CN104411383A - 分析样品组分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了用于将毛细管等电聚焦(cIEF)在线偶联于高分辨率质谱的方法和系统,在该方法和系统中,包含极性有机溶剂和有机酸的鞘流缓冲液既用作用于(cIEF)的固定溶液又用作用于电喷雾电离(ESI)的电离溶液。
Description
发明背景
重组蛋白作为治疗剂变得日益重要。重组蛋白可以使用细胞株制造,例如非人类哺乳动物宿主细胞株,这些细胞株被工程改造成表达特定人类基因序列以产生所关注的蛋白质。在细胞培养物中产生目标蛋白后,该目标蛋白可以通过已知工艺纯化到高纯度水平。然而,由宿主细胞株产生的痕量污染蛋白(称为宿主细胞蛋白或HCP)可以存在于耗乏的细胞培养物中。
HCP可以潜在地影响产品质量和安全性。因此,重要的是对存在于治疗性产品中的HCP进行表征以减低这些风险。针对HCP的当前表征方法(如二维凝胶电泳)倾向于劳动密集的和繁琐的,这可以限制这些用于HCP表征的方法的使用,尤其在商业生产期间。
电泳是指离子通过电场中的吸引或排斥作出的不同移动或迁移。毛细管等电聚焦(cIEF)是基于样品组分等电点(pI)差异的高分辨率分离技术并且适合用于分离两性物质,如氨基酸、肽以及药物。在cIEF中,蛋白质在电场的影响下通过由载体两性电解质(CA)形成的pH梯度迁移。带正电荷的两性电解质朝着阴极迁移,而带负电荷的两性电解质朝着阳极迁移。因此,pH朝着毛细管的阴极端增大而朝着阳极端减小。在两性电解质到达自身pI并且不再带电时,迁移停止,引起稳定pH梯度的形成。两性分析物将最终遇到它会具有零净电荷的pH并且将因此停止迁移,引起分析物利用pI的聚焦或分离。cIEF已与许多检测技术(包括UV吸光度、激光诱发的荧光以及质谱(MS))偶联。
质谱(MS)是将化合物电离以产生带电分子或分子片段的分析技术,这些分子或分子片段接着根据它们的质荷比在分析器中使用电磁场分离。接着,可以对所分离的离子进行检测和分析。
大气压电离(API)来源可以用于将样品分子在大气压下电离并且接着将这些离子转移到质谱仪中。API适于电离热不稳定样品,如聚合物和肽。电喷雾电离(ESI)是API应用,该应用时常用于热不稳定和高分子量化合物(如聚合物和肽,它们是低或非挥发性的)的MS。
然而,用于生物样品(尤其蛋白质降解物)的cIEF与ESI-MS的在线偶联已具挑战性。因此,需要改进的用于生物样品的cIEF与ESI-MS的在线偶联。
发明概述
在此描述了用于鉴别并分析样品中的一种或多种组分的方法。在一个实施例中,该样品包括异质的生物分子混合物。在另一个实施例中,该样品包括重组蛋白耗乏的细胞培养物。在更特定实施例中,一种或多种组分包括宿主细胞蛋白。在一个实施例中,该样品包括重组单克隆抗体耗乏的细胞培养物并且一种或多种样品组分包括宿主细胞蛋白。在更具体实施例中,本发明提供了用于鉴别耗乏的细胞培养物样品中的宿主细胞蛋白(HCP)组分的方法。
在一个实施例中,该方法包括以下步骤:(a)通过毛细管等电聚焦(cIEF)分离该样品中的一种或多种组分;(b)使用鞘流溶液将分离的组分从分离腔室转移到电离仪器;(c)将这些样品组分电离;并且(d)通过质谱(MS)鉴别并分析该样品中的一种或多种组分。在一个实施例中,该电离仪器包括电喷雾电离(ESI)仪器。
在本发明的方法中,该鞘流溶液既充当用于该分离腔室的动员溶液又充当用于该电离仪器的电离溶液。在更具体实施例中,该鞘流缓冲液包含在约30%与约50%之间的极性有机溶剂和在约0.01%与0.1%之间的有机酸。该极性有机溶剂可以是极性质子溶剂或极性非质子溶剂。在一个实施例中,该极性质子溶剂包括脂肪醇,例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇以及其组合。在另一个实施例中,该极性非质子溶剂包括乙腈。在一个实施例中,该有机酸是选自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以及其组合。在一个实施例中,该有机酸的pKa在约4.0与5.0之间。在更具体实施例中,该鞘流溶液包含在约30%与约50%之间的脂肪醇和在约0.01%与0.1%之间的甲酸。在一个实施例中,该鞘流溶液包含在约30%与约50%之间的甲醇和在约0.01%与0.1%之间的甲酸。
在一个实施例中,分离包括以下步骤:(a)将一定体积的该样品和两性电解质缓冲液引入到该分离腔室中,其中该分离腔室包括毛细管;并且(b)在高达约50kV的聚焦电压下将该样品和该两性电解质缓冲液在该分离毛细管中聚焦。在更具体实施例中,该聚焦电压是在约5kV与约50kV之间。在一个实施例中,该样品在介于约300V/cm与约600V/cm之间的外加电场下聚焦。在更具体实施例中,该外加电场是在约300V/cm与约400V/cm之间。
在一个实施例中,该样品在高达约50kV的动员电压下转移到该电离仪器。在更具体实施例中,该动员电压是在约5kV与约50kV之间。在一个实施例中,该样品在介于约300V/cm与约600V/cm之间的外加电场下转移到该电离仪器。在更具体实施例中,该样品在介于约300V/cm与约350V/cm之间的外加电场下转移到该电离仪器。
在另一个实施例中,该样品通过水动力注射转移到该电离仪器。在一个实施例中,水动力注射包括在该分离腔室的入口处使用注射器施加介于约0.5psi与约50psi之间的压力。在另一个实施例中,水动力注射包括在该分离腔室的出口处施加介于约0.5psi与约50psi之间的真空。
在一个实施例中,该分离腔室是毛细管,该毛细管具有体积,并且所引入的样品体积小于或等于该毛细管体积。在一个实施例中,该样品体积是在该毛细管体积的约25%与约100%之间。在另一个实施例中,所引入的样品体积是在约1μL与25μL之间。在一个实施例中,该样品包含各在约0.1μg/ml与10mg/ml之间的一种或多种两性样品组分。
在一个实施例中,该分离腔室是毛细管,该毛细管是熔融硅石(SiO2)毛细管。在一个实施例中,该毛细管包括聚合涂层。在更具体实施例中,该聚合涂层是选自聚丙烯酰胺(LPA)、甲基纤维素、聚乙烯醇(PVA)以及其组合。
在一个实施例中,该两性电解质包括选自AmpholineTM、BiolyteTM、PharmalyteTM、ServalytTM以及其组合的载体两性电解质(CA)。在一个实施例中,该两性电解质包括在约0.1%与约10%之间的PharmalyteTM。在一个实施例中,该两性电解质包括窄pH范围的载体两性电解质。在一个实施例中,该两性电解质包括宽pH范围的载体两性电解质。在一个实施例中,该两性电解质包括选自Pharmalyte(1-3)、Pharmalyte(5-8)以及Pharmalyte(3-10)的PharmalyteTM。在一个实施例中,该两性电解质包括在约2%与约8%之间的Pharmalyte(3-10)溶液。在另一个实施例中,两性电解质是包含酸性和碱性两种官能团的低分子量分子(如氨基酸)的混合物。
在一个实施例中,该方法还包括在将该样品引入到该分离毛细管中之前降解该样品中的一种或多种组分的步骤。在一个实施例中,该样品中的一种或多种组分是用蛋白水解酶(包括例如丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶以及其组合)降解的。在一个实施例中,该样品中的一种或多种组分是用胰蛋白酶降解的。在一个实施例中,该蛋白水解酶被固定在固体支撑物上。在更特定实施例中,胰蛋白酶被固定在固体支撑物上。在一个实施例中,该固体支撑物是选自聚合物粒子、玻璃、膜、凝胶珠粒、溶胶-凝胶支撑物、多孔硅基体、多孔整体材料、磁性材料以及其组合。在一个实施例中,该样品中的一种或多种组分是在介于约25℃与约40℃之间的温度下或在介于约30℃与约40℃之间的温度下降解的(例如通过固定的胰蛋白酶进行)。在一个实施例中,该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与该蛋白水解酶一起孵育历时在约1小时与约20小时之间来降解的。在一个实施例中,该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与该蛋白水解酶(例如固定的胰蛋白酶)一起孵育历时在约30秒与约30分钟之间来降解的。在一个实施例中,该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与该蛋白水解酶一起孵育历时在约5小时与约15小时之间来降解的。在一个实施例中,该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与该蛋白水解酶一起孵育至少约12小时来降解的。
在一个实施例中,该样品在降解之后用水稀释,与载体两性电解质组合并且被引入到该分离腔室。在一个实施例中,该样品以在约2:1与1:2之间的水与样品比率用水稀释。
在一个实施例中,一种或多种组分包括蛋白质并且该方法包括在将样品引入到该分离腔室中之前将该样品中的蛋白质变性。在一个实施例中,将该样品中的蛋白质变性包括热变性。在一个实施例中,将该样品中的蛋白质变性包括将该样品溶液与非离子表面活性剂一起孵育。在一个实施例中,将该样品中的蛋白质变性包括将该样品与碱组合以形成pH在约8与约10之间的碱性溶液,并且将这些蛋白质在该溶液中孵育至少约5分钟或在约5分钟与约60分钟之间。在一个实施例中,将该样品中的蛋白质变性包括将该样品与酸组合以形成pH在约2与约3之间的酸性溶液,并且将这些蛋白质在该溶液中孵育至少约5分钟或在约5分钟与约60分钟之间。在一个实施例中,热变性包括将该样品在介于约60℃与约80℃之间的高温下孵育至少约5分钟或在约5分钟与约60分钟之间。在一个实施例中,将该样品中的这些蛋白质变性包括将该样品与包括碳酸氢铵的变性溶液一起孵育。在一个实施例中,该变性溶液进一步包括尿素。在一个实施例中,该变性溶液进一步包括有机溶剂,如甲醇或乙腈(ACN)。在一个实施例中,将该样品中的这些蛋白质变性包括将该样品与包括有机溶剂(如甲醇或乙腈)的变性溶液一起孵育约30分钟。
在一个实施例中,该方法进一步包括将该样品与还原溶液和/或烷基化溶液一起孵育。在一个实施例中,该还原溶液是选自二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三丁基膦(TBP)以及其组合。在一个实施例中,该烷基化溶液包括碘乙酰胺(IAA)、β-巯基乙醇或其组合。
本发明还提供了用于将毛细管等电聚焦(cIEF)和质谱(MS)接口连接的系统。该系统包括:(a)cIEF仪器,具有用于将液体样品中的一种或多种组分分离并聚焦的分离腔室;(b)电压电源,用于将电位施加在该分离腔室两端,其中该分离腔室包含样品和载体两性电解质并且该电位将该样品中的一种或多种组分分离并聚焦;(c)鞘流溶液,用于将一种或多种已分离并聚焦的组分从该cIEF仪器的该分离腔室直接转移到发射器,该发射器被配置成将该溶液供应到电喷雾电离(ESI)仪器;以及(d)MS仪器,用于分析样品分析物。
在一个实施例中,该鞘流缓冲液包含在约30%与约50%之间的极性有机溶剂和在约0.01%与0.1%之间的有机酸。在一个实施例中,该极性有机溶剂是选自极性质子溶剂和极性非质子溶剂。在一个实施例中,该极性质子溶剂包括脂肪醇。在一个实施例中,该脂肪醇是选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇以及其组合。在一个实施例中,该极性非质子溶剂包括乙腈。在一个实施例中,该有机酸是选自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以及其组合。在一个实施例中,该有机酸的pKa在约4.0与5.0之间。在更具体实施例中,该鞘流溶液包含在约30%与约50%之间的甲醇和在约0.01%与0.1%之间的甲酸。
在一个实施例中,该cIEF仪器包括阳极、阴极、阳极电解质储槽以及阴极电解质储槽。在一个实施例中,该阳极电解质储槽包含了包括酸(如磷酸、甲酸、天冬氨酸或其组合)的阳极电解质。在一个实施例中,该阴极电解质储槽包含了包括碱(如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾或其组合)的阴极电解质。
在一个实施例中,该系统包括被配置成将该分离腔室的一端与该发射器偶联的接口偶联装置。在一个实施例中,将该鞘流溶液引入到该阳极电解质和/或阴极电解质储槽中以动员这些聚焦的样品组分。在一个实施例中,该分离腔室包括具有阳极端的毛细管,其中在将该样品中的一种或多种组分聚焦之后将该毛细管的该阳极端插入到该发射器的输入端中并且将该鞘流溶液引入到该阴极电解质储槽中以动员这些聚焦的组分。在另一个实施例中,该分离腔室包括具有阴极端的毛细管,其中在将该样品中的一种或多种组分聚焦之后将该毛细管的该阴极端插入到该发射器的输入端中并且将该鞘流溶液引入到该阳极电解质储槽中以动员这些聚焦的组分。
这个概述是对本申请的一些传授内容的综述并且并不打算作为对本发明主题的排他性或穷尽性处理。另外的详情见于详细说明和所附权利要求书。本领域的普通技术人员在阅读并理解以下详细描述并且查看形成该详细描述的一部分的图式(其中的每一者均不以限制性意义采用)后将清楚其他方面。本发明的范围由所附权利要求书和其法律等效物界定。
附图简要说明
图1是组合的cIEF-ESI-MS系统的流程图。
图2是cIEF的示意性图示。
图3是ESI的示意性图示。
图4是MS的示意性图示。
图5是展示使用以下不同鞘流缓冲液在cIEF期间针对动员的电流特征曲线的图式:(a)50%甲醇和0.05%乙酸;(b)50%甲醇和0.05%甲酸;以及(c)50%甲醇和0.1%甲酸。
图6是展示计算的pI值对观察到的鉴别的肽从HCP样品的迁移时间的曲线。肽的pI值用TPP计算并且迁移时间从所提取的肽谱获得。
虽然本发明易有不同修改和替代形式,但它的特性已借助于实例和图式示出并且将加以详细描述。然而,应理解,本发明不限于所描述的具体实施例。相反,目的是支持属于本发明的精神和范围内的修改、等效物以及替代物。
详细说明
在此描述了用于鉴别并分析样品中的一种或多种组分的新颖系统。在一个实施例中,该系统被配置成检测样品中的蛋白质,例如残留在耗乏的细胞培养物样品中的残余宿主细胞蛋白。具体来说,该系统使用在线分析和鉴别方法鉴别并分析样品中的组分,该方法组合有毛细管等电聚焦(cIEF)、电喷雾电离(ESI)以及质谱(MS)。提供对该组合的cIEF-ESI-MS系统的综述的流程图展示在图1中。简单来说,制备出包括样品溶液15的混合物的“聚焦溶液”10,该样品溶液可能包含所关注的一种或多种分析物(在此也称为样品组分,例如HCP)和一种或多种其他组分。将聚焦溶液10引入到cIEF仪器100中以便分离。在利用cIEF 100分离了样品组分之后,将包含分离的组分的电离溶液20引入到ESI仪器200中以便电离。电离的组分30可以接着利用MS 300分析。
在此所描述的在线方法能够实质上缩短用于组合的cIEF-ESI-MS方法的总分析时间;而典型的方法可以耗费10小时以上(包括样品制备、降解、分离以及检测),在此所描述的组合的方法能够将完成全部方法的时间缩短到少于约5小时、少于约4小时、少于约3小时或少于约2小时。另外的优点是cIEF可以将样品富集超过10倍。根据在此所描述的本发明,鞘流液体既充当用于cIEF的化学动员溶液又充当用于ESI的电离溶液。
毛细管等电聚焦(cIEF)的综述
如在此所用,术语“电泳”是指离子在电场的影响(吸引或排斥)下的迁移。最简单的电泳分离是基于离子电荷/大小。
毛细管等电聚焦(cIEF)是电泳技术,在该技术中,样品中的两性组分基于等电点(pI)的差异进行分离。在电场的影响下,pH梯度在分离腔室(例如毛细管)内由一系列两性离子(也称为两性电解质)形成。样品中的两性样品组分(它们也可以称为分析物)在电场中迁移直到它们到达pH梯度中它们的pH等于它们的pI(即,其中分子由于正和负电荷抵消成零而不具有净电荷)的部位为止。在这个部位处,两性组分停止移动并且聚焦。在聚焦之后,动员步骤将聚焦的分析物传递出分离腔室以便分析。总的来说,pI相差小于0.05pH单位的分析物可以利用cIEF拆分。
许多类型的化合物可以利用cIEF分离,包括(但不限于)肽、氨基酸、核酸(DNA和RNA)、无机离子、有机碱、有机酸以及完整细胞。如在此所用,术语“肽”是指包含两个或更多个连接在链中的氨基酸的化合物,其中每一氨基酸的羧基连接于邻近氨基酸的氨基。肽的实例包括(但不限于)寡肽(即,连续非分支肽,通常包含在2与10个之间的氨基酸残基)、多肽(即,连续非分支肽,通常包含超过10个氨基酸残基)以及大分子蛋白质(它们可以包括一条或多条折叠成特定空间构象的多肽链)。术语“一级结构”是指蛋白质中多肽链的氨基酸序列。术语“二级结构”是指高度常规亚结构,包括例如α螺旋和β折叠。“三级结构”是指单一蛋白质分子的三维结构,而“四级结构”是指数个蛋白亚基的装配物。
存在于肽上的氨基酸残基可以赋予分子两性特性,使得这些分子包含正和负两种电荷。肽的净电荷取决于侧接官能基和周围环境的pH。总的来说,肽在低于其pI的pH值下带正电荷而在高于其pI的pH值下带负电荷。因此,在电泳期间,单独的肽将朝着pH等于其pI的区域迁移。cIEF因此适用于复杂蛋白混合物(例如耗乏的细胞培养基中的HCP)的分析和/或表征。cIEF也可以用于针对重组产生的蛋白质监测产物加工、研究配制品以及进行质量控制。cIEF也可以用于复杂蛋白混合物的预分级分离。
cIEF仪器
cIEF的基本仪器设置示意性地展示在图2中并且包括分离腔室120、两个缓冲液储槽131、132以及两个电极141、142以及电源150。分离腔室120典型地是具有内壁125的细长毛细管,该内壁界定具有直径(D)的管腔,该管腔在入口121与出口122之间延伸。在一个实施例中,该分离腔室120的该入口121与第一缓冲液储槽131处于流体连通,并且该分离腔室的该出口122与第二缓冲液储槽132处于流体连通。
在一个实施例中,分离腔室120是玻璃毛细管,该玻璃毛细管的长度为至少约5cm、至少约10cm、至少约15cm、至少约20cm、至少约25cm、至少约30cm、至少约35cm、至少约40cm、至少约45cm、至少约50cm以及高达约55cm、高达约60cm、高达约65cm、高达约70cm、高达约75cm、高达约80cm、高达约85cm、高达约90cm、高达约95cm或高达约100cm并且内部直径为至少约10μm、至少约15μm、至少约20μm、至少约25μm、至少约30μm、至少约35μm、至少约40μm、至少约45μm或至少约50μm以及高达约50μm、高达约75μm、高达约100μm、高达约125μm以及高达约150μm。在一个实施例中,该分离腔室120是熔融硅石毛细管。在另一个实施例中,该分离腔室120是由TeflonTM或硼硅酸盐玻璃构建的。在另一个实施例中,该分离腔室可能是使用熟知微型制造技术形成的平面结构中的通道。在这种情况下,该装置可能由玻璃、熔融硅石或如聚二甲基硅烷(PDMS)的聚合物制成。在一些情况下,熔融硅石可能是优选的,因为它在广泛范围的电磁波谱内是透明的并且具有高热传导率。熔融硅石还易于制造成直径几微米的毛细管。
在一些实施例中,裸二氧化硅材料用于分离腔室120的内壁125。在其他实施例中,该分离腔室120的该内壁125上的硅烷基团可以与中性或亲水性取代基共价连接以减少电渗流(EOF)和/或防止分析物吸附到内壁125上。中性涂层的实例包括(但不限于)线性聚丙烯酰胺(LPA)、聚乙烯醇(PVA)、三甲基氯硅烷以及二乙烯基苯涂层。亲水性涂层的实例包括丙烯酰胺(AA)、二甲基丙烯酰胺(DMA)、N-丙烯酰基氨基乙氧基乙醇(AAEE)或N-丙烯酰基氨基丙醇(AAP)。在另一个实施例中,动态涂层可以用于减少电渗流。术语“动态涂层”是指将添加剂包括在分离溶液中,该添加剂紧紧地粘附于该分离腔室的内壁并且有效地逆转电渗流(EOF)的方向。动态涂层添加剂的实例包括表面活性剂和聚合物。表面活性剂可以包括阳离子表面活性剂,如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB);两性离子表面活性剂,如CHAPS、辛酰基磺基甜菜碱、月桂基磺基甜菜碱或棕榈酰基磺基甜菜碱;以及非离子表面活性剂,如tween 20、NP 40或Triton X。其他动态涂层添加剂包括聚合添加剂,如亲水性聚合物,例如甲基纤维素(MC)、(羟丙基)甲基纤维素(HPMC)、聚氧化乙烯(PEO)、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、聚(乙烯醇)或聚(二甲基丙烯酰胺)。动态涂层添加剂可能以一定浓度包括在聚焦溶液中,该浓度在约0.1%w/v与约1.0%w/v之间,或为至少约0.1%w/v、至少约0.2%w/v、至少约0.3%w/v、至少约0.4%w/v以及至少约0.5%w/v以及高达约0.6%w/v、高达约0.7%w/v、高达约0.8%w/v、高达约0.9%w/v或高达约1.0%w/v。
在cIEF期间,pH梯度由于分离溶液存在于分离腔室120内部而形成,其中该分离溶液包括载体两性电解质(CA)。术语“载体两性电解质”(CA)是指包含多种两性组分的溶液。如在此所用,术语“两性组分”是指可以既充当酸又充当碱的物质。两性电解质pH梯度的拆分能力受溶液中两性电解质物质数目的影响。总的来说,两性电解质数目越多,该分离腔室120内邻近位点之间的pH差异越小,使得pH梯度在使用大量两性电解质时更平稳。一些可商购的CA可以包含超过900种两性组分。
CA可以是宽的(即,涵盖多个pH单位)或窄的(即,仅涵盖几个pH单位)。如在此所用,术语“宽”是指CA包含至少约4个pH单位、至少约5个pH单位、至少约6个pH单位以及高达约7个pH单位或高达约8个pH单位。如在此所用,术语“窄”是指CA包含少于约4个pH单位、少于约3个pH单位、少于约2个pH单位、少于约1个pH单位或少于约0.5个pH单位。总的来说,两性电解质组合物基于所希望的pI分离范围加以选择。典型地,选择宽CA以用于未知pI值的样品。然而,在所希望的是具有类似pI值的蛋白质的增强的拆分的情形中,使用窄范围CA混合物可能是所希望的。
总的来说,有四种可商购的CA:PharmalyteTM(宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗集团(GE Healthcare,Pittsburgh,PA))、Bio-lyteTM(加利福尼亚州埃库莱斯的伯乐公司(Bio Rad,Hercules,CA))、ServalytTM(内华达州里诺的百弗瑞公司(Biophoretics,Inc.,Reno,NV))以及AmpholineTM(宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗集团)。
PharmalyteTM是用于cIEF的在宽pH范围(在约3与约10之间)和不同窄pH范围(在约2.5与约5之间;在约4与约6.5之间;在约5与约8之间;在约8与约10.5之间;在约4.2与约4.9之间;在约4.5与约5.4之间;在约5与约6之间;以及在约6.7与约7.7之间)中可供使用的两性电解质缓冲液。在一些情况下,尤其在使用cIEF时,可能所希望的是使用具有低背景UV吸收的CA。PharmalyteTM可能因此是所希望的,归因于它沿着它整个pH梯度的低背景UV吸收。
Bio-LyteTM是用于cIEF的在宽pH范围(在约3.5与约9.5之间)和不同窄范围(在约3与约5之间;在约4与约6之间;在约5与约7之间;在约5与约8之间;在约6与约8之间;在约7与约9之间;以及在约8与约10之间)中可供使用的两性电解质缓冲液。
ServalytTM载体两性电解质是两性离子特征的低分子量分子。这些ServalytTM载体两性电解质是合成衍生的物质的混合物,这些合成衍生的物质的平均分子量分布为400到1000道尔顿并且出现多种pH范围,包括窄pH范围(在约2与约4之间;在约3与约4之间;在约3与约5之间;在约3与约6之间;在约4与约5之间;在约4与约6之间;在约4与约7之间;在约5与约6之间;在约5与约7之间;在约5与约8之间;在约6与约7之间;在约6与约8之间;在约6与约9之间;在约7与约9之间;以及在约9与约11之间)和宽pH范围(在约2与约9之间;在约2与约11之间;在约3与约7之间;在约3与约10之间;在约4与约9之间;在约5与约9之间)。
AmpholineTM是包括不同的低分子量聚氨基-聚羧酸并且覆盖在3.5到10范围内pH的两性电解质缓冲液。然而,AmpholineTM生产在2007年停止。
在一个实施例中,分离溶液包括在约0.1%与约10%之间的CA、在约0.1%与1.0%之间的CA或在约0.2%与0.8%之间的CA。在其他实施例中,分离溶液包括在约1%与10%之间的CA或在约2%与约8%之间的CA。如在此所用,100%是指CA的储备溶液。在更特定实施例中,分离溶液包括至少约0.1%、至少约0.2%、至少约0.3%、至少约0.4%以及高达约0.5%、高达约0.6%、高达约0.7%以及高达约0.8%、高达约0.9%或高达约1%CA。在另一个实施例中,分离溶液包括至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%以及高达约5%、高达约6%、高达约7%、高达约8%、高达约9%以及高达约10%CA。在一个实施例中,CA用惰性稀释剂(如去离子水、碳酸氢铵、乙酸铵或其他缓冲液)稀释。
接近阳极141的储槽131中的缓冲液具有低pH(即,是一种酸)并且在此被称为“阳极电解质缓冲液”。总体上,阳极电解质缓冲液的pH小于约7、小于约6.5、小于约6、小于约5.5、小于约5、小于约4.5、小于约4、小于约3.5、小于约3、小于约2.5或小于约2。接近阴极142的储槽132中的缓冲液具有高pH(即,是一种碱)并且在此被称为“阴极电解质缓冲液”。总体上,阴极电解质缓冲液的pH大于约7、大于约7.5、大于约8、大于约8.5、大于约9、大于约9.5、大于约10、大于约10.5、大于约11、大于约11.5或大于约12。
适合的阳极电解质缓冲液的实例包括甲酸、磷酸、天冬氨酸或其组合。在一个实施例中,阳极电解质缓冲液包括在约50mM与500mM之间的酸,总体上至少约50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、或至少约250mM、以及高达约250mM、高达约300mM、高达约350mM、高达约400mM、高达约450mM或高达约500mM的酸。在更具体实施例中,阳极电解质缓冲液包括在约50mM与500mM之间的磷酸,总体上至少约50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、或至少约250mM、以及高达约250mM、高达约300mM、高达约350mM、高达约400mM、高达约450mM或高达约500mM的磷酸。在一个实施例中,阳极电解质缓冲液可以包括阳极稳定剂,如亚氨基二乙酸。在一个实施例中,阳极电解质缓冲液包括在约50mM与500mM之间的稳定剂(如亚氨基二乙酸),总体上至少约50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、或至少约250mM、以及高达约250mM、高达约300mM、高达约350mM、高达约400mM、高达约450mM、或高达约500mM稳定剂(如亚氨基二乙酸)。
适合的阴极电解质缓冲液的实例包括(但不限于)氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钠、赖氨酸、碳酸钾以及其组合。在一个实施例中,阴极电解质缓冲液包括在约50mM与500mM之间的碱,总体上至少约50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、或至少约250mM、以及高达约250mM、高达约300mM、高达约350mM、高达约400mM、高达约450mM、或高达约500mM的碱。在一个实施例中,阴极电解质缓冲液包括在约50mM与500mM之间的氢氧化钠,总体上至少约50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、或至少约250mM、以及高达约250mM、高达约300mM、高达约350mM、高达约400mM、高达约450mM或高达约500mM的氢氧化钠。在更特定实施例中,阳极电解质缓冲液包括在约0.01%v/v与约5%v/v之间的酸,或至少约0.01%v/v、至少约0.05%v/v、至少约0.1%v/v、至少约0.5%v/v、以及高达约0.5%v/v、高达约1%v/v、高达约5%v/v的酸。在一个实施例中,阴极电解质缓冲液包括在约0.01%v/v与约5%v/v之间的碱,或至少约0.01%v/v、至少约0.05%v/v、至少约0.1%v/v、至少约0.5%v/v、以及高达约0.5%v/v、高达约1%v/v、高达约5%v/v的碱。在一些实施例中,阴极电解质缓冲液包括阴极稳定剂,例如精氨酸。在一个实施例中,阴极电解质缓冲液包括在约100mM与500mM之间的稳定剂(如精氨酸),总体上至少约50mM、至少约100mM、至少约150mM、至少约200mM、或至少约250mM、以及高达约250mM、高达约300mM、高达约350mM、高达约400mM、高达约450mM、或高达约500mM稳定剂(如精氨酸)。在cIEF的操作期间,pH梯度在分离腔室内在阳极141与阴极142之间形成。
任何适合的电源均可以用于cIEF。总体上,使用电压在约1kV到约50kV之间的高电压直流电源,例如电压为至少约1kV、至少约5kV、至少约10kV、至少约15kV、至少约20kV、以及至少约25kV和/或高达约20kV、高达约25kV、高达约30kV、高达约35kV、高达约40kV、高达约45kV或高达约50kV的电源。所产生的电场总体上为至少约300V/cm、至少约325V/cm、至少约350V/cm、至少约375V/cm以及高达约400V/cm、高达约425V/cm、高达约450V/cm、高达约475V/cm、高达约500V/cm、高达约525V/cm、高达约550V/cm、高达约575V/cm、或高达约600V/cm。
在一个实施例中,cIEF仪器是Beckman-Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳系统(加利福尼亚州富勒顿的贝克曼-库尔特仪器公司(Beckman-CoulterInstruments,Inc.,Fullterton,CA))。
总的来说,cIEF可以是分解成五个阶段:
1.样品制备;
2.将样品引入到分离腔室中;
3.在外加电压下将分离腔室中的样品聚焦;
4.将聚焦的样品动员出分离腔室;并且
5.检测并分析已聚焦并动员的样品。
当发展cIEF方法时,可以改变数个参数来改进方法性能,包括例如阳极电解质和阴极电解质缓冲液的组成、分离腔室尺寸和材料、载体两性电解质、聚焦时间和电压、动员方法、样品浓度以及其他添加剂的包括或除去。
样品制备
在此所描述的系统和方法可以用于检测样品中的组分,例如样品中的蛋白质,如耗乏的细胞培养物中的宿主细胞蛋白(HCP)。如在此所用,术语“耗乏的”细胞培养基是指在已移出所关注的的重组蛋白之后来自纯化过程的细胞培养基的流过部分。在一个实施例中,样品是来自重组单克隆抗体细胞培养物的耗乏的细胞培养基。
蛋白质纯化在从简单的一步沉淀程序到大规模生产工艺之间变化。通常,使用一个以上纯化步骤来获得具有所希望的纯度水平的产品。许多纯化流程涉及一些形式的色谱。具有不同选择性的不同色谱技术可以形成强大的组合以用于纯化生物分子。许多纯化方案需要一个以上步骤来实现所希望的产品纯度水平。总体上,纯化方案具有三个阶段:(1)捕获阶段,在捕获阶段中目标产品被分离并浓缩;(2)中间纯化,在中间纯化中大部分块状杂质被移出;以及(3)精制,在精制中痕量杂质被移出。一旦从细胞培养物纯化出重组蛋白,耗乏的(流过)部分就可以接着针对HCP进行分析。
蛋白质变性
在蛋白质的天然形式中,蛋白质折叠成多种形状,一些压实,一些伸长。天然蛋白质通过筛分介质的迁移速率因此更多是它们相对紧密性的反映,而不太是分子量的准确测量。如在此所用,“蛋白质变性”是指改变蛋白质分子的二级、三级或四级结构的蛋白质结构的任何非共价变化。使蛋白质变性会使对移动性的结构影响无效,允许以真实电荷/质量比为基础进行分离。变性还会分离多聚蛋白质中的亚基,允许分析较大的复杂聚集体。另外,大部分天然蛋白质对蛋白水解酶的作用具有抗性。蛋白质变性会改变蛋白质的结构并且可以将适当基团暴露于蛋白水解酶,并且因此增加蛋白分解。因此,通常在电泳之前使蛋白质分子变性。
许多使蛋白质变性的方法是已知的并且可以结合本发明的系统和方法使用。常见变性剂的一个实例是清洁剂,如阴离子表面活性剂,例如十二烷基硫酸钠(SDS)或脱氧胆酸钠(SDC),或非离子表面活性剂,如NP40、TWEEN 20、或Triton X。总体上,蛋白质可以通过将蛋白质溶液与在一定表面活性剂浓度下的表面活性剂一起孵育来变性,该浓度在约0.1mM与约50mM之间,总体上为至少约0.1mM、至少约0.2mM、至少约0.3mM、至少约0.4mM、至少约0.5mM、至少约0.6mM、至少约0.7mM、至少约0.8mM、至少约0.9mM、或至少约1.0mM、以及高达约1mM、高达约5mM、高达约10mM、高达约15mM、高达约20mM、高达约25mM、或高达约50mM。热变性是另一种已知的用于使蛋白质变性的方法。总体上,蛋白质可以通过将它们在至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃、至少约65℃、至少约70℃、以及高达约75℃、高达约80℃、高达约85℃、以及高达约90℃的温度下孵育至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、以及高达约30分钟、高达约45分钟、或高达约60分钟来变性。取决于所研究的蛋白质和加热的强度,热变性可能是或可能不是可逆的。样品中的蛋白质还可以通过将样品溶液与酸组合以形成pH在约2与约3之间的酸溶液来变性。适合的酸的实例包括(但不限于)盐酸胍。在另一个实施例中,样品中的蛋白质可以通过将样品溶液与碱组合以形成pH在约8与约10之间的碱溶液来变性。适合的碱的实例包括(但不限于)尿素。在再另一个实施例中,样品溶液中的蛋白质可以通过将样品溶液与具有高盐浓度(如浓度为从2M到5M的NaCl或LiCl)的溶液组合来变性。在一个实施例中,在等电聚焦之前从蛋白质中移出该盐(例如通过尺寸排阻色谱进行)。
由于二硫键还可以阻碍蛋白分解,故已知的还原和烷基化方法还可以用于辅助完成样品中的蛋白质变性。术语“还原”是指二硫键的还原,并且可以通过将变性的蛋白质与还原剂一起孵育来实现,该还原剂如二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(BME)、氯化三(2-羧乙基)膦(TCEP)或三丁基膦(TBP)[其他?]。总体上,蛋白质通过将蛋白质样品孵育在溶液中来还原,该溶液包含介于约0.1mM与10mM之间的还原剂,总体上至少约0.1mM、至少约0.2mM、至少约0.3mM、至少约0.4mM、或至少约0.5mM还原剂、以及高达约1mM、高达约5mM或高达约10mM还原剂。烷基化是指硫醇的烷基化并且可以通过将变性的蛋白质与烷化剂一起孵育来实现,该烷化剂如乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)、碘乙酰胺(IAM)、4-乙烯基吡啶、或碘乙酸(IAA)、甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)。总体上,将蛋白质样品孵育在溶液中,该溶液包含介于约10mM与500mM之间的烷化剂,总体上至少约10mM、至少约20mM、至少约30mM、至少约40mM、或至少约50mM烷化剂、以及高达约100mM、高达约200mM、高达约300mM、高达约400、或高达约500mM烷化剂。
降解
在一些情况下,可能所希望的是在电泳之前降解该样品中的蛋白质。许多蛋白质降解的方法是已知的并且包括例如蛋白分解。术语“蛋白分解”是指利用称为蛋白酶(或蛋白水解酶)的酶降解蛋白质,这些酶包括例如丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶以及其组合。丝氨酸蛋白酶的实例包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶的实例包括木瓜蛋白酶。其他蛋白酶包括Lys-C、Glu-C以及Asp-N。在更特定实施例中,样品中的蛋白质是利用胰蛋白酶降解的。在一个实施例中,该蛋白水解酶被固定在固体支撑物上。在另一个实施例中,胰蛋白酶被固定在固体支撑物上。有利的是,固定的胰蛋白酶可以用于痕量(低nM或ng)蛋白质降解。固体支撑物的实例包括(但不限于)聚合物粒子、玻璃、膜、凝胶珠粒、溶胶-凝胶支撑物、多孔硅基体、多孔整体材料以及磁性材料。总体上,蛋白质是通过以一定的蛋白酶与蛋白质比率将包含蛋白质的样品溶液与蛋白酶一起孵育来降解的,该蛋白酶与蛋白质比率为至少约1:5、至少约1:10、至少约1:15、至少约1:20、至少约1:25、至少约1:30、以及高达约1:40、高达约1:50、高达约1:75、或高达约1:100。对于固定的胰蛋白酶来说比率可能更高,例如大于1:100。在一个实施例中,将样品溶液与蛋白水解酶一起孵育持续介于约5小时与20小时之间,或至少约5小时、至少约10小时、至少约11小时、至少约12小时、至少约13小时、至少约14小时、至少约15小时、以及高达约15小时或高达约20小时。总体上,降解是在至少约25℃、至少约30℃、至少约35℃、以及高达约40℃、高达约45℃或高达约50℃的温度下执行的。
聚焦溶液的制备
如在此所用的术语“聚焦溶液”是指被引入到cIEF分离腔室中的包含样品的溶液。聚焦溶液可以包括样品溶液和一种或多种其他组分(包括例如载体两性电解质(CA)、惰性稀释剂如蒸馏或去离子水、或其他添加剂)的混合物。在一个实施例中,样品溶液包括耗乏的细胞培养基。
载体两性电解质(CA)
在一个实施例中,聚焦溶液包括载体两性电解质(CA)。如上文所论述,有四种可商购的CA:PharmalyteTM(宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗集团)、Bio-lyteTM(加利福尼亚州埃库莱斯的伯乐公司)、ServalytTM(内华达州里诺的百弗瑞公司以及AmpholineTM(宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗集团)。总的来说,聚焦溶液包括介于约0.1%与约10%之间的CA。在一个实施例中,聚焦溶液包括至少约0.1%、至少约0.2%、至少约0.3%、至少约0.4%、至少约0.5%、以及高达约0.6%、高达约0.7%、高达约0.8%、高达约0.9%或高达约1.0%CA。在其他实施例中,聚焦溶液包括至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、以及高达约6%、高达约7%、高达约8%、高达约9%或高达约10%CA。在其他实施例中,聚焦溶液并不包括载体两性电解质。
盐浓度
在将聚焦溶液引入到分离腔室中之前可能调整的另一个参数是离子强度。术语“离子强度”是指溶液中离子的浓度。对于cIEF来说,可能所希望的是具有低离子强度,例如小于约100mM、小于约75mM、小于约50mM、小于约40mM、小于约30mM、小于约20mM。总的来说,随着盐浓度增大,在聚焦期间出现蛋白质沉淀的风险增大。样品溶液的离子强度可以例如通过已知脱盐方法(包括例如稀释、透析、凝胶过滤、超滤以及固相萃取(SPE)(例如ZiptipTM))改变。
样品的稀释
总的来说,至少约0.1μg/mL/蛋白质、至少约0.5μg/mL/蛋白质、至少约1μg/mL/蛋白质、至少约5μg/mL/蛋白质、至少约10μg/mL/蛋白质、至少约50μg/mL/蛋白质、至少约0.1mg/mL/蛋白质、至少约0.5mg/mL/蛋白质、至少约1mg/ml/蛋白质、至少约5mg/ml/蛋白质、以及高达约10mg/ml/蛋白质的最终浓度是所希望的,以达到使用cIEF足够的灵敏性、聚焦以及动员。
为了获得所希望的蛋白质浓度,样品溶液15可能与稀释剂组合以形成聚焦溶液10,该聚焦溶液接着被引入到分离腔室120中。在一个实施例中,稀释剂是载体两性电解质溶液,并且聚焦溶液是通过将包含一种或多种样品组分的样品溶液与载体两性电解质溶液例如以一定的样品溶液与载体两性电解质溶液比率混合来制备的,该样品溶液与载体两性电解质溶液比率在约5:1与约1:5之间、在约2:1与约1:2之间;或在约1.5:1与约1:1.5之间,或在约1:1下。在另一个实施例中,样品溶液与载体两性电解质的比率可以是在约100:1与约1:1之间、或在约60:1与约1:1之间、或在约100:1与约10:1之间。在另一个实施例中,聚焦溶液是通过将包含一种或多种分析物组分的样品溶液与惰性稀释剂(如去离子水)以一定的样品溶液与稀释剂比率组合来制备的,该样品溶液与稀释剂比率为从约5:1到约1:5、从约2:1到约1:2;从约1.5:15到约1:1.5、或约1:1。
在一个实施例中,蛋白质溶液在cIEF之前例如通过冻干程序进行浓缩。
其他添加剂
在cIEF完成时,将样品的组分聚焦到分离腔室内的窄区中并且浓缩数百倍。将蛋白质限制在其pI点(零净电荷)和高浓度下可能增大沉淀和/或聚集的可能性。因此,可能所希望的是在聚焦溶液中包括一种或多种添加剂以减少沉淀和/或聚集,包括例如尿素、糖以及非离子或两性离子表面活性剂。
在一个实施例中,尿素被包括在聚焦溶液中以改进蛋白质溶解性。在更特定实施例中,尿素以一定浓度包括在聚焦溶液中,该浓度介于约0.1M与约20M之间,或至少约0.1M、至少约0.5M、至少约1M以及高达约5M、高达约10M、高达约15M、或高达约20M。
样品装载
典型地,在将聚焦溶液10引入到分离腔室120中之前,用一种或多种预适应冲洗液准备腔室120。在腔室120包括共价聚合涂层的一个实施例中,分离腔室120用5到10个体积的溶剂(如有机溶剂,例如极性有机溶剂)冲洗,随后引入聚焦溶液。术语“极性有机溶剂”包括极性质子溶剂和极性非质子溶剂两者。如在此所用,术语“极性质子溶剂”是指具有可离解的氢的溶剂,例如包括与氧原子结合的氢原子的醇。术语“极性非质子溶剂”是指缺乏酸性氢的溶剂。适合醇的实例包括脂肪醇,如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇以及其组合。在分离腔室120未经涂布的另一个实施例中,分离腔室120可以用10到15个体积的阳极电解质缓冲液(例如磷酸、甲酸、天冬氨酸或其组合)或阴极电解质缓冲液(例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾或其组合)冲洗。如果希望的话,分离腔室120还可以用10到15个体积的去离子水和/或5到10个体积的分离溶液冲洗。总体上,预适应流体是通过以下方式经由分离腔室输送的:或者在分离腔室120的入口121处例如通过以介于约0.5psi与约50psi之间的压力使用注射泵来施加压力,或者在分离腔室122的出口122处例如通过以介于约0.5psi与约50psi之间的压力施加真空来减小压力。预适应冲洗液的流速总体上是至少约1μL/min、或至少约2μL/min、以及高达约3μL/min、高达约4μL/min、或高达约5μL/min。
一旦分离腔室120就绪,就可以引入该聚焦溶液10。两种常用注射方法包括水动力注射和电动注射。水动力注射是通过在该分离腔室120的两端之间施加介于约0.5psi与约50psi之间的压力差,即,通过在入口121处使用注射器或在出口122处使用真空来实现的。电动注射是通过用包含聚焦溶液10的储槽暂时替换掉阳极电解质储槽131或阴极电解质缓冲液储槽132中的一者并且将电压打开持续某一时间段来执行的。在一个实施例中,聚焦溶液10是通过施加一定电压来引入的,典型地使用在约1kV到约50kV之间的电压,例如至少约1kV、至少约5kV、至少约10kV、至少约15kV、至少约20kV、以及至少约25kV和/或高达约20kV、高达约25kV、高达约30kV、高达约35kV、高达约40kV、高达约45kV或高达约50kV。聚焦电压总体上为至少约300V/cm、至少约325V/cm、至少约350V/cm、至少约375V/cm以及高达约400V/cm、高达约425V/cm、高达约450V/cm、高达约475V/cm、高达约500V/cm、高达约550V/cm、或高达约600V/cm。在电动注射期间,总体上将电压施加持续在约1分钟与约30分钟之间,例如至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、以及高达约10分钟、高达约15分钟、高达约20分钟、高达约25分钟、或高达约30分钟。所引入的样品的特定量可以通过控制注射压力、注射电压和/或注射时间来控制。
在一个实施例中,聚焦溶液10与分离溶液组合,随后引入到分离腔室120中。在替代实施例中,分离腔室120首先经分离溶液填充并且接着将聚焦溶液10引入到分离腔室120中。在再另一个实施例中,分离腔室120部分经分离溶液填充,接着注射该聚焦溶液10,并且接着用分离溶液填充该分离腔室120的其余部分。
足够量的聚焦溶液10应装载于聚焦腔室120中使得聚焦腔室120包含均匀的样品混合物。在一个实施例中,分离腔室120用一定体积的聚焦溶液10注射,该体积小于或等于由分离腔室120的内表面125界定的体积。在一个实施例中,分离腔室120用一定体积的聚焦溶液10注射,该体积是在分离腔室体积的约25%与约100%之间,具体来说,是至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、或至少约50%、以及高达约50%、高达约75%、高达约80%、高达约85%、高达约90%、高达约95%、或高达约100%的分离腔室体积。总的来说,注射到分离腔室120中的聚焦溶液的体积将随着腔室的尺寸而改变。然而,总的来说,分离腔室120用一定体积的聚焦溶液注射,该体积是至少约0.5μl或至少约1μl、至少约2μl、至少约3μl、至少约4μl、至少约5μl、至少约6μl、至少约7μl、至少约8μl、至少约9μl、或至少约10μl、并且取决于分离腔室的尺寸,高达约高达约2μl、高达约3μl、高达约4μl、高达约5μl、高达约10μl、高达约15μl、高达约20μl、或高达约25μl。
聚焦
在聚焦溶液10经制备并且引入到分离腔室120中之后,聚焦可以通过以下方式起始:将分离腔室120的第一端121偶联于第一缓冲液储槽131(包含或者阳极电解质或者阴极电解质缓冲液)并且将分离腔室120的第二端122偶联于第二缓冲液储槽132(包含或者阳极电解质或者阴极电解质缓冲液,无论哪个不用于第一缓冲液储槽),之后施加电场。如在此所用,术语“偶联”意指分离腔室120的末端121、122与对应的储槽131、132处于流体联通。术语“流体连通”意指流体可以在分离腔室120的末端121、122与邻近储槽131、132之间自由传递。在一个实施例中,分离腔室120通过将分离腔室120的对应末端121、122浸没在存在于邻近储槽131、132中的溶液中而与第一131和第二132缓冲液储槽偶联。
在电场的影响下,氢离子开始从包含阳极电解质的储槽朝着包含阴极电解质的储槽迁移,并且来自阴极电解质的氢氧根离子开始以相反方向移动,使得载体两性电解质产生pH梯度。典型地使用在约1kV到约50kV之间的聚焦电压,例如至少约1kV、至少约5kV、至少约10kV、至少约15kV、至少约20kV、以及至少约25kV和/或高达约20kV、高达约25kV、高达约30kV、高达约35kV、高达约40kV、高达约45kV或高达约50kV。聚焦电压总体上为至少约300V/cm、至少约325V/cm、至少约350V/cm、至少约375V/cm以及高达约400V/cm、高达约425V/cm、高达约450V/cm、高达约475V/cm、高达约500V/cm、高达约550V/cm、或高达约600V/cm。
施加该聚焦电压直到样品组分被聚焦,即当样品组分处于对应于其对应等电点的pH下并且迁移终止时,使得每一组分都分离成定位在其等电点的pH下的窄带。一旦每一分析物都已迁移到其净电荷为中性的区域,带的位置就变得恒定并且不再随着时间变化。在一些情况下,一旦样品组分被聚焦,就可以检测到电压降。
许多因素可以影响聚焦时间。举例来说,聚焦时间可以受样品中的盐浓度影响。总体上,更高盐浓度将引起更快的聚焦过程,因为pH梯度倾向于因存在盐而变窄。替代地,聚焦速度在CA的浓度更高或电压改变时可能变得更慢。总体上,聚焦时间在介于约1分钟与约120分钟之间的范围内,例如从至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、以及高达约40分钟、高达约45分钟、高达约50分钟、高达约55分钟、高达约60分钟、高达约90分钟、以及高达120分钟。可以采用电压梯度,在更低电压下开始,并且随着时间推进而增大电压。
在cIEF期间的温度控制可能是重要的,因为pI可能取决于温度。在一个实施例中,聚焦在至少约0℃、至少约5℃、至少约10℃、至少约15℃、至少约20℃、以及高达约25℃、高达约30℃、高达约35℃、或高达约40℃的温度下执行。
动员
在样品溶液的组分被聚焦之后,它们被动员出该分离腔室120。总体上,动员可以水动力地或化学地实现。水动力动员使用或者压力或者真空(总体上介于约0.5psi与约50psi之间)以便动员所聚焦的蛋白质。化学动员通过改变阳极电解质或阴极电解质缓冲液的化学组成来进行,这会引起pH梯度的偏移,该偏移引起所聚焦的样品组分的迁移。常见化学动员方法包括将中性盐(如氯化钠)加入到或者阳极电解质和/或阴极电解质缓冲液中。钠离子充当阳极动员中的非质子阳离子,而氯离子充当阴极动员中的非羟基阴离子。在其他已知化学动员方法中,用阴极缓冲液替换阳极缓冲液(或反过来)。动员的方向(或者阳极或者阴极)可以选择,取决于分析物组分的特性,例如根据分析物的酸性特征。对于阴极动员来说,用包含另一种阴离子的溶液替换阴极电解质缓冲液。对于阳极动员来说,用包含另一种阳离子的溶液替换阳极电解质缓冲液。
于在此所描述的新颖方法和系统中,动员缓冲液是鞘流缓冲液。与常规cEIF-ESI偶联(在该常规cEIF-ESI偶联中,除用于ESI的电离缓冲液之外,用于cIEF的动员缓冲液是分离溶液)对比,使用组合的“鞘流缓冲液”,该鞘流缓冲液既充当用于cIEF的动员缓冲液又充当用于ESI的电离缓冲液。如在此所用,术语“鞘流缓冲液”是指包含极性有机溶剂和有机酸的溶液。总体上,鞘流缓冲液包含介于约25%v/v与约75%v/v之间的极性有机溶剂,总体上至少约25%v/v、至少约30%v/v、至少约35%v/v、至少约40%v/v、至少约45%v/v或至少约50%v/v、以及高达约50%v/v、高达约55%v/v、高达约60%v/v、高达约65%v/v、高达约70%v/v、或高达约75%v/v极性有机溶剂。如在此所用,术语“极性有机溶剂”包括极性质子溶剂和极性非质子溶剂两者。术语“极性质子溶剂”是指具有可离解的氢的溶剂,例如包括与氧原子结合的氢原子的醇。术语“极性非质子溶剂”是指缺乏酸性氢的溶剂。适合极性质子溶剂的实例包括脂肪醇,包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇以及其组合。适合极性非质子溶剂的实例包括乙腈。总体上,鞘流缓冲液还包含在约0.01%v/v与约1%v/v之间的有机酸,总体上至少约0.01%v/v、至少约0.05%v/v、或至少约0.1%v/v以及高达约0.1%v/v、高达约0.5%v/v或高达约1.0%v/v的有机酸。在一个实施例中,有机酸为羧酸。羧酸是包含至少一个羧基并且具有通式R-COOH的有机酸。在一个实施例中,R-为烷烃。在一个实施例中,羧酸的pKa在约3.5与5.0之间。适合羧酸的实例包括(但不限于)甲酸(HCO2H,pKa 3.75)、乙酸(CH3COOH,pKa 4.76)、乙酸(CH3CO2H,pKa 4.7)以及丙酸(CH3CH2CO2H,pKa 4.9)。
在一个实施例中,鞘流缓冲液包含介于约25%v/v与约75%v/v之间的脂肪醇,总体上至少约25%v/v、至少约30%v/v、至少约35%v/v、至少约40%v/v、至少约45%v/v或至少约50%v/v、以及高达约50%v/v、高达约55%v/v、高达约60%v/v、高达约65%v/v、高达约70%v/v、或高达约75%v/v脂肪醇。在一个实施例中,鞘流缓冲液包含介于约25%v/v与约75%v/v之间的甲醇,总体上至少约25%v/v、至少约30%v/v、至少约35%v/v、至少约40%v/v、至少约45%v/v或至少约50%v/v、以及高达约50%v/v、高达约55%v/v、高达约60%v/v、高达约65%v/v、高达约70%v/v、或高达约75%v/v甲醇。在另一个实施例中,鞘流缓冲液包含介于约25%v/v与约75%v/v之间的乙腈,总体上至少约25%v/v、至少约30%v/v、至少约35%v/v、至少约40%v/v、至少约45%v/v或至少约50%v/v、以及高达约50%v/v、高达约55%v/v、高达约60%v/v、高达约65%v/v、高达约70%v/v、或高达约75%v/v乙腈。在其他实施例中,鞘流缓冲液还包含在约0.01%v/v与约1%v/v之间的羧酸,总体上至少约0.01%v/v、至少约0.05%v/v、或至少约0.1%v/v以及高达约0.1%v/v、高达约0.5%v/v或高达约1.0%v/v的羧酸。在更具体实施例中,鞘流缓冲液包含在约0.01%v/v与约1%v/v之间的甲酸,总体上至少约0.01%v/v、至少约0.05%v/v、或至少约0.1%v/v以及高达约0.1%v/v、高达约0.5%v/v或高达约1.0%v/v的甲酸。在更具体实施例中,鞘流缓冲液包含介于约25%v/v与约75%v/v之间的甲醇,总体上至少约25%v/v、至少约30%v/v、至少约35%v/v、至少约40%v/v、至少约45%v/v或至少约50%v/v、以及高达约50%v/v、高达约55%v/v、高达约60%v/v、高达约65%v/v、高达约70%v/v、或高达约75%v/v甲醇以及介于约0.01%v/v与约1%v/v之间的甲酸,总体上至少约0.01%v/v、至少约0.05%v/v、或至少约0.1%v/v以及高达约0.1%v/v、高达约0.5%v/v或高达约1.0%v/v甲酸。
于在此所描述的新颖系统中,cIEF分离腔室120的出口端122在线偶联于电喷雾电离仪器的发射器210的输入端211,并且所分离的样品组分从分离腔室120化学动员到发射器210是使用鞘流缓冲液实现的。如在此所用,术语“偶联”意指cIEF分离腔室的出口端122与发射器210处于流体连通。在一个实施例中,分离腔室120的出口端122通过将分离腔室的出口端122引入到发射器210的入口端210中而与发射器210偶联。
与将来自分离腔室120的洗脱液与电离溶液组合的常规cEIF-ESI偶联对比,在本发明的方法中将鞘流缓冲液(上述)用作动员溶液。鞘流的低流速相对于常规技术有利地减少样品的稀释度。
在动员期间,可能重要的是维持适当的外加电压使得分析物组分保持聚焦并且不因动员步骤而散开。在动员开始时,电流最初保持在低值下,与在聚焦结束时观察到的值相似,例如介于约1μA与约10μA之间,或至少约1μA、至少约2μA、至少约3μA、至少约4μA、至少约5μA、以及高达约6μA、高达约7μA、高达约8μA、高达约9μA、或高达约10μA。随着动员进展,电流随着盐离子进入毛细管而逐渐开始上升。稍后在动员中,当盐离子存在于整个柱中时,电流快速上升指示动员完成,例如,可以观察到介于约10μA与约20μA之间的增大。在一个实施例中,所聚焦的分析物在动员期间维持其相对位置。
在动员期间,使用总体上保持在约1kV到约50kV之间的电压,例如至少约1kV、至少约5kV、至少约10kV、至少约15kV、至少约20kV、以及至少约25kV和/或高达约20kV、高达约25kV、高达约30kV、高达约35kV、高达约40kV、高达约45kV、或高达约50kV。电场总体上保持为至少约300V/cm、至少约325V/cm、至少约350V/cm、至少约375V/cm以及高达约400V/cm、高达约425V/cm、高达约450V/cm、高达约475V/cm、高达约500V/cm、高达约550V/cm、或高达约600V/cm。动员总体上耗时在约1分钟与约30分钟之间,例如至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、或至少约15分钟、以及高达约20分钟、高达约20分钟、高达约25分钟或高达约30分钟。
电喷雾电离(ESI)
cEIF和ESI的偶联可以在线或离线执行。在在线偶联中,从分离腔室120动员的溶液例如使用同轴鞘流接口、无鞘接口或液体接合接口直接进料到电喷雾发射器210中。偶联的离线方法包括收集例如从稍后有待分析的的分离腔室120洗脱的洗脱份。
在典型的cEIF-ESI偶联中,来自分离腔室的洗脱液与挥发性有机溶剂组合以形成电离溶液20,该电离溶液接着被引入到电喷雾发射器210中。参见图3。用于形成电离溶液的典型挥发性有机溶剂的实例包括甲醇和乙腈。电离溶液还可以包括电离剂,例如H+、Na+或K+。
如先前论述,与将来自分离腔室120的洗脱液与电离溶液组合的常规cEIF-ESI偶联对比,相同的鞘流缓冲液可以既用作用于cEIF的动员溶液又用作用于ESI的电离溶液。
如图3中所示,电喷雾发射器210典型地为具有入口211和出口212的细长容器,其中该出口212具有小直径孔口213(即,在约1μm与约10μm之间、在约1μm与约5μm之间或在约2μm与约3μm之间的孔口)。电源250产生电位(典型地在约1kV与约10kV之间、在约2kV到约6kV之间或在约3kV与约4kV之间),将该电位施加在电喷雾发射器210与反电极220之间。电离溶液20中具有相同极性表面电荷的离子与发射器210的电荷之间的排斥引起离子迁移到发射器210的出口212并且形成锥体(称为泰勒锥(Taylor cone)214)。一旦排斥力变得比电离溶液20的表面张力更大,细微的气溶胶喷雾就从发射器210的出口212朝着反电极220发射。当液滴时横穿发射器出口212与反电极220之间的空间时,溶剂蒸发。典型地,电离/蒸发过程是在大气压下执行的。
电离溶液以一定流速引入到发射器210中,该流速为至少约0.001μl/min、至少约0.005μl/min、至少约0.01μl/min、至少约0.05μl/min、至少约0.1μl/min、至少约0.5μl/min、以及高达约0.1μl/min、高达约0.5μl/min、高达约1μl/min、高达约5μl/min、高达约10μl/min、高达约50μl/min、以及高达约100μl/min。
电喷雾电压可以在约1kv与约10kv之间。毛细管出口与发射器尖端之间的距离可以在约1mm与约2mm之间。发射器末端与MS入口之间的距离可以在约1mm与约10mm之间。发射器的大小可以在约2μm与约20μm之间。
一旦样品溶液的组分通过cIEF分离,就可以通过质谱(MS)对它们进行分析。cIEF可以使用电喷雾电离(ESI)作为接口与MS偶联。电喷雾电离(ESI)时常用于电离热不稳定和高分子量化合物,如肽和其他聚合物聚合物。在此所述的本发明提供了用于将CIEF与ESI-MS在线偶联的系统。
质谱
图4是示出了质谱仪350的基本组件的方框图。离子源200(ESI,上述)是中性样品分子被电离的地方。在质量分析器300中,离子使用外加电场根据它们的质荷比(m/z)或者在空间方面或者在时间方面进行加速与分离。
在离子被分离之后,通过检测器400检测这些离子,并且将信号传送到数据系统600以便分析。检测可以基于电荷或动量。更老的仪器使用摄影板来测量每一质荷比下的离子丰度。目前使用的大部分检测器使用与光电倍增管相似的集光器来放大离子信号。这些放大检测器包括:电子倍增器、通道倍增器以及多通道板。检测器针对它的速度、动态范围、增益以及几何结构加以选择。一些检测器灵敏到足以检测单一离子。数据分析可以通过数据库搜索来执行例如以确定宿主细胞蛋白(HCP)的存在。
质谱仪典型地还具有真空系统500来维持低压,从而减少离子与质量分析器300中的其它分子碰撞的机率。碰撞可以引起离子反应、中和、散射、或碎裂,这些可以干扰质谱。为了将碰撞减到最少,实验在高真空条件(典型地10-2到10-5Pa(10-4到10-7托))下进行,取决于仪器的几何结构。
质量分析器的选择取决于分辨率、质量范围、扫描速率以及检测限。每一分析器具有极为不同的工作特征,并且仪器的选择涉及重要权衡并且可以是连续或脉冲的。总体上有五种不同类型的质谱仪:(1)磁扇形和双聚焦仪器,该仪器使用磁场依据离子的动量来分离离子;(2)透过式四极,它使用四极场以允许仅单一m/z值的离子从离子源传递到检测器;(3)四极离子阱,它使用四极场以储存所有m/z值的离子并且接着将它们去稳定化,一次一种m/z值,从而获得质谱;(4)飞行时间(TOF)质谱仪,它依据通过无场区的飞行时间实现不同m/z值的经加速离子的分离;以及(5)傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱仪(有时称为FTMS),它产生一系列共振频率的傅里叶变换,该傅里叶变换对应于储存在磁性离子阱中的不同m/z值的离子。这些类型质谱仪中的任一者都可以结合本发明的系统使用。
LTQ-Orbitrap-velos可以包括约300℃的毛细管温度。MS1Orbitrap分析器可以在60,000的分辨率下。MS1Orbitrap分析器的参数可以包括约395m/z到约1800m/z的扫描范围。12个最强峰可以用于MS2(离子阱)。MS1Orbitrap分析器的参数可以包括35%正规化的碰撞。
如在此所用,术语“约”用于修饰例如在描述本发明中使用的组合物中成分的数量、浓度、体积、工艺温度、工艺时间、产率、流速、压力以及它们的范围。术语“约”是指可能发生的数值量的变化,例如经由用于制备化合物、组合物、浓缩物或使用配制品的典型的测量和操作程序;经由这些程序中无意的误差;经由用于进行这些方法的起始材料或成分的制造、来源或纯度中的差异以及其他类似考虑因素。术语“约”还涵盖因配制品的老化而与具体起始浓度或混合物不同的量,和因混合或处理配制品而与具体起始浓度或混合物不同的量。当利用术语“约”修饰时,在此随附的权利要求书包括这些等效量。
应注意,除非内容另外明确指明,否则如本说明书和所附权利要求书中所用,单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括多个指示物。还应注意的是除非内容另外明确指明,否则术语“或”总体上是以它包括“和/或”的含义使用。
还应注意到,如所使用,在本说明书和所附权利要求书中,短语“配置”描述系统、设备或其他结构被构建成或被配置成执行具体任务或采用具体配置。短语“配置”与其他类似短语如“安排”、“安排和配置”、“构建和安排”、“构建”、“制造和安排”等可以互换使用。
本说明书中的所有公开和专利申请均表现出本发明所涉及的领域的普通技术人员的水平。所有公开和专利申请在此均通过引用并入,其程度就如同每一篇单独的公开或专利申请案特定并且单独地表明为通过引用并入。
本申请打算涵盖本发明主题的改编形式或变化形式。应理解,以上说明旨在是说明性并且非限制性的。应易于清楚的是,在此所描述任何一种或多种设计特征都可以与任何具体配置形成任何组合使用。在使用成型工艺的情况下,这些设计特征可以在无实质性额外制造成本的情况下并入。组合的数目大多以致无法描述,并且本发明不被在此所描述的任一具体说明性组合限制或限于该组合。应参考所附权利要求,以及这些权利要求所授权的等效物的全部范围,判定本发明主题的范围。
工作实例
除非另行说明,否则所有试剂均购自西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich Co.;美国密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO,USA))。
实例1:样品制备
制备BSA降解物
牛血清白蛋白(BSA)降解物(0.1mg/mL)用于评估cIEF-ESI-MS/MS系统的再现性。将BSA(0.5mg/mL)溶解于100mM碳酸氢铵(pH 8.0)中并且在90℃下变性10分钟,之后通过用二硫苏糖醇(DTT)(8mM)在65℃下还原1h并且用碘乙酸(IAA)(20mM)在室温下在黑暗中烷基化30分钟来进行标准还原和烷基化过程。降解通过将蛋白质与胰蛋白酶一起以1:30(w/w)的胰蛋白酶:蛋白质比率在37℃下孵育12小时来执行。羧基官能化的磁性微球(Plus羧基,平均直径约1.5μm)是购自磅斯实验室公司(Bangs Laboratories,Inc.;美国印第安纳州费歇尔斯(Fishers,IN,USA)),并且羧基官能化的磁性微球的活化和胰蛋白酶固定是如李(Li)等人,色谱A杂志(J.Chromatogr.A)2011,1218,2007-2011所描述的执行的。
三蛋白混合物的制备
还使用三蛋白混合物来评估cIEF-ESI-MS/MS系统的性能。三蛋白混合物以50倍浓度范围制备并且包含7μM BSA(0.5mg/mL)、0.7μM细胞色素c(0.0095mg/mL)以及140nM肌红蛋白(0.0025mg/mL)。将蛋白混合物溶解于100mM碳酸氢铵(pH 8.0)中并且在90℃下变性10分钟,之后如先前所述用二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酸(IAA)进行标准还原和烷基化过程。对于固定的胰蛋白酶降解,将30μL蛋白质溶液与200μg胰蛋白酶固定的珠粒一起在37℃下孵育10分钟。降解物用通过来自赛默科技公司(Thermo scientific;美国俄亥俄州玛丽埃塔(Marietta,OH,USA))的Nano Pure系统去离子的水1:1稀释并且储存在-20℃下以供使用。
耗乏的重组人类IgG细胞培养基
重组人类IgG是由医学免疫公司(MedImmune,Inc)使用已知的细胞培养方法制备的。重组人类IgG接着使用NAb蛋白A(赛默科技公司)和蛋白质L(赛默科技公司)离心柱从测试样品中耗乏。简单来说,蛋白A离心柱用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS;pH 7.2)平衡。IgG样品用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释并且加入到柱中。在室温下在通过倒转轻轻混合下孵育十分钟之后,收集流过物并且将它立即加入平衡的蛋白质L离心柱中。如上文所述对蛋白质L柱进行孵育和混合。对蛋白质L流过物(耗乏的培养基)进行收集并且储存在-80℃下以供使用。
将从蛋白质A/L柱获得的流过部分(0.045mg/mL,500μL)(上述)在艾本德浓缩器(Eppendorf concentrator)中干燥。将干燥的样品溶解于具有1M尿素的100μL 100mM碳酸氢铵(NH4HCO3)中并且在90℃下变性10分钟,之后如上述用二硫苏糖醇(DTT)和碘乙酸(IAA)进行标准还原和烷基化过程。降解通过将50μL变性的蛋白质与400μg固定的胰蛋白酶磁性珠粒一起在37℃下孵育10分钟来执行。将降解物储存在-20℃下以供使用。
实例2:cIEF
本实例中所用的仪器是基于由沃伊齐克(Wojcik)等人,质谱快讯(Rapid Commun.Mass Spectrom.)2010,24,2554-2560所描述的毛细管电泳系统。商业线性聚丙烯酰胺(LPA)涂布的毛细管(50μm内径,150μm外径,50cm长,亚利桑那州菲尼克斯的聚微技术公司(PolymicroTechnologies,Phoenix,AZ))用于cIEF分离。将毛细管的阳极端置放于甲酸(0.1%,pH 2.5)中,并且将阴极端置放于0.3%氢氧化铵(pH 11)中。毛细管用在0.4%Pharmalyte(3-10)溶液(新泽西州皮斯卡塔威的通用电气医疗集团(GE Healthcare,Piscataway,NJ))中制备的样品通过将该溶液以2psi吹扫通过毛细管持续3分钟来填充。这个实验中使用的注射体积等于毛细管体积。聚焦电压以360V/cm施加10分钟。
实例3:ESI
在聚焦之后,将毛细管的阴极端插入到电喷雾接口的发射器中(沃伊齐克等人,质谱快讯2010,24,2554-2560),并且化学动员用鞘流缓冲液执行,使得该鞘流缓冲液既用作用于cIEF的化学动员溶液又用作用于电喷雾电离的电离缓冲液。研究了三种类别的鞘流缓冲液:50%甲醇和0.05%乙酸;50%甲醇和0.05%甲酸;50%甲醇和0.1%甲酸。甲酸(FA)是购自飞世尔科技公司(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。电场在动员期间保持在330V/cm下。
图5呈现三种鞘流缓冲液的电流特征曲线。曲线a示出了在鞘流中使用0.05%乙酸的cIEF化学动员。曲线b和c分别使用0.05%甲酸和0.1%甲酸作为鞘流缓冲液。电流在使用50%甲醇和0.05%乙酸的化学动员期间较低并且不显著变化。
相比之下,在使用50%甲醇与0.05%甲酸和50%甲醇与0.1%甲酸的化学动员期间电流增大。电流在0.1%甲酸的情况下比在0.05%甲酸的情况下更快速地增大。似乎更高浓度的甲酸加速动员并且产生窄分离窗。在一些情况下,短分离窗可能不是所希望的,因为它可以限制可以在分离期间聚集的串联质谱的数目。为了加宽分离窗并且增加肽数目和蛋白质序列覆盖率,在以下实验中将50%甲醇与0.05%甲酸用作鞘流。
实例4:数据获取和处理
所有质谱实验均使用LTQ-Orbitrap Velos仪器(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))执行。全MS扫描在Orbitrap质量分析器中在395-1900m/z范围内以分辨率60,000(在400m/z下)获得。选择电荷态≥2的十二个最强峰以便定序并且在35%正规化的碰撞能量、活化q=0.25、10微秒活化时间以及一个微扫描下在离子阱中碎裂。将针对在45秒窗内碎裂两次或更多次选择的峰从用于另外45秒的选择中排除。
对于标准蛋白质样品,原始文件的数据库搜索是在ProteomeDiscoverer 1.2中用SEQUEST搜索引擎对照ipi.bovin.v3.68.fasta(针对BSA和细胞色素c)、equine.fasta(针对肌红蛋白)执行的。所鉴别的置信度值为“高”的肽被认为是阳性鉴别。
对于HCP样品,首先将原始文件传送成mgf文件。mgf文件的数据库搜索是用MASCOT搜索引擎对照SwissProt啮齿动物执行的。Trans-Proteomic Pipeline(TPP)4.4用于过滤数据库搜索结果,其中肽机率和蛋白质机率均高于0.9。
肽(25±4)在一式三份的分析中以高置信度鉴别出,产生44%±6%的序列覆盖率。还分析了三次运行中的肽强度。表1(以下)呈现出从在一式三份的运行中获得的光谱提取的五种肽的峰强度。峰强度的相对标准偏差在从3%到8%的范围内。
表1BSA降解物的一式三份分析中的提取的肽强度
表2(以下)呈现所鉴别的肽的数目和三种蛋白质的序列覆盖率。分析在50倍过量BSA存在下从稀肌红蛋白样品中一致地鉴别出至少一种肽。
表2通过CIEF-ESI-MS/MS鉴别三蛋白混合物
通过串联质谱在耗乏的抗体样品中鉴别出53种肽。在针对这些肽观察到的迁移时间与预测的等电点之间存在单调但非线性关系(参见图6)。对于11分钟的偏移来说,pI对1/(迁移时间-偏移量)的曲线是线性的(r=0.97)。这个偏移量反射出两性电解质开始离开毛细管所必需的时间。相反关系反映正性化学动员。
在用Mascot进行数据库搜索并且用Trans-Proteomic Pipeline(TPP,4.4版)过滤之后,在一式三份的CIEF-ESI-MS/MS运行之后在肽和蛋白质两个层面上以高于0.9的机率鉴别出37种HCP蛋白质。包括样品制备、降解以及CIEF-ESIMS/MS分析在内的总分析时间为约4小时。
Claims (133)
1.用于鉴别并分析样品中的一种或多种组分的方法,该方法包括:
a.通过毛细管等电聚焦(cIEF)分离该样品中的一种或多种组分,其中将该样品和一种两性电解质缓冲液引入到分离腔室中并且在外加电压下聚焦;
b.使用鞘流溶液将这些分离的组分从该分离腔室转移到电离仪器,该鞘流溶液包含在约30%与约50%之间的极性有机溶剂和在约0.01%与0.1%之间的有机酸;
c.将这些样品组分电离;并且
d.通过质谱(MS)鉴别并分析该样品中的一种或多种组分。
2.根据权利要求1所述的方法,其中该鞘流溶液既充当用于该分离腔室的动员溶液又充当用于该电离仪器的电离溶液。
3.根据权利要求1所述的方法,其中该极性有机溶剂是选自极性质子溶剂和极性非质子溶剂。
4.根据权利要求3所述的方法,其中该极性质子溶剂包括脂肪醇。
5.根据权利要求4所述的方法,其中该脂肪醇是选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇以及其组合。
6.根据权利要求3所述的方法,其中该极性非质子溶剂包括乙腈。
7.根据权利要求1所述的方法,其中该有机酸是选自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以及其组合。
8.根据权利要求1所述的方法,其中该有机酸的pKa在约4.0与5.0之间。
9.根据权利要求5所述的方法,其中该脂肪醇是甲醇并且该有机酸是甲酸。
10.根据权利要求1所述的方法,其中分离包括:
a.将一定体积的该样品和两性电解质缓冲液引入到该分离腔室中,其中该分离腔室包括毛细管;并且
b.在高达约50kV的聚焦电压下将该样品和该两性电解质缓冲液在该分离毛细管中聚焦。
11.根据权利要求10所述的方法,其中该聚焦电压是在约5kV与约30kV之间。
12.根据权利要求10所述的方法,其中该样品在介于约300V/cm与约600V/cm之间的外加电场下聚焦。
13.根据权利要求10所述的方法,其中该外加电场是在约300V/cm与约400V/cm之间。
14.根据权利要求1所述的方法,其中该样品在高达约50kV的动员电压下转移到该电离仪器。
15.根据权利要求14所述的方法,其中该动员电压是在约1kV与约50kV之间。
16.根据权利要求1所述的方法,其中该样品在介于约300V/cm与约600V/cm之间的外加电场下转移到该电离仪器。
17.根据权利要求1所述的方法,其中该样品在介于约300V/cm与约350V/cm之间的外加电场下转移到该电离仪器。
18.根据权利要求1所述的方法,其中该样品通过水动力注射转移到该电离仪器。
19.根据权利要求18所述的方法,其中水动力注射包括在该分离腔室的入口处使用注射器施加介于约0.5psi与约50psi之间的压力。
20.根据权利要求18所述的方法,其中水动力注射包括在该分离腔室的出口处施加介于约0.5psi与约50psi之间的真空。
21.根据权利要求10所述的方法,其中该分离毛细管具有体积,并且该引入的样品体积小于或等于该毛细管体积。
22.根据权利要求21所述的方法,其中该样品体积是在该毛细管体积的约25%与约100%之间。
23.根据权利要求22所述的方法,其中该引入的样品体积是在约1μL与25μL之间。
24.根据权利要求10所述的方法,其中该样品包含各在约0.1μg/ml与10mg/ml之间的一种或多种两性样品组分。
25.根据权利要求10所述的方法,其中该分离毛细管包括熔融硅石(SiO2)毛细管。
26.根据权利要求25所述的方法,其中该毛细管包括聚合涂层。
27.根据权利要求26所述的方法,其中该聚合涂层是选自聚丙烯酰胺(LPA)、甲基纤维素、聚乙烯醇(PVA)以及其组合。
28.根据权利要求10所述的方法,其中该两性电解质包括选自AmpholineTM、BiolyteTM、PharmalyteTM、ServalytTM以及其组合的载体两性电解质(CA)。
29.根据权利要求28所述的方法,其中该两性电解质包括介于约1%与约10%之间的PharmalyteTM。
30.根据权利要求28所述的方法,其中该两性电解质包括窄pH范围的载体两性电解质。
31.根据权利要求28所述的方法,其中该两性电解质包括宽pH范围的载体两性电解质。
32.根据权利要求28所述的方法,其中该两性电解质包括选自PharmalyteTM(1-3)、PharmalyteTM(5-8)以及PharmalyteTM(3-10)的PharmalyteTM。
33.根据权利要求32所述的方法,其中该两性电解质包括介于约2%与约8%之间的PharmalyteTM(3-10)溶液。
34.根据权利要求10所述的方法,进一步包括在将该样品引入到该分离毛细管中之前降解该样品中的一种或多种组分的步骤。
35.根据权利要求34所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是用蛋白水解酶降解的。
36.根据权利要求35所述的方法,其中该蛋白水解酶是选自丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶以及其组合。
37.根据权利要求35所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是用胰蛋白酶降解的。
38.根据权利要求37所述的方法,其中该胰蛋白酶被固定在固体支撑物上。
39.根据权利要求38所述的方法,其中该固体支撑物是选自聚合物粒子、玻璃、膜、凝胶珠粒、溶胶-凝胶支撑物、多孔硅基体、多孔整体材料、磁性材料以及其组合。
40.根据权利要求35所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是在介于约35℃与约40℃之间的温度下降解的。
41.根据权利要求35所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与该蛋白水解酶一起孵育历时在约5小时与约20小时之间来降解的。
42.根据权利要求35所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与该蛋白水解酶一起孵育历时在约10小时与约15小时之间来降解的。
43.根据权利要求34所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与蛋白水解酶一起孵育至少约12小时来降解的。
44.根据权利要求34所述的方法,其中该样品在降解之后用水稀释,与载体两性电解质组合并且被引入到该分离腔室中。
45.根据权利要求35所述的方法,其中该样品以在约2:1与1:2之间的水与样品比率用水稀释。
46.根据权利要求1所述的方法,其中电离仪器包括电喷雾电离(ESI)仪器。
47.根据权利要求1所述的方法,其中该样品包括异质的生物分子混合物。
48.根据权利要求1所述的方法,其中该样品包括重组蛋白耗乏的细胞培养物。
49.根据权利要求48所述的方法,其中一种或多种组分包括宿主细胞蛋白。
50.根据权利要求1所述的方法,其中该样品包括重组单克隆抗体耗乏的细胞培养物。
51.根据权利要求50所述的方法,其中一种或多种组分包括宿主细胞蛋白。
52.根据权利要求1所述的方法,其中一种或多种组分包括蛋白质并且该方法包括在将样品引入到该分离腔室中之前将该样品中的蛋白质变性。
53.根据权利要求52所述的方法,其中将该样品中的蛋白质变性包括热变性。
54.根据权利要求52所述的方法,其中将该样品中的蛋白质变性包括将该样品溶液与非离子表面活性剂一起孵育。
55.根据权利要求50所述的方法,其中将该样品中的蛋白质变性包括将该样品与碱组合以形成pH在约8与约10之间的碱性溶液。
56.根据权利要求52所述的方法,其中将该样品中的蛋白质变性包括将该样品与酸一起孵育以形成pH在约2与约3之间的酸性溶液。
57.根据权利要求53所述的方法,其中热变性包括将该样品在介于约60℃与约80℃之间的高温下孵育至少约5分钟。
58.根据权利要求52所述的方法,其中将该样品中的这些蛋白质变性包括将该样品与包括碳酸氢铵的变性溶液一起孵育。
59.根据权利要求58所述的方法,其中该变性溶液进一步包括尿素。
60.根据权利要求52所述的方法,其中该方法进一步包括将该样品与还原和烷基化溶液一起孵育。
61.根据权利要求60所述的方法,其中该还原溶液是选自包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三丁基膦(TBP)以及其组合的溶液。
62.根据权利要求60所述的方法,其中该烷基化溶液包括碘乙酰胺(IAA)、β-巯基乙醇或其组合。
63.用于将毛细管等电聚焦(cIEF)和质谱(MS)接口连接的系统,包括:
a.cIEF仪器,包括用于将液体样品中的一种或多种组分分离并聚焦的分离腔室;
b.电压电源,用于将电位施加在该分离腔室两端,其中该分离腔室包含样品和载体两性电解质并且该电位将该样品中的一种或多种组分分离并聚焦;
c.鞘流溶液,用于将一种或多种已分离并聚焦的组分从该cIEF仪器的该分离腔室直接转移到发射器,该发射器被配置成将该溶液供应到电喷雾电离(ESI)仪器,其中该鞘流溶液包含在约30%与约50%之间的极性有机溶剂和在约0.01%与0.1%之间的有机酸;以及
d.MS仪器,用于分析样品分析物。
64.根据权利要求63所述的系统,其中该极性有机溶剂是选自极性质子溶剂和极性非质子溶剂。
65.根据权利要求64所述的系统,其中该极性质子溶剂包括脂肪醇。
66.根据权利要求65所述的系统,其中该脂肪醇是选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇以及其组合。
67.根据权利要求64所述的系统,其中该极性非质子溶剂包括乙腈。
68.根据权利要求63所述的系统,其中该有机酸是选自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以及其组合。
69.根据权利要求63所述的系统,其中该有机酸的pKa在约4.0与5.0之间。
70.根据权利要求65所述的系统,其中该脂肪醇是甲醇并且该有机酸是甲酸。
71.根据权利要求63所述的系统,其中该cIEF仪器包括阳极、阴极、阳极电解质储槽以及阴极电解质储槽。
72.根据权利要求71所述的系统,其中该阳极电解质储槽包含了包括酸的阳极电解质。
73.根据权利要求72所述的系统,其中该阳极电解质包括磷酸、甲酸、天冬氨酸或其组合。
74.根据权利要求71所述的系统,其中该阴极电解质储槽包含了包括一种碱的阴极电解质。
75.根据权利要求74所述的系统,其中该碱是选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾以及其组合。
76.根据权利要求71所述的系统,包括将该鞘流溶液引入到该阳极电解质和/或阴极电解质储槽中以动员这些聚焦的样品组分。
77.根据权利要求71所述的系统,包括被配置成将该分离腔室的一端与该发射器偶联的接口偶联装置。
78.根据权利要求77所述的系统,其中该分离腔室包括具有阳极端的毛细管,其中在将该样品中的一种或多种组分聚焦之后将该毛细管的该阳极端插入到该发射器的输入端中以动员这些聚焦的组分。
79.根据权利要求78所述的系统,其中该鞘流溶液被引入到该阴极电解质储槽中。
80.根据权利要求77所述的系统,其中该分离腔室包括具有阴极端的毛细管,其中在将该样品中的一种或多种组分聚焦之后将该毛细管的该阴极端插入到该发射器的输入端中以动员这些聚焦的组分。
81.根据权利要求80所述的系统,其中该鞘流溶液被引入到该阳极电解质储槽中。
82.用于鉴别耗乏的细胞培养物样品中的宿主细胞蛋白(HCP)组分的方法,该方法包括:
a.通过毛细管等电聚焦(cIEF)分离该样品中的一种或多种HCP组分,其中将该样品和两性电解质缓冲液引入到分离腔室中并且在外加电压下聚焦这一种或多种HCP组分,该分离腔室包括熔融硅石毛细管并具有入口端和出口端;
b.将该分离腔室的该出口端与电喷雾电离(ESI)仪器的入口端偶联;
c.通过将鞘流溶液引入到该分离腔室的该入口端中来将这些分离的HCP组分从该分离腔室转移到该ESI仪器的发射器,该鞘流溶液包含在约30%与约50%之间的极性有机溶剂和在约0.01%与0.1%之间的有机酸,其中该鞘流溶液既充当用于该分离腔室的动员溶液又充当用于该电离仪器的电离溶液;
d.将这些样品组分电离;并且
e.通过质谱(MS)鉴别并分析该样品中的一种或多种组分。
83.根据权利要求82所述的方法,其中该极性有机溶剂是选自极性质子溶剂和极性非质子溶剂。
84.根据权利要求82所述的方法,其中该极性质子溶剂包括脂肪醇。
85.根据权利要求84所述的方法,其中该脂肪醇是选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇以及其组合。
86.根据权利要求83所述的方法,其中该极性非质子溶剂包括乙腈。
87.根据权利要求82所述的方法,其中该有机酸是选自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以及其组合。
88.根据权利要求82所述的方法,其中该有机酸的pKa在约4.0与5.0之间。
89.根据权利要求84所述的方法,其中该脂肪醇是甲醇并且该有机酸是甲酸。
90.根据权利要求82所述的方法,其中分离包括在高达约50kV的聚焦电压下在该分离毛细管中聚焦该样品和该两性电解质缓冲液。
91.根据权利要求90所述的方法,其中该聚焦电压是在约5kV与约30kV之间。
92.根据权利要求82所述的方法,其中该样品在介于约300V/cm与约600V/cm之间的外加电场下聚焦。
93.根据权利要求92所述的方法,其中该外加电场是在约300V/cm与约400V/cm之间。
94.根据权利要求82所述的方法,其中该样品在高达约50kV的动员电压下转移到该电离仪器。
95.根据权利要求94所述的方法,其中该动员电压是在约5kV与约40kV之间。
96.根据权利要求82所述的方法,其中该样品在介于约300V/cm与约600V/cm之间的外加电场下转移到该电离仪器。
97.根据权利要求96所述的方法,其中该外加电场是在约300V/cm与约350V/cm之间。
98.根据权利要求82所述的方法,其中该样品通过水动力注射转移到该电离仪器。
99.根据权利要求98所述的方法,其中水动力注射包括在该分离腔室的入口处使用注射器施加介于约0.5psi与约50psi之间的压力。
100.根据权利要求98所述的方法,其中水动力注射包括在该分离腔室的出口处施加介于约0.5psi与约50psi之间的真空。
101.根据权利要求82所述的方法,其中该分离毛细管具有体积,并且该引入的样品体积小于或等于该毛细管体积。
102.根据权利要求101所述的方法,其中该样品体积是在该毛细管体积的约25%与约100%之间。
103.根据权利要求102所述的方法,其中该引入的样品体积是在约1μL与25μL之间。
104.根据权利要求82所述的方法,其中该样品包含各在约0.1μg/ml与10mg/ml之间的一种或多种两性样品组分。
105.根据权利要求82所述的方法,其中该毛细管包括聚合涂层。
106.根据权利要求105所述的方法,其中该聚合涂层是选自聚丙烯酰胺(LPA)、甲基纤维素、聚乙烯醇(PVA)以及其组合。
107.根据权利要求82所述的方法,其中该两性电解质包括选自AmpholineTM、BiolyteTM、PharmalyteTM、ServalytTM以及其组合的载体两性电解质(CA)。
108.根据权利要求107所述的方法,其中该两性电解质包括介于约1%与约10%之间的PharmalyteTM。
109.根据权利要求108所述的方法,其中该两性电解质包括窄pH范围的载体两性电解质。
110.根据权利要求108所述的方法,其中该两性电解质包括宽pH范围的载体两性电解质。
111.根据权利要求108所述的方法,其中该两性电解质包括选自PharmalyteTM(1-3)、PharmalyteTM(5-8)以及PharmalyteTM(3-10)的PharmalyteTM。
112.根据权利要求111所述的方法,其中该两性电解质包括介于约2%与约8%之间的PharmalyteTM(3-10)溶液。
113.根据权利要求82所述的方法,进一步包括在将该样品引入到该分离毛细管中之前降解该样品中的一种或多种组分的步骤。
114.根据权利要求113所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是用胰蛋白酶降解的。
115.根据权利要求114所述的方法,其中该胰蛋白酶被固定在固体支撑物上。
116.根据权利要求115所述的方法,其中该固体支撑物是选自聚合物粒子、玻璃、膜、凝胶珠粒、溶胶-凝胶支撑物、多孔硅基体、多孔整体材料、磁性材料以及其组合。
117.根据权利要求113所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是在介于约35℃与约40℃之间的温度下降解的。
118.根据权利要求113所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是通过用该蛋白水解酶将该样品孵育持续在约5小时与约20小时之间来降解的。
119.根据权利要求113所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与该蛋白水解酶一起孵育历时在约10小时与约15小时之间来降解的。
120.根据权利要求113所述的方法,其中该样品中的一种或多种组分是通过将该样品与蛋白水解酶一起孵育至少约12小时来降解的。
121.根据权利要求113所述的方法,其中该样品在降解之后用水稀释,与一种载体两性电解质组合并且被引入到该分离腔室中。
122.根据权利要求121所述的方法,其中该样品以在约2:1与1:2之间的水与样品比率稀释。
123.根据权利要求82所述的方法,其中一种或多种组分包括蛋白质并且该方法包括在将样品引入到该分离腔室中之前将该样品中的蛋白质变性。
124.根据权利要求123所述的方法,其中将该样品中的蛋白质变性包括热变性。
125.根据权利要求123所述的方法,其中将该样品中的蛋白质变性包括将该样品溶液与非离子表面活性剂一起孵育。
126.根据权利要求123所述的方法,其中将该样品中的蛋白质变性包括将该样品与碱组合以形成pH在约8与约10之间的碱性溶液。
127.根据权利要求123所述的方法,其中将该样品中的蛋白质变性包括将该样品与酸一起孵育以形成pH在约2与约3之间的酸性溶液。
128.根据权利要求124所述的方法,其中热变性包括将该样品在介于约60℃与约80℃之间的高温下孵育至少约5分钟。
129.根据权利要求123所述的方法,其中将该样品中的这些蛋白质变性包括将该样品与包括碳酸氢铵的变性溶液一起孵育。
130.根据权利要求129所述的方法,其中该变性溶液进一步包括尿素。
131.根据权利要求123所述的方法,其中该方法进一步包括将该样品与还原和烷基化溶液一起孵育。
132.根据权利要求131所述的方法,其中该还原溶液是选自包括二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、三丁基膦(TBP)以及其组合的溶液。
133.根据权利要求131所述的方法,其中该烷基化溶液包括碘乙酰胺(IAA)、甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)、β-巯基乙醇或其组合。
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