CN108704676A - 一种抗非特异性吸附三维芯片及其应用 - Google Patents

一种抗非特异性吸附三维芯片及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗非特异性吸附三维芯片及其应用，该芯片由固体支撑层、通过Au‑S键连接于支撑层上的引发剂层、共价结合于引发剂层上的点击交联层和共价键结合于点击交联层上的聚乙二醇丙烯酸甲酯层组成。其应用是在所述芯片上固定蛋白质后用于蛋白相互作用的检测，且芯片能抑制血浆和细胞裂解液的非特异性吸附。本发明的芯片具有结构设计新颖，抗蛋白吸附能力强，能很好地抑制血浆及细胞裂解液对芯片表面的非特异性吸附的特点。

Description

一种抗非特异性吸附三维芯片及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物三维芯片及其应用，特别是一种抗非特异性吸附三维芯片及其应用。
背景技术
随着科技的进步及大众新需求的出现，常规生物分析方法的耗时、敏感度低、进样量大、最低检测限过高等缺点，已很难满足快速反应的生物检测需求，至此，新型的生物学检测技术如生物传感芯片等应运而生并发展迅猛。其中基于表面等离子体共振(SPR)技术的生物传感芯片具有快速、简便、敏感、无标记等特性。这些优点，使得基于SPR的生物芯片在医学、食品安全、畜牧兽医、环境检测、药物筛选、军事科学等领域被广泛的研究与应用。
在生物传感芯片的界面进行着各种生化物质的相互作用与分离，其界面的特性决定着芯片的灵敏度、检测限及信号的有效性；因此，生物传感芯片的表面是芯片质量好坏的决定性因素，而表面的非特异性吸附是传感芯片所必须面对的问题。为了解决这一挑战性难题，不同科研团队通过不同的方法在一定程度上实现了对非特异性吸附的抑制，但面对血浆及细胞裂解液等复杂生化样品时，传感芯片表面仍会被非特异性吸附所“污染”。因此，非特异性吸附是生物传感芯片的技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种抗非特异性吸附三维芯片。本发明的芯片具有结构设计新颖，抗蛋白吸附能力强，能很好的抑制血浆及细胞裂解液对芯片表面的非特异性吸附的特点。
本发明的技术方案：一种抗非特异性吸附三维芯片，由固体支撑层、通过Au-S键连接于支撑层上的引发剂层、共价结合于引发剂层上的点击交联层和共价键结合于点击交联层上的聚乙二醇丙烯酸甲酯层组成。
前述的抗非特异性吸附三维芯片，所述三维芯片的制备方法包括如下步骤：
1)通过金属-巯基之间的作用，利用自组装技术将引发剂层组装于支撑层的表面上形成引发剂层；
2)将表面覆盖有引发剂的支撑层浸泡在含炔基/叠氮基团单体、聚乙二醇丙烯酸甲酯单体和催化剂的甲醇-水混合溶液中，并在保护气体氛围下、于30～55℃反应1～6小时，清洗芯片，得到共价结合于引发剂层上的含炔基/叠氮官能团的聚合物层；
3)把步骤2)中含炔基/叠氮官能团聚合物层的芯片浸泡于含有叠氮-聚乙二醇-叠氮或者炔基-聚乙二醇-炔基的点击交联剂和催化剂的甲醇-水混合溶液中，于保护气体氛围下、在30～55℃下反应1～2小时，得到点击交联层；
4)把步骤3)中含点击交联层的芯片置于含有聚乙二醇丙烯酸甲酯单体和催化剂的甲醇-水混合溶液中，在保护气体氛围下、于30～55℃反应3～12个小时，得聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层，即得抗非特异性吸附芯片。
前述的抗非特异性吸附三维芯片，所述支撑层是表面镀有金膜或银膜的玻璃基片。
前述的抗非特异性吸附三维芯片，所述引发剂层包括稀释剂和引发剂，引发剂和稀释剂的摩尔比为1-100:1000；所述稀释剂的结构式为下列1～III中的一种：
其中为6-12的正整数；
所述引发剂的结构式为1～III中的一种：
其中n为6-12的正整数。
前述的抗非特异性吸附三维芯片，所述含炔基/叠氮基团单体的结构式为I～II中的一种：
所述聚乙二醇丙烯酸甲酯单体的结构式为：
其中n为6、8、10或12；
所述叠氮-聚乙二醇-叠氮的结构式为：
其中n为5～50的正整数；
所述炔基-聚乙二醇-炔基的结构式为：
其中n为5～50的正整数。
前述的抗非特异性吸附三维芯片，所述催化剂为卤化铜与抗坏血酸钠；所述甲醇与水的摩尔比为1-3:1。
前述的抗非特异性吸附三维芯片，所述保护气体为氮气或氩气。
一种前述的抗非特异性吸附三维芯片的应用，是在所述芯片上固定蛋白质后用于蛋白相互作用的检测，且芯片能抑制血浆和细胞裂解液的非特异性吸附。
前述的抗非特异性吸附三维芯片的应用，所述应用包括如下步骤：
1)将芯片浸泡于含有二酸酐与溶剂的溶液中，在30～55℃下反应1～12小时，清洗芯片，得到表面羧基化的芯片；
2)把步骤1)中表面羧基化的芯片浸泡在由1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺配成的水溶液中，在常温下反应30～120分钟，清洗，得到表面活化的芯片；
3)把蛋白质通过点样机点于步骤2)表面活化的芯片的表面，室温反应1～3小时，清洗芯片得到固定蛋白的芯片；
4)将步骤3)固定蛋白的芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以缓冲液作为流动相，基线稳定后，通入作用蛋白，随后依次通入PBS、血浆及PBS即可。
前述的抗非特异性吸附三维芯片的应用，所述二酸酐为丁二酸酐或戊二酸酐；所述溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或者四氢呋喃；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:3-6。
本发明的有益效果
(1)本发明所制备抗非特异性吸附芯片的整个表面包括引发剂层、点击交联层与聚乙二醇丙烯酸甲酯层，这一结构设计科学合理，实际应用效果优异。引发层能很好的控制引发密度；点击交联层含有聚乙二醇与点击交联点，其能防止复杂样品进入引发剂层而引起特异性吸附与复杂样品对点击交联层的吸附；聚乙二醇丙烯酸甲酯层是用来固定分析物的固定层，其不但能固定蛋白质，还对复杂样品的非特异性吸附有很好的抑制效果。
(2)本发明所制备的抗非特异性吸附芯片虽然由多层结构组成，但其制备步骤却相对简单。
(3)本发明所制备的抗非特异性吸附芯片能实现在血浆或细胞裂解液条件下的蛋白与其抗体之间的检测。
附图说明
图1为本发明的抗非特异性吸附芯片的结构示意图；
图2为实施例4中固定BSA蛋白芯片对BSA抗体(anti-BSA)的特异性相互作用及对血浆的抗非特异性吸附。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
本发明的实施例
对比例1
在洁净的玻璃基片表面磁控溅射厚度为1nm的铬膜，随后，在铬膜的表面磁控溅射厚度约为30nm的金膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其吸附于表面的污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有稀释剂(式I)浓度为1mM的乙醇溶液，稀释剂通过Au-S键自组装于金表面；反应5小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的稀释剂(式I)层。
对比例2
在洁净的玻璃基片表面磁控溅射厚度为5nm的铬膜，随后，在铬膜的表面磁控溅射厚度约为50nm的金膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其吸附于表面的污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有稀释剂(式II)浓度为1mM的乙醇溶液，稀释剂通过Au-S键自组装于金表面；反应5小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的稀释剂(式II)层。
对比例3
在洁净的玻璃基片表面磁控溅射厚度为3nm的铬膜，随后，在铬膜的表面磁控溅射厚度约为40nm的金膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其吸附于表面的污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有稀释剂(式III)浓度为1mM的乙醇溶液，稀释剂通过Au-S键自组装于金表面；反应5小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的稀释剂(式III)层。
实施例1
一种抗非特异性吸附三维芯片，通过如下方法制备：
1)在洁净的玻璃基片表面磁控溅射厚度为1nm的铬膜，随后，在铬膜的表面磁控溅射厚度约为30nm的金膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其吸附于表面的污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有总浓度为1mM的稀释剂(式I)和引发剂(式I)的乙醇溶液，其中，引发剂与稀释剂的摩尔比为1:1000，稀释剂和引发剂通过Au-S键自组装于金表面；反应5小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的引发剂层。
2)在保护气体氛围下，于芯片反应器I中加入1摩尔份的含炔基基团的单体、1摩尔份的聚乙二醇丙烯酸酯单体(Mn约为300)、100摩尔份的甲醇与100摩尔份的去离子水、0.01摩尔份的氯化铜及0.01摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟待固体溶解。在保护气体氛围下，在上述芯片反应器中放入表面自组装有引发剂层的基片，于30℃反应6小时，清洗芯片，得到共价结合于引发剂层上的含炔基官能团的聚合物层。随后，在保护气体氛围下，于芯片反应器II中加入1摩尔份的叠氮-聚乙二醇-叠氮、100摩尔份的去离子水、0.01摩尔份的氯化铜及0.01摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟后，放入上述含炔基官能团聚合物层的芯片，在35℃下反应2小时，得到共价结合于引发剂层上的点击交联层。
3)在保护气体氛围下，于芯片反应器III中加入1摩尔份的聚乙二醇丙烯酸酯单体(Mn约为300)、100摩尔份的甲醇与100摩尔份的去离子水、0.01摩尔份的氯化铜及0.01摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟待固体溶解。在保护气体氛围下，在上述芯片反应器中放入含点击交联层的芯片，于30℃下反应12小时，得到含引发剂层、点击交联层和聚乙二醇丙烯酸甲酯层的抗非特异性吸附芯片。
实施例2
一种抗非特异性吸附三维芯片，通过如下方法制备：
1)在洁净的玻璃基片表面磁控溅射厚度为5nm的铬膜，随后，在铬膜的表面磁控溅射厚度约为50nm的金膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其吸附于表面的污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有总浓度为1mM的稀释剂(式II)和引发剂(式II)的乙醇溶液，其中，引发剂与稀释剂的摩尔比为100:1000，稀释剂和引发剂通过Au-S键自组装于金表面；反应10小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的引发剂层。
2)在保护气体氛围下，于芯片反应器I中加入1摩尔份的含叠氮基团的单体、1摩尔份的聚乙二醇丙烯酸酯单体(Mn约为2000)、300摩尔份的甲醇与100摩尔份的去离子水、0.1摩尔份的氯化铜及0.1摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟待固体溶解。在保护气体氛围下，在上述芯片反应器中放入表面自组装有引发剂层的基片，于55℃反应1小时，清洗芯片，得到共价结合于引发剂层上的含叠氮官能团的聚合物层。随后，在保护气体氛围下，于芯片反应器II中加入1摩尔份的炔基-聚乙二醇-炔基、100摩尔份的去离子水、0.1摩尔份的溴化铜及0.1摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟后，放入上述含炔基官能团聚合物层的芯片，在55℃下反应1小时，得到共价结合于引发剂层上的点击交联层。
3)在保护气体氛围下，于芯片反应器III中加入1摩尔份的聚乙二醇丙烯酸酯单体(Mn约为2000)、300摩尔份的甲醇与100摩尔份的去离子水、0.1摩尔份的氯化铜及0.1摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟待固体溶解。在保护气体氛围下，在上述芯片反应器中放入含点击交联层的芯片，于55℃下反应3小时，得到含引发剂层、点击交联层和聚乙二醇丙烯酸酯层的抗非特异性吸附芯片。
实施例3
一种抗非特异性吸附三维芯片，通过如下方法制备：
1)在洁净的玻璃基片表面磁控溅射厚度为3nm的铬膜，随后，在铬膜的表面磁控溅射厚度约为40nm的金膜；用等离子清洗仪清洗上述镀有金膜的玻璃基片，除去其吸附于表面的污染物；将清洗后的镀有金膜的玻璃基片立即浸泡在含有总浓度为1mM的稀释剂(式III)和引发剂(式III)的乙醇溶液，其中，引发剂与稀释剂的摩尔比为20:1000，稀释剂和引发剂通过Au-S键自组装于金表面；反应12小时后，玻璃基片表面自组装有单层结构的引发剂层。
2)在保护气体氛围下，于芯片反应器I中加入1摩尔份的含炔基基团的单体、1摩尔份的聚乙二醇丙烯酸酯单体(Mn约为500)、200摩尔份的甲醇与100摩尔份的去离子水、0.05摩尔份的碘化铜及0.05摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟待固体溶解。在保护气体氛围下，在上述芯片反应器中放入表面自组装有引发剂层的基片，于50℃反应3小时，清洗芯片，得到共价结合于引发剂层上的含炔基官能团的聚合物层。随后，在保护气体氛围下，于芯片反应器II中加入1摩尔份的叠氮-聚乙二醇-叠氮、100摩尔份的去离子水、0.05摩尔份的氯化铜及0.05摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟后，放入上述含炔基官能团聚合物层的芯片，在40℃下反应1.5小时，得到共价结合于引发剂层上的点击交联层。
3)在保护气体氛围下，于芯片反应器III中加入1摩尔份的聚乙二醇丙烯酸酯单体(Mn约为500)、200摩尔份的甲醇与100摩尔份的去离子水、0.05摩尔份的氯化铜及0.05摩尔份的抗坏血酸钠，搅拌5分钟待固体溶解。在保护气体氛围下，在上述芯片反应器中放入含点击交联层的芯片，于50℃下反应8小时，得到含引发剂层、点击交联层和聚乙二醇丙烯酸甲酯层的抗非特异性吸附芯片。
实施例4
一种抗非特异性吸附三维芯片的应用：
1)在芯片反应器中I加入1摩尔份的丁二酸酐及100摩尔份的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌5分钟，将实施例1中的抗非特异性吸附芯片及对比例1中的单层芯片放入上述芯片反应器中，在30℃下反应12小时，清洗芯片，得到对比例1及实施例1羧基化的芯片。
2)在芯片反应器II中加入1摩尔份的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、3摩尔份的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及100摩尔份的去离子水，并将上述羧基化的芯片放入芯片反应器中，于常温下反应30分钟，得到对比例1及实施例1表面活化的芯片。把蛋白质(BSA)通过点样机点于活化芯片的表面，室温反应1小时，清洗芯片得到对比例1及实施例1固定蛋白(BSA)的芯片。
3)将对比例1及实施例1固定蛋白的芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以磷酸缓冲液(PBS buffer,10mM,pH＝7.4)作为流动相，流速设为1.5μL/s，基线稳定后，通入5.0μg/mL的抗体BSA(anti-BSA)，随后依次通入PBS、血浆及PBS，如图2，实施例1固定BSA蛋白的芯片对anti-BSA有很好的特异性识别作用，且其对血浆基本没有非特异性吸附；对比例1固定BSA蛋白的芯片对anti-BSA的特异性识别信号明显要小于实施例1，且其对血浆有很强的非特异性吸附。
实施例5
一种抗非特异性吸附三维芯片的应用：
1)在芯片反应器中I加入1摩尔份的丁二酸酐及100摩尔份的二甲基亚砜(DMSO)，搅拌5分钟，将实施例2中的抗非特异性吸附芯片及对比例2中的单层芯片放入上述芯片反应器中，在55℃下反应1小时，清洗芯片，得到对比例2及实施例2羧基化的芯片。
2)在芯片反应器II中加入1摩尔份的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、6摩尔份的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及100摩尔份的去离子水，并将上述羧基化的芯片放入芯片反应器中，于常温下反应120分钟，得到对比例2及实施例2表面活化的芯片。把蛋白质(BSA)通过点样机点于活化芯片的表面，室温反应3小时，清洗芯片得到对比例2及实施例2固定蛋白(BSA)的芯片。
3)将对比例2及实施例2固定蛋白的芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以磷酸缓冲液(PBS buffer,10mM,pH＝7.4)作为流动相，流速设为1.5μL/s，基线稳定后，通入5.0μg/mL的抗体BSA(anti-BSA)，随后依次通入PBS、血浆及PBS，实施例2固定BSA蛋白的芯片对anti-BSA有很好的特异性识别作用，且其对细胞裂解液基本没有非特异性吸附；对比例2固定BSA蛋白的芯片对anti-BSA的特异性识别信号明显要小于实施例2，且其对细胞裂解液有很强的非特异性吸附。
实施例6
一种抗非特异性吸附三维芯片的应用：
1)在芯片反应器中I加入1摩尔份的丁二酸酐及100摩尔份的二甲基亚砜(DMSO)，搅拌5分钟，将实施例3中的抗非特异性吸附芯片及对比例3中的单层芯片放入上述芯片反应器中，在50℃下反应6小时，清洗芯片，得到对比例3及实施例3羧基化的芯片。
2)在芯片反应器II中加入1摩尔份的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、4摩尔份的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及100摩尔份的去离子水，并将上述羧基化的芯片放入芯片反应器中，于常温下反应60分钟，得到对比例3及实施例3表面活化的芯片。把蛋白质(BSA)通过点样机点于活化芯片的表面，室温反应2小时，清洗芯片得到对比例3及实施例3固定蛋白(BSA)的芯片。
3)将对比例3及实施例3固定蛋白的芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以磷酸缓冲液(PBS buffer,10mM,pH＝7.4)作为流动相，流速设为1.5μL/s，基线稳定后，通入5.0μg/mL的抗体BSA(anti-BSA)，随后依次通入PBS、血浆及PBS，实施例3固定BSA蛋白的芯片对anti-BSA有很好的特异性识别作用，且其对血浆基本没有非特异性吸附；对比例3固定BSA蛋白的芯片对anti-BSA的特异性识别信号明显要小于实施例3，且其对血浆有很强的非特异性吸附。

Claims (10)

1.一种抗非特异性吸附三维芯片，其特征在于：由固体支撑层、通过Au-S键连接于支撑层上的引发剂层、共价结合于引发剂层上的点击交联层和共价键结合于点击交联层上的聚乙二醇丙烯酸甲酯层组成。
2.根据权利要求1所述的抗非特异性吸附三维芯片，其特征在于，所述三维芯片的制备方法包括如下步骤：
1)通过金属-巯基之间的作用，利用自组装技术将引发剂层组装于支撑层的表面上形成引发剂层；
2)将表面覆盖有引发剂的支撑层浸泡在含炔基/叠氮基团单体、聚乙二醇丙烯酸甲酯单体和催化剂的甲醇-水混合溶液中，并在保护气体氛围下、于30～55℃反应1～6小时，清洗芯片，得到共价结合于引发剂层上的含炔基/叠氮官能团的聚合物层；
3)把步骤2)中含炔基/叠氮官能团聚合物层的芯片浸泡于含有叠氮-聚乙二醇-叠氮或者炔基-聚乙二醇-炔基的点击交联剂和催化剂的甲醇-水混合溶液中，于保护气体氛围下、在30～55℃下反应1～2小时，得到点击交联层；
4)把步骤3)中含点击交联层的芯片置于含有聚乙二醇丙烯酸甲酯单体和催化剂的甲醇-水混合溶液中，在保护气体氛围下、于30～55℃反应3～12个小时，得聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯层，即得抗非特异性吸附芯片。
3.根据权利要求1或2所述的抗非特异性吸附三维芯片，其特征在于：所述支撑层是表面镀有金膜或银膜的玻璃基片。
4.根据权利要求1或2所述的抗非特异性吸附三维芯片，其特征在于：所述引发剂层包括稀释剂和引发剂，引发剂和稀释剂的摩尔比为1-100:1000；所述稀释剂的结构式为下列1～III中的一种：
其中为6-12的正整数；
所述引发剂的结构式为1～III中的一种：
其中n为6-12的正整数。
5.根据权利要求2所述的抗非特异性吸附三维芯片，其特征在于，所述含炔基/叠氮基团单体的结构式为I～II中的一种：
所述聚乙二醇丙烯酸甲酯单体的结构式为：
其中n为6、8、10或12；
所述叠氮-聚乙二醇-叠氮的结构式为：
其中n为5～50的正整数；
所述炔基-聚乙二醇-炔基的结构式为：
其中n为5～50的正整数。
6.根据权利要求2所述的抗非特异性吸附三维芯片，其特征在于：所述催化剂为卤化铜与抗坏血酸钠；所述甲醇与水的摩尔比为1-3:1。
7.根据权利要求2所述的抗非特异性吸附三维芯片，其特征在于：所述保护气体为氮气或氩气。
8.一种根据权利要求1-7任一项所述的抗非特异性吸附三维芯片的应用，其特征在于：是在所述芯片上固定蛋白质后用于蛋白相互作用的检测，且芯片能抑制血浆和细胞裂解液的非特异性吸附。
9.根据权利要求8所述的抗非特异性吸附三维芯片的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
1)将芯片浸泡于含有二酸酐与溶剂的溶液中，在30～55℃下反应1～12小时，清洗芯片，得到表面羧基化的芯片；
2)把步骤1)中表面羧基化的芯片浸泡在由1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺配成的水溶液中，在常温下反应30～120分钟，清洗，得到表面活化的芯片；
3)把蛋白质通过点样机点于步骤2)表面活化的芯片的表面，室温反应1～3小时，清洗芯片得到固定蛋白的芯片；
4)将步骤3)固定蛋白的芯片按照SPR仪器操作流程固定于仪器中，并以缓冲液作为流动相，基线稳定后，通入作用蛋白，随后依次通入PBS、血浆及PBS即可。
10.根据权利要求9所述的抗非特异性吸附三维芯片的应用，其特征在于：所述二酸酐为丁二酸酐或戊二酸酐；所述溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或者四氢呋喃；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:3-6。
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