CN101294930B - 一种整体型固定化pH梯度的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种整体型固定化pH梯度的制备方法及其应用，其制备方法为先配制一系列由酸、碱以及中性单体组成的具有不同pH值的溶液，每一种溶液聚合得到一个pH梯度，多个梯度组合得到宽范围的pH梯度，采用原位聚合或先聚合后固定的方法将pH梯度固定在柱形容器中，即得整体型固定化pH梯度。与现有技术相比，本发明方法可方便地制备1～14之间任意范围的固定化pH梯度，无须使用商品两性电解质，操作简便，成本低，所制得的pH梯度用于等电聚焦分离蛋白质、多肽等两性电解质，具有梯度稳定、分辨率高、可反复使用、适合于纯化制备等特点。

Description

一种整体型固定化pH梯度的制备方法及其应用

技术领域：本发明涉及一种整体型固定化pH梯度的制备方法及其在等电聚焦分离两性电解质中的应用，属于两性电解质的分离介质的技术领域。

背景技术：现代蛋白组分离技术主要是基于二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D PAGE)及强阳离子交换-反相高效液相色谱(SCX RP-HPLC)，其中后者又称鸟枪技术。迄今为止，2DPAGE仍然是最强大的蛋白组分离技术，但却伴随着耗时长、操作难的缺点。固定化pH梯度(IPG)的发明大大提高了2D PAGE的重现性，并能够增加上样量，从而改善灵敏度。用户可以根据实际情况灵活选用或调配制作不同范围胶条，窄梯度的胶条能显著提高分辨率，多条覆盖窄pH范围的胶条组合起来使用，可以大幅提高显示的蛋白点数目。IPG的缺点是一次性使用、机械强度低、只能依靠电流驱动。在鸟枪技术中，蛋白质混合物先酶解为肽，再经液相色谱分离，导致原始蛋白质的破坏，使标记物的提取最终必须依赖其它方法。

近几年的研究表明，毛细管电泳技术有较多优势，包括分辨率高、样品消耗少、容易自动化等等，因而越来越多地被应用于蛋白组学及生物标记物的发现研究中。毛细管等电聚焦(CIEF)是一种重要的根据等电点分离肽、蛋白质等两性物质的技术。早期的等电聚焦实验之所以往往难以与质谱检测技术匹配，是因为其中使用了高浓度的载体两性电解质(CAs)。三年前本发明人报道了一种无须在样品中添加自由载体两性电解质的毛细管等电聚焦方法，其中使用了整体型固定化pH梯度技术，载体两性电解质分子通过共价键固定于聚合物表面，但不失其酸碱两性及缓冲能力。在聚焦时非挥发性的离子被赶出柱子，而载体两性电解质分子在聚焦完成后并不随蛋白质一起迁移出毛细管，因此被分离的蛋白质区带可以直接导入质谱仪进行检测。为了分离复杂的生物样品，发明人还开发了窄梯度的整体型固定化pH梯度，其分辨率更高，可以进一步分离在宽整体型固定化pH梯度上不能分开的蛋白质谱带。

毛细管等电聚焦对两性电解质尤其是蛋白质及肽具有很高的分辨率。为了在毛细管中建立适宜的pH梯度，CIEF缓冲溶液中加入较高浓度的CAs，这限制了CIEF的应用范围。使用CAs带来的问题主要表现在下列几个方面：

(1)CAs本身是复杂混合物，不同批次的产品会有差异，将导致分离重现性降低；

(2)自由溶液中CAs建立的pH梯度不够稳定，会发生负极漂移现象，漂移使负极端的梯度平坦化，导致在极端(＞9)pH条件下分辨率降低；

(3)CAs有强烈的紫外吸收，直接导致短波范围检测波长不能使用，这会降低紫外-可见检测器吸收灵敏度，实验当中往往只能选择280nm作为检测波长；

(4)质谱是蛋白质表征和鉴定的重要手段，高浓度两性电解质CAs的使用会增大质谱仪噪音，限制了CIEF与质谱仪的联用；

(5)CAs价格昂贵，作为高浓度使用的消耗品会增加实验成本。

在CIEF中，无需CAs而进行聚焦的技术也曾经有过报道，比如流体聚焦(rheoelectrolysis)、电解水、热致pH梯度、自聚焦(auto-focusing)等，但尚存在梯度不够稳定、分辨率低、所需仪器设备太复杂等各种缺点。

显然，与IPG的功效类似，如果将pH梯度固定到柱管中，可以解决CAs带来的部分问题。1986年Hochstrasser等(参考文献：Hochstrasser D.，Augsburger V.，Funk M.，AppelR.，Pellegrini C.，Muller A.F.Immobilized pH gradients in capillary tubes andtwo-dimensional gel electrophoresis.Flectrophoresis 1986，7：505-511)介绍了一种“载体两性电解质-固定化pH梯度”(CA-IPG，carrier ampholyte-immobilizedpHgradient)，他们把商品化CAs(LKB)加入聚丙烯酰胺中制成凝胶，并使其在内径为1.5mm的玻璃管中成型，制成的pH梯度分离介质用于2D PAGE处理人血清样品，显示出一定的效果。然而作者也承认，在使用高电压的情况下该“固定化”梯度有可能从负极端逸出玻璃管，导致系统短路的危险。Klein等人(参考文献：Klein J.，Harding G.，Klein E.Anew isoelectric focusing gel for two-dimensional electrophoresis constructed inmicroporous hollow fiber membranes.J Proteom.Res.2002，1：41-45)在不浸润的微孔塑料管中制备IEF胶，利用商品化的CAs(pH 3～10)，可制得4.5～9.5梯度的分离介质。但上述两种方法只是将CAs引入凝胶，CAs并未通过化学键固定在凝胶上，并且也未将凝胶固定于管壁，因此其稳定性并不理想。

一种新型的在毛细管中制备整体柱型固定化pH梯度(M-IPG，monolithic immobilizedpH gradient)的方法(参考文献：Chun Yang，Guijie Zhu，Weibing Zhang，Yukui Zhang“Repeatedly usable immobilized pH gradient in a monolithic capillary column”Electrophoresis 2004，25：1729-1734)通过在整体基质表面化学键合CAs的方法实现，制备的材料可以方便地实现蛋白质混合物的等电聚焦分离，该方法还可以实现窄梯度的M-IPG(参考文献：Guijie Zhu，Chun Yang，Lihua Zhang，Weibing Zhang，Yukui Zhang“Optimization of the preparation of monolithic immobilized pH gradient and amethod to make narrow gradients”Talanta 2006，70，2-6)。但目前M-IPG的缺点是必须使用商品化的CAs。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一种整体型固定化pH梯度的制备方法及其应用。本发明针对现有M-IPG的缺点，提供了一种可实现1～14任意制定范围的高分辨率pH梯度的制备方法，以及这种pH梯度在等电聚焦分离两性电解质中的应用。

本发明是这样实现的：一种整体型固定化pH梯度的制备方法为：(1)配制一系列由酸、碱以及中性单体组成的具有不同pH值的溶液，每种溶液至少含有3种单体：酸性单体A₁A₂C＝CA₃A₄、碱性单体B₁B₂C＝CB₃B₄、中性单体N₁N₂C＝CN₃N₄，其余成分为溶剂、致孔剂、引发剂中的一种或多种；溶液中单体A₁A₂C＝CA₃A₄、B₁B₂C＝CB₃B₄的浓度呈现梯度分布；(2)每一种溶液聚合得到一个pH梯度，多个梯度组合得到宽范围的pH梯度，采用原位聚合或先聚合后固定的方法将pH梯度固定在柱形容器中，即得整体型固定化pH梯度。(原位聚合是指将溶液灌入柱形容器后再聚合的方法，包括分别聚合与同步聚合两种方式。)

上述单体A₁A₂C＝CA₃A₄和B₁B₂C＝CB₃B₄的浓度为0.01％～80％，N₁N₂C＝CN₃N₄的浓度为1％～90％；其中基团A₁、A₂、A₃、A₄至少一个是酸性，其余为H或含C₁～C₁₀的基团；基团B₁、B₂、B₃、B₄至少一个是碱性，其余为H或含C₁～C₁₀的基团；基团N₁、N₂、N₃、N₄为H或含C₁～C₁₀的基团。

从窄的固定化pH梯度得到宽范围的固定化pH梯度采用下列方法之一或任意组合：(1)按单体A₁A₂C＝CA₃A₄或B₁B₂C＝CB₃B₄的浓度高低顺序排列，将系列溶液依次灌入柱形容器中并各自占领一定长度，系列溶液分别或同步聚合，形成整体型固定化pH梯度，选择不同溶液组合可得到不同范围的固定化pH梯度；(2)系列溶液分别聚合，形成系列短的固定化pH梯度，切割成统一形状后，按单体A₁A₂C＝CA₃A₄或B₁B₂C＝CB₃B₄的浓度高低顺序装入柱形容器并固定，即得不同pH值范围的固定化pH梯度；(3)系列溶液分别聚合，聚合物粉碎后混合，装入柱形容器并固定。

以上所述的酸性单体A₁A₂C＝CA₃A₄为不饱和羧酸或其酸酐、盐类，或者不饱和磺酸或其酸酐、盐类。

具体的说，所述的酸性单体为丙烯酸或其盐、甲基丙烯酸或其盐、氰基丙烯酸或其盐、乌头酸或其盐、富马酸或其盐、马来酸或其盐、山梨酸或其盐、乙烯基磺酸或其盐、烯丙基磺酸或其盐、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸或其盐中的一种或多种。

所述的碱性单体B₁B₂C＝CB₃B₄是不饱和胺类或其盐。

具体的说，所述的碱性单体为乙烯胺、N-甲基亚甲胺、亚乙胺、二甲基丙烯基胺、烯丙基胺、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二烯丙基胺甲基氯化铵、二甲基二丙烯基氯化铵、N，N-二甲基氨基乙基丙烯酸酯甲基氯化铵、N，N-二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯甲基氯化铵、异丁烯酰胺丙基三甲基氯化铵中的一种或多种。

所述的中性单体N₁N₂C＝CN₃N₄是不饱和酰胺、醇、醚、酯或苯乙烯类；包括丙烯酰胺、取代丙烯酰胺、丙烯酸酯类或其混合物。

具体的说，所述的中性单体为丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、烯丙基甲基丙烯酸酯、烯丙基脱水甘油基醚、N-甲基-N-乙烯基乙酰胺、异丙基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、乙烯基甲醚、乙烯基乙醚、乙烯基丙醚、乙烯基正丁醚、乙烯基异丁醚、氯丙烯、丙烯醇、丙烯腈、苯乙烯、二乙烯基苯中的一种或多种。

所述的溶剂、致孔剂为水、C₁～C₁₂一元或多元醇、C₁～C₁₀一元或多元羧酸、聚乙二醇、丙酮、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或多种的混合物。

所述的引发剂为偶氮类或过氧化物类。

具体的说，所述的引发剂为偶氮二异丁腈、双氧水、过氧化苯乙酰或过硫酸钾。

整体型固定化pH梯度制备过程中的聚合反应在40～80℃水浴锅中进行，聚合时间5～48小时。

本发明所述整体型固定化pH梯度的制备方法制备得到的pH梯度在等电聚焦分离两性电解质中的应用。

具体的讲，将整体型固定化pH梯度应用于蛋白质或多肽的等电聚焦分离、纯化。

本发明在实施的过程中，通过调整酸性单体、碱性单体的比例，可以优化固定化pH梯度的pH值范围，从而实现1～14范围内的任意pH梯度。通过调整酸性单体、碱性单体的浓度，可优化固定化pH梯度的缓冲能力及上样量。

与现有技术相比，本发明方法可方便地制备1～14之间任意范围的固定化pH梯度，无须使用两性电解质CAs，操作简便，成本低，所制得的pH梯度用于等电聚焦分离蛋白质、多肽等两性电解质分子，具有梯度稳定、分辨率高、可反复使用、适合于纯化制备等特点。

附图说明：

图1是实施例6中采用分别聚合方法制备宽幅pH梯度示意图。

图2是实施例7中采用同步聚合方法制备宽幅pH梯度示意图。

图3是实施例10中整体型固定化pH梯度实现等电聚焦分离蛋白质混合物的谱带图，其中电压20kv，检测波长280nm，蛋白质浓度均为1.2mg/mL。

图4是实施例11中宽pH梯度和窄pH梯度等电聚焦实验的比较图谱。

具体实施方式：

通过以下实施例可进一步详细阐述本发明，但不作为对本发明的限制。

选择2-丙烯酰氨基2-甲基丙烷磺酸(AMPS，2-acrylamido-2-methylpropyl sulfonicacid)作为酸性单体，N，N-二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯(DEAEMA，N，N-Diethylaminoethyl Methacrylate)为碱性单体，丙烯酰胺(AA)与N，N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为中性单体，溶剂是水及四氢呋喃(THF)，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN，azobisisobutyronitrile)。具体配方见表1。配制一系列酸、碱以及中性单体组成的具有不同pH值的溶液。

表1系列溶液组成

实施例1：称(量)取表1中序号1～22所示的药品，分别置于22个1L容量瓶中，在冰水浴中充分搅拌制成溶液，储于-20℃冰箱中，需要时用移液管取出所需分量使用。该系列溶液能够建立pH值2～11之间的pH梯度。聚合反应在60℃水浴锅中进行，聚合时间5～48小时。

实施例2：与实施例1相比：本实施例在保持中性单体、引发剂的浓度不变的情况下，所用酸、碱性单体的浓度不同。通过提高表1中序号1、2、3中AMPS的用量，使其分别达到20、18、16克，从而使pH范围在低pH方向扩展到pH＝1；通过提高表1中序号20、21、22中DEAEMA的用量，使其分别达到230、270、300克，从而使pH范围在高pH方向扩展到pH＝14。同时，聚合反应温度及时间保持不变。

实施例3：与实施例1、2相比：本实施例使用不同的酸性单体(如乙烯基磺酸或乙烯基磺酸钠)、碱性单体(如乙烯胺)，同时，聚合反应温度及时间保持不变，从而实现pH＝1～14之间的梯度。

实施例4：与实施例1、2、3相比：本实施例使用不同的中性单体(如丙烯醇)，同时，聚合反应温度及时间保持不变，从而实现pH＝1～14之间的梯度。

实施例5：与实施例1、2、3、4相比：本实施例使用不同的溶剂/致孔剂(水和聚乙二醇)，同时，聚合反应温度及时间保持不变，从而实现pH＝1～14之间的梯度。

实施例6：采用分别聚合的方法，实现宽幅度的pH梯度。

内径为100微米的石英毛细管分别用0.5mol/L HCl、0.5mol/L NaOH、甲醇各冲洗10分钟，置于气相色谱炉中，在氮气流下70℃干燥30分钟，灌入50％(v/v)的3-甲基丙烯酸丙酯基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)甲醇溶液，用硅胶将两端封闭，室温下放置24小时，用甲醇将未反应的γ-MAPS冲洗干净，氮气吹干。截取30cm经过上述处理的毛细管，灌入长度为10cm的序号3(表1)溶液[见图1(A)]，封闭两端，60℃水浴锅中进行反应24小时。用10毫升50％(v/v)甲醇水溶液冲洗，在氮气流下60℃干燥30分钟。灌入长度为10cm的序号2(表1)溶液，使之接触序号3溶液形成的聚合物[见图1(B)]，重复聚合、冲洗步骤。最后灌入长度为10cm的序号1(表1)溶液，使之接触序号2溶液形成的聚合物[见图1(C)]，再次重复聚合、冲洗步骤，得到pH值2～4的整体型固定化pH梯度，如图1所示。

实施例7：与实施例6不同之处在于：采用同步聚合方法实现宽幅度的pH梯度。同时在毛细管中灌入长度均为10cm的序号3、2、1(表1)溶液，使之相互接触，并只封闭毛细管一端，以免聚合后出现断裂。聚合、冲洗步骤同实施例6，最后得到pH值2～4的整体型固定化pH梯度(见图2)。

实施例8：与实施例6、7相比：本实施例是在3支10毫升试管中分别加入序号3、2、1(表1)溶液，置于60℃水浴锅中聚合5～48小时后，取出分别截取长度为3cm的聚合物，按顺序装入一根10cm长玻璃管中，两端用硅胶密封固定，得到pH值2～4的整体型固定化pH梯度。

实施例9：与实施例6、7、8相比：本实施例是在3支10毫升试管中分别加入序号3、2、1(表1)溶液，置于60℃水浴锅中聚合5～48小时，取出聚合物研磨成粉并混合，将得到的粉末混合物装入一根10cm长玻璃管中，两端用硅胶密封固定，得到pH值2～4的整体型固定化pH梯度。

实施例10：向制得的整体型固定化pH梯度(pH3～10)毛细管柱中注入蛋白质样品，两端分别置于30mmol/L的H₃PO₄及20mmol/L的NaOH中，在20kv电压下聚焦10分钟后，将NaOH换成0.1mol/L的NaCl，聚焦蛋白质区带开始迁移。图3为6个蛋白质的聚焦谱带。峰归属：1 cytochrome c；2 lentil lectin I；3 human carbonic anhydrase；4 bovine carbonicanhydrase；5 β-lactoglobuline B；6 phycocyanin。

实施例11：本发明方法可方便地制备宽幅度或窄幅度的固定化pH梯度。窄幅度的pH梯度比宽幅度pH梯度有较高的分辨率。图4是相同样品(鸡蛋清蛋白质溶液)在宽pH梯度(3～10)和窄pH梯度(4～8)中聚焦的比较图谱。窄pH梯度(图4下)中出现的峰数目比宽pH梯度(图4上)多，显示出明显的分辨率优势。电泳实验操作同前述实施例10。

Claims (12)

1.一种整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：（1）配制一系列由酸、碱以及中性单体组成的具有不同pH值的溶液，每种溶液至少含有3种单体：酸性单体A₁A₂C=CA₃A₄、碱性单体B₁B₂C=CB₃B₄、中性单体N₁N₂C=CN₃N₄，其余成分为溶剂、致孔剂、引发剂中的一种或多种；溶液中单体A₁A₂C=CA₃A₄、B₁B₂C=CB₃B₄的浓度呈现梯度分布；（2）每一种溶液聚合得到一个pH梯度，多个梯度组合得到宽范围的pH梯度，采用原位聚合或先聚合后固定的方法将pH梯度固定在柱形容器中，即得整体型固定化pH梯度；单体A₁A₂C=CA₃A₄和B₁B₂C=CB₃B₄的浓度为0.01%～80%，N₁N₂C=CN₃N₄的浓度为1%～90%；其中基团A₁、A₂、A₃、A₄至少一个是酸性，其余为H或含C₁～C₁₀的基团；基团B₁、B₂、B₃、B₄至少一个是碱性，其余为H或含C₁～C₁₀的基团；基团N₁、N₂、N₃、N₄为H或含C₁～C₁₀的基团；所述的酸性单体A₁A₂C=CA₃A₄为不饱和羧酸或其酸酐、盐类，或者不饱和磺酸或其酸酐、盐类；所述的碱性单体B₁B₂C=CB₃B₄是不饱和胺类或其盐；所述的中性单体N₁N₂C=CN₃N₄是不饱和酰胺、醇、醚、酯或苯乙烯类。

2.按照权利要求1所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：从窄的固定化pH梯度得到宽范围的固定化pH梯度采用下列方法之一或任意组合：(1)按单体A₁A₂C=CA₃A₄或B₁B₂C=CB₃B₄的浓度高低顺序排列，将系列溶液依次灌入柱形容器中并各自占领一定长度，系列溶液分别或同步聚合，形成整体型固定化pH梯度，选择不同溶液组合可得到不同范围的固定化pH梯度；(2)系列溶液分别聚合，形成系列短的固定化pH梯度，切割成统一形状后，按单体A₁A₂C=CA₃A₄或B₁B₂C=CB₃B₄的浓度高低顺序装入柱形容器并固定，即得不同pH值范围的固定化pH梯度；(3)系列溶液分别聚合，聚合物粉碎后混合，装入柱形容器并固定。

3.按照权利要求1所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：所述的酸性单体为丙烯酸或其盐、甲基丙烯酸或其盐、氰基丙烯酸或其盐、乌头酸或其盐、富马酸或其盐、马来酸或其盐、山梨酸或其盐、乙烯基磺酸或其盐、烯丙基磺酸或其盐、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸或其盐中的一种或多种。

4.按照权利要求1所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：所述的碱性单体为乙烯胺、N-甲基亚甲胺、亚乙胺、二甲基丙烯基胺、烯丙基胺、二烯丙基胺、三烯丙基胺、二烯丙基胺甲基氯化铵、二甲基二丙烯基氯化铵、N, N-二甲基氨基乙基丙烯酸酯甲基氯化铵、N, N-二乙基氨基乙基甲基丙烯酸酯甲基氯化铵、异丁烯酰胺丙基三甲基氯化铵中的一种或多种。

5.按照权利要求1所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：所述的中性单体为丙烯酰胺、取代丙烯酰胺、丙烯酸酯类或其混合物。

6.按照权利要求1所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：所述的中性单体为丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N, N-二甲基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、烯丙基甲基丙烯酸酯、烯丙基脱水甘油基醚、N-甲基-N-乙烯基乙酰胺、异丙基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、乙烯基甲醚、乙烯基乙醚、乙烯基丙醚、乙烯基正丁醚、乙烯基异丁醚、氯丙烯、丙烯醇、丙烯腈、苯乙烯、二乙烯基苯中的一种或多种。

7.按照权利要求1所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：所述的溶剂和/或致孔剂为水、C₁～C₁₂一元或多元醇、C₁～C₁₀一元或多元羧酸、聚乙二醇、丙酮、四氢呋喃、N, N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或多种的混合物。

8.按照权利要求1所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：所述的引发剂为偶氮类或过氧化物类。

9.按照权利要求8所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：所述的引发剂为偶氮二异丁腈、双氧水、过氧化苯乙酰或过硫酸钾。

10.按照权利要求1所述整体型固定化pH梯度的制备方法，其特征在于：所述的聚合反应在40～80℃水浴锅中进行，聚合时间5～48小时。

11.一种采用如权利要求1～10中任一项所述整体型固定化pH梯度的制备方法制备得到的整体型固定化pH梯度的应用，其特征在于：将整体型固定化pH梯度应用于等电聚焦分离两性电解质。

12.按照权利要求11所述整体型固定化pH梯度的应用，其特征在于：将整体型固定化pH梯度应用于蛋白质或多肽的等电聚焦分离、纯化。

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