CN110907249B - 一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法 - Google Patents

一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，具体涉及纳米材料、生物催化及分析化学技术领域，包括以下步骤：S1、MnO2纳米片‑Au复合材料的构建，以多肽为模板制备MnO2纳米片，再采用生物矿化和静电组装技术，将Au纳米簇原位生成在MnO2纳米片上；S2、将分子印迹和仿酶纳米复合材料结合起来用于多模式葡萄糖检测。本发明采用分子印迹技术与复合纳米材料的串联仿酶活性相结合实现对葡萄糖的检测，提高了反应的选择性，对其他糖(乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、蔗糖)无明显响应，可用于葡萄糖多模式检测，其应用于实际样品的测定，表现出良好的重现性、可靠性、准确性。

Description

一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法
技术领域
本发明涉及纳米材料、生物催化及分析化学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法。
背景技术
纳米酶是一类既有纳米材料的独特性能又有催化功能的模拟酶。纳米酶具有催化效率高、稳定、经济和规模化制备的特点，它在医学、化工、食品、农业和环境等领域得到广泛应用。目前，已发现多种纳米酶具有仿葡萄糖氧化酶活性或仿过氧化物酶活性，而这两种活性有望实现串联催化反应，但同时具有仿葡萄糖氧化酶活性和仿过氧化物酶活性的纳米酶仍然鲜有报道。
分子印迹聚合物(MIPs)是通过在模板周围聚合单体形成的一类聚合物。聚合时，模板与聚合物交联；在移除模板之后，生成的空腔用于重新绑定模板。利用分子印迹的高选择性的特点，将分子印迹与具有仿酶活性的纳米材料相结合已有广泛的应用。Zhou等人在《ImmobilizationofCarbonDotsinMolecularlyImprintedMicrogelsforOpticalSensingofGlucoseatPhysiologicalpH》一文中利用碳量子点、葡萄糖和分子印迹，通过调节pH实现对葡萄糖的检测(ACSAppliedMaterials&Interfaces2015，7，15735-15745)。然而，至今尚无将分子印迹和具有仿酶活性的纳米材料结合起来用于多模式检测的报道。并且，尚无基于多仿葡萄糖氧化酶活性复合材料和分子印迹相结合检测目标物的报道。
综上可知，分子印迹多用于大分子量物质的检测，而对于小分子物质应用的很少，且检测效率较低。因此目前尚需开发基于复合多纳米酶用于快速、灵敏、高效的多组分目标物检测。将复合纳米酶、分子印迹结合起来用于葡萄糖多模式检测具有一定的创新性和研究意义。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，通过采用分子印迹技术与复合纳米材料的仿酶活性相结合实现对葡萄糖的检测，提高了反应的选择性，对其他糖(乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、蔗糖)无明显响应，可用于葡萄糖多模式检测，其应用于实际样品的测定，表现出良好的重现性、可靠性、准确性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，包括以下步骤：
S1、MnO2纳米片-Au复合材料的构建，合成步骤包括：
S1.1、将牛血清蛋白与含有二价锰离子的水溶液混合均匀，静置一段时间，然后向上述混合溶液中加入一定量的碱液并混匀，振荡反应一段时间，采用牛血清蛋白同时作为生物模板，在敞开的碱性环境下氧化快速简便地制备出牛血清蛋白负载的MnO2纳米片悬浮液；
S1.2、将上述反应液离心，去除含有未反应成分的上清液，收集沉淀，合成了具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性的MnO2纳米片，4℃保存以备用；
S1.3、将MnO2纳米片、NaBH4依次加入HAuCl4溶液中，采用静电组装及生物矿化技术，将同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性的Au纳米簇原位生成在也同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性MnO2纳米片上，得到同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性且活性加强的MnO2纳米片-Au复合材料；
S2、将分子印迹和MnO2纳米片-Au复合材料结合起来用于葡萄糖检测，制备及检测步骤包括：
S2.1、分子印迹制备：将葡萄糖和过氧化物酶底物构成的模板分子、印迹聚合物单体加入MnO2纳米片-Au复合材料悬浮液中，并加入引发剂引发聚合反应，待聚合过程完成后，离心并用水清洗，放入pH4的缓冲溶液中以使作为模板分子的葡萄糖反应并用水洗脱，放入含H2O2的pH4的缓冲液中以使作为模板分子的过氧化物酶底物反应并用水洗脱，最终得到分子印迹-复合纳米酶系统；
S2.2、建立催化反应体系，具体为包含葡萄糖、分子印迹-复合纳米酶系统以及过氧化物酶底物的缓冲液；待反应体系反应一段时间后，利用分光光度计或荧光仪检测其吸光值或荧光，并绘制出葡萄糖标准工作曲线，实现葡萄糖的检测。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.1中，所述含有二价锰离子的水溶液可由醋酸锰、氯化锰、硫酸锰、硝酸锰配制而成；所述碱液由氢氧化钠、氢氧化钾、氨水配制而成。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.1中，多肽与含有二价锰离子的水溶液混合静置时间为半分钟以上，加入碱液混合振荡时间为0.3h-3天。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S1.2中，也可通过透析或过滤的方法收集纯化MnO2纳米片。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S2.2中，催化反应体系中葡萄糖浓度为0-20mmol/L。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S2.1和S2.2中，催化反应体系中过氧化物酶底物为2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)或AmplexRed(AR)，在步骤S2.1中，聚合物单体为丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、多巴胺或苯硼酸和邻苯二胺，引发剂为过硫酸铵、偶氮二异丁腈或四甲基乙二胺。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S2.2中，催化反应体系中缓冲液的pH值为3-7。
在一个优选地实施方式中，所述步骤S2.2中，催化反应体系在37℃或是室温25℃下反应5-90分钟。
本发明的技术效果和优点：
本发明采用分子印迹技术与复合纳米材料的仿酶活性相结合实现对葡萄糖的检测，提高了反应的选择性，对其他糖(乳糖、半乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、蔗糖)无明显响应，可用于葡萄糖多模式检测，其应用于实际样品的测定，表现出良好的重现性、可靠性、准确性，解决了现有技术中存在的小分子物质检测效率低，分析过程复杂的缺点问题。
附图说明
图1为本发明复合材料的构建示意图；
图2为本发明不同浓度的葡萄糖定量检测的标准工作曲线图；
图3为本发明不同浓度下的葡萄糖最终的定性显色检测示意图。
图4为本发明的透射电镜表征图。
图5为本发明分子印迹(MIP)比分子印迹前(MnO2-Au)和无模板印迹(NIP)活性效果高的示意图。
图6为本发明检测选择性效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明提供了一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，包括以下步骤：
S1、MnO2纳米片-Au复合材料的构建(见图1)，合成步骤包括：
S1.1、将牛血清蛋白与含有二价锰离子的水溶液混合均匀，静置60s，然后向上述混合溶液中加入一定量的碱液并混匀，振荡反应1天，采用牛血清蛋白同时作为生物模板，在敞开的碱性环境下氧化快速简便地制备出牛血清蛋白负载的MnO2纳米片悬浮液，其中含有二价锰离子的水溶液可由醋酸锰、氯化锰、硫酸锰、硝酸锰配制而成；碱液由氢氧化钠、氢氧化钾、氨水配制而成；
S1.2、将上述反应液离心，去除含有未反应成分的上清液，收集沉淀，合成了具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性的MnO2纳米片，4℃保存以备用，也可通过透析或过滤的方法收集纯化MnO2纳米片；
S1.3、将MnO2纳米片、NaBH4依次加入HAuCl4溶液中，采用静电组装及生物矿化技术，将同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性的Au纳米簇原位生成在也同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性MnO2纳米片上，得到同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性且活性加强的MnO2纳米片-Au复合材料；
S2、将分子印迹和MnO2纳米片-Au复合材料结合起来用于葡萄糖检测，检测步骤包括：
S2.1、分子印迹制备：将葡萄糖和TMB过氧化物酶底物构成的模板分子、印迹聚合物单体加入MnO2纳米片-Au复合材料悬浮液中，并加入引发剂引发聚合反应，待聚合过程完成后，离心并用水清洗，放入pH4的缓冲溶液中以使作为模板分子的葡萄糖反应并用水洗脱，放入含H2O2的pH4的缓冲液中以使作为模板分子的TMB过氧化物酶底物反应并用水洗脱，最终得到分子印迹-复合纳米酶系统；
S2.2、建立催化反应体系，具体为包含葡萄糖(0-0.6mmol/L、分子印迹-复合纳米酶系统以及0.5mmol/L的TMB过氧化物酶底物的醋酸缓冲液(pH值为4)；待反应体系在25℃反应30分钟，利用分光光度计检测其300-800nm处的吸光值，并绘制出葡萄糖标准工作曲线，实现葡萄糖的检测。
检测过程不需要分步进行，且分析用时较短。如图2所示，线性范围0-0.6mmol/L。
不同浓度下的葡萄糖，随葡萄糖浓度升高，逐渐变蓝，最终的定性显色检测示意图见图3。
实施例2：
MnO2纳米片-Au复合分子印迹的形貌分析：
采用分子印迹技术，将分子印迹聚合物的悬浮液滴于承载有MnO2纳米片-Au复合材料的玻璃片上，室温晾干后粘在铜台上，利用扫描电子显微镜分析其形貌。
如图4所示，得到的分子印迹聚合物形貌均一，在二氧化锰纳米片的周围可见明显的印迹。
实施例3：
与实施例1不同的是，本实施例中，MnO2纳米片-Au复合分子印迹制备和催化检测反应体系中的过氧化物酶底物还可以采用2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)、邻苯二胺(OPD)或AmplexRed(AR)中的一种，且相应的，利用分光光度计或荧光仪检测其吸光值或荧光时，ABTS对应的缓冲液检测的为420nm处的吸光值；OPD对应的缓冲液检测的为450nm处的吸光值；AR需用荧光仪进行荧光检测，且AR的激发发射波长分别为570、585nm，检测可以为570或585nm处的荧光值。
实施例4：
MnO2纳米片-Au复合分子印迹的仿酶活性：
实验体系a：催化反应体系为包含葡萄糖(浓度为1mmol/L)、上述实施例获得的分子印迹、有机显色剂TMB(浓度为0.5mmol/L)的缓冲液(pH4)。在室温(25℃)下反应30分钟后，利用分光光度计检测其在300-800nm的吸光值。
另做两个对照试验：其中一组对照实验b的催化反应体系中分子印迹中不加实施例获得的分子印迹，在与上述实验体系同样条件下反应30分钟后检测吸光值；另一份对照实验c的催化反应体系不加葡萄糖，在与上述实验体系同样条件下静置30分钟后检测吸光值；
实验体系a显示出明显的峰，说明形成的分子印迹对葡萄糖有催化活性；对照试验b在650nm附近无明显的峰，说明若无MnO2纳米片-Au复合分子印迹作催化剂将无明显反应；对照试验c在650nm附近无明显的峰，说明实验体系a的峰不是MnO2纳米片-Au复合材料分子印迹自身的响应峰；
相同浓度的单独的MnO2和Au的双酶串联活性没有复合之后高，任何催化剂都不加时没有吸收峰，说明650nm的峰不是催化剂自身的响应峰。
如图5所示，分子印迹(MIP)比分子印迹前(MnO2-Au)和无模板印迹(NIP)活性效果高；
检测选择性效果图见图6，分子印迹复合材料仅对葡萄糖有明显响应，对其他糖分子无响应，表现出优秀的选择性。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、MnO2纳米片-Au复合材料的构建，合成步骤包括：
S1.1、将多肽与含有二价锰离子的水溶液混合均匀，静置一段时间，然后向上述混合溶液中加入一定量的碱液并混匀，振荡反应一段时间，采用多肽作为生物模板，在敞开的碱性环境下锰离子被氧化从而快速简便地制备出多肽负载的MnO2纳米片悬浮液；
S1.2、将上述反应液离心，去除含有未反应成分的上清液，收集沉淀，合成了同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性的MnO2纳米片，4℃保存以备用；
S1.3、将MnO2纳米片、NaBH4依次加入HAuCl4溶液中，采用静电组装及生物矿化技术，将同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性的Au纳米簇原位生成在也同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性MnO2纳米片上，得到同时具有过氧化物酶和仿葡萄糖氧化酶活性且活性加强的MnO2纳米片-Au复合材料；
S2、将分子印迹和MnO2纳米片-Au复合材料结合起来用于葡萄糖检测，制备及检测步骤包括：
S2.1、分子印迹制备：将葡萄糖和过氧化物酶底物构成的模板分子、印迹聚合物单体加入MnO2纳米片-Au复合材料悬浮液中，并加入引发剂引发聚合反应，待聚合过程完成后，离心并用水清洗，放入pH值为4的缓冲溶液中以使作为模板分子的葡萄糖反应并用水洗脱，放入含H2O2的pH值为4的缓冲液中以使作为模板分子的过氧化物酶底物反应并用水洗脱，最终得到分子印迹-复合纳米酶系统；
S2.2、建立催化反应体系，具体为包含葡萄糖、分子印迹-复合纳米酶系统以及过氧化物酶底物的缓冲液；待反应体系反应一段时间后，利用分光光度计或荧光仪检测其吸光值或荧光，并绘制出葡萄糖标准工作曲线，实现葡萄糖的检测；
所述步骤S2.1和S2.2中，催化反应体系中过氧化物酶底物为2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、邻苯二胺或Amplex Red，在步骤S2.1中，聚合物单体为丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠，引发剂为过硫酸铵、偶氮二异丁腈或四甲基乙二胺。
2.根据权利要求1所述的一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，其特征在于：所述步骤S1.1中，所述含有二价锰离子的水溶液由醋酸锰、氯化锰、硫酸锰、硝酸锰配制而成；所述碱液由氢氧化钠、氢氧化钾、氨水配制而成。
3.根据权利要求1所述的一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，其特征在于：所述步骤S1.1中，多肽与含有二价锰离子的水溶液混合静置时间为半分钟以上，加入碱液混合振荡时间为0.3h-3天。
4.根据权利要求1所述的一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，其特征在于：所述步骤S1.2中，也可通过透析或过滤的方法收集纯化MnO2纳米片。
5.根据权利要求1所述的一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，其特征在于：所述步骤S2.2中，催化反应体系中葡萄糖浓度为0-20mmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，其特征在于：所述步骤S2.2中，催化反应体系中缓冲液的pH值为3-7。
7.根据权利要求1所述的一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法，其特征在于：所述步骤S2.2中，催化反应体系在37℃或是室温25℃下反应5-90分钟。
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