冲液；所述酶溶液的浓度为5mg/mL。
所述戊二醛用量为大豆环氧化合物水解酶与戊二醛的质量比1：(10-20)。
所述戊二醛溶液的质量浓度为25％。
所述大豆环氧化合物水解酶与UiO-66-NH2纳米晶体(即基材)的质量比为1:(2-20)。
所述步骤(3)、(4)中搅拌速率为100-500r/min。
所述步骤(2)中大豆环氧化合物水解酶为大豆环氧化合物水解酶酶粉。
本发明原理：
UiO-66-NH2纳米晶体表面含有游离的氨基，而大豆环氧化合物水解酶中的碱性氨基酸(赖氨酸(Lys))含有两个以上的氨基。在溶液中酶蛋白沉降在UiO-66-NH2纳米晶体表面，酶中未参与反应的氨基与UiO-66-NH2纳米晶体表面的游离氨基、酶自身的氨基在戊二醛的作用下发生交联反应，形成酶蛋白包裹在UiO-66-NH2纳米晶体表面的酶-UiO-66-NH2纳米晶体复合物，从而实现酶的固定化。酶交联固定于基材(即UiO-66-NH2纳米晶体)表面的示意图如图6所示。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
(1)发明使用简单的沉淀交联技术，成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活(60％～99％)，提高载体的载酶量，提高酶活回收率，固定化效果好。
(2)本发明的固定化大豆环氧化合物水解酶方法，能够用于大豆环氧化合物水解酶等一系列含赖氨酸的酶，并具有作为1,2-环氧辛烷不对称高效水解的平台的潜质。
附图说明
图1为交联剂(戊二醛)的用量对酶制剂的相对酶活回收率以及载酶量的影响；
图2为交联时间对酶制剂的相对酶活回收率以及载酶量的影响；
图3为基材(即UiO-66-NH2纳米晶体)与酶的质量比对酶制剂的相对酶活回收率以及载酶量的影响；
图4为实施例1制备的酶制剂在不同pH之下的相对酶活力；
图5为实施例1制备的酶制剂在不同温度下的相对酶活力；
图6为酶交联固定于基材(即UiO-66-NH2纳米晶体)表面的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例以及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为6.5的磷酸缓冲溶液中，配置成酶溶液；将50mg UiO-66-NH2纳米晶体(基材)与1mL 5mg/mL的酶溶液混匀(质量比10:1)；0℃搅拌下加入一定体积的饱和硫酸铵溶液(饱和度为100％)，使硫酸铵的最终饱和度为80％，以200rpm的搅拌速度搅拌30min；加入一定量25％的戊二醛溶液，使戊二醛终质量为65mg，在0℃、300rpm下搅拌交联反应120min；洗涤、冷冻干燥得到大豆环氧化合物水解酶制剂1。
酶制剂1的相对酶活回收率为82.911％，产品中大豆环氧化合物水解酶与UiO-66-NH2基材比例为89.56mg/g。对酶制剂1进行酶活性的测试，测试结果如图4、5所示。
只改变戊二醛的用量，其他条件与实施例1相同，分别得到以下酶制剂：戊二醛终质量为57.5mg，得到酶制剂2；戊二醛终质量为62.5mg，得到酶制剂3；戊二醛终质量为70mg，得到酶制剂4；戊二醛终质量为75mg，得到酶制剂5；戊二醛终质量为88.4mg，得到酶制剂6。测定酶制剂(酶制剂1-6)的相对酶活回收率和载酶量，其测试结果如图1所示，图1为戊二醛的用量对酶制剂的相对酶活回收率和载酶量的影响。
实施例2
将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为6.5的磷酸缓冲溶液中，配置成酶溶液；将50mg UiO-66-NH2与1mL 5mg/mL的酶溶液混匀(质量比10:1)；0℃搅拌下加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终饱和度为80％，以200rpm的转速搅拌30min；加入一定量25％的戊二醛溶液，使戊二醛终质量为65mg，在0℃、300rpm下搅拌交联反应20min；洗涤、冷冻干燥，得到大豆环氧化合物水解酶制剂7。
酶制剂7的相对酶活回收率为42.676％，产品中大豆环氧化合物水解酶与UiO-66-NH2基材比例为82.49mg/g.
只改变交联反应时间，其他条件与实施例2相同，分别得到以下酶制剂：交联反应40min，得到酶制剂8；交联反应60min，得到酶制剂9；交联反应75min，得到酶制剂10；交联反应90min，得到酶制剂11；交联反应150min，得到酶制剂12；交联反应180min，得到酶制剂13。测定酶制剂(酶制剂7-13以及酶制剂1)的相对酶活回收率和载酶量，其测试结果如图2所示，图2为交联反应时间对酶制剂的相对酶活回收率和载酶量的影响。
实施例3
将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为6.5的磷酸缓冲溶液中，配置成酶溶液；将25mg UiO-66-NH2纳米晶体(即基材)与1mL 5mg/mL的酶溶液混匀(质量比5:1)；0℃搅拌下加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终饱和度为80％，以200rpm的速度搅拌30min；加入一定量25％的戊二醛溶液，使戊二醛终质量为65mg，在0℃、300rpm下搅拌120min；洗涤、冷冻干燥，得到大豆环氧化合物水解酶制剂14。
酶制剂14的相对酶活回收率为64.191％，产品中大豆环氧化合物水解酶与UiO-66-NH2基材比例为173.58mg/g。
只改变UiO-66-NH2纳米晶体(即基材)与酶的质量比，其他条件与实施例3相同，分别得到以下酶制剂：UiO-66-NH2纳米晶体与酶的质量比2.5:1，得到酶制剂15；UiO-66-NH2纳米晶体与酶的质量比6:1，得到酶制剂16；UiO-66-NH2纳米晶体与酶的质量比8:1，得到酶制剂17；UiO-66-NH2纳米晶体与酶的质量比11:1，得到酶制剂18。测定酶制剂(酶制剂14-18以及酶制剂1)的相对酶活回收率和载酶量，其测试结果如图3所示，图3为基材与酶的质量比对酶制剂的相对酶活回收率和载酶量的影响。
实施例4
将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为6.0的磷酸缓冲溶液中，配置成酶溶液；将55mg UiO-66-NH2纳米晶体与1mL 5mg/mL的酶溶液混匀(质量比11:1)；0℃搅拌下加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终饱和度为80％，在0℃、300rpm下搅拌30min；加入一定量25％的戊二醛溶液，使戊二醛终质量为65mg，在0℃、200rpm下搅拌交联反应120min；洗涤、冷冻干燥，得到大豆环氧化合物水解酶制剂。
酶制剂的相对酶活回收率为83.353％，产品中大豆环氧化合物水解酶与UiO-66-NH2基材比例为79.37mg/g.
实施例5
将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为5.5的磷酸缓冲溶液中，配置成酶溶液；将40mg UiO-66-NH2纳米晶体与1mL 5mg/mL的酶溶液混匀(质量比8:1)；0℃搅拌下加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终饱和度为80％，在0℃、250rpm下搅拌30min；加入一定量25％的戊二醛溶液，使戊二醛终质量为65mg，在0℃、500rpm下搅拌交联反应120min；洗涤、冷冻干燥，得到大豆环氧化合物水解酶制剂。
酶制剂的相对酶活回收率为68.830％，产品中大豆环氧化合物水解酶与UiO-66-NH2基材比例为108.98mg/g。
上述实施例仅为本发明的部分实施例，并非用来限定本发明的实施范围；即凡依本发明内容所作的均等变化与修饰，都为本发明权利要求所要求保护的范围所涵盖。
Claims (8)
1.一种大豆环氧化合物水解酶固定方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)将大豆环氧化合物水解酶分散在pH为5-6.5的缓冲溶液中，得到酶溶液；
(2)将(1)中所得的酶溶液与UiO-66-NH2纳米晶体混合，得到混合物；
(3)在0-35℃下，向(2)所得的混合物中加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终饱和度为80%，搅拌混合1-60min，得到混合悬浊液；
(4)将(3)所得的混合悬浊液与戊二醛溶液混合，搅拌反应1-200min，得到固定化大豆环氧化合物水解酶；
(5)将(4)中所得的固定化大豆环氧化合物水解酶冷冻干燥后，得到大豆环氧化合物水解酶制剂；
所述大豆环氧化合物水解酶与UiO-66-NH2纳米晶体的质量比为1:（2-20）。
2.根据权利要求1所述大豆环氧化合物水解酶固定方法，其特征在于：所述戊二醛用量为大豆环氧化合物水解酶与戊二醛的质量比1：（10-20）。
3.根据权利要求1所述大豆环氧化合物水解酶固定方法，其特征在于：所述步骤（3）、（4）中搅拌速率为100-500rpm。
4.根据权利要求1所述大豆环氧化合物水解酶固定方法，其特征在于：所述步骤（1）中大豆环氧化合物水解酶为大豆环氧化合物水解酶酶粉。
5.根据权利要求1所述大豆环氧化合物水解酶固定方法，其特征在于：所述步骤（2）中UiO-66-NH2纳米晶体由四氯化锆与2-氨基对苯二甲酸合成所得。
6.根据权利要求5所述大豆环氧化合物水解酶固定方法，其特征在于：所述UiO-66-NH2纳米晶体的具体制备方法为：称取摩尔比为1 ：1的2-氨基对苯二甲酸和四氯化锆溶解到90-100mL的N,N-二甲基甲酰胺中，在80℃的油浴条件下搅拌反应2h，调高温度至100℃继续搅拌反应4h；抽滤、无水乙醇洗涤，最后在70-80℃条件下烘干即得UiO-66-NH2纳米晶体。
7.根据权利要求1所述大豆环氧化合物水解酶固定方法，其特征在于：所述缓冲液为磷酸缓冲液。
8.一种由权利要求1~7任一项所述大豆环氧化合物水解酶固定方法制备得到的大豆环氧化合物水解酶制剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510183836.4A CN104805068B (zh) | 2015-04-16 | 2015-04-16 | 一种大豆环氧化合物水解酶制剂及固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510183836.4A CN104805068B (zh) | 2015-04-16 | 2015-04-16 | 一种大豆环氧化合物水解酶制剂及固定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104805068A CN104805068A (zh) | 2015-07-29 |
| CN104805068B true CN104805068B (zh) | 2018-09-14 |
Family
ID=53690269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510183836.4A Active CN104805068B (zh) | 2015-04-16 | 2015-04-16 | 一种大豆环氧化合物水解酶制剂及固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104805068B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107365759B (zh) * | 2017-09-07 | 2020-05-29 | 陕西师范大学 | 一种高稳定多级孔Zr-MOF固定化酶反应器及其应用 |
| CN107913676B (zh) * | 2017-11-29 | 2020-03-24 | 广西大学 | 一种超低温法金属有机配体掺杂氨基酸复合材料及其制备方法 |
| CN108355612B (zh) * | 2018-01-26 | 2020-06-16 | 安徽建筑大学 | 内交联铪金属有机骨架材料的合成方法 |
| CN111349681A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-06-30 | 湖南理工学院 | 一种应用固定化脂肪酶催化酯水解动力学拆分2-(4-甲基苯基)丙酸对映体的方法 |
| CN113198536B (zh) * | 2021-04-07 | 2022-06-21 | 浙江工业大学 | 一种酶复合材料及其制备方法与应用 |
| CN114736895B (zh) * | 2022-03-21 | 2024-04-02 | 中南林业科技大学 | 一种利用UiO-66类金属有机框架制备固定化酶的方法 |
-
2015
- 2015-04-16 CN CN201510183836.4A patent/CN104805068B/zh active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Lipase-Supported Metal–Organic Framework Bioreactor CatalyzesWarfarin Synthesis;Wan et al;《Chem. Eur. J》;20141010;摘要，第115右栏第2段-第116右栏最后一段，图1 * |
| Trypsin-Immobilized Metal–Organic Framework as a Biocatalyst In Proteomics Analysis;Shih et al;《ChemPlusChem 》;20121231;摘要，图2 * |
| 绿豆环氧水解酶催化对硝基苯乙烯氧化物的对映归一性水解;鞠鑫等;《催化学报》;20081231;第696-700 * |
| 绿豆环氧水解酶在硅基介孔材料上的固载及催化性能;张艳梅等;《大连民族学院学报》;20140930;摘要，1.1-1.4部分 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104805068A (zh) | 2015-07-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104805068B (zh) | 一种大豆环氧化合物水解酶制剂及固定化方法 | |
| CN105543211B (zh) | 一种固定化葡萄糖氧化酶及其制备方法与应用 | |
| Broun | [20] Chemically aggregated enzymes | |
| CN109092364B (zh) | 一种铜金属有机骨架模拟酶材料及其制备与应用 | |
| CN102703411B (zh) | 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法 | |
| Cho et al. | Immobilization of enzymes on activated carbon: properties of immobilized glucoamylase, glucose oxidase, and gluconolactonase | |
| CN112111478B (zh) | 一种介孔Me/UIO-66-Zr MOF材料及其制备方法和应用 | |
| CN101280298A (zh) | 一种制备可重复利用的磁性纳米固定化酶的方法 | |
| CN110540984A (zh) | 一种HRP/Co3O4@ZIF-8复合催化剂及其制备方法 | |
| CN109266639B (zh) | 一种双重固定化酶及其制备方法和应用 | |
| Li et al. | Immobilization of Candida sp. 99-125 lipase onto silanized SBA-15 mesoporous materials by physical adsorption | |
| Valentova et al. | Comparison of different methods of glucose oxidase immobilization | |
| CN114395549A (zh) | 一种基于中空共价有机骨架材料原位封装酶的方法 | |
| CN110240140A (zh) | 氮掺杂多孔碳材料及其制备方法和应用 | |
| CN105622985B (zh) | 一种磁性纤维素/2-甲基咪唑锌盐及其制备方法与应用 | |
| CN106824240A (zh) | 一种土壤原位修复光催化材料及其制备方法 | |
| CN102703412A (zh) | 固定生物酶的顺磁性的醛基介孔分子筛及其制备方法 | |
| CN110327970A (zh) | 一种Cu-Ce-SAPO-34球形聚集体脱硝催化剂的制备方法 | |
| CN105969758A (zh) | 固定化酶、磁性碳材料及其制备方法 | |
| CN109280660A (zh) | 表面改性磁性埃洛石纳米管内外壁同时固定氯过氧化物酶反应器及应用 | |
| CN115356477A (zh) | 一种链霉亲和素磁珠及其制备方法和应用 | |
| CN110982691B (zh) | 一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法 | |
| CN114910434A (zh) | 一种金属有机框架结构介孔碳纳米酶 | |
| CN109266637B (zh) | 以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器 | |
| CN114369591A (zh) | 一种复合固定化酶材料的制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |