CN115197465B - 一种白桦酸聚合物整体柱的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于色谱分析领域，公开了一种白桦酸聚合物整体柱的制备方法及应用。白桦酸聚合物整体柱的制备方法包括步骤：以3,23‑O‑二乙酰基‑28‑白桦酸胺乙基酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，在生孔剂、交联剂和引发剂的条件下，通过热作用在石英毛细管内原位聚合反应而成。白桦酸聚合物整体柱具有机械强度好、骨架结构稳定、通透性良好和重现性好等优点，对生物分子的富集具有特异性选择；考察对从细胞或组织中提取出来的蛋白进行亲和筛选，从而发掘相应的靶点蛋白，有望为寻找和研究天然产物的靶点蛋白建立一种快速、有效、可行的新方法，也为研究小分子天然产物与不同靶标的作用，提供了重要的研究方法和研究平台。

Description

一种白桦酸聚合物整体柱的制备方法及应用
技术领域
本发明属于色谱分析技术领域，特别涉及一种白桦酸聚合物整体柱的制备方法及应用。
背景技术
由于具有化学结构多样性和良好的类药性质，天然产物一直是新药发现的重要来源。蛋白靶点的发现与研究是天然药物研发过程中的重要一环，同时新靶点的发现可为药物筛选提供突破口，为候选化合物的发现和设计提供重要的理论依据。白桦酸(Betulinicacid,BA，又名白桦酸脂)，BA是一种从天然产物中分离得到的五环三萜类化合物，在多种植物如白桦树(Betula pubescens)、滇刺枣(Ziziphus mauritiana)、夏枯草(Prunellavulgaris)、夹竹桃(Apocynaceae)、毛茛科植物白头翁(Pulsatilla chinensis)等之中均有分布，尤其是桦木科植物中含量最丰富。其良好的治疗HIV、肿瘤、糖尿病效果正受到越来越多的关注。譬如，与目前临床应用的抗HIV-1药物相比，白桦酸类化合物作用机理独特、毒性极低、不良反应较小，是一类极具前途的抗HIV-1的候选化合物；此外，很多白桦酸类衍生物还可以通过抑制细胞生存和生长所需的特定酶(如鸟氨酸脱羧酶等)，从而抑制多种肿瘤和癌细胞的生物活性，如直肠癌、肺癌、白血病、淋巴癌、前列腺癌、卵巢癌等，因此，也是具有新型作用机制的抗肿瘤新药。
亲和色谱技术在天然产物研究中发挥着重要作用，包括纯化分离、活性成分筛选、质量控制、作用机制与作用靶点研究等等。在常见的亲和色谱基质材料中，硅胶具有良好的色谱性能，但耐酸碱性差；树脂和琼脂糖适用的pH范围较宽，但机械强度差。整体柱(Monolithic Column)是由单体、交联剂、引发剂、致孔剂的混合物在色谱柱内通过原位聚合而成的连续床固定相，适合快速分析和流速梯度模式，与传统的填充柱相比，具有制备方法简单、易于改性、柱效高、渗透性好、反压低、传质速度快等优点，同时它还具有可控制孔径的优点，在生物大分子的分离分析上具有很大的优势。对于键合BA类化合物的有机聚合物整体柱，目前尚未见相关文献报道。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种白桦酸聚合物整体柱的制备方法及应用，通过采用一锅法，在石英毛细管内原位聚合得到白桦酸聚合物整体柱，该整体柱具有机械强度好、骨架结构稳定、通透性良好和重现性好等优点，对生物分子的富集具有特异性选择。
本发明的第一方面提供一种白桦酸聚合物整体柱的制备方法，包括以下步骤：
以3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，在生孔剂、交联剂和引发剂的条件下，通过热作用，在石英毛细管内发生原位聚合反应，得到所述白桦酸聚合物整体柱。
优选地，所述白桦酸聚合物整体柱的制备方法，包括以下步骤：
准确称量3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺(EDA-BA)9.7mg、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)13.7mg、正丙醇55mg和1,4-丁二醇45mg，装入1mL玻璃瓶中，超声混合均匀后，经60℃水浴反应1h，再加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)与2mg偶氮二异丁腈(AIBN)，将混合液超声脱气后灌入合适长度的预处理好的石英毛细管内，然后两端用硅胶塞封口，经60℃水浴反应12h，有效长度为18cm；聚合完成以后用甲醇和水依次冲洗掉未反应物、残留溶剂或其他可能低聚物，得到所述白桦酸聚合物整体柱，即poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱。
poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的制备，反应式如下所示：
Figure BDA0003768097260000021
优选地，所述3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺的制备方法，包括以下步骤：
将23-羟基白桦酸溶于吡啶中，加入乙酸酐，搅拌反应，再加入乙酸乙酯，然后调pH至4-5，收集有机层，经洗脱后得到3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸；
将所述3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸与乙二胺、二氯甲烷进行混合反应，经洗脱后得到所述3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺。
优选地，所述洗脱是采用有机试剂进行硅胶柱层析。所述有机试剂包括但不限于石油醚和乙酸乙酯的混合液，二氯甲烷和石油醚的混合液。
优选地，所述3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸的制备方法，包括以下步骤：
将23-羟基白桦酸(0.30g,0.63mmol)溶于12mL干燥吡啶中，加入乙酸酐(1mL)，室温搅拌8小时，反应；向反应液中加入25mL乙酸乙酯，用10％稀盐酸调pH至4～5，分离有机层，用50mL饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，然后以石油醚:乙酸乙酯＝10:1(V/V)作为洗脱剂进行硅胶(200-300目)柱层析，得到白色泡沫状固体(0.32g，收率为91.4％)，即为3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸(Derived-BA)。MS(EI):m/z 579.5[M+Na]+；HR-ESI-MS:m/z 579.3652[M+Na]+(calcd:579.3656)；1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.80,0.88,0.93,0.97(each 3H,s,Me-24,-25,-26,-27),1.69(3H,s,Me-30),1.79(1H,m,H-18),1.95(1H,m,H-19),2.01(3H,s,3-OAc),2.06(3H,s,23-OAc),3.02(1H,m,H-3),3.68(1H,d,J＝11.6Hz,H-23α),3.83(1H,d,J＝11.6Hz,H-23β),4.61(1H,s,H-29α),4.77(1H,s,H-29β)；13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:12.8,14.5,16.0,16.5,17.9,19.3,20.9,21.1,23.1,29.6,36.9,38.0,38.3,40.6,40.6,42.3,46.9,48.0,49.2,50.5,56.3,65.4,74.5,109.7,150.3,170.6,171.0,181.5.
所述3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸的制备，反应式如下所示：
Figure BDA0003768097260000031
优选地，3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺的制备方法，包括以下步骤：
在100mL三口圆底烧瓶中加入3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸(Derived-BA)(0.5g,0.87mmol)、乙二胺(0.3mL,5.4mmol)和30mL二氯甲烷进行混合反应，反应液经过以石油醚:乙酸乙酯＝4:1(V/V)作为洗脱剂进行硅胶(200-300目)柱层析，得到白色泡沫状固体化合物(0.40g，收率为76.9％)，即为3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺(EDA-BA)。1HNMR(400MHz,(CDCl3/TMS))δ:0.74,0.83,0.87,0.97(each 3H,s,Me-24,-25,-26,and-27),1.68(3H,s,Me-30),1.97(1H,m,H-18),2.01(3H,s,3-OAc),2.06(3H,s,23-OAc),2.39(1H,m,H-19),3.06(1H,m,H-3),3.24(2H,t,H-2'),3.68(1H,d,J＝11.5Hz,H-23α),3.84(1H,d,J＝11.5Hz,H-23β),4.60(1H,s,H-29α),4.75(1H,s,H-29β),5.39(1H,s,H-1')；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:12.8,13.0,14.5,15.8,16.1,16.5,17.9,19.3,20.8,21.1,23.1,23.5,30.6,36.9,38.0,39.3,40.5,40.5,40.7,42.4,46.8,48.0,50.6,55.6,65.4,74.4,109.3,150.6,170.6,170.9,171.0；MS(ESI)m/z 599.8[M+H]+.
所述3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺的制备，反应式如下所示：
Figure BDA0003768097260000041
优选地，所述生孔剂为正丙醇和1,4-丁二醇，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈。发明人试验了多个生孔剂系统：用一元生孔剂甲醇、二元生孔剂甲醇/二甲基亚砜、甲醇/水、正丙醇/1,4-丁二醇。结果表明以甲醇为生孔剂时，整体柱聚合不均匀，出现脱壁的现象；以二元溶剂系统甲醇/二甲基亚砜、甲醇/水为生孔剂时，单体没有键合至石英毛细管内壁，证明甲醇、甲醇/二甲基亚砜和甲醇/水这三个生孔剂系统，功能性单体不能完全溶解，故得不到致密的聚合物，将生孔剂系统调整为正丙醇/1,4-丁二醇后，可以保证单体的溶解度并最终得到孔道均匀、致密的聚合物。
优选地，所述正丙醇和所述1,4-丁二醇的质量比为50-55:(45-50)。
优选地，所述3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺和所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的质量比为20-26:(29-36)。
优选地，所述单体和所述交联剂的质量比为49-62:(38-51)。
优选地，所述单体和所述生孔剂的质量比为27.4-32.3:(67.7-72.6)。
优选地，所述石英毛细管是指经过以下预处理的步骤得到的石英毛细管：
用浓度为1-1.5mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管2-3min；再将石英毛细管两端封口放在95-100℃水浴锅反应1-2h；然后用水冲洗石英毛细管直至洗出液的酸碱性pH约为7；再用甲醇冲洗石英毛细管25-30min后用氮气干燥3-4h；干燥完毕后，把体积比为1-1.5:1的甲醇和3-(甲基丙基酰氧基)丙基三甲氧基硅烷混合液灌进石英毛细管中，两端封口且放在60-65℃水浴锅内反应11-12h；最后分别用甲醇和水各冲洗25-30min，氮气干燥11-12h即可。
本发明的第二方面提供本发明所述的制备方法制得的白桦酸聚合物整体柱。
本发明的第三方面提供本发明所述的白桦酸聚合物整体柱在筛选靶点蛋白中的应用。
上述应用的目的不是为了诊断或治疗某疾病。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明采用一锅法，以3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，正丙醇和1,4-丁二醇为生孔剂，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，通过热作用在石英毛细管内发生原位聚合反应，得到白桦酸聚合物整体柱，即poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱，具有机械强度好、骨架结构稳定、通透性良好和重现性好等优点，对生物分子的富集具有特异性选择。
本发明制备得到的新型的键合白桦酸的亲和色谱柱，考察对从细胞或组织中提取出来的蛋白进行亲和筛选，从而发掘相应的靶点蛋白，有望为寻找和研究天然产物的靶点蛋白建立一种快速、有效、可行的新方法；同时，也为研究小分子天然产物与不同靶标的作用，提供了重要的研究方法和研究平台。
附图说明
图1是本发明对石英毛细管预处理的流程图；
图2是本发明白桦酸聚合物整体柱在不同的流动相条件下的线性流速与背压的关系图；
图3是本发明白桦酸聚合物整体柱分离四个反相标样的色谱图；
图4是本发明白桦酸聚合物整体柱横截面的扫描电镜图；
图5是本发明白桦酸聚合物整体柱中乙腈含量与保留时间的关系；
图6是本发明白桦酸聚合物整体柱分离不同蛋白质的色谱图。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂、装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
以下实施例中所用的主要仪器与试剂如下：
3-(甲基丙基酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和邻苯二甲酸二甲酯均购自美国Sigma公司；
偶氮二异丁腈(AIBN)、乙二胺(EDA)、正丙醇(n-Propanol,Pro-OH)、1,4-丁二醇(1,4-Butanedio,BDO)、甲苯和硫脲均购自阿拉丁化学试剂有限公司；
甲醇和乙腈为色谱纯，水为三蒸高纯水，其它一般有机试剂购自广州化学试剂厂；
DK-S22水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)、高压泵(美国Haskel公司)、LX-0.12/10A空气压缩机(上海鲁辛实业有限公司)、T-50.1L溶剂过滤器(天津津腾实验设备有限公司)、XL-30ESEM扫描电镜仪(荷兰PHILIPS公司)、SPD-15C紫外检测器(日本Shimadzu公司)、DiNa-S、DiNa-2D纳流泵(日本KYA公司)、UnimicroTrisepTM色谱工作站(上海通微分析技术有限公司)、20nL四通阀(美国Valco公司)、PB-10pH计(德国Sartorius公司)、石英毛细管(375μmOD×100μmID)(永年锐沣色谱器件有限公司)、KQ2200D超声仪(东莞科桥超声波设备有限公司)、0.22μm滤膜(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。
实施例1白桦酸聚合物整体柱的制备
1.试剂预处理
EDMA的前处理：将12mL EDMA加入50mL的分液漏斗中，然后加入等体积的质量分数5％NaOH溶液，充分震荡，静置分层，收取有机层，在加入等体积的质量分数5％NaOH溶液，如此反复碱洗三次；待此操作完成，有机层在用去离子水洗涤至中性；将洗涤后的EDMA用无水MgSO4干燥，置于4℃冰箱冷藏干燥24h；干燥处理之后的EDMA用0.22μm的有机膜过滤，存于4℃冰箱保存，备用；
GMA的处理方法同EDMA；生孔剂使用前减压蒸馏；偶氮二异丁腈长期不用需经重结晶处理。
2.石英毛细管预处理
参照图1，用浓度为1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管2-3min；再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2h；然后用水冲洗石英毛细管直至洗出液的酸碱性pH为7；再用甲醇冲洗石英毛细管30min后用氮气干燥4h；干燥完毕后，把体积比为1-1:1的甲醇和3-(甲基丙基酰氧基)丙基三甲氧基硅烷混合液灌进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12h；最后分别用甲醇和水各冲洗30min，氮气干燥12h即可。
3.Derived-BA的制备
将23-羟基白桦酸(0.30g,0.63mmol)溶于12mL干燥吡啶中，加入乙酸酐(1mL)，室温搅拌8小时，反应；向反应液中加入25mL乙酸乙酯，用10％稀盐酸调pH至4～5，分离有机层，用50mL饱和食盐水洗涤3次，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，然后以石油醚:乙酸乙酯＝10:1(V/V)作为洗脱剂进行硅胶(200目)柱层析，得到白色泡沫状固体(0.32g，收率为91.4％)，即为3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸(Derived-BA)。MS(EI):m/z 579.5[M+Na]+；HR-ESI-MS:m/z 579.3652[M+Na]+(calcd:579.3656)；1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:0.80,0.88,0.93,0.97(each 3H,s,Me-24,-25,-26,-27),1.69(3H,s,Me-30),1.79(1H,m,H-18),1.95(1H,m,H-19),2.01(3H,s,3-OAc),2.06(3H,s,23-OAc),3.02(1H,m,H-3),3.68(1H,d,J＝11.6Hz,H-23α),3.83(1H,d,J＝11.6Hz,H-23β),4.61(1H,s,H-29α),4.77(1H,s,H-29β)；13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:12.8,14.5,16.0,16.5,17.9,19.3,20.9,21.1,23.1,29.6,36.9,38.0,38.3,40.6,40.6,42.3,46.9,48.0,49.2,50.5,56.3,65.4,74.5,109.7,150.3,170.6,171.0,181.5.
4.EDA-BA的制备
在100mL三口圆底烧瓶中加入3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸(Derived-BA)(0.5g,0.87mmol)、乙二胺(0.3mL,5.4mmol)和30mL二氯甲烷进行混合反应，反应液经过以石油醚:乙酸乙酯＝4:1(V/V)作为洗脱剂进行硅胶(200目)柱层析，得到白色泡沫状固体化合物(0.40g，收率为76.9％)，即为3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺(EDA-BA)。1HNMR(400MHz,(CDCl3/TMS))δ:0.74,0.83,0.87,0.97(each 3H,s,Me-24,-25,-26,and-27),1.68(3H,s,Me-30),1.97(1H,m,H-18),2.01(3H,s,3-OAc),2.06(3H,s,23-OAc),2.39(1H,m,H-19),3.06(1H,m,H-3),3.24(2H,t,H-2'),3.68(1H,d,J＝11.5Hz,H-23α),3.84(1H,d,J＝11.5Hz,H-23β),4.60(1H,s,H-29α),4.75(1H,s,H-29β),5.39(1H,s,H-1')；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:12.8,13.0,14.5,15.8,16.1,16.5,17.9,19.3,20.8,21.1,23.1,23.5,30.6,36.9,38.0,39.3,40.5,40.5,40.7,42.4,46.8,48.0,50.6,55.6,65.4,74.4,109.3,150.6,170.6,170.9,171.0；MS(ESI)m/z 599.8[M+H]+.
5.poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的制备
准确称量3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺(EDA-BA)9.7mg、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)13.7mg、正丙醇55mg和1,4-丁二醇45mg，装入1mL玻璃瓶中，超声混合均匀后，经60℃水浴反应1h，再加入15mg乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)与2mg偶氮二异丁腈(AIBN)，将混合液超声脱气后灌入合适长度的预处理好的石英毛细管内，然后两端用硅胶塞封口，经60℃水浴反应12h，有效长度为18cm；聚合完成以后用甲醇和水依次冲洗掉未反应物、残留溶剂或其他可能低聚物，得到所述白桦酸聚合物整体柱，即poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱。
实施例2对实施例1制得的poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱进行表征
1.通透性
通透性(Permeability)(K)是液相色谱柱一个很重要的参数，一般而言，K值可以通过液相色谱的方法，采用乙腈、水、甲醇等作为流动相，依据Bristow and Knox方程测得：
Figure BDA0003768097260000081
其中μ代表流动相的线性速度，η代表流动相的粘度，L代表柱子的色谱柱的有效长度，ΔP代表色谱柱背压。测试结果如表1所示。
表1
流动相 相对极性 粘度η(×10-3Pa.s) 渗透K(×10-13m2)
乙腈 0.460 0.369 7.98
甲醇 0.762 0.544 7.11
乙腈/水(80:20；v/v) / 0.450 6.50
水 1 0.890 5.83
从表1可以看出，在不同的流动相作用下，K值始终在一个数量级上面，这说明poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱在不同极性强度的流动相体系下没有明显发生溶胀或皱缩，表明poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱的骨架稳定。
2.机械强度
采用微径液相色谱的方法，考察在不同的流动相条件下，线性流速与背压的关系。本节实验分别选择了水、乙腈/水(80:20,v/v)做为流动相，考察在不同的流速条件下，线性流速与背压的关系，实验结果见图2所示。从图2可以看出，线性流速与背压具有良好的线性关系(R2>0.99)，表明poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱具有良好的机械强度。
3.重现性
采用微径液相色谱的方法，测试标准样品保留时间或者保留因子的RSD值。反相色谱评价常选用乙腈/水体系，检测波长为254nm(在此波长下乙腈等无紫外吸收)。本实验采用乙腈/水(50/50,v/v)作为流动相，标准物为硫脲(thiourea)、邻苯二甲酸二甲酯(dimethylphthalate)、苯甲醚(anisole)、萘(naphthalene)，测试结果如表2所示。
表2
重现性 RSDdimethylphthalate(％) RSDanisole(％) RSDnaphthalene(％)
Run-to-run(n＝10) 1.64 1.08 1.33
Day-to-day(n＝3) 1.74 1.53 1.35
Column-to-column(n＝3) 1.92 1.83 0.99
Batch-to-batch(n＝3) 4.51 3.01 3.74
从表2可以看出，各项保留因子的RSD均小于5％，表明poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱的重现性良好。
以硫脲为死时间标记物，四种组分均为中性物质，其中硫脲极性最强，邻苯二甲酸二甲酯和苯甲醚次之，萘极性最弱，用来衡量色谱柱的柱效。条件：乙腈/水(50/50，v/v)；流速：600nL/min；注射量，20nL；检测波长：214nm。结果如图3所示，洗脱次序1-4是硫脲、邻苯二甲酸二甲酯、苯甲醚、萘。
4.元素考察
为了考察poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱的实际组成，对其聚合物组成进行了元素分析测试，结果如表3所示。
表3
整体柱 C O H N
poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) 72.20％ 13.36％ 9.76％ 4.68％
从表3可以看出，C、O、H和N的质量含量分别是72.20％、13.36％、9.76％和4.68％，已知聚合物中N元素仅由EDA-BA分子提供，由此可确认白桦酸成功键合到固定相上。由此可见，本发明采用“一锅法”原位聚合制备的小分子天然产物键合的整体柱是可行，而且可靠的，并有望应用于其他小分子药物、化合物及天然产物等制备对应的整体柱。
5.扫描电镜
对本发明白桦酸聚合物整体柱横截面进行电镜扫描，参照图4中的(a)、(b)，可以看到整体柱孔状结构明显，孔道均匀、致密。
实施例3 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的作用机理
有机聚合物整体柱poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)中的主要功能单体BA是五环三萜类化合物，从其化学结构我们可以初步推断该整体柱的主要分离机理，EDA-BA的结构式如下所示：
Figure BDA0003768097260000101
可以看到EDA-BA的骨架是五环三萜类化合物，以及疏水性乙酰基取代可提供游离氢的亲水性羟基，导致其主要表现为反相色谱的保留机制，而其28位上的氨基由于可以提供游离氢，提示可能存在微弱的亲水作用机理。
采用微径液相色谱的方法，测定poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的保留机理。以非极性化合物甲苯和极性化合物硫脲为测试化合物，乙腈、水为流动相。通过改变流动相中乙腈的含量，考察甲苯(toluene)和硫脲(Thiourea)的保留时间的变化。如图5所示，对于强极性的化合物硫脲，在反相HPLC条件下通常作为死时间标记物，在poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱上，当乙腈的含量从30％增至50％时，硫脲的保留时间基本不变，而甲苯的保留时间显著降低；当乙腈的百分含量含量大于50％时，硫脲的保留时间有轻微的增长，甲苯的保留时间则有渐渐减少。两者的保留时间在乙腈的百分含量为90％处交汇，表明poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱主要表现为反相作用机理。
实施例4poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱的应用
通过将不同类型常见蛋白与酶注入整体柱中，若形成明显的色谱保留，则提示整体柱对该类别蛋白的选择性。采用实施例1制备的poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱对多种蛋白包括胰蛋白酶(Trypsin)、牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)、人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)、细胞色素C(Cytochrome C)以及α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)进行分离富集。条件：缓冲液A，25mmol Tri/HCl，pH 6.5；缓冲液B，50mmolNaCl，pH 6.5；洗脱条件：缓冲液A 0～10min，缓冲液B10～20min，缓冲液A 20～25min；流速：1000nL/min；检测波长：280nm。结果见图6所示，胰蛋白酶(Trypsin)、牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)、人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)和细胞色素C(Cytochrome C)在poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱上未见显著保留，而α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)则有明显保留。由此提示，BA可能与α-葡萄糖苷酶形成亲和作用，进而形成明显的色谱保留效果。表明poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱可用于筛选靶点蛋白。
在本发明要求保护的技术方案范围内调整制备方法中的工艺参数，制得的poly(GMA-ED A-BA-co-EDMA)整体柱的效果与实施例1制得的poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整体柱的效果类似。本发明以3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，正丙醇和1,4-丁二醇为生孔剂，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，通过原位聚合反应制备而成聚合物整体柱poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)，并通过元素分析、扫描电镜、微径液相等手段对整体柱进行表征，表明本发明采用的“一锅法”可很好的应用于以药物或者天然产物单体化合物分子为单体的整体柱制备。
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种白桦酸聚合物整体柱的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
以3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，在生孔剂、交联剂和引发剂的条件下，通过热作用，在石英毛细管内发生原位聚合反应，得到所述白桦酸聚合物整体柱；
所述3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺的制备方法，包括以下步骤：
将23-羟基白桦酸溶于吡啶中，加入乙酸酐，搅拌反应，再加入乙酸乙酯，然后调pH至4-5，收集有机层，经洗脱后得到3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸；
将所述3,23-二乙酰基-17-乙酸白桦酸与乙二胺、二氯甲烷进行混合反应，经洗脱后得到所述3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺；
所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；
所述3,23-O-二乙酰基-28-白桦酸胺乙基酰胺和所述甲基丙烯酸缩水甘油酯的质量比为20-26:(29-36)；
所述单体和所述交联剂的质量比为49-62:(38-51)。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱是采用有机试剂进行硅胶柱层析。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生孔剂为正丙醇和1,4-丁二醇，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述正丙醇和所述1,4-丁二醇的质量比为50-55:(45-50)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述单体和所述生孔剂的质量比为27.4-32.3:(67.7-72.6)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述石英毛细管是指经过以下预处理的步骤得到的石英毛细管：
用浓度为1-1.5mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管2-3min；再将石英毛细管两端封口放在95-100℃水浴锅反应1-2h；然后用水冲洗石英毛细管直至洗出液的酸碱性pH为7；再用甲醇冲洗石英毛细管25-30min后用氮气干燥3-4h；干燥完毕后，把体积比为1-1.5:1的甲醇和3-（甲基丙基酰氧基）丙基三甲氧基硅烷混合液灌进石英毛细管中，两端封口且放在60-65℃水浴锅内反应11-12h；最后分别用甲醇和水各冲洗25-30min，氮气干燥11-12h即可。
7.权利要求1-6任一项所述的制备方法制得的白桦酸聚合物整体柱。
8.权利要求7所述的白桦酸聚合物整体柱在筛选靶点蛋白中的应用。
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