CN105727593A - 亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备与应用 - Google Patents

亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于色谱分离技术领域，公开了一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备与应用。所述色谱柱是以MBP或MCP为功能单体，与交联剂、生孔剂和引发剂混合后，在经过3?(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷预处理的石英毛细管内原位聚合得到。本发明的整体柱以MBP或MCP为功能单体，通过共聚的方式，与交联剂EDMA，硅烷化试剂γ?MAPs(3?(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷)形成稳定的高聚材料，并与毛细管壁紧密结合，既具有优秀的亲水性能，又具有良好的通透性、机械强度、耐酸碱性好，能应用于极性及强极性化合物的分离分析中。

Description

亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备与应用
技术领域
本发明属于色谱分离技术领域，具体涉及一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备与应用。
背景技术
众所周知，液相色谱及联用技术已广泛应用在环境、医学和生命科学等领域，关于其核心元件色谱分离介质及分析功能的研究也日渐深入。近年来，新型色谱固定相整体材料，因具有高通透性、低柱压、传质速度快、制备简单等优点，已经成为研究热点之一，且已成功在反相色谱、离子交换色谱、亲和色谱等分离模式中应用，有效地分离了氨基酸、小肽、蛋白质、多肽和类固醇等多类化合物。根据整体材料制备功能单体的不同，主要分为三大类：有机聚合物整体柱、硅胶整体柱和杂化整体柱[ZouH,HuangX,YeM,LuoQ.Monolithicstationaryphasesforliquidchromatographyandcapillaryelectrochromatography.JChromatogrA.2002；954(1-2):5-32.]。因有机聚合物整体柱具有制备简单、耗时短、成本低、机械强度高、渗透性好、柱背压低和生物样品兼容等特点，可实现分析物快速、高效、高通量的分离，因此受到了广泛地关注。亲水性液相色谱柱是亲水性液相色谱的核心部件，直接决定了色谱的分离效果。自1990年亲水性液相色谱(Hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)被首次提出后[AlpertAJ.Hydrophilic-interactionchromatographyfortheseparationofpeptides,nucleicacidsandotherpolarcompounds.JChromatogr.1990；499:177-96.]，用于HILIC的聚合物整体柱的研究成为了国际色谱领域的研究热点之一。如Lin等通过原位聚合3-磺丙基甲基丙烯酸酯(3-sulfopropylmethacrylate,SPMA)和季戊四醇三丙烯酸酯(pentaerythritoltriacrylate,PETA)，制备成表面带磺酸基和羟基的整体柱，在毛细管液相色谱和压力驱动的毛细管电色谱模式下成功分离极性小的中性和带电分子[LinJ,HuangG,LinX,XieZ.Methacrylate-basedmonolithiccolumnwithmixed-modehydrophilicinteraction/strongcation-exchangestationaryphaseforcapillaryliquidchromatographyandpressure-assistedCEC.Electrophoresis.2008；29(19):4055-65.]，为了增强其亲水作用，作者通过在流动相中加入长链季铵盐-十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)，屏蔽强阳离子交换位点，建立了动态修饰的强阳离子整体柱，实现了反相模式对中性、碱性和酸性亲水化合物的成功分离[LinJ,LinJ,LinX,XieZ.Capillaryliquidchromatographyusingahydrophilic/cation-exchangemonolithiccolumnwithadynamicallymodifiedcationicsurfactant.JChromatogrA.2009；1216(45):7728-31.]；Lin等还用2-(甲基丙烯酰氧乙基)烷基三甲基硫酸(2-(methacryloyloxy)ethyltrimethylammoniummethylsulfate,META)为离子交换位点和极性配基供体，与三乙烯单体PETA共聚合，通过调整生孔剂和META的比例，成功制备了具有强阳离子和亲水机理的整体柱，对中性、酸性和碱性极性化合物的分离具有很好的选择性，且可以避免碱性化合物的拖尾效应[LinJ,LinJ,LinX,XieZ.Preparationofamixed-modehydrophilicinteraction/anion-exchangepolymericmonolithicstationaryphaseforcapillaryliquidchromatographyofpolaranalytes.JChromatogrA.2009；1216(5):801-6.]；在光诱导下，N,N-二甲基-N-甲丙烯乙基-N-(3-磺酸)铵甜菜碱(N,N-dimethyl-N-methacryloxyethyl-N-(3-sulfopropyl)ammoniumbetaine)和聚(乙二醇)二丙烯酸酯(poly(ethyleneglycol)diacrylate)共聚合制备成了亲水性机理的多孔两性离子整体柱，对氨基类、酚类和苯甲酸类化合物具有很好的分离功能[ChenX,TolleyHD,LeeML.Preparationofzwitterionicpolymericmonolithiccolumnsforhydrophilicinteractioncapillaryliquidchromatography.JSepSci.2011Jun22.doi:10.1002/jssc.201100155.]。FengYQ课题组利用N-丙烯酰三(羟甲基)氨基甲烷(poly(N-acryloyltris(hydroxymethyl)aminomethane,NAHAM)和PETA，甲基丙烯酸(methacrylicacid,MAA)和EDMA共聚合制备的整体柱分别成功用于核苷类化合物[ChenML,WeiSS,YuanBF,FengYQ.Preparationofmethacrylate-basedmonolithforcapillaryhydrophilicinteractionchromatographyanditsapplicationindeterminationofnucleosidesinurine.JChromatogrA.2012；1228:183-92.]和牛血清白蛋白酶解多肽产物的分析[ChenML,LiLM,YuanBF,MaQ,FengYQ.Preparationandcharacterizationofmethacrylate-basedmonolithforcapillaryhydrophilicinteractionchromatography.JChromatogrA.2012；1230:54-60.]。Wang等用烷氧基硅烷(四甲氧基硅烷(tetramethoxysilane,TMOS)和乙烯基-三甲氧基硅烷(vinyl-trimethoxysilane,VTMS))的缩醛反应，在水溶性引发剂2,2'-偶氮双(2-甲基丙基脒)盐酸盐(2,2'-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AIBA)作用下，与带季铵基团的丙烯酰胺单体([2-(丙烯酰氧)乙基]三甲基铵硫酸盐([2-(acryloyloxy)ethyl]trimethylammoniummethylsulfate,AETA)共聚反应，成功制备具有亲和和强阳离子交换作用的有机无机杂化整体柱，且在压力毛细管电色谱模式下对极性和碱性核酸碱基及核苷进行了分离[WangX,ZhengY,ZhangC,YangY,LinX,HuangG,XieZ.Preparationandcharacterizationofhybrid-silicamonolithiccolumnwithmixed-modeofhydrophilicandstronganion-exchangeinteractionsforpressurizedcapillaryelectrochromatography.JChromatogrA.2012；1239:56-63.]；最近，有一锅法策略(one-pot)成功制备具有亲水分离机理的两性离子的硅氧杂化整体柱，即用3-甲氧基硅烷丙烯酰胺(3-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-MAPS)为交联剂，合成了两种两性离子硅氧烷杂化整体柱([2-(甲基丙烯酰氧)乙基]二甲基(3-磺酸丙基)氢氧化铵([2-(methacryloyloxy)ethyl]dimethyl-(3-sulfopropyl)ammoniumhydroxide,MSA)和2-甲基丙烯酰羟乙基磷酰胆碱(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine，MPC)为功能单体)，其通透性和机械强度很好，MSA整体柱可对中性、碱性和酸性化合物及小肽进行分离，同时，联用串联质谱可成功鉴定BSA酶解多肽[LinH,OuJ,ZhangZ,DongJ,WuM,ZouH.Facilepreparationofzwitterionicorganic-silicahybridmonolithiccapillarycolumnwithanimproved"one-pot"approachforhydrophilic-interactionliquidchromatography(HILIC).AnalChem.2012；84(6):2721-8.]。本课题组负责人也开展了一系列亲水作用整体柱的工作，如用4-SPV(1-(3-sulphopropyl)-4-vinylpyridinium-betaine)与甲基双丙烯酰胺(N,N'-methylenebisacrylamide,MBA)共聚合成的整体柱，在1min内成功分离了嘌呤和嘧啶[JiangZ,SmithNW,FergusonPD,TaylorMR.Novelhighlyhydrophiliczwitterionicmonolithiccolumnforhydrophilicinteractionchromatography.JSepSci.2009；32(15-16):2544-55.]；以SPP为功能性单体，成功制备了一类新型的有机聚合物基质的亲水作用整体色谱柱poly(SPP-co-EDMA)，测试发现该整体柱对苯酚类、碱基、维生素C等极性较强的一系列化合物具有良好的分离能力[LiuZ,PengY,WangT,YuanG,ZhangQ,GuoJ,JiangZ.Preparationandapplicationofnovelzwitterionicmonolithiccolumnforhydrophilicinteractionchromatography.JSepSci.2013；36:262-269.]。以甲基丙烯酸酯类化合物为功能单体，成功制备了poly(SPE-co-EDMA)整体柱，对中性、酸性和碱性极性小分子化合物具有良好的选择性[JiangZ,SmithNW,FergusonPD,TaylorMR.Hydrophilicinteractionchromatographyusingmethacrylate-basedmonolithiccapillarycolumnfortheseparationofpolaranalytes.AnalChem.2007；79(3):1243-50.]。但是，poly(SPE-co-EDMA)整体柱从亲水作用转为反相作用的临界点大约是60％ACN(ACN/H2O，v/v)，而这个临界点流动相中的ACN含量越低代表这种亲水整体柱的极性就越大。为了提高两性亲水整体柱的极性并系统考察交联剂极性对整体材料性能的影响，本课题组以SPDA为功能性单体，不同极性的化合物为交联剂，成功在100μm内径毛细管内原位聚合形成poly(SPDA-co-EDMA)、poly(SPDA-co-PDA)、poly(SPDA-co-MBA)一系列整体柱，并将它们成功应用于核苷碱基、维生素C异构体、小肽等化合物的分离中[YuanG,PengY,LiuZ,HongJ,XiaoY,GuoJ,SmithNW,CrommenJ,JiangZ.Afacileandefficientstrategytoenhancehydrophilicityofzwitterionicsulfoalkylbetainetypemonoliths,JChromatogrA.2013；1301:88-97.LiuC,ChenW,YuanG,XiaoY,CrommenJ,XuS,JiangZ.Influenceofthecrosslinkertypeonthechromatographicpropertiesofhydrophilicsulfoalkylbetaine-typemonolithiccolumns,JChromatogrA.2014；1373:73-80.]。研究结果发现，提高交联剂极性有可能提高亲水整体柱固定相极性，原因可能是使用极性更强的化合物作为交联剂有效减少不期望获得的亲脂聚合物骨架；并且发现固定相的性能与交联剂性质密切相关。除甜菜碱类化合物外，磷脂酰胆碱类单体是另一种非常重要的两性离子化合物。在前期研究工作中，本课题组已将MPC和EDMA聚合制备成的有机聚合物整体柱成功应用于极性化合物和小肽的分离中[JiangZ,ReillyJ,EverattB,SmithNW.Novelzwitterionicpolyphosphorylcholinemonolithiccolumnforhydrophilicinteractionchromatography.JChromatogrA.2009；1216(12):2439-48.]。Wiedmer等人也将MPC基质的硅胶整体柱应用于核苷、碱基及核苷酸的分离中，并获得了不错的分离效果[MoravcováD,HaapalaM,PlanetaJ,T,KostiainenR,WiedmerSK.Separationofnucleobases,nucleosides,andnucleotidesusingtwozwitterionicsilica-basedmonolithiccapillarycolumnscoupledwithtandemmassspectrometry,JChromatogrA.2014；1373:90-96.]。这些研究成果证明磷脂酰胆碱类化合物有潜力作为一类有效的亲水色谱材料用于极性和强极性化合物的分离、纯化上。更为值得关注地是，近三年来研究发现胆碱磷酸类化合物(cholinephosphate,CP)能够与细胞膜磷脂双分子层中的磷脂酰胆碱(PC)基团产生静电作用，从而被开发用于细胞粘附、创伤修复、药物运载及抗蛋白吸附等领域[YuX,LiuZ,JanzenJ,ChafeevaI,HorteS,ChenW,KainthanRK,KizhakkedathuJN,BrooksDE.Polyvalentcholinephosphateasauniversalbiomembraneadhesive,NatMater.2012；11:468-476.ChenX,ChenT,LinZ,LiX,WuW,LiJ.Cholinephosphatefunctionalizedsurface:protein-resistantbutcell-adhesivezwitterionicsurfacepotentialfortissueengineering.ChemCommun.2015；51:487-490.]。分析胆碱磷酸类化合物的化学结构并与MPC进行对比后发现：除磷酸根与季铵基团取向移位外，其它特征与MPC基本保持一致，因此基于胆碱磷酸类化合物的整体材料有可能表现出与MPC基质的整体材料非常近似的亲水色谱材料性能。但至今为止，胆碱磷酸类化合物尚未被用于制备亲水性有机聚合物整体柱。虽然亲水作用机理整体色谱柱的研究不少，但这些色谱柱极性有限，溶剂选择范围窄，大多只能应用于高有机相的条件，限制了其应用优化范围。因此，开发高效、应用范围广且稳定性良好的新型亲水性整体色谱柱，对强极性化合物的有效富集、分离，仍然是分离科学迫切需要解决的科学问题。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。
本发明的另一目的在于提供上述亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱在极性物质分离分析中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱，所述色谱柱是以2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸丁酯(2-{2-(methacryloyloxy)ethyldimethylammonium}ethyln-butylphosphate，MBP)或2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸(2-(methacryloyloxy)ethylcholinephosphate，MCP)为功能单体，与交联剂、生孔剂和引发剂混合后，在经过3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)预处理的石英毛细管内原位聚合得到。
上述亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱具有连续的多孔结构，其由末端带亲水性胆碱磷酸基团(cholinephosphate)的功能单体MBP或MCP依次序连接交联剂、γ-MAPs和毛细管壁的硅醇基构成。
所述的MBP和MCP功能单体的化学结构式如下式所示：
上述两种功能单体可参照文献[HuG,ParelkarSS,EmrickT.Afacileapproachtohydrophilic,reversezwitterionic,cholinephosphatepolymers.PolymChem.2015；6:525-530.]制备得到。
上述亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，包括以下制备步骤：将MBP或MCP功能单体、交联剂、生孔剂和引发剂混合，超声脱气后，灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管柱内，然后将石英毛细管两端封口，放入水浴中反应，反应完毕后除去石英毛细管中的未反应物，得到亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。
优选地，所述经过γ-MAPs预处理的石英毛细管是按以下操作步骤制备得到：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和γ-MAPs混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得经过γ-MAPs预处理的石英毛细管。通过上述操作，在石英毛细管表面的硅醇基与γ-MAPs(3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷)反应，γ-MAPs键合在硅醇上。
优选地，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)，所述生孔剂为质量比为33:67～38:62的异丙醇和四氢呋喃的混合溶液，所述引发剂为偶氮二异丁腈(Azobisisobutyronitrile,AIBN)；更优选地，所述生孔剂为质量比为35.5:64.5的异丙醇和四氢呋喃的混合溶液。
优选地，所述水浴中反应的温度为45～75℃，时间为2～24h；更优选地，所述水浴中反应的温度为60℃，时间为12h。
优选地，所述MBP或MCP功能单体与交联剂的质量比为52.2:47.8～59.7:40.3；所述引发剂的质量为MBP或MCP功能单体与交联剂总质量的0.5％～1％；所述MBP或MCP功能单体与交联剂的质量之和，与生孔剂的质量比为18.8:81.2～23.8:76.2；更优选地，所述MBP或MCP功能单体与交联剂的质量比为57.2:42.8；所述引发剂的质量为MBP或MCP功能单体与交联剂总质量的1％；所述MBP或MCP功能单体与交联剂的质量之和，与生孔剂的质量比为21.3:78.7。
所述除去石英毛细管中的未反应物是按照以下步骤进行操作：将石英毛细管的一端与高压泵连接，用有机溶剂进行冲洗，所述有机溶剂为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。
上述亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱在极性物质分离分析中的应用。
优选地，所述的极性物质为核苷碱基、核苷酸或小肽。
本发明的制备方法及所得到的色谱柱具有如下优点及有益效果：
(1)本发明首次报道了以MBP或MCP为功能单体，通过共聚的方式，与交联剂EDMA，硅烷化试剂γ-MAPs(3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷)形成稳定的并与毛细管壁紧密结合的高聚材料；该聚合物材料既具有优秀的亲水性能，又具有良好的通透性、机械强度、耐酸碱性好，能应用于极性及强极性化合物的分离分析中；
(2)本发明的胆碱磷酸基质的整体柱与现有MPC整体柱相比，该类胆碱磷酸基质的整体柱表现出柱压低、柱效高和分离能力好的优势；并且MBP或MCP整体柱有潜力通过PC-CP之间的静电作用吸附细胞裂解液甚至活细胞，有潜力用于构建一种新型的细胞膜色谱法用于药物研发早期的候选活性化合物的高通量筛选。
附图说明
图1为实施例1制备所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备示意图；
图2为实施例1制备所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的扫描电镜图；
图3为实施例1制备所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的保留行为结果图；
图4为实施例1制备所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱和poly(MPC-co-EDMA)分离核苷碱基色谱对比图；
图5为实施例1制备所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱和poly(MPC-co-EDMA)的核苷酸分离色谱对比图；
图6为实施例1制备所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱和poly(MPC-co-EDMA)对小肽的分离结果对比图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1～7所使用的经过γ-MAPs预处理的石英毛细管是按以下操作步骤制备得到：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅中反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得经过γ-MAPs预处理的石英毛细管。
实施例1
将功能单体MBP、交联剂EDMA、生孔剂(包括异丙醇和四氢呋喃)和引发剂偶氮二异丁腈AIBN，配制成反应混合液，超声脱气后灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管内，然后将石英毛细管两端封口，放入60℃水浴中反应12小时；反应完毕后将石英毛细管与高压泵连接，冲洗掉未反应物，得到poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。其中MBP与交联剂的质量比为57.2:42.8，致孔剂中异丙醇与四氢呋喃的质量比为35.5:64.5，MBP与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为21.3:78.7，引发剂的质量为MBP与交联剂质量之和的1％。该整体柱的制备示意图如图1所示，柱内有机聚合物的电子扫描电镜结果如图2所示。
实施例2
将功能单体MBP、交联剂EDMA、生孔剂(异丙醇和四氢呋喃)和引发剂偶氮二异丁腈AIBN，配制成反应混合液，超声脱气后灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管内，然后将石英毛细管两端封口，放入60℃水浴中反应12小时，反应完毕后将石英毛细管与高压泵连接，冲洗掉未反应物，得到poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。其中MBP与交联剂的质量比为57.2:42.8，致孔剂中异丙醇与四氢呋喃的质量比为33.0:67.0，MBP与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为21.3:78.7，引发剂的质量为MBP与交联剂质量之和的1％。
实施例3
将功能单体MBP、交联剂EDMA、生孔剂(异丙醇和四氢呋喃)和引发剂偶氮二异丁腈AIBN，配制成反应混合液，超声脱气后灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管内，然后将石英毛细管两端封口，放入60℃水浴中反应12小时，反应完毕后将石英毛细管与高压泵连接，冲洗掉未反应物，得到poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。其中MBP与交联剂的质量比为57.2:42.8，致孔剂中异丙醇与四氢呋喃的质量比为38.0:62.0，MBP与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为21.3:78.7，引发剂的质量为MBP与交联剂质量之和的1％。
实施例4
将功能单体MBP、交联剂EDMA、生孔剂(异丙醇和四氢呋喃)和引发剂偶氮二异丁腈AIBN，配制成反应混合液，超声脱气后灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管内，然后将石英毛细管两端封口，放入60℃水浴中反应12小时，反应完毕后将石英毛细管与高压泵连接，冲洗掉未反应物，得到poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。其中MBP与交联剂的质量比为52.2:47.8，致孔剂中异丙醇与四氢呋喃的质量比为35.5:64.5，MBP与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为21.3:78.7，引发剂的质量为MBP与交联剂质量之和的1％。
实施例5
将功能单体MBP、交联剂EDMA、生孔剂(异丙醇和四氢呋喃)和引发剂偶氮二异丁腈AIBN，配制成反应混合液，超声脱气后灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管内，然后将石英毛细管两端封口，放入60℃水浴中反应12小时；反应完毕后将石英毛细管与高压泵连接，冲洗掉未反应物，得到poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。其中MBP与交联剂的质量比为59.7:40.3，致孔剂中异丙醇与四氢呋喃的质量比为35.5:64.5，MBP与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为21.3:78.7，引发剂的质量为MBP与交联剂质量之和的1％。
实施例6
将功能单体MBP、交联剂EDMA、生孔剂(异丙醇和四氢呋喃)和引发剂偶氮二异丁腈AIBN，配制成反应混合液，超声脱气后灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管内，然后将石英毛细管两端封口，放入60℃水浴中反应12小时；反应完毕后将石英毛细管与高压泵连接，冲洗掉未反应物，得到poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。其中MBP与交联剂的质量比为52.2:47.8，致孔剂中异丙醇与四氢呋喃的质量比为35.5:64.5，MBP与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为23.8:76.2，引发剂的质量为MBP与交联剂质量之和的1％。
实施例7
将功能单体MBP、交联剂EDMA、生孔剂(异丙醇和四氢呋喃)和引发剂偶氮二异丁腈AIBN，配制成反应混合液，超声脱气后灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管内，然后将石英毛细管两端封口，放入60℃水浴中反应12小时；反应完毕后将石英毛细管与高压泵连接，冲洗掉未反应物，得到poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。其中MBP与交联剂的质量比为52.2:47.8，致孔剂中异丙醇与四氢呋喃的质量比为35.5:64.5，MBP与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为18.8:81.2，引发剂的质量为MBP与交联剂质量之和的1％。
实施例1所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的液相保留行为：
用实施例1所得的poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱，乙腈和水为流动相，甲苯、丙烯酰胺和硫脲为测试化合物，测试它们在如下条件下的保留行为，结果如图3所示。
测试条件：
图3所示结果表明，在乙腈浓度超过75％(v/v)时，该柱表现出明显地亲水性相互作用，说明该柱有潜力用于极性和强极性化合物的分离分析。
实施例1所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱和poly(MPC-co-EDMA)分离核苷碱基：
用实施例1所得的poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱和poly(MPC-co-EDMA)，等度洗脱，测试一系列核苷碱基在整体柱上的分离效果，对比结果如图4所示。
测试条件：
样品：胸腺嘧啶(1)、尿嘧啶(2)、腺嘌呤(3)、胞嘧啶(4)、尿苷(5)、胞嘧啶核苷(6)、肌苷(7)
图4所示结果表明，以上7个混合样品利用本发明poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱进行分离，能达到很好的分离效果；并且表现出比poly(MPC-co-EDMA)更高地柱效和更好地分离能力。
实施例1所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱和poly(MPC-co-EDMA)分离核苷酸：
用实施例1所得的poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱和poly(MPC-co-EDMA)，等度洗脱，测试一系列核苷酸在整体柱上的分离效果，对比结果如图5所示。
测试条件：
图5所示结果表明，以上5个混合样品利用本发明poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱进行分离，能达到很好的分离效果；并且表现出比poly(MPC-co-EDMA)更高地柱效和更短地分离时间。
实施例1所得poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱分离小肽：
用实施例1所得的poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱和poly(MPC-co-EDMA)，等度洗脱，测试一系列小肽在整体柱上的分离效果，对比结果如图6所示。
测试条件：
样品：Leu-Leu(1)、Ala-Leu(2)、Leu-Gly(3)、Gly-NLeu(4)、Gly-Val(5)、Ala-Ala(6)、Ala-Tyr(7)、Ala-Gly(8)、Ala-Gly-Gly(9)、L-Carnosine(10)
图6所示结果表明，以上10个混合样品利用本发明poly(MBP-co-EDMA)亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱进行分离，能达到很好的分离效果；并且表现出比poly(MPC-co-EDMA)更高地柱效、更好地选择性和更短地分离时间。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱，其特征在于：所述色谱柱是以MBP或MCP为功能单体，与交联剂、生孔剂和引发剂混合后，在经过3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷预处理的石英毛细管内原位聚合得到。
2.根据权利要求1所述的一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱，其特征在于：所述色谱柱具有连续的多孔结构，其由末端带亲水性胆碱磷酸基团的功能单体MBP或MCP依次序连接交联剂、γ-MAPs和毛细管壁的硅醇基构成。
3.权利要求1或2所述的一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：将MBP或MCP功能单体、交联剂、生孔剂和引发剂混合，超声脱气后，灌入经过γ-MAPs预处理的石英毛细管柱内，然后将石英毛细管两端封口，放入水浴中反应，反应完毕后除去石英毛细管中的未反应物，得到亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱。
4.根据权利要求3所述的一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，其特征在于：所述经过γ-MAPs预处理的石英毛细管是按以下操作步骤制备得到：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和γ-MAPs混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得经过γ-MAPs预处理的石英毛细管。
5.根据权利要求3所述的一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，其特征在于：所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述生孔剂为质量比为33:67～38:62的异丙醇和四氢呋喃的混合溶液；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述水浴中反应的温度为45～75℃，时间为2～24h。
6.根据权利要求5所述的一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，其特征在于：所述生孔剂为质量比为35.5:64.5的异丙醇和四氢呋喃的混合溶液；所述水浴中反应的温度为60℃，时间为12h。
7.根据权利要求3所述的一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，其特征在于：所述MBP或MCP功能单体与交联剂的质量比为52.2:47.8～59.7:40.3；所述引发剂的质量为MBP或MCP功能单体与交联剂总质量的0.5％～1％；所述MBP或MCP功能单体与交联剂的质量之和，与生孔剂的质量比为18.8:81.2～23.8:76.2。
8.根据权利要求7所述的一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，其特征在于：所述MBP或MCP功能单体与交联剂的质量比为57.2:42.8；所述引发剂的质量为MBP或MCP功能单体与交联剂总质量的1％；所述MBP或MCP功能单体与交联剂的质量之和，与生孔剂的质量比为21.3:78.7。
9.根据权利要求3所述的一种亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱的制备方法，其特征在于：所述除去石英毛细管中的未反应物是按照以下步骤进行操作：将石英毛细管的一端与高压泵连接，用有机溶剂进行冲洗，所述有机溶剂为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。
10.权利要求1或2所述的亲水性胆碱磷酸基质的有机聚合物液相整体色谱柱在极性物质分离分析中的应用；所述的极性物质包括核苷碱基、核苷酸或小肽。
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