CN1242262C

CN1242262C - 二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法

Info

Publication number: CN1242262C
Application number: CN 02132792
Authority: CN
Inventors: 张玉奎; 杨春; 张凌怡; 张维冰
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2002-08-21
Filing date: 2002-08-21
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2022-08-21
Also published as: CN1477391A

Abstract

本发明涉及毛细管电泳技术，具体地说是一种二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法及所用接口。它在第一维毛细管电泳分离完成后生物大分子组分流经接口进入第二维毛细管电泳分离操作，实现二维毛细管电泳，而小分子物质可以通过扩散自由透过接口中的中空纤维，并在其达到平衡；所述生物大分子组分流经接口时在线向接口内的中空纤维中添加/脱除含低分子量物质的缓冲溶液，在缓冲溶液连续地流经接口同时实现动态冲洗，同时给正在分离的或已分离过的毛细管柱上同时施加电压，以调整从中空纤维中通过的生物大分子的带电性能。它柱效、峰容量更高、适于复杂样品要求，并具有高柱数、进样样品连续及不同毛细管电泳模式间联用的特点。

Description

二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法

技术领域

本发明涉及毛细管电泳技术，具体地说是一种二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法。

背景技术

毛细管电泳(CE)是一类简便、高效的分离、分析方法。与平板电泳方法相比，具有快速、样品用量少、易于自动化等诸多优点，在蛋白质、抗体、临床样品等生命活性物质的分离分析方面已得到越来越广泛的应用。

尽管毛细管电泳方法具有较高的柱效，但是普遍是一维模式，由于应用电压的限制，制约了所采用的分离柱长度，因而也限制了实际柱效和可能达到的峰容量。此外，毛细管柱过细的内径使得其光谱检测光程过小，对检测灵敏度产生很大影响。这些限制和影响在复杂生化样品、环境样品分析中尤为突出。因此发展具有较大峰容量和较高检测灵敏度的毛细管电泳仪器和方法对于进一步拓宽其应用和研究领域具有十分重要意义。

Gidding等(文献1：Gidings L C，Unified Seperation Sciece，John Wiley& Sons，New York)首先提出将两种分离模式结合构成多维体系用于复杂样品的分离的思想。采用多维分离技术可以极大地提高系统的峰容量，也可以更方便地与高灵敏检测器联用，更好地完成复杂样品的分离分析任务。目前，二维气相色谱已商品化，并成功用于炼厂气等的分离，达到了非常好的效果。二维凝胶电泳是目前蛋白组研究的重要工具，二维液相色谱的研究也有人进行了尝试性的工作。根据毛细管中流体的输运特征，采用电切换的方法进行多维分离的技术在毛细管芯片分离中已有应用，尤其在在人类基因组研究中得到了较好的发展，关亚风等(文献2：孙玉娥，关亚风，分析化学，25(7)，745-749，1997；文献3：孙玉娥，关亚风，色谱，15(2)，106-109，1997)曾经尝试过在芯片上实现不同模式CE的组合。但由于芯片的分离柱长太短，并不能满足对于复杂样品峰容量的要求，同时这种方法也不适于大分子活性蛋白等样品，检测灵敏度较低也限制了其对痕量组分的分离分析。

近几年来实现了CE和其他分离方式包括液相色谱(LC)的联用(文献4：Hooker，Thomas F.；Jeffery，Dorothea J.；Jorgenson，James W，Chem.Anal.，146，581-612 1998；文献5：Hooker，T.F.，Jorgenson，J.W.，Anal.Chem.1997，69，4134-4142；文献6：Moore，A.W.Jr.，Jorgenson，J.W.，Anal.Chem.1995，67，3456-3463；文献7：Liu，Zaiyou；Lee，Milton L.J.Microcolumn Sep.，12(4)，241-254 2000；文献8：Manabe，Takashi，Electrophoresis，21(6)，1116-1122，2000；文献9：Neuhoff，Volker，Electrophoresis，21(1)，3-11，2000；文献10：Bushey，Michelle M.；Jorgenson，James W.，Anal.Chem.，62(10)，978-84，1990；文献11：Tang，Qing；Harrata，A.Kamel；Lee，Cheng S.，Anal.Chem.，69(16)，3177-3182，1997)，得到了与传统二维电泳谱图类似的结果，对于毛细管电泳-毛细管电泳的二维联用也有人做了初步的尝试，这些方法基于柱间电动或机械切换实现样品由一根毛细管柱进入另一根毛细管柱，可以使峰容量得到较大的提高。二维分离在毛细管电泳用于复杂生物样品分离、分析具有非常重要的意义，近来人们已逐渐注意到多维分离的优势，预期将成为分离科学中新的研究热点。但目前为止，高柱数的二维或多维毛细管电泳以及不同模式间的联用还未见报道。

发明内容

为了克服上述不足，本发明的目的是提供一种柱效、峰容量更高、适于复杂样品要求的二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法及所用接口，它具有高柱数、进样样品连续及不同毛细管电泳模式间联用的特点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：在第一维毛细管电泳分离完成后生物大分子组分流经接口进入第二维毛细管电泳分离操作，实现二维毛细管电泳，而小分子物质可以通过扩散自由透过接口中的中空纤维，并在其达到平衡；

所述生物大分子组分流经接口时在线向接口内的中空纤维中添加/脱除含低分子量物质的缓冲溶液，在缓冲溶液连续地流经接口同时实现动态冲洗，同时给正在分离的或已分离过的毛细管柱上同时施加电压，以调整从中空纤维中通过的生物大分子的带电性能；

将通过上述处理的生物大分子组分通过下一接口进入下一维毛细管柱作进一步分离，从而实现多维毛细管电泳，同样小分子物质可以通过扩散自由透过中空纤维，并在其内外达到平衡；所述生物大分子组分流经接口时在线向接口内的中空纤维中添加/脱除含低分子量物质的缓冲溶液，在缓冲溶液连续地流经接口同时实现动态冲洗，同时给正在分离的或已分离过的毛细管柱上同时施加电压，以调整从中空纤维中通过的生物大分子的带电性能；所述加压方式为：在第一维毛细管电泳分离时只向第一维毛细管柱上施加电压，在第一、二维毛细管电泳分离时向第一、二维毛细管柱上同时施加电压，以此类推，即给予在分离的或分离过的毛细管柱上同时施加电压；所述施加的电压控制在5000～30kV范围内；所述在线向生物大分子组分流经的中空纤维中添加/脱除含低分子量物质的缓冲溶液的接口不包括第一维毛细管进样端接口；所述低分子量物质为表面活性剂、盐类；所述毛细管电泳分离模式分别可以是毛细管等电聚焦电泳(CIEF)、毛细管区带电泳(CZE)、毛细管电动力学色谱(MEKC)或毛细管电色谱(CEC)；

采用电渗流驱动二维分离系统，通过第一维毛细管柱进样端电极、接口电极和第二维毛细管柱的出口端的电极构成三电极体系，维持二维毛细管柱中的电势梯度，达到优化的分离效果；采用压力驱动的分离过程，通过密封毛细管柱之间的接口，保持中空纤维内外压力相同，然后在第一维毛细管柱进口端施加0.001到10MPa的压力，使第一维分离的生物大分子组分进入第二维毛细管柱；采用电渗流驱动多维分离系统，通过前一维毛细管柱进样端电极、接口电极和下一维毛细管柱的出口端的电极构成多电极体系，维持多维毛细管柱中的电势梯度，达到优化的分离效果；采用压力驱动的分离过程，通过密封毛细管柱之间的接口，保持中空纤维内外压力相同，然后在前一维毛细管柱进口端施加0.001到10MPa的压力，使前一维分离的生物大分子组分进入下一维毛细管柱；

其所用接口具有接口池体，在接口池体上设有电极插口、入口、出口，安装中空纤维于接口池体两端的连接口之间，毛细管柱通过连接口与中空纤维两端的端口内、外径相匹配密封对接，电极插口上插有电极并伸入接口池体，与中空纤维之间留有距离。

本发明具有如下优点：

1.具有不同毛细管电泳模式间联用的特点。本发明根据中空纤维接口具有半通透的性质，在截留生物大分子的同时，允许小分子溶质、溶剂自由通过，可以通过它向分离系统中添加小分子成分例如阴、阳离子表面活性剂，也可以通过连续进样和冲洗的办法从系统中脱去多余的表面活性剂或盐分，从而方便各种CE模式的自由组合，即多种分离模式的便利连接。

2.柱效高。本发明采用的中空纤维和毛细管柱的内径相互匹配，实现无死体积连接，使生物大分子沿分离通道连续移动，而不向样品槽扩散，无组分丢失现象、无进样过程中样品稀释和堆集问题；采用本发明进行毛细管电泳能够方便地通过维持第一维毛细管柱进样端、第二维毛细管柱出口端及接口处的压力，可以实现二维体系分别在0.001到10MPa的压力下运行；也可以在多维体系中分别实现压力驱动、电渗流驱动或压力、电渗流同时驱动。另外，由于接口可以密封并承受一定压力，能够抑制分离柱中产生气泡。

3.能满足质谱等检测要求。本发明接口设有溶剂置换的功能，能实现缓冲溶液的在线置换，在接口装置中可方便实现蛋白质变性、复性、酶解等操作，所以本发明可用于满足检测系统对缓冲溶液的需要。

4.操作方便。本发明可采用单一电泳模式，也可在不同电泳模式间联用，还可采用电极共用技术及电渗流调整技术，仅使用一台高压电源即可实现二维、多维毛细管电泳分离。

5.应用范围广。本发明接口装置选择分子量截留不同的中空纤维，可以处理不同分子量的生物大分子样品，如寡聚核苷酸、多肽、蛋白质以及DNA等；还可用于第一维分离后的柱后衍生化等反应，本发明所述接口装置由于起溶剂置换的作用，所以也可作为反应器使用。

6.峰容量更高。本发明接口能够实现不同毛细管电泳模式的自由组合，因此不制约所采用的分离柱长度；又，二维或多维毛细管电泳技术的实现，使毛细管电泳模式不能完全处理的复杂组分可以通过多维毛细管电泳技术的联用来达到彻底分离与表征，如图3、4所示，包括二维毛细管柱以后的多维毛细管柱的进样，是以它前面的毛细管柱分离的每个谱峰为基础的，因此柱效将得到很大提高(超过10⁶塔板数/m)，同时峰容量也可进一步提高。

附图说明

图1为本发明接口装置结构示意图。

图2为本发明一个实施例中血红蛋白的毛细管等电聚焦(CIEF)谱图。

图3为本发明一个实施例中血红蛋白的毛细管等电聚焦-毛细管凝胶电泳(CIEF-CGE)。

图4为本发明一个实施例中血红蛋白的毛细管等电聚焦-毛细管凝胶电泳-毛细管区带电泳(CIEF-CGE-CZE)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1

实验条件：

毛细管柱(河北永年锐洋色谱器件有限公司，50μm I.D.，375μm O.D.)，载体两性电解质Pharmalyte(pH3.0-10.0，BioChemika，Switzerland)，生物大分子组分为血红蛋白，为上海生化所产品，其他(本发明其试剂名称)试剂为分析纯。

毛细管电泳仪为Unimicro Technology的TriSep^TM-2000GV型，包括一台Data Module可调波长紫外-可见检测器、一台CEC control module连续可调高压直流电源；数据收集和谱图处理采用依利特公司Echrom98工作站和Echrom98 V2.0软件。

本发明实现二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法的专用接口具有接口池体2，在接口池体2上设有电极插口4、入口5、出口6，安装中空纤维3于接口池体2两端的连接口7之间，毛细管柱1通过连接口7与中空纤维3两端的端口内、外径相匹配密封对接，电极插口4上插有电极并伸入接口池体2，与中空纤维3之间留有距离；所述接口池体2为石英玻璃、陶瓷或聚合物，本实施例为石英玻璃。

本发明实现二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其具体操作步骤如下：

第一维采用毛细管等电聚焦(CIEF)方法，缓冲溶液为30mmol/L tris-HCl(含2％(v/v)Pharmalyte pH3-10)，正极电解液为30mmol/L H₃PO₄、负极电解液为30mmol/L NaOH，整柱进样，第二维采用毛细管凝胶电泳(CGE)方法，第三维采用毛细管区带电泳(CZE)方法，所用毛细管柱长均为25cm，有效长度15cm。实验所用电压为8kV。

在第一维毛细管电泳分离时给第一维毛细管柱上施加8kV电压，分离完成后，用30mmol/L tris-HCl缓冲溶液(含0.2％w/v十二烷基硫酸钠)通过接口装置的入口5、出口6连续(流速2mL/min)冲洗接口，实现在线向接口内的中空纤维3中添加含低分子量物质(0.2％w/v十二烷基硫酸钠)，同时(部分)脱除低分子量物质(载体两性电解质Pharmalyte)。经等电聚焦(IEF)过程形成的pH梯度遭到破坏，实施负极迁移，生物大分子组分经接口进入第二维毛细管柱(其中预先充满所述含0.2％w/v十二烷基硫酸钠的含低分子量物质缓冲溶液)，此时第一、二维毛细管柱上均施加8kV电压，当生物大分子组分进入第二维毛细管柱时，已经全部被十二烷基硫酸钠所饱和并带上负电荷，在电场的驱动下由负极向正极泳动，实现CIEF-CGE二维毛细管电泳；

在第二维毛细管电泳分离完成后，用30mmol/L tris-HCl缓冲溶液连续(流速2mL/min)冲洗第二维毛细管两端的接口，实现在线(部分)脱除低分子量物质(十二烷基硫酸钠)同时在第一、二、三维毛细管上同时施加8kV电压，从第二维毛细管柱出来的生物大分子组分经接口进入第三维毛细管柱，在正常电渗流的驱动下，蛋白质组分由正极向负极泳动，顺利实现CIEF-CGE-CZE三维毛细管电泳。

其实验结果：

如图2所示，生物大分子组分为血红蛋白经过毛细管等电聚焦电泳，按等电点不同分离为5个峰。

如图3所示，经过毛细管等电聚焦电泳分离为5个峰后，经过化学驱动，各个峰一次通过接口进入第二维毛细管，先后按照毛细管凝胶电泳模式进一步分离，每个峰都进一步分离成不同的峰。顺利实现了CIEF-CGE不同模式的联用。因为CGE以CIEF分离的每个谱峰为基础进样的，因此柱效将得到很大提高(超过10⁵塔板数/m)。

如图4所示，同样地经过二维CIEF-CGE分离的组分进一步按毛细管区带电泳分离为更多的峰。顺利实现了CIEF-CGE-CZE不同模式的联用。因为CZE以CGE分离的每个谱峰为基础进样的，因此柱效将得到进一步提高(超过10⁶塔板数/m)，同时峰容量得到进一步提高。

实施例2

与实施例1不同之处在于：在线脱除含低分子量物质的缓冲溶液为盐类与实施例1相同，实施第二维毛细管凝胶电泳分离的时候(电压8kV)，第一维毛细管柱上不加电压，代之以0.1Mpa的压力，用来驱动谱峰；同样实施第三维毛细管柱凝胶电泳分离的时候(电压8kV)，第一、二维毛细管柱上不加电压，代之以0.1Mpa的压力，用来驱动谱峰，可得到相似的结果。

Claims

1.一种二维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：在第一维毛细管电泳分离完成后生物大分子组分流经接口进入第二维毛细管电泳分离操作，实现二维毛细管电泳，而小分子物质可以通过扩散自由透过接口中的中空纤维，并在其达到平衡；

所述生物大分子组分流经接口时在线向接口内的中空纤维中添加含低分子量物质的第二维缓冲溶液和脱除含低分子量物质的第一维缓冲溶液，在缓冲溶液连续地流经接口同时实现动态冲洗，同时给正在分离的和已分离过的毛细管柱上施加电压，以调整从中空纤维中通过的生物大分子的带电性能。

2.按权利要求1所述二维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：所述加电压方式为：在第一维毛细管电泳分离时只向第一维毛细管柱上施加电压，在第一、二维毛细管电泳分离时向第一、二维毛细管柱上同时施加电压，以此类推，即给予在分离的和分离过的毛细管柱上施加电压。

3.按权利要求1所述二维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：所述在线向生物大分子组分流经的中空纤维中添加和脱除含低分子量物质的缓冲溶液的接口不包括第一维毛细管进样端接口；所述低分子量物质为表面活性剂、盐类。

4.按权利要求1所述二维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：所述毛细管电泳是毛细管等电聚焦电泳、毛细管区带电泳、毛细管电动力学色谱或毛细管电色谱。

5.按权利要求1所述二维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：采用电渗流驱动二维分离过程，通过第一维毛细管柱进样端电极、接口电极和第二维毛细管柱的出口端的电极构成三电极体系，维持二维毛细管柱中的电势梯度，达到优化的分离效果。

6.一种多维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：在第一维毛细管电泳分离完成后生物大分子组分流经接口进入第二维毛细管电泳分离操作，实现二维毛细管电泳，而小分子物质可以通过扩散自由透过接口中的中空纤维，并在其达到平衡；

所述生物大分子组分流经接口时在线向接口内的中空纤维中添加含低分子量物质的第二维缓冲溶液和脱除含低分子量物质的第一维缓冲溶液，在缓冲溶液连续地流经接口同时实现动态冲洗，同时给正在分离的和已分离过的毛细管柱上施加电压，以调整从中空纤维中通过的生物大分子的带电性能；

将通过上述第二维分离的生物大分子组分通过下一接口进入下一维毛细管柱作进一步分离，从而实现多维毛细管电泳。

7.按权利要求6所述多维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：所述加电压方式为：在第一维毛细管电泳分离时只向第一维毛细管柱上施加电压，在第一、二维毛细管电泳分离时向第一、二维毛细管柱上同时施加电压，以此类推，即给予在分离的和分离过的毛细管柱上施加电压。

8.按权利要求6所述多维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：所述在线向生物大分子组分流经的中空纤维中添加和脱除含低分子量物质的缓冲溶液的接口不包括第一维毛细管进样端接口；所述低分子量物质为表面活性剂、盐类。

9.按权利要求6所述多维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：所述毛细管电泳是毛细管等电聚焦电泳、毛细管区带电泳、毛细管电动力学色谱或毛细管电色谱。

10.按权利要求6所述多维毛细管电泳分离生物大分子的方法，其特征在于：采用电渗流驱动多维分离过程，通过前一维毛细管柱进样端电极、接口电极和下一维毛细管柱的出口端的电极构成多电极体系，维持多维毛细管柱中的电势梯度，达到优化的分离效果。