CN114324639B

CN114324639B - 一种混合模式弱阳离子固相萃取材料及其制备方法与应用

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Publication number: CN114324639B
Application number: CN202111576433.8A
Authority: CN
Inventors: 黄忠平; 宁弘宇; 徐雨; 刘会君; 范一雷; 韩宇
Original assignee: Zhejiang Branch Of National Drug Laboratory Zhejiang Drug Technology Center; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang Branch Of National Drug Laboratory Zhejiang Drug Technology Center; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-09-29
Anticipated expiration: 2041-12-22
Also published as: CN114324639A

Abstract

本发明公开了一种混合模式弱阳离子固相萃取材料及其制备方法与应用，该材料有着制备条件简单，富集效果好、基质去除能力强、成本低廉且能重复利用的优点，后续结合超高效液相色谱‑串联质谱联用仪应用于环境水样中毒品的检测，并建立方法学；本发明建立的环境水样中毒品的检测方法检测限低至ng/L，可满足毒品监测的灵敏度要求，具有很大的实际应用价值。

Description

一种混合模式弱阳离子固相萃取材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种应用于分析化学领域的弱阳离子交换树脂材料，特别涉及一种混合模式弱阳离子固相萃取材料及其制备方法，以及在环境水样中毒品的检测中的应用。

背景技术

由于污水中毒品含量低至ng/L，目前对污水中毒品含量的检测，主要方法是通过是固相萃取(Solid Phease Extraction，SPE)进行样品提纯和富集，并结合高效液相-质谱联用技术(LC-MS/MS) 检测分析。固相萃取作为一种样品前处理手段被广泛的应用于生物、医药、化工、环境等领域。固相萃取可以通过其材料所带有的特异性吸附，能够对复杂样品进行提纯和富集的效果，从而降低方法的检出限，同时减少复杂样品的基质效应(matrixeffect，ME)。

目前对污水中毒品检测主要使用的是混合模式强阳离子交换固相萃取小柱与反相吸附固相萃取小柱，如Waters公司的Oasis MCX和Oasis HLB固相萃取小柱，这两种商品柱的吸附效果较好，能去除大量的基质效应。但是混合模式强阳离子交换固相萃取柱对部分毒品的萃取效率较低，如海洛因，回收率低于50％、O⁶-单乙酰吗啡，回收率低于80％；而反相吸附固相萃取小柱作为一种通用型吸附小柱，其选择性不如混合模式离子交换柱。此外，两者皆为进口产品，价格都比较昂贵，单个小柱价格在20元左右，产品的制备核心技术由国外掌握。因此开发廉价、萃取效率高、选择性强、适用于污水中毒品萃取的国产固相萃取材料迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一种新型混合模式弱阳离子固相萃取材料，该材料有着制备条件简单，富集效果好、基质去除能力强、成本低廉且能重复利用的优点，后续结合超高效液相色谱-串联质谱联用仪 (UPLC-MS/MS)应用于环境水样中毒品的检测，并建立方法学。

本发明的技术方案如下：

一种混合模式弱阳离子固相萃取材料，其制备方法为：

(1)将洗涤、干燥后的聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球加入二氯甲烷溶胀，接着在冰水浴、搅拌条件下，加入氯乙酰氯(酰基化试剂)、无水氯化铝(催化剂)，自然升至室温(20～30℃)，在氮气保护下反应3～5h，之后经后处理，得到酰基化微球(颜色呈现黄色)；

所述聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球粒径为20μm、孔径为

所述聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球、氯乙酰氯、无水氯化铝的质量比为3：3.5：5；

所述后处理的方法为：反应结束后，用0.1％冰稀盐酸猝灭反应，过滤，滤饼用乙醇、去离子水依次洗涤至中性，得到酰基化微球(保存成湿饼状备用)；

(2)将步骤(1)所得酰基化微球分散于水与乙腈的混合溶剂中，在氮气保护下搅拌并升温至 60～80℃，加入巯基琥珀酸(羧酸化试剂)、氢氧化钾(催化剂)，反应8～12h，之后经后处理，得到一次羧酸化微球；

所述水与乙腈的混合溶剂中，水与乙腈的体积比为2：1；

所述巯基琥珀酸、氢氧化钾与步骤(1)中聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球的质量比为3.5：4.5：3；

所述后处理的方法为：反应结束后，过滤，滤饼依次用乙醇、去离子水、0.1％稀盐酸、去离子水洗涤，得到一次羧酸化微球；

在该步反应中，巯基琥珀酸的巯基与酰基化微球上的氯取代位点进行亲核取代反应接枝二元羧酸基团；

(3)将步骤(2)所得一次羧酸化微球分散于水与乙腈的混合溶剂中，加入偶氮二异丁腈(AIBN，引发剂)，在氮气保护下搅拌并升温至60～70℃，加入巯基琥珀酸，反应6～10h，之后经后处理，得到所述混合模式弱阳离子固相萃取材料；

所述水与乙腈的混合溶剂中，水与乙腈的体积比为1：1；

所述偶氮二异丁腈、巯基琥珀酸与步骤(1)中聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球的质量比为0.13：3： 3；

所述后处理的方法为：反应结束后，过滤，滤饼依次用乙醇、去离子水、0.1％稀盐酸、去离子水洗涤，得到所述混合模式弱阳离子固相萃取材料；

在该步反应中，利用巯基琥珀酸与上一步羧酸化后的微球中苯环上悬挂的双键发生巯基-烯点击反应进行第二次羧酸化修饰，将羧酸化后的微球进一步羧酸化，增加其离子交换能力，最后得到一种表面有着大量羧酸基团的聚合物微球。

本发明制备的混合模式弱阳离子固相萃取材料可应用于环境水样中毒品的检测。具体应用的方法为：

将所述混合模式弱阳离子固相萃取材料装填于固相萃取柱中，经活化处理(依次用甲醇、水处理)后上样，甲醇淋洗，4％三氟乙酸(TFA)甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹后用甲醇复溶，进样分析。

通过对11种毒品富集效果的考察，优化固相萃取条件，同时与三种商品柱的萃取性能进行比较。在优化后的条件下建立固相萃取-UPLC-MS/MS方法，并进行方法学考察，包括检出限、定量限、线性范围、回收率、精密度等，后续应用于环境水样中毒品的检测。

实验结果表明通过巯基琥珀酸修饰后的弱阳离子固相萃取材料，对11种毒品有着很好的富集效果。

本发明具有如下优点：

1.相比较于市面上的商品化固相萃取吸附剂，该材料有着制备工艺简单，成本更为低廉的优点。

2.本发明的弱阳离子固相萃取材料除了对MDA、BE回收率分别为88.9％、84.1％，其余的9 种化合物的回收率均能达到90％以上，证明该材料的对这11种药物有着优异的吸附性能。

3.本发明建立的环境水样中毒品的检测方法检测限低至ng/L，可满足毒品监测的灵敏度要求，说明该方法具有很大的实际应用价值。

附图说明

图1为11种毒品化合物在MRM模式下的萃取离子流图。

图2为PS-DVB、酰基化PS-DVB、PS-DVB-WCX-I(一次羧酸化)以及PS-DVB-WCX-II(二次羧酸化)红外表征图。

图3为PS-DVB(a)微球和PS-DVB-WCX-II(b)扫描电镜图。

图4为不同洗脱溶剂对11种化合物的回收率影响。

图5为样品溶液不同pH值对11种化合物回收率的影响。

图6为PS-DVB-WCX-II与Oasis MCX、Oasis HLB、Oasis WCX三种商品固相萃取小柱对11 种化合富集效果的比较。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1弱阳离子固相萃取材料(PS-DVB-WCX-II)的制备及表征

PS-DVB微球酰氯化：将聚合物微球PS-DVB(粒径20μm，孔径苏州纳微科技有限公司)用G5砂芯漏斗抽滤，用去离子水、乙醇洗涤、烘箱60℃干燥至无水，取3g干燥后的PS-DVB 微球于三颈烧瓶中，加入45ml的无水二氯甲烷作为反应的溶剂，在冰水浴下搅拌，取3.5g氯乙酰氯于恒压漏斗中缓慢滴加至三颈烧瓶，再缓慢的分批次加入5g AlCl₃，加入完毕后将反应升温至 29℃，通入氮气排除空气，反应4h，按时用氮气排出里面产生的HCl气体，用0.1％的冰稀盐酸猝灭反应，将酰氯化后的微球(Acylated-PS-DVB)用乙醇、水依次洗涤至中性，保存成湿饼状备用。

亲核取代羧酸化反应：将第一步酰氯化后的微球置于三颈烧瓶中，加入40mL水和20mL的乙腈混合溶液，超声分散，水浴下搅拌通入N₂排除空气；将温度升至70℃，加入3.5g巯基琥珀酸与 4.5g KOH，在碱性条件下催化剂反应10h；将反应后的微球进行洗涤，用大量的乙醇洗、水洗、稀 HCl、去离子水洗涤。用pH试纸测得微球呈现酸性，表明羧酸基团已经成功修饰至微球表面，得到一次羧酸化微球(PS-DVB-WCX-I)。

巯基-烯点击反应二次羧酸化反应：利用上一步羧酸化后的微球中苯环上悬挂的双键进行二次羧酸化反应。取第二步反应后的微球，加入50mL水/乙腈(1:1)作为反应溶剂，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)0.13g超声溶解后，水浴下搅拌通入N₂排除空气；将温度升至65℃，往溶液中加入巯基琥珀酸3g，搅拌反应8h，将反应后的微球用无水乙醇洗涤、水洗，最后得到弱阳离子交换固相萃取材料。

PS-DVB-WCX-II材料表征：分别用傅立叶变换红外光谱仪、场发射扫描电子显微镜进行材料的表征。

实施例2 11种毒品的色谱质谱条件优化

将所有标准物吗啡(MOR)、甲基苯丙胺(MAMP)、苯丙胺(AMP)、氯胺酮(KET)、去甲氯胺酮(NKET)、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亚甲二氧基苯丙胺(MDA)、可卡因(COC)、苯甲酰爱康宁(BE)、O⁶-单乙酰吗啡(6-AM)、4-甲基卡西酮(4-MMC)分别用甲醇配置成100μg/L的标准溶液母液用于萃取条件优化。由于各物质在仪器上响应差别较大，后续将分别按不同比例配置混合标准溶液用于方法学验证。将配制好的标准溶液置于-24℃保存。

色谱条件：色谱分离柱使用的是ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×150mm,1.8μm)，柱温 40℃，流速0.3ml/min，流动相A相使用的是0.1％的甲酸水溶液，流动相B使用的是0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0min(5％B)，0-3.5min(20％B)，3.5-6min(50％B)，6-7.5min(100％B)， 7.5-10min(100％B)，10-10.5(5％B)，10.5-11.5min(5％B)。分析时长一共为11.5min，进样体积为1μL。

质谱条件：电离源采用ESI源，检测模式为正离子模式，离子源温度550℃，电喷雾电压5500V，气帘气35psi，雾化气50psi，加热气55psi，采用多反应监控模式(MRM)进行定量、定性离子对的选取，以及碰撞电压、去簇电压的优化。

实施例3固相萃取条件优化

洗脱剂的选择：混合模式阳离子交换树脂材料主要包括聚合物骨架提供的疏水作用和离子交换官能团(-COOH)提供离子交换作用。在洗脱过程中，通过洗脱剂破坏目标物与固相萃取材料之间的作用力，从而收集富集在固相萃取材料上的目标化合物，故选择合适的洗脱剂对回收率有着显著的影响。分别考察了5％NH₄OH甲醇溶液、4％HCOOH甲醇溶液、4％三氟乙酸(TFA)甲醇溶液三种不同洗脱溶剂萃取回收率效果，结果见图4。由图4可知，当选择4％TFA甲醇溶液做为洗脱溶剂时，能得到最佳洗脱效果。

样品pH值的优化：溶液的pH值对固相萃取材料和目标物上的离子交换官能团有着抑制或促进作用，合适的pH值能得到更好的萃取效果。考察了不同样品pH值(pH＝3、6、9)对萃取效果的影响，将11种化合物配制成浓度为0.4μg/L的溶液，分别调节pH＝3、pH＝6、pH＝9，上样量为25mL，结果见图5。由图5可知，当样品pH＝6时，该材料对11种化合物的萃取效果最佳。

实施例4弱阳离子交换固相萃取材料与商品柱比较

将合成的弱阳离子交换固相萃取柱同市面上Oasis HLB、Oasis MCX、Oasis WCX三种商品柱进行比较，分别考察不同萃取柱对11种毒品化合物的萃取效果。PS-DVB-WCX-II固相萃取材料使用优化后的最优条件，各商品柱的萃取步骤条件均参考柱使用说明书最佳萃取条件下使用，结果见图 6。由图6可知，PS-DVB-WCX-II固相萃取材料对11种化合物均有着较好的萃取效果，且对部分毒品的萃取效果优于商品柱。

实施例5方法学考察

仪器与试剂

Waters Wat200609固相萃取仪，奥盛MD200-1氮吹仪，AB SCIEX Qtrap 6500+液相色谱-质谱联用仪。

方法学考察：

(1)取阴性污水样品用过滤器通过0.22μm玻璃纤维膜进行过滤，除去水样中的悬浮物，冷藏备用。

(2)精确称取吗啡(MOR)、甲基苯丙胺(MAMP)、苯丙胺(AMP)、氯胺酮(KET)、去甲氯胺酮(NKET)、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亚甲二氧基苯丙胺(MDA)、可卡因(COC)、苯甲酰爱康宁(BE)、O6-单乙酰吗啡(6-AM)、4-甲基卡西酮(4-MMC)，配制成以甲醇为溶剂的混合标准储备液，再用过滤后的污水进行稀释，配置成系列混合标准工作溶液。

所述混合标准储备液中，AMP的浓度为1000μg/L、MOR、KET、NKET、MDA、6-AM的浓度分别为500μg/L，MAMP、COC、BE、MDMA和4-MMC和的浓度为100μg/L。所述混合标准工作溶液中，AMP浓度分别为0.5μg/L、0.25μg/L、0.125μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.0125μg/L、0.005μg/L；MOR、KET、NKET、MDA、6-AM的各自浓度分别为0.25μg/L、0.125μg/L、0.01μg/L、0.05 μg/L、0.0125μg/L、0.005μg/L、0.0025μg/L；COC、BE、MAMP、MDMA、4-MMC的各自浓度分别为0.0005μg/L、0.001μg/L、0.0025μg/L、0.005μg/L、0.01μg/L、0.025μg/L、0.05μg/L；

混合氘代物内标工作溶液配制：其中吗啡-D3、O6-单乙酰吗啡-D3、苯丙胺-D5、氯胺酮-D4、去甲氯胺酮-D4、3,4-亚甲二氧基苯丙胺-D5浓度为1000μg/L；甲基苯丙胺-D5、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺-D5、可卡因-D3和苯甲酰爱康宁-D3浓度为200μg/L。

(3)分别向系列混合标准工作溶液中加入25μL混合氘代物内标工作溶液，进行固相萃取，固相萃取小柱使用前依次用3mL甲醇与3mL纯水活化小柱，活化后进行上样，上样体积均为50mL，上样流速不超过10ml/min，上样完后用3mL甲醇淋洗，用4mL4％TFA甲醇溶液洗脱，并收集洗脱液于10mL玻璃试管中在常温下氮吹至近干，最终使用250μL甲醇复溶，后续进行LC-MS分析。

(4)通过目标分析物与相应的氘代内标物在仪器上所响应的峰面积比为纵坐标，添加的浓度比为横坐标建立系列标准曲线，并考察了本方法的线性关系、检出限、定量限等参数。

(5)结果与讨论

该方法的线性范围、检出限和定量限参数，结果见表1。从表1中可以看到，MAMP、4-MMC、 MDMA、COC、BE在0.5-50ng/L范围内线性良好，MOR、MDA、KET、NKET、6-AM在2.5-250 ng/L范围内线性良好，AMP在5-500ng/L范围内线性良好。

表1 11种化合物的的线性、检出限和定量限结果

该方法的加标回收率，结果见表2，为了考察方法的准确度，故采用了阴性加标的方法考察了方法的加标回收率，其加标量采取了线性范围内的低、中、高三个浓度点进行加标。由表2中可得， 11种化合物的加标回收率为83.6％-118.8％，同时也对该方法的精密度进行了考察，分别采取线性范围内的低、中、高三个浓度点下进行日内(n＝6)和日间(n＝18)的精密度考察，结果间下表。日内和日间精密度均小于15％。

表2 11种化合物的的加标回收率、日内和日间精密度

实施例6实际污水样品中毒品含量的测定

取50mL污水样品用过滤器通过0.22μm玻璃纤维膜进行过滤，除去水样中的悬浮物，然后在滤液中添加25μL混合氘代物内标工作溶液，将溶液振荡混匀，后续在活化好的PS-DVB-WCX-II 小柱上进行固相萃取步骤，通过结合UPLC-MS/MS仪器分析，采用了内标法进行定量，最终得到了样品中各种毒品的含量情况，结果如表3所示，NA为未检出。

表3实际样品中的测定结果

Claims

1.一种混合模式弱阳离子固相萃取材料在环境水样中毒品的检测中的应用；

所述毒品为：吗啡、甲基苯丙胺、苯丙胺、氯胺酮、去甲氯胺酮、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺、3,4-亚甲二氧基苯丙胺、可卡因、苯甲酰爱康宁、O6-单乙酰吗啡和4-甲基卡西酮；

所述应用的方法为：将混合模式弱阳离子固相萃取材料装填于固相萃取柱中，经活化处理后上样，甲醇淋洗，4%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹后用甲醇复溶，进样分析；

所述混合模式弱阳离子固相萃取材料的制备方法为：

（1）将洗涤、干燥后的聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球加入二氯甲烷溶胀，接着在冰水浴、搅拌条件下，加入氯乙酰氯、无水氯化铝，自然升至室温，在氮气保护下反应3~5h，之后经后处理，得到酰基化微球；

（2）将步骤（1）所得酰基化微球分散于水与乙腈的混合溶剂中，在氮气保护下搅拌并升温至60~80℃，加入巯基琥珀酸、氢氧化钾，反应8~12h，之后经后处理，得到一次羧酸化微球；

（3）将步骤（2）所得一次羧酸化微球分散于水与乙腈的混合溶剂中，加入偶氮二异丁腈，在氮气保护下搅拌并升温至60~70℃，加入巯基琥珀酸，反应6~10h，之后经后处理，得到所述混合模式弱阳离子固相萃取材料。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，混合模式弱阳离子固相萃取材料的制备方法步骤（1）中，所述聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球、氯乙酰氯、无水氯化铝的质量比为3：3.5：5。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，混合模式弱阳离子固相萃取材料的制备方法步骤（2）中，所述水与乙腈的混合溶剂中，水与乙腈的体积比为2：1。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，混合模式弱阳离子固相萃取材料的制备方法步骤（2）中，所述巯基琥珀酸、氢氧化钾与步骤（1）中聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球的质量比为3.5：4.5：3。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，混合模式弱阳离子固相萃取材料的制备方法步骤（3）中，所述水与乙腈的混合溶剂中，水与乙腈的体积比为1：1。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，混合模式弱阳离子固相萃取材料的制备方法步骤（3）中，所述偶氮二异丁腈、巯基琥珀酸与步骤（1）中聚苯乙烯基-二乙烯基苯微球的质量比为0.13：3：3。