CN104945552A - 盐酸克伦特罗分子印迹聚合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种合成盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的方法。该方法以盐酸克伦特罗为模板分子，以α-甲基丙烯酸为功能单体，以氢键形式进行相互作用，加入交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂过硫酸铵发生自由基共聚，得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物；所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为117-274:1-300:30-90。本发明的盐酸克伦特罗分子印迹聚合物合成简单快捷、成本低、特异性强、稳定性好，可结合试纸法制成试纸条，用于痕量在线检测盐酸克伦特罗。

Description

盐酸克伦特罗分子印迹聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及分子印迹技术领域，具体涉及盐酸克伦特罗分子印迹聚合物及其制备方法。

背景技术

瘦肉精是具有肾上腺素受体激动作用的一类药物的统称，又称β2-兴奋剂，具有促进肌肉生长、提高瘦肉率的作用，曾作为生长添加剂被广泛关注，但β2-受体激动剂在动物体内有一定的残留时间，通过食物链进入人体后会使一些易感人群产生明显的中毒症状，危害人类健康。盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CLB)是瘦肉精中的一种，它能够明显促进动物生长，并增加瘦肉率，因而被一些不法分子使用在动物生产中用来增加瘦肉率。研究表明，残留在动物体内的盐酸克伦特罗被人使用后会毒害肾脏、肝脏等器官，会出现头痛不适、恶心呕吐、肌肉颤抖、心率加快、头晕目眩等症状，甚至会导致死亡，因此，我国严禁在动物生产中使用盐酸克伦特罗。现有检测盐酸克伦特罗的方法均需要复杂的样品处理过程和分析步骤，需要大型仪器及经过专门训练的专业人员操作，时间长、成本高，远不能满足在线检测的要求。

试纸法由于具有携带方便、操作简单、测定速度快等特点，在食品、水质、医疗卫生等领域有较多应用。如2001年河南省农科院动物免疫学重点实验室与河南百奥生物工程有限公司于成功研发了“瘦肉精”专用快速检测试纸技术并投放市场，使用该试纸可在60秒内快速直观地检测出肉品中是否含有超过安全标准的“瘦肉精”，该试纸检测技术以单克隆抗体为基础设计而成，检测时胶体金标记的“瘦肉精”单抗被检测线上固定化的“瘦肉精”人工结合抗原捕获，形成一条棕红色的检测线，过量的胶体金标记单抗继续涌动被对照线上固定化的羊抗鼠抗体捕获形成一条棕红色的对照线，如果样品中含有“瘦肉精”，它将与固定化在检测线上的人工抗原竞争有限的胶体金标记单抗。申请号为200810219632.1的中国专利，公开了一种盐酸克伦特罗检测试纸及其检测方法，该纸包括支撑固定粘衬层，在支撑固定粘衬层上依次有样品吸附层、结合垫、微孔虹吸反应层和吸水材料层，在结合垫上有示踪粒子标记的盐酸克伦特罗抗体和示踪粒子标记的抗体A，当样品中含有5纳克以上的盐酸克伦特罗时，检测区出现两条线，当样品中盐酸克伦特罗含量小于5纳克时，检测区出现一条线，该试纸具有与夹心法等同的检测模式及判读方式且成本低，该检测方法简便快捷，操作简单。但上述方法在使用中存在以下问题：超过判读时间容易出现假阴性、假阳性结果，质控线有时不显现，检测线颜色模糊不清，漏检率偏高等，因此，寻找一种快捷、方便、高选择、高灵敏的检测盐酸克伦特罗的试纸方法具有重要意义。

分子印迹是近年来兴起的分子特异性识别技术，具有对模板分子在功能基团、分子尺寸、空间结构具有记忆功能的结合位点，可以根据预定的选择性和高度识别性能进行分子识别，在印迹中形成的特异性识别位点能和被分析物选择性作用，并且这种作用是可逆的，这种合成的材料机械强度和化学稳定性好，能在极端环境中使用。现已有将分子印迹技术结合试纸法制备得到的分子印迹试纸条，不仅具备了分子印迹特异识别能力，且具有试纸条检测速度快、携带方便的特点，但是目前尚未有盐酸克伦特罗分子印迹试纸及其检测方法的相关报道，而制备分子印迹试纸的关键技术是制备适用于该检测方法的盐酸克伦特罗分子印迹聚合物。

发明内容

本发明针对现有的经典盐酸克伦特罗的检测方法前处理复杂、时间长、成本高，现有的试纸法易出现假阴性假阳性结果、漏检率高等现状，提供了一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物及其制备方法，该聚合物合成简单快捷、成本低、特异性强、稳定性好。本发明的盐酸克伦特罗分子印迹聚合物可结合试纸法制成试纸条，用于痕量在线检测盐酸克伦特罗。

本发明的技术方案为：

一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物，该聚合物以盐酸克伦特罗为模板分子，以α-甲基丙烯酸为功能单体，以氢键形式进行相互作用，加入交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂过硫酸铵发生自由基共聚，得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物；

所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为117-274:1-300:30-90。

以上所述的盐酸克伦特罗分子印迹聚合物，所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比优选为9.78:1:3.03。

一种以上所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

1.配制浓度为3×10^-3-3×10^-5mol/L的盐酸克伦特罗水溶液；

2.将3-7μLα-甲基丙烯酸加入到10-30mL浓度为3×10^-3-3×10^-5mol/L盐酸克伦特罗水溶液中，超声处理5-15分钟，再加入0.0014-0.0042g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，继续超声处理10-30分钟，静置过夜，得混合液；

3.将80-120μL浓度为0.5mol/L的过硫酸铵溶液，缓慢加入到步骤2得到的混合液中，超声处理10-20分钟，即得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物。

以上所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的应用，所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物可用于色谱分析、固相萃取或膜分离等领域。

以上所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的应用，所述色谱分析的具体方法为：将所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物用于制备分子印迹试纸条，结合酶放大效应技术，快速定性及定量测定盐酸克伦特罗。

利用化学法聚合制备得到盐酸克伦特罗的分子印迹聚合物，将其制备成分子印迹试纸条，用25％乙醇洗脱模板分子盐酸克伦特罗，留下对盐酸克伦特罗具有特异性识别能力的印迹孔穴。印迹膜表面的孔穴能够同时识别盐酸克伦特罗及具有相同结构的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗。将洗脱模板分子的试纸条在高浓度的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗中孵化后，印迹孔穴被葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗占据。随后竞争反应是在样品中的盐酸克伦特罗和印迹膜上的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗之间进行，盐酸克伦特罗能够竞争取代葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗重新占据孔穴。随着样品中盐酸克伦特罗分子浓度的增加，印迹膜上被竞争取代的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗就越多，即残留在印迹膜上的葡萄糖氧化酶就越少。而印迹膜表面的葡萄糖氧化酶能够与底液中的葡萄糖发生酶解反应产生过氧化氢，过氧化氢进一步氧化分解底液中的署红Y使其褪色，因此，通过检测试纸条的荧光强度，能对样品中的盐酸克伦特罗进行快速定性、半定量或定量分析。

本发明的有益效果是：

1.本发明盐酸克伦特罗分子印迹聚合物合成简单快捷、成本低、稳定性好，电化学性能表征结果证明：该印迹聚合物对盐酸克伦特罗具有特异识别性能，印迹效果好，识别效果理想。

2.本发明盐酸克伦特罗分子印迹聚合物可用于色谱分析、固相萃取、膜分离等领域，将所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物用于制备分子印迹试纸条，结合酶放大效应技术，能快速定性及定量测定盐酸克伦特罗，用于痕量在线检测盐酸克伦特罗。

附图说明

图1实施例1盐酸克伦特罗分子印迹聚合物印迹效果电化学性能分析图。

图2为本发明实施例5试纸条的荧光图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步描述，但不限制本发明的使用范围和应用范围。

一、盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的制备方法

实施例1

一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

1.配制浓度为3×10^-4mol/L的盐酸克伦特罗水溶液；

2.将5μLα-甲基丙烯酸加入到20mL浓度为3×10^-4mol/L盐酸克伦特罗水溶液中，超声处理10分钟，再加入0.0028g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，继续超声处理20分钟，静置过夜，得混合液(所述盐酸克伦特罗、α-甲基丙烯酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺加入量的摩尔比为9.78:1:3.03)；

3.将100μL浓度为0.5mol/L的过硫酸铵溶液，缓慢加入到步骤2得到的混合液中，超声处理15分钟引发聚合反应，即得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物。

实施例2

一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

1.配制浓度为3×10^-5mol/L的盐酸克伦特罗水溶液；

2.将3μLα-甲基丙烯酸加入到10mL浓度为3×10^-5mol/L盐酸克伦特罗水溶液中，超声处理5分钟，再加入0.0014g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，继续超声处理10分钟，静置过夜，得混合液(所述盐酸克伦特罗、α-甲基丙烯酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺加入量的摩尔比为117:1:30)；

3.将80μL浓度为0.5mol/L的过硫酸铵溶液，缓慢加入到步骤2得到的混合液中，超声处理10分钟引发聚合反应，即得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物。

实施例3

一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

1.配制浓度为3×10^-3mol/L的盐酸克伦特罗水溶液；

2.将7μLα-甲基丙烯酸加入到30mL浓度为3×10^-3mol/L盐酸克伦特罗水溶液中，超声处理15分钟，再加入0.0042g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，继续超声处理30分钟，静置过夜，得混合液(所述盐酸克伦特罗、α-甲基丙烯酸、N，N-亚甲基双丙烯酰胺加入量的摩尔比为274:300:90)；

3.将120μL浓度为0.5mol/L的过硫酸铵溶液，缓慢加入到步骤2得到的混合液中，超声处理20分钟引发聚合反应，即得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物。

二、盐酸克伦特罗分子印迹聚合物印迹效果分析

利用电化学方法对盐酸克伦特罗分子印迹聚合物进行印迹效果研究。

试验样品：实施例1样品。扫描方法：循环伏安法，扫描底液为1×10^-3mol/L K₃Fe(CN)₆与1mol/L NaNO₃的混合溶液中进行循环伏安扫描(CV)，扫描范围为：0.0-1.0V，扫描速度为50mV/s。

试验结果，见图1。其中a为裸金电极；b为10μL盐酸克伦特罗印迹聚合物均匀滴涂在金电极表面后扫描；c为用20μL 25％的乙醇浸泡步骤b的修饰电极，d为c修饰电极在20mL 3×10^-5盐酸克伦特罗水溶液浸泡10分钟后扫描。

结果表明：本发明实施例1样品对盐酸克伦特罗具有特异性识别能力，印迹效果好。

三、试纸条的制备方法

实施例4

一种分子印迹试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1.对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜的制备：将硝酸纤维素膜放入上述制备好的实施例1盐酸克伦特罗分子印迹聚合物溶液中浸泡30分钟，取出后置40℃烘箱内烘干，用25％乙醇洗涤硝酸纤维素膜，再用水洗涤硝酸纤维素膜，晾干，剪裁好；

2.剪裁大小为8cm×1cm基底，在基底内剪裁出一大小为4cm×0.8cm的镂空区域，在镂空区域的基底周围涂上胶水，将上述步骤2中剪裁好的对盐酸克伦特罗具有选择性识别能力的硝酸纤维素膜粘在基底上，再盖压一个具有相同镂空区域的基底，即得。

四、定性及半定量的检测方法

实施例5

供试品溶液的制备：称取10g饲料，加入20mL 1mol/L盐酸溶解，再加入180mL水，避光震荡25分钟，以3000r/min的速率离心30分钟，取上清液，用1mol/L NaOH溶液调节溶液pH值为8.0，即得。

活性为200-400ug/mL的葡萄糖氧化酶标记盐酸克伦特罗溶液的制备：称取5.0mg葡萄糖氧化酶溶解于1mL水中，加入0.1～0.3mL新配的0.1mol/L NaIO₄溶液，室温下避光搅拌10～30分钟；将搅拌好的溶液装入MW4000透析袋中，对1mmol/L pH值为4.4的HAc-NaAc缓冲液透析，4℃过夜；取上清液，加入10～40μL 0.2mol/L pH值为9.5的碳酸盐缓冲液，使葡萄糖氧化酶的pH值升高至9.0～10.0，得葡萄糖氧化酶溶液；取10mL比色管，加入7mg盐酸克伦特罗及1～3mL 0.01mol/L pH值为9.5的碳酸盐缓冲液，待其完全溶解后，加入上述葡萄糖氧化酶溶液，混匀，室温避光搅拌1～3h，再加入0.1mL新配的4mg/mL NaBH₄溶液，混匀，在4℃的环境中放置1～3h，得混合溶液；将所得混合溶液装入透析袋中，对0.15mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液透析，4℃过夜；透析完成后，将透析袋内的溶液取出，并于4℃避光保存，即得葡萄糖氧化酶标记盐酸克伦特罗溶液，酶标仪测定其浓度300ug/mL。

取上述制备好的盐酸克伦特罗分子印迹试纸条1片，在其反应区内分别滴加上述制备好的葡萄糖氧化酶标记的盐酸克伦特罗溶液，孵化反应10分钟，40℃烘干后，用70μL水淋洗反应区；在淋洗过的反应区内分别滴加25μL上述制备好的供试品溶液，竞争反应10分钟，再用70μL水淋洗反应区；在淋洗过的反应区内分别滴加20μL浓度为0.1g/mL葡萄糖溶液，再分别滴加20μL浓度为8×10^-5mol/L的署红Y溶液，酶催化反应5分钟，将试纸条在40℃烘干，置365nm的紫外灯下检测试纸条的显色情况，见图2。

结果：由于试纸条荧光显色包含在标准比色卡荧光颜色变化范围内，即说明此饲料中含有盐酸克伦特罗，此为定性方法。经认真与标准比色卡比对，由于试纸条荧光颜色与标准比色卡中左起第五个颜色相近，因此判定饲料供试品溶液中盐酸克伦特罗含量数量级与标准比色卡第五个颜色代表的含量数量级相同，即饲料供试品溶液中含有10^-7mol/L数量级的盐酸克伦特罗，此为半定量检测方法。

Claims (5)

1.一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物，其特征在于：以盐酸克伦特罗为模板分子，以α-甲基丙烯酸为功能单体，以氢键形式进行相互作用，加入交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂过硫酸铵发生自由基共聚，得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物；

所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为117-274:1-300:30-90。

2.根据权利要求1所述的盐酸克伦特罗分子印迹聚合物，其特征在于：所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为9.78:1:3.03。

3.一种如权利要求1所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）配制浓度为3×10^-3-3×10^-5 mol/L的盐酸克伦特罗水溶液；

（2）将3-7μL α-甲基丙烯酸加入到10-30 mL浓度为3×10^-3 -3×10^-5 mol/L盐酸克伦特罗水溶液中，超声处理5-15分钟，再加入0.0014-0.0042 g N，N-亚甲基双丙烯酰胺，继续超声处理10-30分钟，静置过夜，得混合液；

（3）将80-120 μL浓度为0.5mol/L的过硫酸铵溶液，缓慢加入到步骤(2)得到的混合液中，超声处理10-20分钟，即得到盐酸克伦特罗分子印迹聚合物。

4.一种如权利要求1所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的应用，其特征在于，所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物用于色谱分析、固相萃取或膜分离。

5.根据权利要求4所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物的应用，其特征在于，所述色谱分析的具体方法为：将所述盐酸克伦特罗分子印迹聚合物用于制备分子印迹试纸条，结合酶放大效应技术，快速定性及定量测定盐酸克伦特罗。