CN110982691B - 一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法,具体制备步骤:以司盘80为表面活性剂,以水为分散相,以单体甲基丙烯酸缩水甘油酯、交联剂二乙烯基苯、致孔剂甲苯为连续相,在过硫酸钾引发下,发生热聚合合成高内相乳液整体柱。然后依次用氨水和金纳米棒修饰,得到金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱,利用金纳米棒与胰蛋白酶的巯基之间的Au‑S键结合来实现胰蛋白酶固定到整体柱孔表面,即制备得到固定化酶反应器。本发明酶解活性高、传质好、机械强度高、扩散限制小,与溶液酶解相比,酶解时间大大缩短,增加了酶的稳定性,且可重复使用多次。
Description
技术领域
本发明涉及一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法,具体是金纳米棒功能化以高内相乳液聚合合成的整体柱,通过金-硫键结合将酶固载到整体柱孔表面,本发明旨在提供一种新的固酶基质,实现蛋白质的高效快速酶解。
背景技术
蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象,研究细胞、组织或生物体所表达的全部蛋白质组成及其变化规律的科学。目前,蛋白组学研究的常用策略包括自上而下和自下而上。由于蛋白质鉴定的准确性,可靠性和可重复性,基于质谱的蛋白质组分析研究的自下而上的策略引起了高度关注。在这种策略中,首先通过蛋白酶将蛋白质样品消化成肽,然后进行液质联用分析以鉴定蛋白质。因此,如何实现蛋白的快速有效酶解成为最具挑战性的步骤之一。过往,蛋白质的消化通常在溶液中进行,但是其具有明显的缺陷,如酶的自溶,酶解效率低,酶解后还需分离酶和底物。为了解决这些问题,已经开发出固定化酶反应器(IMER),将蛋白酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化作用。与传统的溶液酶解相比,固定化酶反应器不仅可防止酶自身溶解、所用酶与底物比例高、消化时间短,并且在可重复使用性和耐用性方面也显示出显着优势,因此备受关注。
众所周知,固定化酶载体材料的各种性质如尺寸、孔隙率、机械强度等都会影响到固定化酶的稳定性和效率。理想的固定游离酶的最佳载体应(1)具有较大的比表面积,从而使大量的酶固定化;(2)传质好,促进底物和产物的快速大量运输;(3)提供出色的机械稳定性。为了获得具有令人满意性能的固酶系统,许多研究已集中在探索各种固酶基质上。
目前,用于固定化酶的载体材料有聚合物膜,微米/纳米颗粒和整体柱等。在各种基质中,整体柱受到了广泛关注,由于其易于制造和修饰,通过在柱内原位聚合可以很容易地制备这种连续整体多孔材料,并且其具有良好的生物相容性,此外,整体柱在结构上具有小的骨架和较大的通孔,有利于快速传质,并保证了较高的酶结合能力,因此有更广泛的应用前景。过往,常用基于颗粒堆积结构的整体柱作为酶的固定化载体,其结构致密,利于小分子的分析,但是其对于生物大分子物质具有明显的扩散限制,当固定化酶反应器在扩散限制条件下进行操作时,底物缓慢到达催化位点,以致酶产物的形成效率较低。因此,开发具有高比表面积且扩散限制小的多孔载体作为酶固定化的载体材料变得有吸引力。
高内相乳液(HIPE)是指分散相体积分数高于74%的高浓乳液,其具有多孔结构,明确的孔隙率和高比表面积。与基于颗粒的整体柱相比,HIPE整体柱(1)大孔结构可使扩散限制被最小化,渗透好,背压低,有利于大分子传质;(2)多孔壁上有多个固定位点,有利于酶的结合,这些优势使HIPE整体柱成为理想的载体材料用于酶的固定化。
目前,对于IMER,酶可以通过几种机制固定化:物理吸附、包埋、共价键合。物理吸附方法,操作简单且成本低廉,但是酶很容易从载体上解吸,所以其稳定性较差。酶也可以通过包埋的方法直接被捕获在基质中,例如溶胶-凝胶技术,然而,底物在此基质中扩散缓慢,因此消化过程较为缓慢。共价法可使酶较牢固地固定在载体上时,但是往往会在相对剧烈的化学反应下来完成酶的结合,可能会导致酶的天然构象发生改变,从而导致酶的活性有所下降。因此,需要开发一种新的较为温和且稳定的基质来实现酶的固定化。
众所周知,金纳米对巯基、氨基、氰基官能团有强亲和力,金纳米可以共价键合到这些官能团的表面上,一方面能防止金纳米团聚改善分散性,另一方面可以作为连接表面含有这些官能团的基质的桥梁。由于金纳米的高比表面积和生物相容性,将生物大分子如酶固定于金纳米上,可提高酶的固定能力,稳定性和寿命,并且可保持酶的天然构象和催化活性。此外,金纳米反应温和,还可增加反应位点数量和整体柱的亲水性。在各种形状的金纳米粒子中,金纳米棒具有独特的晶面表面性质,由于具有可调的长径比和沿圆柱轴相对平坦的表面,易于进一步修饰,因此受到广泛关注。
中国专利CN102391947A公开了一种多孔整体柱固定化酶微反应器的制备方法,制备金纳米粒子修饰毛细管整体柱,具体使用了球形金纳米粒子固定蛋白质,得到多孔整体柱固定化酶反应器。
发明内容
本发明的目的是提供一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法。以高度多孔且有利于大分子传质的高内相乳液整体柱为基质,通过修饰于基质上的金纳米棒与胰蛋白酶的巯基之间进行Au-S键结合,将胰蛋白酶固定到整体柱孔表面,提高了胰蛋白酶的稳定性和使用寿命,是一种有效的酶固定方法。本发明将胰蛋白酶固定于多孔整体柱孔表面,金纳米棒的高比表面积可增加酶的固定量,实现蛋白质的高效、快速酶解。本发明制备得到的酶反应器酶解活性高、传质好、机械强度高、扩散限制小,与溶液酶解相比,酶解时间大大缩短,增加了酶的稳定性,且可重复使用多次。
本发明提供一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法是通过高内相乳液模板法制备得到多孔的毛细管整体柱,通过表面修饰在高内相乳液整体柱表面引入金纳米棒,然后再将胰蛋白酶固定到整体柱孔表面,最终得到基于金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱的固定化酶反应器。
具体制备方法步骤如下:
1)高内相乳液整体柱的制备:以span 80为表面活性剂,以单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、交联剂二乙烯基苯(DVB)、致孔剂甲苯为油相,以包含引发剂过硫酸钾、电解质氯化钙的水溶液为水相,在不断搅拌下将水相逐滴滴加到油相中;滴加完成后高速搅拌,形成均一的油包水型高内相乳液;用注射器(1 mL)将得到的乳液注入到经γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)修饰过的毛细管柱中,用橡胶塞封住毛细管两端,50-60℃水浴中反应2-3 h;聚合完成后,分别用乙腈、去离子水冲洗毛细管柱来去除未反应的物质。
其中,步骤1)所述的表面活性剂span 80在油相中的质量分数为10%-30%;单体与交联剂之比为1:2-2:1;过硫酸钾和氯化钙在水相中的质量分数均为1%;内相体积分数为80%-90%;石英毛细管内径为250 μm。
2)金纳米棒的功能化:将4.5 mol/L氨水注入步骤1)中的整体柱,置于50-60℃水浴中反应1-2 h,反应完全后用去离子水冲洗毛细管柱直至流出液呈中性,得到氨基修饰的高内相乳液整体柱;之后,室温下向氨基修饰的高内相乳液整体柱通入金纳米棒溶液,以0.2 ul/min的流速连续泵送10 h,通过Au-NH2相互作用将金纳米棒固定于整体柱孔表面,然后用去离子水冲洗直至流出液无淡紫色,得到金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱。
3)胰蛋白酶二硫键的还原:用20mM pH 8.0的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液溶解胰蛋白酶和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP),使其浓度分别为10 mg/ml,1 mg/ml;然后将胰蛋白酶和TCEP以10:1的体积比进行混合,于25℃反应3 h;之后,将反应液在4℃下以10000 rpm离心10 min除去不溶物,取上清液,加入过硫酸铵和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,使其浓度分别为1 mg/ml,2 mg/ml,震荡使其充分溶解即得酶衍生液。
4)胰蛋白酶的固定:将步骤3)得到的酶衍生液于4℃下泵送3h,通过步骤2)得到的整体柱,通过金纳米棒与胰蛋白酶的巯基之间的Au-S键结合来实现胰蛋白酶固定到整体柱孔表面;随后20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤以除去未反应的物质,将所得的整体柱在4℃下保存。
其中步骤4)所述的整体柱反应之前应用氮气吹干。
本发明提供了一种金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱为基质的固定化酶反应器,其突出性的显著特点为:
1.本发明以高内相乳液整体柱作为固定化酶反应器的基柱,在结构上具有多孔结构,通过改变乳液组成可以轻松控制其形态,可通过控制孔径分布来适应不同反应条件。
2.本发明利用金纳米棒对SH配体具有很强的亲和力,将胰蛋白酶固定于多孔整体柱孔表面,金纳米棒的高比表面积可增强酶的结合能力。
3.本发明制备得到的酶反应器酶解活性高、传质好、机械强度高、扩散限制小,与溶液酶解相比,酶解时间大大缩短,增加了酶的稳定性,且可重复使用多次。
附图说明
图1为高内相乳液整体柱的扫描电镜图。
图2为高内相乳液整体柱的压汞图。
图3为金纳米棒的透射电镜图。
图4为金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱的扫描电镜图。
图5为酶反应器水解50 mM N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯样品的液相色谱图。
图6 为酶反应器的重现性。
图7 为酶反应器的稳定性。
图8 为大鼠肝脏提取蛋白经酶反应器酶解后的产物经HPLC-MS/MS分析得到的基峰色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件以及手册中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件;所用的设备、材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、以金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱为基质的固定化酶反应器的制备
1)高内相乳液整体柱的制备:
单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(200 μL)、交联剂二乙烯基苯(400 μL)、致孔剂甲苯(200 μL)、表面活性剂span 80(160 μL)加入到反应器中,在磁力搅拌下混合均匀;在不断搅拌下逐滴滴加由引发剂过硫酸钾(72 mg)和电解质氯化钙(72 mg)组成的水溶液(7.2mL),滴加速度为2 s/滴;待滴加完毕后,高速搅拌40 min,形成均一的白色乳液;用1 ml注射器将乳液注入到10 cm预处理过的毛细管中,用橡胶塞封住毛细管两端,并于60℃水浴中反应3 h;聚合完成后,分别用乙腈、去离子水冲洗来去除未反应的物质;图1为高内相乳液整体柱的扫描电镜图,可看到高度交联、明确直径的泡孔结构,并且在泡孔上可观察到由于聚合时体积收缩所形成的孔窗结构;图2为高内相乳液整体柱的压汞图,所测得孔径为孔窗的直径,集中分布在1300 nm。
2)氨基的修饰:
将4.5 mol/L氨水注入步骤1)中的整体柱,置于60℃水浴中反应2 h,反应完全后用去离子水冲洗毛细管柱直至流出液呈中性,得到氨基修饰的高内相乳液整体柱。
3)金纳米棒的合成及功能化:
金纳米棒的合成:将0.1 mol/L十六烷基三甲基溴化铵和0.02 mol/L 5-溴水杨酸超声至溶解;在30℃避光条件下加入4 mmol/L硝酸银,静置15 min;加入100 mmol/L四氯金酸和稀盐酸(32%,wt%),避光搅拌30min;加入0.1 mol/L对苯二酚使溶液变为无色后,立刻加入0.25 mmol/L硼氢化钠还原,混合均匀后搅拌24 h,图3为制备得到的金纳米棒透射电镜图,由图可知金纳米为棒状,长径比为4;
金纳米棒的功能化:室温下向氨基修饰的高内相乳液整体柱通入金纳米棒溶液(100 mmol/L,金纳米棒长径比为4),以0.2 ul/min的流速连续泵送10 h,然后用去离子水冲洗直至流出液无淡紫色,得到金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱;图4为金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱的扫描电镜图,图中的亮点即为金纳米棒。
4)固定化酶反应器的制备:
用20mM pH 8.0的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液溶解胰蛋白酶(美仑生物,250 U/mg)和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP),使其浓度分别为10 mg/ml,1 mg/ml;然后将胰蛋白酶和TCEP以10:1的体积比进行混合,于25℃反应3 h;之后,将反应液在4℃下以10000 rpm离心10 min除去不溶物,取上清液,加入过硫酸铵和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,使其浓度分别为1 mg/ml,2 mg/ml,震荡使其充分溶解即得酶衍生液。
将酶衍生液于4 ℃下泵送3 h,通过步骤2)得到的整体柱;随后20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤以除去未反应的物质,将所得的整体柱在4℃下保存。
实施例2、酶活性测定
按照实施例1步骤进行,得到固定化胰蛋白酶反应器,以N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为酶反应底物,在胰蛋白酶的作用下,底物被水解成N-α-苯甲酰-L-精氨酸(BA)。由图5可知,本发明制备的酶反应器可将50mM的底物BAEE完全酶解成产物BA,实现了高效快速的酶解,可归功于高内相乳液带来的高度多孔结构、快速传质以及金纳米棒的高比表面积。
将BAEE溶于200 mM Tris-Hcl缓冲液(pH 8.5)中,配成不同浓度溶液(0.5 mM-20mM),使用注射泵以1 µL/min流速将底物注入酶反应器,收集流出液,使用高效液相色谱(安捷伦 1260)测定产物BA的峰面积。根据Lineweaver–Burk 双倒数作图,计算得到米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)。
流动相为80mM KH2PO4(pH 3.87):甲醇=7:3,流速1 ml/min,检测波长254 nm,柱温25℃,进样体积5 µL。
实施例3、酶反应器重现性和稳定性测定
酶反应器的重复使用是通过反复暴露于底物BAEE并进行后续的酶活性测定来确定的;在每次测定后,用Tris-HCl缓冲液冲洗1h;由图6可知,酶反应器重复使用5次后,仍有90%左右的活性。
酶反应器的稳定性是通过每周测定一次酶活性来评价的,由图7可知,酶反应器重复使用1月后,仍有80%左右的活性。此酶反应器具有很好的重现性和稳定性,可重复使用多次,可存放1个月以上。
实施例4、酶反应器在生物样品中的应用
用0.9%NaCl清洗大鼠肝脏,然后切成小块,在冰浴下RIPA裂解液中匀浆;在低温下离心30min,取上清液,将提取得到的4 mg大鼠肝脏蛋白溶解在含8M尿素的Tris-HCl缓冲液中,加入100mM DTT于50℃还原20min;冷却至室温后,加入100mM IAA于室温黑暗处还原20min;最后再用Tris-HCl缓冲液稀释至8ml。
将0.5 mg/ml大鼠提取蛋白以0.5ul/min泵送通过按照实施例1步骤得到的固定化胰蛋白酶反应器,蛋白消化物被收集,进行HPLC-MS / MS分析;由图8可知,本发明所制备的酶反应器对蛋白等大分子物质可进行高效的酶解。
Claims (7)
1.一种金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)高内相乳液整体柱的制备:以span 80为表面活性剂,以单体甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、交联剂二乙烯基苯(DVB)、致孔剂甲苯为油相,以包含引发剂过硫酸钾、电解质氯化钙的水溶液为水相,在不断搅拌下将水相逐滴滴加到油相中,滴/2 s;滴加完成后高速搅拌30-40 min,形成均一的白色油包水型高内相乳液;用注射器将得到的乳液注入到经γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)修饰过的10 cm毛细管柱中,用橡胶塞封住毛细管两端,50-60℃水浴中反应2-3 h;聚合完成后,分别用乙腈、去离子水冲洗毛细管柱来去除未反应的物质;内相体积分数为80%-90%;石英毛细管内径为250 μm;
2) 金纳米棒的功能化:将氨水注入步骤1)中的整体柱,置于50-60℃水浴中反应1-2h,反应完全后用去离子水冲洗毛细管柱直至流出液呈中性,得到氨基修饰的高内相乳液整体柱;之后,室温下向氨基修饰的高内相乳液整体柱通入金纳米棒溶液,通过Au-NH2相互作用将金纳米棒固定于整体柱孔表面,然后用去离子水冲洗直至流出液无淡紫色,得到金纳米棒功能化的高内相乳液整体柱;所述的金纳米棒长径比为4; 所述的通入金纳米棒溶液是以0.2 ul/min的流速连续泵送10 h;
3)胰蛋白酶二硫键的还原:用20mM pH 8.0的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液溶解胰蛋白酶和三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP),使其浓度分别为10 mg/ml,1 mg/ml;然后将胰蛋白酶和TCEP以10:1的体积比进行混合,于25℃反应3 h;之后,将反应液在4℃下以10000 rpm离心10 min除去不溶物,取上清液,加入过硫酸铵和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺,使其浓度分别为1 mg/ml,2 mg/ml,震荡使其充分溶解即得酶衍生液;
4)胰蛋白酶的固定:将步骤3)得到的酶衍生液于4 ℃下泵送3 h,通过步骤2)得到的整体柱,通过金纳米棒与胰蛋白酶的巯基之间的Au-S键结合来实现胰蛋白酶固定到整体柱孔表面;随后20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤以除去未反应的物质,将所得的整体柱在4℃下保存。
2.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤1)所述的表面活性剂span80在油相中的质量分数为10%-30%;单体与交联剂之比为1:2-2:1;过硫酸钾和氯化钙在水相中的质量分数均为1%。
3.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤2)所述的金纳米棒的制备方法为:将0.1 mol/L十六烷基三甲基溴化铵和0.02 mol/L 5-溴水杨酸超声至溶解;在30℃避光条件下加入4 mmol/L硝酸银,静置15 min;加入100 mmol/L四氯金酸和稀盐酸(32%,wt%),避光搅拌30min;加入0.1 mol/L对苯二酚使溶液变为无色后,立刻加入0.25 mmol/L硼氢化钠还原,混合均匀后搅拌24 h。
4.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤2)所述的金纳米棒溶液的浓度为100 mmol/L。
5.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤2)所述的氨水浓度为4.5 mol/L。
6.按照权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤4)所述的整体柱反应之前应用氮气吹干。
7.权利要求1-6任一所述的制备方法制备的金纳米棒功能化整体柱固定化酶反应器。
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